BR112012013424B1 - usos de colesterol c25-hidroxilase para hidroxilar ergosterol e 7-desidrocolesterol e métodos de produção de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol e 25-hidroxiergosterol - Google Patents

Abstract

PRODUÇÃO DE ESTERÓIS NÃO-LEVEDURAS POR LEVEDURAS Esta invenção está relacionada á produção de 7-desidrocolesteral, 25-didróxi-7-desidrocolesterol e 25-hidróxi-ergosterol em leveduras como, por exemplo, saccharomyces cerevisiae. Ela também está relacionada a várias enzimas que catalisam a redução da ligação dupla na posição 24 de lanosterol, dimetil zimosterol, metilzimosterol, zimosterol, colesta-7,24- dienol ou colesta-5,7,24-trienol; ou a hidroxilação na posição 25 de ergosterol, 7-desidrocolesterol, colesta-8 e colesta-7 enol. Ela também está relacionada a várias ácidos nucléicos que codificam colesterol C25-hidroxilases e esterol (DELTA)24-redutases e seu uso para produzir e hidroxilar 7-desidrocolesterol ou ergosterol. Ela também está relacionada ás cepas de levedura assim produzidas, e aos métodos de produção desses esteróis que compreendem as etapas de cultivo de uma célula de uma levedura transformada e a coleta do esterol (ou esteróis) resultante.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção está relacionada à produção de esteróis, incluindo 7-desidrocolesterol, 25-hidróxi-7- desidrocolesterol e 25-hidróxi ergosterol em leveduras como, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae. Ela também está relacionada a várias enzimas que catalisam a redução da ligação dupla na posição 24 de zimosterol, colesta-7,24- dienol e colesta-5,7,24-trienol; ou a hidroxilação na posição 25 de ergosterol, 7-desidrocolesterol, colesta-8- enol e colesta-7-enol. Ela também está relacionada a vários ácidos nucléicos que codificam colesterol C25-hidroxilases e esterol Δ24-redutases e seu uso para produzir e hidroxilar 7-desidrocolesterol ou ergosterol. Ela também está relacionada às cepas de levedura assim produzidas, e aos métodos de produção desses esteróis que compreendem as etapas de cultivo de uma célula de levedura transformada, e a coleta do esterol (ou esteróis) resultante.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A via do esterol em leveduras envolve muitas etapas. Um diagrama da via do esterol de levedura é apresentado como FIGURA 14, e é feita referência a ela na discussão da técnica estabelecida, abaixo. US 5.460.949 (Amoco) ensina um método e composição para aumento do acúmulo de esqualeno e trienol em levedura. Esse método inclui o truncamento e superexpressão de HMG1 (o gene único mais importante na regulação da via) em uma cepa na qual os genes ERG5 e ERG6 são inativados. ERG5 e ERG6 codificam as duas atividades de enzimas que distinguem ergosterol, que é o principal esterol de leveduras e fungos, da biossíntese de colesterol. Essas cepas preferivelmente acumulam colesta-5,7,24-trienol, que é normalmente um intermediário da biossíntese de colesterol. WO 03/064650 (Lang e cols.) (US 2006/0240508) revela um método para a produção de 7-desidrocolesterol e/ou o intermediário biossintético ou produtos subseqüentes em leveduras. Aqui, os genes para a C-8 esterol isomerase, a C-5 esterol dessaturase e a esterol Δ24-redutase de camundongo e humanos foram expressos em uma cepa de levedura na qual ERG5 e ERG6 foram inativados e o gene HMG1 foi truncado e superexpresso. Essas leveduras eram capazes de sintetizar 7-desidrocolesterol. WO 03/064652 (Lang e cols.) (US 2006/0088903) revela um método para a produção de zimosterol e/ou o intermediário biossintético e/ou produtos subseqüentes deste em levedura transgênica por aumento da atividade de lanosterol-C14-desmetilase (ERG11). WO 2005/121315 (Aventis) ensina cepas de levedura produtoras de colesterol e usos destas. Um gene de esterol Δ7 redutase de Arabidopsis thaliana e um gene de esterol Δ24-redutase humana foram introduzidos em várias cepas hospedeiras de leveduras nas quais ERG6 e, em alguns casos, ERG5, foram inativados. As novas cepas foram capazes de produzir colesterol misturado com outros intermediários. US 6.562.609 (Russell e cols.) ensina uma colesterol C25-hidroxilase isolada humana e de camundongo e genes.

A técnica estabelecida é omissa quanto à produção 25- hidroxiprovitamina D3 ou 25-hidroxiprovitamina D2 usando levedura transgênica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Foi verificado de acordo com esta invenção que a enzima colesterol C25-hidroxilase (cujo substrato é normalmente colesterol) pode atuar sobre 7- desidrocolesterol e ergosterol para produzir 25-hidróxi-7- desidrocolesterol e 25-hidroxiergosterol, respectivamente.

Dessa forma, um aspecto desta invenção é o uso de uma colesterol C25-hidroxilase de vertebrado para hidroxilar 7- desidrocolesterol ou ergosterol a fim de produzir 25- hidróxi-7-desidrocolesterol (também denominado 25- hidroxiprovitamina D3) ou 25-hidroxiergosterol (também denominado 25-hidroxiprovitamina D2), respectivamente.

A colesterol C25-hidroxilase não é uma enzima que existe naturalmente em leveduras; na verdade, leveduras normalmente não possuem a habilidade para hidroxilar a cadeia lateral de 7-desidrocolesterol, que pode estar presente em leveduras. No entanto, de acordo com esta invenção, podem ser feitas leveduras geneticamente modificadas para converter colesta-5,7,24-trienol em 25- hidróxi-7-desidrocolesterol (25-hidroxiprovitamina D3) pelo processo de: fornecimento da levedura com um ácido nucléico que codifica uma colesterol C25-hidroxilase e cultivo da levedura sob condições de tal forma que a levedura hidroxile 7-desidrocolesterol, pelo qual 25-hidróxi-7-desidrocolesterol (25- hidroxiprovitamina D3) é produzido.

No processo acima, prefere-se que a levedura tenha tido os genes ERG5 e ERG6 inativados, e que ela também tenha sido fornecida com um ácido nucléico que codifica uma enzima esterol Δ24-redutase de vertebrado que tenha sido otimizada para expressão em leveduras.

Também foi verificado, de acordo com esta invenção, que podem ser feitas leveduras geneticamente modificadas para converter ergosterol em 25-hidroxiergosterol (também denominado 25-hidroxiprovitamina D2) pelo processo de: fornecimento da levedura com um ácido nucléico que codifica uma colesterol C25-hidroxilase e cultivo da levedura sob condições de tal forma que a levedura hidroxile ergosterol, pelo qual 25-hidroxiergosterol (25-hidroxiprovitamina D2) é produzido.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Nas FIGURAS seguintes, estas abreviações são usadas: TDH3p é a região promotora de TDH3 (gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase isozima 3 de S. cerevisiae); Ori-pBR é a origem de replicação de ColE1 de pBR322 para E. coli; bla é o gene de β-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli; 2 μ é o fragmento grande do vetor multicópias de 2 μ que carrega a origem de replicação para S. cerevisiae; PGK1t é a região terminadora de PGK1 (3-fosfoglicerato quinase de S. cerevisiae); URA3 é o marcador de auxotrofia de URA3 de S. cerevisiae para uracil; Bam HI, Eco RI, Hind III, Bgl II, Age I referem-se aos sítios de restrição das enzimas de restrição correspondentes;

As localizações dos sítios no vetor são indicadas entre parênteses começando da posição 1 do sítio único Bam HI. FIGURA 1: Mapa de restrição do plasmídeo V51TDH-S24R1. S24R-1 é o gene sintético S24R1 que codifica a suposta esterol Δ24-redutase de Rattus norvegicus; FIGURA 2: Mapa de restrição do plasmídeo V51TDH-S24R2. S24R-2 para o gene sintético S24R2 que codifica a suposta esterol Δ24-redutase de Danio rerio. FIGURA 3: Mapa de restrição do plasmídeo pFLAde-S24R1. S24R1 para o gene sintético S24R1 que codifica a suposta esterol Δ24-redutase de R. norvegicus; ARS-CEN é a origem de replicação autonomamente centromérica para S. cerevisiae; ADE2 para o gene ADE2 de S. cerevisiae. FIGURA 4: Mapa de restrição do plasmídeo V51-C25H1. GALp representa a região promotora indutível de galactose GAL10-CYC1 (Guarente e cols., 1982); C25H-1 para o gene sintético C25H1 que codifica a suposta colesterol C25- hidroxilase de Sus scrofa. FIGURA 5: Mapa de restrição do plasmídeo V51-C25H3. GALp representa a região promotora indutível de galactose GAL10-CYC1 (Guarente e cols., 1982); C25H-3 para o gene sintético C25H3 que codifica a suposta colesterol C25- hidroxilase de Canis familiaris; Todos os perfis de HPLC, registrados a UV 282 nm, foram realizados como descrito no Exemplo 9 com extratos de esterol feitos como descrito no Exemplo 8. Abreviações: C5,7,22,24 = colesta-5,7,22,24-tetraenol; C5,7,24 = colesta-5,7,24-trienol; C5,7,22 = colesta-5,7,22-trienol; C5,7 = colesta-5,7-dienol ou 7-desidrocolesterol; 25OH-C5,7-Ac = acetato de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol; 25OH-E5,7,22-Ac = acetato de 25-hidróxi ergosterol; E5,7,22,24 = ergosta 5,7,22,24-tetraenol; E5,7,22 = ergosta 5,7,22-trienol (ergosterol). FIGURA 6: Perfis de eluição de HPLC de extratos de esterol de cepas que expressam supostas esterol C24- redutase. As seguintes cepas foram usadas: A: controle de ERT/V51TDH; B: ERT/V51TDH-S24R1; C: ERT/V51TDH-S24R2; D: ERT/pFLAde-S24R1. FIGURA 7: Perfis de eluição de HPLC de extratos de esterol de mutantes de erg6 que expressam supostas colesterol C25-hidroxilases. As seguintes cepas foram usadas: C: ERT/pFLAde-S24R1/V51; D: ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H1; E: ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H3. Padrões foram: A, colesta-5,7-dienol (7- desidrocolesterol, adquirido de Sigma- Aldrich, St. Louis, MO 63103, EUA); B, acetato de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol (preparado como descrito no Exemplo 9). FIGURA 8: Espectros UV de picos únicos de cepas erg6 mutantes que expressam supostas colesterol C25- hidroxilases. Os espectros UV foram determinados online entre 205 e 300 nm com o detector de PDA durante HPLC como descrito no Exemplo 9 para os seguintes picos: A: pico-padrão de 7-desidrocolesterol a 11,8 min (Figura 7, perfil A); B: pico-padrão de acetato de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol a 8,5 min (Figura 7 perfil B); C: pico de ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H1 a 8,5 min (Figura 7, perfil D). Figura 9: Perfis de espectrometria de massa de picos únicos de cepas erg6 mutantes que expressam supostas colesterol C25-hidroxilases. Os perfis de fragmentação de massa de m/z = 350 a 450 foram determinados online com o detector MicroMass ZQ durante HPLC como descrito no Exemplo 9 nos seguintes picos: A: Pico-padrão de 7-desidrocolesterol a 11,8 min (Figura 7, perfil A); B: Pico-padrão de acetato de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol a 8,5 min (Figura 7, perfil B); C: Pico de ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H1 a 8,5 min (Figura 7, perfil D). FIGURA 10: Perfis de eluição de HPLC de extratos de esterol de cepas tipo selvagem ERG6 que expressam supostas colesterol C25-hidroxilases. As seguintes cepas foram usadas: B: W303 /V51; C: W303 /V51-C25H1; D: W303 /V51-C25H3. Padrões foram: A, ergosterol (ergosta 5,7,22-trienol) adquirido de Sigma-Aldrich, St. 5 Louis, MO 63103, EUA. Figura 11: Espectros UV de picos únicos de cepas ERG6 do tipo selvagem que expressam supostas colesterol C25- hidroxilases. Os espectros UV foram determinados online entre 205 e 300 nm com o detector de PDA durante HPLC como descrito no Exemplo 9 para os seguintes picos: A: Pico-padrão de ergosterol a 11,9 min (Figura 10, perfil A); B: Pico de W303/V51-C25H1 a 10,0 min (Figura 10, perfil C); C: Pico de W303/V51-C25H1 a 8,7 min (Figura 10, perfil C). Figura 12: Perfis de espectrometria de massa de picos únicos de cepas ERG6 do tipo selvagem que expressam supostas colesterol C25-hidroxilases. Os perfis de fragmentação de massa de m/z = 350 a 450 foram determinados online com o detector MicroMass ZQ durante HPLC como descrito no Exemplo 9 nos seguintes picos: A: Pico-padrão de ergosterol a 11,9 min (Figura 10, perfil A); B: Pico de W303/V51-C25H1 a 10,0 min (Figura 10, perfil C); C: Pico de W303/V51-C25H1 a 8,7 min (Figura 10, perfil C). Figura 13: A parte tardia da via biossintética de esterol de levedura do tipo selvagem (esteróis do tipo ergosta) comparada com levedura na qual ERG6 está inativado (esteróis do tipo colesta). As enzimas estão realçadas em itálico. Setas preenchidas representam reação da enzima encontrada em levedura do tipo selvagem. Setas pontilhadas correspondem às etapas catalisadas por atividades heterólogas (suposta esterol Δ24-redutase, supostas colesterol C25-hidroxilases); as enzimas correspondentes estão sublinhadas. Figura 14: É um diagrama da via do esterol de levedura. Figura 15: É uma comparação da conversão de 7- desidrocolesterol em 25-hidróxi-7-desidrocolesterol (HyDHC) por dez genes de 25-hidroxilase diferentes. As cepas de S. cerevisiae Ecab_HY (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 26), Ecab opt 2.0 (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 25), Ptro opt 2.0 (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 19), Ptro HY (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 20), ConHyD HY (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 31), ConHyD opt 2.0 (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 30), Rnor HY (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 23), Rnor opt 2.0 (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 22), Sscr HY (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 28), Sscr opt 2.0 (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N° : 27) e Scr Pompon, que contém a 25-hidroxilase de porco otimizada como descrito no Exemplo 2, foram cultivadas como descrito no Exemplo 20. Os esteróis foram isolados dos péletes de células e o teor de HyDHC, a proporção de HyDHC de esteróis totais e a conversão de 7-DHC em HyDHC foram comparados com os valores obtidos por integração da 25-hidroxilase C25H1. Todos os novos genes de hidroxilase foram expressos e o produto gênico destes foram capazes de hidroxilar 7-DHC em HyDHC.

DEFINIÇÕES

Ao longo da especificação e das reivindicações, as seguintes definições se aplicam: “Levedura” se refere a Saccharomyces cerevisiae, bem como a outras leveduras que são adequadas para produção em escala comercial, por exemplo, Schizosaccharomyces spp., Pichia spp, Klyuveromyces spp., Hansenula spp. e Yarrowia lipolytica. “Condições-padrão” para hibridização significam, no contexto da presente invenção, as condições que são geralmente usadas por aqueles habilitados na técnica para detectar sinais de hibridização específicos e que são descritas, por exemplo, por Sambrook e cols., “Molecular Cloning”, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Nova York, que é aqui incorporado por referência. Um exemplo de uma “condição de hibridização rigorosa” é incubação de um dia para o outro (por exemplo, 15 horas) a 42°C em uma solução que compreende: formamida 50%, 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trissódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 x solução de Denhardt, sulfato de dextrana 10% e 20 μg/ml de DNA cisalhado, desnaturado, de esperma de salmão, seguido por lavagem do suporte de hibridização em 0,1 x SSC a aproximadamente 65°C.

O termo “% de identidade”, como conhecido na técnica, significa o grau de relação entre sequências de polipeptídeos ou de polinucleotídeos, dependendo do caso, como determinado pela compatibilidade entre trechos dessas sequências. A “identidade” pode ser facilmente determinada por métodos conhecidos, por exemplo, com o programa BESTFIT (Suíte de Aplicativos GCG Wisconsin, versão 10.2, Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, EUA) usando os seguintes parâmetros: penalidade de criação de lacuna (gap) de 8, penalidade de extensão de lacuna de 2 (parâmetros-padrão).

Uma enzima “funcional” significa que, sob condições típicas de cultivo de leveduras, uma enzima realizará a atividade desejada dentro da levedura. Por exemplo, uma “colesterol C25-hidroxilase funcional” significa que, em uma célula de levedura in vivo, a colesterol C25- hidroxilase converterá 7-desidrocolesterol em 25-hidróxi-7- desidrocolesterol.

Uma sequência de ácido nucléico “funcional” significa que a sequência de ácido nucléico inclui sequências necessárias (diferentes daquelas que codificam um polipeptídeo) a fim de que a levedura expresse o polipeptídeo em uma concentração em que ele é funcional. Essas sequências podem incluir promotor (promotores), sequências de terminação, intensificadores e semelhantes. Colesterol 25-hidroxilase

Dessa forma, um aspecto desta invenção é um método de produção de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol ou 25- hidroxiergosterol em uma célula de levedura que compreende: o contato de 7-desidrocolesterol ou ergosterol com uma colesterol C25-hidroxilase, e obtenção de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol ou 25-hidroxiergosterol. De preferência, a colesterol C25-hidroxilase é uma enzima originária de um vertebrado, mais preferivelmente de rato, porco, cão, cavalo, humana, de chimpanzé, de Macaca mulata, camundongo, Gallus gallus, Xenopus laevis, Danio rerio ou Ornithorynchus anatinus. Além disso, derivados dessas enzimas nativas, ou seja, aquelas nas quais a sequência de aminoácidos não é mais a mesma que a enzima nativa, podem ser usados, desde que retenham sua habilidade para funcionar. Por exemplo, esta invenção engloba o uso de enzimas que compartilham pelo menos 90% de identidade com uma C25-hidroxilase de vertebrado nativa e, preferivelmente, aquelas com pelo menos 95% de identidade e, mais preferivelmente, pelo menos 99% de identidade, desde que a enzima derivada retenha sua funcionalidade.

Similarmente, os ácidos nucléicos que podem ser usados nesta invenção são aqueles que codificam as sequências peptídicas acima, e aqueles que hibridizam sob condições rigorosas para aqueles que codificam as sequências peptídicas acima. De preferência, eles são isolados. Além disso, em algumas modalidades, o ácido nucléico que codifica a enzima C25-hidroxilase foi códon-otimizada para ser mais bem adequada ao ambiente da levedura. Em modalidades preferidas, o ácido nucléico é de porco, rato, cão, chimpanzé ou cavalo, e foi códon-otimizado para levedura. Ácidos nucléicos particularmente preferidos são aqueles que foram códon-otimizados, de tal forma que sejam expressos em um hospedeiro de levedura pelo menos tão bem quanto a sequência de ácido nucléico de referência “Sscr Pompon ID. DE SEQ. N°: 5” e, mais preferivelmente, a sequência de ácido nucléico é expressa melhor do que Sscr Pompon”. Os ácidos nucléicos são preferivelmente DNAs.

Ácidos nucléicos particularmente preferidos são aqueles designados como: C25 H1 (com base na hidroxilase de porco; ID. DE SEQ. N°: 5), C25 H3 (com base na hidroxilase de cão: ID. DE SEQ.

Ecab_HY ou Ecab_25OH opt 2.0 (com base na hidroxilase de cavalo: IDS. DE SEQ. Nos: 25 e 26), ConHYD opt 20 (ID. DE SEQ. N°: 30), Rnor HY (com base na hidroxilase de rato ID. DE SEQ. N°: 23), Sscr HY (ID. DE SEQ. N°: 28), Sscr opt 20 (ID. DE SEQ. N°: 27), Sscr Pompon (ID. DE SEQ. N°: 5).

Outro aspecto desta invenção é uma célula de levedura que compreende uma colesterol C25-hidroxilase funcional. Um aspecto adicional desta invenção é uma levedura que é capaz de converter 7-desidrocolesterol ou ergosterol em 25- hidróxi-7-desidrocolesterol ou 25-hidroxiergosterol, respectivamente.

Um aspecto adicional desta invenção é um método de produção de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol em uma levedura que compreende a permissão da expressão de uma colesterol C25-hidroxilase de vertebrado na presença de 7- desidrocolesterol sob condições de cultura que permitem que ocorra a reação de hidroxilação, resultando na produção de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol. Um aspecto adicional desta invenção é um método de produção de 25-hidroxiergosterol em uma levedura que compreende a permissão da expressão de uma colesterol C25-hidroxilase de vertebrado na presença de ergosterol sob condições de cultura que permitem que ocorra a reação de hidroxilação, resultando na produção de 25- hidroxiergosterol.

Prefere-se que múltiplas cópias do gene estejam presentes no vetor de expressão. Em modalidades preferidas, são usadas 2-5 cópias.

Vetores para a clonagem de qualquer um dos genes mencionados anteriormente no hospedeiro de levedura podem ser de qualquer tipo sabidamente útil para clonagem, particularmente plasmídeos e plasmídeos centroméricos que carregam os genes de C25-hidroxilase e sequências de expressão e/ou integração associadas, incluindo promotores e intensificadores comumente usados na técnica, e esses vetores constituem outro aspecto desta invenção.

Em uma levedura que é capaz de produzir 7- desidrocolesterol, por exemplo, aquela descrita em US 2006/0242508, prefere-se que os genes ERG5 e ERG6 sejam inativados e uma esterol Δ24-redutase que se origina de um vertebrado seja expressa, tais como aquelas descritas posteriormente abaixo. Além disso, sob algumas circunstâncias, é vantajoso superexpressar uma versão truncada de HMG1 em uma levedura desse tipo. Essas cepas com genes ERG5 e ERG6 inativados e HMG1 truncados foram descritas na técnica.

A 25-hidroxiprovitamina D3 ou 25-hidroxiprovitamina D2 pode então ser convertida em 25-hidroxivitamina D3, o primeiro metabólito e a forma circulante de vitamina D3, ou D2, respectivamente, usando procedimentos conhecidos de irradiação com luz UV. 25-hidroxivitamina D3 possui um papel importante na formação óssea, e é usada comercialmente como um suplemento vitamínico em rações de aves domésticas e de outros animal. Ela é comercialmente disponível por DSM Nutritional Products sob o nome comercial ROVIMIX HY-D®. A 25-hidroxivitamina D2 mostra efeitos comparáveis à 25-hidroxivitamina D3 no corpo e pode ser usada de forma similar à utilização de 25- hidroxivitamina D3. Esterol Δ24-redutases

Outro aspecto desta invenção consiste em novos ácidos nucléicos que codificam uma esterol Δ24-redutase e que podem ser expressos por uma levedura e podem converter um substrato selecionado do grupo que consiste em: lanosterol, dimetil zimosterol, metil zimosterol, zimosterol, colesta- 7,24-dienol ou colesta-5,7,24-trienol em um produto selecionado do grupo que consiste em: 3β-hidr0xi-8-lanosta- 8-eno, 4,4-dimetil-colesta-8-enol, 4α-metil-colesta-8-enol, colesta-8-enol, latosterol e 7-desidrocolesterol, desde que a sequência de ácido nucléico não seja uma sequência de ácido nucléico humana ou de camundongo.

De preferência, a célula de levedura é uma na qual ERG6 e ERG5 estão inativados. De preferência, esses ácidos nucléicos são DNAs modificados de origem de vertebrado que foram códon-otimizados para a célula hospedeira, desde que não seja de camundongo ou humano. De preferência, a esterol Δ24-redutase é de porco, cão, chimpanzé, Macaca mulata, camundongo, rato, cavalo, Gallus gallus, Xenopus laevis, Danio rerio ou Ornithorynchus anatinus.

Em modalidades particularmente preferidas, estes são DNAs de rato (Rattus norvegicus) ou peixe-zebra (Danio rerio) e, em modalidades mais preferidas, eles foram códon- otimizados para expressão em Saccharomyces cerevisiae. Ácidos nucléicos particularmente preferidos são designados S24R1 (gene de rato modificado, nucleotídeos 10 a 1563 do ID. DE SEQ. N°: 1) e S24R2 (gene de peixe-zebra modificado, nucleotídeos 10 a 1563 do ID. DE SEQ. N°: 3).

Outro aspecto desta invenção é uma sequência de ácido nucléico de vertebrado, preferivelmente DNA, que foi códon- otimizada para expressão em um hospedeiro de levedura, e que codifica uma enzima esterol Δ24-redutase funcional, de tal forma que, dentro de uma célula hospedeira de levedura, a enzima pode converter: lanosterol em 3β-hidr0xi-8-lanosta-8-eno, ou dimetil zimosterol em 4,4-dimetil-colesta-8-enol; metil zimosterol em 4α-metil-colesta-8-enol; zimosterol em colesta-8-enol; colesta-7,24-dienol em latosterol; ou colesta-5,7,24-trienol em 7-desidrocolesterol; e o ácido nucléico que codifica a enzima pode hibridizar para S24R1 ou S24R2 sob condições rigorosas, desde que a sequência de ácido nucléico de vertebrado não seja uma sequência de ácido nucléico isolada de humano ou de camundongo.

Outro aspecto desta invenção são as enzimas codificadas pelas sequências de ácidos nucléicos mencionadas anteriormente. Enzimas preferidas desta invenção são aquelas apresentadas como ID. DE SEQ. N°: 2 e 4 e aquelas que exibem pelo menos 90%, e preferivelmente 95% de identidade para o ID. DE SEQ. N°: 2 ou 4, e que também podem converter: lanosterol em 3β-hidr0xi-8-lanosta-8-eno, dimetil zimosterol em 4,4-dimetil-colesta-8-enol, metil zimosterol em 4α-metil-colesta-8-enol, zimosterol em colesta-8-enol, colesta-7,24-dienol em latosterol, ou colesta-5,7,24-trienol em 7-desidrocolesterol dentro do ambiente de uma célula de levedura.

Outro aspecto desta invenção é um hospedeiro de levedura que contém uma sequência de ácido nucléico funcional, como descrito acima, e, particularmente, um hospedeiro de levedura como, por exemplo, S. cerevisiae, que compreende S24R1, S24R2, ou uma sequência de ácido nucléico que hibridiza para S24R1 ou S24R2 sob condições rigorosas, desde que o ácido nucléico não seja uma sequência humana nem de camundongo. Em modalidades preferidas, os hospedeiros de levedura tiveram ERG5 e ERG6 inativados; e, em uma modalidade particularmente preferida, o hospedeiro de levedura também superexpressa uma versão truncada do gene de HMG1.

Ainda outro aspecto desta invenção é um método de produção de 3β-hidr0xi-8-lanosta-8-eno, 4,4-dimetil- colesta-8-enol, 4α-metil-colesta-8-enol, colesta-8-enol, latosterol ou 7-desidrocolesterol dentro de uma célula de levedura que compreende o contato de lanosterol, dimetil zimosterol, metil zimosterol, zimosterol, colesta-7,24- dienol ou colesta-5,7,24-trienol com uma levedura que compreende uma sequência de ácido nucléico que foi códon- optimizada para expressão em um hospedeiro de levedura e que codifica uma enzima esterol Δ24-redutase funcional, desde que a sequência de ácido nucléico não seja uma sequência de ácido nucléico humana nem de camundongo, e a levedura converte: lanosterol em 3e-hidróxi-8-lanosta-8-eno, dimetil zimosterol em 4,4-dimetil-colesta-8-enol, metil zimosterol em 4α-metil-colesta-8-enol, zimosterol em colesta-8-enol, colesta-7,24-dienol em latosterol, ou colesta-5,7,24-trienol em 7-desidrocolesterol. Nesse método, o ácido nucléico é preferivelmente S24R1, S24R2 ou um ácido nucléico que pode hibridizar para S24R1 ou S24R2 sob condições rigorosas, desde que a sequência de ácido nucléico de vertebrado não seja uma sequência de ácido nucléico humana ou de camundongo.

Outro aspecto desta invenção inclui vetores, incluindo plasmídeos, que compreendem uma sequência de ácido nucléico funcional que foi códon-optimizada para expressão em um hospedeiro de levedura e que codifica uma enzima esterol Δ24-redutase funcional, desde que a sequência de ácido nucléico não seja uma sequência de ácido nucléico humana nem de camundongo. De preferência, o vetor compreende os ácidos nucléicos S24R1, S24R2 ou um ácido nucléico que pode hibridizar para S24R1 ou S24R2 sob condições rigorosas, desde que a sequência de ácido nucléico de vertebrado não seja uma sequência de ácido nucléico humana ou de camundongo. Os vetores podem conter as sequências normais comumente encontradas em plasmídeos ou outros vetores que regulam a transcrição, tradução e/ou integração no cromossomo da levedura. Construções gênicas

Todas as construções gênicas desta invenção que codificam C25-hidroxilase ou uma esterol Δ24-redutase são tipicamente parte de um cassete de expressão que tipicamente possui o gene estranho sob o controle de promotores conhecidos que podem ser regulados com o uso de métodos-padrão, por exemplo, o promotor de ADH1, promotor de TEFL, promotor de GPD de levedura (TDH3), promotor de HXT7 de levedura, promotor de GAL1/10 de levedura ou promotor de PGK1 de levedura que controlam o gene de interesse. Adicionalmente, o cassete de expressão pode compreender sequências upstream e downstream como, por exemplo, uma sequência terminadora e/ou outros elementos reguladores que estão ligados operacionalmente à sequência codificadora para pelo menos um dos genes descritos acima. Os vetores que carregam as construções gênicas desta invenção são introduzidos na levedura com o uso de métodos convencionais.

Os exemplos seguintes são apenas ilustrativos e não visam limitar o escopo da invenção de modo algum. Os conteúdos de todas as referências, pedidos de patente, patentes e pedidos publicados de patente, citados ao longo deste pedido, são aqui incorporados por referência.

EXEMPLOS

Referências: Citações completas para referências aparecem ao final dos Exemplos. Todas as referências são aqui incorporadas por referência. Meios: Tabela 1: Composição do meio mínimo

O meio foi esterilizado por autoclavagem 20 minutos a 120°C antes de sua utilização. Triptofano estéril, uracil ou adenina (b) foram adicionados até uma concentração final de 20 mg/l, se necessário. Tabela 2: Composição do meio sintético de Kapelli.

O meio foi esterilizado por filtração através de uma unidade de filtração de 0,2 μm antes do uso. Triptofano estéril, uracil ou adenina foram adicionados até uma concentração final de 0,2 mg/ml, se necessário. EXEMPLO 1 Seleção de Δ24 (25)-esterol redutases por diferentes organismos e design de genes sintéticos Esterol Δ24-redutase catalisa uma das últimas etapas da biossíntese de colesterol. É uma enzima bem inespecífica que aceita pelo menos zimosterol e desmosterol como substrato. Em 2004, o gene correspondente foi identificado em humanos (Waterman H.R. e cols., 2001). Apenas para os produtos gênicos de humanos e camundongo, a atividade de esterol Δ24-redutase foi formalmente comprovada (Crameri A. e cols., 2006; WO 03/064650). Uma função comparável também foi descrita para o gene de rato homólogo (Wu C. e cols. 2004: Nature 432 (7017): 640-5); no entanto, sem confirmação da atividade enzimática do produto gênico. Em WO 03/064650, é mostrado que a expressão do gene de Δ24-redutase de camundongo em uma mutante S. cerevisiae (ergs erg6) resultou na formação de dois novos esteróis (latosterol e 7-desidrocolesterol), que não ocorrem na cepa hospedeira. A pesquisa de bases de dados públicas como GENBANK ou EMBL por enzimas que sejam homólogas à Δ24(25)- esterol redutase humana foi feita com o programa disponível publicamente BLASTp usado sob condições-padrão. Entre as sequências encontradas, a sequência de Rattus norvegicus, que mostra 97% de identidade de aminoácidos para a sequência de aminoácidos de Homo sapiens (Tabela 1), e a sequência de Danio rerio, que mostra 79% de identidade de aminoácidos para a sequência humana (Tabela 1), foram selecionadas para investigações posteriores. Tabela 3: Supostas proteínas homólogas à Δ24 (25)-esterol redutase humana. Os números são dados em percentual de 5 identidade de aminoácidos.

Para cada cDNA, um gene sintético para expressão em S. cerevisiae foi projetado. Em geral, é possível usar a sequência de cDNA original para essa finalidade. Em alguns casos, é vantajoso tentar adaptar o perfil de uso de códons 10 do cDNA original ao uso de códons no novo hospedeiro utilizando as tabelas de uso de códons das diferentes espécies de acordo com “Kazusa DNA Research Institute” (http://www.kazusa/or.ip/codon). Isso pode ser feito manualmente ou com o auxílio de um programa de computador. 15 Em nosso caso, foi usado um programa de computador, cujo cálculo do algoritmo envolve um gerador de sequência que permite a geração de sequências de DNA com modulação da tendência de códon definida pelo usuário. Algumas limitações também podem ser introduzidas no algoritmo para evitar ou, alternativamente, favorecer, como escolhido, a presença de sítios de restrição específicos. Parte da geração de sequência é dirigida por um gerador de número aleatório que normalmente resulta em sequências de DNA diferentes por tentativa. Não foi possível para o usuário do programa recuperar a semente usada e, dessa forma, reproduzir os resultados. Portanto, as sequências registradas não podem ser previstas e podem ser consideradas para carregar uma assinatura única e original.

A seleção entre versões de sequências de DNA alternativamente geradas era finalmente usuário-dependente (inspeção visual). A versão selecionada das sequências de DNA foi usada para síntese do gene por um fornecedor de serviço (por exemplo, GeneCust Europe, 30b Rue Dominique Lang, 3505 Dudelange, Luxemburgo). Três resíduos de adenina adicionais foram adicionados upstream do códon de iniciação ATG e um segundo códon STOP é adicionado downstream do quadro de leitura aberta a fim de otimizar a iniciação e terminação da tradução. Para clonagem conveniente dos genes sintéticos em vetores de expressão de levedura, sítios de restrições Bam HI e Eco RI foram adicionados upstream e downstream das sequências, respectivamente. Como explicado acima, o gene de esterol Δ24-redutase de rato (número de entrada no GenBank AY92220 (sequência de cDNA) e AAX29968 (sequência de aminoácidos) foi codificado novamente pelo método descrito acima. O novo gene sintético foi denominado S24R1. Sua sequência é apresentada abaixo. ID. DE SEQ. N°: 1: 1 GGATCCAAAA TGGAACCAGC TGTTTCTTTA GCTGTT7GTG CTTTATTATT TTTATTATGG 61 GTAAGAGTCA AAGGTCTTGA ATTTGTCTTA ATTCATCAAA GGTGGGTGTT TGTCTGTTTA 121 TTTTTATTAC CATTATCTTT AATCTTTGAT ATCTATTATT ATGTTAGAGC TTQQGTTGTT 181 TTTAAATTAT CTTCTGCTCC AAGACTACAT GAACAAAGAG TTCAAGATAT CCAAAAACAA 241 GTTAGAGAAT GGAAAGAACA AGGTTCTAAA ACTTTTATGT GTACCGGTCG GCCTGGGTGG 301 CTCACTGTGT CATTAAGGGT TGGTAAATAT AAAAAAACTC ATAAAAATAT CATGATCAAT 361 TTAATGGATA TCTTAGAAGT TGATACTAAA AAACAAATCG TCAGGGTTGA ACCTCTTGTC 421 TCTATGGGGC AAGTCACTGC ATTATTAAAT TCTATTGGTT GGACGCTTCC TGTCCTCCCA 481 GAGTTAGACG ATCTTACTGT TGGTGGTTTA ATCATGGGTA CTGGTATCGA ATCTTCATCT 541 CATAAATATG GTCTTTTTCA ACATATTTGT ACCGCTTATG AACTAATCCT GGCTGATGGC 601 TCATTTGTGC GTTGTACCCC TTCGGAAAAC TCCGATCTAT TTTATGCAGT CCCATGGAGT 661 TGTGGTACTT TAGGTTTTTT AGTTGCTGCT GAAATCAGAA TCATCCCAGC AAAAAAGTAT 721 GTCAAGCTAC GATTTGAACC TGTTAGAGGT CTGGAAGCAA TCTGTGAAAA GTTTACACAT 781 GAATCTCAAA GATTAGAAAA TCATTTTGTT GAAGGGCTTC TCTATAGTCT GGATGAGGCG 841 GTGATTATGA CGGGGGTGAT GACGGACGAC GTTGAGCCAT CTAAATTAAA TTCTATCGGT 901 TCTTATTATA AACCATGGTT TTTTAAACAT GTTGAAAATT ATTTAAAAAC TAATAGGGAA 961 GGATTAGAAT ACATTCCATT AAGACATTAT TATCATAGAC ATACTAGGTC TATCTTTTGG 1021 GAATTACAAG ATATCATCCC ATTTGGTAAT AATCCAATCT TTAGATATTT ATTTGGTTGG 1081 ATGGTTCCAC CAAAAATCTC TTTATTAAAA TTAACTCAAG GTGAAACTTT ACGAAAGCTA 1141 TATGAGCAAC ACCACGTCGT TCAAGATATG TTAGTTCCAA TGAAATGTTT ATCTCAAGCA 1201 TTACATACCT TCCAAAATGA TATCCATGTT TATCCAATCT GGTTATGTCC ATTTATCTTA 1261 CCATCTCAAC CTGGTCTGGT CCACCCTAAA GGTGACGAAG CTGAACTTTA TGTTGATATC 1321 GGTGCCTATG GTGAGCCAAG AGTTAAACAT TTTGAAGCTA GATCATGTAT GAGACAATTA 1381 GAAAAATTTG TTAGATCAGT TCATGGTTTT CAAATGCTAT ATGCAGATTG TTACATGAAC 1441 AGAGAAGAAT TTTGGGAAAT GTTCGATGGT TCTTTATATC ATAAATTAAG AAAACAATTA 1501 GGTTGTCAAG ATGCTTTTCC AGAAGTTTAT GATAAAATCT GTAAAGCTGC TAGACACTAA 1561 TGAGAATTC A sequência de aminoácidos correspondente é: ID. DE SEQ. N°: 2: 1 MEPAVSLAVC AliLFLLWVRV KGLEFVLIHQ RWVFVCLFLL PLSIiIFDIYY YVRAWWFKL 61 SSAPRLHEQR VQDIQKQVRE WKEQGSKTFM CTGRPGWLTV SLRVGKYKKT HKNIMINLMD 121 ILEVDTKKQI VRVEPLVSMG QVTALLNSIG WTLPVLPELD DLTVGGLXMG TGIESSSHKY 181 GLFQHICTAY ELILADGSFV RCTPSENSDL FYAVPWSCGT LGFLVAAEIR IIPAKKYVKL 241 RFEPVRGLEA ICEKFTHESQ RLENHFVEGL LYSLDEAVIM TGVMTDDVEP SKLNSIGSYY 301 KPWFFKHVEN YLKTNREGLE YIPLRHYYHR HTRSIFWELQ DIIPFGNNPI FRYLFGWMVP 361 PKISLLKLTQ GETLRKLYEQ HHWQDMLVP MKCLSQALHT FQNDIHVYPI WLCPFILPSQ 421 PGLVHPKGDE AELYVDIGAY GEPRVKHFEA RSCMRQLEKF VRSVHGFQML YADCYMNREE 481 FWEMFDGSLY HKLRKQLGCQ DAFPEVYDKI CKAARH de DNA acessível no número GenBank NM_001008645 e sequência de aminoácidos no número GenBank NP_001008645) foi registrado com o método descrito acima. O novo gene sintético foi denominado S24R2. Sua sequência é apresentada abaixo: ID. DE SEQ. N°:3: 1 GGATCCAAAA TGGACCCTTT GCTTTACCTT GGAGGCCTAG CGGTCCTCTT CCTTATTTGG 61 ATTAAGGTAA AAGGTTTAGA ATATGTTATT ATCCATCAAA GATGGATCTT TGTTTGTTTA 121 TTTTTATTAC CATTATCTGT CGTCTTCGAT GTTTATTATC ATTTAAGAGC TTGGATCATC 181 TTTAAAATGT GTTCTGCTCC AAAACAACAT GATCAAAGAG TTAGGGATAT TCAAAGGCAA 241 GTCCGTGAAT GGCGGAAGGA TGGGGGTAAG AAATACATGT GCACCGGTAG GCCAGGTTGG 301 CTGACTGTTT CTTTAAGAGT CGGTAAATAT AAATkZiAACTC ATAAAAATAT CATGATCAAT 361 ATGATGGATA TCTTAGAAGT TGATACCAAA AGAAAAGTTG TGAGAGTAGA ACCATTAGCT 421 AATATGGGTC AAGTTACTGC TTTATTAAAT TCTATCGGTT GGACATTACC TGTCTTACCA 481 GAACTTGATG ACTTAACTGT TGGTGGTTTA GTCATGGGCA CTGGTATTGA ATCTTCTTCT 541 CATATCTATG GTTTATTTCA ACATATCTGT GTTGCATTTG AATTAGTTTT AGCTGATGGT 601 TCTTTAGTTA GGTGTACAGA AAAGGAAAAC TCTGATTTAT TTTATGCTGT CCCATGGAGC 661 TGTGGTACCT TAGGTTTTCT AGTCGCGGCT GAAATTCGTA TTATTCCTGC TCAAAAATGG 721 GTCAAATTAC ATTATGAACC TGTCAGGGGA TTAGACGCTA TTTGCAAAAA ATTTGCTGAA 781 GAGTCTGCTA ATAAAGAAAA TCAATTTGTT GAAGGATTAC AÀTATTCTAG AGATGAAGCT 841 GTTATTATGA CGGGTGTAAT GACGGATCAT GCAGAACCCG ATAAAACTAA TTGTATTGGG 901 TATTATTATA AACCTTGGTT CTTTAGACAT GTTGAATCTT TTTTAAAACA AAATAGAGTT 961 GCTGTTGAAT ATATCCCATT AAGACATTAT TATCATAGAC ATACTAGATC AATCTTTTGG 1021 GAACTGCAAG ACATCATTCC ATTTGGCAAT AATCCACTTT TTAGGTACGT TTTTGGATGG 1081 ATGGTGCCAC CAAAAATCTC TTTATTAAAA TTAACTCAAG GTGAAACTAT CAGAAAATTA 1141 TATGAACAAC ATCATGTTGT TCAAGATATG TTAGTTCCAA TGAAAGATAT CAAAGCTGCT 1201 ATCCAAAGAT TTCATGAAGA TATTCATGTC TATCCATTAT GGCTTTGTCC ATTTTTATTA 1261 CCAAATCAAC CTGGAATGGT GCATCCGAAA GGGGATGAGG ACGAGTTATA TGTGGATATT 1321 GGGGCCTACG GCGAACCCAA AGTAAAACAT TTCGAAGCAA CTTCTTCTAC TAGACAATTA 1381 GAAAAATTTG TCCGTGATGT CCATGGTTTT CAAATGCTCT ACGCAGATGT CTATATGGAG 1441 AGAAAAGAAT TTTGGGAAAT GTTCGACGGT ACTTTATATC ATAAATTAAG AGAAGAACTG 1501 GGCTGTAAGG ATGCCTTTCC CGAAGTGTTT GACAAAATCT GTAAAAGTGC ACGTCATTAA 1561 TGAGAATTC A sequência de aminoácidos correspondente é: ID. DE SEQ. N°: 4: 1 MDPLLYLGGL AVLFLIWIKV KGLEYVIIHQ RWIFVCLFLL PLSWFDVYY HLRAWIIFKM 61 CSAPKQHDQR VRDIQRQVRE WRKDGGKKYM CTGRPGWLTV SLRVGKYKKT HKNIMINMMD 121 ILEVDTKRKV VRVEPLANMG QVTALLNSIG WTLPVLPELD DLTVGGLVMG TGIESSSHIY 181 GLFQHICVAF ELVLADGSLV RCTEKENSDL FYAVPWSCGT LGFLVAAEIR IIPAQKWVKL 241 HYEPVRGLDA ICKKFAEESA NKENQFVEGL QYSRDEAVIM TGVMTDHAEP DKTNCIGYYY 301 KPWFFRHVES FLKQNRVAVE YIPLRHYYHR HTRSIFWELQ DIIPFGNNPL FRYVFGWMVP 361 PKISLLKLTQ GETIRKLYEQ HHWQDMLVP MKDIKAAIQR FHEDIHVYPL WLCPFLLPNQ 421 PGMVHPKGDE DELYVDJGAY GEPK7KHFEÀ TSSTRQLEKF VRDVHGFQKL YADVYMERKE 481 FWEMFDGTLY HKLREELGCK DAFPEVFDKI CKSARH sequencia αe a^m^^αos αe coiesteroi us-mαroxnase αe

Homo sapiens e cálculo de sequências de DNA alternativas otimizadas para expressão em S. cerevisiae A atividade de colesterol C25-hidroxilase foi demonstrada para produtos gênicos de H. sapiens e M. musculus (Lund e cols., 1998; US6562609). A pesquisa de bases de dados públicas como, por exemplo, GENBANK ou EMBL, por enzimas que são homólogas à colesterol C25-hidroxilase humana foi feita com o programa disponível publicamente BLASTp usado sob condições-padrão. Entre as sequências encontradas, a sequência de S. scrofa, que mostra 82% de identidade de aminoácidos para a sequência de aminoácidos de H. sapiens (Tabela 2) e 79% para a sequência de M. musculus, e a sequência de C. familiaris, que mostra 70% de identidade de aminoácidos para a sequência humana e para a de camundongo (Tab. 4), foram selecionadas para investigações posteriores. Tabela 4: Identidade de aminoácidos entre supostas colesterol C25-hidroxilases diferentes

O gene de colesterol C25-hidroxilase de porco (sequência de DNA acessível no número GenBank AY974088 e sequência de aminoácidos no número GenBank Q4G1G8) foi registrado por substituição de vinte e cinco códons que correspondem aos códons raramente usados pela levedura Saccharomyces cerevisiae por códons freqüentemente usados em leveduras (Zhang e cols., 1991). O novo gene sintético foi designado C25H1. Sua sequência é apresentada abaixo: 1 GGATCCAAAA TGAGCGGCCA CAACAACTCC GAGCTTTTCG TCCTTTGCAG CTCCAGCCAG 61 CTGTTCCTGC AGCCCCTTTG GGACCACCTG AAGACCTGGG AGACCCTTAT CCTGTCGCCC 121 TTCTTCCCAG TCTTCTTCTC CATGACCACC TACTTGGGCT TCTGCCTGCC CTTCGTGGTA 181 CTGGATGTCT TATGCCCATG GGTGCCCGCA CTGAGGCGTT ACAAGATCCA CCCAGACTTC 241 TCGCCATCGG TGTGGCAGCT GCTGCCCTGC CTGGGGCTGA CACTTTACCA GCATGTGGTG 301 TTCGTGTTCC CAATGACTCT GTTGCACTGG GCAGCAAGCC CAGTTCTTCT GCCCCCAGAA 361 GCCCCCGAGC TGCTTCAGCT GGTGCGTCAC ATCGTGCTGT GCCTGCTGCT TTTCGACACC 421 GAATTTTTCA TCTGGCATGT GCTGCATCAC AAAGTGCCTT GGCTGTACAG GACCTTCCAC 481 AAGATGCACC ACCAGAACTC GTCCTCGTTC GCACTGGCCA CACAGTACAT GAGTGTCGGG 541 GAGCTACTTT CTTTGGGTGT CTTTGACATG GTGAACATCA TGCTGCTTAG GTGCCACCCA 601 CTTACCGTCC TGATCTTCCA CGTGATCAAC ATCTGGCTGT CGGTGGAGGA CCACTCCGGC 661 TATGACTTCC CCTGGTCCGC TCACAGACTA GTACCTTTCG GGTGGTATGG GGGCGTGACA 721 CACCACGACC TACATCACTC CCAGTTTAAC TGCAACTTCG CCCCTTACTT CACACACTGG 781 GACAAAATAC TGGGAACACT GAGGTCTGCT CATGCCAAGT AATGAGAATT C A sequência de aminoácidos correspondente é: ID. DE SEQ. N°: 6: MSGHNNSELF VLCSSSQLFL QPLWDHLKTW ETLILSPFFP VFFSITTYLG FCLPFVVLDV 61 LCPWVPALRR YKIHPDFSPS VWQLLPCLGL TLYQHWFVF PMTLLHWAAS PVLLPPEAPE 121 LLQLVRHIVL CLLLFDTEFF IWHVLHHKVP WLYRTFHKMH HQNSSSFALA TQYMSVGELL 181 SLGVFDMVNI MLLRCHPLTV LIFHVINIWL SVEDHSGYDF PWSAHRLVPF GWYGGVTHHD 241 LHHSQFNCNF APYFTHWDKI LGTLRSAHAK Uma sequência de aminoácidos alternativa de uma suposta esterol C25-hidroxilase de porco da base de dados GENBANK que mostra quatro diferenças para a sequência usada também está disponível, mas não foi posteriormente usada nos experimentos: ID. DE SEQ. N°: 7: 1 MSGHNNSELL VLCSSGQLFL QPLWDHLKTW ETLIQSPFFP VFFSITTYLG FCLPFWLDV 61 LCPWVPALRR YKIHPDFSPS VWQLLPCLGL TLYQHWFVF PMTLLHWAAS PVLLPPEAPE 21 LLQLVRHIVL CLLLFDTEFF IWHVLHHKVP WLYRTFHKMH HQNSSSFALA TQYMSVGELL 181 SLGVFDMVNI MLLRCHPLTV LIFHVINIWL SVEDHSGYDF PWSTHRLVPF GWYGGVTHHD 241 LHHSQFNCNF APYFTHWDKI LGTLRSAHAK O gene de Canis familiaris (sequência de nucleotídeos acessível no número GenBank XM_546596.2 e sequência de aminoácidos no número GenBank XP_543596.1) foi registrado com o método de ajuste descrito no Exemplo 1. O novo gene sintético foi denominado C25H3, e sua sequência de DNA é apresentada abaixo: ID. DE SEQ. N°: 8: 1 GGATCCAAAA TGTCTTCACA TAATTCTTCT GGTCCTTTAG CCTTAGGACC ACCTGGTCAA 61 CTATTATTAC AACCTTTATG GGACCAAGTT AGGGCAAGGG CAGCATTAGC GCAATCGCCT 121 CCCTTTGCAG TCCTTTTTTC TATCACTGCT TATTTAGGTT GTTGTTTACC ATTTGTTTTA 181 TTAGATTTAT TATGTCCAAG AGTTAGAGCA TTAAGGAGAT ATAAAGTCCA TCCCGATTGT 241 GGACCATCTG CAAGGCAATT ATTAGGTTGT TTAGGTAGGA CTGTCTGTCA ACATGTAGCT 301 TTATTATTAC CAGCTTCTTT ATTACATTGT GCCAGGGGTC CCGCTCCATG GCCGAGAGAA 361 GCACCAGAAT TATTACAATT AGCTAGACAT GTTTTAGGTT GTTTATTATT ATTTGATGCT 421 GAAGTTTTTG CTTGGCACGT TTTACATCAT AGAGTTCCAT GGCTTTATAG AACTTTTCAT 481 AAATTACATC ATCAACATGC TGCTTCATTT GCTTTAGCTA CTCAATATAT GGGTGCTTGG 541 GAGTTATTAT CTTTAGGTTT TTTTCATGTT TTAAATGTTG TTTTATTACA ATGTCATCCA 601 TTATCTGTTT TAGCTTTTCA TTTATTAAAT ATCTGGCTAT CTGTTGAAGA TCATTCAGGT 661 TATGATTTCC CATGGTCGAC CCATCGATTA GTCCCCTTTG GTTGGTACGG TGGAGTTGCT 721 CATCATGATT TACATCATTC ACAATTTAAT TGTAATTTTG CACCATATTT TACTCATTGG 781 GACAGAATTT TGGGTACCTT AAGGTCTGCA CCAGCCAAAT AATGAGAATT C A sequência de aminoácidos correspondente é: ID. DE SEQ. N°: 9: MSSHNSSGPL ALGPPGQLL.L QPLWDQVRAR AALAQSPPFA VLFSITAYLG CCLPFVLLDL 61 LCPRVRALRR YKVHPDCGPS ARQLLGCLGR TVCQHVALLL PASLLHCARG PAPWPREAPE 121 LLQLARHVLG CL.LLFDAEVF AWHVLHHRVP WLYRTFHKLH HQHAASFALA TQYMGAWELL 181 SLGFFHVLNV VLLQCHPLSV LAFHLLNIWL SVEDHSGYDF PWSTHRLVPF GWYGGVAHHD 241 LHHSQFNCNF APYFTHWDRI LGTLRSAPAK EXEMPLO 3 Construção do plasmídeo de expressão V51TDH-S24R1 Foram construídos vetores de expressão usando a tecnologia clássica de biologia molecular, como descrito por Sambrook e cols. (1989), e as enzimas de restrição e modificação de DNA foram usadas como recomendado pelo fornecedor (New England Biolabs, Ipswich, MA 01938-2723, EUA).

O vetor de expressão multicópias constitutivo básico V51TDH foi derivado do vetor V51 por substituição do promotor de GAL10-CYC1 indutível por galactose com o promotor do gene TDH3 expresso constitutivamente (gene YGR192C da anotação sistemática de gene na Base de Dados do Genoma de Saccharomyces, que codifica a isozima 3 de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase). V51 carrega a origem de replicação de ColE1 e o gene bla (resistência à ampicilina) para manutenção em Escherichia coli, a origem de 2 μ e o gene URA3 para manutenção em leveduras, o promotor híbrido GAL10-CYC1 e as regiões terminadoras de PGK1 separados por um sítio de clonagem múltipla (MCS) (pYeDP1/8-2, Cullin e Pompon, 1988). A região promotora de TDH3 foi amplificada por PCR em DNA genômico da cepa de levedura W303-1B (Thomas e Rothstein, 1989) e preparada de acordo com Hoffman e Winston (1987) usando os seguintes iniciadores: PTDHAge 5’-CACCGGTGCCATTTCAAAGAATACGTA-3‘ (ID. DE SEQ. N°: 10) PTDHBam 5’-TGGATCCTTATGTGTGTTTATTCGAAAC-3‘ (ID. DE SEQ. N°: 11)

O produto da amplificação por PCR foi digerido por Age I e Bam HI e usado para substituir o fragmento de Age I-Bam HI com comprimento de 617 bp de V51 que carrega o promotor de GAL10-CYC1. O vetor V51TDH resultante é um vetor shuttle de múltiplas cópias de E. coli/S. cerevisiae útil para a expressão constitutiva de um gene de interesse em leveduras por inserção no MCS localizado entre as regiões promotoras de TDH3 (TDH3p) e terminadoras de PGK1 (PGK1t).

O vetor V51TDH-S24R1 para expressão constitutiva do gene sintético S24R1 (veja o Exemplo 1) foi construído por inserção do produto de restrição de Bam HI-Eco RI de 1564 bp do gene sintético S24R1 no vetor V51TDH restringido por Bam HI e Eco RI. O mapa de restrição do vetor de expressão constitutiva V51TDH-S24RI é apresentado na Figura 1. EXEMPLO 4 Construção do plasmídeo de expressão V51TDH-S24R2

O vetor V51TDH-S24R2 para expressão constitutiva de S24R2 (veja o Exemplo 1) foi construído basicamente como já descrito no Exemplo 3. O produto de restrição de Bam HI-Eco RI grande de 1564 bp do gene sintético S24R2 foi ligado no vetor V51TDH restringido por Bam HI e Eco RI. O mapa de restrição de V51TDH-S24R2 é apresentado na Figura 2. EXEMPLO 5 Construção do plasmídeo de expressão centromérico pFLAde- S24R1

O vetor centromérico pFLAde-S24R1 para expressão constitutiva do gene S24R1 (veja o Exemplo 1) foi construído por inserção do cassete de expressão TDH3p- S24R1-PGK1t de V51TDH-S24R1 (descrito no Exemplo 3) no vetor shuttle vazio pFLAde de E. coli/ S. cerevisiae que carrega um centrômero e sequência de replicação autônoma de levedura (ARS CEN) e o marcador de seleção ADE2. O vetor pFLAde foi construído por substituição do fragmento de Bgl II de 1,1 kb de pFL38 (Bonneaud e cols., 1991) que codifica o gene URA3 por um fragmento de Bam HI de 2,7 kb que codifica o gene ADE2 obtido por amplificação por PCR em DNA genômico de levedura usando os seguintes iniciadores: ADE2-1 5’-CGGATCCACTAGTAACGCCGTATCGTGATTAACG-3’, (ID. DE SEQ. N°:12) ADE2-2 5’-AGGATCCTCCTGACGTAGCTATCCTCGGTTCTG-3’. (ID. DE SEQ. N°: 13)

O cassete de expressão TDH3p-524R1-PGK1t foi amplificado por PCR usando a DNA Polimerase PrimeSTAR HS (Takara, Otsu, Shiga, Japão) sob condições-padrão e os seguintes iniciadores: TDH 5’-AGGCGCGCCACCGGTGCCATTTCAAAGAA-3’ (ID. DE SEQ. N°: 14) PGK 5’-AGGCGCGCCCAAGCTTTAACGAACGCAGA-3’. (ID. DE SEQ. N°: 15)

O produto da amplificação foi clonado em pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, 92008, EUA). O cassete TDH3p- S24R1-PGK1t foi isolado desse último vetor por restrição por Sac I-Pst I e ligado no vetor pFLAde cortado pelas mesmas enzimas de restrição. O mapa de restrição do vetor de expressão centromérico resultante pFLAde-S24R1 é apresentado na Figura 3. EXEMPLO 6 Construção do vetor de expressão V51-C25H1

O plasmídeo V51-C25H1 para expressão indutível por galactose de C25H1 (veja o Exemplo 2) foi construído por inserção do fragmento de Bam HI-Eco RI de 826 bp do C25H1 em V51 digerido com Bam HI e Eco RI. O plasmídeo de expressão V51-C25H1 resultante codifica o gene sintético C25H1 sob o controle do promotor híbrido GAL10-CYC1 indutível por galactose (Guarente e cols., 1982) e o terminador de PGK1. O mapa de restrição de V51-C25H1 é apresentado na Figura 4. EXEMPLO 7 Construção do vetor de expressão V51-C25H3

O vetor V51-C25H3 para expressão indutível por galactose do gene sintético C25H3 (veja o Exemplo 2) foi construído como já descrito no Exemplo 6 por inserção do fragmento de Bam HI-Eco RI de 826 bp do gene sintético C25H3 em V51 digerido com Bam HI e Eco RI. O plasmídeo de expressão V51-C25H3 resultante codifica C25H3 sob o controle do promotor híbrido GAL10-CYC1 indutível por galactose e o terminador de PGK1. O mapa de restrição de V51-C25H3 é apresentado na Figura 5. EXEMPLO 8 Transformação de cepas de levedura e extração de esterol A cepa W303-1B (MATalpha; ura3-52; trp1-1; leu2-3,112; his3-11; ade2-1; can1-100; Thomas e Rothstein, 1989) e seu mutante de ERT erg6 (MATalpha; erg6::TRP1; ura3-52; trp1-1; leu2-3,112; his3-11; ade2-1; can1-100) foram transformados com os diferentes plasmídeos de expressão descritos acima. A inativação de ERG6 da cepa ERT foi obtida por inserção do gene de TRP1 funcional em ERG6. O gene de TRP1 de pFL45 (Bonneaud e cols., 1991) foi amplificado por PCR usando iniciadores de TRP1 ladeados por sequências de ERG6. As sequências dos iniciadores são as seguintes: ERGTRP-1: 5’-CATAAGATGAGTGAAACAGAATTGAGAAAAAGACAGGCCCAATCAAATTCG 5 GGTCGAAAAAAGAAAAG-3’ (ID. DE SEQ. N°: 16) ERGTRP-2 5’-CTAGCGACGAAAAGCATCATTGGAGTGAATAACTTGGACTTACCATTCTTAG CATTTTGAC-3’ (ID. DE SEQ. N°: 17).

O produto de PCR resultante foi usado para transformar a cepa W303-1B usando a técnica de lítio-PEG como descrito por Gietz e cols. (1995). Os transformantes foram selecionados em um meio definido sem triptofano, e sua composição de esterol foi verificada por HPLC (Lecain e cols., 1996), confirmando a ausência de ergosterol e a presença de esteróis incomuns consistentes com o efeito conhecido de uma inativação de ERG6. Um transformante de erg6::TRP1 foi guardado para estudos posteriores e designado ERT.

Além de ERT, também a cepa de S. cerevisiae do tipo selvagem BY4742 (genótipo MATalpha; his3Δ1; leu2Δ0; lys2Δ0; ura3Δ0; Brachmann e cols., 1998) foi usada como hospedeira para os plasmídeos construídos.

A transformação de BY4742, W303-1B e ERT foi feita pelo método de lítio-PEG como descrito por Gietz e cols. (1995). Os transformantes foram selecionados em um meio definido mínimo (Tabela 1) sem uracil ou adenina, dependendo do marcador de seleção presente no vetor. Pelo menos dois transformantes independentes de cada transformação foram analisados. Para análise de esterol, os transformantes foram desenvolvidos em meio sintético (descrito na Tabela 2) até a fase estacionária.

Células de levedura foram recuperadas do meio de cultivo por centrifugação e lavadas com um volume igual de água deionizada. As células foram ressuspensas em 100 μl de água em um tubo de Eppendorf de 2 ml e foram quebradas por forte turbilhonamento (5 min) na presença de glóbulos de vidro de 0,1 g (0,5 mm). Dois ml de 1,2-dicloroetano foram adicionados às células ressuspensas e a mistura foi intensamente turbilhonada por 5 minutos. Após 5 minutos de centrifugação a 10.000 rpm, a fase de solvente foi transferida para um tubo de vidro. A extração foi feita duas vezes. A fase orgânica em pool foi evaporada sob nitrogênio. Como última etapa, o extrato seco foi ressuspenso em 100 μl de acetonitrila para análise por HPLC. EXEMPLO 9 Análise de esterol por cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC) com detecção UV e espectrometria de massa

Uma alíquota, normalmente de 30 μl, do extrato de esterol preparado como descrito no Exemplo 8, foi analisada por HPLC de fase reversa monitorada por detecção UV e espectrometria de massa. Uma HPLC “Waters Alliance HT 2790” foi acoplada a um detector UV de arranjo de fotodiodo do tipo “Waters PDA 996” e ao detector de massa “Waters MicroMass ZQ” (Waters, Milford, MA01757, EUA). A separação foi feita em uma coluna XTerra RP18 de 3,5 μm e 4,6 x 100 mm (Waters, Milford, MA01757, EUA) a 60°C com um gradiente linear de 0,03% (v/v) de ácido fórmico contendo água/acetonitrila. A amostra foi injetada após estabilização da coluna com um tampão contendo 80% de tampão A (água com ácido fórmico 0,03%) e 20% de tampão B (acetonitrila com 0,03% de ácido fórmico). Pelos primeiros 5 minutos, a composição do tampão foi gradualmente alterada de 80% de tampão A e 20% de tampão B para 25% de tampão A e 75% de tampão B. Nos 15 minutos seguintes, a composição do tampão foi gradualmente alterada de 25% de tampão A e 75% de tampão B para 12,5% de tampão A e 87,5%. No último minuto do protocolo de separação, 100% de tampão B foram alcançados. Esse valor foi mantido por 2 minutos para permitir a regeneração da coluna.

A cromatografia foi monitorada entre 205 e 300 nm com um detector de arranjo de fotodiodo. O detector de massa permitiu a detecção por eletrospray positivo de m/z que varia de 350 a 450 com uma sensibilidade de 1 unidade de m/z.

Os esteróis foram identificados com base em seu comportamento cromatográfico, seus espectros de absorção UV e seus perfis de fragmentação de massa em comparação com padrões (Tabela 5). O padrão de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol (fornecido por DSM) foi acetilado em acetato de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol (25OH-7DHC-Ac) com anidrido acético na presença de piridina de acordo com Secen e Kalpar (1999). Meio mg de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol seco foi ressuspenso em 1 ml de solução de anidrido acético/piridina (50/50 v/v) e aquecido a 55°C por 3 horas. A mistura de reação foi diluída com 4 ml de água. Meio ml da mistura de reação diluída foi extraído com 1,2-dicloroetano como descrito no Exemplo 8, antes da análise por HPLC.

Analisado sob as condições descritas acima, o padrão de 25OH-7DHC-Ac mostrou uma mudança no tempo de retenção (RT 8,5 min), comparado com o padrão de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol não acetilado (RT 6,9 min) em função da hidrofobicidade maior do composto acetilado. A perfil de fragmentação de massa do padrão de 25OH-7DHC-Ac era similar ao perfil do padrão de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol não acetilado. Um sinal de m/z que corresponde à forma acetilada nunca foi detectado, provavelmente por causa da desacetilação que ocorre durante a detecção no detector de massa. Tabela 5: Propriedades cromatográficas, espectrais e de fragmentação de massa dos diferentes esteróis

EXEMPLO 10 Expressão do gene S24R1 pelo plasmídeo V51TDH-S24R1 na cepa ERT de S. cerevisiae deficiente em ERG6

O plasmídeo V51TDH-S24R1 (veja o Exemplo 3) e o vetor vazio V51TDH como controle foram transformados na cepa ERT pela técnica de lítio-PEG (Gietz e cols., 1995). Os transformantes foram selecionados em um meio definido mínimo sem uracil. Quatro transformantes independentes de cada transformação foram analisados quanto à existência do plasmídeo. Um dos transformantes confirmados foi escolhido aleatoriamente, denominados respectivamente ERT/V51TDH e ERT/V51TDH-S24R1, e usado para análise posterior.

As cepas foram desenvolvidas até a fase estacionária em 2% (p/v) meio de glicose de Kapelli (Tabela 2), todos os esteróis foram extraídos como descrito no Exemplo 8 e analisados por HPLC com detecções UV e espectrometria de massa como descrito no Exemplo 9. Os esteróis principais foram identificados por seu tempo de retenção, propriedades de massa e espectrais usando os respectivos padrões (Tabela 5).

Os perfis de eluição de HPLC (detecção UV a 282 nm) são mostrados na Figura 6. Colesta-5,7,22,24-tetraenol (RT 9,2 min, m/z = 363, UV máx. 233 nm) foi o principal esterol encontrado na cepa ERT/V51TDH erg6 de controle que corresponde a 70% do sinal de UV a 282 nm. Sete por cento dos esteróis totais identificados a 282 nm foram identificados como colesta-5,7,24-trienol (RT 10,3 min, m/z = 365, UV máx. 282 nm; Figura 6-A).

O perfil de esterol da cepa ERT/V51TDH-S24R1 (Figura 6-B) que expressa o gene S24R1 revelou a presença de dois esteróis não detectados na cepa de controle ERT/V51TDH, especificamente, colesta-5,7,22-trienol (RT 10,8 min, m/z = 365, UV máx. 282 nm), o esterol principal dessa cepa (60% do sinal de UV a 282 nm), e colesta-5,7-dienol, também denominado 7-desidrocolesterol (RT 11,8, m/z = 367, UV máx. 282 nm). A presença de colesta-5,7,22-dienol e colesta- 5,7,22-trienol gerados por redução da ligação Δ24-25 de colesta-5,7,24-trienol e colesta-5,7,22,24-tetraenol confirmou a atividade de esterol Δ24-redutase do gene S24R1 (veja a Figura 13). EXEMPLO 11 Expressão do gene S24R2 pelo plasmídeo V51TDH-S24R2 na cepa ERT de S. cerevisiae

O plasmídeo V51TDH-S24R2 (Exemplo 3) que expressa constitutivamente S24R2 foi transformado na cepa ERT usando o protocolo de lítio-PEG (Gietz e cols., 1995). Transformantes foram selecionados em meio mínimo sem uracil. Quatro transformantes independentes foram analisados e mostraram as mesmas propriedades. Um deles foi designado ERT/V51TDH-S24R2 e usado para análise posterior.

A cepa foi cultivada até que alcançasse a fase estacionária em meio de glicose de Kapelli 2% (Tabela 2) e os esteróis foram extraídos e analisados como descrito nos Exemplos 8, 9 e 10. Novamente, colesta-5,7,22,24-tetraenol (RT 9,2 min, m/z = 363, UV máx. 233 nm) e colesta-5,7,24- trienol (RT 10,3 min, m/z = 365, UV máx. 282 nm) foram encontrados como os esteróis principais na cepa de controle ERT/V51TDH (Figura 6-A), enquanto o esterol principal detectado na cepa S24R2 que expressa ERT/V51TDH-S24R2 foi colesta-5,7,22-trienol (RT 10,8 min, m/z = 365, UV máx. 282 nm) com 70% de sinal de UV a 282 nm (Figura 6-C). Colesta- 5,7-dienol (7-desidrocolesterol; RT 11,8, m/z = 367, UV máx. 282 nm) foi encontrado em concentrações menores (13% de sinal UV). Esses resultados confirmam a atividade de esterol Δ24-redutase do gene S24R2. EXEMPLO 12 Expressão de gene S24R1 pelo plasmídeo centromérico pFLAde- S24R1 na cepa ERT de S. cerevisiae

O plasmídeo centromérico pFLAde-S24R1 (Exemplo 5) para expressão constitutiva do gene S24R1 foi transformado na cepa ERT usando o procedimento de lítio-PEG (Gietz e cols., 1995). Os transformantes foram selecionados em um meio definido sem adenina. Quatro transformantes independentes foram analisados quanto à ocorrência do plasmídeo pFLAde- S24R1 e quanto ao seu padrão de esterol. Um deles foi escolhido aleatoriamente, designado ERT/pFLAde-S24R1, e usado para ilustração posterior dos resultados. ERT/pFLAde-S24R1 foi desenvolvido em meio de glicose de Kapelli 2% (Tabela 2) até que alcançasse a fase estacionária. Os esteróis foram extraídos e analisados como descrito nos Exemplos 8 e 9. O principal novo esterol em ERT/pFLAde-S24R1, não presente no controle, foi colesta- 5,7,22-trienol (RT 10,8 min, m/z = 365, UV máx. 282 nm) com 60% do sinal de UV a 282 nm (Figura 6-D). Uma quantidade menor (7% do sinal UV) de 7-desidrocolesterol (RT 11,8, m/z = 367, UV máx. 282 nm) também foi detectada. Além daqueles novos esteróis, colesta-5,7,22,24-tetraenol (RT 9,2 min, m/z = 363, UV máx. 233 nm) e colesta 5,7,24 (RT 10,3 min, m/z = 365, UV máx. 282 nm) que também estavam presentes na cepa ERT de controle (Figura 6-A) também foram encontrados em ERT/pFLAde-S24R1. Esses resultados confirmam a atividade de esterol Δ24-redutase do gene S24R1 expresso pelo plasmídeo centromérico pFLAde-S24R1. EXEMPLO 13 Produção de acetato de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol por co-expressão dos genes S24R1 e C25H1 na cepa de S. cerevisiae ERT

O plasmídeo V51-C25H1 (Exemplo 6) para expressão indutível por galactose do gene C25H1, e o plasmídeo V51 como controle, foi transformado na cepa ERT/pFLAde-S24R1 (descrita no Exemplo 12) com o método de lítio-PEG (Gietz e cols., 1995). V51-C25H1 e pFLAde-S24R1 são plasmídeos compatíveis. Suas origens diferentes, 2 μ e um ARS-CEN, permitem sua ocorrência simultânea em leveduras. Os transformantes foram selecionados em meio mínimo sem uracil e adenina. Quatro transformantes independentes de cada transformação foram analisados e mostraram as mesmas propriedades. Um transformante de cada transformação foi escolhido aleatoriamente, designado ERT/pFLAde-S24R1/V51- C25H1 e ERT/pFLAde-S24R1/V51, respectivamente, e usado para análise posterior.

As cepas foram desenvolvidas em meio de galactose de Kapelli 2% (Tabela 2) até que alcançassem a fase estacionária. Os esteróis foram extraídos e analisados por HPLC com detecção UV e espectrometria de massa como descrito nos Exemplos 8 e 9 sob as condições descritas no Exemplo 10. Como encontrado para a cepa de controle ERT/pFLAde-S24R1/V51 (Figura 7-C), o esterol principal em ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H1 (Figura 7-D) foi colesta-5,7,22- trienol (RT 10,8 min, m/z = 365, UV máx. 282 nm), gerado por redução do esterol colesta-5,7,22,24-tetraenol final pela esterol Δ24-redutase. Um novo composto, não presente na cepa de controle, foi observado na cepa ERT/pFLAde- S24R1/V51-C25H1 (Figura 7-D) que eluiu ao mesmo tempo que o acetato de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol (25OH-7DHC-Ac) preparado, injetado como padrão (RT 8,5 min, Figura 7-B). Esse composto também mostrou um perfil de absorção de UV idêntico (Figura 8-C) ao acetato de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol preparado (Figura 8-B), com o pico duplo em torno de 282 nm, específico para as ligações duplas conjugadas Δ5-Δ7, como também observado para o padrão de 7- desidrocolesterol (Figura 8-A). O novo composto também mostrou um perfil de fragmentação de massa (Figura 9-C) idêntico ao acetato de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol (Figura 9-B), como determinado por análise online de espectrometria de massa (feita como descrito no Exemplo 9).

No caso de 3e-hidróxi-esteróis, a análise por eletrospray produz um sinal principal no peso molecular menos dezessete (protonação (+1) e desidratação na posição C3 (-18). O principal sinal para 7-desidrocolesterol (Figura 9-A) está em massa m/z de 367 (384 (peso molecular de 7-desidrocolesterol) + 1 (protonação) - 18 (desidratação de 3e-hidróxi-esterol)). O sinal observado para o acetato de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol em massa m/z de 383 corresponde à hidroxilação adicional na posição C-25 (367 + 16 = 383). O principal sinal em massa m/z de 365 corresponde à desidratação na posição C25 (383 - 18 = 365) que ocorre para uma fração das moléculas durante a detecção dentro do detector de massa.

Esses resultados diferentes (mesmo tempo de retenção, mesmo perfil UV e mesma fragmentação de massa que o acetato de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol usado como padrão) demonstraram que o novo composto produzido na cepa ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H1 era acetato de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol. EXEMPLO 14

Produção de acetato de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol por co-expressão de S24R1 e C25H3 na cepa de S. cerevisiae ERT V51-C25H3 (Exemplo 7), construído para expressão indutível por galactose do gene C25H3, foi transformado na cepa ERT/pFLAde-S24R1 (veja o Exemplo 13) pelo método de lítio-PEG (Gietz e cols., 1995). Os transformantes foram selecionados em meio mínimo sem uracil e adenina. Quatro transformantes independentes foram analisados para confirmação da ocorrência de ambos os plasmídeos. Um deles foi escolhido aleatoriamente, denominado ERT/pFLAde- S24R1/V51-C25H3, e usado para estudos posteriores. ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H3 foi desenvolvido em meio de galactose de Kapelli 2% (Tabela 2) até a fase estacionária. Das células coletadas, os esteróis foram extraídos e analisados por HPLC com detecções UV e espectrometria de massa como descrito nos Exemplos 8 e 9 sob as condições descritas no Exemplo 10. Como encontrado na cepa de controle ERT/pFLAde-S24R1/V51 (Figura 7-C), o esterol principal em ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H3 (Figura 7-E) era colesta-5,7,22-trienol (RT 10,8 min, m/z = 365, UV máx. 282 nm), o produto da redução do esterol final colesta- 5,7,22,24-tetraenol pela esterol Δ24-redutase, como já descrito no Exemplo 13.

Um composto, não presente na cepa parental, foi encontrado em ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H3 (Figura 7-E) eluindo ao mesmo tempo que acetato de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol (RT 8,5 min, Figura 7-B). Como no caso de ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H1 (descrito no Exemplo 13), esse composto mostrou o perfil de absorção UV idêntico (Figura 8) e o perfil de fragmentação de massa idêntico (Figura 9) ao acetato de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol. Esses resultados (tempo de retenção, perfil UV, e fragmentação de massa são comparáveis com acetato de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol) demonstram que o novo composto produzido em ERT/pFLAde-S24R1/V51-C25H3 é, como no Exemplo 13, acetato de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol. EXEMPLO 15

Produção de acetato de 25-hidróxi-ergosterol por expressão de C25H1 nas cepas de S. cerevisiae W303-1B e BY4742

O plasmídeo V51-C25H1 (Exemplo 6) construído para expressão indutível por galactose de gene C25H1 e o vetor vazio V51 como controle foram transformados na cepa W303-1B (descrita no Exemplo 8) pelo método de lítio-PEG (Gietz e cols., 1995). Os transformantes foram selecionados em meio mínimo sem uracil. Quatro transformantes independentes para cada transformação foram analisados quanto à ocorrência do plasmídeo. Um transformante positivo de cada transformação foi escolhido aleatoriamente, designado W303/V51-C25H1 e W303/V51, respectivamente, e usado para estudos posteriores.

As cepas foram desenvolvidas em meio de galactose de Kapelli 2% (Tabela 2) até que alcançassem a fase estacionária. Os esteróis foram extraídos das células coletadas e analisados por HPLC com detecções UV e espectrometria de massa, como descrito no Exemplo 8 e 9, sob as condições descritas no Exemplo 10. Os perfis de eluição de HPLC (detecção UV a 282 nm) são mostrados na Figura 10. O principal sinal observado para ambas as cepas, W303/V51-C25H1 (Figura 10-C) e W303/V51 (Figura 10-B), correspondia ao ergosterol (ergosta 5,7,22-trienol), o esterol principal de cepas de S. cerevisiae do tipo selvagem, como demonstrado por comparação com o tempo de retenção (Figura 10-A), o espectro UV (Figura 11-A) e o perfil de fragmentação de massa (Figura 12-A) de ergosterol (RT 11,9 min, m/z = 379, UV máx. 282 nm).

Um sinal menor a 10 min para a cepa W303/V51-C25H1 (Figura 10-C) só foi observado como um sinal residual para a cepa de controle W303/V51 (Figura 10-B). O perfil UV desse pico determinado por detecção de PDA online (Figura 11-B) mostrou uma absorção máxima a 233 nm específica para as ligações duplas conjugadas Δ22 e Δ24, além das ligações duplas conjugadas Δ5 e Δ7 que são caracterizadas pelo pico duplo em torno de 282 nm. Provavelmente, esse sinal correspondia a ergosta 5,7,22,24-tetraenol, um dos últimos intermediários da via biossintética do ergosterol sem redução de Δ24 por Erg4p (veja a Figura 13). A massa m/z de 377 detectada por espectrometria de massa online (Figura 12-B) era consistente com uma estrutura ergosta-tetraenol.

Um terceiro sinal a 8,7 min observado em um extrato de esterol da cepa W303/V51-C25H1 (Figura 10-C) por HPLC estava completamente ausente em W303/V51 (Figura 10-B). O perfil UV determinado desse pico (Figura 11-C) mostrou o pico duplo típico com um máximo a 282 nm específico para as ligações duplas conjugadas Δ5 e Δ7. A fragmentação de massa (Figura 12-C) mostrou um sinal principal a m/z = 377 e um sinal menor a m/z = 395, consistentes com uma forma hidroxilada de ergosterol (379 + 16 = 395) e sua forma de desidratação (395 - 18 = 377). O perfil de fragmentação (Figura 12-C) era idêntico àquele de acetato de 25-hidróxi- 7-desidrocolesterol (Figura 9-B), exceto que todas as massas estavam aumentadas em 12 unidades de massa, correspondendo à diferença de massa entre 7- desidrocolesterol (m/z = 367) e ergosterol (m/z = 379). A diferença do tempo de retenção de 3,2 min entre esse novo composto (RT 8,7 min) e ergosterol (RT 11,9 min) era idêntica à diferença do tempo de retenção entre acetato de 25-hidróxi-7-desidrocolesterol (RT 8,5 min) e 7- desidrocolesterol (RT 11.8).

Todas essas propriedades (perfil UV, fragmentação de massa, tempo de retenção) são consistentes com a conclusão de que esse novo composto produzido por expressão de C25H1 em W303/V51-C25H1 era acetato de 25-hidróxi-ergosterol.

A transformação de V51-C25H1 e do vetor vazio V51 como controle na cepa de S. cerevisiae BY4742 levou a resultados (Figura 10) comparáveis àqueles obtidos para cepas W303/V51-C25H1 e W303/V51. O sinal adicional a 8,7 min foi observado novamente por HPLC (detecção UV) para o transformante V51-C25H1. O composto mostrou o mesmo perfil UV (Figura 11) e perfil de fragmentação de massa (Figura 12) que o composto detectado em W303/C25H1, indicando fortemente que esse composto também é acetato de 25- hidróxi-ergosterol. EXEMPLO 16 Produção de acetato de 25-hidróxi-ergosterol por expressão de gene C25H3 na cepa de S. cerevisiae W303-1B

O plasmídeo V51-C25H3 (Exemplo 7) construído para expressão indutível por galactose do gene sintético C25H3 foi transformado na cepa W303-1B (descrita no Exemplo 8) usando o método de lítio-PEG (Gietz e cols., 1995). Os transformantes foram selecionados em meio mínimo sem uracil. Quatro transformantes independentes foram analisados quanto à ocorrência de V51-C25H3. Um transformante positivo foi designado W303/V51-C25H3 e usado para investigações posteriores dos esteróis produzidos.

As cepas foram desenvolvidas em meio de galactose de Kapelli 2% (Tabela 2) até que alcançassem a fase estacionária. Os esteróis foram extraídos das células coletadas e analisados por HPLC com detecções UV e espectrometria de massa, como descrito nos Exemplos 8 e 9, sob as condições descritas no Exemplo 10.

A análise dos extratos de esterol por HPLC (detecção UV a 282 nm) como apresentada na Figura 10-D mostrou que o padrão de esterol de W303/V51-C25H3 era muito similar ao padrão de esterol da cepa W303/V51-C25H1 (Exemplo 15), com um novo composto (RT 8,7 min) produzido, além de ergosterol (RT 11,9 min) e ergosta 5,7,22,24-tetraenol (RT 10,0 min). A detecção de PDA UV online (Figura 11) e a espectrometria de massa (Figura 12) mostraram que esse novo composto possuía as mesmas propriedades que o composto produzido por W303/V51-C25H1, por exemplo, o perfil UV de ligação dupla conjugada específico de Δ5-Δ7, uma fragmentação de massa com um sinal principal a m/z = 377 e um sinal menor a m/z = 395, e um retardo do tempo de retenção por HPLC consistentes com um 25-esterol hidroxilado. Todas essas características (perfil UV, fragmentação de massa, tempo de retenção) indicam fortemente que esse novo composto é acetato de 25-hidróxi-ergosterol resultante da expressão de C25H3. EXEMPLO 17 Introdução de C25H1 e C25H3 em uma cepa de levedura que produz principalmente colesta-5,7,24-trienol

O plasmídeo V51-C25H1 (Exemplo 6) e o plasmídeo V51- CH25H3 (Exemplo 7) para expressão indutível por galactose de genes C25H1 e C25H3, e plasmídeo V51 como controle, foram transformados na cepa ERT erg5 erg6 (descrita no Exemplo 12; ERG5 foi inativado por integração do gene URA3) com o método de lítio-PEG (Gietz e cols., 1995). Os transformantes foram selecionados em meio mínimo sem uracil e adenina. Quatro transformantes independentes de cada transformação foram analisados e mostraram as mesmas propriedades. Um transformante de cada transformação foi escolhido aleatoriamente, designado ERT erg5 erg6/V51- C25H1, ERT erg5 erg6/V51-C25H3 e ERT erg5 erg6/V51, respectivamente, e usado para análise posterior.

As cepas foram desenvolvidas em meio de galactose de Kapelli 2% (Tabela 2) até que alcançassem a fase estacionária. Os esteróis foram extraídos e analisados por HPLC com detecção UV e espectrometria de massa, como descrito nos Exemplos 8 e 9, sob as condições descritas no Exemplo 10. Nenhuma diferença no padrão de esterol foi detectada entre as três cepas, provando que as duas hidroxilases não estão ativas em colesta-5,7,24-trienol. EXEMPLO 18

Seleção de genes adicionais de colesterol 25-hidroxilase Além dos supostos genes selecionados de colesterol 25- hidroxilase de S. scrofa e C. familiaris (Canis lupus), os genes homólogos de R. norvegicus (ID. DE SEQ. N°: 21, número de acesso no banco de genes NP_001020586, XP_220063), P. troglodytes (ID. DE SEQ. N°: 18, número de acesso no banco de genes XP_507901) e E. caballus (ID. DE SEQ. N°: 24, número de acesso no banco de genes XP_001503057) também foram investigados com mais detalhe.

Dois genes códon-otimizados diferentes para expressão em S. cerevisiae para cada 25-hidroxilase selecionada foram calculados (IDS. DE SEQ. Nos: 19, 20, 22, 23, 25, 26). Todos os genes que terminam com o sufixo “_opt” foram códon-otimizados pela empresa DNA 2.0 (Menlo Park, CA, EUA) usando seu algoritmo proprietário. Todos os genes com o sufixo “_HY” foram gerados sempre se colocando o códon mais comum para cada aminoácido em cada posição em que o aminoácido ocorre na sequência. Tabelas de uso de códons típico para levedura estão disponíveis publicamente e também são parte da suíte de programas Lasergene.

Dois novos genes otimizados para a 25-hidroxilase de S. scrofa (veja o Exemplo 2) também foram calculados com a utilização dos mesmos métodos descritos acima (ID. DE SEQ. N°: 27, 28) .

Usando o alinhamento de sequências de aminoácidos que foi calculado com o algoritmo de ClustalW conhecido como entrada, uma sequência de aminoácidos de consenso foi determinada simplesmente selecionando-se o aminoácido mais abundante para cada posição. Se um “aminoácido mais abundante” não puder ser determinado, o aminoácido para a respectiva posição foi escolhido arbitrariamente. A sequência de aminoácidos de ConHyD (ID. DE SEQ. N°: 29) também foi retrotraduzida em duas sequências de DNA diferentes como descrito acima (ID. DE SEQ. N°: 30, 31) . ID. DE SEQ. N°: 18 - Sequência de aminoácidos da suposta colesterol 25-hidroxilase de P. troglodytes: MSCHNCSDPQVLCSSGQLFLQPLWDHLRSWEALLQSPFFPVIFSITTYVGFCLPFVVLD ILCSWVPALRRYKIHPDFSPSARQLLPCLGQTLYQHVMFVFPVTLLHWARSPALLPHEA PELLLLLHHILFCLLLFDMEFFVWHLLHHKVPWLYRTFHKVHHQNSSSFALATQYMSVW ELFSLGFFDMMNVTLLGCHPLTTLTFHVVNIWLSVEDHSGYNFPWSTHRLVPFGWYGGV VHHDLHHSHFNCNFAPYFTHWDKILGTLRTASVPAR ID. DE SEQ. N°: 19 - Sequência de DNA de P. troglodytes CH25OH_opt 2.0: ATGTCATGTCATAACTGTTCTGATCCTCAAGTTTTGTGTTCAAGTGGTCAACTGTTCCT GCAACCTCTTTGGGATCACTTGAGAAGTTGGGAGGCACTATTGCAGTCTCCATTCTTCC CTGTGATCTTCTCTATTACTACCTATGTTGGATTCTGTTTGCCATTTGTGGTGCTGGAC ATTCTATGCTCATGGGTTCCTGCCTTGAGAAGGTATAAGATACATCCTGACTTTTCCCC TTCTGCTAGACAACTTTTACCATGCTTAGGGCAAACATTGTACCAACACGTGATGTTCG TTTTCCCAGTGACATTGTTGCATTGGGCTAGATCCCCAGCTTTACTTCCACACGAAGCC CCAGAACTGTTACTTCTACTACACCACATTCTGTTCTGCTTGCTGCTATTTGATATGGA GTTTTTCGTATGGCACTTGCTTCATCACAAAGTCCCATGGTTATACAGAACCTTTCATA AAGTACATCACCAAAACTCCTCTTCCTTTGCACTGGCCACTCAGTACATGTCTGTTTGG GAATTGTTTAGTTTAGGGTTTTTCGATATGATGAATGTCACGTTGCTAGGCTGTCACCC ATTAACGACATTAACATTTCATGTTGTCAATATCTGGTTGTCAGTTGAGGATCATAGTG GCTACAACTTCCCATGGTCTACGCACAGATTAGTACCATTCGGTTGGTATGGTGGTGTT GTACATCATGACTTGCATCACTCTCATTTCAATTGTAACTTTGCTCCTTACTTCACACA TTGGGATAAGATCCTAGGAACTCTGAGAACAGCCTCAGTACCTGCAAGGTAATGA ID. DE SEQ. N°: 20 - Sequência de DNA de P. troglodytes CH25OH_HY: ATGTCTTGTCACAACTGTTCTGATCCACAAGTTTTGTGTTCTTCTGGTCAATTGTTCTT GCAACCATTGTGGGATCACTTGAGATCaTGGGAAGCcTTGTTGCAATCTCCATTCTTCC CAGTTATTTTCTCTATTACTACTTACGTTGGTTTCTGTTTGCCATTCGTTGTTTTGGAT ATTTTGTGTTCTTGGGTTCCAGCTTTGAGAAGATACAAGATTCACCCAGATTTCTCTCC ATCTGCTAGACAATTGTTGCCATGTTTGGGTCAAACTTTGTACCAACACGTTATGTTCG TTTTCCCAGTTACTTTGTTGCACTGGGCTAGATCcCCAGCTTTGTTGCCACACGAAGCT CCAGAATTGTTGTTGTTGTTGCACCACATTTTGTTCTGTTTGTTGTTGTTCGATATGGA gTTCTTCGTTTGGCACTTGTTGCACCACAAGGTTCCATGGTTGTACAGAACTTTCCACA AGGTTCACCACCAAAACTCTTCTTCTTTCGCTTTGGCTACTCAATACATGTCTGTTTGG GAATTGTTCTCTTTGGGTTTCTTCGATATGATGAACGTTACTTTGTTGGGTTGTCACCC ATTGACTACTTTGACTTTCCACGTTGTTAACATTTGGTTGTCTGTTGAAGATCACTCTG GTTACAACTTCCCATGGTCTACTCACAGATTGGTTCCATTCGGTTGGTACGGTGGTGTT GTTCACCACGATTTGCACCACTCTCACTTCAACTGTAACTTCGCTCCATACTTCACTCA CTGGGATAAGATTTTGGGTACTTTGAGAACTGCTTCTGTTCCAGCTAGATAATGA ID. DE SEQ. N°: 21 - Sequência de aminoácidos da suposta colesterol 25-hidroxilase de R. norvegicus: MACHNVSELQDLGCSNQLLLQPLWDSIRTGEASARSPFFPVIFSIFTYLGFCLPFVVLD VLCPWVPILRRYKIHPDFSPSVRQLLPCLGLTLYQHLVFVFPVTLMHWARSPALLPREA PELSQLLSHVLICLLLFDTEIFAWHLLHHKVPWLYRTFHKVHHQNSSSFALATQYMSVW ELLSLTFFDVLNVAMLQCHPLTILVFHVVNIWLSVEDHSGYDFPWSTHRLVPFGWYGGV AHHDLHHSQFNCNFAPYFTHWDKMLGTLRCAPHSKRLCAGSESCLDSGEQCTVHLNQKK KQT ID. DE SEQ. N°: 22 - Sequência de DNA de R. norvegicus CH25OH_opt 2.0: ATGGCTTGTCATAATGTTTCAGAATTGCAGGATTTGGGTTGTAGTAACCAATTACTACT ACAACCACTTTGGGACTCTATCAGAACTGGCGAAGCATCTGCTCGTTCTCCATTCTTCC CTGTCATTTTCTCCATTTTCACTTACTTAGGCTTTTGTCTGCCATTTGTAGTCTTGGAT GTACTTTGTCCATGGGTTCCTATACTTAGAAGATACAAGATCCATCCTGACTTCTCACC ATCCGTCAGGCAGTTGCTACCTTGCTTGGGTCTAACATTGTATCAGCACCTAGTGTTCG TTTTTCCAGTCACATTGATGCACTGGGCTAGATCACCAGCCCTGCTACCTAGAGAAGCA CCAGAGTTATCTCAATTACTGTCCCATGTACTGATATGCTTGTTGTTGTTTGACACTGA AATCTTTGCTTGGCATCTTTTACACCACAAAGTTCCTTGGTTATACAGAACCTTCCATA AGGTGCATCACCAAAACTCATCTTCATTTGCTTTAGCCACTCAATACATGAGTGTGTGG GAGCTGTTATCATTAACCTTTTTCGATGTCCTTAATGTTGCCATGCTTCAATGTCACCC TTTGACAATTCTGGTTTTTCATGTTGTCAACATCTGGTTGTCTGTAGAAGATCACTCTG GATATGATTTCCCATGGTCTACTCATAGGTTAGTTCCTTTCGGTTGGTACGGGGGTGTA GCACATCATGATCTGCATCATAGTCAATTCAACTGCAATTTCGCACCATACTTCACACA TTGGGATAAGATGCTAGGGACTCTAAGATGTGCCCCACACTCCAAGAGACTTTGTGCTG GATCAGAATCTTGCCTAGATAGTGGTGAACAATGTACAGTGCACTTGAACCAGAAAAAG AAACAAACATGATAATGA ID. DE SEQ. N°: 23 - Sequência de DNA de R. norvegicus CH25OH_HY: ATGGCTTGTCACAACGTTTCTGAATTGCAAGATTTGGGTTGTTCTAACCAATTGTTGTT GCAACCATTGTGGGATTCTATTAGAACTGGTGAAGCaTCTGCTAGATCaCCATTCTTCC CAGTTATTTTCTCTATTTTCACTTACTTGGGTTTCTGTTTGCCATTCGTTGTTTTGGAT GTTTTGTGTCCATGGGTTCCAATTTTGAGAAGATACAAGATTCACCCAGATTTCTCTCC ATCTGTTAGACAATTGTTGCCATGTTTGGGTTTGACTTTGTACCAACACTTGGTTTTCG TTTTCCCAGTTACTTTGATGCACTGGGCTAGATCaCCAGCTTTGTTGCCAAGAGAAGCT CCAGAATTGTCTCAATTGTTGTCTCACGTTTTGATTTGTTTGTTGTTGTTCGATACTGA AATTTTCGCTTGGCACTTGTTGCACCACAAGGTTCCATGGTTGTACAGAACTTTCCACA AGGTTCACCACCAAAACTCTTCTTCTTTCGCTTTGGCTACTCAATACATGTCTGTTTGG GAATTGTTGTCTTTGACTTTCTTCGATGTTTTGAACGTTGCTATGTTGCAATGTCACCC ATTGACTATTTTGGTTTTCCACGTTGTTAACATTTGGTTGTCTGTTGAAGATCACTCTG GTTACGATTTCCCATGGTCTACTCACAGATTGGTTCCATTCGGTTGGTACGGTGGTGTT GCTCACCACGATTTGCACCACTCTCAATTCAACTGTAACTTCGCTCCATACTTCACTCA CTGGGATAAGATGTTGGGTACTTTGAGATGTGCTCCACACTCTAAGAGATTGTGTGCTG GTTCTGAATCTTGTTTGGATTCTGGTGAACAATGTACTGTTCACTTGAACCAAAAGAAG AAGCAAACTTAATGA ID. DE SEQ. N°: 24 - Sequência de aminoácidos da suposta colesterol 25-hidroxilase de E. caballus: MSGHNSSELHVLCSSGQLFLQPLWDSLRTREALTHSPFFPVIFSIATYVGFCLPFVVLD LLCPWVPALRRYKIHPDFLPSARQVLPCLGQTLYQHLVFVFPATLLLWARGPVFLPLEA PELLQLAFHVVFCLLLFDTEFFLWHVLHHKVPWLYRTFHKMHHQNSSSFALATQYMSIW ELFSLVFFDIMNVTLLECHPLTILVFHVVNIWLSVEDHSGYDFPWSTHRLVPFGWYGGV AHHDLHHSQFNCNFAPYFTHWDKILGTLRSAHAK ID. DE SEQ. N°: 25 - Sequência de DNA de E. caballus CH25OH_opt 2.0: ATGTCCGGCCATAACTCATCAGAACTTCATGTTTTGTGTTCCTCTGGCCAATTGTTCCT ACAACCTTTGTGGGATTCACTGAGAACTAGAGAGGCTCTTACACACTCCCCATTCTTCC CAGTAATCTTCTCAATCGCAACTTACGTTGGATTTTGTTTGCCATTTGTTGTCCTTGAC TTGTTATGCCCTTGGGTGCCAGCCCTTAGAAGATACAAGATACATCCTGATTTTCTGCC AAGTGCCAGACAGGTCTTGCCATGCTTAGGTCAAACCCTTTACCAACATCTAGTGTTCG TATTCCCTGCAACACTATTGCTATGGGCTAGAGGGCCAGTATTTCTGCCTTTAGAAGCC CCTGAACTATTACAATTAGCATTCCATGTCGTCTTTTGTCTGTTGTTATTCGATACCGA GTTTTTCCTGTGGCATGTTTTACATCATAAAGTACCATGGTTATACCGTACATTTCACA AAATGCACCATCAAAACAGTTCCTCTTTCGCCCTTGCTACTCAGTATATGTCTATCTGG GAACTGTTTAGTCTAGTCTTTTTCGACATTATGAACGTTACATTGTTGGAATGTCACCC ATTGACAATACTTGTTTTTCATGTTGTGAATATCTGGCTTTCTGTTGAAGATCACTCTG GTTACGATTTCCCTTGGTCAACACATAGGTTAGTTCCATTCGGATGGTATGGTGGAGTG GCTCACCATGATTTGCATCACTCACAATTCAATTGCAATTTCGCACCATACTTCACTCA CTGGGATAAGATTTTGGGTACACTAAGGTCTGCACACGCTAAGTAATGA ID. DE SEQ. N°: 26 - Sequência de DNA de E. caballus CH25OH_HY: ATGTCTGGTCACAACTCTTCTGAATTGCACGTTTTGTGTTCTTCTGGTCAATTGTTCTT GCAACCATTGTGGGATTCTTTGAGAACTAGAGAGGCTTTGACTCACTCTCCATTCTTCC CAGTTATTTTCTCTATTGCTACTTACGTTGGTTTCTGTTTGCCATTCGTTGTTTTGGAT TTGTTGTGTCCATGGGTTCCAGCTTTGAGAAGATACAAGATTCACCCAGATTTCTTGCC ATCTGCTAGACAAGTTTTGCCATGTTTGGGTCAAACTTTGTACCAACACTTGGTTTTCG TTTTCCCAGCTACTTTGTTGTTGTGGGCTAGAGGTCCAGTTTTCTTGCCATTGGAAGCT CCAGAATTGTTGCAATTGGCTTTCCACGTTGTTTTCTGTTTGTTGTTGTTCGATACTGA ATTTTTCTTGTGGCACGTTTTGCACCACAAGGTTCCATGGTTGTACAGAACTTTCCACA AGATGCACCACCAAAACTCTTCTTCTTTCGCTTTGGCTACTCAATACATGTCTATTTGG GAATTGTTCTCTTTGGTTTTCTTCGATATTATGAACGTTACTTTGTTGGAATGTCACCC ATTGACTATTTTGGTTTTCCACGTTGTTAACATTTGGTTGTCTGTTGAAGATCACTCTG GTTACGATTTCCCATGGTCTACTCACAGATTGGTTCCATTCGGTTGGTACGGTGGTGTT GCTCACCACGATTTGCACCACTCTCAATTCAACTGTAACTTCGCTCCATACTTCACTCA CTGGGATAAGATTTTGGGTACTTTGAGATCAGCTCACGCTAAGTAATGA ID. DE SEQ. N°: 27 - Sequência de DNA de S. scrofa CH25OH_opt 2.0: ATGTCTGGTCATAACAATTCTGAGCTATTAGTTCTATGTTCTAGTGGACAGTTGTTCCT TCAGCCATTATGGGATCATTTGAAAACCTGGGAAACTTTGATTCAATCACCATTCTTCC CAGTCTTTTTCTCAATAACAACTTATCTGGGTTTCTGTTTACCTTTCGTAGTGCTAGAT GTTCTATGTCCTTGGGTGCCAGCACTTAGAAGATACAAGATCCACCCTGACTTCTCACC ATCCGTTTGGCAACTACTTCCATGTTTAGGATTAACCCTTTACCAACATGTTGTTTTTG TTTTTCCAATGACACTATTACACTGGGCTGCTTCACCTGTCTTACTACCTCCTGAAGCT CCTGAGTTACTGCAATTAGTGAGACATATAGTTTTGTGCTTGCTTCTGTTCGATACTGA GTTTTTCATTTGGCATGTCTTGCATCACAAAGTACCATGGTTGTATAGGACATTTCATA AGATGCACCATCAGAACAGTTCCTCTTTCGCCCTGGCCACTCAATACATGTCAGTCGGC GAACTGTTGTCTTTGGGTGTATTTGATATGGTTAACATCATGCTACTACGTTGTCATCC ACTTACAGTGTTGATCTTTCATGTCATTAACATCTGGCTTTCAGTAGAAGATCATAGTG GATACGACTTTCCATGGTCTACTCACAGACTGGTTCCATTCGGTTGGTACGGAGGTGTA ACACACCACGATTTGCATCACTCTCAATTCAATTGCAATTTCGCTCCATACTTCACACA TTGGGATAAGATATTGGGCACATTAAGATCCGCACACGCAAAGTAATGA ID. DE SEQ. N°: 28 - Sequência de DNA de S. scrofa CH25OH_HY: ATGTCTGGTCACAACAACTCTGAATTGTTCGTTTTGTGTTCTTCTTCTCAATTGTTCTT GCAACCATTGTGGGATCACTTGAAGACTTGGGAAACTTTGATTTTGTCTCCATTCTTCC CAGTTTTCTTCTCTATTACTACTTACTTGGGTTTCTGTTTGCCATTCGTTGTTTTGGAT GTTTTGTGTCCATGGGTTCCAGCTTTGAGAAGATACAAGATTCACCCAGATTTCTCTCC ATCTGTTTGGCAATTGTTGCCATGTTTGGGTTTGACTTTGTACCAACACGTTGTTTTCG TTTTCCCAATGACTTTGTTGCACTGGGCTGCTTCTCCAGTTTTGTTGCCACCAGAAGCT CCAGAATTGTTGCAATTGGTTAGACACATTGTTTTGTGTTTGTTGTTGTTCGATACTGA gTTCTTCATTTGGCACGTTTTGCACCACAAGGTTCCATGGTTGTACAGAACTTTCCACA AGATGCACCACCAAAACTCTTCTTCTTTCGCTTTGGCTACTCAATACATGTCTGTTGGT GAATTGTTGTCTTTGGGTGTTTTCGATATGGTTAACATTATGTTGTTGAGATGTCACCC ATTGACTGTTTTGATTTTCCACGTTATTAACATTTGGTTGTCTGTTGAAGATCACTCTG GTTACGATTTCCCATGGTCTGCTCACAGATTGGTTCCATTCGGTTGGTACGGTGGTGTT ACTCACCACGATTTGCACCACTCTCAATTCAACTGTAACTTCGCTCCATACTTCACTCA CTGGGATAAGATTTTGGGTACTTTGAGATCaGCTCACGCTAAGTAATGA ID. DE SEQ. N°: 2 9 - Sequência de aminoácidos de ConHyD: MSCHNSSELQVLCSSGQLFLQPLWDHLRTWEALIQSPFFPVIFSITTYVGFCLPFVVLD VLCPWVPALRRYKIHPDFSPSARQLLPCLGQTLYQHVVFVFPVTLLHWARSPALLPREA PELLQLLSHVLFCLLLFDTEFFVWHLLHHKVPWLYRTFHKVHHQNSSSFALATQYMSVW EL1SLGFFDMLNVTLLQCHPLTVLTFHVVNIWLSVEDHSGYDFPWSTHRLVPFGWYGGV AHHDLHHSQFNCNFAPYFTHWDKILGTLRSAhAK ID. DE SEQ. N°: 30 - Sequência de DNA de ConHyD_opt 2.0: ATGTCTTGCCACAATTCCTCTGAGCTTCAAGTATTGTGTTCATCAGGTCAGTTGTTTTT GCAACCATTATGGGATCACTTAAGGACGTGGGAAGCCCTGATTCAAAGTCCTTTCTTCC CTGTGATATTCTCCATAACTACTTACGTGGGCTTTTGTTTACCATTTGTTGTTTTGGAT GTTCTATGCCCATGGGTTCCAGCTCTGAGAAGATACAAGATTCATCCAGATTTCTCCCC TTCAGCCAGACAATTGTTACCATGTTTGGGGCAAACACTATATCAGCATGTGGTCTTTG TTTTCCCTGTGACTCTATTACATTGGGCCAGAAGTCCTGCTTTGCTGCCTAGAGAAGCC CCTGAACTGTTGCAGTTATTGTCTCACGTCTTATTCTGTTTGCTGCTTTTCGATACAGA GTTTTTCGTTTGGCATCTACTTCATCATAAAGTTCCATGGCTGTATAGAACGTTCCACA AAGTCCACCACCAGAACTCTAGTTCATTCGCATTGGCCACCCAATACATGTCCGTATGG GAACTGCTATCTTTAGGCTTTTTCGATATGCTTAATGTCACTCTTTTGCAATGTCATCC TTTGACAGTGCTAACATTCCATGTAGTGAACATCTGGTTATCTGTAGAAGATCACAGTG GATATGATTTTCCTTGGTCTACTCACAGGTTGGTTCCATTTGGATGGTATGGTGGTGTA GCTCATCACGACCTGCATCATTCACAATTCAATTGCAACTTTGCTCCATACTTTACACA TTGGGACAAAATCTTGGGAACATTAAGGTCTGCTCATGCAAAGTGA ID. DE SEQ. N°: 31 - Sequência de DNA de ConHyD_HY: ATGTCTTGTCACAACTCTTCTGAATTGCAAGTTTTGTGTTCTTCTGGTCAATTGTTCTT GCAACCATTGTGGGATCACTTGAGAACTTGGGAAGCaTTGATTCAATCTCCATTCTTCC CAGTTATTTTCTCTATTACTACTTACGTTGGTTTCTGTTTGCCATTCGTTGTTTTGGAT GTTTTGTGTCCATGGGTTCCAGCTTTGAGAAGATACAAGATTCACCCAGATTTCTCTCC ATCTGCTAGACAATTGTTGCCATGTTTGGGTCAAACTTTGTACCAACACGTTGTTTTCG TTTTCCCAGTTACTTTGTTGCACTGGGCTAGATCaCCAGCTTTGTTGCCAAGAGAAGCT CCAGAATTGTTGCAATTGTTGTCTCACGTTTTGTTCTGTTTGTTGTTGTTCGATACTGA ATTtTTCGTTTGGCACTTGTTGCACCACAAGGTTCCATGGTTGTACAGAACTTTCCACA AGGTTCACCACCAAAACTCTTCTTCTTTCGCTTTGGCTACTCAATACATGTCTGTTTGG GAATTGTTGTCTTTGGGTTTCTTCGATATGTTGAACGTTACTTTGTTGCAATGTCACCC ATTGACTGTTTTGACTTTCCACGTTGTTAACATTTGGTTGTCTGTTGAAGATCACTCTG GTTACGATTTCCCATGGTCTACTCACAGATTGGTTCCATTCGGTTGGTACGGTGGTGTT GCTCACCACGATTTGCACCACTCTCAATTCAACTGTAACTTCGCTCCATACTTCACTCA CTGGGATAAGATTTTGGGTACTTTGAGATCaGCTCACGCTAAGTAATGA EXEMPLO 19

Expressão dos novos genes de 25-hidroxilase por uma construção de expressão integrada em ERG6

Os novos genes mostrados no Exemplo 18 foram integrados no lócus ERG6 de S. cerevisiae SC0554 (erg5, erg6, TRP1-pARC300D, URA3-pARC304S, ARE1::TDH3p-S24R2-PGKt- URA3; para uma descrição de dois plasmídeos, veja a Patente U.S. 5.460.949).

A sequência da construção de integração é mostrada abaixo. As hidroxilases de interesse foram clonadas entre o sítio Bam HI e Eco RI da construção de integração. A construção de integração de ERG6 possuía o promotor de TDH3 e o terminador de PGK de S. cerevisiae para expressão e o URA3 de S. cerevisiae para seleção, como encontrado no plasmídeo V51TDH. O cultivo, a transformação e a seleção foram feitos como descritos acima.

As cepas finais foram denominadas: S. cerevisiae Ecab_HY (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 26), Ecab opt 2.0 (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 25), Ptro opt 2.0 (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 19), Ptro HY (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 20), ConHyD HY (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 31), ConHyD opt 2.0 (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 30), Rnor HY (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 23), Rnor opt 2.0 (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 22), Sscr HY (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 28), Sscr opt 2.0 (construção de integração que possui o gene do ID. DE SEQ. N°: 27), e Scr Pompon, que possuía a 25-hidroxilase de porco otimizada como descrito no Exemplo 2. ID. DE SEQ. N°: 32 - Sequência de DNA da construção de integração de ERG6: gtcgacGTTTTACTTTCGATTTAAGTTTTACATAATTTAAAAAAACAAGAATAAAATAA TAATATAGTAGGCAGCATAAGATGAGTGAAACAGAATTGAGAAAAAGACAGGCCCAATT CACTAGGGAGTTACATGGTGATGATATTGGTAAAAAGACAGGTTTGAGTGCATTGATGT CGAAGAACAACTCTGCCCAAAAGGAAGCCGTTCAGAAGTACTTGAGAAATTGGGATGGT AGAACCGATAAAGATGCCGAAGAACGTCGTCTTGAGGATTATAATGAAGCCACACATTC CTACTATAACGTCGTTACAGATTTCTATGAATATGGTTGaGGTTCCTCTTTCCATTTCA GCAGATTTTATAAAGGTGAGAGTTTCGCTGCCTCGATAGCAAGACATGAACATTATTTA GCTTACAAGGCTGGTATTCAAAGAGGCGATTTAGTTCTCGACGTTGGTTGTGGTGTTGG GGGCCCAGCAAGAGAGATTGCAAGATTTACCGGTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAA TTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCT GTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGT GTCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAG CTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCAT CAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAA AAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGG CAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCT CTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCC TACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATT TCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCA AGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAggatccattattatttgaattcGCGGGGGA TCTCCCATGTCTCTACTGGTGGTGGTGCTTCTTTGGAATTATTGGAAGGTAAGGAATTG CCAGGTGTTGCTTTCTTATCCGAAAAGAAATAAATTGAATTGAATTGAAATCGTAGATC AATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTT TTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTAT TAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTT TCCCATTCGATATTTCTATGTTCGGGTTCAGCGTATTTTAAGTTTAATAACTCGAAAAT TCTGCGTTCGAAAGCTTTTCAATTCATCTTTTTTTTTTTTGTTCTTTTTTTTGATTCCG GTTTCTTTGAAATTTTTTTGATTCGGTAATCTCCGAGCAGAAGGAAGAACGAAGGAAGG AGCACAGACTTAGATTGGTATATATACGCATATGTGGTGTTGAAGAAACATGAAATTGC CCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTGCAGGAAACGAAGATAAATCAT GTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCTACTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCCAAGC TATTTAATATCATGCACGAAAAGCAAACAAACTTGTGTGCTTCATTGGATGTTCGTACC ACCAAGGAATTACTGGAGTTAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAATTTGTTTACTAAAAAC ACATGTGGAcATCTTGACTGATTTTTCCATGGAGGGCACAGTTAAGCCGCTAAAGGCAT TATCCGCCAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGTAAT ACAGTCAAATTGCAGTACTCTGCGGGTGTATACAGAATAGCAGAATGGGCAGACATTAC GAATGCACACGGTGTGGTGGGCCCAGGTATTGTTAGCGGTTTGAAGCAGGCGGCGGAAG AAGTAACAAAGGAACCTAGAGGCCTTTTGATGTTAGCAGAATTGTCATGCAAGGGCTCC CTAGCTACTGGAGAATATACTAAGGGTACTGTTGACATTGCGAAGAGCGACAAAGATTT TGTTATCGGCTTTATTGCTCAAAGAGACATGGGTGGAAGAGATGAAGGTTACGATTGGT TGATTATGACACCCGGTGTGGGTTTAGATGACAAGGGAGACGCATTGGGTCAACAGTAT AGAACCGTGGATGATGTGGTCTCTACAGGATCTGACATTATTATTGTTGGAAGAGGACT ATTTGCAAAGGGAAGGGATGCTAAGGTAGAGGGTGAACGTTACAGAAAAGCAGGCTGGG AAGCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGCAAAACTAAAAAACTGTATTATAAGTAAATGCA TGTATACTAAACTCACAAATTAGAGCTTCAATTTAATTATATCAGTTATTACCCGGGAA TCTCGGTCGTAATGATTTCTATAATGACGTTGGAAAGAAAAAGCTTATTCACTAGATCA ATAAGATTCAAATAAAGCGCACGATATATACCTATTTTCCTATATATGCAGATAAAAAG ATAGCACGTTCATTGCTAGCAGGCCTTACAAACAGACTGTCCGATGCCTTTACTACCCC ACAATTTATCCCACTTGTGATTTTCAAGTTCGGCTTTTTTTTTTTTCATCATGTCGTGG CAAACGACCAGTATTTTCTATCAGAATAAGAAAAAACTATAATTCACTGCATACAAACG TATTGACTGCTCCCCTACAGCGGAAGATAGTAAGAATACAACATCGTAACTGTTTCCAT ATTTATGTGCCGATATGGTAAAAGTGAAATCTAAGAATAGTGTTATAAAGCTATTGTCT ACAGCGGCAAGTGGATACTCTCGTTACATCTCGATTAAGAAAGGTGCACCTTTGGTTAC TCAGGTCAGATACGATCCTGTGGTGAAACGGCATGTGCTTTTCAAAGAAGCAAAGAAAA GGAAAGTGGCAGAAAgtcgac EXEMPLO 20 Ensaios em frasco agitado das novas cepas HyDHC

As cepas que foram geradas como descrito no Exemplo 19 foram cultivadas em frascos agitados para avaliar o efeito da superexpressão dos supostos genes de 25-hidroxilase recém-designados. Quatro ml de uma cultura de um dia para o outro em meio YPD foram usados para inoculação de 20 ml de meio de Kapelli (Exemplo 1). Após cultivo por 24 e 48 h, 10 g/l, e, após 32 e 56 h, 20 g/l de glicose foram alimentados. Após um tempo de cultura de 72 h, as células foram centrifugadas, saponificadas e o teor de esterol foi determinado como descrito no Exemplo 9. Como mostrado na Figura 15, todos os novos genes de hidroxilase foram expressos em S. cerevisiae e todos os produtos gênicos foram capazes de hidroxilar 7-DHC em HyDHC, embora com graus variáveis de eficiência.

Literatura, com cada referência sendo aqui incorporada por referência: Brachmann C.B., Davies A., Cost G.J., Caputo E., Li J., Hieter P., Boeke J.D. (1998). Yeast 14(2): 115-132. Crameri A., Biondi E., Kuehnle K., Liitjohann D., Thelen K.M., Perga S., Dotti C.G., Nitsch R.M., Ledesma M.D., Mohajeri M.H. (2006). EMBO J. 25(2): 432-43. Cullin C., Pompon D. (1988). Gene 65: 203-217. Bonneaud N., Ozier-Kalogeropoulos O., Li G.Y., Labouesse M., Minvielle-Sebastia L., Lacroute F. (1991). Yeast 7: 609-615. Gaber R.F., Copple D.M., Kennedy B.K., Vidal M, Bard M. (1989). Mol. Cell. Biol. 9(8): 3.447-3.456. Guarente L., Yocum R.R., Gifford P. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 7.410-7.414. Hoffman C.S. e Winston F. (1987). Gene 57: 267-272. Gietz R.D., Schiestl R.H., Willems A.R., Woods R.A. (1995). Yeast 11: 355-360. Lecain E., Chenivesse X., Spagnoli R., Pompon D. (1996). J. Biol. Chem. 271(18): 10.866-10.873. Lund E.G., Kerr T.A., Sakai J., Li W.P., Russell D.W. (1998). J. Biol. Chem. 273(51): 34.316-34.327. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1998). “Molecular cloning: a laboratory manual”. 2a Edição. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory. Secen H., Kalpar H. (1999). Turk. J. Chem. 23: 27-30. Thomas B.J. e Rothstein R. (1989). Cell 56(4): 6195 630. Waterham H.R., Koster J., Romeijn G.J., Hennekam R.C.M., Vreken P., Andersson H.C., FitzPatrick D.R., Kelley R.I., Wanders R.J.A. (2001). Am. J. Hum. Genet. 69: 685694. 10 Wu C., Miloslayskaya I., Demontis S., Maestro R., Galaktionov K. (2004). Nature 432 (7017): 640-5. Zhang S.P., Zubay G., Goldman E. (1991). Gene 1005: 61-72.

Claims (6)

1. Uso de colesterol C25-hidroxilase para hidroxilar ergosterol caracterizado por produzir 25-hidroxiergosterol, em que a produção ocorre dentro de uma célula de levedura modificada, na qual ERG6 e ERG5 são inativadas, e a levedura também expressa uma esterol Δ24-redutase.

2. Uso de colesterol C25-hidroxilase para hidroxilar 7-desidrocolesterol caracterizado por produzir 25-hidróxi- 7-desidrocolesterol, em que a produção ocorre dentro de uma célula de levedura modificada, na qual ERG6 e ERG5 são inativadas, e a levedura também expressa uma esterol Δ24- redutase.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato da célula de levedura ser selecionada do grupo que consiste em: Saccharomyces cerevisiae, Pichia spp, Klyuveromyces spp., Hansenula spp. Schizosaccharomyces spp. e Yarrowia lipolitica.

4. Método de produção de 25-hidróxi-7- desidrocolesterol em uma levedura geneticamente modificada caracterizado por compreender: a) colocar em contato 7-desidrocolesterol com uma colesterol C25-hidroxilase produzida pela levedura, na qual 25-hidróxi-7-desidrocolesterol é produzido, em que a levedura não possui enzimas de Erg5p e Erg6p ativas, e a levedura também expressa uma esterol Δ24-redutase.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender ainda, antes da etapa (a): colocar em contato colesta-5,7,24-trienol com uma levedura compreendendo uma sequência de ácido nucléico que codifica uma enzima esterol Δ24-redutase funcional, em que a levedura converte lanosterol, dimetil zimosterol, metil zimosterol, zimosterol, colesta-7,24- dienol ou colesta-5,7,24-trienol em 3β-hidr0xi-8-lanosta-8- eno, 4,4-dimetil-colesta-8-enol, 4α-metil-colesta-8-enol, 5 colesta-8-enol, latosterol ou 7-desidrocolesterol, respectivamente.

6. Método de produção de 25-hidroxiergosterol (25- hidroxiprovitamina D2) em uma levedura geneticamente modificada caracterizado por compreender: 10 a) colocar em contato ergosterol produzido pela levedura com uma colesterol C25-hidroxilase produzida pela levedura, em que 25-hidroxiergosterol é produzido.

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