KR20010112396A - 트리아실글리세롤 생산을 위한 생합성 경로에 이용되는신규 효소 및 이를 코딩하는 재조합 ｄｎａ 분자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 트리아실글리세롤의 생성을 위한 생합성 경로에서 인지질로부터 디아실글리세롤로 지방산의 전달을 촉매하는 촉매하는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 단리, 확인 및 특성화와 상기 효소 및 트리아실글리세롤 생산 방법에 관한 것이다.
Description
트리아실글리세롤 (TAG)는 자연계에서 가장 일반적인 지질계 에너지 저장고이다. TAG 합성의 주경로는 아실-CoA로부터 글리세롤 주쇄로의 순차적인 세번의 아실-전달을 수반한다고 생각된다 (1, 2). 여러해동안, 세번째 아실 전달 반응을 촉매하는 아실-CoA:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DAGAT)가 TAG 합성에 관여하는 단 하나의 유일한 효소로 여겨졌다. 이 효소는 막지질 합성에서 유래된 디아실글리세롤 (DAG)를 TAG로 전환시키는 작용을 한다 (2). 이 효소를 코딩하는 유전자는 마우스 (3)와 식물 (4, 5)에서 최근 확인되었고, 코딩된 단백질은 아실-CoA:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (ACAT)와 상동성을 보였다. 또한 최근에는 유질 균류인 모르티에렐라 라마니아나 (Mortierella ramanniana)에서 또다른 DAGAT가 존재하며 이는 마우스의 DAGAT, ACAT 유전자군 또는 공지된 다른 어떠한 유전자와도 무관하다는 사실이 보고되었다 (6).
본 발명은 신규 효소 및 이를 코딩하는 형질 전환을 위한 유전자에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 이후 본 명세서에서 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT)로 지칭하며 아실-CoA와는 독립적인 반응을 촉매하는, 이전에 공지되지 않은 형태의 효소를 코딩하는 유전자 형의 이용에 관한 것이다. 형질 변환 생물체에서 상기 형태의 유전자가 단독으로 발현된다면 세포내에서 생성되는 기름 (트리아실글리세롤)의 총량이 증가할 것이다. PDAT 유전자가 희귀한 지방산의 합성을 위한 유전자와 함께 형질 변환 생물체에서 발현될 경우 트리아실글리세롤 내의 상기 희귀한 지방산의 수준이 증가할 것이다.
산업적 이용을 목적으로 지방산과 같은 화학 공급 재료를, 재활용이 불가능한 석유 화학 제품보다는 재활용이 가능한 식물 원료로부터 생산하는 것이 세계적으로 큰 관심거리이다. 이 개념은 자원 보존이라는 기본 전제를 두고 제조업자와 소비자로부터 광범위하게 설득력을 얻고 있으며 산업적인 신규 농작물 개발에도 중요한 기회를 제공한다.
야생 식물 종에서 얻은 기름에는 다양한 희귀 지방산류가 존재하며 그 특징에 대해서 잘 연구되어 있다. 이들 지방산의 많은 수가 산업적 잠재력을 가지고 있어서, 경작을 통해 특정 지방산을 생산할 수 있도록 해당 식물종의 자국내 재배에 관심이 가고 있다.
희귀 지방산의 생합성에 대한 지식의 증가와 유전 공학 기술의 발달이 결합되어, 이제는 야생종의 특정 지방산 합성에 관여하는 주요 효소 코딩 유전자를 자국내 재배가 가능한 기름 종자 작물 안으로 도입시키는 것이 가능하게 되었다. 이러한 방식으로 적정한 비용으로 높은 순도와 많은 양으로 각각의 지방산을 생산할 수 있다.
평지, 해바라기, 기름야자 등과 같은 모든 작물에서, 기름 (즉, 트리아실글리세롤)이 종자나 과실로부터 얻는 가장 값진 산물이며 전분, 단백질 및 섬유질과 같은 다른 화합물들은 가치가 덜한 부산물로 여겨진다. 따라서, 기름 작물의 다른 화합물 대신에 단위 중량 당 기름 양을 증가시키는 것은 작물의 가치를 높이는 것이다. 환원 탄소의 기름 생산 할당을 제한하는 유전자를 업-레귤레이팅하면 세포는 다른 생성물 대신에 기름을 더 많이 축적시킬 것이다. 그러한 유전자는 이미 기름 작물과 같이 높은 수준의 기름 생성 세포에만 이용될 수 있는 것이 아니라 중간 정도 또는 낮은 기름 함유 작물, 예를 들어 콩, 귀리, 옥수수, 감자, 사탕무 및 순무 등과 미생물 등에서도 상당한 기름 생산을 촉진할 수 있다.
본 발명은 트리아실글리세롤 생산을 위한 생합성 경로에서 인지질로부터 디아실글리세롤로의 지방산 전달을 촉매하는 효소를 코딩하는 재조합 DNA 분자의 단리, 확인 및 특성화에 관한 것이다.
<도면의 설명>
도 1.
14C-표지 PC의 식물 마이크로좀에 의한 중성 지질 분획으로의 대사작용. (A) 해바라기인 알. 코뮤니스 (R.communis) 및 씨. 팔래스티나 (C.palaestina)의 발생 중인 종자로부터 유래한 마이크로좀을 sn-1 위치에 올레산과 sn-2 위치에14C-표지 올레산, 리시놀레산 또는 베르놀산을 갖는 PC (8nmol)를 30℃에서 80분 동안 인큐베이션시켰다. TAG (흰 막대), DAG (검은 막대) 및 에스테르화되지 않은 지방산 (빗금 막대)에 도입된 방사능 양은 박층 크로마토그래피 및 전자 오토라디오그래피를 이용해 정량분석하여 표지된 기질의 첨가분을 백분율로 나타내었다. (B) 베르놀로일기 두 개와 [14C]리시놀레오일기 한 개를 지닌 TAG를 알. 코뮤니스로부터 유래된 마이크로좀에 의해 시험관내 합성함. 첨가된 기질은 무표지 디베르놀로일-DAG (5 nmol)을 sn-1-올레오일-sn-2-[14C]리시놀레오일-DAG (0.4 nmol, 7700 dpm/nmol) 또는 sn-1-올레오일-sn-2-[14C]리시놀레오일-PC (0.4 nmol, 7700 dpm/nmol)와 함께 사용하였다. 마이크로좀을 이 기질과 함께 30℃에서 30분 동안 반응시킨 다음, "일반적인 방법" 란에 기술한 지질 분석을 위해 시료를 수거하였다. 나타낸 데이터는 두 실험의 평균값이다.
도 2.
TLC로 분리한 중성 지질 산물을 방사선 사진으로 가시화한 효모 마이크로좀 내에서의 PDAT 활성. 야생형 효모 균주인 FY1679 (1-3 레인), YNR008w 유전자를 파괴한 콘제닉 효모 균주 (FVKT004-04C(AL)) (4 레인) 또는 그 천연 프로모터 뒤에 YNR008w 유전자를 함유한 pUS1 플라스미드로 형질 전환된 상기와 동일한 유전자 파괴 균주 (5 레인)으로부터 유래된 마이크로좀 막 (PC 10 nmol)의 PDAT 활성을 분석하였다. sn-1-올레오일-sn-2-[14C]리시놀레오일-PC 2 nmol을 디올레오일-DAG 5 nmol (2, 4, 5 레인) 또는 rac-올레오일-베르놀레오일-DAG 5 nmol (3 레인)와 함께 기질로 사용하였다. 효소 분석과 지질 분석을 재료와 방법에 기술한 대로 수행하였다. 세포를 YPD 배양액에서 20시간 동안 예비 배양한 후, 수획하여 리터당 글리세롤 16g이 포함된 동일 부피의 최소 배지에 재현탁하였다. 그 후 세포를 24시간 동안 더 증식시켜 수획하였다. 플라스미드에 대한 선택성은, 형질 전환된 세포를 우라실이 결여된 합성 배지 내에서 증식시킴으로써 유지하였다 (18). 약자: 1-OH-TAG, 모노리시놀레오일-TAG; 1-OH-1-ep-TAG, 모노리시놀레오일-모노베르놀로일-TAG; OH-FA, 에스테르화되지 않은 리시놀레산.
도 3.
PDAT 과발현 효모 세포에서의 지질 함량 (A,B)과 PDAT 활성 (C). 야생형 균주인 W303-1A에서 갈락토스에 의해 유도되는 GAL1-TPK2 프로모터를 통해 pUS4 플라스미드 내의 PDAT 유전자를 과발현시켰다 (7). 상기 발현의 유도는 배양 (A) 2시간 후에 또는 (B) 25 시간 후에 갈락토스를 2％ 최종 농도 (중량/부피)로 첨가함으로써 수행하였다. 그 후 상기 세포를 22시간 동안 더 배양한 후 수획하였다. 수획된 세포 내의 지질 양은 그의 지방산 함량을 GLC-분석하여 결정하였고, TAG (흰색 막대), 극성 지질 (빗금 막대), 스테롤 에스테르 (검은색 막대) 및 다른 지질 (줄무늬 막대)에 대해서 건량 1 mg 당 지방산 ㎛ol로 나타내었다. 도시된 데이타는 3개의 독립적인 효모 배양액에서 얻은 결과의 평균 수치이다. (C) 공벡터 또는 PDAT 플라스미드 (+PDAT) 중 어느 하나를 포함하는 효모로부터 얻은 마이크로좀에 의한 TAG의 시험관내 합성. 상기 세포들은 도 3A 에서 기술한 것처럼 증식하였다. 기질이 되는 지질인 디올레오일-DAG (2.5 nmol) 및 sn-1-올레오일-sn-2-[14C]-올레오일-PC (2 nmol)을 마이크로좀의 분취물 (PC 10 nmol)에 첨가한 후, 28℃에서 10분동안 인큐베이션시켰다. TAG에 도입된 표지의 양을 전자 오토라디오그래피로 정량하였다. 도시한 결과는 두 번 실험의 평균 값이다.
도 4.
효모 PDAT의 기질 특이성. 동결건조된 미아크로좀의 분취액 (PC 10nmol)을 기질이 되는 지질과 30℃에서 10분 (A 패널) 또는 90분 (B 패널) 동안 인큐베이션하여 분석하였다. 도시된 것처럼, 무표지 DAG (2.5 nmol)을 여러 표지된 인지질과 함께 기질로서 사용하였다. (A) 아실 공여체 기질에 대한 효모 PDAT의 sn-위치 특이성. 디올레오일-DAG ＋ sn-1-[14C]올레오일-sn-2-[14C]올레오일 PC (di-[14C]-PC), sn-1-[14C]올레오일-sn-2-올레오일-PC (sn1-[14C]-PC) 또는 sn-1-올레오일-sn-2-[14C]올레오일-PC (sn2-[14C]-PC) 중 하나. (B) 인지질과 다이아실글리세롤의 아실 조성 및 인지질 헤드기에 관련된 효모 PDAT의 특이성. 디올레오일-DAG ＋ sn-1-올레오일-sn-2-[14C]올레오일-PC (올레오일-PC), sn-1-올레오일-sn-2-[14C]올레오일-PE (올레오일-PE), sn-1-올레오일-sn-2-[14C]리시놀레오일-PC (리시놀레오일-PC) 또는 sn-1-올레오일-sn-2-[14C]베르놀로일-PC (베르놀로일-PC). 우측 끝의 막대 2개로 도시된 실험에서는, 모노리시놀레오일-DAG (리시놀레오일-DAG) 또는 모노-베르놀로일-DAG (베르놀로일-DAG)를 sn-1-올레오일-sn-2-[14C]올레오일-PC와 함께 사용하였다. TAG (검은색 막대) 및 lyso-PC (LPC, 흰색 막대)에 도입된 표지의 양을 전자 오토라디오그래피를 통해서 정량하였다. 도시된 결과는 두 번 실험의 평균 수치이다.사용된 마이크로좀은 GAL1-TPK2 프로모터에 의해 PDAT 유전자를 과발현하는 W303-1A 세포에서 유래된 것이며, 이는 도 3에 기술되어 있다. 발현은 초기 정지기에서 유도되었고 세포는 24시간을 더 배양하여 수획하였다.
<발명의 개요>
목적하는 희귀 지방산, 예를 들어 중간쇄 지방산, 하이드록시 지방산, 에폭시 지방산 및 아세틸렌 지방산의 많은 수가 일반적인 식물 지방산과는 독특하게 다른 물리적 성질을 지닌다. 본 발명자들은 천연 상태에서 이러한 희귀 지방산을 그 종자 기름 (즉, 트리아실글리세롤)에 축적하는 식물 종에서 종자의 막 (인)지질에는 상기 지방산이 없거나 극소량 존재한다는 것을 발견하였다. 막지질에서 상기지방산 농도가 낮은 이유는 적절한 막 기능과 이를 통한 적절한 세포 기능을 위한 선행 요건이기 때문이다. 본 발명의 한 측면은, 희귀 지방산을 막지질로부터 효율적으로 수거하여 종자의 트리아실글리세롤로 운반한다면 형질 변환 작물의 종자를 희귀 지방산이 다량 축적되도록 만들 수 있다는 것이다.
본 발명자들은 트리아실글리세롤의 생산에 있어서 인지질로부터 디아실글리세롤로의 지방산 전달을 아실-CoA와는 독립적인 반응을 통해 촉매하는 식물 내의 신종 효소를 확인하였고 이들 효소 (인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제, 축약하여 PDAT)가 식물의 인지질로부터 하이드록시화 에폭시겐화된 지방산, 아마도 중간쇄 지방산과 같은 다른 희귀 지방산을 수거하는데 관여한다는 것도 확인하였다.
이러한 효소 반응은 빵효모 (사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae))의 마이크로좀 조제물 내에 존재하는 것으로 나타났다. 나아가 본 발명은 서열 2 에 기재한 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, 유도체, 대립 형질, 유사체 또는 동위 효소를 포함하는 효소에 관한 것이다. 각각의 유전자를 파괴시킨, 소위 '녹 아웃 (knock out)' 효모 돌연변이체를 만들었고 상기 돌연변이체로부터의 마이크로좀 막은 PDAT 활성이 완전히 결여되어 있었다. 이리하여, 그 파괴된 유전자가 PDAT 효소 (서열 1 및 2)를 코딩한다는 것이 입증되었다. 더우기, 이 PDAT 효소는 서열 2에 기재된, 보존된 연속 서열인 FXKVEA의 리파제 모티프를 포함하는 아미노산 서열 전체를 특징으로 한다. 본 발명은 또한 서열 16, 20 또는 22에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, 유도체, 대립 형질, 유사체 또는동위 효소를 포함하는 효소에 관한 것이다.
더 나아가서, 미지의 기능을 지닌 유전자 및(또는) 단백질을 찾아 확인하였으며, 이들은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 스키조사카로마이세스 펌비 (Schizosccharomyces pombe)에서 유래된 유전자 SPBC776.14 (서열 3)과 SPBC776.14의 추정 오픈 리딩 프레임 CAA22887 (서열 13)이 확인되었다. 더 나아가서 추정 단백질을 코딩하는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis Thaliana) 게놈 서열 (서열 4, 10 및 11) 뿐 아니라 에이. 탈리아나의 AC 004557 좌위 (서열 14)에서 유래된 추정 오픈 리딩 프레임 AAC80628 및 에이. 탈리아나의 AC 003027 좌위 (서열 15)로부터 유래된 추정 오픈 리딩 프레임 AAD10668을 확인하였다.
또한, 부분적으로 서열이 분석된 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) 유래의 cDNA 클론 (서열 9) 및 지(Zea) 산사나무 EST (Extended Sequence Tac) 클론 (서열 7)과 그에 상응하는 추정 아미노산 서열 (서열 8)이 확인되었다. 마지막으로, 두 cDNA 클론이 확인되었는데, 하나는 아라비돕시스 탈리아나 EST (서열 5와 그에 상응하는 예측 아미노산 서열인 서열 6)이고 다른 하나는 라이코페르시콘 에스큘렌툼 (Lycopersicon esculentum) EST 클론 (서열 12)이다. 또한, 리파제 모티프인 FXKWVEA를 포함하는 서열 6, 17, 18, 25 또는 27에 기재된 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며 PDAT로 지칭되는 효소가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 게다가, 서열 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 또는 31에 기재된 서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 그의 단편, 유도체, 대립 형질 또는 유사체로 코딩된 아미노산 서열이나 상기 아미노산 서열을 코딩하는 효소의 기능적 단편, 유도체, 대립 형질, 유사체 또는 동위 효소를 포함하는 효소도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 효소의 기능적 단편은 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT)의 특정 효소 활성을 나타내는 임의의 폴리펩티드 서열을 말한다. 기능적 단편의 길이는 예를 들어 약 660 ±10 개의 아미노산 내지 660 ±250개의 아미노산의 범위에서 다양할 수 있으며, 바람직하게는 660 ±50개 내지 660 ±100개 아미노산을 갖는데 여기서 아미노산 660개라고 하는 "기본 개수"는 서열 1에 따른 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 서열 2의 PDAT 효소의 폴리펩티드 사슬에 상응한다. 결국, 기능적 전장 효소의 "기본 개수"는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 따라 변할 수 있다.
상기 뉴클레오티드 서열의 일부란 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT)의 특정 활성이 나타나는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 뉴클레오티드의 일부의 길이는 유전자의 코딩 영역이나 고도로 보존된 서열에 따라 약 수백개 뉴클레오티드의 광범위한 범위로 다양하게 나타날 수 있다. 예를 들어, 길이는 약 1900 ±10개 내지 1900 ±1000개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 1900 ±50개 내지 1900 ±700개, 더 바람직하게는 1900 ±100개 내지 1900 ±500개의 뉴클레오티드 범위에서 다양하게 나타날 수 있다. 여기서 뉴클레오티드 1900개라고 하는 "기본 개수"는 서열 1의 PDAT 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 해당한다. 결국, 기능을 갖는 전장 유전자의 "기본 개수"는 변할 수 있다.
본 뉴클레오티드 서열의 대립 형질 변이체는 기능적으로 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 여러 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 대립 형질은 당업계에 공지된 방법에 의해 생성된 합성 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 본 뉴클레오티드 서열의 천연 변이체를 포함한다. 여기에는 변화된 활성 및(또는) 조절능을 갖거나 또는 특정 저해제에 대하여 저항성이 있는 효소를 생성하는 변화된 뉴클레오티드 서열도 포함된다. 본 발명은 또한 처음 단리된 뉴클레오티드 서열의 천연 또는 합성 돌연변이체도 포함한다. 이러한 돌연변이는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가, 결실, 역위 또는 삽입일 수 있다.
상동 뉴클레오티드 서열은 상보 서열 및(또는) 본 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화하는 서열을 의미한다. 혼성화 서열에는 당업계에 공지된 중간 정도 이상의 엄격도 조건 하에서 본 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 결합하는 DNA 또는 RNA 군으로부터 선택된 유사 서열들이 포함된다. 엄격한 혼성화 조건의 바람직한 예로는 약 45℃에서 6X 염화 나트륨/시트르산 나트륨 (SSC) 중의 혼성화 후에 50 내지 65℃에서 0.2X SSC, 0.1％ SDS 중에서 한번 또는 그 이상 세척하는 것인데 이에 한정되지는 않는다. 짧은 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 10개 내지 30개 뉴클레오티드, 바람직하게는 12 내지 15개의 뉴클레오티드도 포함된다. 또한 프라이머 또는 혼성화 프로브도 포함된다.
본 발명의 범위 안에 포함되는 상동 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 서열에 약 40％ 이상, 바람직하게는 약 50％ 또는 60％ 이상, 더 바람직하게는 약 70％, 80％ 또는 90％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 약 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 또는 그보다 높은 상동성을 갖는 서열이다. 전술한 정의 모두가 아미노산 서열 및 기능을 갖는 효소에서 적용되며 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 이행될 수 있다.
동위 효소는 1차 구조가 다르지만, 동일하거나 유사한 기질 특이성 및(또는) 촉매 활성을 갖는 효소를 의미한다.
첫번째 실시 양태에서, 본 발명은 PDAT를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 이는 생물학적으로 활성인 PDAT를 코딩하는 서열, 프로브, 형질 전환용 벡터 또는 클로닝 중간체로 사용하려는 서열을 포함한다. PDAT를 코딩하는 서열은 사용 목적에 따라 전장 또는 일부 서열을 코딩한다. 게놈 서열, cDNA 서열, PDAT 전구체 또는 성숙 PDAT의 전부 또는 일부가 대상이다.
서열 1, 3, 4, 10, 11, 19, 21, 23, 24, 29 또는 30에 기재된 서열 또는 그의 일부, 유도체, 대립 형질 또는 상동체로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 역시 포함된다. 본 발명은 서열 5, 7, 9, 12, 25, 26, 28 또는 31에 기재된 서열 또는 그의 일부, 유도체, 대립 형질 또는 상동체로 구성된 군으로부터 선택된 전장 뉴클레오티드 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함한다. 게다가, 서열 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 또는 31에 기재된 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 40％ 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 이종 핵산에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 상기 뉴클레오티드서열을 포함하는 유전자 구조물을 포함한다.
작동 가능하게 연결된다는 용어는 예를 들어 프로모터, 코딩 서열, 터미네이터 및(또는) 조절 요소의 일련의 유기적 작용을 의미하며 여기서 각 요소는 뉴클레오티드 서열의 발현동안 그 본래의 기능을 수행할 수 있는 것이다.
더 나아가, 본 발명의 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터도 본 발명에 포함된다. 또한 이는 선별 마커 유전자 및(또는) 숙주 세포에서의 복제 및(또는) 숙주 세포 게놈으로의 삽입을 위한 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 벡터 뿐만 아니라 발현 벡터를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 유전 공학에 의한 기름 종자, 효모 및 사상균 또는 기름을 축적하는 임의의 다른 생물체를 비롯한 숙주 세포 또는 그 후대에서 세포 내의 유전자 구조물 발현을 통해 PDAT를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한 PDAT를 코딩하는 서열의 생산으로 인해 PDAT를 포함하는 세포 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다.
더 나아가, 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열 및(또는) 상기 유전자 구조물 및(또는) 상기 벡터를 포함하는 형질 변환 세포 및 생물체에 관한 것이다. 더 나아가 본 발명의 목적은 진핵 세포 또는 생물체인 형질 변환 세포 또는 생물체이다. 바람직하게는, 형질 변환 세포 또는 생물체는 효모 세포 또는 식물 세포 또는 식물이다. 본 발명은 변화된 트리아실글리세롤 생합성 경로를 갖는 상기 형질 변환 세포 또는 생물체에 관한 것이다. 또한 변화된 기름 함량을 갖는 형질 변환 세포나 생물체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
더 나아가, 본 발명은 PDAT 활성이 변화된 형질 변환 세포 또는 생물체에 관한 것이다. 이러한 PDAT의 변화된 활성은 유전자 발현, 촉매 활성 및(또는) 효소의 활성 조절에서의 변화를 특징으로 한다. 게다가, 트리아실글리세롤의 생성을 위한 생합성 경로의 변화가 막지질에서 바람직하지 못한 지방산 축적을 방지하는 것을 특징으로 하는 형질 변환 세포 또는 생물체 역시 본 발명에 포함된다.
다른 실시 양태에서, 또한 본 발명은 세포내 기름 함량을 증가시키기 위해서 PDAT를 코딩하는 DNA 서열을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 세포의 막지질로부터 특이적으로 희귀 지방산을 수거하고 이를 트리아실글리세롤로 전달하는 PDAT를 생산하는 DNA를 삽입함으로써 세포 내에서 생산된 트리아실글리세롤중에 희귀 지방산이 다량 축적되는 것에 관한 것이다. 또한 이렇게 변화된 식물 세포도 본 발명에 포함된다.
더 나아가, 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열이 발현되고 상기 형질 변환 세포가 상기 효소를 포함하여 인지질로부터 디아실글리세롤로의 지방산 전달을 촉매함으로써 트리아실글리세롤을 형성하는 조건 하에서, 상기 형질 변환 세포 또는 생물체를 배양하는 것을 포함하는 트리아실글리세롤의 생산 방법에 관한 것이다.
게다가, 전술한 방법에 의해 생산된 트리아실글리세롤 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
더 나아가 본 발명의 목적은 희귀 지방산 함유 트리아실글리세롤(류)의 생산을 위한 상기 효소의 본 뉴클레오티드 서열 및(또는) 용도이다. 또한 상기 본 뉴클레오티드 서열 및(또는) 본 발명의 상기 효소를 임의의 세포 또는 생물체의 형질전환에 사용하여 이러한 세포 또는 생물체 내에서 발현됨으로써 변화된, 바람직하게는 이러한 세포 또는 생물체의 기름 함량이 증가된 결과를 야기하는 것도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 PDAT는 효소 활성 조건 하에서 인지질와 디아실글리세롤로부터 트리아실글리세롤의 생산을 촉매하는 능력을 나타내는 미생물, 동물 또는 식물 자원으로부터 유래된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 단편과 같은 임의의 아미노산 서열을 포함한다. "효소 활성 조건"이란 임의 필수조건이 효소가 기능할 수 있는 환경 (예를 들어 온도, pH, 저해 물질의 부재와 같은 요인들)에 있음을 의미한다.
다른 PDAT는 본 명세서에 기재된 특정 서열로부터 얻을 수 있다. 더 나아가, 예시된 PDAT 및 예시된 서열을 이용하여 얻은 PDAT로부터, 합성 단백질 모델링을 위한 출발 물질과 변형된 아미노산 서열을 포함하는 천연 및 합성 PDAT를 생산 가능함이 자명할 것이다. 변형된 아미노산 서열은 서열의 일부가 합성되든 전부가 합성되든 간에 돌연변이 서열, 절단형 서열, 증가된 서열 등등을 포함한다. 식물 시료로부터 실제 정제된 서열, 또는 그와 동일한 서열 또는 단백질을 코딩하는 서열은, 단백질이나 서열의 수득 방법에 관계없이 천연에서 유래된 것으로 동등하게 간주한다.
더 나아가, 본 발명의 핵산 프로브 (DNA 및 RNA)는 수종의 식물 및 미생물원으로부터 "상동"이거나 "연관된" PDAT를 선별 수거하는 데 사용 가능하다.
더 나아가, 당업자가 본 원에서 제공된 정보를 가지고 임의의 생물체에서 PDAT 활성을 확인하고, 그 활성을 가진 효소를 정제하고 그럼으로써 상기 효소를코딩하는 "비상동" 핵산 서열을 확인할 수 있음은 물론이다.
본 발명은 본질적으로 하기의 측면들을 특징으로 하고 있다.
1. 형질 전환에서의 PDAT 유전자 (게놈 클론 또는 cDNA)의 용도.
2. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 임의의 생물체를 형질 전환하기 위해 사용되어 그 생물체 내에서 발현되고 활성의 재조합 PDAT 효소를 만들어 생물체 내의 기름 함량을 증가시키기 위한 DNA 분자의 용도.
3. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 임의의 생물체를 형질 전환하기 위해 사용되어 막지질 내에 바람직하지 않은 지방산이 축적되는 것을 막기 위한 DNA 분자의 용도.
4. 제1항에 있어서, 중간쇄 지방산, 하이드록시 지방산, 에폭시 지방산 및 아세틸렌 지방산과 같이 막지질에 다량 존재할 경우 유해한 임의의 희귀 지방산을 생산하도록 조작한, 형질 변환 기름 축적 생물체를 형질전환시키기 위한 상기 PDAT 유전자의 용도.
5. 제1항에 있어서, 상기 PDAT 유전자를 생물체의 형질 전환을 위해 사용하는데, 여기서 상기 생물체를, 막지질에 다량 존재할 경우 유해한 중간쇄 지방산, 하이드록시 지방산, 에폭시 지방산 및 아세틸렌 지방산을 비롯한 임의의 희귀 지방산을 생산하도록 조작한 다른 기름 축적 생물체와 교배하는 용도.
6. 제1항에 있어서, 상기 PDAT 유전자 또는 cDNA에 의해 코딩되는 효소가 독특한 아실 특이성을 지닌 PDAT를 코딩하는 것인 용도.
7. 제1항에 있어서, 상기 PDAT 코딩 유전자 또는 cDNA가 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 것이거나 서열 2에 도시된 PDAT의 아미노산 서열과 서열 동일성이 30％ 또는 그 이상인 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 용도.
8. 제1항에 있어서, 상기 PDAT 코딩 유전자 또는 cDNA가 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 것이거나 서열 2에 도시된 PDAT의 아미노산 서열과 서열 동일성이 40％ 또는 그 이상인 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 용도.
9. 제1항에 있어서, 상기 PDAT 코딩 유전자 또는 cDNA가 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 것이거나 서열 2에 도시된 PDAT의 아미노산 서열과 서열 동일성이 60％ 또는 그 이상인 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 용도.
10. 제1항에 있어서, 상기 PDAT 코딩 유전자 또는 cDNA가 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 것이거나 서열 2에 도시된 PDAT의 아미노산 서열과 서열 동일성이 80％ 또는 그 이상인 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 용도.
11. 제1항에 있어서, 상기 PDAT 코딩 유전자 또는 cDNA가 식물로부터 유래된 것이거나 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)로부터 유래된 PDAT의 아미노산 서열 또는 일부 지(Zea) 산사나무, 라이코페리콘 에스쿨랜툼 (Lycopericon esculentum), 또는 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) cDNA 클론의 한쌍 중 상보체 전장 서열에 의해 코딩된 단백질과 서열 동일성이 40％ 또는 그 이상인 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 용도.
12. 재조합 DNA 기술 또는 체세포 혼성화에 의하여 게놈 내에 PDAT 유전자가 전이된 것을 포함하는, 형질 변환 기름 축적 생물체.
13. 제12항에 있어서, 특정의 희귀 지방산 함유 기질에 대해 특이성이 있는 PDAT 유전자와 상기 희귀 지방산 유전자를 게놈 내에 포함하는, 형질 변환 기름 축적 생물체.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 균류, 식물 및 동물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 형질 변환 생물체.
15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 경작 식물 군으로부터 선택된 것인 형질 변환 생물체.
16. 제12항 또는 제13항에 있어서, 경작 식물 군으로부터 선택되고 상기 PDAT 유전자는 저장 기관에 특이적인 프로모터의 조절 하에서 발현되는 것인 형질 변환 생물체.
17. 제12항 또는 제13항에 있어서, 경작 식물 군으로부터 선택되고 상기 PDAT 유전자는 종자 프로모터의 조절 하에서 발현되는 것인 형질 변환 생물체.
18. 제12항 내지 제17항의 생물체로부터 유래된 기름.
19. 천연 코딩 유전자의 뉴클레오티드 서열을 변화시켜 그 결과로 신규 아실 특이성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자를 만드는 것에 의한 PDAT의 아실 특이성을 변화시키는 방법.
20. 제1항의 DNA 분자에 의해 코딩되는 단백질 또는 그의 기능을 갖는 단편.
21. 제20항에 있어서, 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제를 나타내는 단백질
22. 제21항에 있어서, 독특한 아실 특이성을 갖는 단백질
23. 제13항에 있어서, 서열 2, 13, 14 또는 15에 기재된 아미노산 서열 (그리고 서열 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11 또는 12에서 설명하는 유전자의 전장 또는 일부에 의해 코딩되는 단백질) 또는 상기 아미노산 서열과 30％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지는 단백질.
24. 제23항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애로부터 단리된 단백질.
일반적인 방법
효모 균주와 플라스미드. 사용된 야생형 효모 균주는 FY1679 (MATα his3-Δ200 leu2-Δ1 trp1-Δ6 ura3-52) 또는 W303-1A (MATa ADE2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3, 112 trp1-1 ura3-1)이었다 (7). FY1679의 콘제닉 (congenic) 균주인 YNR008w:: KanMX2 파괴 균주 FVKT004-04C (AL)는 유로스카프 콜렉션 (Euroscarf collection)으로부터 얻었다 (8). 5'-TCTCCATCTTCTGCAAAACCT-3' 및 5'-CCTGTCAAAAACCTTCTCCTC -3'의 프라이머와 함께 Taq 폴리머라제 (Taq Polymerase)를 사용하여 W303-1A 게놈 DNA로부터 5'에 583 bp와 3'에 183 bp의 측면에 접한 DNA를 갖는 UNR008w 유전자 함유 2751 bp 단편을 증폭하였다. 결과로 얻은 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고 pBluescript의 EcoRV 부위로 클로닝 (pbluescript-pdat)하였다. 상보성 실험을 하기 위해서, 클로닝된 단편을 HindIII-SacI 절단에 의해 pBluescript로부터 방출시켜 pFL39의 HindIII 및 ScaI 부위 사이에 클로닝 (9)한 결과 pUS1을 생성하였다. PDAT 유전자를 과발현시키기 위하여, 5'의 측면에 접한 단지 24 bp의 DNA를 포함하는 pBluscript 플라스미드로부터 유래된 EcoRI 단편 2202 bp를 GAL1-TRK2 발현 벡터인 pJN92 (12)의 BamHI 부위에 클로닝한 결과 pUS4를 생성하였다.
마이크로좀 조제물. 스토바트 (Stobart)와 스팀네 (Stymne)의 방법 (11)을 사용하여 해바라기 (헬리안투스 아누스,Heliantus annuus), 리시누스 코뮤니스 (Ricinus communis) 및 크레피스 팔래스티나 (Crepis palaestina)의 발생중인 종자로부터 마이크로좀을 조제하였다. 효모의 마이크로좀을 수득하기 위해서, 12ml 용량의 유리 시험관에 효모 세포 (생체 중량) 1 g을 빙냉 완충액 8 ml (20mM Tris-Cl, pH 7.9, 10mM MgCl2, 1mM EDTA, 5％ (부피/부피) 글리세롤, 1mM DTT, 0.3M 황산 암모늄)에 재현탁시켰다. 이 시험관에 유리 비드 4ml (직경 0.45-0.5 mm)을 첨가하고, 그후 MSK 세포 호모게나이저 (cell homogenizer, 비 브라운 독일 멜순겐 아게 (B. Braun, Melsungen AG)) 내에서 세차게 흔들었다 (3 ×60s). 균질화된 현탁액을 15 분 동안 6℃에서 20,000 ×g로 원심분리하고 그 결과로 얻은 상층액을 다시 2 시간동안 6℃에서 100,000 ×g로 원심분리하였다. 100,000 ×g의 원심분리로 얻은 펠렛은 0.1M 인산 칼륨 (pH 7.2)에 재현탁하고 -80℃에 보관하였다. 이것이 후에 효모의 조 마이크로좀 분획으로 불리는 것이다.
지질 기질. [1-14C]올레산 및 [1-14C]리놀레산을 각각 리시누스 코뮤니스(Ricinus Communis) 및 크레피스 팔래스티나 (Crepis Palaestina)의 종자로부터 유래된 마이크로좀 조제물과 함께 인큐베이션하여 방사성 표지된 리시놀레산 (12-하이드록시-9-옥타데켄산) 및 베르놀산 (12,13-에폭시-9-옥타데켄산)을 효소에 의해 합성하였다 (12). sn-2 위치에14C-표지된 아실기를 가지는 포스파티딜콜린 (PC) 또는 포스파티딜에탄올아민 (PE)의 합성은 [14C]올레산, [14C]리시놀레산 또는 [14C]베르놀산의 효소를 이용한 (13) 또는 합성을 통한 (14) 아실화반응을 이용하여 수행하였다. sn-1 위치에 표지된 디올레오일-PC는 sn-1-[14C]올레오일-리소-PC와 무표지 올레산으로부터 문헌 (14)에 기술된 대로 합성하였다. sn-1-올레오일-sn-2-[14C]리시놀레오일-DAG는 (15)에 기술된 대로 비. 세레우스 (B.Cereus)에서 얻은 XI형 인지질 C (시그마 케미컬 캄파니 (Sigma Chemical Co.))의 작용에 의해 PC로부터 합성하였다. 모노베르놀로일- 및 디베르놀레오일-DAG는 이미 (16)에서 기술된 TAG-리파제 (리조푸스 아리주스 (Rizhopus arrhizus, 시그마 케미칼 캄파니. (Sigma Chemical Co.))를 사용하여 유포비아 라가스카 (Euphorbia lagascae)의 종자로부터 추출한 TAG로부터 합성하였다. 모노리시놀레오일-TAG는 피마자로부터 추출된 TAG를 사용하여 동일한 방법으로 합성하였다.
지질 분석. 블라이 (Bligh)와 다이어 (Dyer)가 기술한 대로 (17) 40 ml 배양액에서 수획한 세포를 유리-비드 진탕기로 분쇄하고 클로로포름으로 추출한 후, 미리 코팅된 실리카겔 60 플레이트 (머크, Merck)를 사용하여 헥산/디에틸에테르/아세트산 (80:20:1) 중의 박층 크로마토그래피를 통해 분리하여, 효모의 전체 지질 조성을 측정하였다. 지질 영역은 I2증기에 짧게 노출시켜 위치를 지정했고 적절한 표준을 가지고 확인하였다. 극성 지질, 스테롤-에스테르 및 트리아실글리세롤 뿐만 아니라, 기타 지질이라 불리우는 소량의 잔여 지질류도 플레이트로부터 절개하였다. 지방산 메틸에스테르는 무수 메탄올 중의 2％ (부피/부피) 황산 중에서 60 분동안 85℃로 건조시킨 절개물을 가열함으로써 제조되었다. 메틸 에스테르는 헥산으로 추출하였고 메틸헵타데칸산을 내부 표준으로 하여 50m ×0.32 mm CP-Wax58-CB 융합 실리카 컬럼 (크롬팩, Crompack)을 통한 GLC에 의해 분석하였다. 각 분획의 지방산 함량을 정량하여 각 지질 계열의 상대적인 양을 계산할 때 사용하였다. 총 지질 함량을 측정하기 위해서, 효모 배양액으로부터 분취물 3 ml을 원심분리에 의해 수획하고, 그 결과로 얻은 펠렛은 증류수로 세척하고 동결 건조하였다. 세포의 건량을 측정하고 상기에 기술한 메틸에스테르로의 전환 후에 GLC-분석에 의해 지방산 함량을 정량하였다. 그 후 지질 함량은 효모 건량 1 mg 당 지방산 (FA) nmol로 계산하였다.
효소 분석시험. 발생 중인 식물 종자 또는 효모 세포로부터 유래한 조 마이크로좀 분획의 분취물 (마이크로좀 PC의 10 nmol에 해당)을 밤새 동결 건조시켰다. 그 후 벤젠 중에 용해된,14C-표지된 기질 지질을 건조된 마이크로좀에 첨가하였다. N2기류 하에서 벤젠을 증발시켜 지질이 막에 직접 접촉하도록 한 후, 50 mM 인산 칼륨 (pH 7.2) 0.1 ml을 첨가하였다. 현탁액을 완전히 혼합하고 90분 이하의 지정된 시간 동안 30℃에서 반응시켰다. 지질은 클로로포름을 사용하여 반응 혼합물로부터 추출하였고, 이를 실리카 겔 60 플레이트 (머크, Merck)를 사용하여 헥산/디에틸에테르/아세트산 (35:70:1.5) 중에서 박층 크로마토그래피를 통해 분리하였다. 방사성 지질은 전자 오토라디오그래피 (미국 팩커드 소재 인스턴트 이미저 (Instant Imager))에 의해 플레이트 위에서 가시화하고 정량하였다.
효모 배양. 효모 세포는 YPD 배양액 (1％ 효모 추출물, 2％ 펩톤, 2％ 글루코스), 2％ (부피/부피) 글리세롤과 2％ (부피/부피) 에탄올을 함유하는 합성 배지 (18) 또는 글리세롤 16 g/l를 함유하는 최소배지 중에서 28℃ 온도로 회전 진탕기 상에서 배양하였다.
본 발명은 하기 실시예에서 보다 그 특징을 잘 나타내지만 이에 한정하는 것은 아니다.
기름 종자 마이크로좀에 의한 아실-CoA와 독립적인 TAG의 합성. 기름 종자에서는 많은 양의 희귀 지방산을 발견할 수 있다 (20). 리시놀레산 (21)과 베르놀산 (22)과 같은 다수의 이들 지방산은 중간 전구체로서 각각 sn-2 위치에서 에스테르화된 올레오일 또는 리놀레오일기를 가지는 포스파티딜콜린 (PC)를 사용하여 합성한다. 그러나, PC가 희귀 지방산 합성의 기질이 될 수 있고 종자 내에서 주요 막지질이라고 하더라도, 희귀 지방산은 막에서 거의 발견되지 않는다. 대신, 그들은 주로 TAG에 도입되어 있다. 따라서, 그러한 희귀 지방산이 축적되는 기름 종자내에는 이러한 희귀 아실기를 PC에서 TAG로 효율적이고도 선택적으로 전달시키는 기작이 존재하고 있음이 분명하다. 종자에 각각 높은 농도의 리시놀레산과 베르놀산이 축적되는 식물인 피마자 (리시누스 코뮤니스,Ricinus Communis)와 크레피스 팔래스티나 (Crepis palaestina) 및 그 종자 기름 내에 단지 일반적인 지방산만 가지고 있는 식물인 해바라기 (헬리안투스 아누스(Heliantus annuus))의 종자에서 이러한 전달 반응에 대한 특성을 생화학적으로 밝혀내었다. 발생 중의 종자에서 유래한 조 마이크로좀 분획을14C-표지된 올레오일, 리시놀레오일 또는 베르놀로일기를 sn-2 위치에 갖는 PC와 반응시켰다. 반응 후에, 지질을 추출하여 박층 크로마토그래피로 분석하였다. 본 발명자들은 중성 지질 분획에 도입된 방사선의 선량이 4시간 전반에 걸쳐 선형 증가한다는 것을 발견하였다 (자료는 도시하지 않음). 중성 지질 분획 중 [14C]아실기의 분포는 80분 후에 분석하였다 (도 1). 흥미롭게도 다른 중성 지질 사이의 방사능 양과 분포는 식물의 종과 [14C]아실 사슬의 유형에 따라 매우 달랐다. 따라서, 해바라기 마이크로좀은 [14C]아실기의 유형과는 무관하게 대부분의 표지가 DAG에 도입되었다. 반면, 알 코뮤니스 (R. communis) 마이크로좀은 [14C]리시놀레오일기와 [14C]베르놀로일기가 TAG에 우선적으로 도입되었고, 그에 반해 씨 팔래스티나 (C. palaestina) 마이크로좀에서는 [14C]리시놀레일기가 유리 지방산으로, 그리고 [14C]올레일기가 DAG에서 가장 많이 발견되는 가운데, 최종적으로 [14C]베르놀로일기만이 TAG로 도입되었고 [14C]올레일기는 대부분 DAG에서 발견되었다. 이것은 알 코뮤니스 (R. communis)와 씨 팔래스티나 (C. palaestina)각각의 TAG 풀 안에 리시놀레산 및 베르놀산의 생체내 농도가 높은 이유를 이들 생물체 내에서 PC로부터 TAG로 해당 아실기의 효율적이고 선택적인 전달로 설명할 수 있음을 보여준다.
발생중인 피마자의 마이크로좀 조제물에서 트리아실글리세롤을 시험관내 합성하는 과정은 표 1에 요약되어 있다.
PDAT: 아실-CoA와 독립적인 TAG의 합성을 촉매하는 신규 효소. DAG가 기름 종자 마이크로좀에 의해 촉매되는 반응에서 아실 수용체 뿐만 아니라 아실 공여체로서도 역할을 할 수 있는지 연구하였다. 따라서, 무표지 디베르놀로일-DAG를 sn-1-올레오일-sn-2-[14C]리시놀레오일-DAG 또는 sn-1-올레오일-sn-2-[14C]리시놀레오일 -PC와 알 코뮤니스 (R.communis) 마이크로좀의 존재 하에서 반응시켰다. [14C]리시놀레오일 및 베르놀로일기를 둘다 포함하는 TAG 분자의 합성량은 [14C]리시놀레오일-DAG에 비해서 [14C]리시놀레오일-PC가 아실 공여체로 사용될 때 5배 더 높았다 (도 1B). 이들 자료는 기름 종자 마이크로좀에 의한 아실-CoA에 독립적인 TAG 형성에 있어서 PC가 아실 공여체이고 DAG가 아실 수용체라는 것을 강력히 시사하고 있다. 따라서, 이 반응은 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT)로 지칭되는 신규 효소에 의해 촉매된다.
효모 마이크로좀에서의 PDAT 활성. TAG 합성이 유도되는 환경 하에서 야생형 효모 세포를 배양하였다. 이들 세포로부터 마이크로좀 막을 준비하여, 이를sn-2-[14C]리시놀레오일-PC 및 DAG와 반응시킨 후, 그로부터14C로 표지된채 형성되는 생성물을 분석하였다. 천연 지질 분획 내에서 PC로부터 유래한 [14C]리시놀레오일기는 주로 유리 지방산이나 TAG에서 발견되었고, 또한 합성된 TAG의 양은 반응에 첨가한 DAG의 양에 따라 달랐다 (도 2). 생체내에 존재하지 않아 외래의 [14C]리시놀레오일-PC 및 무표지 베르놀로일-DAG (도 2의 3 레인)를 첨가한 TAG종인 리시놀레오일기와 베르놀로일기를 둘다 포함하는 TAG의 시험관내 합성은, 효모 마이크로좀 막에서 기질로서 PC 및 DAG를 포함하는 아실-CoA에 독립적인 TAG 합성이 존재함을 명확하게 입증한다. 결과적으로, 효모 내에서의 TAG 합성은 식물에서 발견된 PDAT와 유사한 효소에 의해 촉매될 수 있다.
효모에서 PDAT를 코딩하는 유전자. 효모 게놈내의 유전자 (YNR008w)는 공지된 것이지만, 상기 유전자가 정상적인 환경 하에서 성장할 때에는 필수적이지 않다는 사실을 제외하고는 YNR008w의 기능에 대해서 알려진 바가 없다. 기능을 모르는 이 유전자가 파괴된 FVKT004-04C(AL) 효모 균주 (8)로부터 마이크로좀 막을 준비하였다. 마이크로좀 내의 PDAT 활성은 sn-2 위치에 방사성 표지된 지방산 함유 PC를 사용하여 분석하였다. 상기 유전자 파괴 균주에서는 전혀 활성이 없었다 (도 2의 4 레인). 특히 주목할만한 것은, 단일 카피 pUS1 플라스미드에 YNR008w가 존재하는 경우에도 부분적으로 활성이 회복된 것이다 (도 2의 5 레인). 게다가, 야생형 균주로부터 유래된 마이크로좀에 의해 포스파티딜에탄올아민 (PE)의 아실기가 효율적으로 TAG에 도입된 것에 반해 돌연변이 균주로부터 유래된 마이크로좀에 의해서는, 상기 기질의 도입이 일어나지 않았다 (자료 미포함). 이는 인지질의 sn-2 위치로부터 DAG로 아실기의 전달을 촉매하여 TAG를 생성하도록 하는 효모 PDAT를 YNR008w가 코딩한다는 것을 보여준다. 주목해야 할 것은 에르고스테롤을 첨가하여 반응시키거나 YNR008w 유전자의 파괴로 인한 영향으로 PC로부터 형성된 방사성 표지의 유리 지방산이 상당량 존재함에도 불구하고, 방사성 PC로부터 어떠한 콜레스테롤 에스테르도 생성되지 않았다는 것이다 (자료 미포함). 이것은 효모 PDAT가 콜레스테롤 에스테르 합성이나 포스포리파제 활성을 가지고 있지 않다는 것을 보여준다.
PDAT를 과발현시킨 효모 세포에서의 증가된 TAG 함량. PDAT를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 경우의 효과를 연구하기 위해 갈락토스로 유전자 발현을 유도하는 GAL1:TPK2 프로모터 함유 플라스미드인 pUS4로 야생형 효모 균주를 형질 전환시켰다. 클론 없이 발현 벡터만을 함유하는 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포를 합성 글리세롤-에탄올 배지에서 배양하여, 2 시간 (초기 로그기) 또는 25 시간 (정지기) 후에 갈락토스를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 그후 세포를 21 시간동안 더 배양하여, 이를 수획한 후에 분석 시험을 수행하였다. 본 발명자들은 PDAT의 과발현이 광학 농도로 결정한 성장 속도에 주목할만한 영향을 끼치지 않는다는 것을 알아냈다. 그러나, 효모 건량 1 mg당 ㎛ol 단위로 측정한 지질 총 함량은 대조군에 비해 PDAT 과발현 균주에서 47％ (로그기) 또는 29％ (정지기) 더 높았다. 게다가, PDAT의 과발현은 극성 지질과 스테롤에스테르 함량에 영향을 끼치지 않았다. 대신, 이들 세포 내의 지질 함량이 상승한 것은 전적으로 TAG 함량이증가했기 때문이다 (도 3A, B). 따라서, PDAT를 과발현하는 초기 로그기 세포의 TAG량이 2배까지 증가하였고, 정지기 세포에서는 40％까지 증가하였다. 심지어 DAGAT가 유도되고 그에 따라 TAG 합성에 상당히 기여하는 조건 (즉, 정지기) 하에서도 TAG 함량의 증가가 PDAT 과발현에 의해 이루어졌다는 사실은 흥미로운 것이다. PDAT 과발현 균주로부터 유래한 마이크로좀에서 시험관내 PDAT 활성을 분석한 결과 대조구보다 7배 높은 수치로 나타나 생체내에서 TAG 수준이 증가하였음을 관찰한 것과 일치하는 발견이었다 (도 3C). 이러한 결과는 형질 변환 생물체 내의 기름 함량을 증가시키는데 있어서 PDAT 유전자의 잠재적인 용도를 명백히 보여준다.
효모 PDAT의 기질 특이성. PDAT를 과발현하는 균주로부터 조제한 마이크로좀을 사용하여 효모 PDAT의 기질 특이성을 분석하였다 (도 4). 디올레오일-PC를 아실 공여체로 사용하는 도 4의 주어진 조건 하에서 TAG 합성 속도는 1분에 단백질 1 mg당 0.15 nmol이었다. 표지된 PC의 올레오일기를 모두 사용함으로써, 주어진 분석 조건 하에서 [14C]올레오일쇄가 11 pmol/분의 속도로 TAG에 전달되고 15 pmol/분의 속도로 라이소-PC를 형성하는 것을 검출하는 것이 가능하였다. PDAT 결핍 균주로부터 유래된 마이크로좀에서는 TAG가 전혀 없었고 단지 미량의 라이소-PC만이 검출되었는데, 이는 PC 및 DAG를 기질로 공급했을때 효모 PDAT가 등몰량의 TAG 및 라이소-PC 생성을 촉매한다는 것을 강하게 시사한다. TAG보다 라이소-PC가 좀더 생성되는 사실은 PC로부터 라이소-PC 및 에스테르화되지 않은 지방산을 생성하는 효모 마이크로좀 내 포스포리파제의 존재에 의해 설명이 가능하다.
sn-1 위치나 (도 4A의 막대 2) sn-2 위치 (도 4A의 막대 3)에 [14C]아실기를 가지는 디-올레일-PC와 마이크로좀을 반응시킴으로써 다른 아실기 위치에 대한 효모 PDAT의 특이성을 조사하였다. 전자의 경우14C로 표지된 주요 생성물이 라이소-PC이고 후자의 경우 TAG임을 알아냈다. 효모 PDAT는 인지질의 sn-2 위치로부터 DAG로 아실기를 전달하여 sn-1-라이소-PC 및 TAG를 생성하는 특이성을 가지고 있다고 본 발명자들은 결론을 내렸다. 주어진 분석 조건 하에서, CDP-콜린:콜린 포스포트랜스퍼라제의 역반응에 의해 sn-1에 표지된 PC로부터14C-표지된 DAG가 미량으로 생성되었다. 상기 표지된 DAG는 그후 PDAT 활성에 의해 TAG로 더 전환이 가능하다. 따라서 sn-1 위치에 [14C]아실기를 가진 디-올레오일-PC의 존재하에서 생성되는 소량의 표지된 TAG가 sn-1 위치에서도 또한 작용 가능한 PDAT에 의해서 sn-1에 표지된 PC로부터 직접 합성되는가, 아니면 sn-1에 표지된 DAG로 우선 전환된 후에 PC의 sn-2 위치에서 아실기의 전달에 대해 엄격한 선택성을 가지는 PDAT에 의해 아실화되는가의 여부를 가려내는 것은 불가능하다. 종합해보면, 이것은 YNR008w에 의해 코딩되는 PDAT가 PC의 sn-2 위치로부터 DAG로 아실 전달을 촉매하여, 그에 따라서 TAG와 라이소-PC 생성을 유발한다는 것을 보여준다.
효모 PDAT의 기질 특이성을 아실 공여체의 머리부위, 전달되는 아실기 및 수용체인 DAG 분자의 아실쇄에 관련해서 더 분석하였다. 에스 세레비지애 (S.cerevisiae)의 주요한 두개의 막지질은 도 4B (막대 1과 2)에 도시된 PC와 PE이고, PDAT로 촉매되는 반응에서 디올레오일-PE는 디올레오일-PC보다 아실 공여체로서 4배 더 효율적이다. 게다가, 아실 전달 속도는 전달될 아실기의 유형에 따라 매우 달라진다. 따라서, PC의 sn-2 위치에 있는 리시놀레오일기는 동일 위치에 있는 올레오일기보다 2.5배 더 효율적으로 TAG에 전달되었다 (도 4B의 막대 1과 3). 반면, 효모 PDAT는 올레오일기보다 베르놀로일기를 더 잘 전달하지는 않았다 (도 4B의 막대 1 과 4). 또한, 수용체 DAG 분자의 상기 아실쇄도 반응의 효율에 영향을 미친다. 따라서, 리시놀레오일기나 베르놀로일기를 가진 DAG는 디올레오일-DAG보다 더 효율적인 아실 수용체이다 (도 4B의 막대 1, 5 및 6). 종합해보면, 이러한 결과는 PDAT로 촉매되는 아실 전달이 기질인 지질의 성질에 따라 매우 달라진다는 것을 명료하게 보여준다.
PDAT 유전자. 몇몇 PDAT 유전자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 서열 1 내지 15에 나타나 있다. 더 나아가 잠정 서열 및(또는) 부분 서열이 서열번호 16 내지 20과 21 내지 31에 각각 나타나 있다. 아라비돕시스 게놈 서열 중 하나 (서열 4)가 아라비돕시스 EST cDNA 클론 T04806으로 확인되었다. 이 cDNA 클론은 완전히 특성을 밝혀내어 그 뉴클레오티드 서열이 서열 5에 나타나 있다. T04806 cDNA와 아라비놉시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 게놈 DNA 서열 (서열 4)의 서열 상동성을 기초로 하면, 부가의 A가 cDNA 클론의 417번 위치에서 존재함이 명백하다 (자료 미포함). 이 뉴클레오티드를 제거하면 서열 12에서 도시한 아미노산 서열이 된다.
효모 PDAT를 발현하는 아라비돕시스 탈리아나의 종자에서의 증가된 TAG 함량. 아라비돕시스 탈리아나에서 효모의 PDAT를 발현시키기 위해, pBluescript-PDAT로부터 EcoRI 단편을 취하여 나핀 프로모터 (napin promotor) (25)와 함께 pGPTV-KAN 벡터로 클로닝하였다 (26). 올바른 방향으로 효모 PDAT 유전자가 클로닝된 플라스미드 (pGNapPDAT)를 확인하였고, 이 플라스미드로 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시켰다. 이들 박테리아를 뿌리 형질 전환 방법으로 아라비돕시스 탈리아나 컬럼비아 (C-24) 식물을 형질전환시키는데 사용하였다 (27). 공벡터로 형질전환된 식물을 대조군으로 사용하였다.
제1세대 종자 (T1)를 수확하여 카나마이신을 함유한 배지에서 발아시켰다. 제2세대 종자 (T2)를 각 식물로부터 한데 모아서 메탄올 중의 2％ 황산으로 85℃에서 1.5 시간동안 처리하여 종자를 메틸화시킨 후에 기체 액체 크로마토그래피에 의하여 메틸 에스테르를 정량함으로써 종자의 지방산 함량을 분석하였다. 헵타데칸산 메틸 에스테르를 내부 표준으로 하여 정량하였다.
pGNapPDAT로 형질전환시켜 하나의 T1 식물 (26-14)로부터 7개의 T2 식물을 얻었는데, 이중에서 식물 3개는 클론이 없는 벡터로 형질 전환된 T1 식물 32-4로부터 파생된 T2 식물의 종자보다 통계적으로 (양측검정의 평균차) 높은 기름 함량을 갖는 종자를 생산하였다 (표 2).
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표 1.
발생 중인 피마자의 마이크로좀 조제물 내에서 트리아실글리세롤의 시험관내 합성. 마이크로좀의 분취액 (PC 20 nmol)을 동결건조하고 기질이 되는 지질을 벤젠 용액에 첨가하였다: (A) [14C]-DAG 0.4 nmol (7760 dpm/nmol) 및 무표지 DAG 1.6 nmol (해당 경우에만); (B) [14C]-DAG 0.4 nmol (7760 dpm/nmol) 및 무표지 디-리시놀레오일-PC 5 nmol 및 (C) [14C]-DAG 0.25 nmol (4000 dpm/nmol) 및 무표지 DAG 5 nmol. N2를 이용해 벤젠을 증발시키고 50 mM의 인산 칼륨 0.1 ml을 첨가하여 완전히 섞은 후 30℃에서 (A) 20분 동안; 그리고 (B) 및 (C) 30분 동안 인큐베이션했다. 분석 시험은 클로로포름으로 지질을 추출하여 종료시켰다. 그 후 상기 지질을 헥산/디에틸에테르/아세트산 35:70:1.5 중에서 실리카겔 60 플레이트 (독일 다름스타트 소재 머크 (Merk)) 박층 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 방사성 지질을 가시화하여 전자 오토라디오그래피 (미국 팩커드 소재 인스턴트 이미저 (Instant Imager))에 의해 플레이트의 방사능 양을 정량하였다. 결과는 두 번 실험의 평균 수치를 나타낸 것이다.
여러 트리아실글리세롤 (TAG)에서 방사능이 형성되었다. 사용된 약자: 1-OH-, 모노-리시놀레오일-; 2-OH, 디-리시놀레오일-; 3-OH-, 트리리시놀레오일; 1-OH-1-ver-, 모노-리시놀레오일-모노베르놀레오일-; 1-OH-2-ver-, 모노-리시놀레오일-디베르놀레오일-. 방사성 표지 DAG 및 PC는 효소반응으로 조제하였다. 방사성 표지 리시놀레오일기는 지질의 sn-2-위치에, 무표지 올레오일기는 sn-1-위치에 부착하였다. 베르놀레오일- 또는 리시놀레오일 사슬을 함유한 무표지 DAG는 각각 유포비아 라가스캐 (Euphorbia lagascae) 또는 피마자의 기름에 TAG 리파제 (6)을 가하여 조제하였다. 합성 디-리시놀레오일-PC는 메타폰툼 아그리비오스 (Metapontum Agribios, 이탈리아)으로부터 협찬 받았다.
| 첨가된 TAG 내 [ 14 C]-아실기의 몰％ (1) | ||||||
| [14C]-지질이 첨가된 기질(2) | 무표지 지질(2) | 1-OH-TAG | 2-OH-TAG | 1-OH-ver-TAG | 1-OH-2-ver-TAG | 3-OH-TAG |
| A 모노-[14C]-리시놀레오일-DAG | 모노-리시놀레오일-DAG | 2.8 | 12.4 | - | - | - |
| A 모노-[14C]-리시놀레오일-DAG | 모노-베르놀레오일-DAG | 3.2 | 12.1 | 1.3 | - | - |
| A 모노-[14C]-리시놀레오일-DAG | 디-베르놀레오일-DAG | 4 | 10 | 0.5 | 1.2 | - |
| A 모노-[14C]-리시놀레오일-DAG | 디-리시놀레오일-PC | 0.3 | 24.8 | - | - | - |
| B 모노-[14C]-리시놀레오일-PC | 없음 | 6.8 | 8.0 | - | - | 4.7 |
| C 모노-[14C]-리시놀레오일-PC | 디-올레오일-DAG | 8.6 | 9.8 | - | - | 5.0 |
| C 모노-[14C]-리시놀레오일-PC | 모노-리시놀레오일-DAG | 5.7 | 16.7 | - | - | 1.9 |
| C 모노-[14C]-리시놀레오일-PC | 디-리시놀레오일-DAG | 4.5 | 9.4 | - | - | 9.5 |
| C 모노-[14C]-리시놀레오일-PC | 모노-베르놀레오일-DAG | 6.0 | 11.5 | 10.9 | 0.5 | 7.4 |
| C 모노-[14C]-리시놀레오일-PC | 디-베르놀레오일-DAG | 6.7 | 10.8 | 1.1 | 8.4 | 6.8 |
표 2.
나핀 프로모터 제어 하의 효모 PDAT 유전자로 형질전환되거나 (26-14) 공벡터로 형질전환된 (32-4) 아리비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis Thaliana) 식물 개개에서 한데 모아진 T2 종자의 단위 mg 당 총 지방산.
| T1 식물 | T2 식물 번호 | 종자 mg 당 지방산 nmol | 표준 편차 |
| 32-4 | 1 | 1277 | ±11 (n=2) |
| 4 | 1261 | ±63 (n=3) | |
| 5 | 1369 | ±17 (n=3) | |
| 6 | 1312 | ±53 (n=4) | |
| 7 | 1197 | ±54 (n=5) | |
| 8 | 1240 | ±78 (n=4) | |
| 9 | 1283 | ±54 (n=5) | |
| 10 | 1381 | ±35 (n=5) | |
| 26-14 | 1 | 1444 | ±110 (n=4) |
| 2 | 1617* | ±109 (n=4) | |
| 3 | 1374 | ±37 (n=2) | |
| 5 | 1562* | ±70 (n=4) | |
| 6 | 1393 | ±77 (n=4) | |
| 7 | 1433 | ±98 (n=4) | |
| 8 | 1581* | ±82 (n=4) | |
| *: α= 5에서의 평균차 양측 시험법 (two-sided test)으로 나타낸 대조 식물과 PDAT로 형질전환된 식물 사이의 통계적 차이 |
<서열의 기술>
서열 1: GenBank 기탁 번호 Z71623과 뉴클레오티드 1302481인 사카로마이세스 세레비지애의 PDAT 유전자인 YNR008w의 게놈 DNA 서열 및 추정되는 아미노산 서열.
서열 2: 사카로마이세스 세레비지애로부터 추정되는 YNR008w 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열.
서열 3: 스키조사카로마이세스 펌비 유전자인 SPBC776.14의 게놈 DNA 서열.
서열 4: GenBank 기탁 번호 AB006704인 아라비돕시스 탈리아나 좌위의 일부 게놈 DNA 서열.
서열 5: GenBank 기탁 번호 T04806 및 뉴클레오티드 315966인 아라비돕시스 탈리아나 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열.
서열 6: GenBank 기탁 번호 T04806인 아라비돕시스 탈리아나 cDNA 클론의 예측된 아미노산 서열.
서열 7: GenBank 기탁 번호 AI491339 및 뉴클레오티드 4388167인 지 (Zea) 산사나무 EST 클론의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열.
서열 8: GenBank 기탁 번호 AI491339 및 뉴클레오티드 4388167인 지 산사나무 EST 클론의 예측된 아미노산 서열.
서열 9: GenBank 기탁 번호 AI39864 및 뉴클레오티드 4241729인 뉴로스포라 크라사 EST 클론의 일부 DNA 서열.
서열 10: GenBank 기탁 번호 AC004557인 아라비돕시스 탈리아나 좌위의 일부게놈 DNA 서열.
서열 11: GenBank 기탁 번호 AC003027인 아라비돕시스 탈리아나 좌위의 일부 게놈 DNA 서열.
서열 12: GenBank 기탁 번호 AI486635인 라이코페르시콘 에스큘렌툼 cDNA 클론의 일부 DNA 서열.
서열 13: 스키조사카로마이세스 펌비 유전자인 SPBC776.14의 스키조사카로마이세스 펌비의 오픈 리딩 프레임으로 추정되는 CAA22887의 아미노산 서열.
서열 14: GenBank 기탁 번호 AC004557인 아라비돕시스 탈리아나 좌위로부터 유래된 아라비돕시스 탈리아나의 오픈 리딩 프레임으로 추정되는 AAC80628의 아미노산 서열.
서열 15: GenBank 기탁 번호 AC003027인 아라비돕시스 탈리아나 좌위로부터 유래된 아라비돕시스 탈리아나의 오픈 리딩 프레임으로 추정되는 AAD10668의 아미노산 서열.
임시 및(또는) 부분적인 서열은 하기 서열로 정의하였다:
서열 16: 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 효모 ORF인 YNR008w의 아미노산 서열.
서열 17: 아라비돕시스 탈리아나 게놈 서열 (AC004557) 영역의 아미노산 서열.
서열 18: 아라비돕시스 탈리아나 게놈 서열 (AB006704) 영역의 아미노산 서열.
서열 19: 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 효모 ORF인 YNROO8w의 해당 게놈 DNA 서열과 아미노산 서열.
서열 20: 상기 해당 게놈 DNA 서열로부터 유래된 사카로마이세스 세레비지애 효모 ORF의 아미노산 서열.
서열 21: GeneBank 뉴클레오티드 1302481인 사카로마이세스 세레비지애의 PDAT 유전자 YNR008w의 게놈 DNA 서열 및 상기 YNR008w의 추정 아미노산 서열.
서열 22. 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 효모 유전자인 YNR008w의 추정 아미노산 서열.
서열 23. 스키조사카로마이세스 펌비 유전자 SPBC776.14의 게놈 DNA 서열.
서열 24. GenBank 기탁 번호 AB006704인 아라비돕시스 탈리아나의 게놈 DNA 서열.
서열 25. GenBank 기탁 번호 T04806 및 315966인 아라비돕시스 탈리아나 EST-클론인 뉴클레오티드 서열 및 해당 아미노산 서열.
서열 26. GenBank 기탁 번호 4388167인 지 산사나무 cDNA 클론의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열.
서열 27. GenBank 기탁 번호 4388167인 지 산사나무 cDNA 클론의 아미노산 서열.
서열 28. 4241729인 뉴로스포라 크라사 cDNA 클론 WO7G1의 일부 DNA 서열.
서열 29. GenBank 기탁 번호 AC004557인 아라비돕시스 탈리아나 좌위의 일부게놈 DNA 서열.
서열 30. GenBank 기탁 번호 AC003027인 아라비돕시스 탈리아나 좌위의 일부 게놈 DNA 서열.
서열 31. GenBank 기탁 번호 AI486635인 라이코페르시콘 에스큘렌툼 cDNA 클론의 일부 DNA 서열.
Claims (27)
- 트리아실글리세롤의 생산을 위한 생합성 경로에서 인지질로부터 디아실글리세롤로의 지방산 전달을 아실-CoA와는 독립적인 반응을 통해 촉매하는 효소.
- 제1항에 있어서, 서열 2에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, 유도체, 대립 형질, 유사체 또는 동위 효소를 포함하는 효소.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT)로 지칭되는 효소.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 16, 20 또는 22에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, 유도체, 대립 형질, 유사체 또는 동위 효소를 포함하는 효소.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 6, 8, 13, 14, 15, 17, 18, 25 또는 27에 기재된 서열 또는 그의 기능적 단편, 유도체, 대립 형질, 유사체 또는 동위 효소로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 효소.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11,12, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 또는 31에 기재된 서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드, 그의 일부, 유도체, 대립 형질 또는 유사체를 통해 코딩된 아미노산 서열 또는 상기 효소를 코딩하는 아미노산 서열의 기능적 단편, 유도체, 대립 형질, 유사체 또는 동위 효소를 포함하는 효소.
- 트리아실글리세롤의 생산을 위한 생합성 경로에서 인지질로부터 디아실글리세롤로의 지방산 전달을 아실-CoA와는 독립적인 반응을 통해 촉매하는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드.
- 제7항에 있어서, 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (PDAT)로 지칭되는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 서열 1, 3, 4, 10, 11, 19, 21, 23, 24, 29 또는 30에 기재된 서열 또는 그의 일부, 유도체, 대립 형질 또는 유사체로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열.
- 제7항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 5, 7, 9, 12, 25, 26, 28 또는 31에 기재된 서열 또는 그의 일부, 유도체, 대립 형질 또는 유사체로 구성된 군으로부터 선택된 전장 뉴클레오티드 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 일부.
- 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 또는 31에 기재된 서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과의 상동성이 40％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열.
- 이종 핵산에 작동 가능하게 연결된 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조물.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열 또는 제12항의 유전자 구조물을 포함하는 벡터.
- 제13항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 선별 마커 유전자 및(또는) 숙주 세포에서의 복제 또는 숙주 세포 게놈으로의 삽입을 위한 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 벡터.
- 제7항 내지 11항 중 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열 및(또는) 제12항의 유전자 구조물 및(또는) 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 형질 변환 세포 또는 생물체.
- 제16항에 있어서, 진핵 세포 또는 생물체인 형질 변환 세포 또는 생물체.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 효모 세포 또는 식물 세포 또는 식물인 형질 변환 세포 또는 생물체.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 트리아실글리세롤 생합성 경로가 변형된 형질 변환 세포 또는 생물체.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 기름 함량이 변형된 형질 변환 세포 또는 생물체.
- 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, PDAT의 활성이 변형된 형질 변환 세포 또는 생물체.
- 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, PDAT의 활성 변형이 유전자 발현, 촉매 활성 및(또는) 상기 효소의 활성 조절 변형을 특징으로 하는 형질 변환 세포 또는 생물체.
- 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 트리아실글리세롤 생산을 위한생합성 경로의 변형이 막지질에서 바람직하지 못한 지방산의 축적을 막는 것임을 특징으로 하는 형질 변환 세포 또는 생물체.
- 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 상기 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 조건 하에서 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항의 형질 변환 세포 또는 생물체를 배양하는 것을 포함하는 트리아실 글리세롤의 생산 방법.
- 제24항에서의 방법으로 생산된 트리아실글리세롤.
- 트리아실글리세롤의 생산 및(또는) 희귀 지방산 함유 트리아실글리세롤의 생산에 있어서의, 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열 및(또는) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 효소의 용도.
- 임의의 세포 또는 생물체를 형질 전환시켜 상기 세포 또는 생물체 내에서 발현시키고 그 결과 상기 세포 또는 생물체 내에 변형된, 바람직하게는 증가된 기름 함량을 얻기 위한 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 뉴클레오티드 서열 및(또는) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 효소의 용도.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |