BE1030873B1

BE1030873B1 - Isofucosterol en combinaties van isofucosterol en een veelheid van sterolen als voedingsstof voor dieren

Info

Publication number: BE1030873B1
Application number: BE20225727A
Authority: BE
Inventors: Thierry Bogaert; Sharoni Shafir; Geraldine Wright; Jan Bogaert
Original assignee: Apix Biosciences; Phytant
Priority date: 2022-09-13
Filing date: 2022-09-13
Publication date: 2024-04-08
Also published as: WO2024056559A1; BE1030873A1

Abstract

Een methode voor het voederen van ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen, bestaande uit ▪ een samenstelling ter vervanging van stuifmeel die een uit voedingsoogpunt doeltreffende hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan bevat; en ▪ het toedienen van de stuifmeelvervangende samenstelling aan ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen; waarin de stuifmeelsubstituutsamenstelling een uit voedingsoogpunt doeltreffende hoeveelheid ten minste één ander sterol bevat, bij voorkeur ten minste twee andere sterolen, geselecteerd uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-Methylenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol of een fysiologisch beschikbaar conjugaat van één van deze sterolen.

Description

ISOFUCOSTEROL EN COMBINATIES VAN ISOFUCOSTEROL EN EEN VEELHEID

VAN STEROLEN ALS VOEDINGSSTOF VOOR DIEREN

ACHTERGROND

Insecten worden in toenemende mate gebruikt als economisch belangrijke dieren als bestuivers en als dieren die op kosteneffectieve wijze dierlijke eiwitten voor menselijke en dierlijke voeding kunnen produceren met minder gevolgen voor het milieu dan traditionele dierlijke eiwithoudende gewassen (vogels, vissen, zoogdieren). Bijen zijn in de moderne landbouw zeer belangrijk voor de bestuiving van gewassen. Bestuivers worden de laatste tijd bedreigd door blootstelling aan bestrijdingsmiddelen, een grotere prevalentie van ziekteverwekkers en parasieten, en veranderingen in het landschapsbeheer die de overvloed aan natuurlijk voorkomend bloemenstuifmeel verminderen.

Bijenhouders voeden de honingbijenvolken van oudsher met een voedselbron die stuifmeel of pollen bevat die in natuurlijke of agrarische ecosystemen door honingbijen worden verzameld. Het verzamelen van stuifmeel is beperkt qua beschikbaarheid en schaal Ten eerste is het verzamelen van stuifmeel duur. Ten tweede is stuifmeel moeilijk vers te houden. Ten slotte kan stuifmeel dat in natuurlijke of landbouwecosystemen wordt verzameld, ongedierte, ziekten en pesticiden met zich meedragen. Daarom bevatten commercieel verkrijgbare voeders voor bijen meestal geen stuifmeel.

Gebrek aan stuifmeel in voldoende kwaliteit en hoeveelheid is echter een fundamentele reden voor de geconstateerde achteruitgang van de gezondheid en de overleving van bijenkolonies. Honingbijen die natuurlijke stuifmeelbronnen oogsten zetten de hulpbronnen van wilde bijensoorten onder druk en dragen waarschijnlijk bij tot de achteruitgang van hun populatie. Het vervoer van bijenkorven naar stuifmeelgebieden is een fundamentele stressfactor voor bijenvolken en een grote kostenpost voor de bijenteelt.

Een stuifmeelvervanger voor gedomesticeerde bijensoorten zou deze problemen aanpakken.

Bijen halen essentiële voedingsstoffen zoals sterolen uit stuifmeel. Deze sterolen omvatten waarschijnlijk cholesterol, campesterol, bèta-sitosterol of stigmasterol. Oorspronkelijk werk in het USDA Beltsville laboratorium in de jaren 1970 beschrijft het gebruik van sterolen uit stuifmeel door honingbijen die een synthetisch dieet krijgen (Journal of Insect Physiology,

Vol, 26, pp. 287-289). Chakrabarti et al. beschrijven een rol van 24-Methylenecholesterol in de voeding van honingbijen (Chakrabarti, Evaluating effects of a critical micronutrient

(24-Methylenecholesterol) on honeybee physiology, Annals of the entomological society of America, Vol 113, 176-182, 2019). Al deze experimenten zijn echter uitgevoerd met toevoegingen van enkelvoudige sterolen aan een anders sterolvrij dieet. Tot op heden is niet beschreven welke van de vele sterolen en welke sterolcombinaties en concentraties belangrijk of essentieel zijn voor bijen.

US2019/0090507 aan Apix Biosciences benadrukt het belang van plantensterolen en met name van 24-Methyleenecholesterol, campesterol, B-sitosterol en cholesterol.

US2019/0090507 maakt echter geen melding van isofucosterol of fucosterol of een mengsel daarvan met sterolen als belangrijke voedingsstoffen die nodig zijn om een "volledig" voeder voor gedomesticeerde bijen te creëren als voedingssupplement.

Mishyna et a, Joumal of Functional Foods 76 (2021) 104316, doi.org/10.1016/.jff.2020.104316, bespreekt studies over de consumptie van insecten en garnalen met betrekking tot hydrolysaten, hun antioxiderende en angiotensine- converterend enzym remmende activiteiten, vetzuren, cholesterol, mineralen, vitaminen, carotenoïden, fenolische verbindingen, voedingsvezels. In dit document wordt echter geen melding gemaakt van isofucosterol of van de combinatie van cholesterol en isofucosterol.

Soja-eiwit of andere gebruikte eiwitbronnen zoals aardappel bevatten campesterol, bèta- sitosterol, stigmasterol en sporen van desmosterol en isofucosterol (60mg isofucosterol/kg nat gewicht van de aardappel, of 0,006%). (Sirpa O. Kärenlampi, Philip J. White, in

Advances in Potato Chemistry and Technology, 2009) De concentratie van sterolen in deze bronnen ligt onder de voedingsbehoeften van de bijen.

Bij honingbijen maakt isofucosterol 10-50% uit van hun totale lichaamssterolen. Dit komt neer op 0,02-0,06% van het drooggewicht van een honingbij (Svoboda et al. Utilization and metabolism of dietary sterols in the honeybee and the yellow fever mosquito, Lipids

Volume 17 number 3, 1982; onze gegevens). Bij hommels zoals Bombus terrestris vertegenwoordigt isofucosterol 40-55% van hun lichaamssterolen. Deze hoeveelheid bedraagt 0,10-0,25% van het totale drooggewicht van een hommel.

De huidige kunstmatige diëten voor bijen zijn onvolledig, wat leidt tot een aanvankelijke toename van de broedproductie, gevolgd door een snelle daling van de broedproductie na 2240 dagen. Dit wijst erop dat in de huidige voeders een of meer essentiële voedingsstoffen ontbreken. Tot op heden is er echter geen beschreven kunstmatig (stuifmeelvrij) voeder voor bijen dat de verzegelde broedontwikkeling van een kolonie gedurende meer dan 3 tot 4 cycli van 21 dagen kan ondersteunen. Het vermogen van een voeder om de continue broedontwikkeling op lange termijn te ondersteunen is een belangrijke indicator voor de gelijkwaardigheid ervan met stuifmeel en het vermogen om als "volledig voeder” te fungeren. Uit de beste gepubliceerde gegevens blijkt reeds een sterke vermindering van de broedproductie vanaf cyclus 2 (Herbert et al. (1980), J. Insect

Physiol., Vol. 26, pp. 287 tot 289; doi.0rg/10.1186/s12917-022-03151-5; Bee Culture

Education: Honeybee Nutrition - Randy Oliver - Part 1 to 4, Youtube). Aangezien er in veel gebieden waar bijen worden gehouden voor bestuiving of honingproductie een tekort is aan stuifmeel in kwaliteit en kwantiteit, is er behoefte aan samenstellingen en methoden voorbijenvoeding om een kolonie langdurig op een kunstmatig dieet te houden waarbij de bijen onbeperkt broedsel blijven produceren.

De huidige stufmeelvrije kunstmatige diëten voor bijen zijn onvolledig, zodat bijen die met deze diëten worden gevoed, na 3-4 cycli van 21 dagen broedproductie in de kolonie verstoken of uitgeput raken van essentiële voedingsreserves (Herbert et al. (1980), J.

Insect Physiol., Vol. 26, pp. 287 tot 289). Hier tonen wij aan dat wij door toevoeging van isofucosterolfucosterol en een veelvoud aan sterolen een dieet verkrijgen dat de broedproductie en de ontwikkeling van de kolonie in een kolonie gedurende meer dan 4 cycli in stand houdt, hetgeen suggereert dat ons dieet het gebrek aan een of meer essentiële voedingsstoffen in de huidige kunstmatige diëten ondervangt. Hieruit blijkt dat deze uitvinding resulteert in een nieuw dieet dat de bijen voorziet van de noodzakelijke beperkende bestanddelen die zij nodig hebben. Met een dergelijk stuifmeelvrij dieet kan een kolonie gedurende langere perioden van haar levenscyclus zonder natuurlijk stuifmeel in leven worden gehouden, wat een belangrijke ontwikkeling is die de bijenteelt radicaal kan verbeteren.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

Terwijl bij dieren slechts enkele sterolen bestaan, waarvan cholesterol veruit de belangrijkste is, wordt bij planten een breed scala aan sterolen aangetroffen. De structurele verschillen daartussen vloeien voort uit verschillende substituties in de zijketen en het aantal en de positie van dubbele bindingen in het tetracyclische skelet. Plantensterolen kunnen worden gegroepeerd op basis van de aan- of afwezigheid van een of meer functies. Zij kunnen bijvoorbeeld op basis van het ethyleringsniveau op C4 als volgt in drie groepen worden ingedeeld: 4-desmethylsterolen of eindproductsterolen, 4 alfa- monomethylsterolen en 4,4diethylsterolen. Tot de natuurlijk voorkomende 4-

desmethylsterolen behoren sitosterol, stigmasterol, brassicasterol, campesterol, avenasterol en isofucosterol. In de meeste hogere planten zijn sterolen met een vrije 3- hydroxylgroep (vrije sterolen) de belangrijkste eindproducten. Sterolen komen echter ook voor als conjugaten, bijvoorbeeld wanneer de 3-hydroxygroep veresterd is met een vetzuurketen of fenolzuur om een sterylester te verkrijgen. In deze beschrijving verwijst de term sterol zowel naar vrije sterolen als naar geconjugeerde sterolen. In deze specfficatie hebben verwijzingen naar niveaus, hoeveelheden of percentages sterol echter betrekking op het totale gewicht van de sterolgroepen, waarbij het gewicht van de conjugerende groepen zoals vetzuur of fenolzuur buiten beschouwing wordt gelaten. In dit document wordt fucosterol gedefinieerd als fucosterol of het isofucosterol of een mengsel van beide isomeren. In dit document wordt isofucosterol gedefinieerd als isofucosterol of zijn isomeer fucosterol of een mengsel van beide isomeren.

Wanneer in dit document een dosis of hoeveelheid voer wordt beschreven als x gram (of andere hoeveelheid) in een periode van twee weken (of andere tijdsperiode), is dit bedoeld als algemene beschrijving van "dosis gegeven in een tijdseenheid" en niet als specifieke beperking van de specifieke eis om twee keer per week te voeren. Een geoefend persoon kan een wekelijks doseringsschema omrekenen naar een dagelijkse of tweewekelijkse dosis of een soortgelijke tijdsperiode.

De huidige uitvinders hebben op verrassende wijze vastgesteld dat isofucosterol een essentiële voedingsstof is voor bijen. Isofucosterol geleverd via een stuifmeelvrij dieet verhoogt de bijenbroedproductie en de overleving van werkbijen in vergelijking met een isofucosterolvrij stuifmeelvervangend bijendieet. De huidige uitvinders hebben voorts vastgesteld dat de combinatie van isofucosterol en ten minste één ander sterol, met name cholesterol, 24-Methylenecholesterol, en andere fytosterolen, met name campesterol, bèta-sitosterol of stigmasterol, betere groei- en/of gezondheidsprestaties oplevert bij ongewervelde dieren, met name bijen en andere stuifmeeletende insecten, dan isofucosterol alleen.

Dit nut is van belang bij de samenstelling van niet-pollenvoer ter aanvulling van honingbijenvolken in perioden van stuifmeelschaarste in het milieu (tegenwoordig een belangrijke oorzaak van slechte prestaties van bijenvolken), bij de productie van superieure honingbijenkoninginnen en bij de commerciële kweek van stuifmeeletende insecten zoals zwarte soldaatvliegen als alternatieve eiwitbron voor menselijke en dierlijke voeding, hommels (voor bestuiving), lieveheersbeestjes (voor bladluisbestrijding); zweefvliegen (voor bestuiving) en andere commercieel relevante insecten.

Dienovereenkomstig is een eerste aspect van de uitvinding een methode voor het voederen van ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen, bestaande uit 5 =» een samenstelling ter vervanging van stufmeel die een uit voedingsoogpunt doeltreffende hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan bevat; en =» het toedienen van de stufmeelvervangende samenstelling aan ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen; waarin de stuifmeelsubstituutsamenstelling een uit voedingsoogpunt doeltreffende hoeveelheid ten minste één extra sterol bevat, bij voorkeur ten minste twee extra sterolen, geselecteerd uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-

Methylenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol of een fysiologisch beschikbaar conjugaat daarvan.

Eenander aspect van de ongewervelde dieren zijn insecten die stuifmeel eten, bij voorkeur insecten van de orden Hymenoptera en Coleoptera, bij voorkeur honingbijen, hommels, zwarte soldaatvliegen, zweefvliegen of lieveheersbeestjes.

Een ander aspect is dat de aquacultuurorganismen plankton- en algenetende aquacultuurorganismen zijn, bij voorkeur vissen, vislarven, oesters, kokkels, weekdieren, buikpotigen of schaaldieren.

Bij een ander aspect is de uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan een dagelijkse dosis van 0,0006 w% tot 0,052 w% van het levende lichaamsgewicht van de ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen.

Bij een ander aspect bedraagt de uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan 10 tot 60 % van de totale hoeveelheid sterolen van de groep isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol in de totale voeding van de ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen of de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

Bij een ander aspect wordt het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan toegediend in een verhouding van 0,14 g tot 12 g isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan per 30000 bijen per periode van twee weken.

Bij een ander aspect wordt het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan toegediend in een hoeveelheid van 10 tot 60 gewichtspercenten van de totale hoeveelheid sterolen van de groep isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol in het totale dieet van de ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen of van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

Bij een ander aspect is de uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en het ten minste één andere sterol een toedieningsverhouding van 0,2 tot 48 gram per 30000 bijen per periode van twee weken, en het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan wordt toegediend in een hoeveelheid van 10 w% tot 60 w% van de totale hoeveelheid sterolen van de groep isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol in het totale dieet van de bijen of van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

Bij een ander aspect wordt het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en het ten minste één andere sterol toegediend in een verhouding van 0,4 g tot 36 g per 30000 bijen per periode van twee weken, en wordt het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan wordt toegediend in een hoeveelheid van 10 tot 60 w% van de totale hoeveelheid sterolen van de groep isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol in het totale dieet van de bijen of van de stuifmeelsubstituutsamenstelling. — Bi;een ander aspect wordt het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en het ten minste één andere sterol toegediend in een verhouding van 0,6 g tot 20 g per 30000 bijen per periode van twee weken, en wordt het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan wordt toegediend in een hoeveelheid van 10 tot 60 w% van de totale hoeveelheid sterolen van de groep isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol in het totale dieet van de bijen of van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

Bij een ander aspect wordt het isofucosterol, het fucosterolcholesterol, het 24-

Methyleenecholesterol, het bèta-stigmasterol, het stigmasterol en/of het campesterol toegediend in een totale hoeveelheid van 0,001 w% tot 0,087 w% van het levensgewicht van de ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen per dag.

Bij een ander aspect is de uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid: = isofucosterol in een hoeveelheid van 10 tot 60 gewichtspercenten,

= cholesterol in een hoeveelheid van O tot 50 gewichtspercenten, = 24 Methyleenecholesterol in een hoeveelheid van O tot 50 gewichtspercenten, = betasitosterol, stigmasterol en/of campesterol in een hoeveelheid van 0 tot 50 gewichtspercenten ten opzichte van de totale hoeveelheid isofucosterol, fucosterolcholesterol, 24-

Methyleenecholesterol, betasitosterol, stigmasterol en/of campesterol.

Een ander aspect is dat de totale concentratie aan sterolen van 0,01 w% tot 4 w% bedraagt, bij voorkeur van 0,05 w% tot 3 w% en nog liever van 0,05 w% tot 2 w%, en nog liever van 0,05 w% tot 15 w% ten opzichte van het totale gewicht van de pollenvervangende samenstelling.

Bij een ander aspect worden de concentraties sterolen gekozen uit de groep van: = Cholesterol in een hoeveelheid van 0,001 w% tot 2 w%, bij voorkeur van 0,001 w% tot 1,5 w%, meer bij voorkeur van 0,06 w% tot 1,2 w% ten opzichte van het totale gewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling, = 24-Methyleenecholesterol in een hoeveelheid van 0,001 w% tot 2 w%, bij voorkeur van 0,001 w% tot 1,5 w%, meer bij voorkeur van 0,06 w% tot 1,2 w% ten opzichte van het totale gewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling, = Sitosterol, bij voorkeur beta-sitosterol in een hoeveelheid van 0,001 w% tot 2 w%, bij voorkeur van 0,001 w% tot 1 w%, meer bij voorkeur van 0,03 w% tot 0,6 w% ten opzichte van het totale gewicht van de pollenvervangende samenstelling, = Isofucosterol in een hoeveelheid van 0,01 w% tot 5 w%, bij voorkeur van 0,01 w% tot 2 w%, meer bij voorkeur van 0,01 w% tot 1,0 w%, meer bij voorkeur van 0,03 w% tot 06 w% ten opzichte van het totale gewicht van de pollensubstituutsamenstelling, = Campesterol in een hoeveelheid van 0,001 w% tot 2 w%, bij voorkeur van 0,001 w% tot 1 w%, meer bij voorkeur van 0,02 w% tot 0,35 w%, ten opzichte van het totale gewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling, = Stigmasterol in een hoeveelheid van 0,001 w% tot 2 w%, bij voorkeur 0,001 tot 1 w%, meer bepaald 0,01-0,2%, ten opzichte van het totale gewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling, of

= elke combinatie daarvan.

Bij een ander aspect is de samenstelling een volledig ongewerveld dieet, een deel van een ongewerveld dieet of een voedingssupplement en waarin de verhouding tussen 24-

Methyleenecholesterol en het verdere sterol of de combinatie van verdere sterolen 10:1 tot 1:1 bedraagt.

Een ander aspect is dat de samenstelling wordt toegediend aan ongewervelde dieren van de familie Apidae, met name honingbijen (Apini), hommels (Bombini) of angelloze honingbijen (Meliponini).

Bij een ander aspect wordt de samenstelling toegediend = in vaste vorm zoals een pastei of poeder of in vloeibare vorm zoals een oplossing, olie of spray; = binnen of buiten de korf.

In één belichaming is de samenstelling vrijwel zuiver, d.w.z. bestaande uit 50 w% of meer, bij voorkeur 70 w% of meer, nog liever 90 w% van de groep isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol in het totale dieet van de bijen of van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

In één belichaming is de samenstelling vrijwel zuiver, d.w.z.

Bij een ander aspect is de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan een niet-pollen weefsel van een of meer plantensoorten, gekozen uit de groep bestaande uit bladeren, stengels, wortels, knollen, bloemen, zaden, schors en vruchten en combinaties daarvan.

Bij een ander aspect is de bron van het verdere sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-mecholesterol, campesterol, en bèta-sitosterol, en stigmasterol, een stufmeelsubstituutweefsel van een of meer plantensoorten, gekozen uit de groep bestaande uit bladeren, stengels, wortels, knollen, bloemen, zaden, schors en vruchten en combinaties daarvan.

Bij een ander aspect is de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan of de bron van ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol en betasitosterol, en stigmasterol, een extract,

een olie of een raffinage van een stuifmeelsubstituutweefsel van één of meer plantensoorten of een combinatie daarvan.

Bij een ander aspect is de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan of de bron van ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-Methylenecholesterol, campesterol, en bèéta-sitosterol en stigmasterol, een stuifmeelsubstituutweefsel van één of meer plantensoorten, gekozen uit de groep bestaande uit Solanaceae, Poaceae, Ranunculaceae, Fabaceae, Corylaceae.

Bij een ander aspect is de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan of de bron van ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24Methyleenecholesterol, campesterol, en bèta-sitosterol en stigmasterol, een stuifmeelsubstituutbron, gekozen uit de groep bestaande uit: =" een mariene of zoetwater algensoort, met name een extract, een olie of een raffinage van Ulva lactuca; 2 een mariene diatomeeënsoort, met name een extract, een olie of een raffinage van Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira rotula of

Chaetoceros muelleri; en =" een schimmel, met name een extract, een olie of een verfijning van een gist zoals Saccharomyces cerevisiae of Yarrowia lipolytica.

Een ander aspect is dat het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en/of ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-

Methylenecholesterol, campesterol, betasitosterol en stigmasterol, chemisch of enzymatisch wordt gesynthetiseerd of verkregen door genetisch gemodificeerde gastheerorganismen zoals schimmels, bacteriën of algen.

Bij een ander aspect is de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan of het ten minste één extra sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-

Methylenecholesterol, campesterol en bèta-sitosterol, en stigmasterol, gekozen uit de groep bestaande uit algen, planten, schimmels, algen, diatomeeën en combinaties daarvan en waarin de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan een stuifmeelsubstituut is.

Een ander aspect is dat het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-

Methyleenecholesterol, campesterol, bèta-sitosterol en stigmasterol, aan een eusociale bijenkolonie wordt verstrekt uit een synthetische bron.

Bij een ander aspect worden het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en de een of meer andere sterolen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-

Methylenecholesterol, campesterol, stigmasterol en beta-sitosterol, en stigmasterol geleverd als onderdeel van een stuifmeelsubstituutsamenstelling, waarbij de stuifmeelsubstituutsamenstelling bestaat uit: =» eiwitten in een hoeveelheid van 10 w% tot 50 w%, bij voorkeur van 15 w% tot 40 w%, = vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, =» koolhydraten in een hoeveelheid van 20 w% tot 90 w%, bij voorkeur van 30 w% tot 70 w%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, waarin de totale hoeveelheid componenten opgeteld 100 w% bedraagt en waarin de w% betrekking hebben op het totale drooggewicht van de samenstelling.

In een ander opzicht is de samenstelling ter vervanging van stuifmeel vrij van stuifmeel.

Een ander aspect is dat de samenstelling van de pollenvervanger wordt gebruikt voor het voeden van een organisme, gekozen uit de groep bestaande uit: = ongewervelde dieren, bij voorkeur insecten die stuifmeel eten, bij voorkeur insecten van de orden Hymenoptera en Coleoptera, bij voorkeur honingbijen, hommels, zwarte soldaatvliegen, zweefvliegen of lieveheersbeestjes, =» aquacultuurorganismen, bij voorkeur plankton- en algenetende aquacultuurorganismen, bij voorkeur vissen, vislarven, oesters, kokkels, weekdieren, buikpotigen of schaaldieren.

Een ander aspect is het gebruik van de pollensubstitutiesamenstelling van de uitvinding als een geconcentreerde patty, waarbij de concentratie van isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en bèta-sitosterol tussen 10 en 33 % van het totale gewicht van de pollensubstitutiesamenstelling bedraagt.

Een ander aspect van de samensteling ter vervanging van stuifmeel is het eetlustopwekkende bestanddeel voor bijen, geselecteerd uit de groep bestaande uit stuifmeel, suiker, olie of vet, honing, eiwit of een mengsel daarvan. In het geval van andere ongewervelde dieren kan een ander eetlustopwekkend bestanddeel worden gebruikt.

Een ander aspect is dat de concentratie van het bestanddeel dat de eetlust/consumptie van bijen opwekt, varieert van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2,5 w% tot 15 w%, en nog liever van 5 w% tot 10 w% ten opzichte van het totale gewicht van de stuifmeelsubstitutie.

Een ander aspect is dat de stuifmeelvervangende samenstelling in vloeibare vorm of in poedervorm wordt gebruikt.

Bij een ander aspect van het gebruik in vloeibare vorm of in poedervorm bedraagt de concentratie van isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methylenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol 0,01 w% tot 99 w% van het totale drooggewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN

Figuur 1 toont de keuze van cohorten bijen van voeding met of zonder isofucosterol.

Figuur 2 toont de overleving van cohorten bijen die zich voeden met diëten die specifieke concentraties isofucosterol bevatten.

Figuur 3 toont de drempelwaarde voor de invloed van isofucosterol in het bijendieet.

Figuur 4 toont de resultaten van voorbeeld 4A: een langdurig voedingsexperiment in

Apidea-kolonies met bijen die met een veelheid van sterolen, waaronder isofucosterol en 24-Methyleenecholesterol, werden gevoerd.

Figuur 5 toont de resultaten van voorbeeld 4B: Resultaten van een langdurig voedingsexperiment in Apidea-kolonies met bijen die gevoed werden met een veelheid van sterolen zonder isofucosterol maar met 24-Methylenecholesterol.

Figuur 6 toont de resultaten van voorbeeld 4C: Resultaten van een langdurig voedingsexperiment in Apidea-kolonies met bijen die met een veelvoud aan sterolen worden gevoederd, waarbij de totale concentratie sterolen in het dieet constant wordt gehouden en de aanwezigheid (concentratie) van specifieke sterolen tussen de verschillende diëten wordt gevarieerd.

Figuur 7 toont de resultaten van Voorbeeld SA: Het voeren van volwassen zwarte soldaatvliegen met een dieet dat een veelvoud aan sterolen bevat: effect op het aantal gelegde eieren en het gewicht van de gelegde eimassa. De overleving van de volwassen vliegen en het aantal gelegde eimassa's van een populatie die gevoed werd met een stufmeelvervangend dieet (zoals gespecificeerd in US2019/0090507 aan Apix

Biosciences) werd dagelijks gemeten volgens de kweekmethoden beschreven in Thinn en Kainoh 2022. JARQ 56 (2), 211-217 (2022).

Figuur 8 toont de resultaten van Voorbeeld 5B: Het voederen van volwassen zwarte soldaatvliegen met een dieet dat een veelvoud aan sterolen bevat: effect op de levensduur van de volwassen dieren en de overleving van de larven tot het prepupae-stadium. De larven van de zwarte soldaatvlieg (BSF) kregen een dieet met 22% eiwit en 4% vet zoals beschreven in Hogsette 1992. J. Econ. Entomol. 85(6): 2291-2294 tot de ecclosie.

Sterolen werden als zuivere verbindingen rechtstreeks aan het dieet toegevoegd tot een totale hoeveelheid van 0,1%. De overleving van larven en volwassenen gedurende een periode van 50 dagen werd gemeten zoals in Georgescu et al, Eur. J. Entomol. 118: 297- 306, 2021.

Figuur 9 toont de resultaten van Voorbeeld 5C: Het voeren van volwassen zwarte soldaatvliegen met verschillende diëten die een veelheid aan sterolen bevatten: sterolen die zijn aangetroffen in de weefsels van zwarte soldaatvliegen die met een veelheid aan sterolen zijn gevoerd. Sterolen werden toegevoegd aan het dieet. De meting van sterolen in weefsels werd uitgevoerd na verzeping van BSF-weefsels met behulp van GC-MS zoals beschreven in Boukid et al. 2022. Insecten 12, 672.

Figuur 10 toont de resultaten van voorbeeld 6: Het voeren van honingbijenvolken in een

Apidea-experiment met een dieet dat een extract bevat van zwarte soldaatvliegen die een veelvoud aan sterolen te eten kregen.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

Belichamingen van de huidige uitvindingen worden hierna beschreven.

Honingbijen leven in kolonies. In de standaard industriële praktijk zijn er verschillende groottes van kolonies: een kolonie met 8 frames, de industriestandaard, bevat -20000 bijen; een kolonie met 10 frames -24000; een grote kolonie met 12,5 frames in twee verdiepingen = 30000; een kolonie met 2 supers 50000 bijen). In het algemeen hebben bijenvolken een variabele omvang (+/- 50% toename/afname rond het jaargemiddelde, afhankelijk van het seizoen en de beschikbaarheid van voeding).

Rortais et al. 2005 (Apidoiogie, 36(1} 71-83) hebben de literatuur over het stuifmeelverbruik van bijen uitvoerig bestudeerd en hebben vastgesteld dat jaarlijks tot 55 kg per kolonie wordt verzameld. Crailsheim et al. 1993 (J Insect Phys 38(6):409-419) berekenden het jaarlijkse stuifmeelverbruik in twee kolonies op respectievelijk 13,4 en 17,8 kg in kolonies van ongeveer 25000 bijen in juni-augustus. Wille et al. 1982 (Revus Suisse de Zoologie 4 897-214) noteerden 10 tot 26 kg stuifmeel per jaar. Dit hangt uiteraard af van de grootte van de kolonie, de ontwikkeling van de kolonie, de omgeving en het soort stuifmeel.

Keller et al. 2005 (Bes world, 8511}. 3-10} schatten dat elke werkbij gedurende zijn hele leven 140-180 mg stufmeel nodig heeft. Als een hele kolonie 100-200k bijen per jaar grootbrengt, zou dit resulteren in een vraag van 17-34 kg stuifmeel per kolonie. Crailsheim et al. 1993 (J Insect Phys 38(6):409-419) gaven een overzicht van de hoeveelheid stuifmeel die per kolonie werd geconsumeerd uit 5 gepubliceerde artikelen. Zij hebben ook het stuifmeelverbruik gemeten van twee door hen gemeten kolonies. Zij schatten dat de gemiddelde hoeveelheid stuifmeel die nodig is voor een kolonie die -150000 broedsels per jaar produceert 19kg bedraagt.

Wanneer bijenvolken in perioden van stuifmeelschaarste worden bijgevoederd, krijgen Zij dat meestal in de vorm van een eiwitpaté of een stuifmeelpaté (de meeste voederregimes zijn "ad libitum"), wat resulteert in een verbruik van -1,5 tot 2 à 3 pond (0,680-1,35kg) per 12,5 ramen per 2 weken. In de industrie wordt een frame bijen gedefinieerd als -2400 bijen (30000 bijen in de kolonie) en de kasten die in de industrie worden gebruikt kunnen

Sof 8, 10 of 12 frames of zelfs meer bevatten. In het begin van het voorjaarsseizoen is een bijenkorf slechts gedeeltelijk bevolkt (bv. 5 frames in een kast met 10 frames) en naarmate het seizoen vordert, breidt het bijenbestand in die kast zich uit om de kast met 10 frames met bijen te vullen. Tijdens de winter neemt de kolonie dan haar populatie af tot 5-6 bijenkasten.

Bij de berekening van de dosis "mg stuifmeelequivalent voer" die de bijen nodig hebben, moet er rekening mee worden gehouden dat stuifmeel van verschillende plantensoorten een breed scala van -50% suiker, eiwit en andere bestanddelen bevat en dat de voedingswaarde van stuifmeel derhalve per plantensoort verschilt (bereik +/-50%). Door bijvoedering van stuifmeel, stufmeelsupplementen of eiwitsupplementen krijgen de kolonies een dosis van -1,5-—3 Ib of (680g tot 13609) stufmeelsupplement per twee weken. Op jaarbasis komt dit neer op 17,7 kg tot 35,4 kg stuifmeelsupplement, wat overeenkomt met de gepubliceerde cijfers voor een kolonie van 10 kaders die stuifmeel eet, rekening houdend met de variabele voedingskwaliteiten van stuifmeel. Voor kolonies van verschillende grootte worden de dosisberekeningen proportioneel aangepast. (1 bijenvolk = -2400 bijen).

Berekend op basis van de tabel van Roessink et al 2021 (J Apic Res 60: 659-654) verbruikt een kolonie van 30000 bijen 62 gram stuifmeel per dag of 868 gram per 2 weken (in het actieve bloei- & bijenvermeerderingsseizoen).

Een uitgebreidere beschrijving wordt gegeven door de tekst en tabel in onderstaande "Rortais et al. (2005) hebben de literatuur over het stuifmeelverbruik van bijen uitvoerig bestudeerd en hebben vastgesteld dat per kolonie jaarlijks 10 tot 55 kg wordt verzameld.

Crailsheim et al. berekenden het jaarlijkse stuifmeelverbruik in twee kolonies op respectievelijk 13,4 en 17,8 kg in kolonies van ongeveer 25000 bijen in juni-augustus. Wille et al. berekenden 10 tot 26 kg stuifmeel per jaar. Dit hangt uiteraard af van de grootte van de kolonie, de ontwikkeling van de kolonie, de omgeving en het soort stuifmeel. Stuifmeel van maïs wordt bijvoorbeeld in ongeveer de dubbele hoeveelheid geconsumeerd in vergelijking met gemengd stuifmeel, vanwege het relatief lage percentage voedingsstoffen van de hele stuifmeelkorrel. Het eiwitpercentage van het drooggewicht is vergelijkbaar met dat van gemengd stuifmeel (Höcherl et al, 12012). Uiteraard is er geen vaste hoeveelheid die een kolonie kan of moet verzamelen om te groeien, in stand te houden en te functioneren. Toch zijn er goede studies beschikbaar om de jaarlijkse stuifmeelbehoefte van een kolonie in te schatten. Volgens het bovengenoemde artikel van Rortais et al. (2005) verbruikt een voedsterbij gemiddeld 65 mg stuifmeel en een werkster-bij 5,40 mg.

Bijgevolg verbruikt een bij in haar leven minimaal 70,4 mg. Dit is de gemiddelde schatting; er zijn ook dubbele hoeveelheden gemeld. In de bovengenoemde studie van Crailsheim et al. bedroeg de stuifmeelconsumptie per dag 3,4 tot 4,3 mg. Bij een levensduur van 30 dagen van de zomerhoningbij komt dit neer op ongeveer 115 mg. Een andere benadering om de pollenconsumptie te beoordelen wordt gepresenteerd in het overzichtsartikel van

Keller et al, (20054). Het is de beoordeling van het stuifmeelverbruik op basis van stikstof (N) in broed en bijen. Stuifmeel is de enige N-bron in het dieet van de bij. Voor de omrekening van N naar stuifmeel wordt aangenomen dat het stuifmeeleiwit 16% stikstof bevat, dat stuifmeel 20% eiwit bevat en dat de verteringsefficiëntie 80% is. Voor 10 mg N is dus 62,5 mg eiwit nodig, voor 62,5 mg eiwit 312,5 mg stuifmeel en door de efficiëntie van het spijsverteringsproces 390,6 mg stuifmeel dat door de bij wordt geconsumeerd.

Rekening houdend met dit alles is er 125 mg stuifmeel nodig om een bij groot te brengen.

De N in de bijen neemt na opkomst toe met 0,86 mg. De 0,86 mg N komt overeen met 39 mg stuifmeel. In totaal heeft elke bij dus minimaal 125 + 39 = 164 mg stuifmeel nodig, aangezien geen rekening is gehouden met N-verlies door ontlasting. Uitgaande van een actieve en voortplantingsperiode van de bij van 200 dagen en de gemiddelde levensduur van een bij van 35 dagen (Steen et al, 2012), duurt het 200/35 = 6 generaties. Om een kolonie van gemiddeld 15000 bijen in stand te houden, worden 15000 x 6 = 90000 bijen grootgebracht. Het aantal bijen dat jaarlijks wordt grootgebracht en de berekende benodigde hoeveelheid stuifmeel zijn samengevat in tabel 1 [van dit artikel].

De in het begin genoemde 35 kg is de hoeveelheid die nodig is voor een grote kolonie en is een optimale schatting. Hoeveelheden tussen 15 en 25 lijken realistischer. Nogmaals, alles hangt af van stufmeelsoort, omgeving, ontwikkeling van de kolonie en wel/niet stuifmeelval. Het ontnemen van stuifmeel aan kolonies stimuleert het verzamelen van stuifmeel. Het is aan de imker om een adequate stuifmeelstroom in stand te houden. Om na te gaan of de stuifmeelvoorraad voldoende is, volstaat een ruwe schatting van de oppervlakte/het aantal bijenbroodcellen in een kolonie. Een gezonde kolonie van normale grootte heeft per dag ongeveer 0,5 tot 2 dm? (200 - 800 haffvolle bijenbroodcellen) nodig.

Een andere eenvoudige schatting is het wegen van de oogst van de stuifmeelval. Er moet rekening mee worden gehouden dat de efficiëntie van de stuifmeelval varieert tussen 10 en 50% (Keller et al., 2005b).

Tabel 1 uit Roessink et al 2021, Beebread consumption by honeybees is fast: results of six-week field study, Journal of Apicultural Research, 60:659-664, geeft een voorbeeldige berekening van de stuifmeelbehoefte van een bijenvolk op basis van de consumptie van stuifmeel per dag bij een gegeven koloniegrootte. De larven en voedsterbijen zijn de consumenten van stuifmeel. De oudere werkbijen consumeren honing/nectar.

Stuifmeel is de natuurlijke voedselbron voor honingbijen en stuifmeeletende insecten.

Stuifmeel wordt door de plant niet geoptimaliseerd om insecten te voeden (het wordt geoptimaliseerd voor gebruik door de plant = bevruchting). Stuifmeel van verschillende soorten bevat een groot aantal verschillende eiwit-, lipide-, sterol- en antioxidantmoleculen in sterk uiteenlopende concentraties. Daarom is nog niet bekend welke van deze bestanddelen gunstig zijn en welke verdedigingsmoleculen van de plant zijn om te voorkomen dat insecten zich voeden met stuifmeel en welke niet belangrijk zijn voor de voeding van insecten en dus welke wel en welke niet in een kunstmatig dieet moeten worden opgenomen.

De uitvinders toonden aan dat de toevoeging van een voor een kolonie van 30000 bijen berekende dosis van 0,14 tot 12 gram isofucosterol over een periode van twee weken gunstig is voor de prestaties van de kolonie en de bijen (zoals blijkt uit de productie van bijenbroed en andere fitnessparameters zoals de levensduur). Deze dosis komt overeen meteen concentratie van 0,01% tot 1,76% isofucosterol in een pasteitje van 680 gram dat gedurende twee weken aan een kolonie van 30000 bijen wordt gevoerd.

Berekend per niet-stuifmeelsupplement consumerende bij in de kast (= de voedsterbijen = 50% van de bijen in de kast) komt dit neer op een dosis van 140mg/15000 bijen = 0,009 mg tot 12000 mg /15000 bijen = 0,8 mg isofucosterol of fucosterol per voedsterbij per 14 dagen in de kast (een voedsterbij weegt 110 mg). Dit betekent in % van het lichaamsgewicht per dag een dosis isofucosterol of fucosterol van 0,009/110*100/14 = 0,0006% tot 0,8/110*100/14= 0,052%.

Voorts tonen de uitvinders aan dat de dosis isofucosterol of fucosterol van 0,0006% tot 0,052% van het lichaamsgewicht per dag gunstig is voor de productie van larven en volwassen insecten van andere pollenetende insecten, zoals hommels, volwassen en larven van de zwarte soldaatvlieg, volwassen vogelkever, zweefvliegen en andere pollenetende insecten. Het is met name van belang voor de vruchtbaarheid en de vruchtbaarheid van de volwassenen en voor een hoger uitkomstpercentage en de overleving van jonge larven.

De toedieningsvorm beïnvloedt de efficiëntie van de opname en de biologische beschikbaarheid.

Wijze van toediening

De toediening aan een bijenkolonie of -organisme kan beperkt blijven tot de periode waarin het gewenste effect nodig is: zo kort als een eenmalige toediening om de normale broedontwikkeling te verbeteren, op gang te brengen of te ondersteunen wanneer de bijen uit de winter komen, om het broeden van koninginnen op gang te brengen of te ondersteunen of wanneer een insect gameten of eieren moet produceren, maar het kan ook voor langere perioden zijn wanneer de bijen gevoed worden met een gewas dat voedingsarm stuifmeel produceert (zoals bosbessen, wortelen, … ) of gedurende perioden van stuifmeelschaarste in het voorjaar, de zomer of het najaar. Voor kolonies van verschilende grootte kan de dosis proportioneel worden aangepast aan de hoeveelheid aanwezige bijen of voedsterbijen.

Deze tweewekelijkse dosis isofucosterol kan op verschillende manieren aan een bijenkorf of de gevoerde insecten worden toegediend: Deze dosis isofucosterol kan aan de kolonie worden toegediend in verschillende formuleringen (opgenomen in gesuspendeerde, opgeloste of geëmulgeerde vorm op een wijze die de bijen of het doeldier gemakkelijk opnemen): - verwerkt in de standaard 1,5 tot 3 pond eiwit of stuifmeelsupplementen die per 2 weken worden toegediend aan een bijenkorf van 30000 bijen, waarbij in één belichaming de samenstelling isofucosterol of fucosterol of mengsels daarvan bevat in een hoeveelheid van 0,01-5% van het dieet, bij voorkeur 0,01-2%, nog liever 0,01-1%, en nog liever 0,03-0,9% voor honingbijen en 0,03-0,8% voor hommels als percentage van het totale gewicht van de stuifmeelsubstitutiesamenstelling. - meer geconcentreerd in een kleine patty waarin de concentratie dan veel hoger is, bijvoorbeeld tot 33% sterol verwerkt in of gemengd met bestanddelen die bijen ertoe aanzetten de formulering te eten, zoals stuifmeel, suiker, olie/vet, honing of eiwit of een mengsel daarvan, of - verspreid in de kolonie of buiten de kolonie in een voederstation als poeder of pasta met het isofucosterol verwerkt in of gemengd met bestanddelen die bijen ertoe aanzetten de formulering te eten, zoals stuifmeel, suiker, olie/vet, honing of eiwit of een mengsel daarvan, - In de kolonie verspreid of buiten de kolonie in een voederstation gevoerd, een siroop of een vloeistof waarin het isofucosterol is verwerkt of vermengd met bestanddelen die bijen aanzetten tot het eten van de formulering, zoals stuifmeel, suiker, olie/vet, honing of eiwit of een mengsel daarvan, - Bij een andere belichaming kan de dosis sterolmoleculen worden afgegeven via een apparaat dat de sterolsamenstelling in de kolonie injecteert, bijvoorbeeld op voorgeprogrammeerde basis.

- Of elke methode die kan worden gebruikt om de aangegeven dosis toe te dienen zodat de bijen een chemische stof of voedingsstof opnemen, zoals bekend is bij ingewijden.

Bij een ander aspect wordt het sterolmengsel niet toegediend via een paté of een soortgelijk dieet, maar worden de bovengenoemde veelheid en verhouding van sterolen opgelost in een waterig of olieachtig medium of een voedingssuspensie of een andere eetbare vom en aan de kolonie toegediend als drinkvloeistof, vloeibare pasta of verstuiving in de bijenkorf of als poeder. In deze uitvoering kan de concentratie van de sterolen in drooggewicht 0,01-100% bedragen (aangezien de waterdrager uit het toegediende medium is verdampt).

Effect van het voeren van isofucosterol in combinatie met andere sterolen:

De uitvinders tonen verder aan dat een combinatie van isofucosterol en/of cholesterol, en/of 24-Methyleenecholesterol, en/of beta-sitosterol, en/of stigmasterol en/of campesterol vertegenwoordigt (1) een verbetering ten opzichte van alleen isofucosterol, (2) een verbetering ten opzichte van het voeren van combinaties van bovengenoemde sterolen zonder isofucosterol, (3) een verbetering ten opzichte van het voederen van combinaties van bovengenoemde sterolen waarin cholesterol of 24-Methyleenecholesterol, of campesterol, of stigmasterol of betasitosterol ontbreken.

Verrassend genoeg kan een bijenkolonie die gevoed wordt met een dieet dat isofucosterol en een veelheid van sterolen bevat, waaronder 24-Methyleenecholesterol, cholesterol, isofucosterol en campesterol, betasitosterol of stigmasterol, de ontwikkeling van het broedsel gedurende meer dan 4 cycli ondersteunen. Hetzelfde dieet zonder isofucosterol kan dat niet. Belangrijk is dat in onze experimenten de productie van broedsel afvlakt tot een stabiel niveau. Dit traject toont aan dat ons dieet voldoende essentiële voedingsstoffen levert om een onbeperkte broedproductie mogelijk te maken. Dit betekent dat dit dieet gedurende deze periode kan fungeren als stuifmeelvervanger voor de bijenkolonie.

Daarom maakt isofucosterol in dit dieet de bijenteelt onafhankelijk van stuifmeelbronnen ineen natuurlijke of agrarische omgeving. Bij hommels maakt een dergelijk dieet met een veelvoud aan sterolen het voor de stichtende bijenkoninginnen mogelijk larven groot te brengen tot volwassenheid, zonder dat daarvoor stuifmeel nodig is.

Het creëren van een dergelijk recept, blijkt niet duidelijk uit de literatuur. Rasmont et al. (2005 J Econ Ent 98(3): 656-663) interpreteerden de gegevens van Herbert et al. (1980), waar honingbijen werden gevoed met kunstmatige diëten die slechts één sterol bevatten, om aan te geven dat sitosterol en stigmasterol voor honingbijen een bestrijdingsmiddel waren en niet essentieel.

De uitvinders breidden het nut van het uitgevonden dieet uit van honingbijen tot andere stuifmeeletende insecten met commerciële relevantie in biocontrole (bv. lieveheersbeestjes), de productie van biomassa door insecten (bv. zwarte soldaatvlieg) en bestuiving (zweefvliegen).

Er is dringend behoefte aan veranderingen in de veehouderij en de veevoeding waarbij gebruik wordt gemaakt van de afvalstoffen die bij de voedselproductie ontstaan.

Bovendien zijn methoden om gewassen te beschermen tegen plagen uit de landbouw die niet afhankelijk zijn van agrochemische middelen, zoals de productie en het uitzetten van natuurlijke roofinsecten zoals lieveheersbeestjes en zweefvliegen, een belangrijk middel om geïntegreerde strategieën voor plaagbestrijding te creëren die de milieueffecten verminderen en de biodiversiteit beschermen.

Een belangrijke opkomende manier om gebruik te maken van industrieel landbouwafval is het kweken van vliegenlarven in afvalmateriaal zoals de zwarte soldaatvlieg (Hermetia illucens). De larven van de zwarte soldaatvlieg zijn omnivore generalisten en kunnen zich voeden met plantaardig of dierlijk afval, inclusief uitwerpselen, waardoor zij een voordelig middel zijn om afvalbiomassa om te zetten in veevoer. In de landbouwproductie worden deze larven en poppen gevoerd aan pluimvee en vis. Deze insecten halen uit het dieet dat zij als larven consumeren voedingsstoffen die een waardevolle aanvulling vormen op de voedselketen, zoals vetzuren en sterolen (Boukid et al. 2021 Insecten 12, 872.

Nos iso org/10.3390/insects12080672). Diëten zoals industrieel menselijk afval zijn echter niet geoptimaliseerd voor zwarte soldaatvliegen en missen vaak belangrijke essentiële voedingsstoffen. Zo worden de ontwikkelingstijd, grootte en sterfte van met BSF gevoede larven sterk beïnvloed door de aard van het voedsel waarmee ze worden gekweekt (Lalander et al. 2019. J Cleaner Production, — https://doi.0rg/10.1016/;.jclepro.2018.10.017). Vertraagde ontwikkelingstijden als gevolg van suboptimale diëten verminderen de efficiëntie in kweeksystemen.

Een ander probleem met de bestaande kweekmethoden is het suboptimale voedsel voor de levensstadia. Holometabolische insecten eten vaak verschillend voedsel als larven en volwassenen. Elke levensfase heeft wezenlijk andere voedingsbehoeften. Wat in een laboratorium of industriële productieomgeving aan de larven wordt gevoerd, is misschien niet geschikt voor de vruchtbaarheid en de overleving van de volwassen dieren.

In het wild eten BSF-larven rottend organisch materiaal en volwassen BSF eten bloemenpollen. Net als larven hebben volwassen BSF ook eiwitten nodig, ze produceren meer eieren als ze met eiwitten worden gevoerd (Bertinetti et al. 2019. Journal of Insect

Science 19(1): 19; 1-7), Ook al verbetert eiwit de prestaties, de grootte van de eiermassa en het uitkomen van eieren in met eiwit gevoede laboratoriumvliegen is minder dan de helft van die van in het wild gevoede vliegen (Bertinetti et al. 2019). Waarschijnlijk ontbreken bepaalde voedingsstoffen in laboratoriumdiëten die nog niet zijn geïdentificeerd (Bertinetti et al. 2019). Volwassen prestaties zijn belangrijk omdat volwassenen eieren produceren die een snelheidsbeperkende stap zijn in de industriële productie (Cickova et al. 2015 Waste Management Volume 35, januari 2015, 68-80).

Bertinetti et al. (2019) speculeren dat stuifmeel belangrijke voedingsstoffen bevat die BSF nodig hebben. Recent is aangetoond dat zwarte soldaatvliegen veel betere ovipositieprestaties hebben wanneer ze gevoerd worden met een dieet dat bloemenstuifmeel bevat (Thin en Kanoi. 2022. JARQ 56 (2): 211-217). Zo wordt de ovipositie en het uitkomen van eieren verdubbeld en de levensduur met 30% verlengd wanneer vrouwelijke zwarte soldaatvliegen worden gevoerd met stuifmeel (Thin en Kanoi 2022). De bestanddelen van stuifmeel die deze verandering veroorzaken zijn echter onbekend.

Stuifmeel eten bij andere nuttige insecten die in de landbouw worden gebruikt, heeft ook gevolgen voor de vruchtbaarheid van volwassen insecten. Dit is vooral belangrijk bij insecten die worden gekweekt voor biocontrole, zoals lieveheersbeestjes (Coccinelidae) en zweefvliegen (Syrphidae). De larven van lieveheersbeestjes zullen zich bijvoorbeeld met stuifmeel voeden wanneer bladluizen, hun favoriete prooi, niet beschikbaar zijn (Berkvens et al. 2010 Eur. J. Entomol. 107: 189-195, 2010, Shuldiner-Harpez en Coll. 2017 J Insect Behav 30: 432-438). Belangrijk is dat is aangetoond dat stuifmeelvoeding door volwassen kevers vereist is voor de vruchtbaarheid; mannelijke kevers die zich niet voeden met stuifmeel zijn niet in staat om levensvatbare spermatozoa te produceren (Ugine et al. 2019 Ecology Letters 22: 275-283). Stuifmeel eten is ook een essentieel onderdeel van de vruchtbaarheid van zweefvliegen (Syrphidae) die belangrijke bestuivers en predatoren van bladluizen zijn (Hickman et al. 1995 New Zealand Joumal of Zoology 22: 387-392). Vrouwelijke zweefvliegen zijn zeer selectief in de soorten stuifmeel die ze eten; het soort stuifmeel beïnvloedt hun vruchtbaarheid en de overleving van hun nakomelingen (Amorous-Jimenez et al. 2014 BioControl 59:427-435).

Pollen bevatten veel verschillende fytosterolen die niet voorkomen in andere terrestrische plantaardige of dierlijke bronnen (Zu et al. 2020. New Phyt 230: 1169-1184). Deze sterolen hebben een breed scala aan functies in de plant en daarbuiten. Veel fytosterolen worden door planten geproduceerd om het eten van insecten op de plant te remmen.

De huidige uitvinders hebben op verrassende wijze vastgesteld dat isofucosterol, een veel voorkomende sterol in stuifmeel, een essentiële voedingsstof is voor insecten die zich met stuifmeel voeden. Isofucosterol geleverd via een stuifmeelvrij dieet verhoogt de prestaties van volwassen en larvale BSF. De huidige uitvinders hebben ook vastgesteld dat het belangrijkste sterolbestanddeel van stufmeel dat door volwassen vrouwelijke zweefvliegen wordt geselecteerd, isofucosterol is. De huidige uitvinders hebben verder vastgesteld dat de combinatie van isofucosterol en ten minste één ander sterol, in het bijzonder cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, en andere fytosterolen, in het bijzonder campesterol, bèta-sitosterol of stigmasterol, betere groei- en/of gezondheidsprestaties oplevert bij veel ongewervelde dieren, in het bijzonder holometabolische insecten, waaronder bijen en stuifmeeletende vliegen, motten/vlinderachtigen en kevers.

De uitvinders stelden verder vast dat het voeren van een combinatie van isofucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, betasitosterol, stigmasterol en campesterol (1) een verbetering ten opzichte van isofucosterol alleen, (2) een verbetering ten opzichte van combinaties van bovengenoemde sterolen zonder isofucosterol, (3) een verbetering ten opzichte van combinaties van bovengenoemde sterolen waarin cholesterol of 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol of betasitosterol ontbreken.

Verrassend genoeg verbetert het voeren van gekweekte volwassenen van de zwarte — soldaatvlieg of kever met een dieet dat isofucosterol en een sterolmengsel bevat de eileg, het uitkomen van de eieren en de levensduur van de volwassenen. Hetzelfde effect kan worden verkregen door de larven die het broedsel zullen voortbrengen te voeden met een dieet dat isofucosterol en een sterolmengsel bevat (volwassen dieren erven aanzienlijke voedingsreserves van hun larvale/pupale stadium). Dit betekent dat een dergelijk dieet kan fungeren als stufmeelvervanger en als aanvullende voeding voor in het laboratorium gekweekte insectenkolonies. Dit dieet maakt het dus mogelijk de ontwikkelingsduur van de larven en de vruchtbaarheid van de volwassen dieren in industriële culturen van nuttige insecten te optimaliseren.

Dit blijkt niet duidelijk uit de literatuur. Svoboda, een wereldleider op het gebied van insectensterolen, leert dat bij alle soorten op twee na, cholesterol voorziet in de behoefte aan sterolen wanneer het in de voeding aanwezig is (Svoboda. 1999. Critical Reviews in

Biochemistry and Molecular Biology, 34({1):49-57). In zijn samenvatting werd de behoefte aan sterolen uit stuifmeel niet erkend als essentiële voedingsstoffen voor veel insecten die zich met stuifmeel voeden. Hij erkende isofucosterol niet als een noodzakelijk sterol voor de holometabolische groei van larven of de vruchtbaarheid van volwassen insecten.

Dienovereenkomstig is een eerste aspect van de uitvinding een methode voor het voederen van bijen zoals honingbijen en hommels en stuifmeel- of algenetende dieren zoals lieveheersbeestjes, zwarte soldaatvliegen, zweefvliegen, oesters, gamalen en vislarven, bestaande uit: — een fomulering ter vervanging van stuifmeel die een uit voedingsoogpunt doeltreffende hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan bevat; — toediening van de formulering ter vervanging van stuifmeel aan dieren zoals honingbijen en hommels en stuifmeel- of algenetende dieren zoals lieveheersbeestjes, zwarte soldaatvliegen, zweefvliegen, oesters, gamalen en vislarven. _ Nutritioneel effectieve hoeveelheid

Bij voorkeur leidt de toedieningsdosis van de stuifmeelvervangende formulering die isofucosterol of fucosterol of een mengsel daarvan en de verdere sterolen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-Methylenecholesterol, campesterol, stigmasterol en bèta- sitosterol bevat, tot een totale tweewekelijkse dosering van bovengenoemde groep sterolen aan een kolonie van 30000 bijen van 0,2 tot 48 gram, bij voorkeur van 0,4 tot 36 gram en nog liever van 0,6 tot 48 gram, resulteert in een totale tweewekelijkse dosering van de bovengenoemde groep sterolen aan een kolonie van 30000 bijen van 0,2 tot 48 gram, bij voorkeur van 0,4 tot 36 gram en nog liever van 0,6 tot 20 gram, waarbij de 100% van de sterolen in de bovengenoemde doseringen als volgt zijn verdeeld: isofucosterol - fucosterol is 10-60% van de steroldosis; de rest van de sterolen of veelvoud van sterolen vormt de rest van de totale steroldosis.

Bij voorkeur bedraagt de 100%-dosis van de groep sterolen bestaande uit isofucosterolfucosterol en/of cholesterol, en/of 24-Methylenecholesterol, en/of de fytosterolen bestaande uit campesterol en/of stigmasterol en/of beta-sitosterol in het dieet voor een kolonie van 30. 000 bijen gedurende een periode van 14 dagen 0,3 gram tot 20 gram van een samenstelling waarvan 10-60% isofucosterol en/of 0-50% cholesterol en/of 0-50% 24-Methylenecholesterol 000 bijen over een periode van 14 dagen is 0,3 tot 20 gram van een samenstelling waarvan 10-60% isofucosterol en/of 0-50% cholesterol en/of 0-50% 24-Methyleenecholesterol en/of 0-50% van een mengsel van betasitosterol en/of stigmasterol en/of campesterol.

Dit betekent een dosisbereik per dag van de "sterolsamenstelling" van 0,001 % (Formule =0,3/14/1650 x 100) van het lichaamsgewicht van het insect dat het voedsel consumeert tot 0,087% (Formule = 20 / 14 / 1650 x 100) van het lichaamsgewicht van het insect dat het voedsel consumeert 087% (Formule = 20 / 14 / 1650 x 100) van het lichaamsgewicht van het insect dat het voedsel consumeert, waarbij van de sterolsamenstelling 10-60% isofucosterol en/of 0-50% cholesterol en of 0-50% 24-Methyleenecholesterol en/of 0-50% van een mengsel van betasitosterol en/of stigmasterol en/of campesterol.

Bij deze berekening is ervan uitgegaan dat 50% van de bijen voedsterbijen zijn die elk 110 mg wegen.

De totale dosis kan proportioneel worden aangepast voor grotere of kleinere insecten, ongewervelden, insectenkolonies en kortere of langere voederintervallen, waarbij de hier aangegeven eenheidsdosis geldt voor een kolonie van 30000 bijen gedurende 14 dagen. (zie bovenstaande tabel uit Keller et al., 2005b).

Dezelfde samenstellingen en doses gelden voor andere insecten die stuifmeel eten.

Bij een andere belichaming kunnen sommige of al deze sterolgroepen worden toegediend als een prodrug zoals een in water oplosbaar sterolglycoside of een sterolsulfaat of soortgelijk zout, of een in vet oplosbare vorm zoals een sterol-ester of andere soortgelijke prodrugsvormen waarbij de dosis zodanig is aangepast dat deze de fractie van het molecuulgewicht van de respectieve sterolkem in het totale molecuulgewicht van het geconjugeerde sterolmolecuul weergeeft.

De verschillende wijzen van toediening die hierboven voor isofucosterol zijn beschreven, kunnen worden toegepast op isofucosterol en de andere hier beschreven sterol(len).

Om de dosis isofucosterol en groepen sterolen te berekenen die aan andere stuifmeeletende insecten (zie hierboven) moet worden afgegeven in % lichaamsgewicht per dag, wordt de volgende formule gebruikt: - [30000 / 2] * 0,110 gr = "Gewicht van de niet-pollen supplement consumerende insecten (voedsterbijen en/of larven) in een kast van 30000 bijen" (@0,11 gram per voedsterbij en/of larve; @300 bijen in de kast waarvan 50% voedsterbijen en/of larven = 1650 gram) - [Dosis van een bepaalde sterol of groep sterolen die in een periode van 14 dagen aan een kolonie van 30000 bijen wordt toegediend"/14] = "dagelijkse dosis toegediende sterol(len)". - "Dagelijkse dosis toegediend in gram" / "Gewicht van de niet-pollen supplement consumerende insecten (voedsterbijen & larven) in een bijenkorf van 30000 bijen in gram”x 100 = "% lichaamsgewicht van toegediende sterol(len) per dag per gram lichaamsgewicht van het insect". - Hoeveelheid te doseren sterolen voor een hommelkolonie: "% lichaamsgewicht van per dag toegediende sterol(len) per gram lichaamsgewicht van het insect" X "gewicht van de te voederen insecten (voedsterbijen en larven)".

Gemiddeld - zie bovenstaande tabel - wordt 2/3 van het in een kolonie geconsumeerde stuifmeel geconsumeerd door voedsterbijen en 1/3 door de aanwezige larven.

Bij voorkeur wordt de groep sterolen bestaande uit isofucosterolfucosterol en/of cholesterol, en/of 24-Methylenecholesterol, en/of de fytosterolen bestaande uit campesterol en/of stigmasterol en/of betasitosterol gedoseerd via een patty van 1,5 tot 3 pond per 14 dagen aan een kolonie van 30000 bijen. - isofucosterol (0,01-2%, bij voorkeur 0,01-1%, bij voorkeur 0,03-0,6% voederdrooggewicht) of fucosterol (0,01-2%, bij voorkeur 0,01-1%, bij voorkeur 0,03-0,6% voederdrooggewicht) of een mengsel daarvan (in totaal 0,01-2%, bij voorkeur 0,001-1%, bij voorkeur 0,03-0,6% voederdrooggewicht) en ten minste één van de andere sterolen uit onderstaande groep (concentraties in % voederdrooggewicht); resulterend in een veelvoud van isofucosterol of fucosterol of een mengsel daarvan met ten minste één van de verdere sterolen: = Cholesterol 0,001-2%, bij voorkeur 0,001%-1,5%, bij voorkeur 0,06-1,2%, en/of = 24 -Methyleenecholesterol 0,001-2%, bij voorkeur 0,001 %-1,5%, bij voorkeur 0,06- 1,2% en/of = Beta-sitosterol 0,001-2%, bij voorkeur 0,001-1%, bij voorkeur 0,03-0,6% en/of = Campesterol 0,001-2%, bij voorkeur 0,001-1%, bij voorkeur 0,02-0,35% ervof = Stigmasterol 0,001-2%, bij voorkeur 0,001-1%, bij voorkeur 0,01-0,2% en/of of een combinatie daarvan, waarbij de totale concentratie aan sterolen tussen 0,01 en 4% (drooggewicht) ligt.

Bij een ander aspect wordt de samenstelling toegediend aan ongewervelde dieren van de geslachten Apis of Bombus, met name honingbijen of hommels.

Bij een ander aspect is de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan of van ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-

Methylenecholesterol, stigmasterol, campesterol en = betasitosterol, een stuifmeelsubstituutweefsel van één of meer plantensoorten, gekozen uit de groep bestaande uit bladeren, stengels, wortels, knollen, bloemen, zaden, schors en vruchten en combinaties daarvan.

Methylenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol, een dierlijke bron, chemische synthese of in vitro enzymatische synthese, of een natuurlijk of metabolisch gemanipuleerd micro-organisme zoals gist, algen of diatomeeën of een combinatie van dergelijke bronnen.

Methylenecholesterol, stigmasterol, campesterol en betasitosterol, een extract, een olie of een raffinage van een stuifmeelsubstituutweefsel van één of meer plantensoorten of een combinatie daarvan.

Methylenecholesterol, stigmasterol, campesterol en = betasitosterol, een stuifmeelsubstituutweefsel van één of meer plantensoorten gekozen uit de groep bestaande uit Solanaceae, Poaceae, Ranunculaceae, Fabaceae, Corylaceae.

Bij een ander aspect is de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan een bron van stuifmeelvervangers, geselecteerd uit de groep bestaande uit: =" een mariene of zoetwater algensoort, met name een extract, een olie of een raffinage van Ulva lactuca; 2 een mariene diatomeeënsoort, met name een extract, een olie of een raffinage van Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira rotula of

Chaetoceros muelleri; en " een schimmel, met name een extract, een olie of een raffinage van

Saccharomyces cerevesiae of Yarrowia lipolytica.

Bij een ander aspect wordt het isofucosterol of fucosterol chemisch of enzymatisch gesynthetiseerd of verkregen door genetisch gemodificeerde gastheerorganismen zoals schimmels, bacteriën of algen.

Bij een ander aspect is de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en/of van ten minste één sterol uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-

Methylenecholesterol, stigmasterol, campesterol en bèta-sitosterol geselecteerd uit de groep bestaande uit algen, planten, schimmels algen, diatomeeën en combinaties daarvan en waarin de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en van ten minste één extra sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-

Methyleenecholesterol, stigmasterol, campesterol en bètasitosterol, een stuifmeelsubstituut is.

Bij een ander aspect wordt het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en/of ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-

Methyleenecholesterol, campesterol, betasitosterol en stigmasterol, verstrekt aan een eusociaal of primitief eusociaal bijenvolk uit een synthetische bron.

Bij een ander aspect wordt het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en/of ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24- mecholesterol, campesterol, stigmasterol en bèta-sitosterol, verstrekt als onderdeel van een samenstelling ter vervanging van stuifmeel, waarbij de samenstelling ter vervanging van stuifmeel bestaat uit: =» eiwitten in een hoeveelheid van 10 w% tot 50 w%, bij voorkeur van 15 w% tot 40 w%, = vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, =» koolhydraten in een hoeveelheid van 20 w% tot 90 w%, bij voorkeur van 30 w% tot 70 w%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid bestanddelen en eventueel andere bestanddelen opgeteld 100 w% bedraagt en waarbij het w% gerelateerd is aan het totale drooggewicht van de samenstelling.

Toediening via een vloeibaar of halfvloeibaar experiment:

Bi een ander aspect wordt het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en/of ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24- mecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol, verstrekt als onderdeel van een vloeibaar of halfvloeibaar voedingssupplement waaraan eventueel een eetlustopwekker, zoals suiker, of een andere eetlustopwekker is toegevoegd, waarbij de vloeibare of halfvloeibare samenstelling van het voedingssupplement bestaat uit: = naar keuze eiwitten in een hoeveelheid van 10 tot 50 gewichtspercenten, bij voorkeur van 15 tot 40 gewichtspercenten, =» naar keuze vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, =» naar keuze koolhydraten in een hoeveelheid van 20 tot 90 gewichtspercenten, bij voorkeur van 30 tot 70 gewichtspercenten, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, = naar keuze water of een ander oplosmiddel waarbij de totale hoeveelheid bestanddelen en eventueel andere bestanddelen opgeteld 100 w% bedraagt en waarbij het w% gerelateerd is aan het totale drooggewicht van de samenstelling.

In een ander opzicht is de samenstelling in wezen vrij van pollen. _ Isofucosterol en fucosterol

Isofucosterol is een delta-5-sterol met de structuurformule (figuur |):

Ye, N

D H

Cr

HO

Fucosterol is een delta-5-sterol met de structuurformule (figuur 2): 2 N u “1 H (ER

HO

De structuur van isofucosterol / fucosterol is beschreven in https:/pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/compound/5281 326.

24-Methyleenecholesterol

De structuur van 24-Methyleenecholesterol wordt hier beschreven:

Isofucosterol en 24-Methylenecholesterol werden gesynthetiseerd door chemici die bedreven zijn in de kunst van de organische synthese en het eindproduct werd gezuiverd tot 99% zuiverheid en gekarakteriseerd door LCMS, NMR en vloeistofchromatografie (figuur 3, 4, 5 ). Isofucosterol en 24-Methyleenecholesterol kunnen ook worden gezuiverd uit natuurlijke bronnen, zoals door bijen verzameld stuifmeel. Cholesterol was afkomstig van een commerciële bron. B-sitosterol en andere sterolen werden volgens standaardmethoden gezuiverd uit in de handel verkrijgbare sojafytosterolen.

Fysiologisch actieve sterolconjugaten

Onder fysiologisch actieve sterolconjugaten worden verstaan conjugaten van sterolen die door ongewervelde dieren, aquacultuur- of plantaardige organismen kunnen worden gemetaboliseerd.

De sterolmoleculen 24-Methyleenecholesterol, betasitosterol, cholesterol, campesterol, isofucosterolfucosterol, stigmasterol kunnen in verschillende conjugaten en als mengsel van conjugaten in het levensmiddel worden aangeboden.

De concentratie van het in het conjugaatmengsel toegediende sterol wordt als volgt berekend: "Dosis sterolconjugaat Moleculair gewicht sterolconjugaat” / "Moleculair gewicht sterol" X "Gewenste dosis sterol” = "Gewenste dosis sterolconjugaten".

Voorbeelden van de verschillende sterolconjugaten zijn: = als gratis alcohol =" veresterd met een vetzuur (zoals, maar niet beperkt tot, palmitinezuur, stearinezuur, linolzuur, oliezuur, stearinezuur, linoleenzuur). = via de alcoholgroep gekoppeld aan een vetalcohol (sterolalkylethers), = veresterd met een zuur zoals zwavelzuur (sterolsulfaat) = gekoppeld aan een glucide (resulterend in een sterylglycoside). De sterolgroep op de 3-OH positie kan elk sterol zijn van de sterolgroep 24-Methyleenecholesterol,

beta-sitosterol, cholesterol, campesterol, isofucosterolfucosterol, stigmasterol. De suiker glucose kan zijn glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose. Een voorkeursbelichaming is de glucose-ester van de groep sterolen. = veresterd tot g trans-hydroxycinnamaat, ferulate (4-hydroxy-3-methoxycinnamaat) en p-coumaraat esters (zie onderstaande figuur van campesteryl ferulate als voorbeeld van de sterylfenolaat conjugaten). Een voorkeursuitvoering is de cumarinezuurester van de groep sterolen.

Voorkeursvoorbeelden van sterolconjugaten zijn:

Mn, eN PH;

PL

NN | GR,

DB TON, .

CG ç LO

BO ie) ee J

OR, med ff 2

TT eee ei et 437 ES DS 85

Dz es] T

N Ss

H, i aCAG Lu FA Jen

HO ee, > es Te

A ago nn,

Bu ÿ ef 1 ÿ nn ©,

Karoe CH. CL La * aCPG : & Sie en © > A

Ho sol Se res J

Voorbeelden van bèta-sitosterolconjugaten zijn:

“on, x on ès 0

B-sitosterol o-coumarate

LR

> 4 a { ; 4 + so it ne y Ss

A, N La

HS B-sitosterol ferutate

PA

AL dr . =

LA sites

B-sitosterul #-coumarate ôu +

B x

De ASS 7% > 9

BU P-sitosterel caffeate nes De od

LA

CD

Ce eue as 2 ;

Au Fedtosterol gallate

YT ne dd

Sn À 7 ei, CS a a Pe nr citer ast « bsitosterel sinapate

YT chere a 1}

Que 2 5 tr y Ts ar ÿ 4 wr + B-sitesterel vaniflate *

Y ee

OS si Se

Das vos

BT sitesterol phioretate

Naar analogie van de bovenstaande voorbeelden van betasitosterol kunnen ook conjugaten met 24-methyleencholesterol, isofucosterol, campesterol of cholesterol of stigmasterol worden gebruikt.

Andere preferentiële sterolconjugaten komen van nature voor in planten, zoals (A) sterylester (SE), (B) sterylglycoside (SG), (C) acylsterylglycoside (ASG) met de structuurformule:

A EB où ae Lau LS en eu Se” gy = +5 ét

MR, A

V DM

CO EHE, * pete 5 re, _- e= Se EE 2

R-zijketen, die in het geval van dit octrooi kan behoren tot de groep van cholesterol, isofucosterol, 24-Methylenecholesterol, campesterol, betasitosterol, stigmasterol.

Andere voorbeelden zijn sterylglycoside, sterylester en geacetyleerd sterylglycoside.

RENNEN à | Sarl A gE ; ; page ze 8 ei ee, ei sn \ +

X a Te # me” B Ta À a

S ; ; : 5 2 ® N

Sin ener Jcebhisd air aloe

R zijn de zijgroepen van het sterol. Het sterol kan een delta-5 of delta-7 sterol zijn.

Andere voorbeelden van sterolconjugaten zijn:

B-sitosterol-5-giucoside Si

OR

„Oo

HO 9 Dm Mm stern! oh icoside

HO > N ; eu iQ N ee a

OH Ra OCR = gcyt sieroi gimoside ctangesisryi foruiais

OCHa }

HO

Sy an = ©

Cy

A

& Pe | À oo; je x, ï Ï à 3 ï KE ee © ade TT 3 5 & Nr N Ë { 3

N © + » An JE CU FES Sie DAN ; Ee Je hk A, se od ar ge ° > 1 Sieryt frrubsie æ} Hiersi gelaste ë ; ; j F en SX + N 0. j sf

Ee | ae rs => 3 4 © >" ee” = PANNE

VER $ È + L 3 X,

ET a FU ï S = A Ta | ee; " PS nie re 8 ER © a { Ce, X +, os Fo 43 Eterri ahrcoside A Im" “ at alas pe header ‘ { ee, Ge, a

Ld ' LLN R=-0H

TS ges 3 SES, ; ; TX ET - spi 1 5 | 2 stty acid ge TT OY noe

RG ve . oe Fan” SERIE INDIE

Leser] Gen eN ie «x [ f 20101 ‚ Te ga” gere” ; ST y Ï ÿ Ss +

Te © N Ja a PAR ee” ey = ae” a R ee

C'empartermcé Hiiemanerat Srussimarierat

Isofucosterol als voedingsstof voor insecten

De huidige uitvinders hebben verrassend genoeg ontdekt dat isofucosterol een essentiële voedingsstof is voor bijen en andere insecten die stuifmeel eten. Honingbijen en hommels vertonen bijvoorbeeld de volgende niveaus van isofucosterol in hun lichaamssamenstelling:

Tabel 1. Isofucosterolsamenstelling van bijen en potentiële voedselsubstraten voor bijen als percentage van het totaal aan voor bijen relevante fytosterolen lsofucosterol (% totaal) | Totaal fytosterol (g/g)

Honingbij werknemer 28,73 1673,75 50,15 2101,26

Samenstelling van de stuifmeelvervanger

Het kenmerk"pollenvervangend" betekent in wezen vrij van pollen. In de samenstellingen van deze uitvindingen kunnen echter kleine hoeveelheden stuifmeel aanwezig zijn. In één belichaming is de hoeveelheid stuifmeel 15 w% of minder, bij voorkeur 10 w% of minder, nog liever 5 w% of minder en nog liever 1 w% of minder en nog liever 0,1 w% of minder ten opzichte van het drooggewicht van de samenstelling. De termen stuifmeelsubstituut en niet-stuifmeel worden door elkaar gebruikt.

Stuifmeelvervangende bronnen van Isofucosterol

Isofucosterol kan worden verkregen uit pollenvervangende bronnen, bijvoorbeeld via = synthetische chemische synthese; of = elke stuifmeelvervangende plantenbron.

Voorbeelden van stuifmeelvervangende plantaardige bronnen van isofucosterol zijn algen, schimmels, bacteriën of dierlijke delen die isofucosterol bevatten.

In één belichaming bevatten de stuifmeelsubstituten van nature isofucosterol.

Bij een andere belichaming zijn de pollenvervangende bronnen van isofucosterol organismen die metabolisch zijn gemanipuleerd om isofucosterol te produceren.

Ongewervelde dieren

Ongewervelde dieren zijn = geleedpotigen, zoals insecten, spinachtigen, schaaldieren en myriapoden, =» weekdieren, zoals chitons, slakken, tweekleppigen, inktvissen en octopussen, = ringvomige dieren, zoals regenwormen en bloedzuigers; en = cnidaria, zoals hydra's, kwallen, zeeanemonen en koralen.

Bij voorkeur worden ongewervelde dieren gekweekt of gekweekt voor menselijke of dierlijke voeding, zoals honingbijen, hommels, regenwormen, meelwormen, garnalen of rivierkreeften, krekels, vliegenlarven lieveheersbeestjes, zwarte soldatenvliegen, zweefvliegen en oesters of andere tweekleppigen. Bij voorkeur worden ongewervelde dieren van de familie Apidae of Bombidae gebruikt als bestuivers voor land- of tuinbouwgewassen, zoals = bijen van het geslacht Apis en met name Apis mellifera, Apis cerana, Apis dorsata of = hommels van het geslacht Bombus en met name Bombus terrestris, B. impatiens, B. ignites = angeloze honingbijen van de stam Meliponini

Dosering en concentratie

De dosis en concentraties in de hieronder beschreven voorbeelden zijn bedoeld om een kolonie van 30000 bijen over een periode van 14 dagen te voeden met een bijenpaté van 1,5tot3 pond. De dosis van de patty kan worden aangepast aan de grootte van de kolonie en de dosis per 14 dagen kan naar wens van de imker worden herhaald. Dezelfde doses kunnen worden toegediend in belichamingen waarbij de toediening niet via pasteitjes maar via andere vormen als hierboven beschreven geschiedt. De formules voor de berekening van de dosis voor verschilende formuleringen, toedieningswijzen of grootte van bijenvolken of als dosis/dag als % van de insectenbiomassa zijn hierboven beschreven.

In één belichaming wordt het isofucosterol of het fucosterol toegediend in een hoeveelheid die uit voedingsoogpunt doeltreffend is voor ongewervelde dieren, met name honingbijen of hommels.

In één belichaming omvat het voederen van een kolonie van 30000 bijen met 1 pond tot 1,5 tot 3 pond van een bijenpastaformule over een periode van 14 dagen met een concentratie isofucosterol of fucosterol of mengsels daarvan in een hoeveelheid van 0,01- 5%, bij voorkeur van 0,01 tot 2%, en nog liever van 0,01-1% als percentage van het totale gewicht van de stuifmeelsubstitutiesamenstelling. Bij een andere belichaming bedraagt de concentratie isofucosterol of fucosterol of mengsels daarvan 0,03-0,5% voor honingbijen of 0,03-1% voor hommels als percentage van het totale gewicht van de stuifmeelvervangende samenstelling. De dosis van de patty kan worden aangepast aan de grootte van de kolonie en de dosis per 14 dagen kan naar wens van de imker worden herhaald.

In één uitvoeringsvom wordt de cholesterol toegediend in een hoeveelheid die uit voedingsoogpunt doeltreffend is voor ongewervelde dieren, met name honingbijen of hommels. Bij voorkeur wordt de cholesterol toegediend in een concentratie van 0,001-2%, bij voorkeur 0,001-1,5%, meer bepaald 0,06-1,2% van het drooggewicht van de totale stuifmeelsubstituutsamenstelling.

In één uitvoeringsvorm wordt het 24-Methyleenecholesterol toegediend in een hoeveelheid die uit voedingsoogpunt doeltreffend is voor ongewervelde dieren, met name honingbijen of hommels. Bij voorkeur wordt het 24-Methyleenecholesterol toegediend in een concentratie van 0,001-2%, bij voorkeur 0,001-1,5%, meer bepaald 0,06-1,2% van het drooggewicht van de totale stuifmeelsubstituutsamenstelling.

In één uitvoeringsvom wordt het sitosterol toegediend in een hoeveelheid die uit voedingsoogpunt doeltreffend is voor ongewervelde dieren, in het bijzonder voor honingbijen of hommels. Bij voorkeur wordt het sitosterol toegediend in een concentratie van 0,001-2%, bij voorkeur 0,001-1%, en bij voorkeur 0,03-0,6% van het drooggewicht van de totale stuifmeelsubstituutsamenstelling.

In één uitvoeringsvorm wordt het campesterol toegediend in een hoeveelheid die uit voedingsoogpunt doeltreffend is voor ongewervelde dieren, met name honingbijen of hommels. Bij voorkeur wordt het campesterol toegediend in een concentratie van 0,001- 2%, bij voorkeur 0,001-1%, en bij voorkeur 0,02-0,35% van het drooggewicht van de totale stuifmeelsubstituutsamenstelling.

In één belichaming wordt het stigmasterol toegediend in een hoeveelheid die uit voedingsoogpunt doeltreffend is voor ongewervelde dieren, in het bijzonder voor honingbijen of hommels. Bij voorkeur wordt het stigmasterol toegediend in een concentratie van 0,001-2%, bij voorkeur 0,001-1%, en nog liever 0,01-0,2% van het drooggewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

In één belichaming ligt de totale concentratie aan sterolen in de stuifmeelsubstituutsamenstelling tussen 0,01% en 4% van het drooggewicht van de — stuifmeelsubstituutsamenstelling.

Samenstelling van de stuifmeelvervanger

Een ander aspect van de uitvinding is een samenstelling ter vervanging van stuifmeel, bestaande uit a. eiwitten in een hoeveelheid van 10 w% tot 50 w%, bij voorkeur van 15 w% tot 40 w%, b. vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, c. koolhydraten in een hoeveelheid van 30 w% tot 90 w%, bij voorkeur van 30 w% tot 70 w%, d. eventueel vitaminen, en e. eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid van de bestanddelen a) tot en met e) en eventueel andere bestanddelen opgeteld 100 w% bedraagt en waarbij het w% betrekking heeft op het totale drooggewicht van de samenstelling, waarin de stuifmeelsubstituutsamenstelling verder een uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan bevat, en waarin de stuifmeelsubstituutsamenstelling verder ten minste één sterol bevat uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol, waarbij, bij voorkeur, de totale concentratie aan sterolen van 0,01 w% tot 4 w% bedraagt, bij voorkeur van 0,05 w% tot 3 w% en nog liever van 0,05 w% tot 2 w%, en nog liever van 0,05 w% tot 1,5 w% ten opzichte van het totale gewicht van de pollenvervangende samenstelling.

Gebruik voor voeding

Eenander aspect van de uitvinding is het gebruik van de stuifmeelsubstitutiesamenstelling van de uitvinding met een uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan voor het voederen van ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen, waarin de stufmeelsubstitutesamensteling een uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid bevat van ten minste één ander sterol, bij voorkeur ten minste twee andere sterolen, geselecteerd uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-Methylenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol of een fysiologisch beschikbaar conjugaat daarvan.

Een ander aspect van de uitvinding is het gebruik van de stuifmeelvervangende samenstelling van de uitvinding voor het voederen van ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen, waarbij de stufmeelvervangende samenstelling bestaat uit: a. eiwitten in een hoeveelheid van 10 w% tot 50 w%, bij voorkeur van 15 w% tot 40 w%, b. vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, c. koolhydraten in een hoeveelheid van 30 w% tot 90 w%, bij voorkeur van 30 w% tot 70 w%, d. eventueel vitaminen, en e. eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid van de bestanddelen a) tot en met e) en eventueel andere bestanddelen opgeteld 100 w% bedraagt en waarbij het w% betrekking heeft op het totale drooggewicht van de samenstelling, waarin de stuifmeelsubstituutsamenstelling verder een uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan bevat, en waarin de stuifmeelsubstituutsamenstelling verder ten minste één sterol bevat uit de groep die bestaat uit cholesterol, 24-Methylenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol, en waarbij, bij voorkeur, de totale concentratie aan sterolen van 0,01 w% tot 4 w% bedraagt, bij voorkeur van 0,05 w% tot 3 w% en nog liever van 0,05 w% tot 2 w%, en nog liever van 0,05 w% tot 1,5 w% ten opzichte van het totale gewicht van de pollenvervangende samenstelling.

Verdere componenten van de samenstelling

Een ander aspect is een methode voor het voederen van ongewervelde dieren, in het bijzonder honingbijen, waarbij een stuifmeelvervangende samenstelling wordt toegediend, waarbij de stuifmeelvervangende samenstelling bestaat uit: a. eiwitten in een hoeveelheid van 10 w% tot 50 w%, bij voorkeur van 15 w% tot 40 w%, b. vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%,

c. koolhydraten in een hoeveelheid van 30 w% tot 90 w%, bij voorkeur van 30 w% tot 70 w%, d. eventueel vitaminen, en e. eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid van de bestanddelen a) tot en met e) en eventueel andere bestanddelen opgeteld 100 w% bedraagt en waarbij het w% betrekking heeft op het totale drooggewicht van de samenstelling, waarin de stuifmeelsubstituutsamenstelling verder een uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan bevat, en waarin de stuifmeelsubstituutsamenstelling verder ten minste één sterol bevat uit de groep die bestaat uit cholesterol, 24-methyleen-cholesterol, campesterol, stigmasterol en bèta- sitosterol, waarbij, bij voorkeur, de totale concentratie aan sterolen tussen 0,01 w% en 4 w% bedraagt, bij voorkeur tussen 0,05 w% en 3 w% en nog liever tussen 0,05 w% en 2 w% en nog liever tussen 0,05 w% en 1,5 w% ten opzichte van het totale gewicht van de pollenvervangende samenstelling.

Dezelfde samenstelling en reikwijdte gelden voor hommels, zwarte soldaatvliegen, lieveheersbeestjes en andere stuifmeeletende insecten.

VOORBEELDEN

Vergelijkend voorbeeld 1: Isofucosterolgehalten in commercieel bijenvoer

In de handel verkrijgbare stufmeelvervangende bijenvoedersamenstellingen bevatten geen isofucosterol zoals weergegeven in tabel 1.

Tabel 1:

Commercieel verkrijgbare voeders voor honingbijen

Isofucosterol Totaal fytosterolen (microg/g)

UltraBee onder de detectiegrens 2147,29 onder de detectiegrens 1489,84

AP23 onder de detectiegrens 1340,88 onder de detectiegrens 509,18 onder de detectiegrens 280,38 onder de detectiegrens 844,56 0,001 w% is de detectiegrens voor isofucosterol

Analysemethoden van Zu et al. 2021 New Phyt 230: 1169-1184

Totaal berekend als de som van de hoeveelheden fytosterolen die voor de bijen van belang zijn: 24MCHO = 24-Methyleenecholesterol, CAMPE = campesterol, STIGM = stigmasterol, b-SITO = b-sitosterol, ISOFUCO = isofucosterol.

Er bestaat een goede literatuur die beschrijft hoe holidische diëten kunnen worden gemaakt voor experimenten met voedingstesten met honingbijen. Wij verwijzen naar

US2019/0090507, artikelen van Svoboda et al, Chakrabarti et al hierboven voor voorbeelden van verschillende holidische diëten met een achtergrond.

Voorbeeld 1 - Voorkeur essay: Bijen geven de voorkeur aan specifieke concentraties isofucosterol in voedsel.

Pas uitgekomen volwassen werkbijen (Apis mellifera) of volwassen werkhommels (Bombus terrestris) werden getest in een twee-keuze voorkeurstest waarbij de bijen toegang hadden tot twee diëten en ad /ibitum toegang tot water.

Het ene behandelingsdieet bevatte het isofucosterol en het andere geen sterol. Pas uitgekomen bijen werden uit het broedraam gehaald en cohorten van 30 bijen per replicaat werden ondergebracht in plastic kooien. In alle experimenten werden voor elke behandelingsgroep 10 cohorten van elk -30 bijen gebruikt. In alle diëten werden de koolhydraten op 60% gehouden met behulp van sucrose en het vet op 8%. De consumptie van elk dieet werd gedurende 5 dagen om de 24 uur gemeten. De voorkeursindex werd berekend als (hoeveelheid van de behandeling geconsumeerd - hoeveelheid van de controle geconsumeerd)/(totale hoeveelheid geconsumeerd voedsel).

In voorbeeld 1 kregen cohorten bijen de keuze tussen een voeding met of zonder isofucosterol. De bijen gaven de voorkeur aan voeding met ten minste 0,05 % isofucosterol, zoals blijkt uit figuur 7.

Voorbeeld 2 - Overleving: bijen leven langer op voedsel dat isofucosterol bevat

Pas uitgekomen volwassen werksters werden gevoed met een dieetbehandeling en ad libitum toegang tot water. Het behandelde dieet bevatte het isofucosterol. Pas uitgekomen bijen werden uit het broedraam gehaald en cohorten van 30 bijen per replicaat werden gehuisvest in plastic kooien. In alle experimenten werden voor elke behandelingsgroep 10 cohorten van elk -30 bijen gebruikt. De koolhydraten in alle voeders werden op 60% gehouden met behulp van sucrose en het vet op 8%. De consumptie van elk dieet werd in de loop van het experiment dagelijks gemeten. Het aantal levende bijen in de kast werd gedurende 14 dagen elke dag geteld.

Voorbeeld 2 toont de overleving van cohorten bijen die zich voeden met een dieet dat specifieke concentraties isofucosterol bevat (0%, 0,5% en 1% gewicht van het dieet), zoals weergegeven in figuur 8.

Voorbeeld 3 - Broedproductie: Honingbijen produceren meer broedsel met isofucosterol en produceren langer broedsel.

Honingbijen: Volledig functionele geïsoleerde piepschuim Apidea-nestkasten bestaande uit 5 miniframes bevolkt met volwassen werksters en 1 gedekte legkoningin werden bevolkt met 300-400 mI jonge volwassen werksters (- N<1.000 bijen van gemengde leeftijd).

De kolonie bevond zich in een gesloten kas met ventilatie, zodat de honingbijen niet konden foerageren op nectar of stuifmeel. Elke behandeling werd getest met 3-6 kolonies; elke kolonie kreeg een patty van 60-100 g (vast dieet) te eten op de bovenste voederbak die voorzien was van een gaasbodem. Het dieet werd op de eerste dag gevoerd en nogmaals op dag 6; de geconsumeerde hoeveelheid werd gemeten op dag 6 en dag 15.

Indien op dag 6 geen larven of eieren/koninginnen worden waargenomen, is het experiment beëindigd. Op dag 15 werd het aantal afgedekte broedcellen geteld. Bij elke inspectie werd het aantal bijennaden geschat. Suikersiroop (34%) en water werd verstrekt in voederbakken in de tent om koolhydratenhonger te voorkomen en de foerageeractiviteit te stimuleren.

In voorbeeld 3 kregen de bien een dieet met 10-18% eiwit, 6% vet, 1% vitaminen/mineralen en > 75% koolhydraten.

Figuur 9 toont de drempelwaarde van voorbeeld 3 voor de invloed van isofucosterol in het bijendieet. Naarmate de concentratie isofucosterol toenam, nam de hoeveelheid broed per kolonie toe (N > 3 kolonies/behandeling). De poppen en het aantal nieuwe adulten werden geteld over de gehele periode van 10 weken.

Voorbeeld 4A: Langdurig Apidea-experiment met bijen die met een veelheid van sterolen, waaronder isofucosterol en 24-Methyleenecholesterol, werden gevoerd.

Honingbijen: Volledig functionele geïsoleerde piepschuim Apidea-nestkasten bestaande uit 3-5 miniframes bevolkt met volwassen werksters en 1 gedekte legkoningin werden bevolkt met 300-400 mI jonge volwassen werksters (- N<1.000 bijen van gemengde leeftijd).

De kolonies bevinden zich in een gesloten schermhuis met ventilatie, waardoor de honingbijen niet konden foerageren op nectar of stuifmeel. Elke behandeling werd getest met 3-6 kolonies; elke kolonie werd ad libitum gevoed met het vaste dieet op de bovenste voederbak die voorzien was van een gaasbodem, en de verbruikte hoeveelheid werd bij elke voederbeurt beoordeeld. Het aantal afgedekte broedcellen werd om de 12 dagen beoordeeld. Bij elke inspectie werd het aantal bijennaden genoteerd. Als de kolonie de maximale grootte voor de Apidea-box bereikt, wordt een super toegevoegd. Suikersiroop (34%) en water werd verstrekt in voederbakken in de tent om koolhydratenhonger te voorkomen en de foerageeractiviteit te stimuleren.

In voorbeeld 4A kregen de bijen een dieet met 15-30% eiwit, 4-12% vet, 1% vitaminen/mineralen en > 40% koolhydraten (dieet 1).

De experimenten omvatten de volgende behandelingen: e Dieet 1: het bovenstaande dieet 1 waaraan geen sterolen zijn toegevoegd e Dieet 2 = Dieet 1 waaraan isofucosterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, bèta-sitosterol, stigmasterol en cholesterol zijn toegevoegd in de verhoudingen en concentraties zoals hierboven beschreven. e Dieet 3 = Dieet 2 maar zonder opname van 24-Methyleenecholesterol e Dieet 4 = Dieet 2, maar zonder toevoeging van isofucosterol e Dieet 5 = een patty op basis van stuifmeel (pollenpatty) bestaande uit 60,5% stuifmeel (vers ingevroren stuifmeel van honingbijen van BioBest,

Antalya, Turkije), 25,2% poedersuiker en 14,3% honing e Dieet 6 = Dieet 2 maar zonder opname van cholesterol e Dieet 7 = Dieet 2, maar zonder opname van bèta-sitosterol, stigmasterol en campesterol e DIET 8 = een algemeen gebruikt commercieel dieet

Figuur 4- resultaten van experiment 4A: Gemiddelde oppervlakte van het verzegelde broed (cm2), elke 12 dagen beoordeeld gedurende een periode van 15 weken. Elke kolonie kreeg één dieetbehandeling: Dieet 1 (kruisjes, dunne stippellijn), Dieet 2 (volle cirkels, dikke volle lijn), Dieet 3 (volle ruiten, dunne stippellijn), Dieet 4 (lege ruiten, dikke stippellijn), Dieet 5 (open cirkels, dikke stippellijn), Dieet 6 (volle vierkanten, dunne volle lijn), Dieet 7 (lege vierkanten, dikke stippellijn), en Dieet 8 (sterretjes, dunne stippellijn).

Voorbeeld 4B: Langdurig Apidea-experiment met bijen die met een veelheid van sterolen zonder isofucosterol, maar met 24-Methyleenecholesterol worden gevoederd

In Voorbeeld 4B kregen de bijen een dieet met 15-30% eiwit, 412% vet, 1% vitaminen/mineralen en > 40% koolhydraten (Dieet 1).

De experimenten omvatten de volgende behandelingen:

Dieet 1 = een dieet met 15-30% eiwit, 5-10% vet, 1% vitaminen/mineralen en > 40% koolhydraten, waaraan geen sterolen zijn toegevoegd.

Dieet 2 = stuifmeelpaté (60,5 % door honingbijen verzamelde gemengde stuifmeelkorrels, 25,2 % poedersuiker en 14,3 % honing).

Dieet 3 = Dieet 4, maar zonder opname van 24-Methyleenecholesterol.

Dieet 4 = Dieet 1 waaraan 24-Methyleenecholesterol, campesterol, bèta-sitosterol, stigmasterol en cholesterol zijn toegevoegd in verhoudingen en concentraties zoals hierboven beschreven.

Dieet 5 = een in de handel gebruikelijke voeding.

Figuur 5 toont het resultaat van experiment 4B: Gemiddelde oppervlakte van het verzegelde broed (cm2), elke 12 dagen beoordeeld over een periode van 15 weken. Elke kolonie kreeg één dieetbehandeling: Dieet 1 (kruisjes, dunne stippellijn), Dieet 2 (volle cirkels, dikke volle lijn), Dieet 3 (lege ruiten, dunne lijn), Dieet 4 (lege cirkels, dikke stippellijn), Dieet 5 (sterretjes, dunne stippellijn).

Voorbeeld 4C: Langdurig Apidea-experiment met bijen die een veelvoud aan sterolen te eten krijgen, waarbij de totale concentratie sterolen in het dieet constant wordt gehouden en de aanwezigheid (concentratie) van specifieke sterolen tussen de verschillende diëten wordt gevarieerd.

De experimenten omvatten de volgende behandelingen:

Dieet 2 = Dieet 1 waaraan 24-Methyleenecholesterol en isofucosterol zijn toegevoegd in lagere concentraties dan in de bovenstaande voorkeursoptie, en campesterol,

betasitosterol, stigmasterol en cholesterol zijn toegevoegd in verhoudingen en concentraties als in de bovenstaande voorkeursoptie.

Dieet 3 = Dieet 2, maar met grotere concentraties 24-Methyleenecholesterol en isofucosterol, zoals in de bovenstaande voorkeursoptie, cholesterol, en lagere concentraties campesterol, betasitosterol en stigmasterol, om een vergelijkbaar totaal sterolpercentage te behouden als in Dieet 2.

Dieet 4 = zoals die van dieet 3, maar zonder opname van 24-Methyleenecholesterol en van cholesterol, met handhaving van het totale sterolpercentage zoals in dieet 7.

Dieet 5 = vergelijkbaar met dieet 3, maar zonder toevoeging van isofucosterol.

Dieet 6 = vergelijkbaar met dieet 3, maar zonder opname van 24-Methyleenecholesterol en isofucosterol.

Dieet 7 = zoals dieet 3, maar zonder toevoeging van 24-Methyleenecholesterol, isofucosterol en cholesterol, waarbij het totale percentage sterolen gelijk blijft aan dat van dieet 4.

Dieet 8 = stuifmeelpaté (60,5 % door honingbijen verzamelde gemengde stuifmeelkorrels, 25,2 % poedersuiker en 14,3 % honing).

Figuur 6: Resultaten van voorbeeld 4C: Resultaten van een langdurig voedingsexperiment in Apidea-kolonies met bijen die met een veelvoud aan sterolen worden gevoederd, waarbij de totale concentratie sterolen in het dieet constant wordt gehouden en de aanwezigheid (concentratie) van specifieke sterolen tussen de verschillende diëten wordt gevarieerd.

VOORBEELD 5: Experimenten met de zwarte soldaatvlieg

Figuur 8 toont de resultaten van Voorbeeld 5B: Het voeren van volwassen zwarte soldaatvliegen met een dieet dat een veelheid aan sterolen bevat: effect op de levensduur van de volwassen dieren en de overleving van de larven tot het prepupae-stadium. De larven van de zwarte soldaatvlieg (BSF) kregen een dieet met 22% eiwit en 4% vet zoals beschreven in Hogsette 1992. J. Econ. Entomol. 85(6): 2291-2294 tot de ecclosie.

Sterolen werden als pure verbindingen rechtstreeks aan het dieet toegevoegd tot een totale hoeveelheid van 0,1%. De overleving van larven en volwassenen gedurende een periode van 50 dagen werd gemeten zoals in Georgescu et al, Eur. J. Entomol. 118: 297- 306, 2021.

Figuur 9 toont de resultaten van Voorbeeld 5C: Het voeren van volwassen zwarte soldaatvliegen met verschillende diëten die een veelvoud aan sterolen bevatten: sterolen die zijn aangetroffen in de weefsels van zwarte soldaatvliegen die met een veelvoud aan sterolen zijn gevoerd. Sterolen werden toegevoegd aan het dieet. De meting van sterolen in weefsels werd uitgevoerd na verzeping van BSF-weefsels met behulp van GC-MS zoals beschreven in Boukid et al. 2022. Insecten 12, 672.

VOORBEELD 6: Experimenten met de zwarte soldaatvlieg

Verandering van de voedingssamenstelling van een BFS-larve voor een doelsoort (honingbij) door een veelvoud aan sterolen in het dieet van de BFS-larven op te nemen, een voederformulering met larven te maken en die larven aan de doelsoort te voeren. De larven van de zwarte soldaatvlieg werden gevoederd met een dieet als in figuur 10. De door honingbijen benodigde sterolen werden aan het dieet toegevoegd in hoeveelheden als gespecificeerd in voeding 2 of als afzonderlijke sterolen (24-Methylenecholesterol, 24MC of isofucosterol). Aan één groep werden geen sterolen rechtstreeks aan het dieet toegevoegd. Er werden extracten gemaakt met hexaan van gevriesdroogde BSF-larven.

Het hexaanoplosmiddel met de vetfractie werd aan het dieet toegevoegd; het hexaan mocht verdampen voordat het dieet werd gebruikt om de larven te voeden.

Dit voorbeeld toont in het algemeen aan hoe het voeren van een veelheid van sterolen, aangepast aan de behoeften van een doelsoort, de prestaties van de doelsoort ten goede kan komen. Aangezien BFS gekweekt op verschillende afvalstromen geen optimale sterolprofielen bevat voor algen of plankton etende gekweekte vis, schaaldieren en gekweekte ongewervelde zeedieren en hun larven, is deze methode om fucosterol of isofucosterol toe te voegen, 24-Methylenecholesterol (alle verrijkt in algen maar afwezig in de huidige niet met algen gevoerde kunstmatige diëten voor bovengenoemde soorten) aan BFS-diëten toe te voegen en vervolgens lipide- of eiwitextracten of totale extracten van deze BFS-larven te verstrekken aan aquacultuurorganismen die algen eten, is een methode om de prestaties van aquacultuurkunstmatige diëten te verbeteren voor organismen die zich gewoonlijk met plankton en larven voeden en isofucosterol en/of 24-

Methylenecholesterol nodig hebben.

Tabel met de vertaling van de Engelse uitdrukkingen in de beschrijving

Avoids sterol Vermijdt sterolen

Prefers sterols Geeft de voorkeur aan sterolen

Isofucosterol Isofucosterol % weight % gewicht

Time (days) Tijd (dagen)

Capped brood per unit protein per colony | Kapselbroed per eenheid eiwit per kolonie per 2 week period per periode van 2 weken

Isofucosterol Isofucosterol

Capped brood per unit protein per colony | Afgesloten broed per eenheid eiwit per per 2 week period kolonie per periode van 2 weken

Area of sealed brood (cm2) Oppervlakte afgedekt broed (cm2)

Sterols found in black soldier flies fed | Sterolen gevonden in zwarte specific sterols in diet soldaatvliegen gevoed met specifieke en ee

Honeybee colonies fed with BSF extract | Honingbijenvolken gevoed met BSF-

Capped brood/colony Afgedekt broed/kolonie

Claims

CONCLUSIES

1. Een methode voor het voederen van ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen, bestaande uit =» een samenstelling ter vervanging van stufmeel die een uit voedingsoogpunt doeltreffende hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan bevat; en =» het toedienen van de stufmeelvervangende samenstelling aan ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen; waarin de stuifmeelsubstituutsamenstelling een uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid van ten minste één extra sterol bevat, bij voorkeur ten minste twee extra sterolen, geselecteerd uit de groep bestaande uit cholesterol, 24- Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol of een fysiologisch beschikbaar conjugaat daarvan.

2. De methode van het conclusie 1, waarin =» De ongewervelde dieren zijn insecten die stuifmeel eten, bij voorkeur insecten van de orden Hymenoptera en Coleoptera, bij voorkeur honingbijen, hommels, zwarte soldaatvliegen, zweefvliegen of lieveheersbeestjes, =» De —aquacultuurorganismen zijn plankton- en = algenetende aquacultuurorganismen, bij voorkeur vissen, vislarven, oesters, kokkels, weekdieren, buikpotigen of schaaldieren.

3. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarbij de uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan een dagelijkse dosis is van 0,0006 w% tot 0,052 w% van het levende lichaamsgewicht van de ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen.

4 De methode van een van de voorgaande conclusies, waarbij de uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan tussen 10 en 60 procent ligt van de totale hoeveelheid sterolen van de groep isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-mecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol in het totale dieet van de ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen of de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

5. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarbij het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan wordt toegediend in een verhouding van 0,14 g tot 12 g isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan per 30000 bijen per periode van twee weken.

6. De methode van het conclusie 5, waarin het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan wordt toegediend in een hoeveelheid van 10 tot 60 % van de totale hoeveelheid sterolen van de groep isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24- Methylenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol in het totale dieet van de ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen of van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

7. De methode van een van de voorgaande conclusies, =» waarin de uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en het ten minste één andere sterol een toedieningsverhouding heeft van 0,2 tot 48 gram per 30000 bijen per periode van twee weken, en =» waarin het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan wordt toegediend in een hoeveelheid van 10 tot 60 gewichtspercenten van de totale hoeveelheid sterolen van de groep isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol in het totale dieet van de bien of van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

8. De methode van een van de voorgaande conclusies, = waarin het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en ten minste één ander sterol wordt toegediend in een verhouding van 0,4 g tot 36 g per 30000 bijen per periode van twee weken, en =» waarin het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan wordt toegediend in een hoeveelheid van 10 tot 60 gewichtspercenten van de totale hoeveelheid sterolen van de groep isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol in het totale dieet van de bien of van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

9. De methode van een van de voorgaande conclusies,

= waarin het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en ten minste één ander sterol wordt toegediend in een verhouding van 0,6 g tot 20 g per 30000 bijen per periode van twee weken, en =» waarin het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan wordt toegediend in een hoeveelheid van 10 tot 60 gewichtspercenten van de totale hoeveelheid sterolen van de groep isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol in het totale dieet van de bien of van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

10. De methoden van een van de voorgaande conclusies, waarin het isofucosterol, het fucosterolcholesterol, het 24-mecholesterol, het betastigmasterol, het stigmasterol en/of het campesterol worden toegediend in een hoeveelheid van 0,001 w% tot 0,087 w% van het levensgewicht van de ongewervelde dieren of aquacultuurorganismen per dag.

11. De methoden van een van de voorgaande conclusies, waarin de uit voedingsoogpunt effectieve hoeveelheid is: = isofucosterol in een hoeveelheid van 10 tot 60 gewichtspercenten, = cholesterol in een hoeveelheid van O tot 50 gewichtspercenten, = 24 Methyleenecholesterol in een hoeveelheid van O tot 50 gewichtspercenten, = betasitosterol, stigmasterol en/of campesterol in een hoeveelheid van 0 tot 50 gewichtspercenten in vergelijking met de totale hoeveelheid isofucosterol, fucosterolcholesterol, 24- Methyleenecholesterol, betastigmasterol, stigmasterol en/of campesterol.

12. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarin de totale concentratie van sterolen van 0,01 w% tot 4 w% bedraagt, bij voorkeur van 0,05 w% tot 3 w% en nog liever van 0,05 w% tot 2 w%, en nog liever van 0,05 w% tot 1,5 w% ten opzichte van het totale gewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.

13. De methode van een van de voorgaande conconclusies, waarbij de concentraties sterolen worden gekozen uit de groep van: = Cholesterol in een hoeveelheid van 0,001 w% tot 2 w%, bij voorkeur van 0,001 w% tot 1,5 w%, meer bij voorkeur van 0,06 w% tot 1,2 w% ten opzichte van het totale gewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling,

= 24 Methyleenecholesterol in een hoeveelheid van 0,001 w% tot 2 w%, bij voorkeur van 0,001 w% tot 1,5 w%, meer bij voorkeur van 0,06 w% tot 1,2 w% ten opzichte van het totale gewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling, = Sitosterol, bij voorkeur beta-sitosterol in een hoeveelheid van 0,001 w% tot 2 w%, bij voorkeur van 0,001 w% tot 1 w%, meer bij voorkeur van 0,03 w% tot 0,6 w% ten opzichte van het totale gewicht van de pollenvervangende samenstelling, = Isofucosterol in een hoeveelheid van 0,01 w% tot 5 w%, bij voorkeur van 0,01 w% tot 2 w%, meer bij voorkeur van 0,01 w% tot 1,0 w%, meer bij voorkeur van 0,03 w% tot 06 w% ten opzichte van het totale gewicht van de pollensubstituutsamenstelling, = Campesterol in een hoeveelheid van 0,001 w% tot 2 w%, bij voorkeur van 0,001 w% tot 1 w%, meer bij voorkeur van 0,02 w% tot 0,35 w%, ten opzichte van het totale gewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling, = Stigmasterol in een hoeveelheid van 0,001 w% tot 2 w%, bij voorkeur 0,001 tot 1 w%, meer bepaald 0,01-0,2%, ten opzichte van het totale gewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling, of = elke combinatie daarvan.

14. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarin de samenstelling een volledig ongewerveld dieet, een deel van een ongewerveld dieet of een voedingssupplement is en waarin de verhouding tussen 24-mecholesterol en het andere sterol of de combinatie van andere sterolen 10:1 tot 1:1 bedraagt.

15. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarin de samenstelling wordt toegediend aan ongewervelde dieren van de familie Apidae, met name honingbijen (Apini), hommels (Bombini) of honingbijen zonder ster (Meliponini).

16. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarin de samenstelling wordt toegediend = in vaste vorm zoals een pastei of poeder of in vloeibare vorm zoals een oplossing, olie of spray; = binnen of buiten de korf.

17. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarin

=» de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan is een pollenvervangend weefsel van één of meer plantensoorten, geselecteerd uit de groep bestaande uit bladeren, stengels, wortels, knollen, bloemen, zaden, schors en vruchten en combinaties daarvan; en/of =» de bron van het andere sterol, geselecteerd uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, en betasitosterol, en stigmasterol, in het bijzonder het cholesterol is een stuifmeelsubstituut weefsel van een of meer plantensoorten geselecteerd uit de groep bestaande uit bladeren, stengels, wortels, knollen, bloemen, zaden, schors en vruchten en combinaties daarvan.

18. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarbij de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan of de bron van ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24- Methyleenecholesterol, campesterol, en beta-sitosterol en stigmasterol, een extract, een olie of een raffinage is van een niet-pollenweefsel van een of meer plantensoorten of een combinatie daarvan.

19. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarbij de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan of de bron van ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24- Methylenecholesterol, campesterol, en beta-sitosterol, stigmasterol, een stuifmeelsubstituutweefsel is van een of meer plantensoorten, gekozen uit de groep bestaande uit Solanaceae, Poaceae, Ranunculaceae, Fabaceae, Corylaceae.

20. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarbij de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan of de bron van ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24- Methylenecholesterol, campesterol, en beta-sitosterol en stigmasterol, een stuifmeelsubstituutbron is, gekozen uit de groep bestaande uit: =" een mariene of zoetwater algensoort, met name een extract, een olie of een raffinage van Uva lactuca; 2 een mariene diatomeeënsoort, met name een extract, een olie of een raffinage van Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira rotula of Chaetoceros muelleri; en

=" een schimmel, met name een extract, een olie of een verfijning van een gist zoals Saccharomyces cerevesiae of Yarrowia lipolytica.

21. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarbij het isofucosterol of fucosterol en ten minste één ander sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, betasitosterol en stigmasterol, chemisch of enzymatisch wordt gesynthetiseerd of verkregen door genetisch gemodificeerde gastheerorganismen zoals schimmels, bacteriën of algen.

22. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarbij de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan of het ten minste één extra sterol, gekozen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-Methylenecholesterol, campesterol, en bèta-sitosterol en stigmasterol, gekozen wordt uit de groep bestaande uit algen, planten, schimmels, algen, diatomeeën en combinaties daarvan en waarbij de bron van het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan een pollenvervangend weefsel is.

23. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarbij het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en ten minste één ander sterol uit de groep cholesterol, 24-Methylenecholesterol, campesterol, betasitosterol en stigmasterol aan een eusociale bijenkolonie wordt verstrekt uit een synthetische bron.

24. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarin het isofucosterol, fucosterol of een mengsel daarvan en de een of meer andere sterolen uit de groep bestaande uit cholesterol, 24-Methylenecholesterol, campesterol, stigmasterol en beta-sitosterol worden verstrekt als onderdeel van een stuifmeelsubstituutsamenstelling, waarin de stuifmeelsubstituutsamenstelling bestaat uit: =» eiwitten in een hoeveelheid van 10 w% tot 50 w%, bij voorkeur van 15 w% tot 40 w%, = vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, =» koolhydraten in een hoeveelheid van 20 w% tot 90 w%, bij voorkeur van 30 w% tot 70 w%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen,

waarin de totale hoeveelheid componenten opgeteld 100 w% bedraagt en waarin de w% betrekking hebben op het totale drooggewicht van de samenstelling.

25. De methode van een van de voorgaande conclusies, waarin de samenstelling ter vervanging van stuifmeel in wezen vrij is van stuifmeel.

26. Gebruik van de pollenvervangende samenstelling van een van de voorgaande conclusies voor het voeden van een organisme uit de groep bestaande uit: = ongewervelde dieren, bij voorkeur insecten die stuifmeel eten, bij voorkeur insecten van de orden Hymenoptera en Coleoptera, bij voorkeur honingbijen, hommels, zwarte soldaatvliegen, zweefvliegen of lieveheersbeestjes, =» aquacultuurorganismen, bij voorkeur plankton- en algenetende aquacultuurorganismen, bij voorkeur vissen, vislarven, oesters, kokkels, weekdieren, buikpotigen of schaaldieren.

27. Gebruik van de pollensubstitutiesamenstelling volgens het conclusie 26 als een geconcentreerde patty, waarbij de concentratie van isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methylenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol ten opzichte van het totale gewicht van de pollensubstitutiesamenstelling tussen 10 w% en 33 w% ligt.

28. Gebruik van de samenstelling ter vervanging van stuifmeel volgens het conclusie 27, waarin de samenstelling een bestanddeel bevat dat bijen eetlust opwekt, gekozen uit de groep bestaande uit stuifmeel, suiker, olie of vet, honing, of eiwit of een mengsel daarvan.

29. Gebruik van de stuifmeelvervangende samenstelling volgens het conclusie 28, waarbij de concentratie van het bestanddeel dat bijen eetlust/consumptie opwekt van 1 w% tot 20 w% is, bij voorkeur van 2,5 w% tot 15 w%, nog meer bij voorkeur van 5 w% tot 10 w% ten opzichte van het totale gewicht van de stuifmeelvervangende samenstelling.

30. Gebruik van de pollenvervangende samenstelling volgens het conclusie 26, waarin de pollenvervangende samenstelling in vloeibare vorm of in poedervorm is.

31. Gebruik volgens het conclusie 30, waarin de concentratie van isofucosterol, fucosterol, cholesterol, 24-Methyleenecholesterol, campesterol, stigmasterol en betasitosterol 0,01 w% tot 99 w% bedraagt ten opzichte van het totale drooggewicht van de stuifmeelsubstituutsamenstelling.