BE1029426B1

BE1029426B1 - Methods for the administration of beneficial nutrients to organisms

Info

Publication number: BE1029426B1
Application number: BE20215756A
Authority: BE
Inventors: Thierry Bogaert; Geraldine Wright; Sharoni Shafir
Original assignee: Apix Biosciences
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2022-12-14

Abstract

Een methode voor het voederen van ongewervelde dieren, bestaande uit: - een samenstelling te verstrekken die een microbieel organisme of delen, extracten, oliën of verfijningen daarvan bevat; en - toediening van de samenstelling aan ongewervelde dieren waarbij het microbiële organisme wordt gekozen uit de groep bestaande uit schimmels, algen of bacteriën; en waarbij het microbiële organisme genetisch gemodificeerd is om een voedingsstof voor ongewervelden te produceren.A method of feeding invertebrates consisting of: - providing a composition containing a microbial organism or parts, extracts, oils or refinements thereof; and - administering the composition to invertebrates wherein the microbial organism is selected from the group consisting of fungi, algae or bacteria; and wherein the microbial organism is genetically modified to produce an invertebrate nutrient.

Description

Methoden voor de toediening van heilzame voedingsstoffen aan organismenMethods for the administration of beneficial nutrients to organisms

ACHTERGROND Bijen zijn in de modeme landbouw zeer belangrijk voor de bestuiving van gewassen. Bestuivers worden de laatste tijd bedreigd door de blootstelling aan bestrijdingsmiddelen, de toegenomen prevalentie van ziekteverwekkers en parasieten en veranderingen in het landschapsbeheer die de overvloed aan natuurlijk bloemstuifmeel doen afnemen. Imkers voeden honingbijenkolonies van oudsher met een voedselbron die stuifmeel of pollen bevat dat in de natuur door bijen is verzameld. Omdat stuifmeel slechts beperkt beschikbaar is en op beperkte schaal wordt verzameld, stuifmeel verzamelen duur is, stuifmeel moeilijk vers te houden is en in het wild verzameld stuifmeel drager kan zijn van plagen, ziekten en bestrijdingsmiddelen. Daarom bevatten in de handel verkrijgbare voeders meestal geen stuifmeel. Deze stufmeelvervangende samenstellingen zijn reeds beschreven door de huidige uitvinders. US2019/0090507 naar Apix Biosciences benadrukt het belang van plantensterolen en in het bijzonder van 24-methyleencholesterol, campesterol, B- sitosterol, en cholesterol. US2019/0090507 vermeldt echter niet 24-methyleencholesterol, campesterol, B-sitosterol, en cholesterol verkregen uit genetisch gemodificeerd micro- organisme. US2019/0090507 aan Apix Biosciences wijst ook op het belang van fenolverbindingen, carotenoïden, en vitamine C en E als voedingsstoffen voor bijen, maar vermeldt niet dat deze uit een micro-organisme kunnen worden verkregen.BACKGROUND Bees are very important in modern agriculture for the pollination of crops. Pollinators have recently been threatened by exposure to pesticides, the increased prevalence of pathogens and parasites, and changes in landscape management that are reducing the abundance of natural flower pollen. Beekeepers traditionally feed honey bee colonies with a food source that contains pollen or pollen collected by bees in nature. Because pollen is only available in limited quantities and collected on a limited scale, collecting pollen is expensive, pollen is difficult to keep fresh and pollen collected in the wild can carry pests, diseases and pesticides. Therefore, commercially available feeds usually do not contain pollen. These pollen replacement compositions have already been described by the present inventors. US2019/0090507 to Apix Biosciences emphasizes the importance of plant sterols and in particular 24-methylene cholesterol, campesterol, β-sitosterol, and cholesterol. However, US2019/0090507 does not mention 24-methylene cholesterol, campesterol, β-sitosterol, and cholesterol obtained from genetically modified microorganism. US2019/0090507 to Apix Biosciences also points out the importance of phenolic compounds, carotenoids, and vitamins C and E as nutrients for bees, but does not mention that these can be obtained from a microorganism.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING De huidige uitvinders hebben verrassend vastgesteld dat essentiële voedingsstoffen, in het bijzonder sterolen, stanolen, polyfenolen en carotenoïden, die doeltreffend kunnen worden toegediend aan ongewervelde dieren, in het bijzonder bijen, door synthese of productie in micro-organismen of delen daarvan. Voorbeelden van dergelijke sterolvoedingsstoffen zijn cholesterol, desmosterol, 24methyleencholesterol, 7- dehydroxycholesterol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol en fucosterol. Voorbeelden zijn de stanolen zoals cholestanol en 24-methylenecholst-7-enol. Voorbeelden van polyfenolen zijn de flavenolen, quercetine en rutine, en fenolzuren zoals p-cumarinezuur. Voorbeelden van carotenoïden zijn b-caroteen en astaxanthine.BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION The present inventors have surprisingly found that essential nutrients, especially sterols, stanols, polyphenols and carotenoids, which can be effectively administered to invertebrates, especially bees, by synthesis or production in microorganisms or parts of them. Examples of such sterol nutrients are cholesterol, desmosterol, 24methylene cholesterol, 7-dehydroxycholesterol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol and fucosterol. Examples are the stanols such as cholestanol and 24-methylenecholest-7-enol. Examples of polyphenols are the flavenols, quercetin and rutin, and phenolic acids such as p-coumaric acid. Examples of carotenoids are b-carotene and astaxanthin.

Bijgevolg bestaat een eerste aspect van de uitvinding uit een methode voor het voederen van ongewervelde dieren, bestaande uit: =» een samenstelling te verstrekken die een microbieel organisme of een algensoort of delen, extracten, oliën of mengsels of verfijningen daarvan bevat; = toediening van deze samenstelling aan een doelsoort waarbij het organisme wordt gekozen uit de groep bestaande uit schimmels, algen of bacteriën; en waarbij het microbiële organisme een voedingsstof produceert op natuurlijke wijze of na selectie of modificatie van de microbe.Accordingly, a first aspect of the invention is a method of feeding invertebrates comprising: =» providing a composition containing a microbial organism or a species of algae or parts, extracts, oils or mixtures or refinements thereof; = administration of this composition to a target species wherein the organism is selected from the group consisting of fungi, algae or bacteria; and wherein the microbial organism produces a nutrient naturally or upon selection or modification of the microbe.

Ineen ander aspect wordt de voedingsstof gekozen uit de groep bestaande uit sterolen of stanolen, met inbegrip van, maar niet beperkt tot: cholesterol, desmosterol, 24- methyleencholesterol, cholestanol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol en fucosterol.In another aspect, the nutrient is selected from the group consisting of sterols or stanols, including, but not limited to: cholesterol, desmosterol, 24-methylene cholesterol, cholestanol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol, and fucosterol.

Een ander aspect is dat de voedingsstof wordt gekozen uit de groep bestaande uit fenolzuren, epicatechinen, catechinen en flavonoïden.Another aspect is that the nutrient is selected from the group consisting of phenolic acids, epicatechins, catechins and flavonoids.

IN een ander aspect wordt de voedingsstof gekozen uit de groep bestaande uit carotenen en xanthofylen, waaronder b-caroteen, astaxanthine, zeaxanthine.IN another aspect, the nutrient is selected from the group consisting of carotenes and xanthophylls, including β-carotene, astaxanthin, zeaxanthin.

In een ander aspect is het micro-organisme verder gemodificeerd of geselecteerd om geen antinutriënten tot expressie te brengen of te produceren.In another aspect, the microorganism has been further modified or selected not to express or produce antinutrients.

Een ander aspect is dat de ongewervelde antinutriënt zymosterol of ergosterol is.Another aspect is that the invertebrate antinutrient is zymosterol or ergosterol.

In een ander aspect is de samenstelling een volledig dieet voor de doelsoort, een deel van een dieet voor de doelsoort of een voedingssupplement, of een topische toepassing.In another aspect, the composition is a complete target diet, part of a target diet or nutritional supplement, or topical application.

In een ander aspect is de samenstelling een samenstelling voor een dieet voor een celkweek of organoïdecultuur, een onderdeel van een dieet of een voedingssupplement voor een celkweek of organoïdecultuur.In another aspect, the composition is a composition for a cell culture or organoid culture diet, a component of a diet or a nutritional supplement for a cell culture or organoid culture.

IN een ander aspect is de samenstelling een dieet voor ongewervelde diersoorten, een onderdeel van een dieet voor doelsoorten of een voedingssupplement, of een topische toepassing.IN another aspect, the composition is an invertebrate diet, a component of a target species diet or nutritional supplement, or a topical application.

In een ander aspect wordt de samenstelling toegediend aan ongewervelde dieren van de familie van de Apidae, in het bijzonder honingbijen, hommels of angelloze bijen.In another aspect, the composition is administered to invertebrates of the Apidae family, particularly honeybees, bumblebees or stingless bees.

In een ander aspect wordt de samenstelling toegediend = in vaste vorm zoals een pasteitje of in vloeibare vorm zoals een oplossing of spray, korrel of poeder; = binnen of buiten de korf.In another aspect, the composition is administered = in solid form such as a patty or in liquid form such as a solution or spray, granule or powder; = inside or outside the hive.

In een ander aspect wordt het organisme gekozen uit de groep bestaande uit: =" een zee- of zoetwateralg, in het bijzonder een extract, een olie of een raffinage van U/va lactuca of Laminarna sp; =» een marien kiezelwier of een microalg, met name een extract, een olie of een raffinaat van kiezelwieren zoals Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira rotula, of Chaetoceros muelleri of microalgen zoals Dunaliella salina of Porphyridium cruentum, en =» een schimmel, in het bijzonder een extract, een olie of een raffinage van gistsoorten zoals Saccharomyces cerevisiae, Xanthophyllomyces dendrorhus of Yarrowia lipolytica, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Kluyveromyces, Neurospora, Penicillium, Pichia {Hansenula), Puccinia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sclerotium, Trichoderma, en Xanthophyllomyces (Phaffia); in sommige belichamingen behoort het organisme tot een soort die onder meer Aspergillus nidulans, A. niger, A. terreus, Botrytis cinerea, C. utilis, Cercospora — nicotianae, Fusarnumfujikuroi (Gibberella zeae) Kluyveromyces lactis, K. lactis, Neurospora crassa, Pichia pastor is, Puccinia distincta, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Sclerotium rolfsi, Trichoderma reesei, en Xanthophyllomyces dendrorhous {Phaffia rhodozymo), bij voorkeur Yarrowia lipolytica In een ander aspect is er een chemische, chromatografische of enzymatische modificatiestap om de ongewervelde voedingsstof te verkrijgen.In another aspect, the organism is selected from the group consisting of: == a marine or freshwater alga, especially an extract, an oil or a refining of U/va lactuca or Laminarna sp; =» a marine diatom or a microalgae , in particular an extract, an oil or a refinate of diatoms such as Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira rotula, or Chaetoceros muelleri or microalgae such as Dunaliella salina or Porphyridium cruentum, and =» a fungus, in particular an extract, an oil or a refining of yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Xanthophyllomyces dendrorhus or Yarrowia lipolytica, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Kluyveromyces, Neurospora, Penicillium, Pichia {Hansenula), Puccinia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sclerotium, Trichoderma, and Xanthophyllomyces (Phaffia); in some embodiments, the organism belongs to a species that includes Aspergillus nidulans, A. niger, A. terreus, Botrytis cinerea, C. utilis, Cercospor a — Nicotianae, Fusarnum fujikuroi (Gibberella zeae) Kluyveromyces lactis, K. lactis, Neurospora crassa, Pichia pastor is, Puccinia distincta, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Sclerotium rolfsi, Trichoderma reesei, and Xanthophyllomyces dendrorhous {Phaffia rhodozymo), preferably Yarrowia lipolytica In another aspect, there is a chemical, chromatographic or enzymatic modification step to obtain the invertebrate nutrient.

Een ander aspect is dat de samenstelling voor een lid van de familie der Apidae bestaat uit: = eiwitten in een hoeveelheid van 10 tot 50 gew%, bij voorkeur van 20 tot 40 gew%,Another aspect is that the composition for a member of the Apidae family consists of: = proteins in an amount of 10 to 50% by weight, preferably 20 to 40% by weight,

=» vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, = koolhydraten in een hoeveelheid van 30 tot 90 gew%, bij voorkeur van 50 tot 70 gew%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid componenten 100 % bedraagt en waarbij het % gerelateerd is aan het totale drooggewicht van de samenstelling. In een ander aspect omvat de samenstelling een voedingsstof voor insecten, geselecteerd uitde groep bestaande uit cholesterol, desmosterol, cholestanol, 24-methyleencholesterol, 24-methylenecholst-7-enol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol en fucosterol of mengsels daarvan in een bepaalde hoeveelheid: Van 0,01-5% van de voeding als afzonderlijke bestanddelen, waarbij geen bestanddeel ooit minder dan 0,01% van de voeding uitmaakt, en van 0,1-5% van de voeding in een mengsel.=» fatty acids in an amount of 1 w% to 20 w%, preferably from 2 w% to 12 w%, = carbohydrates in an amount of 30 to 90 wt%, preferably from 50 to 70 wt%, =» optional vitamins, and =" optionally minerals, where the total amount of components is 100% and where the % is related to the total dry weight of the composition. In another aspect, the composition includes an insect nutrient selected from the group consisting of cholesterol, desmosterol, cholestanol, 24-methylene cholesterol, 24-methylenecholest-7-enol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol, and fucosterol or mixtures thereof in a certain amount: From 0.01-5% of the food as individual ingredients, with no ingredient ever being less than 0.01% of the food, and from 0.1-5% of the food in a mixture.

Als mengsel, bij voorkeur van 0,1-1% en nog meer bij voorkeur van 0,3-0,5% voor honingbijen en 0,3-0,8% voor hommels, als percentage van het totale natte gewicht van de stuifmeelvervangende samenstelling en/of Waarbij de verhoudingen van de sterolen de hoeveelheden vertegenwoordigen die in de doelsoort, zoals bijen, worden aangetroffen (zie tabel 1).As a mixture, preferably from 0.1-1% and more preferably from 0.3-0.5% for honeybees and 0.3-0.8% for bumblebees, as a percentage of the total wet weight of the pollen substitute composition and/or Where the ratios of the sterols represent the amounts found in the target species, such as bees (see Table 1).

In een ander aspect bevat de samenstelling een voedingsstof voor insecten, geselecteerd uit de groep bestaande uit fenolzuren, proanthocyanidinen, epicatechinen, catechinen, en flavonoïden zoals quercetine, naringenine, p-cumaarzuur of mengsels daarvan in een bepaalde hoeveelheid: Van 0,01-5% van het rantsoen, bij voorkeur van 0,01-1% en nog meer bij voorkeur van 0,03-0,5% voor honingbijen en 0,03-0,8% voor hommels, als percentage van het totale gewicht van de stuifmeelsubstitutensamenstelling en waarbij de overheersende klasse fenolen bestaat uit proanthocyanidinen of flavonoïden en ten minste 30% van het totaal aan polyfenolen uitmaakt, maar bij voorkeur tussen 70-100% van het totaal aan polyfenolen.In another aspect, the composition contains an insect nutrient selected from the group consisting of phenolic acids, proanthocyanidins, epicatechins, catechins, and flavonoids such as quercetin, naringenin, p-coumaric acid or mixtures thereof in a specific amount: From 0.01-5 % of the ration, preferably from 0.01-1% and more preferably from 0.03-0.5% for honeybees and 0.03-0.8% for bumblebees, as a percentage of the total weight of the pollen substitute composition and wherein the predominant class of phenols is proanthocyanidins or flavonoids and constitutes at least 30% of the total polyphenols, but preferably between 70-100% of the total polyphenols.

In een ander aspect bevat de samenstelling een nutriënt voor een doelsoort, geselecteerd uit de groep carotenoïden of xanthofylen zoals b-caroteen, lycopeen, of astaxanthine of mengsels daarvan in een bepaalde hoeveelheid: van 0,01-5% van het rantsoen, bij voorkeur van 0,01-1% en nog meer bij voorkeur van 5 0,03-0,5% voor honingbijen en 0,03-0,8% voor hommels, als percentage van het totale gewicht van de stuifmeelvervangende samenstelling Een ander aspect is dat de samenstelling voor de doelsoort in wezen vrij is van pollen.In another aspect, the composition contains a target nutrient selected from the group of carotenoids or xanthophylls such as b-carotene, lycopene, or astaxanthin or mixtures thereof in a certain amount: from 0.01-5% of the ration, preferably of 0.01-1% and more preferably of 5 0.03-0.5% for honeybees and 0.03-0.8% for bumblebees, as a percentage of the total weight of the pollen replacement composition. Another aspect is that the composition for the target species is essentially free of pollen.

Een ander aspect van de uitvinding is het gebruik van een samenstelling die een microbieel organisme of delen, extracten, oliën, mengsels of verfijningen daarvan bevat, = waarbij het microbiële organisme wordt gekozen uit de groep bestaande uit schimmels, algen of bacteriën; en = waarbij het microbiële organisme is gemodificeerd of geselecteerd om een nutriënt van de doelsoort te produceren; voor het voeden van ongewervelde dieren.Another aspect of the invention is the use of a composition containing a microbial organism or parts, extracts, oils, mixtures or refinements thereof, = wherein the microbial organism is selected from the group consisting of fungi, algae or bacteria; and = wherein the microbial organism has been modified or selected to produce a target species nutrient; for feeding invertebrates.

In een ander aspect van het gebruik, bestaat de samenstelling uit: = eiwitten in een hoeveelheid van 10 tot 50 gew%, bij voorkeur van 20 tot 40 gew%, =» vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, = koolhydraten in een hoeveelheid van 30 tot 90 gew%, bij voorkeur van 50 tot 70 gew%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid componenten 100 % bedraagt en waarbij het % betrekking heeft op het totale natte gewicht van de samenstelling voor het voederen van ongewervelde dieren, in het bijzonder bijen of hommels.In another aspect of use, the composition consists of: = proteins in an amount of 10 to 50 wt%, preferably from 20 to 40 wt%, = » fatty acids in an amount of 1 wt% to 20 wt%, at preferably from 2 wt% to 12 wt%, = carbohydrates in an amount from 30 to 90 wt%, preferably from 50 to 70 wt%, =" optionally vitamins, and =" optionally minerals, the total amount of components being 100% and wherein the % refers to the total wet weight of the composition for feeding invertebrates, especially bees or bumblebees.

In een ander aspect van het gebruik van de onderhavige uitvinding is de samenstelling in wezen vrij van pollen.In another aspect of the use of the present invention, the composition is essentially free of pollen.

Een ander aspect van de uitvinding is een samenstelling bestaande uit:Another aspect of the invention is a composition consisting of:

= eiwitten in een hoeveelheid van 10 tot 50 gew%, bij voorkeur van 20 tot 40 gew%, = vetzuren in een hoeveelheid van 1 w% tot 20 w%, bij voorkeur van 2 w% tot 12 w%, = koolhydraten in een hoeveelheid van 30 tot 90 gew%, bij voorkeur van 50 tot 70 gew%, =" eventueel vitaminen, en =" eventueel mineralen, waarbij de totale hoeveelheid componenten 100 % bedraagt, waarbij het % gerelateerd is aan het totale drooggewicht van de samenstelling en waarbij de samenstelling in wezen vrij is van antinutriénten.= proteins in an amount of 10 to 50 wt.%, preferably from 20 to 40 wt.%, = fatty acids in an amount of 1 wt.% to 20 wt.%, preferably from 2 wt.% to 12 wt.%, = carbohydrates in a amount from 30 to 90% by weight, preferably from 50 to 70% by weight, =" optionally vitamins, and =" optionally minerals, the total amount of components being 100%, the % being related to the total dry weight of the composition and wherein the composition is essentially free of antinutrients.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN Figuur 1 toont de keuze van de cohorten bijen van voeding met of zonder isofucosterol. Figuur2 toont de overleving van cohorten bijen die zich voedden met diëten die specifieke concentraties isofucosterol bevatten. Figuur 3 toont de drempelwaarde voor de invloed van isofucosterol in bijenvoeding voor broedBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 shows the choice of the bee cohorts of diet with or without isofucosterol. Figure 2 shows the survival of cohorts of bees fed diets containing specific concentrations of isofucosterol. Figure 3 shows the threshold for the influence of isofucosterol in bee nutrition for brood

GEDETARLLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING Belichamingen van de huidige uitvindingen worden hiema beschreven. Sterolvoedingsstoffen en sterolantinutriënten voor ongewervelden Micro-organismen, planten en hogere dierlijke geslachten synthetiseren sterolverbindingen de novo. De ongewervelde protostome groep van dieren zijn echter sterol auxotrofen en moeten sterolen uit de voeding verkrijgen. Sommige herbivoren, zoals sprinkhanen, eten bijvoorbeeld planten of schimmels en zetten natuurlijk voorkomende fytosterolen zoals b-sitosterol om in cholesterol. Insectenroofdieren, aaseters en parasieten halen cholesterol direct uit het voedsel dat zij consumeren. Andere ongewervelde dieren, zoals honingbijen (Apis melifera), halen andere sterolen rechtstreeks uit stuifmeel en nemen sommige daarvan ongemodificeerd op in hun weefsels (Svoboda et al. 1981). De opname van sterolen en het profiel van sterolen in het weefsel van ongewervelde dieren hangt af van de samenstelling van het substraat, het vermogen van het dier om specifieke sterolen die in het voedsel aanwezig zijn te gebruiken en/of te modificeren, en andere omgevingsvariabelen zoals temperatuur (Knittlefelder et al 2020). Lipiden zijn zeer belangrijk in alle organismen en zijn de substraten voor de productie van signaalmoleculen.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Embodiments of the present inventions are described below. Sterol Nutrients and Sterol Antinutrients for Invertebrates Microorganisms, plants and higher animal genera synthesize sterol compounds de novo. However, the invertebrate protostome group of animals are sterol auxotrophs and must obtain sterols from the diet. For example, some herbivores, such as locusts, eat plants or fungi and convert naturally occurring phytosterols such as b-sitosterol into cholesterol. Insect predators, scavengers and parasites obtain cholesterol directly from the food they consume. Other invertebrates, such as honeybees (Apis melifera), obtain other sterols directly from pollen and incorporate some of them unmodified into their tissues (Svoboda et al. 1981). The uptake of sterols and the profile of sterols in the tissue of invertebrates depends on the composition of the substrate, the ability of the animal to use and/or modify specific sterols present in the food, and other environmental variables such as temperature (Knittlefelder et al 2020). Lipids are very important in all organisms and are the substrates for the production of signaling molecules.

Ze worden ook gebruikt als opslagmoleculen voor energie in dieren.They are also used as energy storage molecules in animals.

Specifieke vormen van lipiden, zoals sterolen, zijn essentiële elementen van celmembranen.Specific forms of lipids, such as sterols, are essential elements of cell membranes.

Sterolen zijn ook de substraten voor de aanmaak van hormonen, feromonen, afweerstoffen of substraten voor de synthese van vitaminen: Veel insecten nemen sterolen op uit hun voedsel en gebruiken deze ongewijzigd in de membranen van hun weefsels (b.v.Sterols are also the substrates for the production of hormones, pheromones, antibodies or substrates for the synthesis of vitamins: Many insects absorb sterols from their food and use them unchanged in the membranes of their tissues (e.g.

Drosophila), Honingbijen zijn een voorbeeld van een ongewerveld dier dat sterolen uit zijn voedselbron opneemt en deze ongewijzigd in weefsels vasthoudt.Drosophila), honey bees are an example of an invertebrate animal that absorbs sterols from its food source and retains them unchanged in tissues.

Het is ook een dier dat verschillende sterolverbindingen nodig heeft.It is also an animal that needs various sterol compounds.

Onderzoek dat in de jaren '80 door de USDA laboratoria in Beltsville werd uitgevoerd, bestudeerde de sterolsamenstelling van honingbijen en de post-ingestieve modificatie van geselecteerde sterolverbindingen bij de Hymenoptera.Research conducted in the 1980s by the USDA laboratories in Beltsville studied the sterol composition of honey bees and the post-ingestural modification of selected sterol compounds in the Hymenoptera.

Zij stelden vast dat ten minste zeven sterolen in bijenweefsels worden aangetroffen: cholesterol, campesterol, 24- methyleencholesterol, desmosterol, stigmasterol, b-sitosterol, en isofucosterol (zie tabel 1). Svoboda stelde door middel van radiolabelingstudies vast dat 24-methyleencholesterol, sitosterol en campesterol uit de voeding (stuifmeel) worden verkregen en niet in cholesterol worden omgezet (Svoboda et al. 1981). Uit deze gegevens concludeerden zij dat honingbijen geen functionele genen hebben voor de enzymen die nodig zijn om 24- methyleencholesterol, sitosterol of campesterol in cholesterol om te zetten.They found that at least seven sterols are found in bee tissues: cholesterol, campesterol, 24-methylene cholesterol, desmosterol, stigmasterol, b-sitosterol, and isofucosterol (see Table 1). Svoboda established through radiolabeling studies that 24-methylene cholesterol, sitosterol and campesterol are obtained from food (pollen) and are not converted to cholesterol (Svoboda et al. 1981). From these data, they concluded that honey bees lack functional genes for the enzymes needed to convert 24-methylene cholesterol, sitosterol or campesterol into cholesterol.

Daarom worden de fytosterolen, 24-methyleencholesterol, sitosterol, cholesterol en campesterol, beschouwd als essentiële voedingsstoffen van het bijendieet, die worden verkregen uit stuifmeel.Therefore, the phytosterols, 24-methylene cholesterol, sitosterol, cholesterol and campesterol, are considered essential nutrients of the bee diet, which are obtained from pollen.

De rol, de bron en de behoefte aan desmosterol, b-sitosterol, stigmasterol en isofucosterol in bijenweefsels zijn onbekend.The role, source and requirement of desmosterol, b-sitosterol, stigmasterol and isofucosterol in bee tissues are unknown.

Zij zijn in de weefsels van honingbijen aanwezig voor bijna 50% van de sterolen van de bij (gecombineerd, tabel 1). Net als bij andere insecten wordt cholesterol bij honingbijen omgezet in ecdysteroïden (bv. 20-hydroxyecdyson). Deze verbindingen zijn de belangrijkste hormonen die de veranderingen in de rui en de voortplanting bij insecten regelen (Svoboda en Feldlaufer, 1991). Campesterol is het substraat dat nodig is om het rui-hormoon makisteron A aan te maken (Feldlaufer et al. 1986). Het sterol 24-methyleencholesterol maakt 40-50% uit van de sterolen in honingbijenweefsels en is een belangrijk bestanddeel van de membranen van bijencellen. De afwezigheid ervan leidt tot atrofie van de hypofaryngeale klieren (Chakrabarti et al. 2020) en de bijen stoppen met de productie van broedsel (Herbert et al. 1980). Bij hommels vormen desmosterol, b-sitosterol, stigmasterol en isofucosterol sterolen 70-80% van de sterolen in het weefsel (tabel 1). Aangezien het natuurlijke voedsel van de bij tot 30 verschillende sterolen kan bevatten (Vilette et al. 2015; Zu et al. 2021), is het waarschijnlijk dat deze resterende sterolen in het bijenweefsel worden opgenomen in plaats van cholesterol op dezelfde manier als 24-methyleencholesterol dat doet. De gegevens in tabel 1 geven de hoeveelheden van deze zeven sterolen aan voor eusociale bijen.They are present in honey bee tissues for nearly 50% of bee sterols (combined, Table 1). As in other insects, cholesterol in honeybees is converted to ecdysteroids (eg 20-hydroxyecdysone). These compounds are the main hormones controlling changes in moulting and reproduction in insects (Svoboda and Feldlaufer, 1991). Campesterol is the substrate required to produce the moulting hormone makisterone A (Feldlaufer et al. 1986). The sterol 24-methylene cholesterol makes up 40-50% of the sterols in honeybee tissues and is an important component of bee cell membranes. Its absence leads to atrophy of the hypopharyngeal glands (Chakrabarti et al. 2020) and the bees stop producing brood (Herbert et al. 1980). In bumblebees, desmosterol, b-sitosterol, stigmasterol and isofucosterol sterols make up 70-80% of the sterols in the tissue (Table 1). Since the bee's natural food can contain up to 30 different sterols (Vilette et al. 2015; Zu et al. 2021), it is likely that these remaining sterols are absorbed into the bee tissue instead of cholesterol in the same way as 24-methylene cholesterol that does. The data in Table 1 indicate the amounts of these seven sterols for eusocial bees.

De in tabel 1 vermelde fytosterolen komen in lage tot sporenhoeveelheden voor in het gebruikte of voor de bijenvoederfabrikant beschikbare plantaardige meel. De enige meelbronnen die tegenwoordig door commerciële bijenvoederproducenten worden gebruikt, bevatten niet alle noodzakelijke sterolen, zoals blijkt uit de vergelijkende tabel 1. Bovendien levert het stuifmeel van één enkele plantensoort niet alle zeven sterolen die honingbijen nodig hebben (Vilette et al. 2015). In de natuur verzamelen foeragerende bijen stuifmeel van diverse plantenbronnen, die elk wel enkele, maar niet alle andere belangrijke sterolen kunnen bevatten. Het stuifmeel van geen enkele plantensoort bevat alle voor bijen relevante sterolen in de juiste hoeveelheid en verhoudingen (Vilette et al. 2015). Gemengd stuifmeel wordt gebruikt als aanvulling op commerciële bijenvoeders, maar het is duur en kan pesticiden en bijenpathogenen herbergen. Het gebruik van door bijen verzameld stuifmeel dat op de ene locatie is verkregen om bijen op een andere, door pollen beperkt gebied te voeden, is niet haalbaar voor de aantallen kolonies die tegenwoordig voor commerciële bestuiving worden gekweekt (d.w.z. honderden per bijenstandplaats).The phytosterols listed in Table 1 occur in low to trace amounts in the vegetable meal used or available to the bee feed manufacturer. The only flour sources currently used by commercial bee feed producers do not contain all the necessary sterols, as can be seen in the comparative table 1. In addition, the pollen of a single plant species does not provide all seven sterols required by honey bees (Vilette et al. 2015). In nature, foraging bees collect pollen from a variety of plant sources, each of which may contain some, but not all, of the other important sterols. The pollen of no single plant species contains all the sterols relevant to bees in the right amount and proportions (Vilette et al. 2015). Mixed pollen is used to supplement commercial bee feeds, but it is expensive and can harbor pesticides and bee pathogens. Using bee-gathered pollen obtained in one location to feed bees in another pollen-limited area is not feasible for the numbers of colonies currently grown for commercial pollination (i.e. hundreds per apiary).

Honingbije | CHO | DES | 24MC | CMP | STIG | B-SIT | ISF ZYM | ERG | Totaal Pd ee en em Door bien | 1.15 | 15.0 | 21.19 | 3.25 | 0.53 | 25.92 | 32.95 2418 verzameld pee | [a a [a [oa [a [ae [enHoneybee | CHO | DES | 24MC | CMP | STIG | B-SIT | ISF ZYM| ERG | Total Pd ee and em By bien | 1.15 | 15.0 | 21.19 | 3.25 | 0.53 | 25.92 | 32.95 2418 collected pee | [a a [a [oa [a [ae [en

Koninklijke 0.88 | 9.43 | 4022 | 6.70 | 0.71 | 21.73 | 20.34 729.9 dd nd en en De [ee [ee ee [a [a ee re bb [a fa ee ween 128 (268 [6206 509 (988 [2098 Wer 080 900 [TR ones == TE ae SES ee a [eee ee er ee ee a [ee eee [ea eere oee [oe [a [a [a [ae [ae [ae ee Bei JI B ee ee en CHO = cholesterol, DES = desmosterol, 24MC = 24-methyleencholesterol, CMP = campesterol, STIGM = stigmasterol, b-SIT = b-sitosterol, ISF = isofucosterol, ZYM = zymosterol, ERG = Toediening van sterolvoedingsstoffen via micro-organismen De commerciële productie van dieren vereist de ontwikkeling van kosteneffectieve maar nutritioneel optimale voeders.Royal 0.88 | 9.43 | 4022 | 6.70 | 0.71 | 21.73 | 20.34 729.9 dd nd en en De [ee [ee ee [a [a ee re bb [a fa ee ween 128 (268 [6206 509 (988 [2098 Wer 080 900 [TR ones == TE ae SES ee a [eee ee er ee ee a [ee eee [ea eere oee [oe [a [a [a [ae [ae [ae ee Bei JI B ee ee en CHO = cholesterol, DES = desmosterol, 24MC = 24-methylene cholesterol, CMP = campesterol, STIGM = stigmasterol, b-SIT = b-sitosterol, ISF = isofucosterol, ZYM = zymosterol, ERG = Delivery of sterol nutrients via microorganisms The commercial production of animals requires the development of cost-effective yet nutritionally optimal feeds.

Commerciële stuifmeelvervangers voor honingbijen worden geproduceerd op basis van zaadmeel en biergist en bevatten niet alle sterolen die bijen nodig hebben om broed te produceren, en de sterolen die het wel bevat, zijn niet in de optimale verhoudingen aanwezig (vergelijkende tabel 1. Herbert et al. 1980). Twee van de belangrijkste en overvloedigste sterolen die in de huidige bijenvoeding ontbreken (vergelijk tabel 1) zijn 24-methyleencholesterol en isofucosterol.Commercial honey bee pollen substitutes are produced from seed meal and brewer's yeast and do not contain all of the sterols that bees need to produce brood, and the sterols it does contain are not present in optimal proportions (Comparative Table 1. Herbert et al. 1980). Two of the most important and abundant sterols lacking in current bee diets (compare Table 1) are 24-methylene cholesterol and isofucosterol.

Andere steroïden zoals desmosterol en stigmasterol zijn in kleinere hoeveelheden aanwezig, maar kunnen even relevant zijn.Other steroids such as desmosterol and stigmasterol are present in smaller amounts but may be equally relevant.

Bovendien bevatten commerciële voedingsmiddelen ook aanzienlijke hoeveelheden ergosterol: een sterol dat niet in bijenweefsels voorkomt en schadelijk is, omdat we hebben ontdekt dat het een stof is die bijen vermijden op te eten als ze een keuze hebben.In addition, commercial foods also contain significant amounts of ergosterol: a sterol that is not found in bee tissues and is harmful, as we have found it to be a substance that bees avoid eating if they have a choice.

Schade wordt veroorzaakt door het vermijden van het eten van een voedingsmiddel en door het voeden van ziekteverwekkers of het veroorzaken van directe schade via metabolische routes.Damage is caused by avoiding eating a food and feeding pathogens or causing direct damage through metabolic pathways.

Een stam van een panel van stammen die zeldzame sterolen levert aan ongewerveld voedsel, heeft bredere toepassingen als bron van sterolen voor ongewervelde dieren: = cholesterol voor geleedpotigen = 24-methyleencholesterol voor ongewervelde zeedieren, zoals weekdieren die in de aquacultuur worden gekweekt (kokkels, oesters, inktvis) = Andere insecten - hommels, rode metselbilen, angelloze bijen, sprinkhanen, krekels, meelwormen, en zwarte soldaatvliegen Het principe voor het maken van dergelijke giststammen is welbekend bij diegenen die ervaring hebben met deze kunst: =» Een ergosteroldeficiënte stam van S. cerevisiae kan bijvoorbeeld worden gemaakt door de genen erg4 en erg 5 in S. cerevisiae te deleten (bv.A strain from a panel of strains that provides rare sterols to invertebrate food has wider applications as a source of sterols for invertebrates: = cholesterol for arthropods = 24-methylene cholesterol for marine invertebrates, such as molluscs grown in aquaculture (clams, oysters , squid) = Other insects - bumblebees, mason's buttocks, stingless bees, locusts, crickets, mealworms, and black soldier flies The principle for making such yeast strains is well known to those experienced in this art: =» An ergosterol-deficient strain of S cerevisiae can be made, for example, by deleting the erg4 and erg 5 genes in S. cerevisiae (e.g.

BG4742 erg4 erg5 Japans papier). Hetzelfde kan worden gedaan in Yarrowia lipolytica door de orthologen van erg4 en erg 5 te deleten.BG4742 erg4 erg5 Japanese paper). The same can be done in Yarrowia lipolytica by deleting the erg4 and erg 5 orthologs.

Een dergelijke stam met een tekort aan ergosterol kan tot expressie worden gebracht van 24-methyleencholesterol als voornaamste sterol door expressie van het St DWF5 cDNA of een enzym met dezelfde acitviteit in deze stam (stam T21). Expressie van het SSR2-gen in deze 24-methyleencholesterol accumulerende stam resulteerde in de productie van cholesterol. = Een giststam uit S. cerevisiae die desmosterol als voomaamste sterol produceert, kan worden gemaakt door het gistgen erg6 (of zijn ortholoog in Y. lipolytica of in andere gistsoorten) te deleten en St DWF5 of een enzym met dezelfde activiteit tot expressie te brengen (stam T31). Expressie van het SSR2-gen in deze desmosterol accumulerende stam resulteerde in de productie van cholesterol. = Een ergosteroldeficiënte stam van S. cerevisiae kan bijvoorbeeld worden gemaakt door de genen erg4 en erg 5 in S. cerevisiae te deleten (bv.Such an ergosterol deficient strain can be expressed of 24-methylene cholesterol as the main sterol by expression of the St DWF5 cDNA or an enzyme having the same activity in this strain (strain T21). Expression of the SSR2 gene in this 24-methylene cholesterol accumulating strain resulted in the production of cholesterol. = A yeast strain from S. cerevisiae that produces desmosterol as the main sterol can be made by deleting the yeast gene erg6 (or its ortholog in Y. lipolytica or in other yeast species) and expressing St DWF5 or an enzyme with the same activity ( strain T31). Expression of the SSR2 gene in this desmosterol accumulating strain resulted in the production of cholesterol. = For example, an ergosterol-deficient strain of S. cerevisiae can be created by deleting the erg4 and erg 5 genes in S. cerevisiae (eg.

BG4742 erg4 erg5, Sawai et al. 2014). Hetzelfde kan worden gedaan in Yarrowia lipolytica door de orthologen van erg4 en erg 5 te deleten.BG4742 erg4 erg5, Sawai et al. 2014). The same can be done in Yarrowia lipolytica by deleting the erg4 and erg 5 orthologs.

Een dergelijke ergosteroldeficiënte stam kan isofucosterol als primair sterol tot expressie brengen door het SMT2 cDNA of een enzym met dezelfde activiteit in deze stam tot expressie te brengen (stam T55, zie fig.). = Een ergosteroldeficiënte stam van S. cerevisiae kan bijvoorbeeld worden gemaakt door de genen erg4 en erg 5 of erg5 alleen in S. cerevisiae te deleten (bv.Such an ergosterol-deficient strain can express isofucosterol as primary sterol by expressing the SMT2 cDNA or an enzyme having the same activity in this strain (strain T55, see Fig.). = For example, an ergosterol-deficient strain of S. cerevisiae can be created by deleting the erg4 and erg 5 or erg5 genes only in S. cerevisiae (e.g.

BG4742 erg4 erg5, Sawai et al. 2014). Hetzelfde kan worden gedaan in Yarrowia lipolytica door de orthologen van erg4 en erg 5 te deleten). Een dergelijke ergosteroldeficiënte stam kan tot expressie worden gebracht van campesterol als het primaire (290%) sterol door expressie van het DWF1 cDNA of het DHCR7-gen van een enzym met dezelfde activiteit in deze stam (stam T55). Een gist die cholesterol als voomaamste sterol (290%) produceert, kan ook worden gemaakt door de erg 5- en erg 6-genen van de gist te deleten en de DHCR24- en DCHR7- enzymen tot expressie te brengen (zie stam RH6829). Tabel 2. Gist gemanipuleerd om specifieke sterolen tot expressie te brengen die in bijenweefsels worden aangetroffen Sterol | Gist sp.BG4742 erg4 erg5, Sawai et al. 2014). The same can be done in Yarrowia lipolytica by deleting the orthologs of erg4 and erg 5). Such an ergosterol-deficient strain can be expressed from campesterol as the primary (290%) sterol by expression of the DWF1 cDNA or the DHCR7 gene of an enzyme having the same activity in this strain (strain T55). A yeast that produces cholesterol as the main sterol (290%) can also be made by deleting the yeast erg 5 and erg 6 genes and expressing the DHCR24 and DCHR7 enzymes (see strain RH6829). Table 2. Yeast engineered to express specific sterols found in bee tissues Sterol | Yeast sp.

AtDWF5, Aare, Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 AtDWF1, Aare2 AtSMT2 AtDWF7 Xu et al. 2020 ACS Synth.AtDWF5, Aare, Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 AtDWF1, Aare2 AtSMT2 AtDWF7 Xu et al. 2020 ACS Synth.

Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 CMP Y. lipolytica XIDHCR7 Aerg5 Du etal 2016 PLoS One 11(1):e0146773 CMP Y. lipolytica XIDHCR7 x2 | Aerg5 Qian et al. 2020 Toegepaste microbiologie en biotechnologie 104:7165-7175 CMP Y. lipolytica DHCR7 ACL en Zhang et al.Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 CMP Y. lipolytica XIDHCR7 Aerg5 Du etal 2016 PLoS One 11(1):e0146773 CMP Y. lipolytica XIDHCR7 x2 | Aerg5 Qian et al. 2020 Applied Microbiology and Biotechnology 104:7165-7175 CMP Y. lipolytica DHCR7 ACL and Zhang et al.

Biotech Letters POX2 39:1033-1039 CHO S. cerevesiae | DrDHCR7, Aerg5, Souza et al. 2011 Metab Eng DrDHCR24 | Aerg6 13(5):555-569; CHO P. pastoris DrDHCR7, Aerg5, Hirz et al. 2013 Appl Microbiol DrDHCR24 | Aerg6 Biot. 97(21):9465-9478 CHO S. cerevesiae | StDWF5, Aerg6 Sawai et al. 2014 Plant Cell26 StSSR2 9):3763-3774 CHO S. cerevesiae | StDWFS5, Aerg4, Sawai et al. 2014 Plant Cell26 StSSR2 Aerg5 (9):3763-3774 CHO Y. lipolytica SSR2, Aerg5 Xu et al. 2020 ACS Synth.Biotech Letters POX2 39:1033-1039 CHO S. cerevesiae | DrDHCR7, Aerg5, Souza et al. 2011 Metab Eng DrDHCR24 | Aerg6 13(5):555-569; CHO P. pastoris DrDHCR7, Aerg5, Hirz et al. 2013 Appl Microbiol DrDHCR24 | Aerg6 Biot. 97(21):9465-9478 CHO S. cerevesiae | StDWF5, Aerg6 Sawai et al. 2014 Plant Cell26 StSSR2 9):3763-3774 CHO S. cerevesiae | StDWFS5, Aerg4, Sawai et al. 2014 Plant Cell26 StSSR2 Aerg5 (9):3763-3774 CHO Y. lipolytica SSR2, Aerg5 Xu et al. 2020 ACS Synth.

StDWF5 Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 Y. lipolytica | StDWF5 Xu et al. 2020 ACS Synth.StDWF5 Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 Y. lipolytica | StDWF5 Xu et al. 2020 ACS Synth.

Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 a ee Ee 6(6): e21316. (9):3763-3774 AtDWF7 Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 pastoris = Piscia pastoris Er bestaan verschilende methoden om het expressieniveau van metabolieten in giststammen op te voeren tot aanzienlijk hogere niveaus, die welbekend zijn bij mensen die deskundig zijn op dit gebied.Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 a ee Ee 6(6): e21316. (9):3763-3774 AtDWF7 Biol. 2020, 9, 11, 3157-3170 pastoris = Piscia pastoris There are several methods to increase the expression level of metabolites in yeast strains to significantly higher levels, which are well known to those skilled in the art.

Voorbeelden zijn: = Met Y. /polytica als gistsoort versus S. cerevisiae, =» Toevoeging van kopieën of overexpressie van specifieke enzymen in de pathway, zoals het DWF7-gen | dwf5/dwf1-expressiestam, = Vervanging van regulerende elementen in genen in de pathway om bronnen of knelpunten in de pathway weg te nemen, = Vervanging van genen de pathway door orthologe genen van andere organismen, =» Toevoeging van exemplaren of overexpressie van een algemene inducerende factor van de steroïdroute, = Selecteren van de stam onder hitte of selecteren van stammen die beter bestand zijn tegen stress door ionische vloeistoffen, = Verandering van het substraat waarop de gist wordt gekweekt, =» Ronden van mutatie en selectie om hoog producerende stammen te identificeren, ‚ Wijziging van de expressieniveaus in de sterol-ester- en sterol-acetaatroute, leidend tot opheffing van de negatieve terugkoppelingsremming op cholesterolproducerende enzymen.Examples are: = With Y. /polytica as the yeast species versus S. cerevisiae, =» Addition of copies or overexpression of specific enzymes in the pathway, such as the DWF7 gene | dwf5/dwf1 expression strain, = Replacement of regulatory elements in genes in the pathway to remove resources or bottlenecks in the pathway, = Replacement of genes in the pathway with orthologous genes from other organisms, =» Addition of copies or overexpression of a common inducing factor of the steroid pathway, = Selecting the strain under heat or selecting strains more resistant to ionic fluid stress, = Changing the substrate on which the yeast is grown, =» Rounds of mutation and selection to produce high producing strains identify, ‚ Alteration of the expression levels in the sterol ester and sterol acetate pathway leading to the abolition of the negative feedback inhibition on cholesterol producing enzymes.

Ongewervelde antinutriënten Daarom beschikt een fabrikant van bijenvoeding over zeer weinig in de handel verkrijgbare en voor de kosten aanvaardbare bronnen van de specifieke fytosterolen die voor bijen van belang zijn en die in een formule kunnen worden verwerkt in de juiste samenstelling, hoeveelheid en verhoudingen die voor bijen van belang zijn.Invertebrate antinutrients Therefore, a bee food manufacturer has very few commercially available and cost-acceptable sources of the specific phytosterols of interest to bees that can be formulated in the correct composition, amount and proportions that are beneficial to bees. of interest.

De huidige voeders zijn daarom per definitie uit voedingsoogpunt onvolledig, omdat essentiële sterolen ontbreken.The current feeds are therefore by definition nutritionally incomplete, because essential sterols are missing.

Gisten zoals Saccharomyces cerevisiae en Yarrowia lypolitica zijn enkele van de belangrijkste micro-organismen die worden gebruikt voor de commerciële productie van vetten en andere vetafgeleide verbindingen zoals sterolen en steroïden.Yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Yarrowia lypolitica are some of the main microorganisms used for the commercial production of fats and other fat-derived compounds such as sterols and steroids.

Veel zeealgen en diatomeeën die een uiteenlopende reeks sterolen bevatten, worden ook gemanipuleerd om lipideverbindingen te produceren (Rampan et al. 2010, Gallo et al. 2020). Bovendien zijn verschilende plantensoorten gemanipuleerd om specifieke sterolen of lipideverbindingen te produceren of tot expressie te brengen (Sawai et al. 2014). Ongewervelde dieren zijn niet op grote schaal gemanipuleerd voor het gehalte aan lipiden of sterolen, maar hebben het potentieel om dat in de toekomst te worden als informatie over hun genomen en metabolische routes wordt onthuld.Many marine algae and diatoms containing a diverse array of sterols are also engineered to produce lipid compounds (Rampan et al. 2010, Gallo et al. 2020). In addition, several plant species have been engineered to produce or express specific sterols or lipid compounds (Sawai et al. 2014). Invertebrates have not been widely manipulated for lipid or sterol content, but have the potential to become so in the future as information about their genomes and metabolic pathways is revealed.

De meeste van deze bronnen bevatten zeer lage gehalten aan sterolen en zouden als geheel niet in bijenvoedsel kunnen worden verwerkt zonder de sterolen te concentreren of te extraheren, wat kostenverhogend is.Most of these sources contain very low levels of sterols and as a whole could not be processed into bee food without concentrating or extracting the sterols, which increases costs.

Sommige schimmels, waaronder S. cerevisiae, Torula kunnen in bijenvoeder worden verwerkt als bron van eiwitten, vitaminen, aminozuren.Some fungi, including S. cerevisiae, Torula can be incorporated into bee feed as a source of protein, vitamins, amino acids.

De gist die tegenwoordig in de levensmiddelen- en diervoederindustrie wordt gebruikt, heeft producten die volledig op gist zijn gebaseerd.The yeast used in the food and feed industry today has products that are entirely based on yeast.

Deze specifieke gisten bevatten echter antinutriënten voor bijen.However, these specific yeasts contain antinutrients for bees.

Bovendien moeten in een commercieel bijenvoeder alle vereiste voedingselementen (eiwitten, vetten, micronutriënten, mineralen) worden verwerkt uit commercieel aanvaardbare en beschikbare bronnen.In addition, a commercial bee feed must contain all required nutritional elements (proteins, fats, micronutrients, minerals) from commercially acceptable and available sources.

De beschikbare voederbronnen bevatten slechts sporen van sommige van de fytosterolen die bijen nodig hebben (tabel 1) en als deze sterolen aanwezig zijn, zijn ze niet aanwezig in de voor bijen geschikte verhoudingen.The available feed sources contain only trace amounts of some of the phytosterols required by bees (Table 1) and when these sterols are present, they are not present in the proportions appropriate for bees.

De momenteel beschikbare voederbronnen kunnen dus niet worden gebruikt om de gewenste gehalten en samenstelling te bereiken zonder de concentratie van andere voedingsstoffen in gevaar te brengen.Thus, currently available feed sources cannot be used to achieve the desired levels and composition without compromising the concentration of other nutrients.

Verder is er geen commercieel beschikbare rendabele bron van isofucosterol, 24- methyleencholesterol, cholestanol, desmosterol of andere sterolen of stanolen die ongewervelde dieren nodig hebben.Furthermore, there is no commercially available cost-effective source of isofucosterol, 24-methylene cholesterol, cholestanol, desmosterol, or other sterols or stanols required by invertebrates.

De enige in de handel verkrijgbare bron van cholesterol als toevoegingsmiddel voor diervoeding die niet is verontreinigd met antinutriënten, is afkomstig van een extract van dierlijke oorsprong (schapenwol of pluimveeproducten). Een oplossing voor bovenstaand probleem is het gebruik van een micro-organisme of een alg of een ander ongewerveld dier of een combinatie van dergelijke organismen die van nature of na metabole engineering, mutatie of selectie, niet het antinutriënt ergosterol of andere antinutriënten bevatten. Een andere mogelijkheid is om in het ongewervelde diervoeder een gist of een ander micro-organisme op te nemen dat in plaats van ergosterol de gewenste sterolen produceert via metabolic engineering, mutatie of selectie. Ten derde zou men ook een extract van een dergelijk organisme kunnen gebruiken dat de sterolen bevat. Niet-pollen samenstelling De samenstelling van de uitvinding is bij voorkeur een niet-pollen samenstelling.The only commercially available source of cholesterol as an animal feed additive that is not contaminated with antinutrients comes from an extract of animal origin (sheep's wool or poultry products). A solution to the above problem is the use of a micro-organism or an alga or other invertebrate animal or a combination of such organisms that naturally or after metabolic engineering, mutation or selection do not contain the antinutrient ergosterol or other antinutrients. Another possibility is to include a yeast or another micro-organism in the invertebrate feed that produces the desired sterols instead of ergosterol via metabolic engineering, mutation or selection. Thirdly, one could also use an extract of such an organism containing the sterols. Non-pollen composition The composition of the invention is preferably a non-pollen composition.

De eigenschap "niet-stuifmeelhoudend" betekent in wezen vrij van stuifmeel. Er kunnen echter kleine hoeveelheden stuifmeel aanwezig zijn in de samenstellingen van de huidige uitvindingen. In één belichaming is de hoeveelheid stuifmeel 15 w% of minder, bij voorkeur 10 w% of minder, nog liever 5 w% of minder en nog liever 1 w% of minder en nog liever 0,1 w% of minder in verhouding tot het drooggewicht van de samenstelling.The property "non-pollen" means essentially free of pollen. However, small amounts of pollen may be present in the compositions of the present inventions. In one embodiment, the amount of pollen is 15 wt% or less, preferably 10 wt% or less, more preferably 5 wt% or less, more preferably 1 wt% or less, more preferably 0.1 wt% or less relative to the dry weight of the composition.

In een andere belichaming is de samenstelling een stuifmeelvervangende samenstelling die een stuifmeeldieet vervangt.In another embodiment, the composition is a pollen replacement composition that replaces a pollen diet.

Ongewervelden Ongewervelde soorten zijn de meest diverse dieren op aarde. Zij zijn belangrijke componenten van natuurlijke ecologische systemen en spelen een sleutelrol bij de productie van menselijk voedsel. Een steeds belangrijker onderdeel van de voedselproductie betreft de teelt van ongewervelde dieren zoals insecten, schaaldieren en weekdieren als voedsel voor mens en dier en voor hun rol in ecosysteemdiensten zoals bestuiving. Insecten worden ook gekweekt als natuurlijke vijanden van plaaginsecten en uitgezet als onderdeel van strategieën voor geïntegreerde plaagbestrijding.Invertebrates Invertebrates are the most diverse animals on earth. They are important components of natural ecological systems and play a key role in the production of human food. An increasingly important part of food production involves the cultivation of invertebrates such as insects, crustaceans and molluscs as food for humans and animals and for their role in ecosystem services such as pollination. Insects are also bred as natural predators of insect pests and introduced as part of integrated pest management strategies.

Ongewervelde dieren omvatten = geleedpotigen, zoals insecten, spinachtigen, schaaldieren, en myriapoden, = weekdieren, zoals chitons, slakken, tweekleppigen, inktvissen en octopussen, = eencelligen, zoals regenwormen en bloedzuigers; en = cnidarianen, zoals hydra's, kwallen, zeeanemonen en koralen.Invertebrates include = arthropods, such as insects, arachnids, crustaceans, and myriapods, = molluscs, such as chitons, snails, bivalves, squids, and octopuses, = unicellulars, such as earthworms and leeches; and = cnidarians, such as hydras, jellyfish, sea anemones and corals.

Ongewervelde dieren die bij voorkeur worden gekweekt of gekweekt voor menselijke of dierlijke voeding, zoals bijen, hommels, regenwormen, meelwormen, gamalen, rivierkreeften, krekels en vliegenlarven, hebben de voorkeur. Ongewervelde dieren van de familie van de Apidae, die worden gebruikt als bestuivers voor land- en tuinbouwgewassen, hebben de voorkeur, zoals = bijen van het geslacht Apis, in het bijzonder Apis mellifera of = hommels van het geslacht Bombus en in het bijzonder Bombus terrestris Dosering en concentratie De ongewervelde voedingsstof, met name het cholesterol, desmosterol, 24- methyleencholesterol, 24-methylenecholst-7-enol, cholestanol, 7-dehydrocholesterol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol of fucosterol, wordt toegediend in een hoeveelheid die vanuit voedingsoogpunt doeltreffend is voor ongewervelde dieren.Invertebrates that are preferably farmed or reared for human or animal food, such as bees, bumblebees, earthworms, mealworms, prawns, crayfish, crickets and fly larvae are preferred. Invertebrates of the Apidae family, which are used as pollinators for agricultural and horticultural crops, are preferred, such as = bees of the genus Apis, in particular Apis mellifera or = bumblebees of the genus Bombus and in particular Bombus terrestris Dosage and concentration The invertebrate nutrient, in particular the cholesterol, desmosterol, 24-methylene cholesterol, 24-methylenecholest-7-enol, cholestanol, 7-dehydrocholesterol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol or fucosterol, is administered in an amount that nutritionally effective for invertebrates.

In één belichaming betekent voedingskundig doeltreffend een concentratie van ongewervelde voedingsstoffen, in het bijzonder cholesterol, desmosterol, 24- methyleencholesterol, 24-methylenecholst-7-enol, cholestanol, 7-dehydrocholesterol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol of fucosterol of mengsels daarvan in een hoeveelheid van 001 w% tot 5 w%, bij voorkeur van 0,02 w% tot 2 w%, en nog meer bij voorkeur van 0,03 w% tot 0,6 w% van het drooggewicht van de stuifmeelvervangende samenstelling.In one embodiment, nutritionally effective means a concentration of invertebrate nutrients, specifically cholesterol, desmosterol, 24-methylene cholesterol, 24-methylenecholest-7-enol, cholestanol, 7-dehydrocholesterol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol or fucosterol or mixtures thereof in an amount of 0.01 wt.% to 5 wt.%, preferably from 0.02 wt.% to 2 wt.%, and more preferably from 0.03 wt.% to 0.6 wt.% of the dry weight of the pollen replacement composition .

In één belichaming bedraagt de dosis isofucosterol die een imker voor een kolonie honingbijen zou gebruiken, ongeveer 0,1-0,5% van het totale gewicht van het rantsoen. Als elke voedsterbij 120 mg weegt en 10-15 mg voedsel per dag consumeert, en als een kolonie bijen voor ongeveer 50% uit voedsterbijen of jongvolwassen werkbijen bestaat, zou dit neerkomen op 5-25 mg isofucosterol per kolonie per dag.In one embodiment, the dose of isofucosterol that a beekeeper would use for a colony of honeybees is approximately 0.1-0.5% of the total weight of the ration. If each nurse bee weighs 120 mg and consumes 10-15 mg of food per day, and if a colony of bees consists of approximately 50% nurse bees or young adult worker bees, this would equate to 5-25 mg isofucosterol per colony per day.

Inéén geval, voor een hommelkolonie van 300 bijen, moet het dieet isofucosterol bevatten in hoeveelheden van 0,3-0,8% van het totale gewicht van het dieet. Als elke hommel ongeveer 200 mg weegt en 20 mg voedsel per dag consumeert, en als alle bijen het voedsel consumeren, dan zou de effectieve dosis isofucosterol 2-5 mg per dag per kolonie zijn.In one case, for a bumblebee colony of 300 bees, the diet should contain isofucosterol in amounts of 0.3-0.8% of the total weight of the diet. If each bumblebee weighs about 200 mg and consumes 20 mg of food per day, and if all bees consume the food, then the effective dose of isofucosterol would be 2-5 mg per day per colony.

VOORBEELDEN Vergelijkend voorbeeld 1: Sterolvoedingsstoffen- en antinutriëntengehalten in commercieel bijenvoer In de handel verkrijgbare bijenvoedersamenstellingen zonder pollen bevatten geen essentiële nutriënten en wel antinutriënten, zoals blijkt uit de vergelijkende tabel 1 hieronder.EXAMPLES Comparative Example 1: Sterol Nutrient and Antinutrient Content in Commercial Bee Feed Commercially available pollen-free bee feed compositions do not contain essential nutrients and do contain antinutrients, as shown in Comparative Table 1 below.

(9/9) Door bijen | 1.0 0.2 49.0 4.6 13.1 31.1 1587.9 verzameld gemengd stuifmeel ws = Koninklijke 19 | 2.0 62.8 5.5 17.5 837.9 gelei e= [no =| [|] [en m ee m2 1e 105 [ar] 8 je = [pels er 108 [86] | e= | =| [|] oe [res ae] | Ki ee ga ss [90 0] TE | PP || (PPS vos CAO MR OUT | PE | 9 |M | 09 PPS pe [me 98 [er 15e [es] 05 jean ps [ml | | 88 17 | 82] 0 | er | 08 90] 01 | Pe | 55 | 37 09 | a ess | | ee | CHO = cholesterol, DES = desmosterol, 24M = 24-methyleencholesterol, CAMPE = campesterol, STIGM = stigmasterol, b-SITO = b-sitosterol, ISOFUCO = isofucosterol Voorbeeld 1 - Voorkeur essay: Bijen geven de voorkeur aan specifieke concentraties isofucosterol in voedsel.(9/9) By bees | 1.0 0.2 49.0 4.6 13.1 31.1 1587.9 collected mixed pollen ws = Koninklijke 19 | 2.0 62.8 5.5 17.5 837.9 jelly e= [no =| [|] [en m ee m2 1st 105 [ar] 8 je = [pels er 108 [86] | e= | =| [|] oe [res ae] | Ki ee ga ss [90 0] TE | PP || (PPS fox CAO MR OUT | PE | 9 |M | 09 PPS pe [me 98 [er 15e [es] 05 jean ps [ml | | 88 17 | 82] 0 | er | 08 90] 01 | Pe | 55 | 37 09 | aess | | ee | CHO = cholesterol, DES = desmosterol, 24M = 24-methylene cholesterol, CAMPE = campesterol, STIGM = stigmasterol, b-SITO = b-sitosterol, ISOFUCO = isofucosterol Example 1 - Essay Preference: Giving Bees prefer specific concentrations of isofucosterol in food.

Pas uitgekomen volwassen werkhommels (Apis mellifera) en volwassen werkhommels (Bombus terrestris) werden getest in een tweekeuzetest waarbij de bijen toegang hadden tot twee diëten en ad libitum toegang hadden tot water.Newly hatched adult worker bumblebees (Apis mellifera) and adult worker bumblebees (Bombus terrestris) were tested in a two-choice test where the bees had access to two diets and had access to water ad libitum.

Het ene dieet bevatte het isofucosterol en het andere bevatte geen sterol.One diet contained the isofucosterol and the other contained no sterol.

Pas uitgekomen bijen werden uit het broedraam gehaald en cohorten van 30 bijen per replicaat werden ondergebracht in plastic opfokkooien.Newly hatched bees were removed from the brooder and cohorts of 30 bees per replicate were housed in plastic rearing cages.

In alle experimenten werden 10 cohorten van -30 bijen elk gebruikt voor elke behandelingsgroep.In all experiments, 10 cohorts of -30 bees each were used for each treatment group.

In alle diëten werd het koolhydraatgehalte op 60% gehouden met poedersuiker en het vetgehalte op 8% met een emulsie.In all diets the carbohydrate content was kept at 60% with icing sugar and the fat content at 8% with an emulsion.

Maltodextrine werd gebruikt als variabele vulstof.Maltodextrin was used as a variable filler.

De consumptie van elk dieet werd om de 24 uur gemeten gedurende 5 dagen.Consumption of each diet was measured every 24 hours for 5 days.

De voorkeursindex werd berekend als (hoeveelheid geconsumeerd van de behandeling - hoeveelheid geconsumeerd van de controle)/(totale hoeveelheid geconsumeerd voedsel). In voorbeeld 1 werd aan cohorten bijen de keuze gegeven tussen een dieet met of zonder isofucosterol.The index of preference was calculated as (amount of treatment consumed - amount of control consumed)/(total amount of food consumed). In Example 1, cohorts of bees were given the choice between a diet with or without isofucosterol.

De bijen gaven de voorkeur aan voedsel dat ten minste 0,05 % isofucosterol in het voedsel bevatte, zoals blijkt uit figuur 1. Voorbeeld 2 - Overleving: bijen leven langer van voedsel dat isofucosterol bevat Pas uitgekomen volwassen werkbijen werden gevoed met een dieetbehandeling en ad libitum toegang tot water.The bees preferred food containing at least 0.05% isofucosterol in the food as shown in Figure 1. Example 2 - Survival: Bees live longer on food containing isofucosterol Newly hatched adult worker bees were fed a dietary treatment and ad libitum access to water.

Het behandelde dieet bevatte het isofucosterol.The treated diet contained the isofucosterol.

In alle voeders werd het koolhydraatgehalte op 60% gehouden met poedersuiker en het vetgehalte op 8% met een emulsie.In all feeds the carbohydrate content was kept at 60% with icing sugar and the fat content at 8% with an emulsion.

De consumptie van elk dieet werd in de loop van het experiment elke dag gemeten.Consumption of each diet was measured every day during the course of the experiment.

Het aantal levende bijen in de kast werd gedurende 14 dagen elke dag geteld.The number of live bees in the hive was counted every day for 14 days.

Voorbeeld 2 toont de overleving van cohorten bijen die zich voeden met diëten die specifieke concentraties isofucosterol bevatten (0%, 0,5% en 1% gewicht van het dieet), zoals weergegeven in figuur 2. Voorbeeld 3 - Broedproductie: Honingbijen produceren meer broed met isofucosterol en produceren langer broed.Example 2 shows the survival of cohorts of bees fed on diets containing specific concentrations of isofucosterol (0%, 0.5% and 1% weight of the diet), as shown in Figure 2. Example 3 - Brood Production: Honey bees produce more brood with isofucosterol and produce longer brood.

Honingbijen: Volledig functionele geïsoleerde piepschuim APIDEA-nestkasten, bestaande uit 5 miniframes bevolkt met volwassen werksters en 1 gedekte legkoningin, werden bevolkt met 300-400 mI jonge volwassen werksters (- N<1.000 bijen van gemengde leeftijden). De kolonie bevond zich in een gesloten serre met ventilatie, zodat de honingbijen niet op nectar of stuifmeel konden foerageren.Honeybees: Fully functional insulated Styrofoam APIDEA nest boxes, consisting of 5 miniframes populated with adult workers and 1 mated laying queen, were populated with 300-400 ml young adult workers (-N<1,000 bees of mixed ages). The colony was in a closed greenhouse with ventilation, so that the honey bees could not forage for nectar or pollen.

Elke behandeling werd getest met 3-6 kolonies; elke kolonie werd gevoederd met een pasteitje van 60-100 g (vast voer) op de bovenste voederbak, voorzien van een gaasbodem.Each treatment was tested with 3-6 colonies; each colony was fed with a 60-100 g patty (solid food) on the top feeder, fitted with a mesh bottom.

Het voer werd op de eerste dag gegeven en nogmaals op dag 6; de geconsumeerde hoeveelheid werd gemeten op dag 6 en dag 15. Als op dag 6 geen larven of eieren zijn waargenomen, is het experiment beëindigd.The food was given on the first day and again on day 6; the amount consumed was measured on day 6 and day 15. If no larvae or eggs are observed on day 6, the experiment has ended.

Het aantal afgedekte broedcellen werd op dag 15 geteld.The number of capped brood cells was counted on day 15.

Het aantal bijenvolken werd bij elke inspectie geschat.The number of bee colonies was estimated at each inspection.

Suikerstroop (34%) en water werden verstrekt in voederbakken in de tent om te voorkomen dat de bijen verhongeren aan koolhydraten en om de foerageeractiviteit te stimuleren.Sugar syrup (34%) and water were provided in feeders in the tent to prevent the bees from starving on carbohydrates and to encourage foraging activity.

In voorbeeld 3 werden de bijen gevoederd met een dieet dat 10-18% eiwit, 6% vet, 1% vitaminen/mineralen en > 75% koolhydraten bevatte.In Example 3, the bees were fed a diet containing 10-18% protein, 6% fat, 1% vitamins/minerals and >75% carbohydrates.

Figuur 3 toont de drempel van voorbeeld 3 voor de invloed van isofucosterol in bijendieet.Figure 3 shows the threshold of Example 3 for the influence of isofucosterol in bee diet.

Naarmate de concentratie isofucosterol toenam, nam de hoeveelheid broed die in elk volk werd geproduceerd toe (N > 3 volken/behandeling). De poppen en het aantal nieuwe adulten werden gedurende de gehele periode van 10 weken geteld.As the concentration of isofucosterol increased, the amount of brood produced in each colony increased (N > 3 colonies/treatment). Pupae and the number of new adults were counted throughout the 10-week period.

Voorbeeld 4 - Broedproductie: Honingbijen produceren meer broed met een meervoud aan sterolen en produceren langer broed.Example 4 - Brood Production: Honey bees produce more brood with a plurality of sterols and produce longer brood.

Voorbeeld 5 - Honingbijen produceren efficiënter broedsel per eenheid eiwit wanneer sterolen aan het voedsel worden toegevoegd Voorbeeld 6 - Honingbijen produceren langer broed met een meervoud van vereiste sterolen dan met enige andere sterolvoorziening Voorbeeld 7 - Overleving: bijen leven langer van voedsel dat astaxanthine bevat Vertaling van Engelse uitdrukkingen in de tekeningen Example Voorbeeld Avoids sterol Vermijdt sterol Prefers sterol Geeft de voorkeur aan sterol Isofucosterol Isofucosterol weight gewicht survival per cohoert overleving per cohoert time (days) tijd (dagen) Capped brood per uni protein per colony Afgedekt broed per uni eiwit per kolonie per 2 week period per periode van 2 wekenExample 5 - Honeybees produce brood more efficiently per unit of protein when sterols are added to food Example 6 - Honeybees produce brood longer with multiple required sterols than with any other sterol supply Example 7 - Survival: bees live longer on food containing astaxanthin English expressions in the drawings Example Example Avoids sterol Avoids sterol Prefers sterol Prefers sterol Isofucosterol Isofucosterol weight weight survival per cohort survival per cohort time (days) time (days) Capped brood per uni protein per colony Capped brood per uni protein per colony per 2 week period per 2 week period

Claims

CONCLUSIONS

1. A method of feeding invertebrates comprising: =» providing a composition containing a microbial organism or parts, extracts, oils, mixtures or refinements thereof; and = administering the composition to invertebrates, = wherein the microbial organism is selected from the group consisting of fungi, algae or bacteria; and = where the microbial organism has been genetically modified or selected to produce an invertebrate nutrient .

2. The method of claim 1, wherein the invertebrate nutrient is selected from the group consisting of sterols or stanols, such as cholesterol, desmosterol, 24-methylene cholesterol, 24-methylenecholst-7-enol, cholestanol, 7-dehydrocholesterol, campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, isofucosterol and fucosterol.

A method of claim 1, wherein the invertebrate nutrient is a polyphenolic compound of one of the following classes: proanthocyanidins or their subunits (catechins and epicatechins), flavonoids, or cinnamic acids.

4. A method of statement 1, wherein the invertebrate nutrient is a carotenoid or a xanthophyll, such as β-carotene or astaxanthin.

5. The method of any of the preceding claims, wherein the microorganism has been further selected or modified so as not to express or produce invertebrate antinutrients.

6. The method of any of the preceding claims, wherein the invertebrate antinutrient is a sterol such as zymosterol or ergosterol.

7. The method of any of the preceding claims, wherein the composition is a complete invertebrate diet, part of an invertebrate diet, or dietary supplement.

8. The method of any of the preceding claims, wherein the composition is administered to invertebrates of the Apidae family, especially honeybees or bumblebees.

9. The method of any of the preceding claims, wherein the composition is administered a. in solid form, such as a patty, or in liquid form, such as a solution or an aerosol; b. inside or outside the hive.

10. The method of any of the preceding claims, wherein the microorganism is selected from the group consisting of: =» a marine or freshwater algal species, i.e. an extract, an oil, a mixture or a refinement of Ulva /actuca; =» a marine diatom species, in particular an extract, an oil, a mixture or a refinement of Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira rotula, or Chaetoceros muelleri or microalgae such as Dunaliella salina or Porphyndium cruentum; and =" a fungus, especially an extract, an oil, a mixture or a refinement of Saccharomyces cerevisiae, Xanthophyllomyces sp. or Yarrowia lipolytica. = The method of any of the preceding statements, in which a chemical, chromatographic or enzymatic modification step is performed to obtain the invertebrate nutrient.

11. The method of any of the preceding claims, wherein the composition consists of: = proteins in an amount of 10 to 50 wt%, preferably from 20 to 40 wt%, =» fatty acids in an amount of 1 wt% to 20 w%, preferably from 2 w% to 12 w%, = carbohydrates in an amount of 30 to 90 wt%, preferably from 50 to 70 wt%, =" optionally vitamins, and =" optionally minerals, = where the total amount of components is 100% and where the % is related to the total dry weight of the composition.

12. The method of any of the preceding claims, wherein the composition contains an insect nutrient selected from the group consisting of cholesterol, desmosterol, 24-methylenecholesterol, 24-methylenecholest-7-enol campesterol, stigmasterol, b-sitosterol, cholestanol, 7 -dehydrocholesterol, isofucosterol and fucosterol or mixtures thereof in an amount:

=» From 0.01-5% of the feed as individual ingredients, with no ingredient ever making up less than 0.01% of the feed, and from 0.1-5% of the feed in a mixture; = as a mixture, preferably from 0.1-1% and even more preferably from 0.3-0.5% for honeybees and 0.3-0.8% for bumblebees, as a percentage of the total weight of the pollen substitute composition; and/or ‚ Where the ratios of the sterols correspond to the amounts found in bees (see Table 1) = Where the ratios of the sterols used correspond to the amounts of the sterols found in a target organism; = where the nutrients are applied locally.

A method according to any one of the preceding claims, wherein the composition contains an insect nutrient having polyphenols in the following groups phenolic acids, proanthocyanidins, epicatechins, catechins and flavonoids such as quercetin, naringenin, p-coumaric acid or mixtures thereof in an amount of 0.01 -5% of the ration, preferably from 0.01-1% and even more preferably from 0.03-0.8% for bumblebees, as a percentage of the total weight of the ration.01-1% and even more preferably from 0.03-0.5% for honeybees and 0.03-0.8% for bumblebees as a percentage of the total weight of the pollen replacement composition and where the predominant class of phenols is either proanthocyanidins or flavonoids and at least 30% of the total polyphenols and is preferably 70-100% of the total polyphenols.

A method according to any preceding claim, wherein the composition contains an insect nutrient selected from the group of carotenoids or xanthophylls such as b-carotene, lycopene, or astaxanthin or mixtures thereof, in an amount of 0.01-5% of the diet, preferably from 0.01-1% and more preferably from 0.03-0.5% for honeybees and 0.03-0.8% for bumblebees, as a percentage of the total weight of the pollen replacement composition.

15. The method of any of the foregoing claims, wherein the composition is essentially free of pollen.

16. Use of the composition of any of the foregoing statements for the feeding of invertebrates, especially honeybees, bumblebees or stingless bees.