BR112020023394A2

BR112020023394A2 - esterol aciltransferases modificadas

Info

Publication number: BR112020023394A2
Application number: BR112020023394-3A
Authority: BR
Inventors: Christopher Mark Farrell; Lisa Ann Laprade; Otto Martin Lehmann; Joshua Trueheart
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2021-02-09
Also published as: EP3797159A1; JP7460540B2; CN112752841A; EA202092799A1; JP2021523692A; CN112752841B; US20210115412A1; WO2019224187A1; US12227772B2

Abstract

A presente invenção se refere a enzimas esterol aciltransferase modificadas com atividade e/ou especificidade aprimorada em relação à acilação do precursor de vitamina D3 7-desidrocolesterol (7-DHC) a ser usado na produção biotecnológica da vitamina D3. A invenção se refere adicionalmente a uma cepa de levedura que expressa as ditas enzimas modificadas e seu uso em um processo para produção de vitamina D3 ou derivados e/ou metabólitos da mesma.

Description

“ESTEROL ACILTRANSFERASES MODIFICADAS”

[0001] A presente invenção se refere a enzimas esterol aciltransferase modificadas com atividade e/ou especificidade aprimorada em relação à acilação do precursor de vitamina D3 7-desidrocolesterol (7-DHC) a ser usado na produção biotecnológica da vitamina D3. A invenção se refere adicionalmente a uma cepa de levedura que expressa as ditas enzimas modificadas e seu uso em um processo para produção de vitamina D3 ou derivados e/ou metabólitos da mesma.

[0002] A vitamina D3 (também conhecida como colecalciferol ou calciol) pode ser sintetizada na pele de mamíferos a partir da pró-vitamina D3 (também conhecida como 7-desidrocolesterol ou 7-DHC) que é produto da biossíntese de colesterol mediante a exposição à luz UV, através disso, 7-DHC é fotoquimicamente convertido em pró-vitamina D3, que isomeriza à temperatura corporal na forma biologicamente ativa de vitamina D3. No fígado, a vitamina D3 é convertida em 25-hidroxivitamina D3 biologicamente ativa (também conhecida como calcidiol, calcifediol, 25- hidroxicolecalciferol, 25-OH-D3 ou HyD), que é a principal forma circulante da vitamina D3. Hidroxilação adicional ocorre no rim.

[0003] Para produção industrial de vitamina D3, a síntese tanto química quanto biotecnológica está disponível (em princípio). A síntese química começa com o colesterol isolado de, por exemplo, gordura de lã que é desidrogenada em 7-DHC, um intermediário importante tanto na síntese química quanto na síntese biotecnológica. Através da exposição por luz UV e outras etapas de purificação/extração, 7-DHC é convertido em vitamina D3. As cepas de levedura modificadas podem ser usadas para biossíntese de 7-DHC, em que acetil-CoA é convertido em um processo enzimático de múltiplas etapas em 7-DHC. A dita conversão enzimática ocorre no retículo endoplasmático da levedura. Quantidades excessivas de esteróis, incluindo 7-DHC e precursores do mesmo, não necessários nas membranas celulares, são tóxicas à levedura e são, desse modo, armazenadas como ésteres esterílicos em organelas intracelulares (assim chamadas corpos lipídicos) a partir das quais podem ser adicionalmente isoladas. O equilíbrio entre esteróis livres e aqueles armazenados nos corpos lipídicos (principalmente na forma de ésteres esterílicos) é desencadeado pela ação de várias proteínas (enzimas), incluindo a ação de esterol aciltransferases. Em levedura, particularmente Saccharomyces cerevisiae, a formação de éster de esteróis é principalmente realizada pelas duas esterol aciltransferases Are1p e Are2p.

[0004] Devido à ação inespecífica das ditas enzimas esterol aciltransferases, o agrupamento de ésteres esterílicos que é armazenado dentro dos corpos lipídicos é relativamente diverso, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, ésteres de ergosterol, zimosterol, lanosterol, latosterol, colesta-5,7,24(25)-trienol ou 7-DHC. Já que apenas colesta-5,7,24(25)-trienol, um precursor para 7-DHC, e não zimosterol, pode ser usado para síntese de vitamina D3, há uma necessidade de armazenamento seletivo de ésteres específicos, como, por exemplo, ésteres de 7-DHC, nos corpos lipídicos e/ou de aumento do turnover de intermediários de 7-DHC produzidos por tais cepas de levedura que são adicionalmente convertidas em vitamina D3 e/ou derivados ou metabólitos da mesma. Um metabólito particular que também é o foco da presente invenção é 25-hidroxivitamina D3.

[0005] Assim, uma tarefa em andamento consiste em gerar células hospedeiras, como levedura capaz de produzir esteróis, com alta produtividade/especificidade para 7-DHC e/ou acúmulo reduzido de produtos colaterais/intermediários incluindo zimosterol, lanosterol ou latosterol, em particular, ésteres de tais intermediários armazenados nos corpos lipídicos.

[0006] Surpreendentemente, constatou-se agora que a especificidade da atividade de esterol aciltransferase na célula hospedeira pode ser deslocada para 7-DHC por meio de introdução de certas substituições de aminoácidos na sequência de ARE2 e/ou ARE1, o que resultará em uma maior produtividade e/ou razão de produto da célula hospedeira em relação à 7-DHC como um intermediário importante na produção de vitamina D3.

[0007] Assim, a presente invenção se refere a enzimas modificadas com atividade de esterol aciltransferase, isto é, esterol aciltransferases modificadas, particularmente atividade de isoforma de esterol aciltransferase Are1p e/ou Are2p, que compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição ou em posições correspondentes a resíduos selecionados a partir de 592 e/ou 595 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, sendo que a enzima modificada aumentou a especificidade em relação à 7-DHC em produtos colaterais/intermediários, incluindo zimosterol.

[0008] O polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, que mostra atividade de ARE1, incluindo polinucleotídeos que codificam tal polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, foi isolado de Saccharomyces cerevisiae. O polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:3, que mostra atividade de ARE2, incluindo polinucleotídeos que codifica tal polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO:3, foi isolado de Saccharomyces cerevisiae.

[0009] Os termos "esterol aciltransferase", "aciltransferase", "ARE", "enzima que tem atividade de aciltransferase" ou apenas "enzima" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a enzimas [EC 2.3.1.26], isto é, aciltransferases que transferem grupos acila graxa de uma molécula para outra. Tal transferência ou atividade enzimática pode ser medida por meios conhecidos pela pessoa versada na técnica. Esterol aciltransferases foram isoladas de diferentes origens, incluindo mamíferos, levedura ou plantas. Tanto ARE1 quanto ARE2 são capazes de acilar esteróis, como, por exemplo, zimosterol e/ou 7-DHC nos respectivos ésteres. Como usado no presente documento, uma enzima "modificada", isto é, aciltransferase modificada, tem uma atividade e/ou especificidade preferencial em relação à esterificação de 7- DHC em comparação com a esterificação de, por exemplo, zimosterol, e/ou formação aprimorada de ésteres de esterol totais, incluindo, por exemplo, 7-DHC ou zimosterol. As isoformas de aciltransferase preferenciais são Are1p ou Are2p. Uma esterol aciltransferase "não modificada", particularmente ARE1 e ARE2, como usado no presente documento se refere às respectivas enzimas endógenas que não portam uma ou mais substituições de aminoácidos como definido no presente documento.

[0010] Como usado no presente documento, uma célula hospedeira que porta uma atividade de esterol aciltransferase modificada como definido no presente documento, particularmente ARE2 e/ou ARE1 que compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos como definido no presente documento, é denominada célula hospedeira "modificada". A respectiva célula hospedeira que porta uma atividade de esterol aciltransferase não modificada, isto é, que codifica os genes de ARE1 e/ou ARE2 do tipo selvagem, é denominada célula hospedeira "não modificada".

[0011] Como usado no presente documento, os termos "zimosterol", "lanosterol", "latosterol", "colesta- 5,8,24(25)-trienol", "colesta-5,7,24(25)-trienol" ou "7- DHC" que especificam intermediários de vitamina D3 incluem tanto a forma livre quanto a forma de éster dos ditos compostos. Como usado no presente documento, uma mistura de esteróis contém 7-DHC e "produtos colaterais" ou intermediários, incluindo, porém sem limitação, zimosterol, lanosterol, latosterol, colesta-5,8,24(25)-trienol ou colesta-5,7,24(25)-trienol.

[0012] Como usado no presente documento, uma "levedura produtora de colesterol" não pode mais produzir ergosterol, mas os produtos de colesterol, incluindo, porém sem limitação, colesta-5,7,24(25)-trienol, colesta-5,8,24(25)- trienol, colesta-7,24(25)-dienol, 7-DHC ou zimosterol. Particularmente, isso pode ser alcançado através da introdução de inativação dupla de erg5erg6.

[0013] Em uma modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 592 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de fenilalanina por leucina (F592L). Preferencialmente, a enzima que tem atividade de ARE1 modificada é originada de Saccharomyces, como S. cerevisiae. Com o uso da dita enzima ARE1 modificada, a razão entre 7-DHC e zimosterol na mistura de esteróis poderia ser aumentada em pelo menos cerca de 15 % em comparação a uma cepa que expressa a ARE1 endógena não modificada.

[0014] Em uma modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 595 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de fenilalanina por leucina (G595D). Preferencialmente, a enzima que tem atividade de ARE1 modificada é originada de Saccharomyces, como S. cerevisiae. Com o uso da dita enzima ARE1 modificada, a razão entre 7-DHC e zimosterol na mistura de esteróis poderia mais do que dobrar, isto é, ser aumentada em pelo menos cerca de 55 % em comparação a uma cepa que expressa a ARE1 endógena não modificada.

[0015] Em uma modalidade adicional, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE2 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 624 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:3, preferencialmente substituição de fenilalanina por leucina (F624L). Preferencialmente, a enzima que tem atividade de ARE2 modificada é originada de Saccharomyces, como S. cerevisiae. Com o uso da dita enzima ARE2 modificada, a razão entre 7- DHC e zimosterol na mistura de esteróis poderia ser aumentada em pelo menos cerca de 15 % em comparação a uma cepa que expressa a ARE2 endógena não modificada.

[0016] Em uma modalidade adicional, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE2 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 627 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:3, preferencialmente substituição de glicina por ácido aspártico (G627D). Preferencialmente, a enzima que tem atividade de ARE2 modificada é originada de Saccharomyces, como S. cerevisiae. Com o uso da dita enzima ARE2 modificada, a razão entre 7- DHC e zimosterol na mistura de esteróis poderia ser aumentada em pelo menos cerca de 15 % em comparação a uma cepa que expressa a ARE2 endógena não modificada.

[0017] A substituição de aminoácidos (ou substituições de aminoácido) descrita em uma posição correspondente ao resíduo F592L e/ou G595D na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo de aminoácido (ou resíduos de aminoácido) 624 e/ou 627 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:3 e como descrito no presente documento. Preferencialmente, a substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo F592L na SEQ ID NO:1 pode ser combinado com substituições adicionais, como substituições de aminoácidos na posição (ou posições) correspondente a G595D na SEQ ID NO:1 e/ou F624L na SEQ ID NO:3 e/ou G627D na SEQ ID NO:3. Uma enzima modificada preferencial é uma enzima que tem atividade de ARE1 e compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente a G595D na SEQ ID NO:1, que mostra títulos de 7-DHC pelo menos cerca de 30, 35, 40, 45 % maiores, pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30 % menos zimosterol na mistura de esteróis com um percentual de 7-DHC na mistura de esteróis de cerca de 70-76 %.

[0018] Como usado no presente documento, a atividade de ARE1 e/ou ARE2 é modificada. Isso pode ser alcançado, por exemplo, introduzindo (uma) mutação (ou mutações) no gene endógeno que codifica ARE1 e/ou ARE2, isto é, substituição de aminoácidos (ou substituições de aminoácidos) em uma ou mais posições como descrito no presente documento. A pessoa versada na técnica sabe como manipular geneticamente uma célula de levedura, resultando em modificação de atividade de ARE1 e/ou ARE2. Essas manipulações genéticas incluem, porém sem limitação, por exemplo, substituição de gene, amplificação de gene, rompimento de gene, transfecção, transformação com uso de plasmídeos, vírus ou outros vetores.

[0019] A geração de uma mutação em ácidos nucleicos ou aminoácidos, isto é, mutagênese, pode ser realizada de formas diferentes, como, por exemplo, por mutagênese aleatória ou lateral, danos físicos provocados por agentes, como, por exemplo, radiação, tratamento químico ou inserção de elemento genético. A pessoa versada sabe como introduzir as mutações.

[0020] A presente invenção é particularmente direcionada ao uso de tais enzimas ARE1 e/ou ARE2 modificadas como definido no presente documento em um processo para a produção de 7-DHC, um intermediário para a vitamina D3. Preferencialmente, as enzimas modificadas da presente invenção são introduzidas e/ou expressas em uma célula hospedeira adequada, como levedura, preferencialmente levedura produtora de esterol, em particular célula de levedura produtora de colesterol, como selecionado a partir de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Klyuveromyces spp., Hansenula spp. ou Yarrowia lipolytica, preferencialmente S. cerevisiae. O hospedeiro modificado é usado para produção de 7-DHC, que pode ser adicionalmente convertido em vitamina D3 e/ou 25- hidroxivitamina D3.

[0021] Uma célula hospedeira adequada pode ser adicionalmente modificada para aumentar adicionalmente a produção de 7-DHC, um intermediário importante para a biossíntese de vitamina D3 e/ou reduzir o acúmulo de produtos colaterais.

[0022] Assim, em uma modalidade, a invenção é direcionada a uma cepa de levedura que tem atividade de ARE1 e/ou ARE2 modificada e, adicionalmente, em que ERG5 e ERG6 são inativadas. A célula de levedura pode ser adicionalmente modificada através da expressão de uma enzima heteróloga que tem atividade de C24-redutase, particularmente selecionada a partir de EC 1.3.1.72, como uma C24-redutase heteróloga que está ativa em colesta-7,24-dienol, zimosterol ou trienol (por exemplo, colesta-5,7,25-trienol), de preferência, uma esterol Δ24-redutase de planta ou vertebrado, com mais preferência, a partir de fonte de vertebrados, ainda com mais preferência, a partir de ser humano, porco, cão, camundongo, rato, cavalo, Danio rerio ou qualquer fonte conhecida, desde que possa ser expressa dentro da dita célula de levedura. Com máxima preferência, a esterol Δ24-redutase é selecionada a partir de Danio rerio, rato ou ser humano.

As sequências que expressam as ditas enzimas esterol Δ24- redutase estão publicamente disponíveis, incluindo, porém sem limitação, UniProtKB/Swiss-Prot referência Q15392, Q60HC5, Q8VCH6, Q5BQE6, Q39085 ou P93472 (consulte, por exemplo, o documento WO2003064650). Com o uso de tal cepa de levedura, o percentual de 7-DHC presente na mistura de esteróis está na faixa de cerca de 70 ou mais, preferencialmente como 75, 80, 88, 90, 95, 98 % com base na quantidade total de esteróis.

[0023] Em outra modalidade, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção pode ser adicionalmente modificada por meio de introdução de homólogos de enzimas endógenas envolvidas na biossíntese de 7-DHC, como, por exemplo, C5- esterol desaturase (ERG3) e/ou C8-esterol isomerase (ERG2), resultando em especificidade e/ou produtividade aumentada de 7-DHC com acúmulo reduzido de produtos colaterais ou intermediários de vitamina D3, incluindo, porém sem limitação, zimosterol, lanosterol e/ou latosterol. Preferencialmente, a célula hospedeira modificada como definido no presente documento compreende uma ERG2 e/ou ERG3 heteróloga, em que a ERG2 é preferencialmente selecionada a partir de Ustilago maydis (sequência derivada de UniProtKB P32360), e/ou em que a ERG3 é preferencialmente selecionada a partir de Pichia pastoris (sequência derivada de UniProtKB C4QY87) ou Schizosaccharomyces pombe (sequência derivada de UniProtKB O94457). As cepas que compreendem ambos os homólogos de ERG2 e ERG3 juntamente com as ARE1 e/ou ARE2 modificadas como definido no presente documento produzem uma mistura de esteróis com mais de cerca de 80 % de percentual de 7-DHC e razão entre 7-DHC e colesta-8-enol e/ou latosterol aumentada em pelo menos cerca de 15 a 20 %. É ainda mais preferencial uma cepa modificada como definido no presente documento que compreenda adicionalmente duas ou mais cópias de homólogos de ERG2 e/ou ERG3 como descrito acima.

[0024] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a um processo para melhorar uma célula hospedeira em relação à produção de 7-DHC, em que uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento, isto é, modificada por meio de introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos em esterol aciltransferases ARE1 e/ou ARE2 como definido no presente documento, em particular uma célula de levedura produtora de colesterol, preferencialmente uma célula de levedura em que ERG5 e ERG6 são inativadas e em que, opcionalmente, uma enzima heteróloga que tem atividade de C-24-redutase como definido no presente documento é expressa, e/ou em que, opcionalmente, homólogos de ERG2 e/ou ERG3 endógenas são expressos, sendo que a célula hospedeira é aprimorada de tal modo que o percentual de 7-DHC na quantidade total de esterol produzido pela dita célula hospedeira seja aumentado para cerca de pelo menos 70, 75, 80 %, preferencialmente 88, 90, 95, 98 %, em particular em que a razão entre 7-DHC e produtos colaterais, incluindo zimosterol e colesta-8-enol, é aumentada em pelo menos cerca de 5, 10, 15, 18, 20, 25 % e em comparação a uma cepa de levedura que expressa a atividade de ARE1 e/ou ARE2 não modificada, isto é, do tipo selvagem.

[0025] Em um aspecto da presente invenção, uma célula hospedeira que compreende atividade de ARE1 e/ou ARE2 modificadas como definido no presente documento é usada em um processo para produção de precursor de vitamina D3 7-DHC.

A célula hospedeira modificada pode ser cultivada em um meio aquoso suplementado com nutrientes adequados sob condições aeróbicas ou anaeróbicas e como conhecido pela pessoa versada na técnica para as respectivas células hospedeiras produtoras de colesterol. Opcionalmente, tal cultivo é na presença de proteínas e/ou cofatores envolvidos na transferência de elétrons, como conhecido na técnica. O cultivo/crescimento da célula hospedeira pode ser conduzido na batelada, batelada alimentada, modo semicontínuo ou contínuo. Dependendo da célula hospedeira, de preferência, a produção de vitamina D3 e precursores da mesma, como 7- DHC, pode variar, como é conhecido pela pessoa versada. O cultivo e o isolamento de 7-DHC e outros intermediários na produção de vitamina D3 são descritos, por exemplo, nos documentos WO2011067144 ou WO2017108799. A 7-DHC pode ser isolada e/ou opcionalmente mais purificada a partir da mistura de esteróis e pode ser adicionalmente convertida em vitamina D3 e/ou 25-hidroxivitamina D3 com o uso de métodos conhecidos na técnica.

[0026] Com o uso de uma célula hospedeira como descrito no presente documento, a especificidade de substrato de atividade de esterol aciltransferase poderia ser deslocada para 7-DHC, resultando em um percentual de pelo menos cerca de 70 % de 7-DHC nos esteróis totais produzidos pela dita célula hospedeira, com títulos de até cerca de 10 g/l ou mais de 7-DHC produzida após cerca de 100 h de fermentação sob condições de cultura adequadas.

[0027] Os termos "ARE1" e "Are1p", "ARE2" e "Are2p", "ERG5" e "Erg5p", "ERG6" e "Erg6p" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a um polipeptídeo codificado pelos respectivos genes are1, are2, erg5 e erg6. Para o propósito da presente invenção, a célula de levedura produtora de colesterol é modificada de tal modo que de fato mostre atividade modificada de ARE1 e/ou ARE2, por exemplo, realize uma modificação em qualquer uma das ARE1, ARE2 endógenas ou ambas, resultando em especificidade modificada de ARE1 e/ou ARE2, em que a dita modificação é alcançada por meio da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos como definido no presente documento.

[0028] Os genes que codificam ERG5, ERG6, ARE1, ARE2, ERG2, ERG3 ou esterol Δ24-redutase (ERG4), cultivo e engenharia genética da célula de levedura como usado no presente documento são conhecidos e descritos, por exemplo, no documento US 7608421.

[0029] Como usado no presente documento, os termos "C-24- redutase" ou "Δ24-redutase" são usados intercambiavelmente no presente documento. Em levedura, essa enzima é codificada por erg4 e está ativa no grupo metila do átomo de carbono na posição 24. Trienol, que não exibe tal grupo metila na dita posição, não é, portanto, um substrato aceitável para a levedura ERG4.

[0030] Os termos "C-8 esterol isomerase", "delta 8,7- isomerase" ou "enzima que tem C-8 esterol isomerase" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a enzimas que são capazes de catalisar a conversão de colesta-8-enol em colesta-7-enol e/ou zimosterol em colesta-7,24-dienol. Em levedura, essa enzima é codificada por erg2. Um homólogo de ERG2 preferencial a ser usado em uma célula hospedeira modificada de acordo com a presente invenção é um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 41 %,

como, por exemplo, pelo menos 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:5 que mostra atividade de C-8 esterol isomerase e incluindo polinucleotídeos que codificam tal polipeptídeo, obtenível junto à Ustilago maydis. Particularmente, 1 ou mais cópias, como pelo menos cerca de 1, 2, 3, 5, do dito homólogo de ERG2 são expressas em uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento.

[0031] Os termos "C-5 esterol desaturase", "enzima que tem C-5 esterol desaturase" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a enzimas que são capazes de catalisar a conversão de colesta-8-enol em colesta-7,24- dienol e/ou colesta-7-enol em colesta-5,7,24-trienol e/ou 7- DHC. Em levedura, essa enzima é codificada por erg3. Um homólogo de ERG3 preferencial a ser usado em uma célula hospedeira modificada de acordo com a presente invenção é um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 45 %, como, por exemplo, pelo menos 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:7 que mostra atividade de C-5 esterol desaturase e incluindo polinucleotídeos que codificam tal polipeptídeo, obtenível junto à Pichia pastoris ou Schizosaccharomyces pombe. Particularmente, 1 ou mais cópias, como pelo menos 1, 2, 3, 5, do dito homólogo de ERG3 são expressas em uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento.

[0032] Os termos "identidade de sequência", "% de identidade" são usados intercambiavelmente no presente documento. Para o propósito desta invenção, é definido aqui que, para determinar a percentagem de identidade de sequência de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideal.

De modo a otimizar o alinhamento entre as duas sequências, podem ser introduzidas lacunas em qualquer uma das duas sequências que são comparadas.

Esse alinhamento pode ser realizado ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas.

Alternativamente, o alinhamento pode ser realizado ao longo de um comprimento menor, por exemplo, ao longo de cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucleicos/bases ou aminoácidos.

A identidade de sequência é a porcentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências ao longo da região alinhada relatada.

A identidade de sequência em porcentagem entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada com o uso do algoritmo Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências (Needleman, S.

B. e Wunsch, C.

D. (1970) J.

Mol.

Biol. 48, 443-453). Ambas dentre as sequências de aminoácidos e sequências de nucleotídeos podem ser alinhadas pelo algoritmo.

O algoritmo de Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE.

Para os propósitos da presente invenção, foi usado o programa NEEDLE do pacote EMBOSS (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, Longden and Bleasby, Trends in Genetics 16, (6) páginas 276—277, http://emboss.bioinformatics.nl/). É usado EBLOSUM62 para as sequências de proteínas para a matriz de substituição.

Para a sequência de nucleotídeos, é usado EDNAFULL.

Os parâmetros opcionais usados têm uma penalidade de abertura de lacunas de 10 e penalidade de extensão de lacuna de 0,5. Um técnico no assunto compreenderá que todos estes parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a porcentagem total de identidade de duas sequências não é significativamente alterada quando são usados diferentes algoritmos.

[0033] Após o alinhamento pelo programa NEEDLE como descrito acima, a porcentagem de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência da invenção é calculada como a seguir: número de posições correspondentes no alinhamento que mostra um aminoácido idêntico ou um nucleotídeo idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após a subtração do número total de vãos no alinhamento. A identidade como definido no presente documento pode ser obtida a partir de NEEDLE através do uso da opção NOBRIEF e é etiquetada na saída do programa como "identidade mais longa". Se ambas as sequências de aminoácidos que são comparadas não diferirem em que qualquer um dos seus aminoácidos, as mesmas são idênticas ou têm 100 % de identidade. Em relação às enzimas originadas a partir de plantas como definido no presente documento, o elemento versado na técnica está ciente de que enzimas derivadas de planta podem conter um sinal de direcionamento de cloroplasto deve ser clivado através de enzimas específicas, como, por exemplo, enzimas de processamento de cloroplasto (CPEs).

[0034] As enzimas ARE2 e ARE1/homólogos, como definido no presente documento também abrangem enzimas que portam substituição de aminoácidos (ou substituições de aminoácido) que não alteram a atividade enzimática, isto é, que mostram as mesmas propriedades em relação à enzima do tipo selvagem e catalisam a acilação de esteróis como definido no presente documento. Tais mutações são denominadas também “mutações silenciosas”, que não alteram a atividade (enzimática) das enzimas como descrito no presente documento.

[0035] Como usado no presente documento, o termo "atividade específica" ou "atividade" em relação às enzimas significa sua atividade catalítica, isto é, sua habilidade de catalisar a formação de um produto a partir de um determinado substrato. A atividade específica define a quantidade de substrato consumida e/ou produto produzido em um determinado período de tempo e por quantidade definida de proteína em uma temperatura definida. Tipicamente, a atividade específica é expressa em µmol de substrato consumido ou produto formado por min por mg de proteína. Tipicamente, µmol/min é abreviado por U (= unidade). Portanto, as definições de unidade para atividade específica de µmol/min/(mg de proteína) ou U/(mg de proteína) são usadas de modo intercambiável ao longo desse documento. Uma enzima é ativa, se realizar sua atividade catalítica in vivo, isto é, na célula hospedeira como definido no presente documento ou em um sistema adequado (sem células) na presença de um substrato adequado. A pessoa versada sabe como medir a atividade de enzima, como, por exemplo, por HPLC.

[0036] Em relação à presente invenção, entende-se que os organismos, como, por exemplo, microrganismos, fungos, algas ou plantas, incluem também sinônimos ou basônimos de tais espécies que têm as mesmas propriedades fisiológicas, como definido pelo Código Internacional de Nomenclatura de Procariotas ou pelo Código Internacional de Nomenclatura para algas, fungos e plantas (Código de Melbourne).

[0037] Em particular, a presente invenção apresenta as presentes modalidades:

[0038] (1) Uma enzima modificada que tem atividade de esterol aciltransferase que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em (uma) posição (ou posições) correspondente a resíduos selecionados a partir de 592 e/ou 595 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente a substituição correspondente à F592L e/ou G595D.

[0039] (2) Uma enzima modificada como definido no presente documento e como da modalidade (1) que catalisa a esterificação de esteróis que compreende 7-desidrocolesterol (7-DHC) e zimosterol, em que a razão entre 7-DHC e zimosterol nos ésteres de esterol é aumentada em pelo menos cerca de 15 % em comparação com a razão entre 7-DHC e zimosterol na catálise com o uso da respectiva enzima não modificada.

[0040] (3) Uma enzima modificada como definido no presente documento e como da modalidade (1) ou (2), em que a substituição de aminoácidos é selecionada a partir de G595D.

[0041] (4) Uma célula hospedeira, preferencialmente uma levedura, mais preferencialmente uma levedura produtora de esterol, ainda mais preferencialmente uma levedura produtora de colesterol, que compreende uma enzima modificada como definido no presente documento e como das modalidades (1), (2), (3).

[0042] (5) Uma célula hospedeira como definido no presente documento e como da modalidade (4) usada para a produção de uma mistura de esteróis que compreende 7-DHC e zimosterol, em que a razão entre 7-DHC e zimosterol é aumentada em pelo menos cerca de 15 % em comparação a uma célula hospedeira que expressa uma enzima não modificada.

[0043] (6) Uma célula hospedeira como definido no presente documento e como da modalidade (4) ou (5), em que ERG5 e ERG6 são inativadas.

[0044] (7) Uma célula hospedeira como definido no presente documento e como da modalidade (4), (5), (6), em que a célula expressa uma enzima heteróloga selecionada a partir de EC 1.3.1.72 que tem atividade de esterol Δ24- redutase, preferencialmente em que a enzima heteróloga é originada de planta ou animal vertebrado, mais preferencialmente originada de ser humano, porco, cão, camundongo, rato, cavalo ou Danio rerio.

[0045] (8) Uma célula hospedeira como definido no presente documento e como das modalidades (4), (5), (6), (7), em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula, e Yarrowia, preferencialmente selecionada a partir de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp. ou Yarrowia lipolytica.

[0046] (9) Um processo para reduzir o percentual de zimosterol em uma mistura de esteróis que compreende zimosterol e 7-DHC que compreende cultivar uma célula hospedeira como definido no presente documento e como das modalidades (4), (5), (6), (7), (8) sob condições adequadas e opcionalmente isolar e/ou purificar a 7-DHC da mistura de esteróis.

[0047] (10) Um processo para aumentar o percentual de 7- DHC em uma mistura de esteróis que compreende 7-DHC e zimosterol que compreende cultivar uma célula hospedeira como definido no presente documento e como das modalidades (4), (5), (6), (7), (8) sob condições adequadas e opcionalmente isolar e/ou purificar a 7-DHC da mistura de esteróis.

[0048] (11) Um processo para a produção de 7-DHC que compreende a conversão enzimática de acetil-CoA em uma mistura de esteróis que compreende zimosterol e 7-DHC com uma célula hospedeira como definido no presente documento e como das modalidades (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), em que o percentual de 7-DHC na mistura de esteróis é de pelo menos cerca de 70 %.

[0049] (12) Um processo como definido no presente documento e como da modalidade (11), em que a 7-DHC é adicionalmente convertida em vitamina D3.

[0050] (13) Um processo como definido no presente documento e como da modalidade (11) ou (12), em que a 7-DHC é adicionalmente convertida em 25-hidroxivitamina D3.

[0051] (14) Uso de uma enzima modificada como definido no presente documento e como das modalidades (1), (2), (3) ou uma célula hospedeira como definido no presente documento e como das modalidades (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), em um processo para a produção de 7-DHC, em que a 7-DHC é isolada de uma mistura de esteróis que compreende zimosterol e 7-DHC, e em que a razão entre 7-DHC e zimosterol é aumentada em pelo menos cerca de 15 % em comparação a um processo que usa a respectiva enzima não modificada e a célula hospedeira, respectivamente.

[0052] Os exemplos a seguir são ilustrativos somente e não se destinam a limitar o escopo da invenção de modo algum. Exemplos

Exemplo 1: Métodos gerais, cepas e plasmídeos

[0053] Todos os procedimentos de biologia molecular básica e manipulação de DNA descritos no presente documento foram, em geral, realizados de acordo com Sambrook et al. (1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nova York) ou Ausubel et al. (1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: Nova York). Os genótipos dos plasmídeos e cepas S. cerevisiae usados são listados nas Tabelas 1 e 2. A cepa produtora de 7-DHC de Saccharomyces cerevisiae Y2140 foi construída a partir de uma cepa antecedente CEN.PK do tipo selvagem. Nessa cepa do tipo selvagem, um cassete de disrupção de erg5 foi transformada, o qual continha um gene otimizado por códon para uma esterol 24-redutase de peixe-zebra flanqueada por um promotor PGK1 e um terminador CYC1 em combinação com TRP1. Subsequentemente, um cassete de disrupção de erg6 foi transformado, o qual continha o gene para uma esterol 24- redutase de rato flanqueada por um promotor TDH3 e um terminador PGK1 em combinação com LEU2. Todas as cepas mencionadas são MATα, e portam uma cópia superexpressa do gene de HMG-CoA redutase truncado constitutivamente ativo (tHMG1). Tabela 1: Cepas de Saccharomyces cerevisiae. Y2159 erg5Δ::PGK1p-S24R2-CYC1t- Técnicas TRP1 erg6Δ::TDH3p-S24R1- moleculares e PGK1t-URA3 erg4Δ:: HygR genéticas TDH3p-tHMG1 clássicas e padrão Y2017 erg5Δ::PGK1p-S24R2-CYC1t- Substituição TRP1 erg6Δ::TDH3p-S24R1- direcionada com PGK1t-URA3 erg4Δ::PGK1p- cassete de LEU2 Scer-ARE1-CYC1t-LEU2 TDH3p- tHMG1

Y2157 erg5Δ::PGK1p-S24R2-CYC1t- Substituição TRP1 erg6Δ::TDH3p-S24R1- direcionada com PGK1t-URA3 erg4Δ::PGK1p- cassete de LEU2 Scer-are1 F592L-CYC1t-LEU2 TDH3p-tHMG1 Y2159 erg5Δ::PGK1p-S24R2-CYC1t- Substituição TRP1 erg6Δ::TDH3p-S24R1- direcionada com PGK1t-URA3 erg4Δ::PGK1p- cassete de LEU2 Scer-are1 G595D-CYC1t-LEU2 TDH3p-tHMG1 Tabela 2: plasmídeos usados para construção de mutações de ARE. "Scer" significa Saccharomyces cerevisiae. Plasmídeo Cadeia Inserto Oligos ou SEQ ID principal fonte NO pHyD459 pHyD445 Scer-ARE1 Inserção de LEU2 pMB7584 pHyD459 Scer-are1 MO10013 & 16 & 17 F592L MO10014, 19 & 20 MO10016 & MO10017 pMB7585 pHyD459 Scer-are1 MO10013 & 16 & 18 G595D MO10015 Exemplo 2: Construção de plasmídeo de ARE1-WT pHyD459

[0054] WT S. cerevisiae ARE1 foi sintetizado por DNA2.0, incorporando um sítio XbaI na extremidade 5’ (TCTAGAACAAAatg...) e um sítio PstI na extremidade 3’. Esse foi clonado em um plasmídeo de deleção de erg4∆::HygR com o uso de sítios únicos de XbaI e PstI. LEU2 foi subsequentemente usado para substituir a fração de HygR através de uma clonagem de KpnI-AgeI. Exemplo 3: Clonagem de genes mutantes de ARE1

[0055] A variante de pMB7584 mutante de ARE1 de S. cerevisiae (F592L) foi gerada pela ligação de um produto de PCR clivado por BsrGI-BsaI gerado a partir de ARE1 (oligos de acordo com a SEQ ID NO:16 & 17) com um oligo de fita dupla derivado pelo anelamento de SEQ ID NO:19 e 20 em pHyD459 clivado por BsrGI-PstI. De modo similar, a variante de pMB7585 mutante de ARE1 de S. cerevisiae (G595D) foi gerada pela ligação de um produto de PCR clivado por BsrGI-BsaI gerado a partir de ARE1 (oligos de acordo com a SEQ ID NO:16 & 18) com um oligo de fita dupla derivado pelo anelamento de SEQ ID NO:21 e 22 em pHyD459 clivado por BsrGI-PstI. Os oligos, bem como outras sequências usadas no presente documento, estão listados na listagem de sequências. Exemplo 3: Introdução de ARE1 WT e genes mutantes em Saccharomyces cerevisiae

[0056] Para testar o impacto dos genes ARE1 mutantes na produção de 7-DHC em comparação com o gene WT, a cepa Y2140 foi transformada com três diferentes construtos:

[0057] (1) um fragmento SalI de plasmídeo pHyD459 que é um construto de disrupção de erg4 que porta o gene WT ARE1 sob o controle do promotor PGK1 e LEU2 no construto que porta o gene WT ARE1 sob o controle do promoter PGK1 e LEU2;

[0058] (2) um fragmento SalI de plasmídeo pMB7584 que é um construto de disrupção de erg4 que porta o gene are1 F592L sob o controle do promotor PGK1 e gene LEU2are1 F592L sob o controle do promotor PGK1 e LEU2;

[0059] (3) um fragmento SalI de plasmídeo pMB7585 que é um construto de disrupção de erg4 que porta o gene are1 G595D sob o controle do promotor PGK1 e gene LEU2are1 G595D sob o controle do promotor PGK1 e LEU2.

[0060] Transformantes foram selecionados (em meio mínimo) a 30 °C e foram triados para sensibilidade à higromicina. As cepas resultantes dessas transformações estão listadas na

Tabela 1 acima. Essas cepas foram subsequentemente testadas quanto à sua produtividade de 7-DHC e pureza geral de 7-DHC esterol como descrito no Exemplo 4 abaixo. Exemplo 4: Análise por HPLC de esteróis em cepas mutantes de

ARE

[0061] As cepas a serem testadas foram inicialmente colocadas em placa em YPD ágar e incubadas por 48 horas a 30 °C. Duas pré-culturas de YPD em milímetros foram inoculadas a partir dessas placas e crescidas em uma roda de rolo por 24 horas a 30 °C. Em uma placa de microtitulação de 24 poços, 0,8 ml de YPD + 10 g/l de etanol foram inoculados a partir da pré-cultura para um OD600 final de 0,5. As placas de microtitulação foram crescidas a 30 °C em um ambiente umidificado e com agitação a 800 rpm em um agitador com uma órbita de 3 mm. Em 24 e 48 horas pós-inoculação, 16 µl de etanol foram adicionados a cada poço como uma alimentação. Em 72 horas pós-inoculação, as células foram amostradas quanto ao teor de esterol.

[0062] Para a extração de esteróis das culturas, oitenta microlitros de caldo integral foram pipetados em um tubo Precellys de 2 ml com esferas de vidro. Oitocentos microlitros de solução de saponificação (5 % de KOH em etanol) foram adicionados e as amostras foram colocadas em um Homogeneizador Precellys 24 e agitadas a 6500 rpm por 3 ciclos em 15 segundos por ciclo. Sessenta microlitros de ácido acético glacial foram, então, adicionados e os tubos foram centrifugados por 1 minuto na velocidade de topo. O sobrenadante foi avaliado através de HPLC quanto ao teor de esterol (consultar Tabela 3). Tabela 3: razões entre 7-DHC e intermediários de esterol selecionados em controle e cepas mutantes de ARE1 e/ou ARE2. "Lano-/lato" significa uma mistura de lanosterol e latosterol, "zim" significa zimosterol. Os números estão em mg/ml de esteróis. Mutante 7-DHC lano- Colesta-8- zim Razão Razão entre /lato enol entre 7-DHC e 7-DHC e lano/lato zim Peso de 1060 70 99 92 12 15 ARE1 are2-F624L 1090 35 122 80 14 31 are2-G627D 1141 50 140 82 14 23 are1-F592L 1240 62 143 105 14 20 are1-G595D 1448 104 152 77 19 14

[0063] Como resultado de uma triagem de vários mutantes de Are1 de S. cerevisiae, os inventores chegaram a um número de variantes de Are1 que, quando expressas, produzem 7-DHC com uma maior produtividade total, menos acúmulo de produtos colaterais de esterol (zimosterol, latosterol, lanosterol, colesta-8-enol, etc), ou ambos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Enzima modificada caracterizada por ter atividade de esterol aciltransferase que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em (uma) posição (ou posições) correspondente a resíduos selecionados a partir de 592 e/ou 595 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente a substituição correspondente à F592L e/ou G595D.

2. Enzima modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por catalisar a esterificação de esteróis que compreende 7-desidrocolesterol (7-DHC) e zimosterol, em que a razão entre 7-DHC e zimosterol nos ésteres de esterol é aumentada em pelo menos cerca de 15 % em comparação com a razão entre 7-DHC e zimosterol na catálise com o uso da respectiva enzima não modificada.

3. Enzima modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácidos é selecionada a partir de G595D.

4. Célula hospedeira, preferencialmente uma levedura, mais preferencialmente uma levedura produtora de esterol, ainda mais preferencialmente uma levedura produtora de colesterol, caracterizada por compreender uma enzima modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ser usada para produção de uma mistura de esteróis que compreende 7-DHC e zimosterol, em que a razão entre 7-DHC e zimosterol é aumentada em pelo menos cerca de 15 % em comparação a uma célula hospedeira que expressa uma enzima não modificada.

6. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que ERG5 e ERG6 são inativadas.

7. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizada pelo fato de que a célula expressa uma enzima heteróloga selecionada a partir de EC

1.3.1.72 que tem atividade de esterol Δ24-redutase, preferencialmente em que a enzima heteróloga é originada de planta ou animal vertebrado, mais preferencialmente originada de ser humano, porco, cão, camundongo, rato, cavalo ou Danio rerio.

8. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula, e Yarrowia, preferencialmente selecionada a partir de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp. ou Yarrowia lipolytica.

9. Processo para reduzir o percentual de zimosterol em uma mistura de esteróis que compreende zimosterol e 7-DHC caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 8, sob condições adequadas, e opcionalmente isolar e/ou purificar a 7-DHC da mistura de esteróis.

10. Processo para aumentar o percentual de 7-DHC em uma mistura de esteróis que compreende 7-DHC e zimosterol caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 8,

sob condições adequadas, e opcionalmente isolar e/ou purificar a 7-DHC da mistura de esteróis.

11. Processo para produção de 7-DHC caracterizado por compreender a conversão enzimática de acetil-CoA em uma mistura de esteróis que compreende zimosterol e 7-DHC com uma célula hospedeira conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 8, em que o percentual de 7-DHC na mistura de esteróis é de pelo menos 70 %.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a 7-DHC é adicionalmente convertida em vitamina D3.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a 7-DHC é adicionalmente convertida em 25-hidroxivitamina D3.

14. Uso de uma enzima modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou célula hospedeira conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado por ocorrer em um processo para a produção de 7-DHC, em que a 7-DHC é isolada de uma mistura de esteróis que compreende zimosterol e 7-DHC, e em que a razão entre 7- DHC e zimosterol é aumentada em pelo menos cerca de 15 % em comparação com um processo com o uso da respectiva enzima não modificada e célula hospedeira, respectivamente.