BE1029426B1 - Methoden voor de toediening van heilzame voedingsstoffen aan organismen - Google Patents

Abstract

Een methode voor het voederen van ongewervelde dieren, bestaande uit: - een samenstelling te verstrekken die een microbieel organisme of delen, extracten, oliën of verfijningen daarvan bevat; en - toediening van de samenstelling aan ongewervelde dieren waarbij het microbiële organisme wordt gekozen uit de groep bestaande uit schimmels, algen of bacteriën; en waarbij het microbiële organisme genetisch gemodificeerd is om een voedingsstof voor ongewervelden te produceren.

Description

Methoden voor de toediening van heilzame voedingsstoffen aan organismen

ACHTERGROND Bijen zijn in de modeme landbouw zeer belangrijk voor de bestuiving van gewassen. Bestuivers worden de laatste tijd bedreigd door de blootstelling aan bestrijdingsmiddelen, de toegenomen prevalentie van ziekteverwekkers en parasieten en veranderingen in het landschapsbeheer die de overvloed aan natuurlijk bloemstuifmeel doen afnemen. Imkers voeden honingbijenkolonies van oudsher met een voedselbron die stuifmeel of pollen bevat dat in de natuur door bijen is verzameld. Omdat stuifmeel slechts beperkt beschikbaar is en op beperkte schaal wordt verzameld, stuifmeel verzamelen duur is, stuifmeel moeilijk vers te houden is en in het wild verzameld stuifmeel drager kan zijn van plagen, ziekten en bestrijdingsmiddelen. Daarom bevatten in de handel verkrijgbare voeders meestal geen stuifmeel. Deze stufmeelvervangende samenstellingen zijn reeds beschreven door de huidige uitvinders. US2019/0090507 naar Apix Biosciences benadrukt het belang van plantensterolen en in het bijzonder van 24-methyleencholesterol, campesterol, B- sitosterol, en cholesterol. US2019/0090507 vermeldt echter niet 24-methyleencholesterol, campesterol, B-sitosterol, en cholesterol verkregen uit genetisch gemodificeerd micro- organisme. US2019/0090507 aan Apix Biosciences wijst ook op het belang van fenolverbindingen, carotenoïden, en vitamine C en E als voedingsstoffen voor bijen, maar vermeldt niet dat deze uit een micro-organisme kunnen worden verkregen.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING De huidige uitvinders hebben verrassend vastgesteld dat essentiële voedingsstoffen, in het bijzonder sterolen, stanolen, polyfenolen en carotenoïden, die doeltreffend kunnen worden toegediend aan ongewervelde dieren, in het bijzonder bijen, door synthese of productie in micro-organismen of delen daarvan. Voorbeelden van dergelijke sterolvoedingsstoffen zijn cholesterol, desmosterol, 24methyleencholesterol, 7- dehydroxycholesterol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol en fucosterol. Voorbeelden zijn de stanolen zoals cholestanol en 24-methylenecholst-7-enol. Voorbeelden van polyfenolen zijn de flavenolen, quercetine en rutine, en fenolzuren zoals p-cumarinezuur. Voorbeelden van carotenoïden zijn b-caroteen en astaxanthine.

Bijgevolg bestaat een eerste aspect van de uitvinding uit een methode voor het voederen van ongewervelde dieren, bestaande uit: =» een samenstelling te verstrekken die een microbieel organisme of een algensoort of delen, extracten, oliën of mengsels of verfijningen daarvan bevat; = toediening van deze samenstelling aan een doelsoort waarbij het organisme wordt gekozen uit de groep bestaande uit schimmels, algen of bacteriën; en waarbij het microbiële organisme een voedingsstof produceert op natuurlijke wijze of na selectie of modificatie van de microbe.

Ineen ander aspect wordt de voedingsstof gekozen uit de groep bestaande uit sterolen of stanolen, met inbegrip van, maar niet beperkt tot: cholesterol, desmosterol, 24- methyleencholesterol, cholestanol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol en fucosterol.

Een ander aspect is dat de voedingsstof wordt gekozen uit de groep bestaande uit fenolzuren, epicatechinen, catechinen en flavonoïden.

IN een ander aspect wordt de voedingsstof gekozen uit de groep bestaande uit carotenen en xanthofylen, waaronder b-caroteen, astaxanthine, zeaxanthine.

In een ander aspect is het micro-organisme verder gemodificeerd of geselecteerd om geen antinutriënten tot expressie te brengen of te produceren.

Een ander aspect is dat de ongewervelde antinutriënt zymosterol of ergosterol is.

In een ander aspect is de samenstelling een volledig dieet voor de doelsoort, een deel van een dieet voor de doelsoort of een voedingssupplement, of een topische toepassing.

In een ander aspect is de samenstelling een samenstelling voor een dieet voor een celkweek of organoïdecultuur, een onderdeel van een dieet of een voedingssupplement voor een celkweek of organoïdecultuur.

IN een ander aspect is de samenstelling een dieet voor ongewervelde diersoorten, een onderdeel van een dieet voor doelsoorten of een voedingssupplement, of een topische toepassing.

In een ander aspect wordt de samenstelling toegediend aan ongewervelde dieren van de familie van de Apidae, in het bijzonder honingbijen, hommels of angelloze bijen.

In een ander aspect wordt de samenstelling toegediend = in vaste vorm zoals een pasteitje of in vloeibare vorm zoals een oplossing of spray, korrel of poeder; = binnen of buiten de korf.

In een ander aspect wordt het organisme gekozen uit de groep bestaande uit: =" een zee- of zoetwateralg, in het bijzonder een extract, een olie of een raffinage van U/va lactuca of Laminarna sp; =» een marien kiezelwier of een microalg, met name een extract, een olie of een raffinaat van kiezelwieren zoals Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira rotula, of Chaetoceros muelleri of microalgen zoals Dunaliella salina of Porphyridium cruentum, en =» een schimmel, in het bijzonder een extract, een olie of een raffinage van gistsoorten zoals Saccharomyces cerevisiae, Xanthophyllomyces dendrorhus of Yarrowia lipolytica, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Kluyveromyces, Neurospora, Penicillium, Pichia {Hansenula), Puccinia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sclerotium, Trichoderma, en Xanthophyllomyces (Phaffia); in sommige belichamingen behoort het organisme tot een soort die onder meer Aspergillus nidulans, A. niger, A. terreus, Botrytis cinerea, C. utilis, Cercospora — nicotianae, Fusarnumfujikuroi (Gibberella zeae) Kluyveromyces lactis, K. lactis, Neurospora crassa, Pichia pastor is, Puccinia distincta, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Sclerotium rolfsi, Trichoderma reesei, en Xanthophyllomyces dendrorhous {Phaffia rhodozymo), bij voorkeur Yarrowia lipolytica In een ander aspect is er een chemische, chromatografische of enzymatische modificatiestap om de ongewervelde voedingsstof te verkrijgen.

Een ander aspect is dat de samenstelling voor een lid van de familie der Apidae bestaat uit: = eiwitten in een hoeveelheid van 10 tot 50 gew%, bij voorkeur van 20 tot 40 gew%,

=» vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, = koolhydraten in een hoeveelheid van 30 tot 90 gew%, bij voorkeur van 50 tot 70 gew%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid componenten 100 % bedraagt en waarbij het % gerelateerd is aan het totale drooggewicht van de samenstelling. In een ander aspect omvat de samenstelling een voedingsstof voor insecten, geselecteerd uitde groep bestaande uit cholesterol, desmosterol, cholestanol, 24-methyleencholesterol, 24-methylenecholst-7-enol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol en fucosterol of mengsels daarvan in een bepaalde hoeveelheid: Van 0,01-5% van de voeding als afzonderlijke bestanddelen, waarbij geen bestanddeel ooit minder dan 0,01% van de voeding uitmaakt, en van 0,1-5% van de voeding in een mengsel.

Als mengsel, bij voorkeur van 0,1-1% en nog meer bij voorkeur van 0,3-0,5% voor honingbijen en 0,3-0,8% voor hommels, als percentage van het totale natte gewicht van de stuifmeelvervangende samenstelling en/of Waarbij de verhoudingen van de sterolen de hoeveelheden vertegenwoordigen die in de doelsoort, zoals bijen, worden aangetroffen (zie tabel 1).

In een ander aspect bevat de samenstelling een voedingsstof voor insecten, geselecteerd uit de groep bestaande uit fenolzuren, proanthocyanidinen, epicatechinen, catechinen, en flavonoïden zoals quercetine, naringenine, p-cumaarzuur of mengsels daarvan in een bepaalde hoeveelheid: Van 0,01-5% van het rantsoen, bij voorkeur van 0,01-1% en nog meer bij voorkeur van 0,03-0,5% voor honingbijen en 0,03-0,8% voor hommels, als percentage van het totale gewicht van de stuifmeelsubstitutensamenstelling en waarbij de overheersende klasse fenolen bestaat uit proanthocyanidinen of flavonoïden en ten minste 30% van het totaal aan polyfenolen uitmaakt, maar bij voorkeur tussen 70-100% van het totaal aan polyfenolen.

In een ander aspect bevat de samenstelling een nutriënt voor een doelsoort, geselecteerd uit de groep carotenoïden of xanthofylen zoals b-caroteen, lycopeen, of astaxanthine of mengsels daarvan in een bepaalde hoeveelheid: van 0,01-5% van het rantsoen, bij voorkeur van 0,01-1% en nog meer bij voorkeur van 5 0,03-0,5% voor honingbijen en 0,03-0,8% voor hommels, als percentage van het totale gewicht van de stuifmeelvervangende samenstelling Een ander aspect is dat de samenstelling voor de doelsoort in wezen vrij is van pollen.

Een ander aspect van de uitvinding is het gebruik van een samenstelling die een microbieel organisme of delen, extracten, oliën, mengsels of verfijningen daarvan bevat, = waarbij het microbiële organisme wordt gekozen uit de groep bestaande uit schimmels, algen of bacteriën; en = waarbij het microbiële organisme is gemodificeerd of geselecteerd om een nutriënt van de doelsoort te produceren; voor het voeden van ongewervelde dieren.

In een ander aspect van het gebruik, bestaat de samenstelling uit: = eiwitten in een hoeveelheid van 10 tot 50 gew%, bij voorkeur van 20 tot 40 gew%, =» vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, = koolhydraten in een hoeveelheid van 30 tot 90 gew%, bij voorkeur van 50 tot 70 gew%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid componenten 100 % bedraagt en waarbij het % betrekking heeft op het totale natte gewicht van de samenstelling voor het voederen van ongewervelde dieren, in het bijzonder bijen of hommels.

In een ander aspect van het gebruik van de onderhavige uitvinding is de samenstelling in wezen vrij van pollen.

Een ander aspect van de uitvinding is een samenstelling bestaande uit:

= eiwitten in een hoeveelheid van 10 tot 50 gew%, bij voorkeur van 20 tot 40 gew%, = vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, = koolhydraten in een hoeveelheid van 30 tot 90 gew%, bij voorkeur van 50 tot 70 gew%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid componenten 100 % bedraagt, waarbij het % gerelateerd is aan het totale drooggewicht van de samenstelling en waarbij de samenstelling in wezen vrij is van antinutriénten.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN Figuur 1 toont de keuze van de cohorten bijen van voeding met of zonder isofucosterol. Figuur2 toont de overleving van cohorten bijen die zich voedden met diëten die specifieke concentraties isofucosterol bevatten. Figuur 3 toont de drempelwaarde voor de invloed van isofucosterol in bijenvoeding voor broed

GEDETARLLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING Belichamingen van de huidige uitvindingen worden hiema beschreven. Sterolvoedingsstoffen en sterolantinutriënten voor ongewervelden Micro-organismen, planten en hogere dierlijke geslachten synthetiseren sterolverbindingen de novo. De ongewervelde protostome groep van dieren zijn echter sterol auxotrofen en moeten sterolen uit de voeding verkrijgen. Sommige herbivoren, zoals sprinkhanen, eten bijvoorbeeld planten of schimmels en zetten natuurlijk voorkomende fytosterolen zoals b-sitosterol om in cholesterol. Insectenroofdieren, aaseters en parasieten halen cholesterol direct uit het voedsel dat zij consumeren. Andere ongewervelde dieren, zoals honingbijen (Apis melifera), halen andere sterolen rechtstreeks uit stuifmeel en nemen sommige daarvan ongemodificeerd op in hun weefsels (Svoboda et al. 1981). De opname van sterolen en het profiel van sterolen in het weefsel van ongewervelde dieren hangt af van de samenstelling van het substraat, het vermogen van het dier om specifieke sterolen die in het voedsel aanwezig zijn te gebruiken en/of te modificeren, en andere omgevingsvariabelen zoals temperatuur (Knittlefelder et al 2020). Lipiden zijn zeer belangrijk in alle organismen en zijn de substraten voor de productie van signaalmoleculen.

Ze worden ook gebruikt als opslagmoleculen voor energie in dieren.

Specifieke vormen van lipiden, zoals sterolen, zijn essentiële elementen van celmembranen.

Sterolen zijn ook de substraten voor de aanmaak van hormonen, feromonen, afweerstoffen of substraten voor de synthese van vitaminen: Veel insecten nemen sterolen op uit hun voedsel en gebruiken deze ongewijzigd in de membranen van hun weefsels (b.v.

Drosophila), Honingbijen zijn een voorbeeld van een ongewerveld dier dat sterolen uit zijn voedselbron opneemt en deze ongewijzigd in weefsels vasthoudt.

Het is ook een dier dat verschillende sterolverbindingen nodig heeft.

Onderzoek dat in de jaren '80 door de USDA laboratoria in Beltsville werd uitgevoerd, bestudeerde de sterolsamenstelling van honingbijen en de post-ingestieve modificatie van geselecteerde sterolverbindingen bij de Hymenoptera.

Zij stelden vast dat ten minste zeven sterolen in bijenweefsels worden aangetroffen: cholesterol, campesterol, 24- methyleencholesterol, desmosterol, stigmasterol, b-sitosterol, en isofucosterol (zie tabel 1). Svoboda stelde door middel van radiolabelingstudies vast dat 24-methyleencholesterol, sitosterol en campesterol uit de voeding (stuifmeel) worden verkregen en niet in cholesterol worden omgezet (Svoboda et al. 1981). Uit deze gegevens concludeerden zij dat honingbijen geen functionele genen hebben voor de enzymen die nodig zijn om 24- methyleencholesterol, sitosterol of campesterol in cholesterol om te zetten.

Daarom worden de fytosterolen, 24-methyleencholesterol, sitosterol, cholesterol en campesterol, beschouwd als essentiële voedingsstoffen van het bijendieet, die worden verkregen uit stuifmeel.

De rol, de bron en de behoefte aan desmosterol, b-sitosterol, stigmasterol en isofucosterol in bijenweefsels zijn onbekend.

Zij zijn in de weefsels van honingbijen aanwezig voor bijna 50% van de sterolen van de bij (gecombineerd, tabel 1). Net als bij andere insecten wordt cholesterol bij honingbijen omgezet in ecdysteroïden (bv. 20-hydroxyecdyson). Deze verbindingen zijn de belangrijkste hormonen die de veranderingen in de rui en de voortplanting bij insecten regelen (Svoboda en Feldlaufer, 1991). Campesterol is het substraat dat nodig is om het rui-hormoon makisteron A aan te maken (Feldlaufer et al. 1986). Het sterol 24-methyleencholesterol maakt 40-50% uit van de sterolen in honingbijenweefsels en is een belangrijk bestanddeel van de membranen van bijencellen. De afwezigheid ervan leidt tot atrofie van de hypofaryngeale klieren (Chakrabarti et al. 2020) en de bijen stoppen met de productie van broedsel (Herbert et al. 1980). Bij hommels vormen desmosterol, b-sitosterol, stigmasterol en isofucosterol sterolen 70-80% van de sterolen in het weefsel (tabel 1). Aangezien het natuurlijke voedsel van de bij tot 30 verschillende sterolen kan bevatten (Vilette et al. 2015; Zu et al. 2021), is het waarschijnlijk dat deze resterende sterolen in het bijenweefsel worden opgenomen in plaats van cholesterol op dezelfde manier als 24-methyleencholesterol dat doet. De gegevens in tabel 1 geven de hoeveelheden van deze zeven sterolen aan voor eusociale bijen.

De in tabel 1 vermelde fytosterolen komen in lage tot sporenhoeveelheden voor in het gebruikte of voor de bijenvoederfabrikant beschikbare plantaardige meel. De enige meelbronnen die tegenwoordig door commerciële bijenvoederproducenten worden gebruikt, bevatten niet alle noodzakelijke sterolen, zoals blijkt uit de vergelijkende tabel 1. Bovendien levert het stuifmeel van één enkele plantensoort niet alle zeven sterolen die honingbijen nodig hebben (Vilette et al. 2015). In de natuur verzamelen foeragerende bijen stuifmeel van diverse plantenbronnen, die elk wel enkele, maar niet alle andere belangrijke sterolen kunnen bevatten. Het stuifmeel van geen enkele plantensoort bevat alle voor bijen relevante sterolen in de juiste hoeveelheid en verhoudingen (Vilette et al. 2015). Gemengd stuifmeel wordt gebruikt als aanvulling op commerciële bijenvoeders, maar het is duur en kan pesticiden en bijenpathogenen herbergen. Het gebruik van door bijen verzameld stuifmeel dat op de ene locatie is verkregen om bijen op een andere, door pollen beperkt gebied te voeden, is niet haalbaar voor de aantallen kolonies die tegenwoordig voor commerciële bestuiving worden gekweekt (d.w.z. honderden per bijenstandplaats).

Honingbije | CHO | DES | 24MC | CMP | STIG | B-SIT | ISF ZYM | ERG | Totaal Pd ee en em Door bien | 1.15 | 15.0 | 21.19 | 3.25 | 0.53 | 25.92 | 32.95 2418 verzameld pee | [a a [a [oa [a [ae [en

Koninklijke 0.88 | 9.43 | 4022 | 6.70 | 0.71 | 21.73 | 20.34 729.9 dd nd en en De [ee [ee ee [a [a ee re bb [a fa ee ween 128 (268 [6206 509 (988 [2098 Wer 080 900 [TR ones == TE ae SES ee a [eee ee er ee ee a [ee eee [ea eere oee [oe [a [a [a [ae [ae [ae ee Bei JI B ee ee en CHO = cholesterol, DES = desmosterol, 24MC = 24-methyleencholesterol, CMP = campesterol, STIGM = stigmasterol, b-SIT = b-sitosterol, ISF = isofucosterol, ZYM = zymosterol, ERG = Toediening van sterolvoedingsstoffen via micro-organismen De commerciële productie van dieren vereist de ontwikkeling van kosteneffectieve maar nutritioneel optimale voeders.

Commerciële stuifmeelvervangers voor honingbijen worden geproduceerd op basis van zaadmeel en biergist en bevatten niet alle sterolen die bijen nodig hebben om broed te produceren, en de sterolen die het wel bevat, zijn niet in de optimale verhoudingen aanwezig (vergelijkende tabel 1. Herbert et al. 1980). Twee van de belangrijkste en overvloedigste sterolen die in de huidige bijenvoeding ontbreken (vergelijk tabel 1) zijn 24-methyleencholesterol en isofucosterol.

Andere steroïden zoals desmosterol en stigmasterol zijn in kleinere hoeveelheden aanwezig, maar kunnen even relevant zijn.

Bovendien bevatten commerciële voedingsmiddelen ook aanzienlijke hoeveelheden ergosterol: een sterol dat niet in bijenweefsels voorkomt en schadelijk is, omdat we hebben ontdekt dat het een stof is die bijen vermijden op te eten als ze een keuze hebben.

Schade wordt veroorzaakt door het vermijden van het eten van een voedingsmiddel en door het voeden van ziekteverwekkers of het veroorzaken van directe schade via metabolische routes.

Een stam van een panel van stammen die zeldzame sterolen levert aan ongewerveld voedsel, heeft bredere toepassingen als bron van sterolen voor ongewervelde dieren: = cholesterol voor geleedpotigen = 24-methyleencholesterol voor ongewervelde zeedieren, zoals weekdieren die in de aquacultuur worden gekweekt (kokkels, oesters, inktvis) = Andere insecten - hommels, rode metselbilen, angelloze bijen, sprinkhanen, krekels, meelwormen, en zwarte soldaatvliegen Het principe voor het maken van dergelijke giststammen is welbekend bij diegenen die ervaring hebben met deze kunst: =» Een ergosteroldeficiënte stam van S. cerevisiae kan bijvoorbeeld worden gemaakt door de genen erg4 en erg 5 in S. cerevisiae te deleten (bv.

BG4742 erg4 erg5 Japans papier). Hetzelfde kan worden gedaan in Yarrowia lipolytica door de orthologen van erg4 en erg 5 te deleten.

Een dergelijke stam met een tekort aan ergosterol kan tot expressie worden gebracht van 24-methyleencholesterol als voornaamste sterol door expressie van het St DWF5 cDNA of een enzym met dezelfde acitviteit in deze stam (stam T21). Expressie van het SSR2-gen in deze 24-methyleencholesterol accumulerende stam resulteerde in de productie van cholesterol. = Een giststam uit S. cerevisiae die desmosterol als voomaamste sterol produceert, kan worden gemaakt door het gistgen erg6 (of zijn ortholoog in Y. lipolytica of in andere gistsoorten) te deleten en St DWF5 of een enzym met dezelfde activiteit tot expressie te brengen (stam T31). Expressie van het SSR2-gen in deze desmosterol accumulerende stam resulteerde in de productie van cholesterol. = Een ergosteroldeficiënte stam van S. cerevisiae kan bijvoorbeeld worden gemaakt door de genen erg4 en erg 5 in S. cerevisiae te deleten (bv.

BG4742 erg4 erg5, Sawai et al. 2014). Hetzelfde kan worden gedaan in Yarrowia lipolytica door de orthologen van erg4 en erg 5 te deleten.

Een dergelijke ergosteroldeficiënte stam kan isofucosterol als primair sterol tot expressie brengen door het SMT2 cDNA of een enzym met dezelfde activiteit in deze stam tot expressie te brengen (stam T55, zie fig.). = Een ergosteroldeficiënte stam van S. cerevisiae kan bijvoorbeeld worden gemaakt door de genen erg4 en erg 5 of erg5 alleen in S. cerevisiae te deleten (bv.

BG4742 erg4 erg5, Sawai et al. 2014). Hetzelfde kan worden gedaan in Yarrowia lipolytica door de orthologen van erg4 en erg 5 te deleten). Een dergelijke ergosteroldeficiënte stam kan tot expressie worden gebracht van campesterol als het primaire (290%) sterol door expressie van het DWF1 cDNA of het DHCR7-gen van een enzym met dezelfde activiteit in deze stam (stam T55). Een gist die cholesterol als voomaamste sterol (290%) produceert, kan ook worden gemaakt door de erg 5- en erg 6-genen van de gist te deleten en de DHCR24- en DCHR7- enzymen tot expressie te brengen (zie stam RH6829). Tabel 2. Gist gemanipuleerd om specifieke sterolen tot expressie te brengen die in bijenweefsels worden aangetroffen Sterol | Gist sp.

Genen Geschrapt | Referentie ingevoegd | e genen 24MC | S. cerevesiae | St DWF5 Aerg4, Sawai et al. 2014 Plant Cell26 Aerg5 9):3763-3774 b-SIT | S. cerevesiae | AtDWF7, Aerg4, Xu et al. 2020 ACS Synth.

AtDWF5, Aare, Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 AtDWF1, Aare2 AtSMT2 AtDWF7 Xu et al. 2020 ACS Synth.

Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 CMP Y. lipolytica XIDHCR7 Aerg5 Du etal 2016 PLoS One 11(1):e0146773 CMP Y. lipolytica XIDHCR7 x2 | Aerg5 Qian et al. 2020 Toegepaste microbiologie en biotechnologie 104:7165-7175 CMP Y. lipolytica DHCR7 ACL en Zhang et al.

Biotech Letters POX2 39:1033-1039 CHO S. cerevesiae | DrDHCR7, Aerg5, Souza et al. 2011 Metab Eng DrDHCR24 | Aerg6 13(5):555-569; CHO P. pastoris DrDHCR7, Aerg5, Hirz et al. 2013 Appl Microbiol DrDHCR24 | Aerg6 Biot. 97(21):9465-9478 CHO S. cerevesiae | StDWF5, Aerg6 Sawai et al. 2014 Plant Cell26 StSSR2 9):3763-3774 CHO S. cerevesiae | StDWFS5, Aerg4, Sawai et al. 2014 Plant Cell26 StSSR2 Aerg5 (9):3763-3774 CHO Y. lipolytica SSR2, Aerg5 Xu et al. 2020 ACS Synth.

StDWF5 Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 Y. lipolytica | StDWF5 Xu et al. 2020 ACS Synth.

Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 a ee Ee 6(6): e21316. (9):3763-3774 AtDWF7 Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 pastoris = Piscia pastoris Er bestaan verschilende methoden om het expressieniveau van metabolieten in giststammen op te voeren tot aanzienlijk hogere niveaus, die welbekend zijn bij mensen die deskundig zijn op dit gebied.

Voorbeelden zijn: = Met Y. /polytica als gistsoort versus S. cerevisiae, =» Toevoeging van kopieën of overexpressie van specifieke enzymen in de pathway, zoals het DWF7-gen | dwf5/dwf1-expressiestam, = Vervanging van regulerende elementen in genen in de pathway om bronnen of knelpunten in de pathway weg te nemen, = Vervanging van genen de pathway door orthologe genen van andere organismen, =» Toevoeging van exemplaren of overexpressie van een algemene inducerende factor van de steroïdroute, = Selecteren van de stam onder hitte of selecteren van stammen die beter bestand zijn tegen stress door ionische vloeistoffen, = Verandering van het substraat waarop de gist wordt gekweekt, =» Ronden van mutatie en selectie om hoog producerende stammen te identificeren, ‚ Wijziging van de expressieniveaus in de sterol-ester- en sterol-acetaatroute, leidend tot opheffing van de negatieve terugkoppelingsremming op cholesterolproducerende enzymen.

Ongewervelde antinutriënten Daarom beschikt een fabrikant van bijenvoeding over zeer weinig in de handel verkrijgbare en voor de kosten aanvaardbare bronnen van de specifieke fytosterolen die voor bijen van belang zijn en die in een formule kunnen worden verwerkt in de juiste samenstelling, hoeveelheid en verhoudingen die voor bijen van belang zijn.

De huidige voeders zijn daarom per definitie uit voedingsoogpunt onvolledig, omdat essentiële sterolen ontbreken.

Gisten zoals Saccharomyces cerevisiae en Yarrowia lypolitica zijn enkele van de belangrijkste micro-organismen die worden gebruikt voor de commerciële productie van vetten en andere vetafgeleide verbindingen zoals sterolen en steroïden.

Veel zeealgen en diatomeeën die een uiteenlopende reeks sterolen bevatten, worden ook gemanipuleerd om lipideverbindingen te produceren (Rampan et al. 2010, Gallo et al. 2020). Bovendien zijn verschilende plantensoorten gemanipuleerd om specifieke sterolen of lipideverbindingen te produceren of tot expressie te brengen (Sawai et al. 2014). Ongewervelde dieren zijn niet op grote schaal gemanipuleerd voor het gehalte aan lipiden of sterolen, maar hebben het potentieel om dat in de toekomst te worden als informatie over hun genomen en metabolische routes wordt onthuld.

De meeste van deze bronnen bevatten zeer lage gehalten aan sterolen en zouden als geheel niet in bijenvoedsel kunnen worden verwerkt zonder de sterolen te concentreren of te extraheren, wat kostenverhogend is.

Sommige schimmels, waaronder S. cerevisiae, Torula kunnen in bijenvoeder worden verwerkt als bron van eiwitten, vitaminen, aminozuren.

De gist die tegenwoordig in de levensmiddelen- en diervoederindustrie wordt gebruikt, heeft producten die volledig op gist zijn gebaseerd.

Deze specifieke gisten bevatten echter antinutriënten voor bijen.

Bovendien moeten in een commercieel bijenvoeder alle vereiste voedingselementen (eiwitten, vetten, micronutriënten, mineralen) worden verwerkt uit commercieel aanvaardbare en beschikbare bronnen.

De beschikbare voederbronnen bevatten slechts sporen van sommige van de fytosterolen die bijen nodig hebben (tabel 1) en als deze sterolen aanwezig zijn, zijn ze niet aanwezig in de voor bijen geschikte verhoudingen.

De momenteel beschikbare voederbronnen kunnen dus niet worden gebruikt om de gewenste gehalten en samenstelling te bereiken zonder de concentratie van andere voedingsstoffen in gevaar te brengen.

Verder is er geen commercieel beschikbare rendabele bron van isofucosterol, 24- methyleencholesterol, cholestanol, desmosterol of andere sterolen of stanolen die ongewervelde dieren nodig hebben.

De enige in de handel verkrijgbare bron van cholesterol als toevoegingsmiddel voor diervoeding die niet is verontreinigd met antinutriënten, is afkomstig van een extract van dierlijke oorsprong (schapenwol of pluimveeproducten). Een oplossing voor bovenstaand probleem is het gebruik van een micro-organisme of een alg of een ander ongewerveld dier of een combinatie van dergelijke organismen die van nature of na metabole engineering, mutatie of selectie, niet het antinutriënt ergosterol of andere antinutriënten bevatten. Een andere mogelijkheid is om in het ongewervelde diervoeder een gist of een ander micro-organisme op te nemen dat in plaats van ergosterol de gewenste sterolen produceert via metabolic engineering, mutatie of selectie. Ten derde zou men ook een extract van een dergelijk organisme kunnen gebruiken dat de sterolen bevat. Niet-pollen samenstelling De samenstelling van de uitvinding is bij voorkeur een niet-pollen samenstelling.

De eigenschap "niet-stuifmeelhoudend" betekent in wezen vrij van stuifmeel. Er kunnen echter kleine hoeveelheden stuifmeel aanwezig zijn in de samenstellingen van de huidige uitvindingen. In één belichaming is de hoeveelheid stuifmeel 15 w% of minder, bij voorkeur 10 w% of minder, nog liever 5 w% of minder en nog liever 1 w% of minder en nog liever 0,1 w% of minder in verhouding tot het drooggewicht van de samenstelling.

In een andere belichaming is de samenstelling een stuifmeelvervangende samenstelling die een stuifmeeldieet vervangt.

Ongewervelden Ongewervelde soorten zijn de meest diverse dieren op aarde. Zij zijn belangrijke componenten van natuurlijke ecologische systemen en spelen een sleutelrol bij de productie van menselijk voedsel. Een steeds belangrijker onderdeel van de voedselproductie betreft de teelt van ongewervelde dieren zoals insecten, schaaldieren en weekdieren als voedsel voor mens en dier en voor hun rol in ecosysteemdiensten zoals bestuiving. Insecten worden ook gekweekt als natuurlijke vijanden van plaaginsecten en uitgezet als onderdeel van strategieën voor geïntegreerde plaagbestrijding.

Ongewervelde dieren omvatten = geleedpotigen, zoals insecten, spinachtigen, schaaldieren, en myriapoden, = weekdieren, zoals chitons, slakken, tweekleppigen, inktvissen en octopussen, = eencelligen, zoals regenwormen en bloedzuigers; en = cnidarianen, zoals hydra's, kwallen, zeeanemonen en koralen.

Ongewervelde dieren die bij voorkeur worden gekweekt of gekweekt voor menselijke of dierlijke voeding, zoals bijen, hommels, regenwormen, meelwormen, gamalen, rivierkreeften, krekels en vliegenlarven, hebben de voorkeur. Ongewervelde dieren van de familie van de Apidae, die worden gebruikt als bestuivers voor land- en tuinbouwgewassen, hebben de voorkeur, zoals = bijen van het geslacht Apis, in het bijzonder Apis mellifera of = hommels van het geslacht Bombus en in het bijzonder Bombus terrestris Dosering en concentratie De ongewervelde voedingsstof, met name het cholesterol, desmosterol, 24- methyleencholesterol, 24-methylenecholst-7-enol, cholestanol, 7-dehydrocholesterol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol of fucosterol, wordt toegediend in een hoeveelheid die vanuit voedingsoogpunt doeltreffend is voor ongewervelde dieren.

In één belichaming betekent voedingskundig doeltreffend een concentratie van ongewervelde voedingsstoffen, in het bijzonder cholesterol, desmosterol, 24- methyleencholesterol, 24-methylenecholst-7-enol, cholestanol, 7-dehydrocholesterol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol of fucosterol of mengsels daarvan in een hoeveelheid van 001 w% tot 5 w%, bij voorkeur van 0,02 w% tot 2 w%, en nog meer bij voorkeur van 0,03 w% tot 0,6 w% van het drooggewicht van de stuifmeelvervangende samenstelling.

In één belichaming bedraagt de dosis isofucosterol die een imker voor een kolonie honingbijen zou gebruiken, ongeveer 0,1-0,5% van het totale gewicht van het rantsoen. Als elke voedsterbij 120 mg weegt en 10-15 mg voedsel per dag consumeert, en als een kolonie bijen voor ongeveer 50% uit voedsterbijen of jongvolwassen werkbijen bestaat, zou dit neerkomen op 5-25 mg isofucosterol per kolonie per dag.

Inéén geval, voor een hommelkolonie van 300 bijen, moet het dieet isofucosterol bevatten in hoeveelheden van 0,3-0,8% van het totale gewicht van het dieet. Als elke hommel ongeveer 200 mg weegt en 20 mg voedsel per dag consumeert, en als alle bijen het voedsel consumeren, dan zou de effectieve dosis isofucosterol 2-5 mg per dag per kolonie zijn.

VOORBEELDEN Vergelijkend voorbeeld 1: Sterolvoedingsstoffen- en antinutriëntengehalten in commercieel bijenvoer In de handel verkrijgbare bijenvoedersamenstellingen zonder pollen bevatten geen essentiële nutriënten en wel antinutriënten, zoals blijkt uit de vergelijkende tabel 1 hieronder.

Vergelijkende tabel 1: Tabel 1. Sterolsamenstelling (% totaal van de relevante sterolen) van bijen en commerciële stuifmeelvervangers Honingbijen CHO | DES 24-M CAMPE | STIGM | B-SITO | ISOFUC Totaal

(9/9) Door bijen | 1.0 0.2 49.0 4.6 13.1 31.1 1587.9 verzameld gemengd stuifmeel ws = Koninklijke 19 | 2.0 62.8 5.5 17.5 837.9 gelei e= [no =| [|] [en m ee m2 1e 105 [ar] 8 je = [pels er 108 [86] | e= | =| [|] oe [res ae] | Ki ee ga ss [90 0] TE | PP || (PPS vos CAO MR OUT | PE | 9 |M | 09 PPS pe [me 98 [er 15e [es] 05 jean ps [ml | | 88 17 | 82] 0 | er | 08 90] 01 | Pe | 55 | 37 09 | a ess | | ee | CHO = cholesterol, DES = desmosterol, 24M = 24-methyleencholesterol, CAMPE = campesterol, STIGM = stigmasterol, b-SITO = b-sitosterol, ISOFUCO = isofucosterol Voorbeeld 1 - Voorkeur essay: Bijen geven de voorkeur aan specifieke concentraties isofucosterol in voedsel.

Pas uitgekomen volwassen werkhommels (Apis mellifera) en volwassen werkhommels (Bombus terrestris) werden getest in een tweekeuzetest waarbij de bijen toegang hadden tot twee diëten en ad libitum toegang hadden tot water.

Het ene dieet bevatte het isofucosterol en het andere bevatte geen sterol.

Pas uitgekomen bijen werden uit het broedraam gehaald en cohorten van 30 bijen per replicaat werden ondergebracht in plastic opfokkooien.

In alle experimenten werden 10 cohorten van -30 bijen elk gebruikt voor elke behandelingsgroep.

In alle diëten werd het koolhydraatgehalte op 60% gehouden met poedersuiker en het vetgehalte op 8% met een emulsie.

Maltodextrine werd gebruikt als variabele vulstof.

De consumptie van elk dieet werd om de 24 uur gemeten gedurende 5 dagen.

De voorkeursindex werd berekend als (hoeveelheid geconsumeerd van de behandeling - hoeveelheid geconsumeerd van de controle)/(totale hoeveelheid geconsumeerd voedsel). In voorbeeld 1 werd aan cohorten bijen de keuze gegeven tussen een dieet met of zonder isofucosterol.

De bijen gaven de voorkeur aan voedsel dat ten minste 0,05 % isofucosterol in het voedsel bevatte, zoals blijkt uit figuur 1. Voorbeeld 2 - Overleving: bijen leven langer van voedsel dat isofucosterol bevat Pas uitgekomen volwassen werkbijen werden gevoed met een dieetbehandeling en ad libitum toegang tot water.

Het behandelde dieet bevatte het isofucosterol.

Pas uitgekomen bijen werden uit het broedraam gehaald en cohorten van 30 bijen per replicaat werden ondergebracht in plastic opfokkooien.

In alle experimenten werden 10 cohorten van -30 bijen elk gebruikt voor elke behandelingsgroep.

In alle voeders werd het koolhydraatgehalte op 60% gehouden met poedersuiker en het vetgehalte op 8% met een emulsie.

Maltodextrine werd gebruikt als variabele vulstof.

De consumptie van elk dieet werd in de loop van het experiment elke dag gemeten.

Het aantal levende bijen in de kast werd gedurende 14 dagen elke dag geteld.

Voorbeeld 2 toont de overleving van cohorten bijen die zich voeden met diëten die specifieke concentraties isofucosterol bevatten (0%, 0,5% en 1% gewicht van het dieet), zoals weergegeven in figuur 2. Voorbeeld 3 - Broedproductie: Honingbijen produceren meer broed met isofucosterol en produceren langer broed.

Honingbijen: Volledig functionele geïsoleerde piepschuim APIDEA-nestkasten, bestaande uit 5 miniframes bevolkt met volwassen werksters en 1 gedekte legkoningin, werden bevolkt met 300-400 mI jonge volwassen werksters (- N<1.000 bijen van gemengde leeftijden). De kolonie bevond zich in een gesloten serre met ventilatie, zodat de honingbijen niet op nectar of stuifmeel konden foerageren.

Elke behandeling werd getest met 3-6 kolonies; elke kolonie werd gevoederd met een pasteitje van 60-100 g (vast voer) op de bovenste voederbak, voorzien van een gaasbodem.

Het voer werd op de eerste dag gegeven en nogmaals op dag 6; de geconsumeerde hoeveelheid werd gemeten op dag 6 en dag 15. Als op dag 6 geen larven of eieren zijn waargenomen, is het experiment beëindigd.

Het aantal afgedekte broedcellen werd op dag 15 geteld.

Het aantal bijenvolken werd bij elke inspectie geschat.

Suikerstroop (34%) en water werden verstrekt in voederbakken in de tent om te voorkomen dat de bijen verhongeren aan koolhydraten en om de foerageeractiviteit te stimuleren.

In voorbeeld 3 werden de bijen gevoederd met een dieet dat 10-18% eiwit, 6% vet, 1% vitaminen/mineralen en > 75% koolhydraten bevatte.

Figuur 3 toont de drempel van voorbeeld 3 voor de invloed van isofucosterol in bijendieet.

Naarmate de concentratie isofucosterol toenam, nam de hoeveelheid broed die in elk volk werd geproduceerd toe (N > 3 volken/behandeling). De poppen en het aantal nieuwe adulten werden gedurende de gehele periode van 10 weken geteld.

Voorbeeld 4 - Broedproductie: Honingbijen produceren meer broed met een meervoud aan sterolen en produceren langer broed.

Voorbeeld 5 - Honingbijen produceren efficiënter broedsel per eenheid eiwit wanneer sterolen aan het voedsel worden toegevoegd Voorbeeld 6 - Honingbijen produceren langer broed met een meervoud van vereiste sterolen dan met enige andere sterolvoorziening Voorbeeld 7 - Overleving: bijen leven langer van voedsel dat astaxanthine bevat Vertaling van Engelse uitdrukkingen in de tekeningen Example Voorbeeld Avoids sterol Vermijdt sterol Prefers sterol Geeft de voorkeur aan sterol Isofucosterol Isofucosterol weight gewicht survival per cohoert overleving per cohoert time (days) tijd (dagen) Capped brood per uni protein per colony Afgedekt broed per uni eiwit per kolonie per 2 week period per periode van 2 weken

Claims (16)

CONCLUSIES

1. Een methode voor het voederen van ongewervelde dieren, bestaande uit: =» een samenstelling te verstrekken die een microbieel organisme of delen, extracten, oliën, mengsels of verfijningen daarvan bevat; en = toediening van de samenstelling aan ongewervelde dieren, = waarbij het microbiële organisme wordt gekozen uit de groep bestaande uit schimmels, algen of bacteriën; en = waarbij het microbiële organisme genetisch gemodificeerd of geselecteerd is om een ongewervelde voedingsstof te produceren .

2. De methode van claim 1, waarbij de ongewervelde voedingsstof wordt gekozen uit de groep bestaande uit sterolen of stanolen, zoals cholesterol, desmosterol, 24- methyleencholesterol, 24-methylenecholst-7-enol, cholestanol, 7- dehydrocholesterol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol en fucosterol.

3. Een methode van claim 1, waarbij de ongewervelde voedingsstof een polyfenolverbinding is uit een van de volgende klassen: proanthocyanidinen of hun subeenheden (catechinen en epicatechinen), flavonoïden, of kaneelzuren.

4. Een methode van stelling 1, waarbij de ongewervelde voedingsstof een carotenoïde of een xanthofyl is, zoals b-caroteen of astaxanthine.

5. De methode van een van de voorgaande beweringen, waarbij het micro- organisme verder is geselecteerd of gemodificeerd om geen ongewervelde antinutriënten tot expressie te brengen of te produceren.

6. De methode van een van de voorgaande beweringen, waarin de ongewervelde antinutriënt een sterol is zoals zymosterol of ergosterol.

7. De methode van een van de voorgaande beweringen, waarbij de samenstelling een volledige ongewervelde voeding, een deel van een ongewervelde voeding of een voedingssupplement is.

8. De methode van een van de voorgaande beweringen, waarbij de samenstelling wordt toegediend aan ongewervelde dieren van de familie der Apidae, in het bijzonder honingbijen of hommels.

9. De methode van een van de voorgaande beweringen, waarbij de samenstelling wordt toegediend a. in vaste vorm, zoals een pasteitje, of in vloeibare vorm, zoals een oplossing of een verstuiver; b. binnen of buiten de korf.

10. De methode van een van de voorgaande beweringen, waarbij het micro- organisme wordt gekozen uit de groep bestaande uit: =» een mariene of zoetwater algensoort, met name een extract, een olie, een mengsel of een raffinage van Ulva /actuca; =» een mariene diatomeeënsoort, met name een extract, een olie, een mengsel of een raffinage van Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira rotula, of Chaetoceros muelleri of microalgen zoals Dunaliella salina of Porphyndium cruentum; en =" een schimmel, met name een extract, een olie, een mengsel of een raffinage van Saccharomyces cerevisiae, Xanthophyllomyces sp. of Yarrowia lipolytica. = De methode van een van de voorgaande beweringen, waarin een chemische, chromatografische of enzymatische modificatiestap wordt uitgevoerd om de ongewervelde voedingsstof te verkrijgen.

11. De methode van een van de voorgaande beweringen, waarin de samenstelling bestaat uit: = eiwitten in een hoeveelheid van 10 tot 50 gew%, bij voorkeur van 20 tot 40 gew%, =» vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, = koolhydraten in een hoeveelheid van 30 tot 90 gew%, bij voorkeur van 50 tot 70 gew%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, = waarbij de totale hoeveelheid componenten 100 % bedraagt en waarbij het % gerelateerd is aan het totale drooggewicht van de samenstelling.

12. De methode van een van de voorgaande claims, waarbij de samenstelling een insectennutriënt bevat, geselecteerd uit dan groep bestaande uit cholesterol, desmosterol, 24-methyleencholesterol, 24-methylenecholst-7-enol campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, cholestanol, 7-dehydrocholesterol, isofucosterol en fucosterol of mengsels daarvan in een hoeveelheid:

=» Van 0,01-5% van de voeding als afzonderlijke bestanddelen, waarbij geen bestanddeel ooit minder dan 0,01% van de voeding uitmaakt, en van 0,1- 5% van de voeding in een mengsel; = als mengsel, bij voorkeur van 0,1-1% en nog meer bij voorkeur van 0,3- 0,5% voor honingbijen en 0,3-0,8% voor hommels, als percentage van het totale gewicht van de stuifmeelvervangende samenstelling; en/of ‚ Waarbij de verhoudingen van de sterolen overeenkomen met de hoeveelheden die in bijen worden aangetroffen (zie tabel 1) = Waarbij de verhoudingen van de gebruikte sterolen overeenkomen met de hoeveelheden van de sterolen die in een doelorganisme worden aangetroffen; = waar de voedingsstoffen plaatselijk worden aangebracht.

13. Een methode volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij de samenstelling een insectennutriënt bevat met polyfenolen in de volgende groepen fenolzuren, proanthocyanidinen, epicatechinen, catechinen en flavonoïden zoals quercetine, naringenine, p-cumaarzuur of mengsels daarvan in een hoeveelheid van 0,01-5% van het rantsoen, bij voorkeur van 0,01-1% en nog meer bij voorkeur van 0,03-0,8% voor hommels, als percentage van het totale gewicht van het rantsoen.01-1% en nog meer bij voorkeur van 0,03-0,5% voor honingbijen en 0,03- 0,8% voor hommels als percentage van het totale gewicht van de stuifmeelvervangende samenstelling en waarbij de overheersende klasse fenolen ofwel proanthocyanidinen ofwel flavonoïden is en ten minste 30% van de totale polyfenolen uitmaakt en bij voorkeur 70-100% van de totale polyfenolen bedraagt.

14. Een methode volgens een voorgaande claim, waarbij de samenstelling een voedingsstof voor insecten bevat, geselecteerd uit de groep carotenoïden of xanthofylen zoals b-caroteen, lycopeen, of astaxanthine of mengsels daarvan, in een hoeveelheid van 0,01-5% van het dieet, bij voorkeur van 0,01-1% en nog meer bij voorkeur van 0,03-0,5% voor honingbijen en 0,03-0,8% voor hommels, als percentage van het totale gewicht van de stuifmeelvervangende samenstelling.

15. De methode van een van de voorgaande beweringen, waarbij de samenstelling in wezen vrij is van pollen.

16. Gebruik van de samenstelling van een van de voorgaande beweringen voor het voederen van ongewervelde dieren, in het bijzonder honingbijen, hommels of angelloze bijen.