KR20240132532A - 동물을 위한 영양소로서 이소푸코스테롤 및 이소푸코스테롤과 다양한 스테롤의 조합 - Google Patents
동물을 위한 영양소로서 이소푸코스테롤 및 이소푸코스테롤과 다양한 스테롤의 조합 Download PDFInfo
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Abstract
무척추동물 또는 양식 유기체에게 먹이를 주는 방법으로서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물을 영양학적 유효량으로 포함하는 꽃가루 대체 조성물을 제공하는 단계; 및 무척추동물 또는 양식 유기체에게 상기 꽃가루 대체 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 꽃가루 대체 조성물은 적어도 하나의 추가의 스테롤, 바람직하게는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤 또는 이들의 생리학적으로 이용가능한 결합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 추가의 스테롤을 영양학적 유효량으로 포함하는, 방법.
Description
곤충은 수분 매개체(pollinator)로서 경제적으로 중요한 동물로서, 그리고 전통적인 동물성 단백질 작물(새, 어류, 포유류)보다 환경에 미치는 영향이 적으면서 비용 효율적으로 인간 및 동물 사료용 동물성 단백질을 생산할 수 있는 동물로서 점점 더 많이 사용되고 있다. 벌(bees)은 현대 농업에서 작물의 수분(pollination)을 위해 매우 중요하다. 최근 수분 매개체는 살충제에의 노출, 병원균 및 기생충의 확산 증가, 및 자연적으로 발생하는 꽃가루의 양을 줄이는 조경 관리 변화로 인해 위협을 받아 왔다.
역사적으로 양봉가들은 꿀벌이 자연 또는 농업 생태계에서 수집한 꽃가루 또는 꽃가루가 포함된 먹이 공급원을 꿀벌 군집(colony)에 공급해 왔다. 꽃가루 수집은 가용성(availability) 및 규모가 제한되어 있다. 첫째, 꽃가루 수집에는 비용이 많이 든다. 둘째, 꽃가루는 신선도를 유지하기가 어렵다. 마지막으로, 자연 생태계나 농업 생태계에서 수집된 꽃가루는 해충, 질병, 및 살충제를 옮길 수 있다. 따라서, 시중에서 판매되는 벌 먹이에는 일반적으로 꽃가루가 포함되어 있지 않다.
그러나, 충분한 품질과 양의 꽃가루의 부족은 벌 군집의 건강과 생존이 감소하는 근본적인 이유이다. 천연 꽃가루 자원을 수확하는 꿀벌은 야생 벌 종의 자원에 압력을 가하며 개체수 감소에 기여할 가능성이 높다. 꽃가루 지역으로 벌집(hive)을 운반하는 것은 벌 군집에 대한 근본적인 스트레스 요인이자 양봉 산업에 대한 주요 비용이다. 길 들여진 벌 종을 위해 고안된 꽃가루 대체품은 이러한 문제를 해결할 것이다.
벌은 꽃가루로부터 스테롤과 같은 필수 영양소를 얻는다. 이러한 스테롤에는 콜레스테롤, 캄페스테롤, 베타-시토스테롤 또는 스티그마스테롤이 포함될 가능성이 높다. 1970년대 USDA Beltsville 연구소의 최초 연구에서는 합성 사료를 먹인 꿀벌이 꽃가루 유래의 스테롤을 활용하는 방법을 설명하고 있다(Journal of Insect Physiology, Vol, 26, pp. 287-289). Chakrabarti 등은 꿀벌 영양에서 24-메틸렌콜레스테롤의 역할을 설명하고 있다(Chakrabarti, Evaluating effects of a critical micronutrient (24-Methylenecholesterol) on honeybee physiology, Annals of the entomological society of America, Vol 113, 176-182, 2019). 그러나, 이들 실험은 모두 스테롤이 없는 먹이에 단일 스테롤을 첨가하여 수행되었다. 현재까지 많은 스테롤 중 어떤 것이 그리고 어떤 스테롤 조합과 농도가 벌에게 중요하거나 필수적인지는 설명되지 않았다.
Apix Biosciences의 US2019/0090507호는 식물성 스테롤, 특히 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, β-시토스테롤 및 콜레스테롤의 중요성을 강조하고 있다. 그러나, US2019/0090507호는 사료 보충제로서 길들여진 벌을 위한 '완전한' 사료를 생성하는데 필요한 중요한 영양소로서 이소푸코스테롤이나 푸코스테롤 또는 이들과 스테롤의 혼합물을 개시하지 않고 있다.
문헌[Mishyna 등, Journal of Functional Foods 76 (2021) 104316, doi.org/10.1016/j.jff.2020.104316]은 가수분해물, 이의 항산화제 및 안지오텐신 전환 효소 억제 활성, 지방산, 콜레스테롤, 미네랄, 비타민, 카로티노이드, 페놀 화합물, 식이섬유와 관련하여 곤충 및 새우의 섭취에 대한 연구를 논의하고 있다. 그러나 이 문헌에서는 이소푸코스테롤이나 콜레스테롤과 이소푸코스테롤의 조합에 대해서는 언급하지 않고 있다.
대두 단백질 또는 감자와 같은 기타 사용되는 단백질 공급원에는 캄페스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤, 미량의 데스모스테롤 및 이소푸코스테롤(감자의 습윤 중량 1 kg당 60mg 이소푸코스테롤, 또는 0.006%)이 포함되어 있다(Sirpa O. Karenlampi, Philip J. White, in Advances in Potato Chemistry and Technology, 2009). 이러한 공급원의 스테롤 농도는 벌의 영양 요구량보다 낮다.
꿀벌의 경우 이소푸코스테롤은 꿀벌의 총 체질(corporeal) 스테롤의 10 내지 50%를 차지한다. 이는 꿀벌의 건조 중량의 0.02 내지 0.06%에 해당한다(Svoboda 등, Utilization and metabolism of dietary sterols in the honeybee and the yellow fever mosquito, Lipids Volume 17 number 3, 1982; 본 발명자들의 데이터). Bombus terrestris와 같은 호박벌의 경우 이소푸코스테롤은 그 벌의 체질 스테롤의 40 내지 55%를 차지한다. 이러한 양은 호박벌의 전체 건조 중량의 0.10 내지 0.25%에 해당한다.
벌을 위한 현재의 인공 사료는 불완전하여 초기에는 새끼 생산(brood production)이 증가하다가 22 내지 40일에 걸쳐 새끼 생산이 급격히 감소하게 된다. 이는 현재의 사료는 하나 이상의 필수 영양소가 부족하다는 것을 나타낸다. 그러나, 현재까지 21일의 3 내지 4주기 이상 동안 군집의 밀폐된 새끼 발달(brood development)을 지원할 수 있는 벌용 인공(꽃가루가 없는) 사료는 기술되어 있지 않다. 지속적인 새끼 발달을 지원하는 사료의 능력은 꽃가루와의 사료의 동등성 및 "완전한 사료"로 작용하는 사료의 능력의 핵심 지표이다. 가장 잘 발표된 데이터는 2주기 이후부터 새끼 생산이 크게 감소했음을 이미 보여준다(Herbert 등, (1980), J. Insect Physiol., Vol. 26, pp. 287 to 289; doi.org/10.1186/s12917-022-03151-5; Bee Culture Education: Honeybee Nutrition - Randy Oliver - Part 1 to 4, Youtube). 따라서, 수분이나 꿀 생산을 위해 벌을 사육하는 많은 지역에서는 꽃가루의 질과 양이 부족하므로, 인공 먹이로 장기간 군집을 유지하여 벌이 계속해서 새끼(brood)를 생산하도록 한다는 관점에서 꿀벌에게 먹이를 주는 조성물 및 방법을 제공할 필요가 있다.
벌을 위한 현재의 꽃가루 없는 인공 사료는 불완전하므로, 이러한 먹은 먹은 벌은 군집에서 21일간의 새끼 생산의 3 내지 4주기 후에 필수 영양소 보유량이 박탈되거나 고갈된다(Herbert 등, (1980), J. Insect Physiol., Vol. 26, pp. 287 to 289). 여기에서 본 발명자들은 이소푸코스테롤/푸코스테롤과 다양한 스테롤을 첨가함으로써 4주기 이상 동안 군집에서 새끼 생산과 군집 발달을 유지하는 먹이를 얻을 수 있음을 보여주는데, 이는 본 발명의 먹이가 현재의 인공 먹이에서 볼 수 있는 하나 이상의 필수 영양소의 부족을 극복할 수 있음을 시사한다. 이는 본 발명이 벌에게 필요한 제한 성분(들)을 공급하는 새로운 먹이를 제공한다는 것을 보여준다. 따라서, 이러한 꽃가루 없는 먹이는 천연 꽃가루 없이 군집의 연장된 수명 주기 동안 군집을 유지하며, 이는 양봉 관행을 근본적으로 개선할 수 있는 중요한 발전이다.
꿀벌은 인간의 식량 안보에 매우 중요하다. 지금까지 수천 년 동안 길들여져 왔음에도 불구하고, 벌집이 이의 영양을 위해 꿀 및 꽃가루를 소비해야 하는 필요성을 완전히 제거하는 꽃가루 없는 인공 먹이(artificial diet)는 개발되지 않았다. 이러한 먹이는 세계 작물의 35%를 지속적으로 수분시키고 야생 수분 매개체 및 식물의 생물다양성을 보호하는 인류의 능력을 유지하는데 중요한 도구가 될 것이다.
꿀벌집은 이의 영양 요구 사항을 충족하기 위해 영양학적으로 적합한 꽃가루의 지속적이고 다양한 공급원을 필요로 한다. 꽃가루는 벌집의 단백질, 탄수화물, 아미노산, 비타민, 지질, 스테롤 및 기타 미량 영양소의 필수 공급원이다. 대부분의 식물 종은 벌집의 모든 영양 요구 사항을 충족하지 못하는 조성을 갖는 꽃가루를 생성한다. 따라서, 꿀벌은 다양한 꽃 기원의 꽃가루를 수집함으로써 그의 영양 요구 사항의 균형을 맞추는 생리적 메커니즘을 발달시켰다.
꽃가루에서 확인된 많은 복잡한 분자의 꿀벌에 대한 영양 관련성 또는 요구 사항은 아직 알려져 있지 않다. 꽃가루와 꿀벌에는 다량 영양소 외에도 특정 화학 계열(예: 플라보노이드, 스테롤, 지질 등)의 여러 구성원이 포함되어 있다.
많은 논문에서는, 다양한 꽃가루 공급원의 영양소 조성과 이러한 다양한 꽃가루의 영양적 특성을 연관시켜서 특정 분자의 영양학적 관련성이 추론되었다. 서로 다른 꽃가루는 수십 개의 분자의 조성이 매우 다양하기 때문에, 이러한 상관적 접근 방식으로는 단일 성분의 관련성에 대한 결론을 실제로 도출할 수 없다.
꿀벌 영양을 연구하기 위한 또 다른 실험적 접근 방식에서는, 이러한 성분 계열의 단일 성분(단일 스테롤, 단일 항산화제)을 간단한 기본 먹이에 추가하고(Herbert, Chakrabarti, 표 7 참조) 일반적으로 케이지에 갇힌 벌의 먹이 공급 및 수명과 같은 단기 분석에서 효과가 있는 것으로 확인되었다. 이는 각 화학 물질의 경우 화학 계열(chemical family)의 다른 구성원이 없을 때 꿀벌이 화학 계열의 이러한 구성원의 존재로부터 영양학적으로 이익을 얻을 수 있다는 암시를 제공하지만 이것이 벌이 화학적으로 필요로 하는 최적의 분자인지 또는 벌이 생활주기 및 계절 전반에 걸쳐 벌집을 영양적으로 지원하기 위해 하나 이상의 계열 구성원을 필요하거나 그로부터 이익을 얻는지 여부를 나타내지는 않는다.
곤충은 스테롤을 합성할 수 없으며 대부분의 곤충이 콜레스테롤로 전환하는 먹이 공급원에서 스테롤을 얻는다. 대부분의 곤충과 달리, 벌(꿀벌, 호박벌 등)은 미량의 콜레스테롤만을 함유하고 있으며 피토스테롤을 콜레스테롤로 탈알킬화할 수 없다. 따라서, 꿀벌은 콜레스테롤 대신 피토스테롤을 세포막의 구조적 요소, 발달 호르몬의 전구체, 및 단백질 복합체의 구조적 구성 요소로 사용한다(예를 들어, 24-메틸렌-콜레스테롤은 로얄젤리 단백질 mrjp1-아피미신 복합체의 주요 성분이다; 표 7). 다양한 꽃 종 유래의 꽃가루는 피토스테롤 조성과 비율이 크게 다르다. 꿀벌, 호박벌 및 기타 벌 종은 먹이의 균형을 맞추기 위해 다양한 종으로부터 꽃가루를 수집한다. 꿀벌의 스테롤 조성은 꿀벌에 존재하는 스테롤의 90% 이상을 차지하는 6가지 주요 스테롤(아래에 나열됨)로 구성된다. 이러한 피토스테롤은 꿀벌의 꽃 먹이의 피토스테롤 조성을 부분적으로 반영하는 다양한 비율로 존재한다. 일반적으로, 꿀벌 유충은 먹이 공급원에 따라 다음 비율로 0.1 내지 0.3% 스테롤을 함유한다: 40 내지 60% 24-메틸렌-콜레스테롤; 15 내지 40% 베타-시토스테롤; 15 내지 50% 이소푸코스테롤; 3 내지 10% 캄페스테롤; 1 내지 5% 스티그마스테롤, 및 0.1 내지 2% 콜레스테롤.
꿀벌 영양에서 특정 스테롤의 중요성을 다루는 규정된 스테롤 조성의 전체 먹이(holidic diet)에 대한 두 가지 실험만이 발표되었다. 하나의 실험에서 Herbert 등(1980, 표 7)은 스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌-콜레스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤 및 스티그마스테롤(이소푸코스테롤 아님)을 스테롤이 부족한 규정된 먹이에 개별적으로 추가하고 각각 하나의 스테롤이 포함된 이러한 먹이를 텐트에 둘러싸인 벌집에 최대 12주 동안 공급했다. 그들은 24-메틸렌-콜레스테롤과 같은 몇몇 스테롤을 함유한 먹이가 다른 스테롤을 함유한 먹이보다 더 많은 새끼를 생산한다는 것을 보여주었다. 이 실험에서는 하나의 스테롤이 다른 스테롤과 생리학적으로 교환될 수 있는지 여부, 즉 꿀벌이 다수의 스테롤을 필요로 하는지 아니면 단지 몇 개의 스테롤만 필요로 하는지, 그리고 특정 피토스테롤의 부재가 다른 피토스테롤(의 조합)의 존재에 의해 보상할 수 있는지 여부에 대한 결론을 도출할 수 없었다.
Chakrabarti 등(표 7)은 인공 사료에 존재하는 단일 스테롤인 24-메틸렌-콜레스테롤을 사용하여 단기 먹이 공급 실험을 수행했으며, 존재하는 경우 24-메틸렌-콜레스테롤이 상당한 생리적 및 대사 효과를 나타냄을 보여주었다(새끼 생산은 측정되지 않았다). 그러나, 이러한 실험에서는 관찰된 효과가 특정 스테롤에 특정한지 또는 비특이적으로 스테롤 류의 분자에 특정한지 여부를 평가하기 위한 24-메틸렌-콜레스테롤과 상이한 스테롤을 함유한 대조 먹이는 포함되지 않았다. 이러한 실험에서는 24-메틸렌-콜레스테롤과 상이한 스테롤이 유사한 효과를 갖거나 중복되는 생리학적 효과를 갖는지 여부를 구별하지 못했다.
현재까지 꽃가루에 포함된 스테롤 중 어떤 것이 임의성(facultative) 스테롤인지, 그리고 어떤 것(있는 경우)이 먹이에 영양학적으로 필수적인지는 밝혀지지 않았다. 현재까지 꿀벌에 대한 이소푸코스테롤의 영양 요구량을 평가하는 영양 실험은 보고되지 않았다. 꽃가루와 유사한 농도 및 비율로 규정된 다양한 스테롤을 포함하는 완전한 먹이로부터 24-메틸렌-콜레스테롤 또는 이소푸코스테롤 또는 이 두 가지 스테롤을 모두 생략하는 것이 벌집 및 이의 꿀벌의 건강에 영향을 미치는지 여부를 다루는 실험은 보고되지 않았다. 최신 기술에 대한 추가의 참조를 위해서는 표 7을 참조한다.
발명의 간단한 설명
동물에는 스테롤이 극소수(단연코 콜레스테롤이 가장 주요한 스테롤임)인 반면, 식물에서는 광범위한 스테롤이 발견된다. 이들 사이의 구조적 변화는 측쇄에서의 서로 다른 치환 및 사환식 골격에서의 이중 결합의 수 및 위치 때문에 발생한다. 식물성 스테롤은 하나 이상의 작용기(functionality)의 유무에 따라 분류될 수 있다. 예를 들어 이들 스테롤은 C4의 에틸화 수준을 기준으로 다음과 같이 세 그룹으로 나눌 수 있다: 4-데스메틸스테롤 또는 최종 생성물 스테롤, 4 알파-모노메틸 스테롤, 및 4,4-디-에틸스테롤. 자연적으로 발생하는 4-desm-에틸스테롤로는 시토스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 아베나스테롤 및 이소푸코스테롤이 있다. 대부분의 고등 식물에서는, 유리 3-히드록실기를 가진 스테롤(유리 스테롤)이 주요 최종 생성물이다. 그러나, 예를 들어 3-히드록시 기가 지방산 사슬 또는 페놀산에 의해 에스테르화되어 스테릴 에스테르를 생성하는 경우, 스테롤은 결합체(conjugate)로도 발생한다. 본 설명의 목적상, 스테롤이라는 용어는 유리 스테롤 및 결합 스테롤을 모두 의미한다. 그러나 본 명세서에서 스테롤의 수준, 양 또는 백분율에 대한 언급은 지방산 또는 페놀산과 같은 결합기(conjugating group)의 중량을 제외한 스테롤 기의 총 중량을 의미한다. 본 문서에서 푸코스테롤은 푸코스테롤 또는 이의 이성질체인 이소푸코스테롤 또는 이 두 이성질체의 혼합물로 정의된다. 본 문서에서 이소푸코스테롤은 이소푸코스테롤 또는 이의 이성질체인 푸코스테롤 또는 이 두 이성질체의 혼합물로 정의된다.
본 문서에 기재된 공급 투여량이나 양은 2주 동안(또는 다른 기간) x 그램(또는 다른 양)으로 표시되며, 이는 "시간 단위로 제공되는 투여량"에 대한 일반적인 설명으로 의도된 것이지 2주에 걸쳐 먹이를 주어야 한다는 특정 요구 사항으로 특별히 제한하는 것이 아니다. 당업자는 주간 투여량 계획(regiment)을 일일 또는 격주 투여량 또는 임의의 유사한 기간으로 다시 계산할 수 있다.
놀랍게도 본 발명자들은 이소푸코스테롤이 벌을 위한 필수 영양소라는 사실을 확립했다. 꽃가루가 없는 먹이를 통해 전달되는 이소푸코스테롤은 이소푸코스테롤이 없는 꽃가루 대체 벌 먹이에 비해 일벌의 새끼 생산 및 생존을 증가시킨다. 본 발명자들은 이소푸코스테롤과 적어도 하나의 추가의 스테롤, 특히 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤 및 기타 피토스테롤, 특히 캄페스테롤, 베타-시토스테롤 또는 스티그마스테롤의 조합이 이소푸코스테롤 단독과 비교하여 무척추동물, 특히 벌 및 다른 꽃가루를 먹는 곤충에서 더 높은 성장 및/또는 건강 성능을 제공한다는 것을 추가로 확인했다.
이러한 유용성은 환경에서 꽃가루가 부족한 기간(오늘날 꿀벌 군집의 불량한 성능의 주요 원인)에서 꿀벌 군집을 보충하기 위한 비-꽃가루 사료의 제제화, 우수한 꿀벌 여왕벌의 생산, 및 인간 및 동물 사료의 대체 단백질 공급원인 동애등에(black soldier fly), 호박벌(수분용), 무당벌레(진딧물 방제용); 꽃등에(수분용) 및 기타 상업적으로 관련된 곤충과 같은 꽃가루를 먹는 곤충의 상업적인 사육에 중요하다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 무척추동물 또는 양식 유기체(aquaculture organism)에게 먹이를 주는 방법으로서,
- 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물을 영양학적 유효량으로 포함하는 꽃가루 대체 조성물(pollen substitute composition)을 제공하는 단계; 및
- 무척추동물 또는 양식 유기체에게 꽃가루 대체 조성물을 투여하는 단계를 포함하고,
꽃가루 대체 조성물은 적어도 하나의 추가의 스테롤, 바람직하게는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤 또는 이들의 생리학적으로 이용가능한 결합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 추가의 스테롤을 영양학적 유효량으로 포함하는, 방법이다.
또 다른 측면에서, 무척추동물은 꽃가루를 먹는 곤충, 바람직하게는 벌목 및 딱정벌레목의 곤충, 더욱 바람직하게는 꿀벌, 호박벌, 동애등에, 꽃등에 또는 무당벌레이다.
또 다른 측면에서, 양식 유기체는 플랑크톤 및 조류(algae)를 먹는 양식 유기체, 바람직하게는 어류, 어류 유충, 굴, 조개, 연체동물, 복족류 또는 갑각류이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 영양학적 유효량은 무척추동물 또는 양식 유기체의 생체 중량의 0.0006 중량% 내지 0.052 중량%의 일일 투여량(daily dose)이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 영양학적 유효량은 무척추동물 또는 양식 유기체의 전체 먹이(total diet)에서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군의 스테롤의 총량 또는 꽃가루 대체 조성물의 스테롤의 총량의 10 중량 내지 60 중량%이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물은 2주의 기간당 벌 30000마리당 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 0.14g 내지 12g의 비율로 투여된다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물은 무척추동물 또는 양식 유기체의 전체 먹이에서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군의 스테롤의 총량 또는 꽃가루 대체 조성물의 스테롤의 총량의 10 중량 내지 60 중량%의 양으로 투여된다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및 적어도 하나의 추가의 스테롤의 영양학적 유효량은 2주의 기간당 벌 30000마리당 0.2 내지 48 그램의 투여 비율이고, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물은 벌의 전체 먹이에서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군의 스테롤의 총량 또는 꽃가루 대체 조성물의 스테롤의 총량의 10 중량 내지 60 중량%의 양으로 투여된다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및 적어도 하나의 추가의 스테롤은 2주의 기간당 벌 30000마리당 0.4 g 내지 36 g의 비율로 투여되고, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물은 벌의 전체 먹이에서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군의 스테롤의 총량 또는 꽃가루 대체 조성물의 스테롤의 총량의 10 중량 내지 60 중량%의 양으로 투여된다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및 적어도 하나의 추가의 스테롤은 2주의 기간당 벌 30000마리당 0.6 g 내지 20 g의 비율로 투여되고, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물은 벌의 전체 먹이에서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군의 스테롤의 총량 또는 꽃가루 대체 조성물의 스테롤의 총량의 10 중량 내지 60 중량%의 양으로 투여된다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 베타-스티그마스테롤, 스티그마스테롤 및/또는 캄페스테롤은 하루에 무척추동물 또는 양식 유기체의 생체 중량의 0.001 중량% 내지 0.087 중량%의 총량으로 투여된다.
또 다른 측면에서, 영양학적 유효량은 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤 및/또는 캄페스테롤의 총량을 기준으로,
- 10 중량% 내지 60 중량%의 양의 이소푸코스테롤,
- 0 중량% 내지 50 중량%의 양의 콜레스테롤,
- 0 중량% 내지 50 중량%의 양의 24-메틸렌콜레스테롤,
- 0 중량% 내지 50 중량%의 양의 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤 및/또는 캄페스테롤이다.
또 다른 측면에서, 스테롤의 총 농도는 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 4 중량%, 바람직하게는 0.05 중량% 내지 3 중량%, 더욱 바람직하게는 0.05 중량% 내지 2 중량%이고, 더욱 더 바람직하게는 0.05 중량% 내지 1.5 중량%이다.
또 다른 측면에서, 스테롤의 농도는 다음 그룹에서 선택된다:
- 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1.5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.06 중량% 내지 1.2 중량%의 양의 콜레스테롤,
- 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1.5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.06 중량% 내지 1.2 중량%의 양의 24-메틸렌콜레스테롤,
- 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%, 더욱 바람직하게는 0.03 중량% 내지 0.6 중량%의 양의 시토스테롤, 바람직하게는 베타-시토스테롤,
- 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 2 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 중량% 내지 1.0 중량%, 더욱 바람직하게는 0.03 중량% 내지 0.6 중량%의 양의 이소푸코스테롤,
- 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%, 더욱 바람직하게는 0.02 중량% 내지 0.35 중량%의 양의 캄페스테롤,
- 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.2 중량%의 양의 스티그마스테롤, 또는
- 이들의 임의의 조합.
또 다른 측면에서, 조성물은 무척추동물 전체 먹이, 무척추동물 먹이의 일부 또는 먹이 보충제이고, 24-메틸렌콜레스테롤 대 추가의 스테롤 또는 추가의 스테롤의 조합의 비율은 10:1 내지 1:1이다.
또 다른 측면에서, 조성물은 꿀벌과(Apidae family)의 무척추동물, 특히 꿀벌(꿀벌족), 호박벌(뒤영벌족) 또는 침없는 꿀벌(침없는 꿀벌족)에 투여된다.
또 다른 측면에서, 조성물은
- 패티(patty) 또는 분말과 같은 고체 형태 또는 용액, 오일 또는 스프레이와 같은 액체 형태로
- 벌집(hive)의 내부 또는 외부에 투여된다.
일 구현예에서, 조성물은 실질적으로 순수하며. 즉, 벌의 전체 먹이에서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군 또는 꽃가루 대체 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 70 중량% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90 중량%로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 조성물은 실질적으로 순수하며, 즉, 임의의 추가의 화합물이 없다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원은 잎, 줄기, 뿌리, 괴경(tuber), 꽃, 씨앗, 나무껍질(bark) 및 열매 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물 종의 비화분(non-pollen) 조직이다.
또 다른 측면에서, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가의 스테롤의 공급원은 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 꽃, 씨앗, 나무껍질, 열매 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물 종의 화분 대체 조직이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤의 공급원은 하나 이상의 식물종의 꽃가루 대체 조직의 추출물, 오일, 또는 정제물(refinement) 또는 또는 이들의 조합이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤의 공급원은 가지과(Solanaceae), 벼과(Poaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 콩과(Fabaceae) 및 너도밤나무과(Corylaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종 이상의 식물 종의 꽃가루 대체 조직이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤의 공급원은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
- 해양 또는 담수 조류 종, 특히 참갈파래(Ulva lactuca)의 추출물, 오일 또는 정제물;
- 해양 규조류 종, 특히 탈라시오시라 프세오도나나(Thalassiosira pseudonana), 탈라시오시라 로툴라(Thalassiosira rotula) 또는 각모조(Chaetoceros muelleri)의 추출물, 오일 또는 정제물; 및
- 진균, 특히 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipitica)와 같은 효모의 추출물, 오일 또는 정제물.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및/또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤은 화학적으로 또는 효소적으로 합성되거나 진균, 박테리아 또는 조류와 같은 유전자 변형 숙주 유기체에 의해 얻어진다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤의 공급원은 조류, 식물, 진균, 조류, 규조류 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원은 꽃가루 대체 조직이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤은 합성 공급원으로부터 사회성(eusocial) 벌 군집에 제공된다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 스테롤은 꽃가루 대체 조성물의 일부로서 제공되고, 여기서의 꽃가루 대체 조성물은
- 10 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 15 중량% 내지 40 중량%의 양의 단백질,
- 1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 2 중량% 내지 12 중량%의 양의 지방산,
- 20 중량% 내지 90 중량%, 바람직하게는 30 중량% 내지 70 중량%의 양의 탄수화물,
- 선택적으로 비타민, 및
- 선택적으로 미네랄을 포함하고,
여기서의 성분들의 총량은 100 중량%이고, 중량%는 조성물의 총 건조 중량을 기준으로 한 것이다.
또 다른 측면에서, 꽃가루 대체 조성물에는 꽃가루가 없다.
또 다른 측면에서, 꽃가루 대체 조성물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기체에게 먹이를 주기 위해 사용된다:
- 무척추동물, 바람직하게는 꽃가루를 먹는 곤충, 더욱 바람직하게는 벌목 및 딱정벌레목의 곤충, 더욱 더 바람직하게는 꿀벌, 호박벌, 동애등에, 꽃등에 또는 무당벌레,
- 양식 유기체, 바람직하게는 플랑크톤 및 조류를 먹는 양식 유기체, 더욱 바람직하게는 어류, 어류 유충, 굴, 조개, 연체동물, 복족류 또는 갑각류.
또 다른 측면은 농축된 패티로서 본 발명의 꽃가루 대체 조성물의 용도이고, 여기서의 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤의 농도는 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 10 중량% 내지 33 중량%이다.
또 다른 측면에서, 꽃가루 대체 조성물은 꽃가루, 설탕, 오일 또는 지방, 꿀, 또는 단백질 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 벌 식욕/섭취(consumption) 유도 성분을 포함한다. 다른 무척추동물의 경우, 다른 식욕/섭취 유도 성분이 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 벌 식욕/섭취 유도 성분의 농도는 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 2.5 중량% 내지 15 중량%, 더욱 더 바람직하게는 5 중량% 내지 10 중량%이다.
다른 측면에서, 꽃가루 대체 조성물은 액체 형태 또는 분말로 사용된다.
액체 형태 또는 분말로서의 용도의 또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤의 농도는 꽃가루 대체 조성물의 전체 건조 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 99 중량%이다.
본 발명의 또 다른 측면은 특히 벌을 위한 꽃가루가 없는 사료 조성물(feed composition) 또는 꽃가루 대체 조성물로서, 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 1 중량%의 이소푸코스테롤, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 0.3 중량%의 이소푸코스테롤을 포함하는 꽃가루 대체 조성물이고, 여기서의 조성물은 사료 섭취를 증가시키기 위해 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 특히 벌을 위한 꽃가루가 없는 사료 조성물 또는 꽃가루 대체 조성물로서, 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 1 중량%의 푸코스테롤, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 0.3 중량%의 푸코스테롤을 포함하는 꽃가루 대체 조성물이고, 여기서의 조성물은 사료 섭취를 증가시키기 위해 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 특히 벌을 위한 꽃가루가 없는 사료 조성물 또는 꽃가루 대체 조성물로서, 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 0.3 중량%의 이소푸코스테롤 및 푸코스테롤을 포함하는 꽃가루 대체 조성물이고, 여기서의 이소푸코스테롤 대 푸코스테롤의 중량비는 0.01:100 내지 100:0.01이고, 조성물은 사료 섭취를 증가시키기 위해 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 특히 벌을 위한 꽃가루가 없는 사료 조성물 또는 꽃가루 대체 조성물로서, 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 0.3 중량%의 이소푸코스테롤/푸코스테롤을 포함하는 꽃가루 대체 조성물이고;
- 여기서의 이소푸코스테롤 대 푸코스테롤의 중량비는 0.01:100 내지 100:0.01이고;
- 꽃가루 대체 조성물은 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 0.5 중량%의 24-메틸렌-콜레스테롤을 추가로 포함하고;
- 이소푸코스테롤 및 푸코스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤의 비율은 2:100 내지 100:2이고; 그리고
- 꽃가루 대체 조성물은 사료 섭취를 증가시키기 위해 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 특히 벌을 위한 꽃가루가 없는 사료 조성물 또는 꽃가루 대체 조성물로서, 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 0.3 중량%의 24-메틸렌-콜레스테롤을 포함하는 꽃가루 대체 조성물이고;
- 여기서의 꽃가루 대체 조성물은 0.01:100 내지 100:0.01의 이소푸코스테롤 대 푸코스테롤의 중량비로서 이소푸코스테롤 및 푸코스테롤을 추가로 포함하고;
- 이소푸코스테롤과 푸코스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤의 중량비는 2:100 내지 100:2이고; 그리고
- 꽃가루 대체 조성물은 사료 섭취를 증가시키기 위해 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 특히 꿀벌을 위한 꽃가루 없는 사료 조성물 또는 꽃가루 대체 조성물로서, 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.02 중량% 내지 3 중량%의 스테롤을 포함하는 꽃가루 대체 조성물이고, 여기서의 스테롤은 24-메틸렌-콜레스테롤, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- 여기서의 이소푸코스테롤과 푸코스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤의 중량비는 0.5:100 내지 100:0.5이고/이거나;
- 이소푸코스테롤 대 푸코스테롤의 중량비는 0:10 내지 10:0이고/이거나;
- 이소푸코스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤, 푸코스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 콜레스테롤, 에르고스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 스테롤의 합의 중량비는 2:100 내지 100:2이고/이거나;
- 푸코스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤, 이소푸코스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 콜레스테롤, 에르고스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 스테롤의 합의 중량비는 2:100 내지 100:2이고/이거나;
- 24-메틸렌-콜레스테롤 대 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 콜레스테롤, 에르고스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 스테롤의 합의 중량비는 2:100 내지 100:2이고/이거나;
- 콜레스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 스테롤의 합의 중량비는 15:1 내지 1:100이고/이거나;
- 꽃가루 대체 조성물은 사료 섭취를 증가시키기 위해 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함한다.
도 1은 이소푸코스테롤이 있거나 없는 먹이를 먹는 벌의 코오트의 선택을 보여준다.
도 2는 특정 농도의 이소푸코스테롤이 포함된 먹이를 먹도록 제한된 벌의 코호트의 생존을 보여준다.
도 3은 벌 먹이에서 이소푸코스테롤의 영향에 대한 임계값을 보여준다.
도 4는 실시예 4A의 결과를 보여준다: 이소푸코스테롤 및 24-메틸렌콜레스테롤을 포함하는 다수의 스테롤을 공급한 벌을 이용한 Apidea 군집에서의 장기 먹이공급 실험.
도 5는 실시예 4B의 결과를 보여준다: 24-메틸렌콜레스테롤을 포함하지만 이소푸코스테롤이 없는 다수의 스테롤을 공급한 벌을 이용한 꿀벌과 군집에서의 장기 먹이공급 실험의 결과.
도 6은 실시예 4C의 결과를 보여준다: 먹이 중 스테롤의 잔체 농도가 일정하게 유지되고 특정 스테롤의 존재(농도)가 먹이들 간에 변화되도록 다양한 스테롤을 공급한 벌을 이용한 꿀벌과 군집에서의 장기 사료공급 실험의 결과.
도 7은 실시예 5A의 결과를 보여준다: 동애등에 성충에게 다수의 스테롤을 함유하는 먹이를 공급: 산란된 알의 부화율 및 산란된 난괴(egg mass)의 중량에 미치는 영향. 꽃가루 대체 먹이(Apix Biosciences의 US2019/0090507에 명시됨)을 곱급한 집단에서 성충 생존율 및 산란된 난괴의 수는 문헌[Thinn and Kainoh 2022. JARQ 56 (2), 211-217 (2022)]에 기재된 사육 방법을 사용하여 매일 측정했다.
도 8은 실시예 5B의 결과를 보여준다: 동애등에 성충에게 다양한 스테롤을 함유하는 사료를 공급: 성충 수명 및 번데기 전 단계까지의 유충 생존에 미치는 영향. 동애등에(BSF) 유충에게 문헌[Hogsette 1992. J. Econ. Entomol. 85(6): 2291-2294]에 기재된 바와 같이 22% 단백질, 4% 지방을 함유한 먹이를 부화(ecclosion)시까지 먹였다. 스테롤은 0.1%의 총량으로 먹이에 직접 첨가된 순수 화합물로 공급되었다. 50일 기간에 걸친 유충 및 성충 생존을 문헌[Georgescu 등, Eur. J.Entomol. 118: 297-306, 2021]에서와 같이 측정했다.
도 9는 실시예 5C의 결과를 보여준다: 동애등에 성충에게 다양한 스테롤을 함유하는 다양한 먹이를 공급: 스테롤은 다양한 스테롤을 먹인 검은 동애등에의 조직에서 발견된다. 스테롤은 먹이에 첨가하였다. 조직 내 스테롤의 측정은 문헌[Boukid 등, 2022. Insects 12, 672]에 기재된 바와 같이 GC-MS를 사용하여 BSF 조직의 비누화 후에 수행하였다.
도 10은 실시예 6의 결과를 보여준다: 다양한 스테롤을 공급한 동애등에의 추출물을 함유한 먹이를 꿀벌과 실험에서 꿀벌 군집에 공급.
도 11은 실시예 7의 실험 셋업(setup)을 보여준다. 도 11A는 텐트 울타리(tented enclosure)의 사진이다. 도 11B는 도 11A에 도시된 텐트 내의 벌집 및 피더(feeder)의 사진이다. 도 11C는 미니플러스 벌집(miniplus hive)의 벌 프레임 위에 올려진 패티를 보여준다. 도 11D는 개별 프레임을 촬영하기 위한 셋업 및 장치를 보여준다.
도 12는 도 11에 도시된 텐트 울타리 내에 있고 실시예 7에 따라 사료 A 대 사료 B를 공급한 벌집의 캐핑된 누적 새끼 수(cumulative capped brood count)를 보여준다(표 2B 및 표 4의 원시 데이터). 세로축은 12일부터 96일까지 생산된 캐핑된 새끼의 누적 수를 나타낸다. 가로 축은 텐트 울타리에 벌집을 배치하기 시작한 후 및 먹이 A 또는 먹이 B를 공급하기 시작한 후 12일부터 96일까지를 나타낸다. 위쪽 실선은 먹이 A를 공급한 모든 벌집의 평균을 나타낸다. 아래쪽 실선은 먹이 B를 공급한 모든 벌집의 평균을 나타낸다. 먹이 A를 공급한 개별 벌집은 짧은 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다. 먹이 B를 공급한 개별 벌집은 긴 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다.
도 13은 실시예 7에 따라 먹이 A 대 먹이 B를 공급한 텐트 울타리 내 벌집이 소비한 먹이의 누적 중량을 보여준다. 수직 축은 12일부터 96일까지 소비된 누적 그램 사료를 나타낸다. 가로 축은 텐트 울타리 내에 벌집을 배치하기 시작한 후 및 먹이 A 또는 먹이 B를 공급하기 시작한 후 12일부터 96일까지를 나타낸다. 위쪽 실선은 먹이 A를 공급한 모든 벌집의 평균을 보여준다. 아래쪽 실선은 먹이 B를 공급한 모든 벌집의 평균을 보여준다. 먹이 A를 공급한 개별 벌집은 짧은 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다. 먹이 B를 공급한 개별 벌집은 긴 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다.
도 14는 실시예 7에 따라 밀폐된 텐트에 배치를 시작한 후 및 먹이 공급을 시작한 후 24일 시점부터 96일까지 먹이 A 또는 먹이 B를 공급한 벌집의 캐핑된 새끼 수를 보여준다(표 2A 및 표 2A의 원시 데이터). 세로 축은 24일부터 96일까지 생산된 캐핑된 새끼의 수를 보여준다. 가로 축은 텐트 울타리에 벌집을 배치하기 시작하고 먹이 A 또는 먹이 B를 공급하기 시작한 후 24일부터 96일까지를 보여준다.
도 15는 실시예 7에 따라 36일부터 84일까지 먹이 A를 공급한 29번 벌집 내의 새끼가 있는 모든 프레임의 사진을 보여준다.
도 16은 실시예 7에 따라 36일부터 84일까지 먹이 B를 공급한 29번 벌집 내의 새끼가 있는 모든 프레임의 사진을 보여준다.
도 17은 실시예 7에 따른 실험의 시작 후 60일, 72일 및 84일째에 먹이 A를 공급한 벌집 번호 29(위쪽 2열) 및 먹이 B를 공급한 벌집 번호 26(아래쪽 2열) 내의 새끼가 있는 프레임의 사진을 보여준다. 벌집 번호 29와 26 플롯 모두는 먹이 A 및 먹이 B를 공급한 벌집의 평균과 가깝다.
도 18은 실시예 7에 따라 먹이 A 대 먹이 C를 공급한 텐트 울타리 내 벌집의 캐핑된 누적 새끼 수를 보여준다(표 2B 및 표 4의 원시 데이터). 세로축은 12일부터 96일까지 생산된 캐핑된 새끼의 누적 수를 나타낸다. 가로 축은 텐트 울타리에 벌집 배치를 시작하고 먹이 A 또는 먹이 B를 먹이기 시작한 후 12일부터 96일까지를 보여준다. 위쪽 실선은 먹이 A를 공급한 모든 벌집의 평균을 보여준다. 아래쪽 실선은 먹이 C를 공급한 모든 벌집의 평균이다. 먹이 A를 공급한 개별 벌집은 짧은 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다. 먹이 C를 공급한 개별 벌집은 짧은 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다.
도 19는 실시예 7의 실험의 시작 후 48일, 60일, 72일, 84일 및 96일에 먹이 A를 공급한 벌집 번호 29(위쪽 2열)와 먹이 C를 공급한 벌집 번호 14(아래쪽 2열)내의 새끼가 있는 프레임의 사진을 보여준다. 벌집 번호 29 및 14 플롯 모두 먹이 A와 먹이 C를 공급한 벌집의 평균에 가깝다.
도 20은 밀폐된 텐트에 배치를 시작하고 먹이를 공급하기 시작한 후 24일 시점부터 96일까지 실시예 8에 따라 먹이 A, B, C 및 E를 공급한 벌집 내의 캐핑된 새끼 수를 보여준다(표 6의 원시 데이터). 세로 축은 24일부터 96일까지 생산된 캐핑된 새끼의 수를 나타낸다. 가로 축은 텐트 울타리 내에 벌집을 배치하기 시작하고 먹이 A, B, C 및 E(상업용)를 공급하기 시작한 후 24일부터 96일까지를 보여준다.
도 2는 특정 농도의 이소푸코스테롤이 포함된 먹이를 먹도록 제한된 벌의 코호트의 생존을 보여준다.
도 3은 벌 먹이에서 이소푸코스테롤의 영향에 대한 임계값을 보여준다.
도 4는 실시예 4A의 결과를 보여준다: 이소푸코스테롤 및 24-메틸렌콜레스테롤을 포함하는 다수의 스테롤을 공급한 벌을 이용한 Apidea 군집에서의 장기 먹이공급 실험.
도 5는 실시예 4B의 결과를 보여준다: 24-메틸렌콜레스테롤을 포함하지만 이소푸코스테롤이 없는 다수의 스테롤을 공급한 벌을 이용한 꿀벌과 군집에서의 장기 먹이공급 실험의 결과.
도 6은 실시예 4C의 결과를 보여준다: 먹이 중 스테롤의 잔체 농도가 일정하게 유지되고 특정 스테롤의 존재(농도)가 먹이들 간에 변화되도록 다양한 스테롤을 공급한 벌을 이용한 꿀벌과 군집에서의 장기 사료공급 실험의 결과.
도 7은 실시예 5A의 결과를 보여준다: 동애등에 성충에게 다수의 스테롤을 함유하는 먹이를 공급: 산란된 알의 부화율 및 산란된 난괴(egg mass)의 중량에 미치는 영향. 꽃가루 대체 먹이(Apix Biosciences의 US2019/0090507에 명시됨)을 곱급한 집단에서 성충 생존율 및 산란된 난괴의 수는 문헌[Thinn and Kainoh 2022. JARQ 56 (2), 211-217 (2022)]에 기재된 사육 방법을 사용하여 매일 측정했다.
도 8은 실시예 5B의 결과를 보여준다: 동애등에 성충에게 다양한 스테롤을 함유하는 사료를 공급: 성충 수명 및 번데기 전 단계까지의 유충 생존에 미치는 영향. 동애등에(BSF) 유충에게 문헌[Hogsette 1992. J. Econ. Entomol. 85(6): 2291-2294]에 기재된 바와 같이 22% 단백질, 4% 지방을 함유한 먹이를 부화(ecclosion)시까지 먹였다. 스테롤은 0.1%의 총량으로 먹이에 직접 첨가된 순수 화합물로 공급되었다. 50일 기간에 걸친 유충 및 성충 생존을 문헌[Georgescu 등, Eur. J.Entomol. 118: 297-306, 2021]에서와 같이 측정했다.
도 9는 실시예 5C의 결과를 보여준다: 동애등에 성충에게 다양한 스테롤을 함유하는 다양한 먹이를 공급: 스테롤은 다양한 스테롤을 먹인 검은 동애등에의 조직에서 발견된다. 스테롤은 먹이에 첨가하였다. 조직 내 스테롤의 측정은 문헌[Boukid 등, 2022. Insects 12, 672]에 기재된 바와 같이 GC-MS를 사용하여 BSF 조직의 비누화 후에 수행하였다.
도 10은 실시예 6의 결과를 보여준다: 다양한 스테롤을 공급한 동애등에의 추출물을 함유한 먹이를 꿀벌과 실험에서 꿀벌 군집에 공급.
도 11은 실시예 7의 실험 셋업(setup)을 보여준다. 도 11A는 텐트 울타리(tented enclosure)의 사진이다. 도 11B는 도 11A에 도시된 텐트 내의 벌집 및 피더(feeder)의 사진이다. 도 11C는 미니플러스 벌집(miniplus hive)의 벌 프레임 위에 올려진 패티를 보여준다. 도 11D는 개별 프레임을 촬영하기 위한 셋업 및 장치를 보여준다.
도 12는 도 11에 도시된 텐트 울타리 내에 있고 실시예 7에 따라 사료 A 대 사료 B를 공급한 벌집의 캐핑된 누적 새끼 수(cumulative capped brood count)를 보여준다(표 2B 및 표 4의 원시 데이터). 세로축은 12일부터 96일까지 생산된 캐핑된 새끼의 누적 수를 나타낸다. 가로 축은 텐트 울타리에 벌집을 배치하기 시작한 후 및 먹이 A 또는 먹이 B를 공급하기 시작한 후 12일부터 96일까지를 나타낸다. 위쪽 실선은 먹이 A를 공급한 모든 벌집의 평균을 나타낸다. 아래쪽 실선은 먹이 B를 공급한 모든 벌집의 평균을 나타낸다. 먹이 A를 공급한 개별 벌집은 짧은 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다. 먹이 B를 공급한 개별 벌집은 긴 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다.
도 13은 실시예 7에 따라 먹이 A 대 먹이 B를 공급한 텐트 울타리 내 벌집이 소비한 먹이의 누적 중량을 보여준다. 수직 축은 12일부터 96일까지 소비된 누적 그램 사료를 나타낸다. 가로 축은 텐트 울타리 내에 벌집을 배치하기 시작한 후 및 먹이 A 또는 먹이 B를 공급하기 시작한 후 12일부터 96일까지를 나타낸다. 위쪽 실선은 먹이 A를 공급한 모든 벌집의 평균을 보여준다. 아래쪽 실선은 먹이 B를 공급한 모든 벌집의 평균을 보여준다. 먹이 A를 공급한 개별 벌집은 짧은 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다. 먹이 B를 공급한 개별 벌집은 긴 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다.
도 14는 실시예 7에 따라 밀폐된 텐트에 배치를 시작한 후 및 먹이 공급을 시작한 후 24일 시점부터 96일까지 먹이 A 또는 먹이 B를 공급한 벌집의 캐핑된 새끼 수를 보여준다(표 2A 및 표 2A의 원시 데이터). 세로 축은 24일부터 96일까지 생산된 캐핑된 새끼의 수를 보여준다. 가로 축은 텐트 울타리에 벌집을 배치하기 시작하고 먹이 A 또는 먹이 B를 공급하기 시작한 후 24일부터 96일까지를 보여준다.
도 15는 실시예 7에 따라 36일부터 84일까지 먹이 A를 공급한 29번 벌집 내의 새끼가 있는 모든 프레임의 사진을 보여준다.
도 16은 실시예 7에 따라 36일부터 84일까지 먹이 B를 공급한 29번 벌집 내의 새끼가 있는 모든 프레임의 사진을 보여준다.
도 17은 실시예 7에 따른 실험의 시작 후 60일, 72일 및 84일째에 먹이 A를 공급한 벌집 번호 29(위쪽 2열) 및 먹이 B를 공급한 벌집 번호 26(아래쪽 2열) 내의 새끼가 있는 프레임의 사진을 보여준다. 벌집 번호 29와 26 플롯 모두는 먹이 A 및 먹이 B를 공급한 벌집의 평균과 가깝다.
도 18은 실시예 7에 따라 먹이 A 대 먹이 C를 공급한 텐트 울타리 내 벌집의 캐핑된 누적 새끼 수를 보여준다(표 2B 및 표 4의 원시 데이터). 세로축은 12일부터 96일까지 생산된 캐핑된 새끼의 누적 수를 나타낸다. 가로 축은 텐트 울타리에 벌집 배치를 시작하고 먹이 A 또는 먹이 B를 먹이기 시작한 후 12일부터 96일까지를 보여준다. 위쪽 실선은 먹이 A를 공급한 모든 벌집의 평균을 보여준다. 아래쪽 실선은 먹이 C를 공급한 모든 벌집의 평균이다. 먹이 A를 공급한 개별 벌집은 짧은 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다. 먹이 C를 공급한 개별 벌집은 짧은 점선 및 벌집 번호로 표시되어 있다.
도 19는 실시예 7의 실험의 시작 후 48일, 60일, 72일, 84일 및 96일에 먹이 A를 공급한 벌집 번호 29(위쪽 2열)와 먹이 C를 공급한 벌집 번호 14(아래쪽 2열)내의 새끼가 있는 프레임의 사진을 보여준다. 벌집 번호 29 및 14 플롯 모두 먹이 A와 먹이 C를 공급한 벌집의 평균에 가깝다.
도 20은 밀폐된 텐트에 배치를 시작하고 먹이를 공급하기 시작한 후 24일 시점부터 96일까지 실시예 8에 따라 먹이 A, B, C 및 E를 공급한 벌집 내의 캐핑된 새끼 수를 보여준다(표 6의 원시 데이터). 세로 축은 24일부터 96일까지 생산된 캐핑된 새끼의 수를 나타낸다. 가로 축은 텐트 울타리 내에 벌집을 배치하기 시작하고 먹이 A, B, C 및 E(상업용)를 공급하기 시작한 후 24일부터 96일까지를 보여준다.
발명의 상세한 설명
이하, 본 발명의 구현예를 설명한다.
꿀벌은 무리지어 산다. 표준 산업 실시에는 다음과 같이 다양한 크기의 군집이 있다: 산업 표준인 8개 프레임 군집은 ~20000마리의 벌을 포함하고; 10개 프레임 군집은 ~ 24000마리 벌; 2층짜리 12.5개 프레임의 대형 군집은 30000마리 벌; 2개의 벌집(super)을 이용한 군집은 50000마리 벌을 포함한다. 전체 벌 군집은 크기가 다양하다(계절 및 영양 가용성에 따라 연중 평균 +/- 50% 크기 증가/감소).
문헌[Rortais 등, 2005 (Apidologie, 36(1), 71-83)]은 벌의 꽃가루 섭취 문헌을 종합적으로 검토하고 군집당 매년 10 내지 최대 55kg까지 수집하는 것을 확인했다. 문헌[Crailsheim 등, 1993 (J Insect Phys 38(6):409-419)]은 6월 내지 8월에 약 25,000마리의 벌이 있는 군집에서 두 군집의 연간 꽃가루 섭취량을 각각 13.4kg과 17.8kg으로 계산했다. 문헌[Wille 등, 1982 (Revue Suisse de Zoologie 4: 897-914)]은 연간 10 내지 26kg의 꽃가루를 기록했다. 이는 분명히 군집 크기, 군집 발달, 환경 및 꽃가루 유형에 따라 달라진다.
문헌[Keller 등, 2005 (Bee world, 86(1): 3-10)]은 일벌 한 마리가 평생 동안 140 내지 180mg의 꽃가루를 필요로 한다고 추정하고 있다. 전체 군집이 연간 100,000 내지 200,000마리의 벌을 사육한다면, 군집당 17 내지 34kg의 꽃가루가 필요하게 된다. 문헌[Crailsheim 등, 1993 (J Insect Phys 38(6):409-419)]은 5개의 공개된 논문으로부터 군집당 소비되는 꽃가루의 양을 요약했다. 또한, 이 문헌의 저자들은 이들이 측정한 두 개의 군집의 꽃가루 소비량을 측정했다. 이들은 연간 약 150,000마리의 새끼를 생산하는 군집에 필요한 꽃가루의 평균 양이 19kg이라고 추정하고 있다.
벌 군집이 꽃가루가 부족한 기간에 보충 먹이를 받는 경우, 일반적으로 단백질 패티 또는 꽃가루 패티 형태의 보충 먹이를 받으며(대부분의 먹이공급 방식은 "무제한(ad libitum)"임), 결과적으로 2주마다 12.5개 프레임당 약 1.5 내지 2 내지 3파운드(0.680 내지 1.35kg)를 소비한다. 업계에서는 벌의 프레임은 약 2400마리 벌(군집에서는 30000마리 벌)로 정의되며 업계에서 사용되는 벌집은 5개 또는 8개, 10개 또는 12개 이상의 프레임을 포함할 수 있다. 봄철이 시작될 때 벌집은 부분적으로만 채워지며(예: 10개 프레임의 벌집에서 5개 벌 프레임) 계절이 진행됨에 따라 벌집의 벌 개체수는 10개 프레임 벌집을 10개 벌 프레임으로 채울 정도로 확장된다. 겨울 동안 군집은 이의 개체수를 5 또는 6개 벌 프레임으로 감소시킨다.
벌이 필요로 하는 "꽃가루 등가 사료(mg)"의 투여량을 계산할 때, 다양한 식물 종 유래의 꽃가루에는 약 50%의 설탕, 단백질 및 기타 성분이 포함되어 있으므로 꽃가루의 영양가는 식물에 따라 다르다(+/-50% 범위)는 점을 고려해야 한다. 꽃가루의 보충 공급, 꽃가루 보충제 또는 단백질 보충제를 통해 군집은 2주마다 약 1,5 내지 약 3lb 또는 (680g 내지 1360g)의 꽃가루 보충제를 투여 받는다. 연간 기준으로 이는 17,7kg 내지 35,4kgkg의 꽃가루 보충 사료에 해당하며, 이는 꽃가루의 다양한 영양적 특성을 고려하여 꽃가루를 먹는 10개 프레임의 군집에 대해 발표된 수치를 갖는 범위 내에 있다. 크기가 다른 군집의 경우, 투여량 계산이 비례적으로 조정된다(1개 벌 프레임 = 약 2400마리 벌).
문헌[Roessink 등, 2021(J Apic Res 60: 659-654)]의 표를 기반으로 계산한 결과, 30,000마리 벌 군집은 하루에 62g 또는 2주에 868g의 꽃가루를 소비한다(활성 개화 및 벌 증식 계절에서).
더욱 광범위한 설명은 아래의 인용문에 포함된 텍스트 및 표를 통해 제공된다: https://www.insignia-bee.eu/how-much-pollen-does-a-colony-need/
Rortais 등(2005)은 벌의 꽃가루 소비 문헌을 종합적으로 검토하고 군집당 매년 10 내지 55kg을 수집한다고 기록했다. Crailsheim 등은 6월 내지 8월에 약 25,000마리의 벌 군집에서 두 군집의 연간 꽃가루 소비량을 각각 13.4kg 및 17.8kg으로 계산했다. Wille 등은 연간 10 내지 26kg의 꽃가루를 기록했다. 이는 분명히 군집 크기, 군집 발달, 환경 및 꽃가루 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 옥수수 꽃가루는 전체 꽃가루 중 영양소 비율이 상대적으로 낮기 때문에 혼합 꽃가루에 비해 약 두 배의 양으로 소비된다. 건조 중량의 단백질 백분율은 혼합 꽃가루와 비슷하다(Hocherl 등, 12012). 분명히, 군집이 성장하고, 유지되고, 기능하기 위해 수집할 수 있거나 수집해야 하는 고정된 양은 없다. 그럼에도 불구하고, 한 군집에 대한 연간 꽃가루 필요량을 평가할 수 있는 좋은 연구가 있다. 앞서 언급한 Rortais 등 (2005)의 논문에 따르면, 내역벌(nurse bee)은 평균 65mg의 꽃가루를 소비하고 일벌 유충(worker-larvae)은 5.40mg을 소비한다. 결과적으로 벌은 평생 동안 최소 70.4mg을 소비한다. 이는 평균 추정치이며; 두 배의 양도 보고되었다. 앞서 언급한 Crailsheim 등의 연구에서는 하루 꽃가루 소비량은 3.4 내지 4.3mg이었다. 여름 꿀벌의 수명이 30일인 경우 이는 약 115mg이다. 꽃가루 소비량을 평가하는 또 다른 접근법은 Keller 등 (2005a)의 리뷰 논문에 제시되어 있다. 이는 새끼 및 벌에서 질소(N)를 기준으로 꽃가루 소비량을 평가한 것이다. 꽃가루는 벌의 먹이에서 유일한 N 공급원이다. N을 꽃가루로 변환하려면, 꽃가루 단백질이 16% 질소를 함유하고, 꽃가루가 20% 단백질을 함유하고, 소화효율이 80%라고 가정한다. 따라서, 10mg의 N의 경우, 단백질은 62.5mg이고, 62.5mg의 단백질의 경우 꽃가루는 312.5mg이고 영양(alimentary) 과정의 효능에 따라 벌이 소비하는 꽃가루는 390.6mg이다. 이 모든 것을 고려하면 벌 한 마리를 사육하는데 125mg의 꽃가루가 필요하다. 출현 후 벌에서의 N은 0.86mg 만큼 증가한다. 0.86 mg의 N은 39 mg 꽃가루에 해당한다. 그러므로, 배변(defecation)에 의한 N 손실은 고려되지 않기 때문에 각각의 벌은 최소한 125 + 39 = 164mg의 꽃가루를 필요로 한다. 벌의 활동 및 번식 기간을 200일로 계산하고 벌의 평균 수명을 35일로 계산하면(Steen 등, 2012), 200/35 = 6세대가 얻어진다. 평균 15000마리의 벌 군집을 유지하기 위해 15000 x 6 = 90000마리의 벌을 사육한다. 매년 사육되는 벌의 수 및 필요한 꽃가루의 계산된 양은 [이 논문의] 표 1에 요약되어 있다.
처음에 언급한 35kg은 큰 군집에 필요한 양이며 최적의 추정치이다. 15와 25 사이의 양이 더 현실적으로 보인다. 다시 말하지만, 이는 모두 꽃가루 유형, 환경, 군집 발달 및 꽃가루 트랩 여부에 따라 달라진다. 꽃가루로부터 집단을 박탈하면 꽃가루 수집이 촉진된다. 적절한 꽃가루 흐름을 유지하는 것은 양봉가의 몫이다. 꽃가루 저장량이 충분한지 확인하려면, 간단히 군집에서 벌떡 방(beebread cell)의 표면/수를 대략적으로 추정하면 된다. 건강한 보통 크기의 군집은 하루에 약 0.5 내지 2dm2(200 내지 800개의 반쯤 채워진 벌떡 방)를 필요로 한다. 또 다른 간단한 추정은 꽃가루 트랩의 수확량을 측정하는 것이다. 꽃가루 트랩의 효능은 10 내지 50% 사이에서 다양하다는 점을 고려해야 한다(Keller 등, 2005b).
문헌[Roessink 등, 2021, Beebread consumption by honeybees is fast: results of six-week field study, Journal of Apicultural Research, 60:659-664]의 표 1은 주어진 크기의 군집에 대한 일일 꽃가루 소비량을 기준으로 벌집의 꽃가루 요구량을 계산한 예시를 보여준다. 유충 및 내역벌은 꽃가루의 소비자이다. 나이가 많은 일벌은 꿀을 소비한다.
꽃가루는 꿀벌 및 꽃가루를 먹는 곤충의 천연 식품 공급원을 나타낸다. 꽃가루는 식물이 곤충을 먹이도록 최적화되지는 않는다(식물 사용 = 수정을 위해 최적화됨). 다양한 종의 꽃가루는 넓은 범위의 단백질, 지질, 스테롤, 항산화 분자를 다양한 농도로 함유한다. 따라서, 이러한 구성 성분 중 어떤 것이 유익하고 어떤 것이 곤충이 꽃가루를 먹는 것을 막는 식물 방어 분자이고 어떤 것이 곤충 영양에 중요한 성분이 아니므로 어떤 것을 인공 먹이에 포함시키는 것이 중요하고 어떤 것을 인공 먹이에서 제외하는 것이 중요한지는 아직 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 30000마리의 벌 군집에 대해 계산된 2주 투여량으로서 0.14 내지 12g의 이소푸코스테롤을 첨가하는 것이 (새끼 생산 및 수명과 같은 기타 적합성 매개변수에서 볼 수 있듯이) 군집 및 벌의 성능에 유익하다는 것을 확인하였다. 이 투여량은 2주에 걸쳐 30,000마리의 벌 군집에 공급한 680그램 패티의 0.01% 내지 1.76% 이소푸코스테롤 농도를 나타낸다.
벌집에서 비화분 보충제를 소비하는 벌을 기준으로 계산하면(= 내역벌 = 벌집에 있는 벌의 50%). 이는 140mg/벌 15000마리 = 0.009mg 내지 12000mg/벌 15000마리 = 벌집에서 14일 동안 내역벌당 0.8mg 이소푸코스테롤 또는 푸코스테롤의 투여량을 나타낸다(내역벌 무게는 110mg). 이는 하루당 체중의 %로 0.009/110*100/14 = 0.0006% 내지 0.8/110*100/14= 0.052%의 이소푸코스테롤 또는 푸코스테롤 투여량을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 하루당 체중의 0.0006% 내지 0.052%의 이소푸코스테롤 또는 푸코스테롤의 투여량이 호박벌, 동애등에 성충 및 유충과 같은 다른 꽃가루를 먹는 곤충; 무당벌레 성충, 꽃등에 및 기타 꽃가루를 먹는 곤충의 유충 및 성충의 생산에 유익하다는 것을 확인하였다. 특히, 성충의 생식력과 번식력, 및 어린 유충의 더 높은 부화율 및 생존에 중요하다.
투여 형태는 흡수 효율 및 생체 이용률에 영향을 미친다.
투여 방법
벌 군집이나 유기체에 대한 투여는 원하는 효과가 필요한 기간 동안에만 이루어질 수 있다. 벌이 겨울철에서 나올 때 정상적인 붕아 발달을 개선, 유도 또는 지원하거나, 여왕벌 번식을 유도 또는 지원하기 위해서나 곤충이 생식세포(gamete)나 알을 생산해야 하는 경우 단 한 번 투여된다. 벌이 영양이 부족한 꽃가루를 생산하는 작물(예: 블루베리, 당근 등)을 먹는 경우 투여는 더 오랜 기간 동안 이루어질 수 있거나 봄, 여름 또는 가을에 꽃가루가 부족한 기간 내내 이루어질 수 있다. 다양한 크기의 군집의 경우 투여량은 존재하는 벌 또는 내역벌의 양에 비례하여 조정될 수 있다.
이러한 격주 투여량의 이소푸코스테롤은 벌집이나 사육 곤충에게 다양한 방법으로 투여될 수 있다: 이러한 투여량의 이소푸코스테롤은 다음과 같이 다양한 제제(벌이나 표적 동물이 쉽게 섭취할 수 있는 방식으로 현탁, 용해 또는 유화된 형태로 통합됨)로 군집에 투여될 수 있다:
- 30000마리 벌의 벌집에 2주마다 투여되는 표준 1.5 내지 3파운드의 단백질 또는 꽃가루 보충(pollen supplement) 패티에 포함됨. 이 경우, 일 구현예에서, 조성물은 꽃가루 대체 조성물의 총 중량에 대한 백분율로서 꿀벌의 경우 먹이의 0.01 내지 5%, 바람직하게는 0.01 내지 2%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1%, 더욱 더 바람직하게는 0.03 내지 0.9%, 그리고 호박벌의 경우 0.03 내지 0.8%의 양으로 이소푸코스테롤 또는 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
- 농도가 더욱 높아지도록 작은 패티에 더욱 많이 농축됨. 예를 들어, 최대 33%의 스테롤이 꽃가루, 설탕, 유지/지방, 꿀, 단백질 또는 이들의 혼합물과 같은, 벌이 제제를 섭취하도록 유도하는 성분에 포함되거나 이와 혼합됨, 또는
- 꽃가루, 설탕, 기름/지방, 꿀, 단백질 또는 이들의 혼합물과 같은, 벌이 제제를 먹도록 유도하는 성분에 이소푸코스테롤이 포함되거나 이와 혼합된 분말 또는 페이스트로서 공급 스테이션에서 군집 내에 퍼지거나 군집 외부의 공급됨;
- 꽃가루, 설탕, 기름/지방, 꿀, 단백질 또는 이들의 혼합물과 같은, 벌이 제제를 먹도록 유도하는 성분에 이소푸코스테롤이 포함되거나 이와 혼합되어 있는 시럽 또는 액체로서 공급 스테이션에서 군집 내에 퍼지거나 군집 외부의 공급됨,
- 또 다른 구현예에서, 투여량의 스테롤 분자는 예를 들어 사전 프로그래밍된 방식으로 콜로니에 스테롤 조성물을 주입하는 장치를 통해 전달될 수 있다.
- 또는 벌이 당업자에게 공지된 것과 같은 화학물질 또는 영양소를 섭취하도록 지시된 투여량을 전달하는데 사용될 수 있는 임의의 방법.
또 다른 측면에서, 스테롤 혼합물은 패티 또는 유사한 먹이를 통해 투여되지 않지만, 상기한 다수 및 비율의 스테롤은 수성 또는 유성 매질 또는 영양 슬러시(slush) 또는 기타 식용가능한 형태에 용해되고 마시기 위한 액체, 벌집용 액체 페이스트 또는 스프레이, 또는 분말로서 군집에 투여된다. 이러한 구현예에서, 스테롤의 건조 중량 농도는 건조 중량으로 0.01 내지 100%일 수 있다(물 담체는 투여된 매질로부터 증발되기 때문에).
다른 스테롤과 조합된 이소푸코스테롤의 공급의 효과:
또한, 본 발명자들은 이소푸코스테롤 및/또는 콜레스테롤, 및/또는 24-메틸렌콜레스테롤 및/또는 베타-시토스테롤, 및/또는 스티그마스테롤 및/또는 캄페스테롤의 조합이 다음을 나타내는 것을 확인했다:
(1) 이소푸코스테롤 단독을 공급하는 것보다 개선,
(2) 이소푸코스테롤이 없는 상기 스테롤의 조합을 공급하는 것보다 개선,
(3) 콜레스테롤, 또는 24-메틸렌콜레스테롤, 또는 캄페스테롤, 또는 스티그마스테롤 또는 베타-시토스테롤이 없는 상기 스테롤의 조합을 공급하는 것보다 개선.
놀랍게도, 이소푸코스테롤과, 24-메틸렌콜레스테롤, 콜레스테롤, 이소푸코스테롤 및 캄페스테롤, 베타-시토스테롤 또는 스티그마스테롤을 포함한 다양한 스테롤을 함유한 먹이를 공급한 벌 군집은 4주기 이상 동안 새끼 발달을 지원할 수 있다. 이소푸코스테롤이 없는 동일한 먹이는 그렇게 할 수 없다. 중요한 것은 본 발명자들의 실험에서 새끼 생산 수준이 안정적인 수준으로 떨어졌다는 것이다. 이러한 궤적(trajectory)은 본 발명의 먹이가 무한한 새끼 생산을 가능하게 하는 적절한 수준의 필수 영양소를 공급한다는 것을 보여준다. 이는 이러한 먹이가 이 기간 동안 벌 군집에 대하여 꽃가루를 대체하는 역할을 할 수 있음을 의미한다. 따라서, 이 먹이 내의 이소푸코스테롤은 양봉이 자연 환경이나 농업 환경에서 꽃가루 자원으로부터 독립되도록 한다. 호박벌의 경우, 다양한 스테롤을 함유한 이러한 먹이를 통해 여왕벌은 꽃가루 없이도 유충을 성충으로 키울 수 있다.
이러한 방안(recipe)을 만드는 것은 문헌으로부터 명백하지 않다. 예를 들어, 문헌[Rasmont 등, (2005 J Econ Ent 98(3): 656-663)]은, 시토스테롤과 스티그마스테롤이 꿀벌에 대한 섭식 저해 물질일 뿐 필수가 아니라는 것을 확인하기 위해 단 하나의 스테롤만을 함유한 인공 먹이를 꿀벌에게 공급한 Herbert 등(1980)의 데이터를 해석했다.
본 발명자들은 본 발명의 먹이의 유용성을 꿀벌부터, 생물학적 방제(예: 무당벌레), 곤충 바이오매스 생산(예: 동애등에) 및 수분(꽃등에)과 관련하여 상업적인 관련성을 갖는 다른 꽃가루를 먹는 곤충까지 확장했다.
식량 생산에서 발생하는 폐기물을 활용하는 축산 및 가축 사육에 대한 변화가 시급히 필요하다. 또한, 무당벌레, 꽃등에와 같은 천연 곤충 포식자를 생산 및 방출하는 것과 같은, 농약에 의존하지 않는 농업 해충으로부터 작물을 보호하는 방법은 환경 영향을 줄이고 생물 다양성을 보호하는 통합 해충 관리 전략을 수립하는 중요한 수단이다.
산업적 농업 폐기물을 활용하는 중요한 떠오르는 수단은 동애등에(Hermetia illucens)와 같은, 폐기물에서 파리 유충을 배양하는 것이다. 동애등에 유충은 잡식성이며 배설물을 포함한 식물 또는 동물 폐기물을 먹을 수 있어, 폐기물 바이오매스를 가축 사료로 전환하는 유리한 수단이 된다. 농업 생산에서, 이러한 유충과 번데기는 가금류와 어류의 먹이가 된다. 이들 곤충은 이들이 소비하는 먹이로부터 지방산 및 스테롤 영양소를 획득하여 먹이 사슬에 귀중한 첨가물인 유충을 제공한다(Boukid 등, 2021 Insects 12, 672. https://doi.org/10.3390/insects12080672). 그러나, 산업 폐기물과 같은 먹이는 동애등에에 최적화되지 않았으며 종종 주요 필수 영양소가 누락되어 있다. 예를 들어, BSF를 먹인 유충의 발달 시간, 크기 및 사망률은 이들의 배양에 사용되는 사료의 특성에 크게 영향을 받는다(Lalander 등, 2019. J Cleaner Production, https://doi.org/10.1016/j.jclepro.2018.10.017). 최적이 아닌(suboptimal) 먹이로 인한 발달 시간 지연은 사육 시스템의 효율성을 감소시킨다.
기존 사육 방법의 또 다른 문제는 먹이가 생활사 단계에 최적이 아니라는 것이다. 완전 변태 곤충은 유충 및 성충으로서 서로 다른 사료를 섭취하는 경우가 많다. 각 생활사 단계마다 영양 요구량이 상당히 다르다. 실험실이나 산업 생산 환경에서 유충에게 공급되는 것은 성충의 번식력 및 생존에 적합하지 않을 수 있다.
야생에서, BSF 유충은 부패하는 유기물을 먹고 성충 BSF는 꽃가루를 먹는다. 유충과 마찬가지로, 성충 BSF도 단백질을 필요로 하면, 이들은 단백질을 먹일 때 더 많은 알을 생산한다(Bertinetti 등, 2019. Journal of Insect Science 19(1): 19; 1-7). 단백질이 성능을 향상시키더라도, 단백질을 먹인 실험실에서 사육된 파리의 난괴 크기 및 알의 부화는 야생 먹이를 먹인 파리의 절반 미만이다(Bertinetti 등, 2019). 아직 확인되지 않은 실험용 먹이에는 특정 영양소가 누락되었을 가능성이 있다(Bertinetti 등, 2019). 성충은 산업 생산에서 율속 단계인 알을 생산하기 때문에 성충 성능은 중요하다(Cickova 등, 2015 Waste Management Volume 35, January 2015, 68-80).
Bertinetti 등 (2019)은 꽃가루는 BSF에 필요한 주요 영양소를 것으로 추측하고 있다. 최근, 동애등에는 꽃가루가 포함된 사료를 먹였을 때 산란 능력이 훨씬 향상된 것으로 확인되었다(Thin 및 Kanoi. 2022. JARQ 56 (2): 211-217). 예를 들어, 암컷 검은 동애등에에 꽃가루를 공급하면 산란 및 알 부화가 두 배로 늘어나고 수명이 30% 만큼 증가한다(Thin 및 Kanoi 2022). 그러나 이러한 변화를 일으키는 꽃가루의 성분은 알려져 있지 않다.
농업에 사용되는 다른 유익한 곤충에 꽃가루를 공급하는 것도 성충의 번식력에 영향을 미친다. 이는 무당벌레(Coccinelidae) 및 꽃등에(Syrphidae)와 같은, 생물학적 방제를 위해 사육되는 곤충에서 특히 중요하다. 예를 들어, 무당벌레 유충은 선호하는 먹이인 진딧물이 없을 때 꽃가루를 먹는다(Berkvens 등, 2010 Eur. J. Entomol. 107: 189-195, 2010, Shuldiner-Harpez and Coll. 2017 J Insect Behav 30: 432-438). 중요한 것은 딱정벌레 성충에 의한 꽃가루 섭식이 번식력을 위해 필요한 것으로 확인되었으며, 꽃가루를 먹지 않는 수컷 딱정벌레는 생존가능한 정자를 생산할 수 없다(Ugine 등. 2019 Ecology Letters 22: 275-283). 또한, 꽃가루 섭식은 중요한 수분매개자이자 진딧물의 포식자인 꽃등에(Syrphidae)의 번식력에 필수적인 구성요소이다(Hickman 등, 1995 New Zealand Journal of Zoology 22: 387-392). 암컷 꽃등에는 이들이 먹는 꽃가루의 종류를 매우 신중히 선택하며; 꽃가루의 종류는 번식력 및 자손의 생존에 영향을 미친다(Amorous-Jimenez 등, 2014 BioControl 59:427-435).
꽃가루에는 다른 육상 식물이나 동물 공급원에서는 발견되지 않는 다양한 피토스테롤이 포함되어 있다(Zu 등, 2020. New Phyt 230: 1169-1184). 이러한 스테롤은 식물 내부와 식물 외부에서 광범위한 기능을 가지고 있다. 많은 피토스테롤은 곤충이 식물을 먹는 것을 억제하기 위해 식물에서 생산된다.
본 발명자들은 꽃가루에서 발견되는 일반적인 스테롤인 이소푸코스테롤이 꽃가루를 먹는 곤충의 필수 영양소라는 사실을 놀랍게도 확인했다. 꽃가루가 없는 먹이를 통해 전달되는 이소푸코스테롤은 성충 및 유충 BSF의 성능을 향상시킨다. 또한, 본 발명자들은 성충 암컷 꽃등에가 선택하는 꽃가루의 주요 스테롤 성분이 이소푸코스테롤임을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 이소푸코스테롤과 적어도 하나의 추가의 스테롤, 특히 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 및 기타 피토스테롤, 특히 캄페스테롤, 베타-시토스테롤 또는 스티그마스테롤의 조합이 많은 무척추동물, 특히 벌 및 꽃가루를 먹는 파리, 나방/나비 및 딱정벌레를 포함한 완전 변태 곤충에서 더 높은 성장 및/또는 건강 성능을 제공한다는 사실을 확인했다.
또한, 발명자들은 이소푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤 및 캄페스테롤의 조합을 먹이는 것이 다음을 나타낸다는 것을 확인했다:
(1) 이소푸코스테롤 단독에 비해 개선,
(2) 이소푸코스테롤이 없는 상기 스테롤의 조합에 비해 개선,
(3) 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 또는 베타-시토스테롤이 없는 상기 스테롤의 조합에 비해 개선.
놀랍게도, 이소푸코스테롤과 스테롤 혼합물이 포함된 먹이를 양식된 동애등에나 딱정벌레 성충에게 먹이면 산란 및 부화 성능과 성충의 수명이 향상된다. 이소푸코스테롤과 스테롤 혼합물이 함유된 사료를 새끼를 생산할 유충에게 먹이면 동일한 효과를 얻을 수 있다(성충은 유충/번데기 단계에서 상당한 양의 영양을 물려받는다). 이는 그러한 먹이가 꽃가루 대체물 및 실험실에서 사육된 곤충 군집에 대한 보충 영양의 형태로 작용할 수 있음을 의미한다. 따라서, 이러한 먹이를 통해 유익한 곤충의 산업적 배양에서 유충 발달 시간 및 성충 번식력을 최적화할 수 있다.
이는 문헌으로부터 명백하지 않다. 곤충 스테롤에 대한 세계적인 연구자인 Svoboda는 두 종을 제외한 모든 종에서 콜레스테롤이 먹이에 존재하는 경우 먹이에 필요한 스테롤을 공급한다고 교시하고 있다(Svoboda. 1999. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 34(1):49-57). 그의 요약에서는 많은 꽃가루를 먹는 곤충에 대한 필수 영양소로서 꽃가루 유래의 스테롤이 필요하다는 점을 인식하지 못했다. 그는 이소푸코스테롤을 완전 변태 유충 성장이나 성충 생식력에 필요한 스테롤로 인식하지 못했다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 꿀벌 및 호박벌과 같은 벌 및 무당벌레, 동애등에, 꽃등에, 굴, 새우 및 어류 유충과 같은 꽃가루 또는 조류를 소비하는 동물에게 먹이를 주는 방법으로서,
- 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물을 영양학적 유효량으로 포함하는 꽃가루 대체 제제(pollen substitute formulation)를 제공하는 단계;
- 꿀벌 및 호박벌과 같은 벌 및 무당벌레, 동애등에, 꽃등에, 굴, 새우 및 어류 유충과 같은 꽃가루 또는 조류를 소비하는 동물에 꽃가루 대체 제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법이다.
영양학적 유효량
바람직한 측면에서, 이소푸코스테롤 또는 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 스테롤을 함유하는 꽃가루 대체 제제의 투여량은, 30000마리의 벌 군집에 대한 0.2 내지 48g, 바람직하게는 0.4g 내지 36g, 더욱 바람직하게는 0.6 내지 20g의 상기 스테롤 군의 총 격주 투여량에 해당하고, 위에 나타낸 투여량의 스테롤 100%는 다음과 같이 나누어진다: 이소푸코스테롤 - 푸코스테롤은 스테롤 투여량의 10 내지 60%이고; 나머지 스테롤 또는 다수의 스테롤은 전체 스테롤 투여량의 나머지를 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 14일 동안 30,000마리의 벌 군집을 위한 먹이에서 이소푸코스테롤/푸코스테롤 및/또는 콜레스테롤, 및/또는 24-메틸렌콜레스테롤, 및/또는 캄페스테롤 및/또는 스티그마스테롤 및/또는 베타-시토스테롤로 구성된 피토스테롤로 이루어진 군의 100% 투여량은 0.3 내지 20g의 조성물인데, 이 투여량의 10 내지 60%는 이소푸코스테롤이고/이거나 0 내지 50%는 콜레스테롤이고/이거나 0 내지 50%는 24-메틸렌콜레스테롤이고/이거나 0 내지 50%는 베타-시토스테롤 및/또는 스티그마스테롤 및/또는 캄페스테롤의 혼합물이다.
이는 "스테롤 조성물"의 일일 투여량 범위가 사료를 소비하는 곤충 체중의 0.001%(식 = 0.3/14/1650 x 100) 내지 사료를 소비하는 곤충 체중의 0.087%(식 = 20/14/1650 x 100)이고, 스테롤 조성물의 10 내지 60%가 이소푸코스테롤이고/이거나 0 내지 50%가 콜레스테롤이고/이거나 0 내지 50%가 24-메틸렌콜레스테롤이고/이거나 0 내지 50%가 베타-시토스테롤 및/또는 스티그마스테롤 및/또는 캄페스테롤의 혼합물인 것을 나타낸다.
이 계산은 벌의 50%가 각각 무게가 110mg인 내역벌이라는 것을 기준으로 한다.
전체 투여량은 더 크거나 작은 곤충, 무척추동물, 곤충 군집 및 더 짧거나 긴 먹이 공급 간격에 따라 비례적으로 조정될 수 있으며, 여기에 표시된 단위 투여량은 14일의 기간 동안 벌 30,000마리 군집에 대한 것이다(위의 Keller 등 2005b의 표 참조).
다른 꽃가루를 먹는 곤충에도 동일한 조성 및 투여량 범위가 적용된다.
또 다른 구현예에서, 이들 스테롤 모이어티 중 일부 또는 전부는 수용성 스테롤 글리코시드 또는 스테롤 설페이트 또는 유사한 염과 같은 전구약물, 또는 스테롤-에스테르와 같은 지용성 형태 또는 다른 유사한 전구약물 형태로 전달될 수 있고, 이때 투여량은 결합된(conjugated) 스테롤 분자의 전체 분자량에서 각각의 스테롤 핵의 분자량 분율을 나타내도록 조정된다.
이소푸코스테롤에 대해 위에서 설명한 다양한 투여 방법이 이소푸코스테롤 및 여기에 설명된 다른 스테롤(들)에 적용될 수 있다.
다른 꽃가루를 먹는 곤충(위 참조)에게 전달하고자 하는 이소푸코스테롤 및 스테롤 군의 투여량을 일일 체중%로 계산하기 위하여 다음 식을 사용한다:
- [ 30000 / 2] * 0.110 그램 = "30,000마리의 벌집에서 비화분(non-pollen) 보충제를 소비하는 곤충(내역벌 및/또는 유충)의 무게"(내역벌 및/또는 유충당 0.11그램; 벌집에 있는 벌 30000마리(이 중 50%는 내역벌 및/또는 유충임) = 1650그램)
- ["30000마리의 벌 군집에 14일 동안 전달되는 주어진 스테롤 또는 스테롤 군의 투여량"/14] = "투여된 스테롤(들)의 일일 투여량"
- "투여되는 일일 투여량(그램)" / "30000마리의 벌집에 있는 비화분 보충제를 소비하는 곤충(내역벌 및 유충)의 무게(그램)" x 100 = "곤충 체중 1 그램당 하루에 투여되는 스테롤(들)의 체중 %"
- 호박벌 군집에 대한 스테롤의 투여량:
"곤충 체중 1g당 하루에 투여되는 스테롤(들)의 체중 %" X "먹이고자 하는 곤충(내열벌 및 유충)의 무게"
평균적으로 위의 표를 참조한다. 한 군집에서 소비되는 꽃가루의 2/3는 내역벌이 소비하고 1/3은 존재하는 유충이 소비한다(위의 표 참조).
이소푸코스테롤/푸코스테롤 및/또는 콜레스테롤, 및/또는 24-메틸렌콜레스테롤, 및/또는 캄페스테롤 및/또는 스티그마스테롤 및/또는 베타-시토스테롤로 구성된 피토스테롤로 이루어진 스테롤 군이 벌 30,000마리의 군집에 14일당 1.5 내지 3파운드 패티를 통해 투여되는 바람직한 구현예에서, 패티는 다음을 함유한다:
- 이소푸코스테롤(사료 건조 중량의 0.01 내지 2%, 바람직하게는 0.01 내지 1%, 더욱 바람직하게는 0.03 내지 0.6%) 또는 푸코스테롤(사료 건조 중량의 0.01 내지 2%, 바람직하게는 0.01 내지 1%, 더욱 바람직하게는 0.03 내지 0.6%) 또는 이들의 혼합물(사료 건조 중량의 총 0.01 내지 2%, 바람직하게는 0.001 내지 1%, 더욱 바람직하게는 0.03 내지 0.6%) 및 아래의 군에서 선택되는 추가의 스테롤 중 적어도 하나(사료 건조 중량%의 농도); 즉, 다수의 이소푸코스테롤 또는 푸코스테롤 또는 이들과 추가의 스테롤 중 하나 이상과의 혼합물:
- 콜레스테롤 0.001 내지 2%, 바람직하게는 0.001 내지 1.5%, 더욱 바람직하게는 0.06 내지 1.2%, 및/또는
- 24-메틸렌콜레스테롤 0.001 내지 2%, 바람직하게는 0.001 내지 1.5%, 더욱 바람직하게는 0.06 내지 1.2%, 및/또는
- 베타-시토스테롤 0.001 내지 2%, 바람직하게는 0.001 내지 1%, 더욱 바람직하게는 0.03 내지 0.6%, 및/또는
- 캄페스테롤 0.001 내지 2%, 바람직하게는 0.001 내지 1%, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.35%, 및/또는
- 스티그마스테롤 0.001 내지 2%, 바람직하게는 0.001 내지 1%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.2%, 또는
- 이들의 임의의 조합. 이때, 스테롤의 총 농도는 0.01 내지 4%(건조 중량)의 범위이다.
또 다른 측면에서, 조성물은 Apis 또는 Bombus 속의 무척추동물, 특히 꿀벌 또는 호박벌에게 투여된다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 스테롤의 공급원은 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 꽃, 씨앗, 나무껍질, 열매 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 식물 종의 꽃가루 대체 조직이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 스테롤의 공급원은 동물 공급원, 화학적 합성 또는 시험관 내 효소 합성물, 또는 효모, 조류 또는 규조류와 같은 천연 또는 대사 조작된 미생물, 또는이들 공급원의 조합이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 스테롤의 공급원은 하나 이상의 식물 종의 꽃가루 대체 조직의 추출물, 오일, 정제물, 또는 이들의 조합이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 스테롤의 공급원은 가지과, 벼과, 미나리아재비과, 콩과 및 너도밤나무과로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종 이상의 식물 종의 꽃가루 대체 조직이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 꽃가루 대체 공급원이다:
- 해양 또는 담수 조류 종, 특히 참갈파래(Ulva lactuca)의 추출물, 오일 또는 정제물;
- 해양 규조류 종, 특히 탈라시오시라 프세오도나나(Thalassiosira pseudonana), 탈라시오시라 로툴라(Thalassiosira rotula) 또는 각모조(Chaetoceros muelleri)의 추출물, 오일 또는 정제물; 및
- 진균, 특히 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipitica)의 추출물, 오일 또는 정제물.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤 또는 푸코스테롤은 화학적으로 또는 효소적으로 합성되거나 진균, 박테리아 또는 조류와 같은 유전자 변형 숙주 유기체에 의해 얻어진다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 및/또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤의 공급원은 조류, 식물, 진균, 조류, 규조류 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 및 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤의 공급원은 꽃가루 대체 조직이다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및/또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤은 합성 공급원으로부터 사회성이거나 또는 원시적으로 사회성인 벌 군집에 제공된다.
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및/또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 스테롤은 꽃가루 대체 조성물의 일부로서 제공되고, 여기서의 꽃가루 대체 조성물은
- 10 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 15 중량% 내지 40 중량%의 양의 단백질,
- 1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 2 중량% 내지 12 중량%의 양의 지방산,
- 20 중량% 내지 90 중량%, 바람직하게는 30 중량% 내지 70 중량%의 양의 탄수화물,
- 선택적으로 비타민, 및
- 선택적으로 미네랄을 포함하고,
여기서의 성분들 및 선택적인 추가의 성분들의 총량은 100 중량%이고, 중량%는 조성물의 총 건조 중량을 기준으로 한 것이다.
액체 또는 반액체 실험을 통한 투여:
또 다른 측면에서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및/또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 스테롤은, 설탕과 같은 식욕 자극제 또는 기타 식욕 자극제가 선택적으로 추가되는 액체 또는 반액체 사료 보충제의 일부로서 제공되고, 여기서의 액체 또는 반액체 사료 보충제는
- 선택적으로 10 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 15 중량% 내지 40 중량%의 양의 단백질,
- 선택적으로 1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 2 중량% 내지 12 중량%의 양의 지방산,
- 선택적으로 20 중량% 내지 90 중량%, 바람직하게는 30중량% 내지 70 중량%의 양의 탄수화물,
- 선택적으로 비타민, 및
- 선택적으로 미네랄,
- 선택적으로 물 또는 또 다른 용매를 포함하고,
여기서의 성분들 및 선택적인 추가의 성분들의 총량은 100 중량%이고, 중량%는 조성물의 총 건조 중량을 기준으로 한 것이다.
다른 측면에서, 조성물에는 본질적으로 꽃가루가 없다.
이소푸코스테롤 및 푸코스테롤
이소푸코스테롤은 하기 구조식의 델타-5 스테롤이다(도 1):
푸코스테롤은 하기 구조식의 델타-5 스테롤이다(도 2):
이소푸코스테롤/푸코스테롤의 구조는 아래에 설명되어 있다.
https://en.wikipedia.org/wiki/Isofucosterol 및
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5281326
24-메틸렌콜레스테롤
24-메틸렌콜레스테롤의 구조는 아래에 설명되어 있다.
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/24-Methylenecholesterol
이소푸코스테롤 및 24-메틸렌콜레스테롤은 유기 합성 분야의 숙련된 화학자들에 의해 합성되었으며 그 최종 생성물은 99% 순도로 정제되었으며 LCMS, NMR 및 액체 크로마토그래피를 통해 특성 분석하였다(도 3, 도 4, 도 5).
이소푸코스테롤 및 24-메틸렌콜레스테롤은 벌이 수집한 꽃가루와 같은 천연 공급원으로부터도 정제될 수 있다. 콜레스테롤은 상업적인 공급원 유래였다. B-시토스테롤 및 기타 스테롤은 표준 방법을 사용하여 시판되는 대두 피토스테롤로부터 정제되었다.
생리학적 활성 스테롤 결합체
생리학적 활성 스테롤 결합체(conjugate)는 무척추 동물 또는 양식 또는 식물 유기체에 의해 대사될 수 있는 스테롤의 결합체를 의미한다.
스테롤 분자인 24-메틸렌콜레스테롤, 베타-시토스테롤, 콜레스테롤, 캄페스테롤, 이소푸코스테롤/푸코스테롤, 스티그마스테롤은 다양한 결합체 및 결합체의 혼합물로 식품에 제공될 수 있다.
결합체 혼합물 형태로 투여된 스테롤의 농도는 다음과 같이 계산된다:
'스테롤 결합체의 투여량 스테롤 결합체의 분자량' / '스테롤의 분자량' X '원하는 스테롤의 투여량' = '원하는 스테롤 결합체의 투여량'.
다양한 스테롤 결합체의 예는 다음과 같다:
- 유리 알코올로서 존재하는 것
- 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산, 리놀렌산 등)으로 에스테르화된 것
- 알코올 기를 통해 지방 알코올(스테롤 알킬 에테르)에 연결된 것
- 황산과 같은 산에 의해 에스테르화된 것(스테롤 황산염)
- 글루코사이드에 연결되어 스테릴 글리코사이드를 생성한 것. 3-OH 위치의 스테롤 기는 스테롤 기인 24-메틸렌콜레스테롤, 베타-시토스테롤, 콜레스테롤, 캄페스테롤, 이소푸코스테롤/푸코스테롤, 스티그마스테롤의 임의의 스테롤일 수 있다. 당 글루코스는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 자일로스, 아라비노스일 수 있다. 바람직한 구현예는 스테롤 군의 글루코스 에스테르이다.
- g 트랜스-하이드록시신나메이트, 페룰레이트(4-하이드록시-3-메톡시신나메이트) 및 p-쿠마레이트 에스테르로 에스테르화된 것(스테릴 페놀레이트 결합체의 예로서 캄페스테릴 페룰레이트에 대한 아래 그림 참조). 바람직한 구현예는 스테롤 군의 쿠마르산 에스테르이다.
스테롤 접합체의 바람직한 예는 다음과 같다:
베타-시토스테롤 결합체의 예는 다음과 같다:
위의 베타-시토스테롤 예와 유사하게, 24-메틸렌 콜레스테롤, 이소푸코스테롤, 캄페스테롤 또는 콜레스테롤 또는 스티그마스테롤과의 결합체가 사용될 수 있다.
하기의 구조를 갖는 (A) 스테릴 에스테르(SE), (B) 스테릴 글리코시드(SG), (C) 아실 스테릴 글리코시드(ASG)와 같은 추가의 바람직한 스테롤 결합체가 식물에서 자연적으로 발생한다:
본 특허의 경우 R 측쇄는 콜레스테롤, 이소푸코스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤의 군에 속할 수 있다.
추가 예에는 스테릴-글리코시드, 스테릴 에스테르 및 아세틸화 스테릴 글리코시드가 포함된다.
R은 스테롤의 측쇄 기이다. 스테롤은 델타-5 또는 델타-7 스테롤일 수 있다.
스테롤 결합체의 추가의 예는 다음과 같다:
곤충 영양소로서 이소푸코스테롤
본 발명자들은 놀랍게도 이소푸코스테롤이 벌 및 기타 꽃가루를 먹는 곤충을 위한 필수 영양소라는 사실을 확인했다. 예를 들어 꿀벌 및 호박벌은 이의 신체 조성에서 다음과 같은 수준의 이소푸코스테롤을 보여준다.
| 표 1. 벌의 이소푸코스테롤 조성과 벌을 위한 잠재적인 사료 기질의 총 벌-관련 피토스테롤 비율(%) | ||
| 이소푸코스테롤(전체%) | 총 피토스테롤(㎍/g) | |
| 꿀벌 일벌 | 28.73 | 1673.75 |
| 호박벌 일벌 | 50.15 | 2101.26 |
꽃가루 대체 조성물
용어 "꽃가루 대체물"은 본질적으로 꽃가루가 없음을 의미한다. 그러나, 본 발명의 조성물에는 소량의 꽃가루가 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 꽃가루의 양은 조성물의 건조 중량을 기준으로 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 5 중량% 이하, 더욱 더 바람직하게는 1 중량% 이하, 더욱 더 바람직하게는 0.1 중량% 이하이다. 꽃가루 대체물이라는 용어와 비화분이라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.
이소푸코스테롤의 꽃가루 대체 공급원
이소푸코스테롤은 예를 들어 다음을 통해 꽃가루 대체 공급원에서 얻을 수 있다:
- 합성 화학적 합성; 또는
- 임의의 꽃가루 대체 식물 공급원.
이소푸코스테롤의 꽃가루 대체 식물 공급원의 예로는 이소푸코스테롤을 함유하는 조류, 진균, 박테리아 또는 동물 부위가 있다.
일 구현예에서, 꽃가루 대체 공급원은 자연적으로 이소푸코스테롤을 함유한다.
또 다른 구현예에서, 이소푸코스테롤의 꽃가루 대체 공급원은 이소푸코스테롤을 생산하도록 대사적으로 조작된 유기체이다.
무척추동물
무척추동물에는 다음이 포함된다:
- 곤충, 거미류, 갑각류, 및 다족류와 같은 절지동물,
- 딱지 조개류, 달팽이, 쌍각류 조개, 오징어, 및 문어와 같은 연체동물,
- 지렁이 및 거머리와 같은 환형동물; 및
- 히드라, 해파리, 말미잘, 및 산호와 같은 자포동물.
바람직한 무척추동물은 꿀벌, 호박벌, 지렁이, 거저리, 새우(shrimp), 새우(prawn) 또는 가재, 귀뚜라미, 파리 유충, 무당벌레, 검은 동애등에, 꽃등에 및 굴 또는 기타 쌍각류와 같은, 인간 또는 동물 영양을 목적으로 양식되는 무척추동물이다.
특히 바람직한 무척추동물은 농업 또는 원예 식물의 수분매개체로서 사용되는 꿀벌과(Apidae) 또는 뒤영벌아과(Bombidae) 과의 무척추동물이고, 예를 들어 다음과 같다:
- 아피스(Apis) 속의 벌, 특히 아피스 멜리페라(Apis mellifera), 아피스 세라나(Apis cerana), 아피스 도르사타(Apis dorsata) 또는
- 뒤영벌속(Bombus) 속의 호박벌, 특히 봄버스 테라스트리스(Bombus terrestris), 봄버스 임파티엔스(B. impatiens), 봄버스 이그니테스(B. ignites)
- 꿀벌족(Meliponini)의 무침 꿀벌
투여량 및 농도
아래 설명된 실시예에서의 투여량 및 농도는 14일 동안 30,000마리의 벌 군집에게 1.5파운드 내지 3파운드의 벌 패티를 먹이기 위한 것이다. 패티의 투여량은 군집의 크기에 맞게 조정할 수 있으며 양봉가가 원하는 대로 14일간 투여를 반복할 수 있다. 투여가 패티를 통하지 않고 위에서 설명한 다른 형태를 통해 이루어지는 구현예서도 동일한 투여량이 전달될 수 있다. 다양한 제형에 대한 투여량을 계산하기 위한 식, 투여 방법 또는 벌 군집의 크기 또는 곤충 바이오매스의 %로서 투여량/일(day)이 위에 기재되어 있다.
일 구현예에서, 이소푸코스테롤 또는 푸코스테롤은 무척추동물, 특히 꿀벌 또는 호박벌에게 영양학적으로 유효한 양으로 투여된다.
일 구현예에서, 영양학적으로 유효한은 꽃가루 대체 조성물의 총 중량의 백분율로 0.01 내지 5%, 바람직하게는 0.01 내지 2%, 더욱 더 바람직하게는 0.01 내지 1%의 양으로 이소푸코스테롤 또는 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 농도를 갖는 1파운드 내지 1.5 내지 3파운드의 꿀벌 패티 제제를 14일의 기간에 걸쳐 30,000마리 벌의 군집에 공급하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이소푸코스테롤 또는 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 농도는 꽃가루 대체 조성물의 총 중량의 백분율로서 꿀벌의 경우 0.03 내지 0.5%, 호박벌의 경우 0.03 내지 1%이다. 패티의 투여량은 군집의 크기에 맞게 조정할 수 있으며 양봉가가 원하는 대로 14일간 투여를 반복할 수 있다.
일 구현예에서, 콜레스테롤은 무척추동물, 특히 꿀벌 또는 호박벌에 대해 영양학적으로 유효한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 콜레스테롤은 총 꽃가루 대체 조성물의 건조 중량을 기준으로 0.001 내지 2%, 바람직하게는 0.001% 내지 1.5%, 더욱 바람직하게는 0.06 내지 1.2%의 농도로 투여된다.
일 구현예에서, 24-메틸렌콜레스테롤은 무척추동물, 특히 꿀벌 또는 호박벌에 대해 영양학적으로 유효한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 24-메틸렌콜레스테롤은 전체 꽃가루 대체 조성물의 건조 중량을 기준으로 0.001 내지 2%, 바람직하게는 0.001% 내지 1,5%, 더욱 바람직하게는 0.06 내지 1.2%의 농도로 투여된다.
일 구현예에서, 시토스테롤은 무척추동물, 특히 꿀벌 또는 호박벌에 대해 영양학적으로 유효한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 시토스테롤은 전체 꽃가루 대체 조성물의 건조 중량을 기준으로 0.001 내지 2%, 바람직하게는 0.001 내지 1%, 더욱 바람직하게는 0.03 내지 0.6%의 농도로 투여된다.
일 구현예에서, 캄페스테롤은 무척추동물, 특히 꿀벌 또는 호박벌에 대해 영양학적으로 유효한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 캄페스테롤은 전체 꽃가루 대체 조성물의 건조 중량을 기준으로 0.001 내지 2%, 바람직하게는 0.001 내지 1%, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.35%의 농도로 투여된다.
일 구현예에서, 스티그마스테롤은 무척추동물, 특히 꿀벌 또는 호박벌에 대해 영양학적으로 유효한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 스티그마스테롤은 꽃가루 대체 조성물의 건조 중량을 기준으로 0.001 내지 2%, 바람직하게는 0.001 내지 1%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.2%의 농도로 투여된다.
일 구현예에서, 꽃가루 대체 조성물 중 스테롤의 총 농도는 꽃가루 대체 조성물의 건조 중량을 기준으로 0.01% 내지 4%의 범위이다.
꽃가루 대체 조성물
본 발명의 추가의 측면은
a. 10 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 15 중량% 내지 40 중량%의 양의 단백질,
b. 1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 2 중량% 내지 12 중량%의 양의 지방산,
c. 30 중량% 내지 90 중량%, 바람직하게는 30 중량% 내지 70 중량%의 양의 탄수화물,
d. 선택적으로 비타민, 및
e. 선택적으로 미네랄을 포함하는 꽃가루 대체 조성물이고,
여기서의 성분 a) 내지 e) 및 선택적인 추가 성분의 총량은 100 중량%이고, 중량%는 조성물의 총 건조 중량을 기준으로 한 것이며,
꽃가루 대체 조성물은 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물을 영양학적 유효량으로 추가로 포함하고,
꽃가루 대체 조성물은 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 스테롤을 추가로 포함하고,
바람직한 구현예에서, 스테롤의 총 농도는 꽃가루 대체 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 4 중량%, 바람직하게는 0.05 중량% 내지 3 중량%, 더욱 바람직하게는 0.05 중량% 내지 2 중량%, 더욱 더 바람직하게는 0.05 중량% 내지 1.5 중량%이다.
먹이를 주기 위한 용도
본 발명의 추가의 측면은 무척추동물 또는 양식 유기체에게 먹이를 주기 위한, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물을 영양학적 유효량으로 포함하는 본 발명의 꽃가루 대체 조성물의 용도이고, 여기서의 꽃가루 대체 조성물은 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤 또는 이들의 생리학적으로 이용가능한 결합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤, 바람직하게는 적어도 2개의 추가의 스테롤을 영양학적 유효량으로 포함한다.
본 발명의 추가의 측면은 무척추동물 또는 양식 유기체에게 먹이를 주기 위한 본 발명의 꽃가루 대체 조성물의 용도이고, 여기서의 꽃가루 대체 조성물은
a. 10 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 15 중량% 내지 40 중량%의 양의 단백질,
b. 1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 2 중량% 내지 12 중량%의 양의 지방산,
c. 30 중량% 내지 90 중량%, 바람직하게는 30 중량% 내지 70 중량%의 양의 탄수화물,
d. 선택적으로 비타민, 및
e. 선택적으로 미네랄을 포함하고,
여기서의 성분 a) 내지 e) 및 선택적인 추가 성분의 총량은 100 중량%이고, 중량%는 조성물의 총 건조 중량을 기준으로 한 것이며,
꽃가루 대체 조성물은 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물을 영양학적 유효량으로 추가로 포함하고,
꽃가루 대체 조성물은 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 스테롤을 추가로 포함하고,
바람직한 구현예에서, 스테롤의 총 농도는 꽃가루 대체 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 4 중량%, 바람직하게는 0.05 중량% 내지 3 중량%, 더욱 바람직하게는 0.05 중량% 내지 2 중량%, 더욱 더 바람직하게는 0.05 중량% 내지 1.5 중량%이다.
추가의 조성물 성분
추가의 측면은 꽃가루 대체 조성물을 투여하는, 무척추동물, 특히 꿀벌에게 먹이를 주는 방법이고, 여기서의 꽃가루 대체 조성물은
a. 10 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 15 중량% 내지 40 중량%의 양의 단백질,
b. 1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 2 중량% 내지 12 중량%의 양의 지방산,
c. 30 중량% 내지 90 중량%, 바람직하게는 30 중량% 내지 70 중량%의 양의 탄수화물,
d. 선택적으로 비타민, 및
e. 선택적으로 미네랄을 포함하고,
여기서의 성분 a) 내지 e) 및 선택적인 추가 성분의 총량은 100 중량%이고, 중량%는 조성물의 총 건조 중량을 기준으로 한 것이며,
꽃가루 대체 조성물은 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물을 영양학적 유효량으로 추가로 포함하고,
꽃가루 대체 조성물은 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 스테롤을 추가로 포함하고,
바람직한 구현예에서, 스테롤의 총 농도는 꽃가루 대체 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 4 중량%, 바람직하게는 0.05 중량% 내지 3 중량%, 더욱 바람직하게는 0.05 중량% 내지 2 중량%, 더욱 더 바람직하게는 0.05 중량% 내지 1.5 중량%이다.
호박벌, 동애등에, 무당벌레 및 기타 꽃가루를 먹는 곤충에도 동일한 조성물 및 범위가 적용된다.
실시예
비교예 1: 상업적으로 입수가능한 벌 사료 내 이소푸코스테롤 수준
상업적으로 입수가능한 꽃가루 대체 벌 사료 조성물은 아래 표 1에 나타낸 바와 같이 이소푸코스테롤을 포함하지 않는다.
| 상업적으로 입수가능한 꿀벌 사료 | ||
| 이소푸코스테롤 | 총 피토스테롤(㎍/g) | |
| UltraBee | 검출 한계 미만 | 2147.29 |
| MegaBee | 검출 한계 미만 | 1489.84 |
| AP23 | 검출 한계 미만 | 1340.88 |
| BeePro | 검출 한계 미만 | 509.18 |
| Broodbuilder | 검출 한계 미만 | 280.38 |
| FeedBee | 검출 한계 미만 | 844.56 |
| 0.001 중량%가 이소푸코스테롤 검출 한계이다 | ||
| 문헌[Zu 등. 2021 New Phyt 230: 1169-1184]의 분석 방법 | ||
| 벌-관련 피토스테롤의 양의 합으로 계산된 총계: 24MCHO = 24-메틸렌콜레스테롤, CAMPE = 캄페스테롤, STIGM = 스티그마스테롤, b-SITO = b-시토스테롤, ISOFUCO = 이소푸코스테롤 | ||
꿀벌을 이용한 먹이 분석 실험을 위해 홀리딕(holidic) 먹이를 만드는 방법을 설명하는 좋은 문헌이 있다. 본 발명자들은 다양한 배경 홀리딕 먹이의 예에 대하여 위에서 언급한 US2019/0090507호, Svoboda 등, Chakrabarti 등의 논문을 참조한다.
실시예 1 - 선호도 분석: 벌은 사료에서 특정 농도의 이소푸코스테롤을 선호한다.
새로이 출현한 성체 일벌 꿀벌(Apis mellifera) 또는 성체 일벌 호박벌(Bombus terrestris)은, 벌이 두 가지 먹이에 접근하고 물에 자유롭게 접근할 수 있는 2-선택 선호도 분석(two-choice preference assay)에서 테스트하였다.
하나의 처리 먹이는 이소푸코스테롤을 포함하엿고 다른 처리 먹이는 스테롤을 전혀 포함하지 않았다. 새로이 출현한 꿀벌을 새끼 프레임(brood frame)에서 제거하고 복제(replicate)당 30마리 벌의 코호트를 플라스틱 사육 케이지에 수용했다. 모든 실험에서, 각 처리 그룹에는 약 30마리의 벌로 각각 구성된 10개의 코호트를 사용하였다. 모든 먹이에서 탄수화물은 자당을 사용하여 60%로 유지하였고 지방은 8%로 유지하였다. 각 먹이의 섭취량은 5일 동안 24시간마다 측정하였다. 선호도 지수는 (처리 먹이의 섭취량 - 대조군의 섭취량)/(사료의 총 섭취량)으로 계산하였다.
실시예 1에서, 벌의 코호트에는 이소푸코스테롤이 있거나 없는 먹이에 대한 선택권이 주어졌다. 도 7에서 도시한 바와 같이, 벌은 먹이에 이소푸코스테롤이 0.05% 이상 포함된 먹이를 섭취하는 것을 선호했다.
실시예 2 - 생존: 벌은 이소푸코스테롤이 함유된 사료를 섭취하면 더 오래 산다.
새로이 출현한 성체 일벌 꿀벌은 처리 먹이를 받았고 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 처리 먹이는 이소푸코스테롤을 포함하였다. 새로 출현한 벌을 새끼 프레임에서 제거하고 복제당 30마리 벌의 코호트를 플라스틱 사육 케이지에 수용했다. 모든 실험에서 각 처리 군에는 약 30마리의 벌로 각각 구성된 10개의 코호트를 사용하였다. 모든 먹이의 탄수화물은 자당을 사용하여 60%로 유지하였고 지방은 8%로 유지하였다. 실험 기간 동안 매일 각 먹이의 섭취량을 측정했다. 박스 안에 살아 있는 벌의 수를 14일 동안 매일 측정했다.
실시예 2는 도 8에 도시된 바와 같이, 특정 농도의 이소푸코스테롤(먹이의 0 중량%, 0.5 중량% 및 1 중량%)을 포함하는 먹이를 먹도록 제한된 벌 집단의 생존을 나타낸다.
실시예 3 - 새끼 생산: 꿀벌은 이소푸코스테롤을 사용하여 더 많은 새끼를 생산하고 더 오랜 기간 동안 새끼를 생산한다.
꿀벌: 성체 일벌 및 짝짓기한 여왕벌 1마리로 채워진 5개의 미니 프레임으로 구성된 완전한 기능의 절연 스티로폼 Apidea nuc에는 300 내지 400ml의 젊은 성체 일벌(혼합 연령의 ~ N<1,000마리 벌)을 채웠다.
군집은 꿀벌이 꿀이나 꽃가루를 섭취하지 못하도록 환기 장치가 있는 밀폐된 온실에 위치시켰다. 각 처리는 3 내지 6개의 군집으로 테스트하였다. 각 군집에는 메쉬 플로어가 장착된 상단 피더(feeder) 상의 60 내지 100g 패티(고형 먹이)를 공급했다. 첫날 및 6일차에 다시 먹이를 공급하고, 소비된 양은 6일 및 15일에 측정하였다. 6일까지 유충이나 알/여왕벌이 관찰되지 않으면 실험을 종료한다. 캐핑된 새끼방(capped brood cell)의 수는 15일째에 계산하였다. 각 검사 동안에 벌 솔기(bee seam)의 수를 추정했다. 텐트 내부의 피더에는 설탕시럽(34%)과 물을 공급하여 탄수화물 결핍을 예방하고 채집활동을 촉진하였다.
실시예 3에서, 벌에게 10 내지 18% 단백질, 6% 지방, 1% 비타민/미네랄 및 > 75% 탄수화물을 함유하는 먹이를 공급했다.
도 9는 벌 먹이에서 이소푸코스테롤의 영향에 대한 실시예 3의 역치(threshold)를 나타낸다. 이소푸코스테롤의 농도가 증가할수록 각 군집에서 생산된 새끼의 양이 증가했다(N > 3 군집/처리). 번데기와 새로운 성충의 수를 전체 10주 기간에 걸쳐 계산했다.
실시예 4A: 이소푸코스테롤 및 24-메틸렌콜레스테롤을 포함하는 다수의 스테롤을 먹인 벌을 이용한 장기 Apidea 실험.
꿀벌: 성체 일벌 및 짝짓기한 여왕벌 1마리로 채워진 3 내지 5개의 미니 프레임으로 구성된 완전한 기능의 절연 스티로폼 Apidea nuc에 300 내지 400ml의 젊은 성체 일벌(혼합 연령의 ~ N<1,000마리 벌)을 채웠다.
군집은 꿀벌이 꿀이나 꽃가루를 섭취하지 못하도록 환기 장치가 있는 밀폐된 스크린하우스에 위치시켰다. 각 처리는 3 내지 6개의 군집으로 테스트하였다. 각 군집에는 메쉬 플로어가 장착된 상단 피더 상의 고형 먹이를 공급했고, 소비된 양은 매 먹이 공급마다 평가하였다. 캐핑된 새끼방의 수를 12일마다 평가했다. 각 검사 동안에 벌 솔기의 수를 기록했다. 군집이 Apidia 박스의 최대 크기에 도달하면 벌집(super)을 추가한다. 텐트 내부의 피더에는 설탕시럽(34%) 및 물을 공급하여 탄수화물 결핍을 예방하고 채집활동을 촉진하였다.
실시예 4A에서, 벌에게 15 내지 30% 단백질, 4 내지 12% 지방, 1% 비타민/미네랄 및 > 40% 탄수화물을 함유하는 먹이를 공급했다(먹이 1).
실험은 하기의 처리를 포함하였다:
- 먹이 1: 스테롤을 첨가하지 않은 상기의 먹이 1
- 먹이 2 = 이소푸코스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤 및 콜레스테롤을 상기 바람직한 구현예에 따른 비율 및 농도로 첨가한 먹이 1
- 먹이 3 = 24-메틸렌콜레스테롤을 포함하지 않는 먹이 2
- 먹이 4 = 이소푸코스테롤을 포함하지 않는 먹이 2
- 먹이 5 = 꽃가루 60.5%(터키 안탈리아 바이오베스트에서 수집한 신선한 냉동 꿀벌 꽃가루), 가루 설탕 25.2%, 꿀 14.3%로 구성된 꽃가루 기반 패티(꽃가루 패티)
- 먹이 6 = 콜레스테롤을 포함하지 않는 먹이 2
- 먹이 7 = 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤 및 캄페스테롤을 포함하지 않는 먹이 2
- 먹이 8 = 일반적으로 사용되는 시중에서 판매되는 먹이
도 4 - 실시예 4A의 결과: 15주에 걸쳐서 12일 마다 평가된 봉인된 새끼의 평균 면적(cm2). 각 군집에게 다음과 같은 먹이 중 하나를 공급했다: 먹이 1(십자가형, 가는 점선), 먹이 2(완전한 원형, 굵은 실선), 먹이 3(채워진 마름모형, 가는 점선), 먹이 4(빈 마름모형, 두꺼운 점선), 먹이 5(빈 원형, 굵은 점선), 먹이 6(채워진 사각형, 가는 실선), 먹이 7(빈 사각형, 두꺼운 점선), 먹이 8(별형, 가는 점선 ).
실시예 4B: 이소푸코스테롤은 없으나 24-메틸렌콜레스테롤을 포함하는 다수의 스테롤을 먹인 벌을 이용한 장기 Apidea 실험.
꿀벌: 성체 일벌 및 짝짓기한 여왕벌 1마리로 채워진 3 내지 5개의 미니 프레임으로 구성된 완전한 기능의 절연 스티로폼 Apidea nuc에 300 내지 400ml의 젊은 성체 일벌(혼합 연령의 ~ N<1,000마리 벌)을 채웠다.
군집은 꿀벌이 꿀이나 꽃가루를 섭취하지 못하도록 환기 장치가 있는 밀폐된 스크린하우스에 위치시켰다. 각 처리는 3 내지 6개의 군집으로 테스트하였다. 각 콜로니에는 메쉬 플로어가 장착된 상단 피더 상의 고형 사료를 자유롭게 공급했고, 소비된 양은 매 먹이 공급마다 평가하였다. 캐핑된 새끼방의 수를 12일마다 평가했다. 각 검사 동안에 벌 솔기의 수를 기록했다. 군집이 Apidia 박스의 최대 크기에 도달하면, 벌집을 추가한다. 텐트 내부의 피더에는 설탕시럽(34%) 및 물을 공급하여 탄수화물 결핍을 예방하고 채집활동을 촉진하였다.
실시예 4B에서, 벌에게 단백질 15 내지 30%, 지방 4 내지 12%, 비타민/미네랄 1% 및 탄수화물 40% 이상을 함유하는 먹이를 공급했다(먹이 1).
실험은 하기의 처리를 포함했다:
먹이 1 = 단백질 15 내지 30%, 지방 5 내지 10%, 비타민/미네랄 1%, 및 탄수화물 40% 이상을 함유하고 스테롤이 첨가되지 않은 먹이.
먹이 2 = 꽃가루 패티(꿀벌이 수집한 혼합 꽃가루 알갱이 60.5%, 가루 설탕 25.2%, 및 꿀 14.3%).
먹이 3 = 24-메틸렌콜레스테롤을 포함하지 않는 먹이 4.
먹이 4 = 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤 및 콜레스테롤이 상기 바람직한 구현예에 따른 비율 및 농도로 첨가된 먹이 1.
먹이 5 = 일반적으로 사용되는 시중에서 판매되는 먹이.
도 5는 실험 4B의 결과를 보여준다: 15주 동안 12일마다 평가된 밀봉된 새끼의 평균 면적(cm2). 각 군집에는 다음과 같은 먹이 중 하나를 공급했다: 먹이 1(십자가형, 가는 점선), 먹이 2(채워진 원형, 굵은 실선), 먹이 3(빈 다이아몬드형, 가는 선), 먹이 4(빈 원형, 굵은 점선), 먹이 5(별형, 가는 점선).
실시예 4C: 먹이 중 스테롤의 총 농도가 일정하게 유지되고 특정 스테롤의 존재(농도)가 먹이 마다 다르도록 다양한 스테롤을 공급한 벌을 이용한 장기 Apidea 실험.
꿀벌: 성체 일벌 및 짝짓기한 여왕벌 1마리로 채워진 3 내지 5개의 미니 프레임으로 구성된 완전한 기능의 절연 스티로폼 Apidea nuc에는 300 내지 400ml의 젊은 성체 일벌(혼합 연령의 ~ N<1,000마리 벌)을 채웠다.
군집은 꿀벌이 꿀이나 꽃가루를 섭취하지 못하도록 환기 장치가 있는 밀폐된 스크린하우스에 위치시켰다. 각각의 처리는 3 내지 6개의 콜로니로 테스트하였다. 각 군집에는 메쉬 플로어가 장착된 상단 피더 상의 고형 먹이를 자유롭게 공급했으며, 소비된 양은 매 먹이 공급마다 평가하였다. 캐핑된 새끼방의 수를 12일마다 평가했다. 각 검사 동안에 벌 솔기의 수를 기록했다. 군집이 Apidia 박스의 최대 크기에 도달하면 벌집을 추가한다. 텐트 내부의 피더에는 설탕시럽(34%) 및 물을 공급하여 탄수화물 결핍을 예방하고 채집활동을 촉진하였다.
실험은 다음 처리를 포함하였다:
먹이 1 = 단백질 15 내지 30%, 지방 5 내지 10%, 비타민/미네랄 1%, 탄수화물 40% 이상을 함유하고 스테롤이 첨가되지 않은 먹이.
먹이 2 = 24-메틸렌콜레스테롤 및 이소푸코스테롤이 상기 바람직한 구현예보다 낮은 농도로 첨가되고 캄페스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤 및 콜레스테롤이 상기 바람직한 구현예에 따른 비율 및 농도로 첨가된 먹이 1.
먹이 3 = 먹이 2와 유사한 총 스테롤 비율을 유지하도록 상기 바람직한 구현예보다 24-메틸렌콜레스테롤과 이소푸코스테롤 및 콜레스테롤의 농도가 높고 캄페스테롤, 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤의 농도가 낮은 먹이 2.
먹이 4 = 먹이 3과 유사하지만 24-메틸렌콜레스테롤과 콜레스테롤을 포함하지 않고 먹이 7과 같이 총 스테롤 비율을 유지함.
먹이 5 = 먹이 3과 유사하지만 이소푸코스테롤을 포함하지 않음.
먹이 6 = 먹이 3과 유사하지만 24-메틸렌콜레스테롤 및 이소푸코스테롤을 포함하지 않음.
먹이 7 = 먹이 3과 유사하지만 24-메틸렌콜레스테롤, 이소푸코스테롤 및 콜레스테롤을 포함하지 않고 먹이 4와 같이 총 스테롤 비율을 유지함.
먹이 8 = 꽃가루 패티(꿀벌이 수집한 혼합 꽃가루 알갱이 60.5%, 가루 설탕 25.2%, 및 꿀 14.3%).
도 6: 실시예 4C의 결과: 먹이 중 스테롤의 총 농도는 일정하게 유지되고 특정 스테롤의 존재(농도)는 먹이마다 다르도록 다양한 스테롤을 공급한 벌을 이용한 Apidea 군집에서의 장기 먹이 공급 실험의 결과.
실시예 5: 동애등에 실험
도 7은 실시예 5A의 결과를 보여준다: 동애등에 성체에게 다수의 스테롤을 함유하는 먹이를 공급: 산란된 알의 부화율 및 산란된 난괴의 중량에 미치는 영향. 문헌[Thinn and Kainoh 2022. JARQ 56 (2), 211-217 (2022)]에 기재된 사육 방법을 이용하여 성충 생존율 및 꽃가루 대체 먹이(Apix Biosciences의 US2019/0090507에 명시됨)을 공급한 집단에서 산란된 난괴의 수를 매일 측정했다.
도 8은 실시예 5B의 결과를 보여준다: 동애등에 성충에게 다양한 스테롤을 함유하는 먹이를 공급: 성충 수명 및 번데기 전단계까지의 유충 생존에 미치는 영향. 동애등에(BSF) 유충에게 문헌[Hogsette 1992. J. Econ. Entomol. 85(6): 2291-2294]에 기재된 바와 같이 22% 단백질, 4% 지방을 함유한 먹이를 부화시까지 공급했다. 스테롤은 0.1%의 총량으로 먹이에 직접 첨가된 순수 화합물로 공급되었다. 50일 동안의 유충 및 성체 생존율은 문헌[Georgescu et al., Eur. J. Entomol. 118: 297-306, 2021]에 기재된 바와 같이 측정하였다.
도 9는 실시예 5C의 결과를 보여준다: 동애등에 성충에게 다양한 스테롤을 함유하는 다양한 먹이를 공급: 다양한 스테롤을 공급한 동애등에의 조직에서 발견된 스테롤. 스테롤을 먹이에 추가하였다. 조직 내 스테롤 측정은 문헌[Boukid 등. 2022. Insects 12, 672]에 기재된 바와 같이 GC-MS를 사용하여 BSF 조직의 비누화후에 수행하였다.
실시예 6: 동애등에 실험
BFS 유충의 먹이에 다수의 스테롤을 포함시켜서 표적 종(꿀벌)에 대한 BFS 유충의 영양 조성을 변경시키고, 유충을 함유한 사료 제제를 만들고, 이들 유충에게 공급했다. 동애등에 유충에게 도 10과 같이 먹이를 공급했다. 꿀벌에게 필요한 스테롤은 먹이 2에서 지정된 양으로 먹이에 추가하거나 단일 스테롤(24-메틸렌콜레스테롤, 24MC 또는 이소푸코스테롤)로 추가하였다. 한 그룹에서는 스테롤을 먹이에 직접 첨가하지 않았다. 동결 건조된 BSF 유충으로부터 헥산을 사용하여 추출물을 얻었다. 지방 분획을 함유한 헥산 용매를 먹이에 첨가했으며, 유충에게 먹이를 주기 전에 헥산을 증발시켰다.
본 실시예는 일반적으로 표적 종의 요구 사항을 충족하도록 조정된 다양한 스테롤을 공급함으로써 표적 종의 성능에 어떻게 도움이 될 수 있는지를 보여준다. 다양한 폐기물 흐름에서 성장한 BFS에는 조류나 플랑크톤을 먹는 양식 어류, 갑각류, 양식 해양 무척추 동물 및 이들의 유충에 대한 최적의 스테롤 프로필이 포함되어 있지 않기 때문에, 푸코스테롤 또는 이소푸코스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤(모두 조류에서 풍부하지만 위의 종의 먹이에 대한 현재의 비-조류 인공 먹이에는 없음)을 BFS 먹이에 첨가한 다음 이러한 BFS 유충의 지질이나 단백질 또는 전체 추출물을 조류를 먹는 양식 유기체에게 공급하는 이러한 방법은, 일반적으로 플랑크톤과 유충을 먹고 이소푸코스테롤/푸코스테롤 및/또는 24-메틸렌콜레스테롤을 필요로 하는 유기체에 대한 양식 인공 먹이의 성능을 향상시키는 방법이다.
도 10은 실시예 6의 결과를 보여준다: 다양한 스테롤을 공급한 동애등에의 추출물을 함유한 먹이를 사용한 Apidea 실험에서 꿀벌 군체에 공급.
실시예 7: 꿀벌을 위한 완전한 먹이의 개발: 이소푸코스테롤 및 다양한 스테롤의 중요성.
다음 실시예에서 본 발명자들은 다수의 스테롤이 첨가된 꽃가루 없는 먹이로부터 단일 피토스테롤 또는 한 쌍의 피토스테롤을 제거하는 것이 이 먹이만을 공급하는 벌집의 장기간 새끼 생산에 영향을 미치는지 여부를 테스트하고자 했다.
이에 본 발명자들은 벌집이 큰 텐트에 완전히 포함되어 있고(도 11A 내지 도 11D) 외부 사료에 접근할 수 없으며 스테롤 조성은 다르지만 총 스테롤 농도(꽃가루 및 꿀벌에서 발견되는 것과 유사한)가 동일한 꽃가루 없는 먹이를 공급하는 분석을 설정하였다:
다음과 같은 3개의 먹이를 제조했다:
- 먹이 A: 단백질, 지질, 미네랄, 비타민, 항산화제, 및 미량의 스테롤을 포함하지만 스테롤은 첨가하지 않은 꽃가루 없는 꿀벌 먹이. 이러한 연구 먹이는 업계의 "단백질 보충제"에 대한 표준(PCT/GB2016/053573)에 따라, 벌집의 벌 프레임 위에 놓을 수 있는 패티로서 산업적으로 이용가능한 성분을 사용하여 APIX Biosciences NV Belgium사에 의해 제조하였다. 이 먹이는 영양소가 더 완전하고 균형 잡혀 있으며 우수한 영양 기반을 가지고 있다는 점을 제외하고 Herbert 등이 사용한 먹이와 유사하다. 이러한 먹이의 경우, 본 발명자들은 (지질에 용해된 상태로) 0.375% 추가된 스테롤[24-메틸렌-콜레스테롤(0.125%), 이소푸코스테롤/푸코스테롤 이성질체(0.0625%) 및 스테롤 혼합물(0.1875%)[일반적으로 꿀벌이 공급하는 꽃가루에서 발견되는 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤(이소푸코스테롤 및 24-메틸렌-콜레스테롤 없음) 포함]]을, 평균적으로 꽃가루의 자연적 조성을 반영하는 피토스테롤의 농도 및 비율로 혼합하였다. 반합성 24-메틸렌-콜레스테롤(순도 97%) 및 반합성 이소푸코스테롤(순도 97%, 이소푸코스테롤 75% 및 E-Z 이성체 푸코스테롤 25%, 이하 "이소푸코스테롤/푸코스테롤" 또는 "이소푸코스테롤"로 상호 교환적으로 명명함)은 Phytant NV Belgium사에서 구입했다. 먹이 A의 배경 먹이는 등록된 동물 사료 성분을 이용하여 제조되고 꽃가루가 없는 독점적 먹이(벨기에 APIX Biosciences NV사에서 개발)이다(PCT/GB2016/053573).
- 먹이 B: 꽃가루가 없고 이소푸코스테롤/푸코스테롤이 없는 먹이. 이것은 먹이 A로부터 0.0625% 첨가된 이소푸코스테롤/푸코스테롤 혼합물이 생략된 것이다. 먹이에서 첨가된 스테롤의 총 농도를 일정하게 유지하기 위해, 먹이에서 다른 첨가된 스테롤의 농도를 0.375% 스테롤을 첨가한 먹이 A 의 총 스테롤 농도에 비례하여 증가시켰다. 이는 추가된 다른 개별 스테롤의 농도를 1.2배로 증가시키며, 이로 인해 이러한 스테롤의 농도가 꿀벌이 성공적으로 먹는 꽃가루에 존재하는 범위의 중간 내에 있다.
- 먹이 C: 꽃가루가 없고 24-메틸렌-콜레스테롤이 없는 먹이. 이는 먹이 A로부터 0.125% 첨가된 24-메틸렌-콜레스테롤을 생략한 것이다. 사료에서 첨가된 스테롤의 총 농도를 일정하게 유지하기 위해, 먹이에 존재하는 다른 스테롤의 농도를 0.375% 스테롤을 첨가한 먹이 A의 총 스테롤 농도에 비례하여 증가시켰다. 이로써 추가된 다른 스테롤의 농도는 꿀벌이 성공적으로 먹는 꽃가루에 존재하는 범위의 중간 내에 있다.
본 발명자들은 유일한 영양 공급원(설탕 피더 및 물 피더를 통해 텐트에 제공되는 설탕 시럽 및 물 제외)으로 공급되는 경우 벌집에서 96일 동안 새끼 생산(>4개 내역벌 세대)을 유지하기 위한, 이러한 3가지 먹이와 미국에서 널리 사용되는 제4 상업용 먹이(먹이 E, 도 20 및 실시예 8 참조)의 능력을 평가했다. 800 내지 850ml(약 2000마리의 벌)및 여왕벌로 먹이당 6개의 작은 벌집을 각각 2m x 4.5m x 3m 크기의 인접한 텐트 울타리에 분산시켰다(텐트당 벌집 3개, 도 11). 텐트 인클로저는 벨기에 Wingene에 있다(0일 = 5월 23일). 0일째에는 벌집에 미량의 꽃가루와 벌떡만이 존재했다. 여왕벌은 연령과 유전적 배경이 동일한 갓 교배된 자매 여왕벌이었다(Apis mellifera ligustica).
표준 양봉 관행에 따라 프레임 상단(새끼 둥지 위)에 패티를 놓아 6일마다 각 벌집에 먹이를 제공했다(도 11). 같은 텐트에 있는 세 개의 벌집 모두 동일한 먹이를 공급받았다(사료당 텐트 2개). 벌들은 자유롭게 물에 접근할 수 있었고 6일마다 50% 자당 설탕 시럽 400ml를 텐트 내의 테이블 위에 놓았다(설탕은 모든 방(cell)에 시럽을 채우는 것을 피하기 위해 자유롭게 제공되지 않았으므로 새끼를 위한 공간이 제한되었다)(도 11C). 각 벌집의 먹지 않은 패티의 무게를 측정하고 이를 신선한 패티로 교체하여 6일마다 사료 소비량을 측정했다. 96일 동안 12일마다 모든 벌집의 새끼가 포함된 각 프레임의 사진을 촬영했다(도 11D). 캐핑된 새끼는 2 또는 3명의 서로 다른 개인이 각 사진(도 15, 16 및 17)에서 수동으로 계수했으며 또 다른 개인이 결과를 재검증했다(품질 보증 확인). 처음 24일(벌집 안정화 기간) 동안 여왕벌이 산란을 멈춘 벌집과 관찰 중 우발적으로 여왕벌이 부서진 벌집은 실험에서 제외하였다. 이러한 관찰 체제는 벌집 내의 태어난 모든 벌(캐핑된 새끼로 발달한 모든 새끼)이 적어도 한 번만 사진 촬영되도록 보장한다. 84일째에, 향후 연구를 위해 각 벌집에서 25 내지 30마리 벌의 샘플을 채취했다.
이러한 설계는 일련의 단일 피토스테롤(이소푸코스테롤은 아님)을 간단한 홀리딕 먹이에 포함시켰고 더 이상 알이 생산되지 않을 때까지 작은 벌집을 먹이에 유지시킨 Herbert 등(참조)의 실험과 유사하다. 그러나, 실험 설계에서 본 발명자들은 정의된 다양한 스테롤을 추가하고, 보다 복잡하고 완전한 배경 먹이를 사용했으며, 총 스테롤 농도를 일정하게 유지하면서 먹이로부터 단일 스테롤을 생략하는 효과를 평가했다.
본 발명자들의 실험은 96일 동안 진행하였다(인공 먹이에서 21일의 4.5번의 새끼 주기). 내역벌이 벌집에 저장된 사료 및 실험 시작 시 존재했던 벌에 저장된 임의의 영양소 풀을 고갈시키는 데는 약 24일 또는 1.5일의 생활 주기가 걸린다. 24일째에 관찰된 캐핑된 새끼는 모두 텐트 내의 산란 알에서 나오므로 인공 먹이가 충분히 공급될 것으로 예상된다. 36일째부터 관찰된 캐핑된 새끼는 인공 먹이로 자란 내역벌에 의해 충분히 먹이를 받을 것으로 예상된다. 내역벌이 여왕벌에게 공급하는 영양소에도 동일하게 적용된다.
이소푸코스테롤/푸코스테롤의 중요성
벌 및 벌집은 날아갔다가 해질녘이나 비가 올 경우 벌집으로 돌아오는 것, 채집꾼이 설탕 시럽과 물을 수집하는 것, 방향을 잡고 배변 비행을 하는 정상적인 일주기(diurnal)로 확인되는 바와 같이 텐트 내에서 정상적인 행동을 보였다. 그러나, 이러한 조건에서 벌집은 다음과 같이 상당한 스트레스를 경험한다: (1) 벌집에 갇혀 그물에 대항하여 날아가고, (2) 더 중요한 것은 벌집을 열고 12일마다 사진 촬영을 위해 모든 프레임을 제거하는 때, 새끼를 차가운 온도에 노출시키고 벌집을 크게 교란한다. 후자의 과정은 벌집의 적합성과 생산성에 상당히 부정적인 영향을 미쳤을 것이다. 고려해야 할 또 다른 요소는 새로 설정된 작은 벌집(800 내지 850 ml 벌 및 새로 짝짓기한 여왕벌)으로 시작했다는 것이다. 작은 벌집은 교란을 받는 것에 더 민감하며 예를 들어 4000마리의 벌이 있는 더 큰 군집보다 덜 가열/냉각될 수 있다. 열파(heat wave) 동안 본 발명자들은 단일 노즐로부터 물을 분무하여 온도를 저하시켜서 최대 37.5℃로 유지하였다.
이러한 스트레스에도 불구하고 본 발명자들은 꽃가루 없는 먹이 A와 설탕 용액만을 공급한 벌집을 건강하게 유지할 수 있었고 텐트 울타리 내에서 96일 이상 동안 안정적으로 새끼를 생산할 수 있었다. 상업용 단백질 패티를 공급한 벌집은 36일 후에 새끼의 급격한 감소를 나타낸다(먹이 E, 도 20).
현재까지 꿀벌을 위한 인공 꽃가루 없는 완전한 먹이는 보고되지 않았다.
결과를 도 12 내지 도 20 및 하기 표 2 내지 표 4에 나타낸다.
| 새끼 수 | 24일 | 36일 | 48일 | 60일 | 72일 | 84일 | 96일 | |
| 모든 스테롤을 함유하는 먹이 A | 평균 먹이 A | 320 | 445 | 364 | 307 | 291 | 322 | 303 |
| 먹이 B = 먹이 A - 이소푸코스테롤 - 푸코스테롤 | 평균 먹이 B | 219 | 119 | 96 | 173 | 105 | 81 | 98 |
| 먹이 C = 먹이 A - 24-메틸렌콜레스테롤 | 평균 먹이 C | 322 | 434 | 249 | 281 | 223 | 206 | 168 |
| 누적 새끼 수 | 24일 | 36일 | 48일 | 60일 | 72일 | 84일 | 96일 | |
| 모든 스테롤을 함유하는 먹이 A | 평균 먹이 A | 320 | 765 | 1129 | 1436 | 1727 | 2049 | 2353 |
| 먹이 B = 먹이 A - 이소푸코스테롤 - 푸코스테롤 | 평균 먹이 B | 219 | 338 | 434 | 607 | 712 | 792 | 890 |
| 먹이 C = 먹이 A - 24-메틸렌콜레스테롤 | 평균 먹이 C | 322 | 756 | 1005 | 1286 | 1509 | 1715 | 1882 |
| 캐핑된 새끼 수 | 벌집 번호 | 24일 | 36일 | 48일 | 60일 | 72일 | 84일 | 96일 |
| 먹이 A | 4 | 443 | 849 | 430 | 215 | 172 | 339 | 399 |
| 29 | 236 | 384 | 342 | 255 | 268 | 361 | 178 | |
| 40 | 427 | 276 | 375 | 508 | 483 | 525 | 576 | |
| 56 | 400 | 578 | 465 | 406 | 359 | 204 | 213 | |
| 57 | 93 | 137 | 210 | 153 | 173 | 180 | 151 | |
| 평균 먹이 A | 320 | 445 | 364 | 307 | 291 | 322 | 303 | |
| 먹이 B | 12 | 484 | 146 | 412 | 349 | 364 | 394 | 353 |
| 15 | 160 | 22 | 12 | 197 | 3 | 0 | 0 | |
| 26 | 280 | 157 | 74 | 123 | 98 | 78 | 130 | |
| 28 | 38 | 308 | 53 | 292 | 104 | 12 | 102 | |
| 50 | 61 | 22 | 0 | 72 | 56 | 0 | 2 | |
| 51 | 292 | 60 | 22 | 5 | 4 | 0 | 0 | |
| 평균 먹이 B | 219 | 119 | 96 | 173 | 105 | 81 | 98 | |
| 먹이 C | 14 | 271 | 503 | 254 | 186 | 93 | 190 | 228 |
| 30 | 307 | 528 | 125 | 215 | 135 | 85 | 51 | |
| 34 | 459 | 223 | 364 | 396 | 336 | 219 | 148 | |
| 41 | 252 | 480 | 253 | 328 | 328 | 328 | 243 | |
| 평균 먹이 C | 322 | 434 | 249 | 281 | 223 | 206 | 168 |
| 누적 새끼 수 | 벌집 번호 | 24일 | 36일 | 48일 | 60일 | 72일 | 84일 | 96일 |
| 먹이 A | 4 | 443 | 1292 | 1722 | 1937 | 2109 | 2448 | 2847 |
| 29 | 236 | 620 | 962 | 1217 | 1485 | 1846 | 2024 | |
| 40 | 427 | 703 | 1078 | 1586 | 2069 | 2594 | 3170 | |
| 56 | 400 | 978 | 1443 | 1849 | 2208 | 2412 | 2625 | |
| 57 | 93 | 230 | 440 | 593 | 766 | 946 | 1097 | |
| 평균 먹이 A | 320 | 765 | 1129 | 1436 | 1727 | 2049 | 2353 | |
| 먹이 B | 12 | 484 | 630 | 1042 | 1391 | 1755 | 2149 | 2502 |
| 15 | 160 | 182 | 194 | 391 | 394 | 394 | 394 | |
| 26 | 280 | 437 | 511 | 634 | 732 | 810 | 940 | |
| 28 | 38 | 346 | 399 | 691 | 795 | 807 | 909 | |
| 50 | 61 | 83 | 83 | 155 | 211 | 211 | 213 | |
| 51 | 292 | 352 | 374 | 379 | 383 | 383 | 383 | |
| 평균 먹이 B | 219 | 338 | 434 | 607 | 712 | 792 | 890 | |
| 먹이 C | 14 | 271 | 774 | 1028 | 1214 | 1307 | 1497 | 1725 |
| 30 | 307 | 835 | 960 | 1175 | 1310 | 1395 | 1446 | |
| 34 | 459 | 682 | 1046 | 1442 | 1778 | 1997 | 2145 | |
| 41 | 252 | 732 | 985 | 1313 | 1641 | 1969 | 2212 | |
| 평균 먹이 C | 322 | 756 | 1005 | 1286 | 1509 | 1715 | 1882 |
도 12 및 표 2, 3 및 4는 먹이 A를 공급한 벌집에서는 평균 12일과 96일 사이에 캐핑된 새끼 2,353마리를 생산하는 반면, 먹이 B를 공급한 벌집에서는 같은 기간에 캐핑된 새끼 890마리를 생산한다는 것을 보여준다. 또한, 도 12는 60일 후에 먹이 B를 공급한 1개의 벌집(벌집 번호12)를 제외한 모든 벌집에서 생산된 새끼의 양이 감소하는 반면 먹이 A를 공급한 모든 벌집은 선형 성장 증가를 나타냄을 보여준다. 먹이 B를 공급한 5개 벌집 중 3개는 84일째에 캐핑된 새끼를 중단한 반면, 먹이 A를 공급힌 모든 벌집은 계속해서 새끼를 생산했다. 이는 먹이 A로부터 이소푸코스테롤-푸코스테롤을 생략하면 새끼를 생산하는 벌집의 능력에 심각한 영향을 미치고 다른 스테롤이 이러한 결핍을 보상할 수 없음을 보여준다. 새끼 생산은 벌집의 생존에 필수적인 기능이다.
표 2 및 3 및 도 12, 14, 15, 16 및 17은 먹이 A의 경우 각 시점의 새끼의 양이 안정적인 반면(도 14A), 먹이 B의 경우 각 시점에서 생산된 새끼의 양은 먹이 A의 경우 보다 낮다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 먹이 A의 경우 96일 또는 4.5세대의 내역벌에 대해 테스트된 조건 하에서 벌집이 안정적이라는 결론을 내렸다(위에서 설명한 심각한 스트레스에도 불구하고). 0.0625% 이소푸코스테롤-푸코스테롤을 먹이로부터 생략하고 다른 추가된 스테롤의 각각의 농도를 비례적으로 증가시켜서 대체하는 경우 벌집은 확실히 새끼 생산 성능이 떨어지고 안정성이 떨어진다.
도 13은 먹이 A와 B의 소비량을 보여준다. 벌집에서 꽃가루의 주요 사용은 내역벌에게 먹이를 주어 유충과 여왕에게 먹이를 주기 위한 것이기 때문에, 새끼가 적게 생산되면 먹이도 덜 소비된다는 것이 논리적이다(도 13).
새끼가 있는 프레임의 사진은 평균 먹이 A를 공급한 벌집 번호 29(도 15)와 평균 먹이 B를 공급한 벌집 번호 26(도 16)에서 캐핑된 새끼의 수 및 패턴의 차이를 명확하게 보여준다.
도 17은 먹이 A를 공급한 벌집이 먹이 B를 공급한 벌집보다 지속적으로 더 많은 새끼를 생산한다는 것을 보여준다.
본 발명자들은 꽃가루와 비슷한 농도로 콜레스테롤, 캄페스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤 및 24-메틸렌콜레스테롤을 포함하지만 이소푸코스테롤-푸코스테롤은 포함하지 않는 불완전한 먹이에 이소푸코스테롤-푸코스테롤을 첨가하면 내역벌(꽃가루나 기타 영양소(설탕 용액 제외)에 접근하지 않음)의 4.5 새끼 주기(세대)에 걸쳐 벌집을 유지하는 먹이가 얻어진다는 결론을 내렸다. 역으로 말하면, 본 실시예는 완전한 먹이로부터 이소푸코스테롤-푸코스테롤을 생략하면 벌집 및 꿀벌의 적합성이 심각하게 감소하고 이러한 이소푸코스테롤-푸코스테롤 생략을 다른 스테롤로 비례적으로 보상해도 이러한 생략을 보상하지 못한다는 것을 보여준다.
이는 이소푸코스테롤-푸코스테롤이 꿀벌집의 먹이에 기능적으로 중요하고 필수적이라는 최초의 명확한 증거이다. 데이터는 꽃가루와 꿀벌에 존재하는 다른 모든 주요 스테롤의 존재에도 불구하고 이소푸코스테롤-푸코스테롤이 꿀벌의 새끼 생산에 필요하며 이의 생리학적 역할은 먹이에 존재하는 다른 스테롤(콜레스테롤, 24-메틸렌-콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 베타-시토스테롤은 일반적으로 꿀벌에 존재하는 전체 스테롤의 >80%를 나타내며, 나머지는 이소푸코스테롤-푸코스테롤임)에 의해서는 가정될 수 없음을 보여준다. 또한, 먹이 A는 꽃가루가 없는, 꿀벌을 위한 최초로 보고된 완전한 인공 먹이이다.
24-메틸렌콜레스테롤의 중요성
먹이 A로부터 24-메틸렌-콜레스테롤을 생략한 먹이 C를 공급한 벌집은 48일차부터 생산량의 차이가 증가하기 시작했다(도 18 및 도 19 및 표 2, 3 및 4). 36일부터 96일 사이에, 먹이 C를 공급한 벌집은 평균 1126마리의 누적 캐핑된 새끼를 생산한 반면, 먹이 A를 공급한 벌집은 평균 1588마리의 누적 캐핑된 새끼를 생산했다. 본 발명자들은 먹이 A와 먹이 B(이소푸코스테롤-푸코스테롤 제외)에서 생산된 캐핑된 새끼의 차이는 24 내지 36일에 이미 명백히 나타났다는 점에 주목한다(표 2 및 표 3). 먹이 B에서 이소푸코스테롤을 생략한 효과와 비교하여 먹이 C에서 관찰된 바와 같이 24-메틸렌-콜레스테롤의 생략으로 인한 표현형의 늦은 출현은, 꿀벌은 벌집에 있는 24-메틸렌 콜레스테롤 풀(pool)을 새끼 및 내열벌로 재순환하여 벌집에서 풀(의일부)을 유지하는 메커니즘을 가지고 있다는 Sbovoda 등의 관찰에 의해 설명될 수 있다(표 7). 본 실시예에 보고된 데이터는 그의 생략의 효과가 더 일찍 나타나기 때문에 24-메틸렌-콜레스테롤에 비해 인공 꿀벌 먹이에서 이소푸코스테롤-푸코스테롤의 중요성의 증가된 중요성을 더욱 강조한다.
이러한 데이터는 24-메틸렌-콜레스테롤이 꿀벌의 먹이에 기능적으로 필요하며 이의 생리적 기능이 꽃가루에 일반적으로 존재하는 농도 및 비율로 먹이에 존재하는 다른 스테롤(콜레스테롤, 이소푸코스테롤/푸코스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤)의 존재에 의해 완전히 보상될 수 없다는 최초의 기술적 입증이다.
실시예 8: 이소푸코스테롤/푸코스테롤 및 24-메틸렌-콜레스테롤 결핍의 행동 표현형.
벌집에 있는 벌 및 내역벌의 수는 중요하지만, 벌의 질 및 생리적 적합성도 벌집의 적합성 및 작물 수분 능력에 똑같이 중요하다.
꿀벌은 벌집 안에서 복잡한 행동 기능(청소, 새끼에게 먹이주기, 방 만들기, 보호, 환기, 난방 등) 벌집 밖에서 복잡한 행동 기능(벌집으로부터 최대 2km 떨어진 먼 거리를 비행하고, 집으로 돌아가는 길을 찾고, 벌집 동료에게 먹이 공급원의 위치를 알리고, 꿀, 꽃가루, 미네랄, 물, 프로폴리스 등을 수집)을 수행해야 한다. 벌집에 있는 벌의 수 및 수명은 벌집이 유지 및 성장을 위해 얼마나 많은 자원을 수집할 수 있는지를 결정한다. 상업적인 관점에서, 더 크고 활동적이며 잘 목이공급된 벌집(더 오래 살고 더 건강한 채집자가 있는)은 작물을 더 잘 수분하고 살충제 및 다른 스트레스 요인(열, 운송, 질병)에의 노출에 더 잘 견뎌낼 수 있다. 요약하면, 벌집에 있는 벌의 수뿐만 아니라 벌의 질도 중요하다.
다양한 스테롤은 세포의 막 구조에 다르게 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 동물 세포의 막에서 스테롤의 역할 중 하나는 막의 유동성과 막의 래프트(raft)에서 단백질의 구성(organization)을 조절하는 것이다. 이는 다른 세포 근육과 뉴런의 적절한 기능, 막 곡률과 소포체의 형성 및 다양한 환경 온도에의 적응을 위해 중요하다.
본 실시예에서 본 발명자들은 스테롤 조성만 서로 다른 다양한 먹이를 공급한 텐트 울타리 내의 벌집이 동등한 행동적 적합성을 갖는 꿀벌을 생산하는지 여부를 살펴보았다.
본 발명자들은 위에서 설명한 것과 동일한 프로토콜에 따라 동일한 텐트 설정에서 다음 먹이를 섭취한 꿀벌의 행동 및 활동을 특성 분석했다(도 11 참조):
1. 실외 벌집: 이 벌집은 자매 여왕벌 및 동일한 수의 꿀벌이 있는 텐트 내 벌집과 동시에 시작되었지만, 자연에서 꽃가루 흐름 및 꿀을 자유롭게 이용할 수 있도록 텐트에 인접한 실외에 배치되었다.
2. 텐트 내 벌집 - 먹이 A: 먹이 A는 위를 참조한다(실시예 7과 동일한 벌집 및 시점). 먹이 A' = 먹이 A와 동일한 조성 및 비율로 스테롤 농도를 두 배(0.75%)로 첨가한 먹이 A. 먹이 A와 A'는 동일한 표현형을 갖는다.
3. 텐트 내 벌집 - 먹이 B: 먹이 A에서 이소푸코스테롤/푸코스테롤을 제외한 것(다른 추가 스테롤의 농도는 위에서 설명한 대로 비례적으로 위쪽으로 조정됨; 실시예 1과 동일한 벌집 및 시점)
4. 텐트 내 벌집 - 먹이 C: 먹이 A에서 24-메틸렌-콜레스테롤을 제외한 것(위에 설명된 대로 다른 추가 스테롤의 농도는 비례적으로 위쪽으로 조정됨; 실시예 1과 동일한 벌집 및 시점)
5. 텐트 내 벌집 - 먹이 D: 먹이 A에서 이소푸코스테롤/푸코스테롤 및 24-메틸렌-콜레스테롤을 제외한 것(추가된 다른 스테롤의 농도는 먹이 A'의 농도(0.75%)로 상향 조정됨; 실시예 1과 같은 시점에서 평행 텐트에서 진행됨; 먹이 공급 및 벌집 평가의 동일한 전체 프로토콜)
6. 텐트 내 벌집 - 먹이 E: 시중에서 판매되는 먹이(완전히 다른 먹이; 실시예 1과 같은 시점에서 텐트에서 병행하여 진행됨; 먹이 공급 및 벌집 교란의 동일한 전체 프로토콜)
먹이 E(상업용 먹이)를 공급한 벌집은 36일 후에 새끼를 생산하는 것을 사실상 중단했다(표 5, 도 20). 먹이 A, B, C 및 D를 공급한 벌집은 96일째에도 새끼를 생산하였다. 먹이 및 실험 설계는 실시예 7에 설명되어 있다.
98 또는 99일째에, 벌집을 열고 여러 표현형에 대해 시각적으로 점수를 매겼다(점수: 표현형이 없음(-), 표현형이 있음 (+), 표현형이 더 심각함(++), 표현형이 훨씬 더 심각함(+++)).
벌집은 하기의 표현형에 대해 2명의 관찰자에 의해 독립적으로 점수를 받았다:
- 무기력함: 벌들이 벌집에 꼼짝없이 앉아 있음.
- 떨림(shaking), 둔한 몸놀림: 벌이 뒷다리를 늘어뜨리고 걷고, 불안정하게 걷고, 날개를 열린 자세에서 접힌 자세로 덜 신속하게 바꿈(둔한 신경근 활동의 징후),
- 약한 반응 - 날아오르지 못함: 프레임 상의 벌이 벌집으로부터 프레임을 제거하거나 핀셋을 프레임 상의 벌들을 통해 이동시켜서 교란을 받는 것에 느리게 반응하고, 벌이 프레임으로부터 밀려난 후 더 느리게 위로 기어올라가고, 교란을 받아도 날아오르지 못함.
- 느린 움직임: 벌들이 프레임 및/또는 설탕 피더 주변 및/또는 둥지 입구에서 정상보다 더 느리게 움직임.
- 반응성: 이것은 벌집 안팎에서 꿀벌의 전반적인 벌집 활동과 활력을 나타내는 1 내지 5점(낮음 내지 높음)의 통합 점수이다.
이러한 관찰 결과는 하기 표 5 및 표 6에 나타낸다.
| 먹이 | 무기력함 | 떨림, 둔한 몸놀림 | 약한 반응, 날라오르지 못함 | 느린 움직임 | 반응성 |
| 텐트 옆 실외 벌집 - 꽃가루 수집 | - | - | - | - | 5 |
| 먹이 A(0.375% 스테롤; 모든 스테롤) 및 먹이 A'(0.750%; 모든 스테롤) - 텐트 내 | - | - | - | - | 5 |
| 먹이 C(먹이 A에서 24-메틸렌 콜레스테롤을 뺀 것) - 텐트 내 | - | - | - | + | 3 |
| 먹이 B(먹이 A에서 이소푸코스테롤/푸코스테롤을 뺀 것) - 텐트 내 | ++ | + | ++ | ++ | 2 |
| 먹이 D(먹이 A에서 24 메틸렌 콜레스테롤을 빼고 이소푸코스테롤을 뺀 것; 스테롤 농도 0.75%) - 텐트 내 | - | +++ | ++ | ++ | 3 |
| 먹이 E: 시중에서 판매하는 패티 - 텐트 내 | +++ | - | +++ | +++ | 1 |
표현형 없음 -; 표현형 더 심각함 ++; 표현형 있음 +; 표현형 매우 심각함 +++
| 캐핑된 새끼 수 | 24일 | 36일 | 48일 | 60일 | 72일 | 84일 | 96일 | ||||
| 평균 먹이 A | 320 | 445 | 364 | 307 | 291 | 322 | 303 | ||||
| 평균 먹이 B | 219 | 119 | 96 | 173 | 105 | 81 | 98 | ||||
| 평균 먹이 C | 322 | 434 | 249 | 281 | 223 | 206 | 168 | ||||
| 평균 먹이 E | 255 | 244 | 77 | 69 | 16 | 0 | 0 | ||||
| 캐핑된 새끼 수 | 벌집 번호 | 24일 | 36일 | 48일 | 60일 | 72일 | 84일 | 96일 | |||
| 먹이 E | 9 | 199 | 229 | 52 | 41 | 9 | 0 | 0 | |||
| 13 | 245 | 287 | 54 | 88 | 33 | 1 | 0 | ||||
| 37 | 364 | 174 | 108 | 86 | 34 | 0 | 0 | ||||
| 44 | 344 | 258 | 54 | 109 | 4 | 0 | 0 | ||||
| 55 | 124 | 270 | 116 | 19 | 0 | 0 | 0 | ||||
| 평균 | 255 | 244 | 77 | 69 | 16 | 0 | 0 | ||||
먹이 A 및 A'를 섭취한 벌은 텐트 울타리 옆에 있는 자연에서 먹이를 수집하는 벌집에서 나온 벌과 마찬가지로 활동적이고, 반응성이 있고, 움직임이 있었다.
먹이 C(먹이 A에서 24-메틸렌 콜레스테롤을 제외한 한)을 공급한 벌집은 느린 움직임 표현형(+)을 보였고, 반응성 점수가 3으로 낮았다.
먹이 B(먹이 A에서 이소푸코스테롤/푸코스테롤을 제외한 것)를 공급한 벌집은 무기력함(++), 떨림/둔한 몸놀림(++), 약한 반응/날아오르지 못함(++), 및 느린 움직임(++) 표현형을 보였으며, 반응성 점수가 2로 낮았다.
먹이 D(먹이 A'에서 24 메틸렌 콜레스테롤과 이소푸코스테롤을 제외한 것)를 공급한 벌집은 먹이 B보다 떨림/둔한 움직임(+++) 표현형이 현저히 더 많이 나타났지만 무기력한 표현형은 나타나지 않았다. 먹이 D의 경우 무기력한 표현형이 없기 때문에, 먹이 D를 공급한 벌집은 반응성 점수 3을 받았다. 약한 반응/날아 오르지 않음(++) 및 느린 움직임 표현형(++)은 먹이 B와 D를 공급한 벌집에서 유사했지만 먹이 C와는 확연히 달랐다.
본 발명자들은 꿀벌에 존재하는 주요 스테롤(콜레스테롤, 24-메틸렌-콜레스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤 스티그마스테롤, 이소푸코스테롤/푸코스테롤)을 함유하는 먹이 A로부터 이소푸코스테롤/푸코스테롤 또는 24-메틸렌-콜레스테롤을 제외하면 생산된 캐핑된 새끼가 감소할 뿐만(실시예 1) 꿀벌이 복잡한 벌집 작업을 효율적으로 수행하는데 필요한 그의 생리적 적합성에 영향을 줄 수 있는 다양한 표현형을 보인다는 결론을 내렸다.
또한 이소푸코스테롤-푸코스테롤이나 24-메틸렌 콜레스테롤 또는 이들 두 스테롤의 부재로 인해 나타나는 표현형은 다른 스테롤의 증가를 통해 생리적으로 보상될 수 없음을 보여준다. 또한 이소푸코스테롤과 24-메틸렌 콜레스테롤을 모두 제거하는 것이 먹이 A'에서 이들 스테롤 중 하나를 하나씩 제거하는 것보다 신경근에 더 심각한 영향을 미쳐(둔한 몸놀림) 적합성에 영향을 미친다는 것을 보여준다.
먹이 A로부터 이소푸코스테롤/푸코스테롤을 제거하는 영향이 24-메틸렌콜레스테롤을 제거하는 영향보다 더 심각하다는 관찰 결과는 이 분야에서 놀라운 발견인데, 이는 문헌["Sterol and Lipid metabolism in bees" Furse et al 2023, https://doi.org/10.1007/s11306-023-02039-1)]에서 검토한 바와 같이 이 분야에서 24-메틸렌콜레스테롤은 "꿀벌에게 중요하고 필수적인 식물 스테롤"로 널리 주장되고 있기 때문이다.
실시예 7 및 8의 데이터는 꿀벌이 다양한 스테롤을 필요로 한다는 것을 보여주는데, 이는 단독으로 또는 조합되어 제외된 이소푸코스테롤과 24-메틸렌콜레스테롤 모두는 꿀벌의 생리학에서 꽃가루에 존재하는 다른 스테롤로 기능적으로 대체될 수 없기 때문이다.
본 발명자들은 먹이 A가 벌집에서 새끼 생산을 지속하는 관점뿐만 아니라 고품질 벌을 생산하는 관점에서도 완벽한 먹이라고 결론지었다. 또한, 본 발명자들은 이소푸코스테롤/푸코스테롤이 이 먹이에 필수적이며, 꽃가루에 존재하는 다른 주요 식물 스테롤을 비례적으로 증가시켜 이소푸코스테롤/푸코스테롤을 대체할 수 없다는 결론을 내렸다. 24-메틸렌-콜레스테롤의 경우에도 동일한 결과가 나타났지만 그 정도는 더 낮았다. 도 20 및 표 5는 미국에서 널리 사용되는 상업적으로 판매되는 단백질 패티와 비교하여 완전한 먹이 A의 성능이 더 우수함을 보여준다.
표 7: 참조 문헌의 목록
Chakrabarti 등
- doi:10.3390/molecules25030571
Herbert 및 Svoboda 그룹
- doi:10.1007/BF02534310
- doi:10.1016/0022-1910(80)90135-3
- doi:10.1016/0022-1910(80)90136-5
- doi:10.1016/0020-1790(86)90024-7
- doi:10.1007/BF02535107
Feldlaufer
- doi.org/10.1002/arch.940030502
Furse S 등
- doi:10.1007/s11306-023-02039-1
Tian 등
- doi:10.1038/s41467-018-05619-1
Claims (33)
- 무척추동물 또는 양식 유기체에게 먹이를 주는 방법으로서,
이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물을 영양학적 유효량으로 포함하는 꽃가루 대체 조성물을 제공하는 단계; 및
무척추동물 또는 양식 유기체에게 상기 꽃가루 대체 조성물을 투여하는 단계를 포함하고,
상기 꽃가루 대체 조성물은 적어도 하나의 추가의 스테롤, 바람직하게는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤 또는 이들의 생리학적으로 이용가능한 결합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 추가의 스테롤을 영양학적 유효량으로 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 무척추동물은 꽃가루를 먹는 곤충, 바람직하게는 벌목 및 딱정벌레목의 곤충, 더욱 바람직하게는 꿀벌, 호박벌, 동애등에, 꽃등에 또는 무당벌레이고,
상기 양식 유기체는 플랑크톤 및 조류를 먹는 양식 유기체, 바람직하게는 어류, 어류 유충, 굴, 조개, 연체동물, 복족류 또는 갑각류인, 방법. - 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 영양학적 유효량은 상기 무척추동물 또는 양식 유기체의 생체 중량의 0.0006 중량% 내지 0.052 중량%의 일일 투여량인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 영양학적 유효량은 상기 무척추동물 또는 양식 유기체의 전체 먹이에서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군의 스테롤의 총량 또는 상기 꽃가루 대체 조성물의 스테롤의 총량의 10 중량 내지 60 중량%인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물은 2주의 기간당 벌 30000마리당 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 0.14 내지 12 그램의 비율로 투여되는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물은 상기 무척추동물 또는 양식 유기체의 전체 먹이에서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군의 스테롤의 총량 또는 상기 꽃가루 대체 조성물의 스테롤의 총량의 10 중량 내지 60 중량%의 양으로 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및 적어도 하나의 추가의 스테롤의 영양학적 유효량은 2주의 기간당 벌 30000마리당 0.2 내지 48 그램의 투여 비율이고,
상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물은 벌의 전체 먹이에서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군의 스테롤의 총량 또는 상기 꽃가루 대체 조성물의 스테롤의 총량의 10 중량 내지 60 중량%의 양으로 투여되는, 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및 적어도 하나의 추가의 스테롤은 2주의 기간당 벌 30000마리당 0.4 내지 36 그램의 비율로 투여되고,
상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물은 벌의 전체 먹이에서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군의 스테롤의 총량 또는 상기 꽃가루 대체 조성물의 스테롤의 총량의 10 중량 내지 60 중량%의 양으로 투여되는, 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및 적어도 하나의 추가의 스테롤은 2주의 기간당 벌 30000마리당 0.6 내지 20 그램의 비율로 투여되고,
상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물은 벌의 전체 먹이에서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군의 스테롤의 총량 또는 상기 꽃가루 대체 조성물의 스테롤의 총량의 10 중량 내지 60 중량%의 양으로 투여되는, 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 베타-스티그마스테롤, 스티그마스테롤 및/또는 캄페스테롤은 하루에 상기 무척추동물 또는 양식 유기체의 생체 중량의 0.001 중량% 내지 0.087 중량%의 양으로 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영양학적 유효량은 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤 및/또는 캄페스테롤의 총량을 기준으로,
10 중량% 내지 60 중량%의 양의 이소푸코스테롤,
0 중량% 내지 50 중량%의 양의 콜레스테롤,
0 중량% 내지 50 중량%의 양의 24-메틸렌콜레스테롤,
0 중량% 내지 50 중량%의 양의 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤 및/또는 캄페스테롤인, 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 스테롤의 총 농도는 상기 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 4 중량%, 바람직하게는 0.05 중량% 내지 3 중량%, 더욱 바람직하게는 0.05 중량% 내지 2 중량%이고, 더욱 더 바람직하게는 0.05 중량% 내지 1.5 중량%인, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1.5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.06 중량% 내지 1.2 중량%의 양의 콜레스테롤,
상기 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1.5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.06 중량% 내지 1.2 중량%의 양의 24-메틸렌콜레스테롤,
상기 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%, 더욱 바람직하게는 0.03 중량% 내지 0.6 중량%의 양의 시토스테롤, 바람직하게는 베타-시토스테롤,
상기 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 2 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 중량% 내지 1.0 중량%, 더욱 바람직하게는 0.03 중량% 내지 0.6 중량%의 양의 이소푸코스테롤,
상기 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%, 더욱 바람직하게는 0.02 중량% 내지 0.35 중량%의 양의 캄페스테롤,
상기 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.2 중량%의 양의 스티그마스테롤, 또는
이들의 조합으로 이루어진 군에서 스테롤의 농도가 선택되는, 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 무척추동물 전체 먹이, 무척추동물 먹이의 일부 또는 먹이 보충제이고, 24-메틸렌콜레스테롤 대 상기 추가의 스테롤 또는 추가의 스테롤의 조합의 비율은 10:1 내지 1:1인, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 꿀벌과의 무척추동물, 특히 꿀벌(꿀벌족), 호박벌(뒤영벌족) 또는 침없는 꿀벌(침없는 꿀벌족)에 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 패티 또는 분말과 같은 고체 형태 또는 용액, 오일 또는 스프레이와 같은 액체 형태로,
벌집의 내부 또는 외부에 투여되는, 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원은 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 꽃, 씨앗, 나무껍질 및 열매 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물 종의 꽃가루 대체 조직이고/이거나,
상기 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가의 스테롤의 공급원은 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 꽃, 씨앗, 나무껍질, 열매 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 식물 종의 꽃가루 대체 조직인, 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤의 공급원은 하나 이상의 식물종의 비화분 조직의 추출물, 오일, 정제물 또는 이들의 조합인, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤의 공급원은 가지과, 벼과, 미나리아재비과, 콩과 및 너도밤나무과로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종 이상의 식물 종의 꽃가루 대체 조직인, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤의 공급원은,
해양 또는 담수 조류 종, 특히 참갈파래의 추출물, 오일 또는 정제물;
해양 규조류 종, 특히 탈라시오시라 프세오도나나, 탈라시오시라 로툴라 또는 각모조의 추출물, 오일 또는 정제물; 및
진균, 특히 사카로마이세스 세레비지애 또는 야로위아 리폴리티카와 같은 효모의 추출물, 오일 또는 정제물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤 또는 푸코스테롤 및 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤은 화학적으로 또는 효소적으로 합성되거나 진균, 박테리아 또는 조류와 같은 유전자 변형 숙주 유기체에 의해 얻어지는, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 또는 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤의 공급원은 조류, 식물, 진균, 조류, 규조류 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 여기서 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물의 공급원은 꽃가루 대체 조직인, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 및 베타-시토스테롤 및 스티그마스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 스테롤은 합성 공급원으로부터 사회성 벌 군집에 제공되는, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 또는 이들의 혼합물 및 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 스테롤은 꽃가루 대체 조성물의 일부로서 제공되고, 상기 꽃가루 대체 조성물은,
10 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 15 중량% 내지 40 중량%의 양의 단백질;
1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 2 중량% 내지 12 중량%의 양의 지방산;
20 중량% 내지 90 중량%, 바람직하게는 30 중량% 내지 70 중량%의 양의 탄수화물;
선택적으로 비타민; 및
선택적으로 미네랄을 포함하고,
여기서의 성분들의 총량은 100 중량%이고, 중량%는 상기 조성물의 총 건조 중량을 기준으로 한 것인, 방법. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 꽃가루 대체 조성물에는 꽃가루가 본질적으로 없는, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 꽃가루 대체 조성물을 이용하는 방법으로서,
무척추동물, 바람직하게는 꽃가루를 먹는 곤충, 더욱 바람직하게는 벌목 및 딱정벌레목의 곤충, 더욱 더 바람직하게는 꿀벌, 호박벌, 동애등에, 꽃등에 또는 무당벌레,
양식 유기체, 바람직하게는 플랑크톤 및 조류를 먹는 양식 유기체, 더욱 바람직하게는 어류, 어류 유충, 굴, 조개, 연체동물, 복족류 또는 갑각류로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기체에게 먹이를 주기 위한, 방법. - 제26항에 있어서, 상기 꽃가루 대체 조성물은 농축된 패티이고, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤의 농도가 상기 꽃가루 대체 조성물의 총 중량을 기준으로 10 중량% 내지 33 중량%인, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 조성물은 꽃가루, 설탕, 오일 또는 지방, 꿀, 또는 단백질 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 벌 식욕/섭취 유도 성분을 포함하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 벌 식욕/섭취 유도 성분의 농도는 상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 2.5 중량% 내지 15 중량%, 더욱 더 바람직하게는 5 중량% 내지 10 중량%인, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 꽃가루 대체 조성물은 액체 형태 또는 분말인, 방법.
- 제30항에 있어서, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 콜레스테롤, 24-메틸렌콜레스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤의 농도는 상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 건조 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 99 중량%인, 방법.
- 특히 벌을 위한 꽃가루가 없는 사료 조성물 또는 꽃가루 대체 조성물로서,
상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 1 중량%의 이소푸코스테롤, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 0.3 중량%의 이소푸코스테롤을 포함하고 사료 섭취를 증가시키기 위해 상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함하거나,
상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 0.3 중량%의 푸코스테롤을 포함하고 사료 섭취를 증가시키기 위해 상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함하거나,
상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 0.3 중량%의 이소푸코스테롤 및 푸코스테롤을 0.01:100 내지 100:0.01의 이소푸코스테롤 대 푸코스테롤의 중량비로 포함하고 사료 섭취를 증가시키기 위해 상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함하거나,
상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 0.3 중량%의 이소푸코스테롤/푸코스테롤을 0.01:100 내지 100:0.01의 이소푸코스테롤 대 푸코스테롤의 중량비로 포함하고, 상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 0.5 중량%의 24-메틸렌-콜레스테롤을 2:100 내지 100:2의 이소푸코스테롤과 푸코스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤의 비율로 추가로 포함하고, 사료 섭취를 증가시키기 위해 상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함하거나,
상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 0.3 중량%의 24-메틸렌-콜레스테롤을 포함하고, 이소푸코스테롤 및 푸코스테롤을 0.01:100 내지 100:0.01의 이소푸코스테롤 대 푸코스테롤의 중량비 및 2:100 내지 100:2의 이소푸코스테롤과 푸코스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤의 중량비로 추가로 포함하고, 사료 섭취를 증가시키기 위해 상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함하는, 조성물. - 특히 벌을 위한 꽃가루가 없는 사료 조성물 또는 꽃가루 대체 조성물로서, 상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.02 중량% 내지 3 중량%의 스테롤을 포함하고, 상기 스테롤은 24-메틸렌-콜레스테롤, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되고,
이소푸코스테롤과 푸코스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤의 중량비는 0.5:100 내지 100:0.5이고/이거나,
이소푸코스테롤 대 푸코스테롤의 중량비는 0:10 내지 10:0이고/이거나,
이소푸코스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤, 푸코스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 콜레스테롤, 에르고스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 스테롤의 합의 중량비는 2:100 내지 100:2이고/이거나,
푸코스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤, 이소푸코스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 콜레스테롤, 에르고스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 다른 스테롤의 합의 중량비는 2:100 내지 100:2이고/이거나,
24-메틸렌-콜레스테롤 대 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 콜레스테롤, 에르고스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 스테롤의 합의 중량비는 2:100 내지 100:2이고/이거나,
콜레스테롤 대 24-메틸렌-콜레스테롤, 이소푸코스테롤, 푸코스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 스테롤의 합의 중량비는 15:1 내지 1:100이고/이거나,
상기 꽃가루 대체 조성물은 사료 섭취를 증가시키기 위해 상기 꽃가루 대체 조성물의 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 15 중량%의 양으로 천연 꽃가루를 선택적으로 추가로 포함하는, 조성물.
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