JP7460540B2

JP7460540B2 - 修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ

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Publication number: JP7460540B2
Application number: JP2020557258A
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Inventors: クリストファー，マークファレル，; リサ，アンラプラード，; オットー，マーティンレーマン，; ジョシュアトゥルーハート，
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Publication date: 2024-04-02
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Description

発明の詳細な説明

本発明は、ビタミンＤ３の生物工学的生成に使用されるビタミンＤ３前駆物質７－デヒドロコレステロール（７－ＤＨＣ）のアシル化に対する向上した活性及び／又は特異性を有する修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ酵素に関する。本発明は、前記修飾酵素を発現する酵母株並びにビタミンＤ３又はその誘導体及び／若しくは代謝産物を生成するプロセスにおけるその使用に更に関する。

ビタミンＤ３（コレカルシフェロール又はカルシオールとしても知られる）は、哺乳動物の皮膚においてプロビタミンＤ３（７－デヒドロコレステロール又は７－ＤＨＣとしても知られる）から合成され得、それは、コレステロール生合成の産物であり、紫外線に曝露されると、７－ＤＨＣは、プロビタミンＤ３に光化学的に変換され、体温において生物活性型ビタミンＤ３に異性化する。肝臓において、ビタミンＤ３は、生物学的に不活性な２５－ヒドロキシビタミンＤ３（カルシジオール、カルシフェジオール、２５－ヒドロキシコレカルシフェロール、２５－ＯＨ－Ｄ３又はＨｙＤとしても知られる）に変換され、それは、ビタミンＤ３の主要な循環形である。更なるヒドロキシル化が腎臓内で生じる。

ビタミンＤ３の工業的製造について、化学合成及び生物工学的合成のいずれも（原則的に）利用可能である。化学合成は、例えば、羊毛脂から単離されたコレステロールから開始され、それは、化学合成及び生物工学的合成のいずれでも重要な中間体である７－ＤＨＣに脱水素される。紫外線による曝露及び更なる精製／抽出工程により、７－ＤＨＣは、ビタミンＤ３に変換される。修飾酵母株を７－ＤＨＣの生合成に使用することができ、多段階酵素的プロセスでアセチル－ＣｏＡが７－ＤＨＣに変換される。前記酵素的変換は、酵母の小胞体内で行われる。細胞膜で必要とされない、７－ＤＨＣ及びその前駆物質などの過剰量のステロールは、酵母に対して毒性であり、したがって細胞小器官内にステリルエステル（いわゆる脂肪滴）として貯蔵され、細胞小器官からそれを更に単離することができる。遊離ステロールと、脂肪滴に貯蔵されるステロール（主にステリルエステルの形態における）との平衡状態は、ステロールアシルトランスフェラーゼの作用など、数種類のタンパク質（酵素）の作用を介して誘発される。酵母、特にサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、ステロールのエステル形成は、主に２種類のステロールアシルトランスフェラーゼＡｒｅ１ｐ及びＡｒｅ２ｐによって行われる。

前記ステロールアシルトランスフェラーゼ酵素の非特異的作用のため、脂肪滴内に貯蔵されているステリルエステルのプールは、相対的に多様であり、限定されないが、例えばエルゴステロール、チモステロール、ラノステロール、ラトステロール、コレスタ－５，７，２４（２５）－トリエノール又は７－ＤＨＣのエステルなどが挙げられる。ビタミンＤ３合成には、７－ＤＨＣの前駆物質、コレスタ－５，７，２４（２５）－トリエノールのみを使用することができ、チモステロールを使用することができないため、例えば７－ＤＨＣのエステルなど、脂肪滴内への特異的なエステルの選択的な貯蔵並びに／或いはビタミンＤ３及び／又はその誘導体若しくは代謝産物に更に変換される、かかる酵母株によって生成される７－ＤＨＣの中間体の代謝回転を増加することのいずれかが必要とされる。本発明の焦点でもある特定の代謝産物は、２５－ヒドロキシビタミンＤ３である。

したがって、７－ＤＨＣに対する高い生産性／特異性を有し、且つ／又は副産物／中間体、例えばチモステロール、ラノステロール若しくはラトステロール、特に脂肪滴内に貯蔵されるかかる中間体のエステルの蓄積が低減された、ステロールを生成することができる酵母などの宿主細胞を生成することが継続的な課題である。

意外なことに、本発明者らは、ここで、宿主細胞におけるステロールアシルトランスフェラーゼ活性の特異性が、ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１の配列に特定のアミノ酸置換を導入することにより、７－ＤＨＣに対してシフトすることができ、それによりビタミンＤ３生成における重要な中間体としての７－ＤＨＣに対する宿主細胞の生産性及び／又は生成比が高まることを見出した。

したがって、本発明は、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性、すなわち修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ、特にステロールアシルトランスフェラーゼアイソフォームＡｒｅ１ｐ及び／又はＡｒｅ２ｐの活性を有する修飾酵素であって、配列番号１によるポリペプチドにおける５９２及び／又は５９５から選択される残基に対応する位置での１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、チモステロールなどの副産物／中間体と比較して７－ＤＨＣに対して増加した特異性を有する、修飾酵素に関する。

ＡＲＥ１活性を示す、配列番号１によるポリペプチドであって、配列番号１によるかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチドがサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されている。ＡＲＥ２活性を示す、配列番号３によるポリペプチドであって、配列番号３によるかかるポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチドがサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されている。

「ステロールアシルトランスフェラーゼ」、「アシルトランスフェラーゼ」、「ＡＲＥ」、「アシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素」又は単なる「酵素」という用語は、本明細書において区別なく使用され、且つ酵素［ＥＣ２．３．１．２６］、すなわち１つの分子から別の分子に脂肪酸アシル基を転移するアシルトランスフェラーゼを意味する。かかる転移又は酵素活性は、当業者に公知の手段で測定することができる。ステロールアシルトランスフェラーゼは、哺乳動物、酵母又は植物などの様々な起源から単離されている。ＡＲＥ１及びＡＲＥ２のいずれも、例えば、チモステロールなどのステロール及び／又は７－ＤＨＣをそれぞれのエステルにアシル化することができる。本明細書で使用される「修飾」酵素、すなわち修飾アシルトランスフェラーゼは、例えば、チモステロールのエステル化と比較して、７－ＤＨＣのエステル化に対して好ましい活性及び／若しくは特異性を有し、且つ／又は例えば７－ＤＨＣ若しくはチモステロールなどのステロールエステル全体の向上した形成を有する。好ましいアシルトランスフェラーゼアイソフォームは、Ａｒｅ１ｐ又はＡｒｅ２ｐである。本明細書で使用される「非修飾」ステロールアシルトランスフェラーゼ、特にＡＲＥ１及びＡＲＥ２は、本明細書で定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を保有しないそれぞれの内因性酵素を意味する。

本明細書で定義される修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を保持する、特に本明細書で定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、ＡＲＥ２及び／又はＡＲＥ１を保持する、本明細書で使用される宿主細胞は、「修飾」宿主細胞と呼ばれる。非修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を保持する、すなわち野生型ＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２遺伝子をコードするそれぞれの宿主細胞は、「非修飾」宿主細胞と呼ばれる。

本明細書で使用される、ビタミンＤ３中間体を特定化する「チモステロール」、「ラノステロール」、「ラトステロール」、「コレスタ－５，８，２４（２５）－トリエノール」、「コレスタ－５，７，２４（２５）－トリエノール」又は「７－ＤＨＣ」という用語は、前記化合物の遊離型及びエステル型の両方を含む。本明細書で使用されるステロールミックスは、７－ＤＨＣ及び「副産物」又は中間体、限定されないが、チモステロール、ラノステロール、ラトステロール、コレスタ－５，８，２４（２５）－トリエノール若しくはコレスタ－５，７，２４（２５）－トリエノールなどを含有する。

本明細書で使用される「コレステロール産生酵母」は、もはやエルゴステロールを産生することができないが、限定されないが、コレスタ－５，７，２４（２５）－トリエノール、コレスタ－５，８，２４（２５）－トリエノール、コレスタ－７，２４（２５）－ジエノール、７－ＤＨＣ又はチモステロールなどのコレステロール生成物を産生することができる。特に、これは、ｅｒｇ５ｅｒｇ６ダブルノックアウトの導入によって達成され得る。

一実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基５９２に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはロイシンによるフェニルアラニンの置換（Ｆ５９２Ｌ）を含む。好ましくは、修飾ＡＲＥ１活性を有する酵素は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。前記修飾ＡＲＥ１酵素を使用すると、ステロールミックス中のチモステロールに対する７－ＤＨＣの比を、非修飾内因性ＡＲＥ１を発現する株と比べて少なくとも約１５％だけ増加させることができた。

一実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ１活性は、配列番号１によるポリペプチドにおける残基５９５に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはロイシンによるフェニルアラニンの置換（Ｇ５９５Ｄ）を含む。好ましくは、修飾ＡＲＥ１活性を有する酵素は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。前記修飾ＡＲＥ１酵素を使用すると、ステロールミックス中のチモステロールに対する７－ＤＨＣの比を、非修飾内因性ＡＲＥ１を発現する株と比べて２倍を超えて、すなわち少なくとも約５５％だけ増加させることができた。

更なる実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２活性は、配列番号３によるポリペプチドにおける残基６２４に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはロイシンによるフェニルアラニンの置換（Ｆ６２４Ｌ）を含む。好ましくは、修飾ＡＲＥ２活性を有する酵素は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。前記修飾ＡＲＥ２酵素を使用すると、ステロールミックス中のチモステロールに対する７－ＤＨＣの比を、非修飾内因性ＡＲＥ２を発現する株と比べて少なくとも約１５％だけ増加させることができた。

更なる実施形態において、本明細書で定義される修飾酵素、特に修飾ＡＲＥ２活性は、配列番号３によるポリペプチドにおける残基６２７に対応する位置でのアミノ酸置換、好ましくはアスパラギン酸によるグリシンの置換（Ｇ６２７Ｄ）を含む。好ましくは、修飾ＡＲＥ２活性を有する酵素は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。前記修飾ＡＲＥ２酵素を使用すると、ステロールミックス中のチモステロールに対する７－ＤＨＣの比を、非修飾内因性ＡＲＥ２を発現する株と比べて少なくとも約１５％だけ増加させることができた。

配列番号１における残基Ｆ５９２Ｌ及び／又はＧ５９５Ｄに対応する位置での記載のアミノ酸置換は、本明細書で定義される更なる置換、すなわち配列番号３による且つ本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸残基６２４及び／又は６２７に対応する１つ又は複数の位置での置換と組み合わされ得る。好ましくは、配列番号１における残基Ｆ５９２Ｌに対応する位置でのアミノ酸置換は、配列番号１におけるＧ５９５Ｄに対応し、且つ／又は配列番号３におけるＦ６２４Ｌに対応し、且つ／又は配列番号３におけるＧ６２７Ｄに対応する位置でのアミノ酸置換などの更なる置換と組み合わされ得る。好ましい修飾酵素は、ＡＲＥ１活性を有し、且つ配列番号１におけるＧ５９５Ｄに対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、少なくとも約３０、３５、４０、４５％高い７－ＤＨＣ力価を示し、ステロールミックス中の７－ＤＨＣのパーセンテージが約７０～７６％であると共に、ステロールミックス中のチモステロールが少なくとも約１５、２０、２５、３０％少ない。

本明細書で使用されるＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２の活性は、修飾される。これは、例えば、ＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２をコードする内因性遺伝子に変異、すなわち本明細書に記載の１つ又は複数の位置でのアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。酵母細胞をどのように遺伝子操作して、ＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２活性が修飾されるかは、当業者に公知である。これらの遺伝子操作としては、限定されないが、例えば遺伝子置換、遺伝子増幅、遺伝子破壊、トランスフェクション、プラスミド、ウイルス又は他のベクターを用いた形質転換が挙げられる。

核酸又はアミノ酸内への変異の生成、すなわち変異誘発は、様々な方法において、例えばランダム若しくは部位特異的突然変異誘発、例えば放射線、化学的治療などの薬剤又は遺伝因子の挿入によって起こる物理的ダメージなどによって行われ得る。

本発明は、特に、７－ＤＨＣ、ビタミンＤ３の中間体を生成するプロセスにおける、本明細書で定義されるかかる修飾ＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２酵素の使用に関する。好ましくは、本発明の修飾酵素は、酵母、好ましくはステロール産生酵母、特にコレステロール産生酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａｓｐｐ．）、クルイベロミセス属（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｓｐｐ．）又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、好ましくはＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される酵母など、適切な宿主細胞に導入され、且つ／又は発現される。修飾宿主は、ビタミンＤ３及び／又は２５－ヒドロキシビタミンＤ３に更に変換され得る７－ＤＨＣを生成するために使用される。

適切な宿主細胞を更に修飾して、ビタミンＤ３の生合成に対する重要な中間体、７－ＤＨＣの生成が更に増加され、且つ／又は副産物の蓄積が低減され得る。

したがって、一実施形態において、本発明は、修飾ＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２活性を有する酵母株に関し、更に、ＥＲＧ５及びＥＲＧ６は、不活化されている。酵母細胞は、前記酵母細胞内で発現することができる限り、コレスタ－７，２４－ジエノール、チモステロール又はトリエノール（例えば、コレスタ－５，７，２５－トリエノール）上で活性である異種Ｃ２４－レダクターゼ、好ましくは植物若しくは脊椎動物ステロールΔ２４－レダクターゼ、より好ましくは脊椎動物由来のレダクターゼ、更により好ましくはヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウマ、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ）又は既知のいずれかの源由来のレダクターゼなど、ＥＣ１．３．１．７２から特に選択される、Ｃ２４－レダクターゼ活性を有する異種酵素の発現によって更に修飾され得る。最も好ましくは、ステロールΔ２４－レダクターゼは、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ）、ラット又はヒトから選択される。前記ステロールΔ２４－レダクターゼ酵素を発現する配列は、公的に入手可能であり、限定されないが、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ参照番号Ｑ１５３９２、Ｑ６０ＨＣ５、Ｑ８ＶＣＨ６、Ｑ５ＢＱＥ６、Ｑ３９０８５又はＰ９３４７２（例えば、国際公開第２００３０６４６５０号パンフレットを参照されたい）が挙げられる。かかる酵母株を使用すると、ステロールミックス中に存在する７－ＤＨＣのパーセンテージは、ステロールの総量に対して約７０％以上の範囲であり、好ましくは例えば７５、８０、８８、９０、９５、９８％である。

他の実施形態において、本発明による宿主細胞は、例えば、Ｃ５－ステロールデサチュラーゼ（ＥＲＧ３）及び／又はＣ８－ステロールイソメラーゼ（ＥＲＧ２）など、７－ＤＨＣの生合成に関与する内因性酵素のホモログの導入によって更に修飾され得、７－ＤＨＣの特異性及び／又は生産性が増加すると共に、限定されないが、チモステロール、ラノステロール及び／又はラトステロールなどの副産物又はビタミンＤ３中間体の蓄積が低減される。好ましくは、本明細書に定義される修飾宿主細胞は、異種ＥＲＧ２及び／又はＥＲＧ３を含み、ＥＲＧ２は、好ましくは、Ｕｓｔｉｌａｇｏｍａｙｄｉｓ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＰ３２３６０に由来の配列）から選択され、且つ／又はＥＲＧ３は、好ましくは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＣ４ＱＹ８７に由来する配列）又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＯ９４４５７に由来する配列）から選択される。本明細書において定義される修飾ＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２と共にＥＲＧ２及びＥＲＧ３ホモログの両方を含む株は、７－ＤＨＣ約８０％のパーセンテージを有し、且つコレスタ－８－エノール及び／又はラトステロールに対する７－ＤＨＣの比が少なくとも約１５～２０％増加したステロールミックスを産生する。上述のＥＲＧ２及び／又はＥＲＧ３ホモログのいずれかの２つ以上のコピーを更に含む、本明細書に定義される修飾株が更に好ましい。

特定の実施形態において、本発明は、その宿主細胞が、本明細書で定義される修飾宿主細胞、すなわち本明細書において定義されるステロールアシルトランスフェラーゼＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２における１つ又は複数のアミノ酸置換の導入によって修飾された修飾宿主細胞、特にコレステロール産生酵母細胞、好ましくはＥＲＧ５及びＥＲＧ６が不活化されている酵母細胞であり、且つ任意選択的に、本明細書で定義されるＣ－２４－レダクターゼ活性を有する異種酵素が発現され、且つ／又は任意選択的に、内因性ＥＲＧ２及び／又はＥＲＧ３のホモログが発現され、宿主細胞は、前記宿主細胞によって産生されるステロール総量中の７－ＤＨＣのパーセンテージが、非修飾、すなわち野生型ＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２活性を発現する酵母株と比べて約少なくとも７０、７５、８０％、好ましくは８８、９０、９５、９８％に増加され、特にチモステロール及びコレスタ－８－エノールなどの副産物に対する７－ＤＨＣの比が少なくとも約５、１０、１５、１８、２０、２５％だけ増加されるように改善される、７－ＤＨＣの産生に対して宿主細胞を向上させるプロセスに関する。

本発明の一態様において、本明細書で定義される修飾ＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２活性を含む宿主細胞がビタミンＤ３前駆物質７－ＤＨＣを産生するプロセスで使用される。それぞれのコレステロール産生宿主細胞に関して、好気性又は無気的条件下において且つ当業者に公知のように、適切な栄養で補われた水性媒体中で修飾宿主細胞が培養され得る。任意選択的に、かかる培養は、当技術分野で公知のように、タンパク質及び／又は電子の移行に関与する補因子の存在下にある。宿主細胞の培養／増殖は、バッチ、フェドバッチ、半連続又は連続式で行われ得る。宿主細胞に応じて、好ましくは、ビタミンＤ３及び７－ＤＨＣなどのその前駆物質の生成は、当業者に公知であるように様々であり得る。ビタミンＤ３の生成における７－ＤＨＣ及び他の中間体の培養及び単離は、例えば、国際公開第２０１１０６７１４４号パンフレット又は国際公開第２０１７１０８７９９号パンフレットに記載されている。７－ＤＨＣは、ステロールミックスから単離され、且つ／又は任意選択的に更に精製され得、当技術分野で公知の方法を用いてビタミンＤ３及び／又は２５－ヒドロキシビタミンＤ３に更に変換され得る。

本明細書に記載の宿主細胞を使用して、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性の基質特異性を７－ＤＨＣに対してシフトすることができ、前記宿主細胞によって産生される総ステロール中の７－ＤＨＣのパーセンテージが少なくとも約７０％となり、適切な培養条件下において約１００時間発酵させた後に産生される７－ＤＨＣの力価は、最大で約１０ｇ／ｌ又はそれを超える。

「ＡＲＥ１」及び「Ａｒｅ１ｐ」、「ＡＲＥ２」及び「Ａｒｅ２ｐ」、「ＥＲＧ５」及び「Ｅｒｇ５ｐ」、「ＥＲＧ６」及び「Ｅｒｇ６ｐ」という用語は、本明細書において区別なく使用され、それぞれの遺伝子ａｒｅ１、ａｒｅ２、ｅｒｇ５及びｅｒｇ６によってコードされるポリペプチドを意味する。本発明の目的のために、コレステロール産生酵母細胞は、ＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２の修飾活性を示す例えば内因性ＡＲＥ１、ＡＲＥ２又はその両方の修飾を保持し、ＡＲＥ１及び／又はＡＲＥ２の修飾特異性が得られるように修飾され、前記修飾は、本明細書で定義される１つ又は複数のアミノ酸置換の導入を介して活性化される。

ＥＲＧ５、ＥＲＧ６、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２、ＥＲＧ２、ＥＲＧ３又はステロールΔ２４－レダクターゼ（ＥＲＧ４）をコードする遺伝子、本明細書において使用される酵母細胞の培養及び遺伝子操作は、公知であり、例えば米国特許第７６０８４２１号明細書に記載されている。

本明細書で使用される「Ｃ－２４－レダクターゼ」又は「Δ２４－レダクターゼ」という用語は、本明細書において区別なく使用される。酵母において、この酵素は、ｅｒｇ４によってコードされ、位置２４の炭素原子のメチル基に対して活性である。したがって、前記位置でかかるメチル基を示さないトリエノールは、酵母ＥＲＧ４に対して許容可能な基質ではない。

「Ｃ－８ステロールイソメラーゼ」、「Δ８，７－イソメラーゼ」又は「Ｃ－８ステロールイソメラーゼを有する酵素」という用語は、本明細書において区別なく使用され、コレスタ－８－エノールのコレスタ－７－エノールへの変換及び／又はチモステロールのコレスタ－７，２４－ジエノールへの変換を触媒することができる酵素を意味する。本発明による修飾宿主細胞において使用される好ましいＥＲＧ２ホモログは、配列番号５と少なくとも約４１％、例えば少なくとも４４、４５、４８、４９、５３、５６、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までの同一性を有するポリペプチドであり、Ｃ－８ステロールイソメラーゼ活性を示し、Ｕｓｔｉｌａｇｏｍａｙｄｉｓから入手可能なかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。特に、前記ＥＲＧ２ホモログの少なくとも約１、２、３、５つなど、１つ又は複数のコピーは、本明細書で定義される修飾宿主細胞において発現される。

「Ｃ－５ステロールデサチュラーゼ」、「Ｃ－５ステロールデサチュラーゼを有する酵素」という用語は、本明細書において区別なく使用され、コレスタ－８－エノールのコレスタ－７，２４－ジエノールへの変換並びに／又はコレスタ－７－エノールのコレスタ－５，７，２４－トリエノール及び／若しくは７－ＤＨＣへの変換を触媒することができる酵素を意味する。酵母において、この酵素は、ｅｒｇ３によってコードされる。本発明による修飾宿主細胞において使用される好ましいＥＲＧ３ホモログは、配列番号７と少なくとも約４５％、例えば少なくとも５０、５２、６０、７０、８０、９０、９２、９５、９８又は１００％までの同一性を有するポリペプチドであり、Ｃ－５ステロールデサチュラーゼ活性を示し、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）から入手可能なかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。特に、前記ＥＲＧ３ホモログの少なくとも１、２、３、５つなど、１つ又は複数のコピーは、本明細書で定義される修飾宿主細胞において発現される。

「配列同一性」、「同一性％」という用語は、本明細書において区別なく使用される。本発明の目的では、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列同一性のパーセンテージを決定するために、最適な比較のために配列がアライメントされることが本明細書において定義される。２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入され得る。かかるアライメントは、比較される配列の完全長をわたって行うことができる。代わりに、アライメントは、それより短い長さにわたり、例えば約２０、約５０、約１００以上の核酸／塩基又はアミノ酸にわたり行われ得る。配列同一性は、報告されるアライメント領域にわたる２つの配列間の同一マッチのパーセンテージである。２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性％は、２つの配列のアライメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３－４５３）を用いて決定され得る。アミノ酸配列とヌクレオチド配列とのいずれもアルゴリズムによってアライメントすることができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータープログラムＮＥＥＤＬＥにおいて実現されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムが使用された（バージョン２．８．０以上，ＥＭＢＯＳＳ：ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，ＬｏｎｇｄｅｎａｎｄＢｌｅａｓｂｙ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ１６，（６）ｐｐ２７６－２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質の配列に関して、置換行列にＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列について、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意のパラメーターは、ギャップオープンペナルティ１０及びギャップ伸長ペナルティ０．５である。これらの異なるすべてのパラメーターによってわずかに異なる結果が生じるが、２つの配列の同一性の全体的なパーセンテージは、異なるアルゴリズムを使用した場合に有意に変化しないことを当業者は理解するであろう。

上述のＮＥＥＤＬＥプログラムによってアライメントした後、問い合わせ配列と本発明の配列との配列同一性のパーセンテージが以下の通りに計算される：両方の配列における同一アミノ酸又は同一ヌクレオチドを示すアライメントの対応する位置の数は、アライメントにおけるギャップの総数を引いた後にアライメントの全長で割られる。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによってＮＥＥＤＬＥから得ることができ、「最長の同一性」としてプログラムのアウトプットで標識される。比較される両方のアミノ酸配列がそれらのアミノ酸のいずれにおいても違いがない場合、それらは、同一であるか又は１００％の同一性を有する。本明細書において定義される植物に由来する酵素に関して、植物由来酵素は、例えば、葉緑体処理酵素（ＣＰＥ）などの特異的酵素によって切断される、葉緑体標的シグナルを含有し得るという事実が当業者によって認識される。

本明細書で定義されるＡＲＥ２及びＡＲＥ１酵素／ホモログは、酵素活性を変化させないアミノ酸置換を保持する酵素も包含し、すなわち、その酵素は、野生型酵素に関して同じ特性を示し、本明細書で定義されるステロールのアシル化を触媒する。かかる変異は、「サイレント変異」とも呼ばれ、本明細書に記載の酵素の（酵素的）活性を変化させない。

本明細書で使用される、酵素に関する「特異的活性」又は「活性」という用語は、その触媒活性、すなわち所定の基質からの産物の形成を触媒するその能力を意味する。所定の時間内及び定義された温度において、タンパク質の定義された量当たりで消費される基質及び／又は生成される産物の量が特異的活性によって定義される。通常、特異的活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１分当たりで消費される基質又は形成される産物μｍｏｌで表される。通常、μｍｏｌ／分は、Ｕ（＝単位）によって省略される。したがって、μｍｏｌ／分／（タンパク質ｍｇ）又はＵ／（タンパク質ｍｇ）の特異的活性の単位定義は、本明細書全体を通して区別なく使用される。酵素がその触媒活性を生体内、すなわち本明細書で定義される宿主細胞内又は適切な基質の存在下において適切な（無細胞）システム内で発揮する場合、酵素は、活性である。当業者であれば、例えばＨＰＬＣなどによる測定など、どのように酵素活性を測定するかを知っている。

本発明に関して、例えば、微生物、菌類、藻類又は植物などの生物は、原核生物の命名法の国際コード又は菌類、藻類及び植物の命名法の国際コード（メルボルンコード）によって定義される、同じ生物学的特性を有するかかる種の異名又はバソニムも包含する。

特に、本発明は、本発明の以下の実施形態を特徴とする：
（１）配列番号１によるポリペプチドにおける５９２及び／又は５９５から選択される残基に対応する位置の１つ又は複数のアミノ酸置換、好ましくはＦ５９２Ｌ及び／又はＧ５９５Ｄに対応する置換を含む、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する修飾酵素。
（２）７－デヒドロコレステロール（７－ＤＨＣ）及びチモステロールを含むステロールのエステル化を触媒し、ステロールエステル中のチモステロールに対する７－ＤＨＣの比は、それぞれの非修飾酵素を用いた触媒におけるチモステロールに対する７－ＤＨＣの比と比べて少なくとも約１５％だけ増加される、本明細書に定義され且つ実施形態（１）による修飾酵素。
（３）アミノ酸置換は、Ｇ５９５Ｄから選択される、本明細書に定義され且つ実施形態（１）又は（２）による修飾酵素。
（４）本明細書で定義され且つ実施形態（１）、（２）、（３）による修飾酵素を含む宿主細胞、好ましくは酵母、より好ましくはステロール産生酵母、更により好ましくはコレステロール産生酵母。
（５）７－ＤＨＣ及びチモステロールを含むステロールミックスの生成に使用され、チモステロールに対する７－ＤＨＣの比は、非修飾酵素を発現する宿主細胞と比較して少なくとも約１５％だけ増加される、本明細書で定義され且つ実施形態（４）による宿主細胞。
（６）ＥＲＧ５及びＥＲＧ６は、不活化されている、本明細書で定義され且つ実施形態（４）又は（５）による宿主細胞。
（７）ステロールΔ２４－レダクターゼ活性を有するＥＣ１．３．１．７２から選択される異種酵素を発現し、好ましくは、その異種酵素は、植物又は脊椎動物に由来し、より好ましくはヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウマ又はゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ）に由来する、本明細書で定義され且つ実施形態（４）、（５）、（６）による宿主細胞。
（８）サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）及びヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から選択され、好ましくはサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａｓｐｐ．）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｓｐｐ．）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｓｐｐ．）又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から選択される、本明細書で定義され且つ実施形態（４）、（５）、（６）、（７）による宿主細胞。
（９）チモステロール及び７－ＤＨＣを含むステロールミックス中のチモステロールのパーセンテージを低減するプロセスであって、適切な条件下において、本明細書で定義され且つ実施形態（４）、（５）、（６）、（７）、（８）による宿主細胞を培養することと、任意選択的に、ステロールミックスから７－ＤＨＣを単離及び／又は精製することとを含むプロセス。
（１０）７－ＤＨＣ及びチモステロールを含むステロールミックス中の７－ＤＨＣのパーセンテージを増加させるプロセスであって、適切な条件下において、本明細書で定義され且つ実施形態（４）、（５）、（６）、（７）、（８）による宿主細胞を培養することと、任意選択的に、ステロールミックスから７－ＤＨＣを単離及び／又は精製することとを含むプロセス。
（１１）本明細書で定義され且つ実施形態（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）による宿主細胞を用いる、チモステロール及び７－ＤＨＣを含むステロールミックスへのアセチル－ＣｏＡの酵素的変換を含む、７－ＤＨＣの生成のプロセスであって、ステロールミックス中の７－ＤＨＣのパーセンテージは、少なくとも約７０％である、プロセス。
（１２）７－ＤＨＣは、ビタミンＤ３に更に変換される、本明細書で定義され且つ実施形態（１１）によるプロセス。
（１３）７－ＤＨＣは、２５－ヒドロキシビタミンＤ３に更に変換される、本明細書に定義され且つ実施形態（１１）又は（１２）によるプロセス。
（１４）７－ＤＨＣを生成するプロセスにおける、本明細書で定義され且つ実施形態（１）（２）、（３）による修飾酵素又は本明細書で定義され且つ実施形態（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）による宿主細胞の使用であって、７－ＤＨＣは、チモステロール及び７－ＤＨＣを含むステロールミックスから単離され、チモステロールに対する７－ＤＨＣの比は、それぞれの非修飾酵素及び宿主細胞を使用したプロセスと比較してそれぞれ少なくとも約１５％だけ増加される、使用。

以下の実施例は、単に例示的なものであり、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。

［実施例］
［実施例１：一般的方法、株及びプラスミド］
本明細書に記載のすべての基礎的分子生物学及びＤＮＡ操作手順は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ：ＮｅｗＹｏｒｋ）又はＡｕｓｕｂｅｌら（１９９８．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：ＮｅｗＹｏｒｋ）に準拠して実施した。使用されたサッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株及びプラスミドの遺伝子型を表１及び２に示す。野生型ＣＥＮ．ＰＫバックグラウンド株から開始して、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）７－ＤＨＣ産生株Ｙ２１４０を作製した。ＴＲＰ１と併せてＰＧＫ１プロモーター及びＣＹＣ１ターミネーターによって隣接される、ゼブラフィッシュ由来ステロール２４－レダクターゼに対するコドン最適化遺伝子を含有するｅｒｇ５破壊カセットをこの野生型株に形質転換した。続いて、ＬＥＵ２と併せてＴＤＨ３プロモーター及びＰＧＫ１ターミネーターにより隣接されるラット由来ステロール２４－レダクターゼの遺伝子を含有するｅｒｇ６破壊カセットを形質転換した。記載のすべての株がＭＡＴαであり、短縮された恒常的に活性なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ遺伝子（ｔＨＭＧ１）の過剰発現コピーを保持する。

［実施例２：ＡＲＥ１－ＷＴプラスミドｐＨｙＤ４５９の作製］
Ｘｂａｌ部位を５’末端に（ＴＣＴＡＧＡＡＣＡＡＡａｔｇ．．．）、Ｐｓｔｌ部位を３’末端に組み込んで、野生型サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＥ１をＤＮＡ２．０によって合成した。固有のＸｂａｌ及びＰｓｔｌ部位を用いて、ｅｒｇ４Δ：：Ｈｙｇ^Ｒ欠失プラスミドにこれをクローニングした。続いて、ＬＥＵ２を使用して、Ｋｐｎｌ－ＡｇｅｌクローニングによってＨｙｇＲ部位を置換した。

［実施例３：ＡＲＥ１変異体遺伝子のクローニング］
ＡＲＥ１から産生されたＢｓｒＧｌ－Ｂｓａｌ－切断ＰＣＲ産物（配列番号１６＆１７によるオリゴ）を、配列番号１９及び２０をＢｓｒＧｌ－Ｐｓｔｌ－切断ｐＨｙＤ４５９にアニーリングすることによって誘導された二本鎖オリゴとライゲートすることにより、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＥ１変異バリアントｐＭＢ７５８４（Ｆ５９２Ｌ）を産生した。同様に、ＡＲＥ１から産生されたＢｓｒＧｌ－Ｂｓａｌ－切断ＰＣＲ産物（配列番号１６＆１８によるオリゴ）を、配列番号２１及び２２をＢｓｒＧｌ－Ｐｓｔｌ－切断ｐＨｙＤ４５９にアニーリングすることによって誘導された二本鎖オリゴとライゲートすることにより、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＥ１変異バリアントｐＭＢ７５８５（Ｇ５９５Ｄ）を産生した。本明細書で使用されるオリゴ並びに更なる配列は、配列表に示す。

［実施例３：サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）へのＡＲＥ１ＷＴ及び変異体遺伝子の導入］
野生型遺伝子と比較して、７－ＤＨＣ生成における変異体ＡＲＥ１遺伝子の影響を試験するために、Ｙ２１４０株を３つの異なる構築物で形質転換した：
（１）ＰＧＫ１プロモーターの制御下でのＷＴＡＲＥ１遺伝子を保有するｅｒｇ４破壊構築物並びにＰＧＫ１プロモーター及びＬＥＵ２の制御下でのＷＴＡＲＥ１遺伝子を保有するＬＥＵ２．ｏｎ構築物であるプラスミドｐＨｙＤ４５９のＳａｌＩ断片；
（２）ＰＧＫ１プロモーターの制御下でのａｒｅ１Ｆ５９２Ｌ遺伝子及びＰＧＫ１プロモーター及びＬＥＵ２の制御下でのＬＥＵ２ａｒｅ１Ｆ５９２Ｌ遺伝子を保有するｅｒｇ４破壊構築物であるプラスミドｐＭＢ７５８４のＳａｌＩ断片；
（３）ＰＧＫ１プロモーターの制御下でのａｒｅ１Ｇ５９５Ｄ遺伝子及びＰＧＫ１プロモーター及びＬＥＵ２の制御下でのＬＥＵ２ａｒｅ１Ｇ５９５Ｄ遺伝子を保有するｅｒｇ４破壊構築物であるプラスミドｐＭＢ７５８５のＳａｌＩ断片。

形質転換株を（最少培地）で３０℃において選択し、ハイグロマイシン感度に対してスクリーニングした。これらの形質転換から生じた株を上記の表１に挙げる。続いて、以下の実施例４に記載のように、これらの株をその７－ＤＨＣ生産性及び７－ＤＨＣステロール総純度に関してアッセイした。

［実施例４：ＡＲＥ変異株におけるステロールのＨＰＬＣ分析］
試験される株を最初にＹＰＤ寒天上にプレーティングし、３０℃において４８時間インキュベートした。ＹＰＤ前培養物２ｍＬをこれらのプレートから接種し、３０℃において２４時間ローラーホイール上で増殖させた。２４穴マイクロタイタープレートにおいて、前培養物からＹＰＤ０．８ｍＬ＋エタノール１０ｇ／Ｌを最終ＯＤ_６０００．５に接種した。マイクロタイタープレートを加湿環境内で３０℃において増殖し、軌道３ｍｍの振盪機で８００ｒｐｍにおいて振盪した。接種から２４及び４８時間後、エタノール１６μｌをそれぞれのウェルにフィード（ｆｅｅｄ）として添加した。接種から７２時間後、ステロール含有量に関して細胞をサンプリングした。

培養物からステロールを抽出するために、ガラスビーズを有する２ｍＬＰｒｅｃｅｌｌｙｓチューブに全ブロス８０マイクロリットルをピペットで移した。けん化溶液（エタノール中の５％ＫＯＨ）８００マイクロリットルを添加し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４ホモジナイザーに試料を入れ、１５秒／サイクルにおいて６５００ｒｐｍで３サイクル、攪拌した。次いで、氷酢酸６０マイクロリットルを添加し、最高速度でチューブを１分間遠心した。ステロール含有量に関して、ＨＰＬＣによって上澄をアッセイした（表３を参照されたい）。

種々のサッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｒｅ１変異体をスクリーニングした結果、本発明者らは、発現した場合に多くのＡｒｅ１変異体が高い総生産性で７－ＤＨＣを産生すること、ステロール副産物（チモステロール、ラトステロール、ラノステロール、コレスタ－８－エノール等）の蓄積が少ないこと又はその両方を見出した。

Claims

ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する、ＥＣ２．３．１．２６から選ばれる修飾酵素であって、
１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、
配列番号１によるポリペプチドにおける５９２の位置、又は、哺乳動物、酵母若しくは植物ステロールアシルトランスフェラーゼ１（ＡＲＥ１）における対応する位置、のアミノ酸がロイシンであり、
及び／又は
配列番号１によるポリペプチドにおける５９５の位置、又は、哺乳動物、酵母若しくは植物ステロールアシルトランスフェラーゼ１（ＡＲＥ１）における対応する位置、のアミノ酸がアスパラギン酸である、修飾酵素。
前記アミノ酸置換が、Ｆ５９２Ｌ及び／又はＧ５９５Ｄから選ばれる請求項１に記載の修飾酵素。
請求項１又は２に記載の修飾酵素を含む、ステロール産生酵母。
チモステロール及び７－ＤＨＣを含むステロールミックス中のチモステロールのパーセンテージを低減するプロセスであって、適切な条件下において、請求項３に記載の酵母を培養することを含むプロセス。
７－ＤＨＣ及びチモステロールを含むステロールミックス中の７－ＤＨＣのパーセンテージを増加させるプロセスであって、適切な条件下において、請求項３に記載の酵母を培養することを含むプロセス。
前記ステロールミックスから前記７－ＤＨＣを単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項４又は５に記載のプロセス。
請求項３に記載の酵母を用いる、チモステロール及び７－ＤＨＣを含むステロールミックスへのアセチル－ＣｏＡの酵素的変換を含む、７－ＤＨＣの生成のプロセスであって、前記ステロールミックス中の７－ＤＨＣのパーセンテージは、少なくとも７０％である、プロセス。
前記７－ＤＨＣは、ビタミンＤ３に更に変換され、及び／又は、２５－ヒドロキシビタミンＤ３に更に変換される、請求項７に記載のプロセス。
７－ＤＨＣの生成のプロセスにおける、請求項１又は２に記載の修飾酵素又は請求項３に記載の酵母の使用であって、前記７－ＤＨＣは、チモステロール及び７－ＤＨＣを含むステロールミックスから単離され、チモステロールに対する７－ＤＨＣの比は、それぞれの非修飾酵素及び宿主細胞を用いたプロセスとそれぞれ比較して少なくとも１５％増加される、使用。