JP2004141125A - 代謝工学的に改変されている真菌類およびそれを用いるステロール類の製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】チモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３Δ−オル若しくはその由来生合成化合物等のステロール類を効率的に製造する方法を提供する。
【解決手段】ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性が低減化され、ステロールΔ７−リダクターゼ、および／またはステロールΔ５−デサチュラーゼが高発現化されるように代謝工学的に改変された真菌類（酵母、カビ）を培養し、培養物からステロール類を採取する。
【選択図】 図１
【解決手段】ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性が低減化され、ステロールΔ７−リダクターゼ、および／またはステロールΔ５−デサチュラーゼが高発現化されるように代謝工学的に改変された真菌類（酵母、カビ）を培養し、培養物からステロール類を採取する。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬、食品工業において有用なステロール類を製造する真菌類およびそれを用いたステロール類の製造法に関し、更に詳しくは、酵母、カビ等の真菌類を用いて、培養液からチモステロール、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物を製造する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ステロール類は動物、植物、真菌類に含まれている生命活動に必須の物質であり、細胞膜に遊離型ステロール（Ｆｒｅｅ ｓｔｅｒｏｌ）の状態で含まれるほか、一部は脂肪酸とのエステル型（Ｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒ）として貯蔵される。酵母、カビ等の真菌類ではエルゴステロール（ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ）が主ステロールとなっているが、エルゴステロールは紫外線を照射することによりビタミンＤ３に変換されるので、医薬品の原料として産業上利用することができる。
【０００３】
植物ではシトステロール（ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ）、カンペステロール（ｃａｍｐｅｓｔｅｒｏｌ）、スチグマステロール（ｓｔｉｇｍａｓｔｅｒｏｌ）が主ステロールであるが、これら植物由来ステロール類には抗肥満効果があることが明らかになっており、すでに食用油脂に添加して食品産業に利用されはじめている。さらに特定の植物においては、多くの種類のステロール類が配糖体として存在し、植物体ごと生薬として、あるいは抽出物が生薬成分として利用されている。
【０００４】
一方、動物ではコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）が主ステロールであるが、コレステロールは化粧品のベースオイルとして利用されるほか、誘導体のコール酸（ｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、デオキシコール酸は界面活性剤として利用される。さらにデオキシコール酸の異性体であるウルソデオキシコール酸は医薬品として利用されている。またコレステロールから誘導される各種ステロイドホルモンも、医薬品として利用されている。このように、ステロール類には多岐にわたる用途があり、産業上極めて有用な物質である。
【０００５】
産業上用途が広いステロールであるコレステロールおよびその類縁体の製造には、現在動物組織の抽出物を原料とし用いているが、より安価で安定的に供給可能な代替原料の製造法の開発が求められている。
真菌類のエルゴステロールや植物のシトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなどは、その側鎖の２４位にメチル基ないしはエチル基があり、さらに真菌類のエルゴステロールは母核のＢ環の５位および７位にそれぞれ１つ、側鎖２２位に１つの二重結合を持ち、動物由来のステロールとは物性が大きく異なっている。これらの理由から真菌類のエルゴステロールは、そのままではコレステロール類縁体・誘導体原料を代替することはできない。
【０００６】
動物原料の代替ステロールを真菌類で効率的に生産するためには、少なくとも（１）母核の二重結合は５位の１つのみで（図１母核１）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロール、（２）母核の二重結合は７位の１つのみで（図１母核２）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロール、又は（３）母核の二重結合は５位および７位の２つで（図１母核３）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロールが主ステロールとなるように蓄積させることが必要である。
【０００７】
酵母、カビ等の真菌類においては、生合成酵素欠損株あるいは生合成酵素遺伝子の過剰発現によりステロール組成を変えた研究例は知られていた。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシエでステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を欠損させることにより、側鎖２４位にメチル基を持たないステロールのみが蓄積するようにした例（Ｘｕ， Ｓ．， ａｎｄ Ｎｅｓ， Ｗ． Ｄ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８１， ５０９−５１７）、また酵母でステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ５）を欠損させアラビドプシスのΔ７−ステロールリダクターゼを高発現するように代謝工学的に改変し、エルゴスタ−５，２４−ジエノール、エルゴスタ−５−エネノール、エルゴスタ−５，２２−ジエノールが蓄積するようにした例はあった（Ｌｅｃａｉｎ， Ｅ．， Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ， Ｘ．， Ｓｐａｇｎｏｌｉ， Ｒ．， ａｎｄ Ｐｏｍｐｏｎ， Ｄ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（１８）， １０８６６−１０８７３）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、真菌類を用いて、産業上有用な、（１）母核の二重結合は５位の１つのみで（図１母核１）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロール、（２）母核の二重結合は７位の１つのみで（図１母核２）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロール、又は（３）母核の二重結合は５位および７位の２つで（図１母核３）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロールが主ステロールとして生成されるように改変された例はこれまでなく、培養の容易な酵母、カビ等の真菌類微生物を用いた新規な製造菌株および該菌株を用いた上記ステロール類の製造法の開発が望まれていた。
【０００９】
本発明は、従来コレステロール類縁体や誘導体の原料にはなり得なかった真菌類由来のステロール類を、代謝工学的手法を用いて改変した微生物を用いて、産業上有用なステロール類、すなわちチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルもしくはその由来生合成化合物を製造する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、真菌類を用いた産業上有用なステロール類、すなわちチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルもしくはその由来生合成化合物を製造する方法において、代謝工学的手法により真菌類の菌株の改変を鋭意検討した結果、真菌類のステロールＣ−２２デサチュラーゼ（Ｃ−２２ ｓｔｅｒｏｌ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）（ＥＣ１．１４．１４．−）、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼ（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：Δ２４−ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ＥＣ２．１．１．４１）の両方の活性を低減化し、ステロールΔ７−リダクターゼ（ｓｔｅｒｏｌΔ７−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＥＣ１．３．１．２１）が高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類（酵母、カビ）、または該真菌類のステロールΔ５−デサチュラーゼ（ｓｔｅｒｏｌΔ５−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）が高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類を培養することにより、チモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物を効率的に生産することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明により、ステロールＣ−２２デサチュラーゼおよびステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化するように代謝工学的に改変されていることを特徴とする真菌類、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの活性を低減化し、ステロールΔ７−リダクターゼを高発現するように代謝工学的に改変されていることを特徴とする真菌類、ステロールＣ−２２デサチュラーゼおよびステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化し、かつステロールΔ７−リダクターゼを高発現化するように代謝工学的に改変されていることを特徴とする真菌類、および、上記いずれかの真菌類のステロールΔ５−デサチュラーゼを高発現化するように代謝工学的に改変されていることを特徴とする真菌類が提供される。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の真菌類を培養し、培養物からチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物を採取することを特徴とするチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物（図１で側鎖Ｂの場合）の製造方法、および、上記した本発明の真菌類またはその処理物を、チモステロール、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルまたはコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オルに接触させて、デスモステロールを生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするデスモステロールの製造方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の製造方法で得られたステロール類を、ステロールΔ２４−リダクターゼに接触させることによりステロール類の２４（２５）位の二重結合を還元することを特徴とする、ステロール類（図１で側鎖Ａの場合）の製造方法、および、上記した本発明の製造方法で得られたステロール類の側鎖二重結合を水酸化することにより２５−ヒドロキシステロール、又は、２４，２５−ジヒドロキシステロールの製造方法、および、該誘導体の１α位を水酸化し、Ｂ環を開環し、最終的に２５−ヒドロキシビタミンＤ３類、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３類、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール等の活性型ビタミンＤ類に変換することを特徴とする、活性型ビタミンＤ類の製造方法が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明はステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化し、ステロールΔ７−リダクターゼを高発現するように代謝工学的に改変（図２参照）された真菌類（酵母、カビ）、または該真菌類のステロールΔ５−デサチュラーゼを高発現するように代謝工学的に改変された真菌類を培養し、培養物からチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物を採取することを特徴とするチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物の製造方法を提供する。
【００１５】
コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル由来生合成化合物とは、真菌類生物内でコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルから生合成可能な化合物のことであり、具体的には、コレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オル、デスモステロール、あるいは、コレステロール等が挙げられる。
宿主微生物として用いる真菌類としては、中間体としてチモステロールを経由しエルゴステロールを主ステロールとして生産する（図２参照）真菌類であればいかなる真菌類でも良い。とりわけ、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、または、トルロプシス属、または、ピキア属に属する酵母であることが好ましく、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、デバリオマイセス・ニルソニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｎｉｌｓｓｏｎｉｉ）、トルロプシス・コリキュロサ（Ｔｏｌｕｌｏｐｓｉｓ ｃｏｌｌｉｃｕｌｏｓａ）、ピキア・ファリノサ（Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ）が挙げられる（Ｋａｎｅｋｏ，Ｈ．ら（１９７６） Ｌｉｐｉｄｓ １１（１２）、８３７−８４４）。
【００１６】
これらの中で、代謝工学的手法が用いやすいことからサッカロミセス属が好適である。さらに、サッカロミセス属は、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３などの栄養要求性の遺伝型であることが望ましく、例えば、サッカロミセス・セレビシエ ＫＡ３１１Ａ株（ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）（Ｉｒｉｅ， Ｋ．， Ｔａｋａｓｅ， Ｍ．， Ｌｅｅ， Ｋ． Ｓ．， Ｌｅｖｉｎ， Ｄ． Ｅ．， Ａｒａｋｉ， Ｈ．， Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， Ｋ．， ａｎｄ Ｏｓｈｉｍａ， Ｙ． （１９９３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３， ３０７−３０８３）やサッカロミセス・セレビシエ ＹＰＨ５００株 （ＭＡＴα ａｄｅ２ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｌｙｓ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を挙げることができる。
尚、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＫＡ３１１Ａ株（ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）は、独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９０５３として寄託されている。
【００１７】
本発明においてステロールＣ−２２デサチュラーゼは、各種ステロール類の側鎖の２２（２３）位に二重結合を導入する能力を有する酵素であり、具体的には、例えばコレスタ−５，７，２４−トリエノールをコレスタ−５，７，２２，２４−テトラエノールに、エルゴスタ−５，７−ジエノールをエルゴスタ−５，７，２２−トリエノールに、エルゴスタ−５，２４（２５）−ジエノールをエルゴスタ−５，２２，２４（２５）−トリエノールに、エルゴスタ−５，７，２４（２５）−トリエノールをエルゴスタ−５，７，２２，２４（２５）−テトラエノールに変換する能力を有する酵素を指す。
【００１８】
また、本発明におけるステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼは、Ｓ−アデノシルメチオニンから各種ステロール類の２４位にメチル基を転移させる能力、さらには転移により付加されたメチル基にさらにメチル基を転移させる能力を有する酵素であり、具体的には、例えばチモステロールをフェコステロールに変換する能力を有する酵素を指す。
【００１９】
また、これら酵素をコードする遺伝子は、既に単離され塩基配列が決定されているものもあり、例えば、ステロールＣ−２２デサチュラーゼとしては、サッカロミセス・セレビシエ由来の遺伝子が報告されており（Ｖｅｎｋａｔｒａｍｅｓｈ， Ｍ．， Ｇｕｏ，Ｄ．， Ｊｉａ， Ｚ．， Ｎｅｓ， Ｗ．Ｄ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２９９， ３１３−３２４）、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼとしては、サッカロミセス・セレビシエ由来の遺伝子が報告されている（Ｓｋａｇｇｓ， Ｂ．Ａ．， Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｊ．Ｆ．， Ｐｉｅｒｓｏｎ， Ｃ．Ａ．， Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ， Ｋ．Ｓ．， Ｃｈｕｎ， Ｋ．Ｔ．， Ｋｏｅｇｅｌ， Ｃ．， Ｂａｒｂｕｃｈ， Ｒ．， ａｎｄ Ｂａｒｄ， Ｍ． （１９９６） Ｇｅｎｅ １６９， １０５−１０９）。
【００２０】
ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性低減化方法としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの化学物質あるいはＵＶなどの変異源処理によって得られた両酵素遺伝子の欠損突然変異株を交配する方法、両遺伝子の転写をアンチセンス遺伝子の導入によりおさえる方法、両遺伝子の転写産物をＲＮＡｉ技術によって抑制する方法、両酵素の特異的阻害剤で酵素活性を抑える方法などを用いることができる。
【００２１】
真菌類においては、ステロールＣ−２２デサチュラーゼおよびステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをそれぞれコードしている遺伝子断片中に、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性遺伝子ＤＮＡないしはカナマイシンやオーレオバシジンなどの抗生物質や抗真菌薬に対する耐性遺伝子が挿入された遺伝子断片、あるいはその遺伝子断片がさらにベクターに挿入されたプラスミドを作成し、相同組換えにより宿主染色体中の該遺伝子を破壊する方法が好適に用いられる。
【００２２】
例えば、サッカロミセス・セレビシエにおいては、ステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ５）を含むＤＮＡ断片、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を含むＤＮＡ断片を制限酵素切断ないしはポリメラーゼチェーンリアクション法（以下これを「ＰＣＲ」と略称することがある）によって得てベクターに組み込んで中間ベクターｐＥＲＧ５およびｐＥＲＧ６を作成する。この中間ベクターをＥＲＧ５遺伝子およびＥＲＧ６遺伝子の遺伝子内部にある任意の制限酵素部位で２つに切断し、酵母のＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性遺伝子ｃＤＮＡのいずれか１つを２つの中間ベクター同士で重ならないように選択し挿入することにより遺伝子破壊用ベクターないしはそれをＰＣＲで増幅して得られる遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を作成する。次いでこの遺伝子破壊用ベクターないしは遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を酵母に遺伝子導入することで相同組換えを誘発し、目的遺伝子を破壊することができる。
【００２３】
酵母において、遺伝子破壊用ベクター作成ないしは遺伝子破壊用ＤＮＡ断片作成に用いるベクター系としては、ｐＵＣ系（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ， Ｃ．， Ｖｉｅｉｒａ， Ｊ． ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ｊ． （１９８５） Ｇｅｎｅ ３３（１）， １０３−１１９）やｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（Ｓｈｏｒｔ， Ｊ． Ｍ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｊ． Ｍ．， Ｓｏｒｇｅ， Ｊ． Ａ． ａｎｄ Ｈｕｓｅ， Ｗ． Ｄ． （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６（１５）， ７５８３−７６００、Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ， Ｍ． Ａ． ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ， Ｊ． Ｍ． （１９８９） ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７（２２）， ９４９４）などがあげられる。これらのベクターは市販されており容易に入手可能である。
【００２４】
かくして構築される遺伝子破壊用ＤＮＡ断片若しくは遺伝子破壊用ベクターの具体例として、ＥＲＧ５遺伝子の内部３７１ｂｐを欠失させ、この欠失部分にＴＲＰ１遺伝子が挿入されているＤＮＡ断片（ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１）若しくは該ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１、ＥＲＧ６遺伝子の内部４７６ｂｐを欠失させ、この欠失部分にＨＩＳ３遺伝子が挿入されているＤＮＡ断片（ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３）若しくは該ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３等が挙げられる。
【００２５】
遺伝子導入の方法としては、例えば、電気穿孔法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法があげられるが、酢酸リチウム法が特に好ましい。酵母における遺伝子破壊の確認は、特定の栄養要求性遺伝子が挿入された遺伝子部分が相同組換えにより酵母ゲノム中に組み込まれるために、宿主株が持っていた複数の栄養要求性のうち該当する栄養要求性が消失することで知ることができる。さらにＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子の５’末端と３’末端にそれぞれ設定したＰＣＲプライマーを用いて、遺伝子破壊操作を受けた酵母株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片の長さが挿入した栄養要求性遺伝子の長さだけ大きくなっていることを確認することにより遺伝子破壊の確認を行うことができる。
【００２６】
かくして得られる遺伝子破壊株の具体例としては、遺伝子破壊用ベクターｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１のｅｒｇ５：：ＴＲＰ１断片でＥＲＧ５遺伝子を破壊した、サッカロミセス・セレビシエＫＡΔ５−５株、さらに該Δ５−５株のＥＲＧ６遺伝子をｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３のｅｒｇ６：：ＨＩＳ３断片で破壊したＫＡΔ５Δ６−１株、ＫＡΔ５Δ６−４株、ＫＡΔ５Δ６−５株等が挙げられる。
ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性が低減化された宿主微生物に、さらにステロールΔ７−リダクターゼおよび／またはステロールΔ５−デサチュラーゼが高発現化されるように代謝工学的に改変することができる。
【００２７】
この改変に用いるステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子としては、人、マウスなどの動物由来の遺伝子、およびシロイヌナズナ（Ｌｅｃａｉｎ， Ｅ．， Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ， Ｘ．， Ｓｐａｇｎｏｌｉ， Ｒ．， ａｎｄ Ｐｏｍｐｏｎ， Ｄ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（１８）， １０８６６−１０８７３）、イネ、トマト、大豆などの植物由来遺伝子を挙げることができる。
また、この改変に用いるステロールΔ５−デサチュラーゼとしては、酵母由来の遺伝子（Ａｒｔｈｉｎｇｔｏｎ， Ｂ．Ａ．， Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｌ．Ｇ．， Ｓｋａｔｒｕｄ， Ｐ．Ｌ．， Ｇｕｙｎｎ， Ｃ．Ｊ．， Ｂａｒｂｕｃｈ， Ｒ．Ｊ．， Ｕｌｂｒｉｇｈｔ， Ｃ．Ｅ．， ａｎｄ Ｂａｒｄ， Ｍ． （１９９１） Ｇｅｎｅ １０２（１）， ３９−４４）、ヒトなどの動物由来の遺伝子（Ｍａｔｕｓｈｉｍａ， Ｍ．， Ｉｎａｚａｗａ， Ｊ．， Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｅ．， Ｓｕｚｕｍｏｒｉ， Ｋ．， ａｎｄ Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｙ． （１９９６） Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ７４（４）， ２５２−２５４）、およびシロイヌナズナ（Ｇａｃｈｏｔｔｅ， Ｄ．， Ｈｕｓｓｅｌｓｔｅｉｎ， Ｔ．， Ｂａｒｄ， Ｍ．， Ｌａｃｒｏｕｔｅ， Ｆ．， ａｎｄ Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ， Ｐ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ９（３）， ３９１−３９８）、イネ、トマト、大豆などの植物由来遺伝子を挙げることができる。
これらの遺伝子を真菌類で高発現させるためには、染色体組込型プラスミドのうち多コピーが染色体に組み込まれるベクターを用いる方法（Ｓａｋａｉ， Ａ．， Ｏｚａｗａ， Ｆ．， Ｈｉｇａｓｈｉｚａｋｉ， Ｔ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｙ．， ａｎｄ Ｈｉｓｈｉｎｕｍａ， Ｆ． （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． ９， １３８２−１３８５）および非組み込み型プラスミドのうち２μｍプラスミド由来のｐＡＵＲベクター（タカラバイオ社製）やｐＥＳＣベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）などの多コピー型を用いる方法が好適である。
【００２８】
好ましくはフォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子あるいはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子などの恒常的プロモーターないしはＧＡＬ１ＧＡＬ１０（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， Ｒ． Ｗ． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４（８）， １４４０−１４４８）などの誘導型プロモーター（例えば、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）の下流にステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子またはステロールΔ５−デサチュラーゼをつないで２μｍプラスミドなどの多コピー型プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した発現ベクターを構築し、それを宿主となる真菌類の二重遺伝子破壊株に導入する方法が好適である。
【００２９】
さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビシエのｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株にアラビドプシスのｍＲＮＡからＰＣＲを用いて取得したステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を酵母のアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター下流につなぎ、ＬＥＵ２遺伝子をつないだ２μｍプラスミドに挿入して発現ベクターを構築する方法、および酵母の染色体からＰＣＲを用いて取得したステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子を酵母のアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター下流につなぎ、ＵＲＡ３遺伝子をつないだ２μｍプラスミドに挿入して発現ベクターを構築する方法が好適である。
【００３０】
かくして構築される発現ベクターの具体例として、シロイヌナズナ由来のステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を改変型２μｍベクターｐＡＤＮＳΔＥへ組み込むことにより構築されるプラスミドｐＡＤ−Δ７、およびサッカロミセス・セレビシエ由来のステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子（ＥＲＧ３）を改変型２μｍベクターｐＡＤ−ＵＲＡへ組み込むことにより構築されるプラスミドｐＡＵ−ＥＲＧ３が挙げられる。
遺伝子導入の方法としては、電気穿孔法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等があげられるが、中でも酢酸リチウム法が特に好ましい。遺伝子導入は、例えばシロイヌナズナのステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子ｃＤＮＡの５’末端と３’末端に設定したプライマー、あるいは酵母のステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子ｃＤＮＡの５’末端と３’末端に設定したプライマーを用い、形質転換処理した二重遺伝子破壊株から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことで確認できる。
【００３１】
かくして得られるｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株にステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入した菌株の例としては、ＫＡΔ５Δ６−４株に、プラスミドｐＡＤ−Δ７を導入したｐＡＤ−Δ７／ ＫＡΔ５Δ６−４株を挙げることができる。このようにして改変された菌株は、（１）ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの活性を低減化することにより、フェコステロールを経てエルゴステロールを合成する流れを止め、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの合成方向へ導き、（２）Δ７−ステロールリダクターゼを高発現化することにより、中間産物であるコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルおよびコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オル等を効率よくデスモステロールまで導き、さらに、（３）ステロールＣ−２２デサチュラーゼの活性を低減化することにより、生成したコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルおよびコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オル、デスモステロール等のステロールの２２位が不飽和化されることを防ぐことができる。
また、かくして得られるｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株にステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子およびステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子を導入した菌株の例としては、ＫＡΔ５Δ６−４株に、プラスミドｐＡＤ−Δ７およびｐＡＵ−ＥＲＧ３を導入したＥ３−４．１株を挙げることができる。このようにして改変された菌株は、（１）ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの活性を低減化することにより、フェコステロールを経てエルゴステロールを合成する流れを止め、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの合成方向へ導き、（２）ステロールΔ５−デサチュラーゼを高発現化することにより、中間産物であるコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルをコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オルへより効率良く変換し、（３）Δ７−ステロールリダクターゼを高発現化することにより、中間産物であるコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルおよびコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オル等を効率よくデスモステロールまで導き、さらに、（４）ステロールＣ−２２デサチュラーゼの活性を低減化することにより、生成したコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルおよびコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オル、デスモステロール等のステロールの２２位が不飽和化されることを防ぐことができる。
【００３２】
ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化し、Δ７−ステロールリダクターゼを高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類、または該真菌類のステロールΔ５−デサチュラーゼを高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類によるチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物の生産は、発酵法によるエルゴステロールの製造に用いられる方法と同様の方法により行うことができる。すなわち、上記生産株を炭素源、窒素源、無機塩、アミノ酸、ビタミンなどを含有する培地中、好気条件下、温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えば、真菌類菌体中にチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物が蓄積するのでこれを採取する。
【００３３】
炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール、フルクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜、などの炭水化物、ピルビン酸、メバロン酸などの各種有機酸が使用できる。さらに真菌類の資化性によって、炭化水素、アルコールなども用いられる。特に廃糖蜜は好適にもちいられる。
【００３４】
窒素源としては、例えばアンモニア、または塩化アンモニウム、炭酸アンモニウムなどの各種無機塩および有機アンモニウム塩類あるいはペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物など種々のものが使用可能である。
無機塩としては、例えばリン酸第一水素カリウム、リン酸水素第二カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどを使用する。ビタミン、アミノ酸としては、使用する真菌類の種類によってことなるが、必要に応じ添加する。また使用する菌株が、栄養要求性を示す場合は、その要求物質を添加する。さらに培地には、チモステロール、あるいは、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル、あるいは、コレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オルを加えて菌株ないしはその処理物に接触させることで、チモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物を蓄積させても良い。
【００３５】
培養は使用する菌株に応じて適切な条件で行うが、通常は、震盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下に行う。生産株として、サッカロミセス・セレビシエを用いる場合は、培養温度は２０〜４０℃が好適であり、培地のｐＨは弱酸性付近に維持する事が望ましい。培養期間は通常１〜５日間で菌体中にチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物が蓄積する。
【００３６】
培養終了後のステロールの抽出は一般に生物組織からステロール類を抽出する方法により行うことができる。具体的には、例えば、菌体を海砂とともにそのままアセトン中で破砕し酢酸エチルで抽出するか、又は、２ＭのＮａＯＨを含む５０％エタノール中で２時間煮沸し鹸化したのちヘプタンないしはクロロホルム／メタノール／水（体積比８６：１６：１）混液で抽出し、薄層クロマトグラフィーにかけステロール画分を掻き取って、窒素気流下で乾燥させメタノール／クロロホルム混液に溶解することで総ステロールを菌体から抽出する。
【００３７】
次いでステロールの種類の同定は、薄層クロマトグラフィーで分離抽出したステロール画分を、それ自体公知の適当な溶媒およびカラムの組み合わせでガスクロマトグラフィーないしは高速液体クロマトグラフィーにかけて、現れるピークの保持時間を標準試料の保持時間と比較することで行うことができる。また、同定された各種ステロールの総ステロール中にしめる割合は各ピークの面積から算出することができる。さらに、これらの主要なステロールのピークが目的化合物であることの確認は、マススペクトロメトリーを用いて、分子量および開裂パターンを調べることで行うことができる。また、ＧＣ−ＭＳあるいはＨＰＬＣ−ＭＳを用いることによりさらに効率よく抽出されたステロール類を同定することができる。
【００３８】
また、本発明の真菌類またはその処理物を、チモステロール、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルまたはコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オルに接触させて、デスモステロールを生成蓄積させることができる。真菌類は培養した菌体をそのまま用いてもよいし、得られた菌体を超音波破砕、フレンチプレス若しくはホモジェナイザー等の機械的破壊法、又はリゾチームを用いた酵素的破壊法等によって処理したものを用いても良い。接触させる際には反応液にグルコース、シュークロース、フルクトース等の炭素源をエネルギー源として添加し、収量が向上する場合はそれらの炭素源を適宜添加することも可能である。その他溶液には界面活性剤、有機物及び無機物等を必要により添加することもできる。
【００３９】
得られたチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物は各種医薬等の中間体となりうる。例えば、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル由来生合成化合物であるデスモステロールは、その側鎖２４（２５）位の二重結合を化学的にあるいは還元酵素によって生物学的に還元することでコレステロールを生産することができる。具体的には、例えば、ヒトでその遺伝子が単離されているステロールΔ２４−リダクターゼ（ＳｔｅｒｏｌΔ２４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）とデスモステロールとを、酵素反応が起こりうる適当な条件下で接触させることにより２４（２５）位の二重結合が還元され、コレステロールが生成する。
【００４０】
すなわち、例えばフォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子あるいはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子などの恒常的プロモーターないしはＧＡＬ１ＧＡＬ１０などの誘導型プロモーターの下流にヒトのステロールΔ２４−リダクターゼをコードする遺伝子（Ｗａｔｅｒｈａｍ， Ｈ．Ｒ．， Ｋｏｓｔｅｒ， Ｊ．， Ｒｏｍｅｉｊｎ， Ｇ．Ｊ．， Ｈｅｎｎｋａｍ， Ｒ．Ｃ．Ｍ．， Ｖｒｅｋｅｎ， Ｐ．， Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｈ．Ｃ．， ＦｉｔｚＰａｔｒｉｃｋ， Ｄ．Ｒ．， Ｋｅｌｌｙ， Ｉ．， ａｎｄ Ｗａｎｄｅｒｓ， Ｒ．Ｊ．（２００１） Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ． ６９， ６８５−６９４）を連結して発現ベクターを作成し、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化しステロールΔ７−リダクターゼを高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類、例えば前記ｐＡＤ−Δ７／ ＫＡΔ５Δ６−４株、あるいはステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化しステロールΔ７−リダクターゼおよびステロールΔ５−デサチュラーゼを高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類、例えば前記Ｅ３−４．１株に遺伝子導入し発現させることでコレステロールを産生する形質転換株を作製することができる。得られた形質転換株はデスモステロールの生産に用いたと同様の方法で培養し、ステロールを抽出することでコレステロールを得ることができる。
【００４１】
また、デスモステロールのような側鎖二重結合を持つステロイドは、この二重結合を利用してＨｇ（ＯＡｃ）２次いでＮａＢＨ４処理することで２５−ヒドロキシステロールに、あるいはＯｓＯ４で酸化するかｅｐｏｘｉｄｅ化後酸処理で２４，２５−ジヒドロキシステロールに誘導できる。ついでＢａｒｔｏｎ法（Ｂａｒｔｏｎ， Ｄ．Ｈ．Ｒ．， Ｈｅｓｓｅ， Ｒ．Ｈ．， Ｐｅｃｈｅｔ， Ｍ．Ｍ．， Ｒｉｚｚａｒｄｏ， Ｅ． （１９７３） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ９５， ２７４８）によりこれらの誘導体の１α位を水酸化し、ＵＶ照射によりＢ環を開環し熱異性化することで、最終的に２５−ヒドロキシビタミンＤ３類、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３類、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール等の活性型ビタミンＤ類に変換することができる（池川信夫、竹下徹、「有機合成化学」、（１９７９）第３７巻、第９号、７５５−７７１頁参照）。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１ サッカロミセス・セレビシエ ＫＡ３１１Ａ 株の ＥＲＧ５ および ＥＲＧ６ 遺伝子の二重遺伝子破壊株の作成
（１）酵母染色体ＤＮＡの調製
サッカロミセス・セレビシエ ＫＡ３１１Ａ株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９０５３）をＹＰＤ液体培地（１％ 酵母エキス、２％ ポリペプトン、２％ グルコース）１０ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養をおこなった。培養液から菌体を集菌し、ＳＴＥＳ緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下「トリス」と略す）、０．００１Ｍ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（以下「ＥＤＴＡ」と略す）、０．１％ ラウリル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５）０．１ｍｌに懸濁後、石英砂を細胞と同体積加えた。サンプルを３０秒間ボルテックスミキサーで撹拌した後、１分間氷上に静置した。この操作を３回繰り返した。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（体積比２５：２４：１）を０．１ｍｌ加えて、同様に３０秒間の撹拌と１分間の氷上静置を２回繰り返した。
微量用遠心機により二層に分離させ、水層を回収した。等容積のクロロホルムを加えて撹拌した後、同様に微量用遠心機により二層に分離させ、水層を回収した。１０分の１容の３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）、２．５倍容の９９％ エタノールを加えてＤＮＡを沈殿回収後、０．０５ｍｌのＴＥ緩衝液（０．０１Ｍ トリス、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解した。
【００４３】
（２）遺伝子破壊用の酵母ＥＲＧ５、ＥＲＧ６遺伝子断片の調製
サッカロミセス・セレビシエ由来ステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ５）を含むＤＮＡ断片、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を含むＤＮＡ断片は、上記（１）で取得したサッカロミセス・セレビシエ ＫＡ３１１Ａ株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにて合成、単離した。以下にその方法の詳細を示す。
【００４４】
ＥＲＧ５遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＥＲＧ５−５Ａ（配列番号１）、リバースプライマーＥＲＧ５−３Ａ（配列番号２）を用いた。このプライマーの組み合わせでＥＲＧ５の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの４塩基前から終始コドンの３塩基後までを増幅することができる。また、５’側に制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、Ｓａｃ Ｉの認識配列を、３’側にＫｐｎ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。
【００４５】
ＥＲＧ６遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＥＲＧ６−５Ｂ（配列番号３）、リバースプライマーＥＲＧ６−３Ｂ（配列番号４）を用いた。このプライマーの組み合わせでＥＲＧ６の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの１１塩基前から終始コドンの１２塩基後までを増幅することができる。また、５’側にに制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉの認識配列を、３’側にＥｃｏＲ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。ＰＣＲはＴａｑ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、▲１▼９４℃、２分、▲２▼９４℃、１分、▲３▼５５℃、２分、▲４▼７２℃、４分、▲２▼から▲４▼の反応を３０回繰り返し、▲５▼７２℃、４分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次に、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．１１ｋｂｐのＥＲＧ５遺伝子断片および約１．２ｋｂｐのＥＲＧ６遺伝子断片を確認した。
【００４６】
（３）遺伝子破壊用組換え体プラスミドｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１、ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３の調製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（東洋紡社製）を制限酵素Ｓａｃ Ｉ（タカラバイオ社製、以下、特に記載のない限り、制限酵素はタカラバイオ社製である）およびＫｐｎ Ｉで切断したものと、ＰＣＲ合成したＥＲＧ５遺伝子断片をＳａｃ ＩおよびＫｐｎ Ｉで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’（インビトロジェン社製）に形質転換し、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％ 寒天、０．００５Ｎ ＮａＯＨ）上に生育したコロニーからアルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｓａｃ ＩおよびＫｐｎ Ｉによる切断で約２．９ｋｂｐと１．１ｋｂｐの断片が確認でき、且つＰｓｔ ＩおよびＳｃａ Ｉによる切断で約２．５７ｋｂｐと１．３２ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、ｐＳＫ−ＥＲＧ５と名付けた。
【００４７】
次に、ｐＳＫ−ＥＲＧ５をＢｇｌ ＩＩおよびＨｉｎｃ ＩＩで切断し、ＥＲＧ５遺伝子の内部３７１ｂｐを欠失させた。この欠失部分に、プラスミドｐＳＫ−ＴＲＰ１をＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｃＩＩで切断して得た約０．９１ｋｂｐの酵母トリプトファン合成系の遺伝子であるＴＲＰ１遺伝子断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により和合連結させた。なお、ｐＳＫ−ＴＲＰ１は、ＴＲＰ１遺伝子を含むプラスミドｐＪＪ２８１（Ｊｏｎｅｓ， Ｓ． ａｎｄ Ｐｒａｋａｓｈ，Ｌ． （１９９０） Ｙｅａｓｔ ６， ３６３−３６６の記載に準じて調製）をＳａｃ ＩおよびＢｇｌ ＩＩで切断して得た約０．８７ｋｂｐのＴＲＰ１遺伝子断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋をＳａｃ ＩおよびＢａｍＨＩで切断したものと和合連結させたプラスミドである。
ｐＳＫ−ＥＲＧ５とＴＲＰ１遺伝子断片との和合連結物を上記と同様にエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出をおこなった。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉによる切断で約３．６８ｋｂｐと０．８６ｋｂｐの断片が確認でき、且つＳａｃ ＩおよびＫｐｎ Ｉによる切断で約２．９ｋｂｐと１．６３ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、ｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１と名付けた（図３）。
【００４８】
ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３に関しても、ｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１の作成と同様に、まずｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）をＰｓｔ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉで切断したものと、ＰＣＲ合成したＥＲＧ６遺伝子断片をＰｓｔ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。連結物をエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出をおこなった。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｐｓｔ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉによる切断で約２．６６ｋｂｐと１．２ｋｂｐの断片が確認でき、且つＳｃａ Ｉによる切断で約１．８ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、ｐＵＣ−ＥＲＧ６Ｂと名付けた。
【００４９】
次に、ｐＵＣ−ＥＲＧ６ＢをＮｓｐＶ（東洋紡社製）およびＸｂａ Ｉで切断し、ＥＲＧ６遺伝子の内部４７３ｂｐを欠失させた。この欠失部分に、ｐＵＣ１８−ＨＩＳ３から酵母ヒスチジン合成系の遺伝子であるＨＩＳ３遺伝子断片をＣｌａ ＩおよびＸｂａ Ｉで切断して得た約１．５３ｋｂｐのＤＮＡ断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により和合連結させた。
【００５０】
なお、ｐＵＣ１８−ＨＩＳ３は以下の方法で作成した。プラスミドｐＹｅｈｉｓ２（Ｋａｓｕｎｉｃ， Ｄ．Ａ． ａｎｄ Ｋｕｓｈｎｅｒ， Ｓ． Ｒ． （１９８０） Ｇｅｎｅ １２， １−１０の記載に準じて調製）を鋳型として、フォワードプライマーＨＩＳ３−５Ｂ（配列番号５）、リバースプライマーＨＩＳ３−３Ａ（配列番号６）を用いてＰＣＲによるＨＩＳ３遺伝子合成をおこなった。このプライマーの組み合わせでＨＩＳ３の蛋白質コード領域とプロモーター、ターミネーター領域を含む配列を増幅することができる。具体的には、プロモーター領域として蛋白質コード領域の４７０ｂｐ上流から、ターミネーター領域として蛋白質コード領域の３９０ｂｐ下流を含む配列である。また、５’側に制限酵素ＢａｍＨ Ｉの認識配列を、３’側にＥｃｏＲ Ｉ、Ｃｌａ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。ＨＩＳ３遺伝子のＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、上記（２）と同じ温度条件で反応をおこなった。
【００５１】
ＰＣＲ合成したＨＩＳ３遺伝子断片をＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで切断したものと、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）をＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結し、上記と同様にエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出をおこなった。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨ Ｉによる切断で約２．６６ｋｂｐと１．５３ｋｂｐの断片が確認でき、且つＰｓｔ Ｉによる切断で約２．９９ｋｂｐと１．２０ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとした。
【００５２】
ｐＵＣ−ＥＲＧ６ＢとＨＩＳ３遺伝子断片との和合連結物を上記と同様にエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出をおこなった。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｐｓｔ Ｉによる切断で約３．９６ｋｂｐと０．９３ｋｂｐの断片が確認でき、且つＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉによる切断で約２．８１ｋｂｐと１．１２ｋｂｐと０．７７ｋｂｐと０．１９ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３と名付けた（図３）。
【００５３】
（４）遺伝子破壊用断片ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１の導入によるＥＲＧ５遺伝子破壊株ＫＡΔ５−５株の作成
上記（３）で作成したプラスミドｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１をＳａｃ ＩおよびＫｐｎ Ｉで切断し、アガロースゲルから約１．６３ｋｂｐのＤＮＡ断片（ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１）をＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ ＩＩ ＫＩＴ（フナコシ社製）により抽出した。このＤＮＡ断片をサッカロミセス・セレビシエＫＡ３１１Ａ株（ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）に酢酸リチウム法（Ｉｔｏ， Ｈ．， Ｆｕｋｕｄａ，Ｙ．， Ｍｕｒａｔａ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｉｍｕｒａ， Ａ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３（１）， １６３−１６８）で形質転換し、各２０ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、ウラシルを含むＳＤ寒天培地（０．１７％ ＹＥＡＳＴ ＮＩＴＲＯＧＥＮ ＢＡＳＥ ｗ／ｏ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ（ＤＩＦＣＯ社製）、２％ グルコース、２％ 寒天）に播き、３０℃で３日から５日間培養した。
【００５４】
寒天培地上で生育してきたトリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％ 酵母エキス、２％ ポリペプトン、２％ グルコース）５ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養をおこなった。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＥＲＧ５−５ＡとリバースプライマーＥＲＧ５−３Ａの組み合わせでＰＣＲを行い、ＥＲＧ５遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件でおこなった。比較対照として、ＫＡ３１１Ａ株の染色体ＤＮＡ、プラスミドｐＳＫ−ＥＲＧ５、ｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１を鋳型にして、同様にＰＣＲをおこなった。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＫＡΔ５−５と名付けた形質転換体はｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１と同じ約１．６３ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された（図４参照）。従って、ＫＡΔ５−５株は相同組換えによりＥＲＧ５遺伝子が破壊されたことが確認できた。
【００５５】
（５）ＫＡΔ５−５株への遺伝子破壊用断片ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３の導入による二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−１， ＫＡΔ５Δ６−４， ＫＡΔ５Δ６−５株の作成
上記（３）で作成したプラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３をＳｃａ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉで切断し、アガロースゲルから約２．０９ｋｂｐのＤＮＡ断片（ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３）をＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ ＩＩ ＫＩＴ（フナコシ社製）により抽出した。このＤＮＡ断片を上記（４）で作成したＫＡΔ５−５株に酢酸リチウム法（Ｉｔｏ， Ｈ．， Ｆｕｋｕｄａ， Ｙ．， Ｍｕｒａｔａ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｉｍｕｒａ， Ａ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３（１）， １６３−１６８）で形質転換し、各２０ｍｇ／ｍｌのＬ−ロイシン、ウラシルを含むＳＤ寒天培地に播き、３０℃で５日から７日間培養した。
【００５６】
寒天培地上で生育してきたヒスチジンおよびトリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％ 酵母エキス、２％ ポリペプトン、２％ グルコース）５ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養をおこない、上記（４）と同様に染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＥＲＧ６−５ＢとリバースプライマーＥＲＧ６−３Ｂの組み合わせでＰＣＲを行い、ＥＲＧ６遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件でおこなった。比較対照として、ＫＡ３１１Ａ株、ＫＡΔ５−５株の染色体ＤＮＡ、プラスミドｐＵＣ−ＥＲＧ６、ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３を鋳型にして、同様にＰＣＲをおこなった。
【００５７】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＫＡΔ５Δ６−１、ＫＡΔ５Δ６−４、ＫＡΔ５Δ６−５と名付けた形質転換体はｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３と同じ約２．２３ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された（図４参照）。従って、ＫＡΔ５Δ６−１、ＫＡΔ５Δ６−４、ＫＡΔ５Δ６−５株は相同組換えによりＥＲＧ６遺伝子が破壊されたことが確認できた。
【００５８】
実施例２ ｅｒｇ５ ｅｒｇ６ 二重変異株へのシロイヌナズナ由来ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子の導入
（１）シロイヌナズナ全ＲＮＡからのステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子ｃＤＮＡの調製
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ， ｃｖ， Ｃｏｌｕｍｂｉａ）をパーライトとバーミキュライトの１：１混合土上で発芽させ、２３℃、短日条件で弱光下４週間生育させ、花芽を形成させた。この植物体全体を取り、フェノール／ＳＤＳとＬｉＣｌを用いる方法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ， Ｊ．Ｍ．， Ｐｒｚｙｂｙｌａ， Ａ．Ｅ．， ＭａｃＤｏｎａｌｄ， Ｒ．Ｊ． （１９７９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８， ５２９４−５２９９）で全ＲＮＡを抽出した。
【００５９】
次いで、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用い、３’側プライマーとしては４５塩基からなる合成オリゴマー（配列番号７）を用いてＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。このＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型として、５’側プライマーとしては５７塩基からなる合成オリゴマー（配列番号８）を、３’側プライマーとしては前述の４５塩基からなる合成オリゴマーを用い、開始コドンから終止コドンまでを含み５’端に制限酵素Ｎｏｔ Ｉサイトを、３’端に制限酵素ＥｃｏＲ Ｉサイトを持つ二重鎖ｃＤＮＡ断片Δ７−１を合成した。Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ合成反応の溶液組成および反応条件は全てｃＤＮＡ合成キットのプロトコルに従って行った。二重鎖合成反応に関しては、反応液組成はｃＤＮＡ合成キットのプロトコルに従い、ＰＣＲ反応は最初に９４℃で１分反応させたあと、９４℃３０秒、６０℃２分、７２℃２分のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分反応させることで行った。
【００６０】
（２）ステロールΔ７−リダクターゼｃＤＮＡを含む酵母用発現ベクターｐＡＤ−Δ７の調製
ＰＣＲ合成したステロールΔ７−リダクターゼｃＤＮＡ断片Δ７−１をＴＡクローニングキット ｗｉｔｈ ＩＮＶαＦ’ Ｅ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン社製）を用いてクローン化し、プラスミドｐＣＲ−Δ７を作成した。
【００６１】
ｐＣＲ−Δ７をＮｏｔ Ｉで切断後、ＥｃｏＲ Ｉによる部分切断をおこない、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。酵母導入用ベクターには、酵母用マーカー遺伝子としてロイシン合成系のＬＥＵ２遺伝子、大腸菌用マーカー遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子を含み、外来遺伝子を酵母細胞内で構成的に発現させるためのアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（ＡＤＨ１）のプロモーター、ターミネーター領域を含む２μｍベクターｐＡＤＮＳ（Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ， Ｊ．， Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ， Ｃ．， Ｍｉｃｈａｅｌｉ， Ｔ．， Ｏ’Ｎｅｉｌｌ， Ｋ．， Ｒｉｇｇｓ， Ｍ． ａｎｄ Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６（１０）， ３５９９−３６０３の記載に準じて調製）を改変したｐＡＤＮＳΔＥ （Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｍ． ａｎｄ Ｎｉｋａｗａ， Ｊ． （２００１） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８３（１７）， ４９８５−４９９３の記載に準じて調製） を用いた。
【００６２】
ｐＡＤＮＳΔＥをＮｏｔ Ｉ およびＥｃｏＲ Ｉで切断したものと、上記１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片とをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結し、上記と同様にエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出をおこなった。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉによる切断で約８．８ ｋｂｐと０．４３ｋｂｐの断片が確認でき、且つＣｌａ Ｉによる切断で約５．４ ｋｂｐと３．９ ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、このプラスミドをｐＡＤ−Δ７と名付けた（図４）。
【００６３】
（３）二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−４へのプラスミドｐＡＤ−Δ７の導入
上記（２）で作成したプラスミドｐＡＤ−Δ７を実施例１で作成したＫＡΔ５Δ６−４株に酢酸リチウム法（Ｉｔｏ， Ｈ．， Ｆｕｋｕｄａ， Ｙ．， Ｍｕｒａｔａ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｉｍｕｒａ， Ａ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３（１）， １６３−１６８）で形質転換し、２０ｍｇ／ｍｌのウラシルを含むＳＤ寒天培地に播き、３０℃で３日から５日間培養した。プラスミドが確実に導入されていることを調べるために、生育してきたコロニーを再度２０ｍｇ／ｍｌのウラシルを含むＳＤ寒天培地に移し、ロイシン非要求性を確認し、プラスミドｐＡＤ−Δ７が導入された二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−４（ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４）を得た。
【００６４】
実施例３ 親株、二重遺伝子破壊株、遺伝子導入株の ＹＰＤ 培地における増殖速度の比較
親株（ＫＡ３１１Ａ株）、二重遺伝子破壊株（ＫＡΔ５Δ６−４株）、遺伝子導入株（ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株）の増殖を比較するために、各株をＳＤ培地で２日間前培養を行い、ＹＰＤ液体培地にＯＤ６００が約０．３になるよう植菌した。３０℃で培養を行い、培養開始６時間までは２時間毎に、６時間から１２時間までは１．５時間毎に、その後は２４時間、３０時間、３６時間、４８時間後に、分光光度計（ＵＶ−１６００， 島津）でＯＤ６００値を測定した。図４に示すように、二重遺伝子破壊株は親株よりも増殖が劣っていたが、シロイヌナズナ由来ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入した組換え酵母は親株と同程度に増殖することが確認できた（図５）。
【００６５】
以上の結果より、ＥＲＧ５、ＥＲＧ６遺伝子の二重破壊により二重遺伝子破壊株は若干の生育の低下が認められたものの死には至らないことから、遺伝子破壊を起因とするステロール組成の変化、即ち、細胞中に含まれる主ステロールがエルゴステロールからコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルに変わることによる酵母の生育への影響は比較的小さいものと推定された。さらに、同二重遺伝子破壊株にステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入することにより生育の低下が回復することが明らかになった。
【００６６】
実施例４ 親株、二重遺伝子破壊株、遺伝子導入株の生産するステロール類の 分析
ｅｒｇ５ ｅｒｇ６遺伝子二重破壊株（ＫＡΔ５Δ６−４株）、およびステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入した二重遺伝子破壊株（ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株）をあらかじめＳＤ培地で２日培養し、種菌を作成したのち、ＹＰＤ液体培地に全量接種して３０℃で２日培養した。酵母培養液を４℃、３０００ｒｐｍで遠心分離し、１０〜１３ｇの酵母菌体を回収した。酵母菌体の２〜３倍量（２０〜４０ｍｌ）の７０％アセトン水溶液を加えて海砂とともに乳鉢中で磨砕した。磨砕液を３重のミラクロスで濾過したのち、ミラクロス上の固形物に再度７０％アセトン水溶液を加えてよく混ぜ３０分間超音波をかけ再度濾過して、最初の濾液と一緒にした。この濾液を室温で減圧濃縮機にかけて液量が１ｍｌ位になるまでアセトンを飛ばした。
【００６７】
この試料に酢酸エチルを加え脂質を再抽出し、濃縮した後、ヘキサン−ジエチルエーテル−酢酸（体積比８０：２０：１）の溶媒系を用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィーにかけ、ローダミン６Ｇや２’，７’−ジクロロフルオロセインなどで発色させた。発色程度を指標としてステロール画分を掻き取り、クロロホルム：メタノール：エーテル（体積比１：１：１）溶出溶媒で抽出し、０．５ｍｇをガスクロマトグラフィーあるいは、ＧＣ／ＭＳにかけステロールの分析を行った。
【００６８】
標準試料としては、デスモステロール、および、エルゴステロールを用いて、その保持時間とサンプルのクロマトグラムに現れるピークの保持時間を比較したところ、二重破壊株酵母からの抽出サンプルでは、図６ａに示すとおりコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの保持時間と考えられる位置に主ピークが現れた。また、デスモステロールの保持時間と一致する位置にもピークが現れた。
【００６９】
さらにＧＣ／ＭＳ分析の結果、すなわち分子量および開裂パターンから、組換え酵母の主ステロールは確かにデスモステロールであることが確認できた（図７ａ）。さらに、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルと考えられたピークに関しても、ＧＣ／ＭＳ分析の結果から、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルであることが明らかになった（図７ｂ）。
【００７０】
これらのピークの面積計算をおこなったところ、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルは全ステロールの６０％、デスモステロールは全ステロールの１０％を占めていることがわかった。このことより、酵母のＥＲＧ５、ＥＲＧ６遺伝子の二重破壊により、酵母におけるエルゴステロール方向への合成を停止させ、チモステロールからコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル合成の方向にステロールの代謝経路を変えることが可能であることが明らかになった。
【００７１】
一方、ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入した二重破壊株からの抽出サンプルでは、図６ｂに示すとおりデスモステロールの保持時間と一致する位置に主ピークが現れた。また、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの保持時間と考えられる位置にもピークが現れた。これらのピークの面積計算をおこなったところ、デスモステロールは全ステロールの７１％、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルは全ステロールの２０％を占めていることがわかった。このことより、二重遺伝子破壊株へのステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子の導入により、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの大部分が、デスモステロールに変換されることが明らかになった。
【００７２】
実施例５ ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入した ｅｒｇ５ ｅｒｇ６ 二重遺伝子破壊株へのステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子の導入
（１）酵母染色体ＤＮＡからのステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子の断片の調製
ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入したＥＲＧ５ ＥＲＧ６二重遺伝子破壊株ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株中に存在する約２０％のコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルを全てデスモステロールに変換させる目的で、ステロールΔ５−デサチュラーゼを過剰発現させるために、サッカロミセス・セレビシエ由来ステロールΔ５−デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ３）を含む遺伝子断片をＰＣＲにより合成、単離した。
鋳型ＤＮＡとして実施例１（１）で取得したＫＡ３１１Ａ株の染色体ＤＮＡを用い、フォワードプライマーＥＲＧ３−５Ａ（配列番号９）、リバースプライマーＥＲＧ３−３Ａ（配列番号１０）により、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、実施例１（２）の反応条件でＰＣＲを行った。これら２つのプライマーにより、ＥＲＧ３遺伝子の開始コドンから終始コドンまでを含む１０９８ｂｐを増幅することができる。また、５’側に制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩの認識配列を、３’側にＮｏｔ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。ＥＲＧ３遺伝子断片合成の確認は、アガロースゲル電気泳動で行った。
【００７３】
（２）ステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子過剰発現ベクターｐＡＵ−ＥＲＧ３の調製
ＰＣＲ合成したＥＲＧ３遺伝子断片をＴＡクローニングキット ｗｉｔｈ ＩＮＶαＦ’ Ｅ． ｃｏｌｉ（インビトロジェン社製）を用いてクローン化し、プラスミドｐＣＲ−ＥＲＧ３を作成した。
酵母用ベクターとして、酵母用マーカー遺伝子にウラシル合成系のＵＲＡ３遺伝子を、大腸菌用マーカー遺伝子にアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＡＤ−ＵＲＡを用いた。このベクターは、多コピー型酵母−大腸菌シャトルベクターｐＲＳ４２６ （Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ， Ｔ． Ｗ．， Ｓｉｋｏｒｓｋｉ， Ｒ． Ｓ．， Ｄａｎｔｅ， Ｍ．， Ｓｈｅｒｏ， Ｊ． Ｈ． ａｎｄ Ｈｉｅｔｅｒ， Ｐ． （１９９２） Ｇｅｎｅ １１０（１）， １１９−１２２）をＳａｃ ＩとＫｐｎ Ｉで切断したのち、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）で平滑化した部分に、ｐＡＤＮＳΔＥのＡＤＨ１プロモーター／マルチクローニングサイト／ＡＤＨ１ターミネーターをＢａｍＨ Ｉで切断しＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）で平滑化した約２ｋｂｐの断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）で連結して作成したものである。
ｐＣＲ−ＥＲＧ３をＨｉｎｄ ＩＩＩで切断して得た約１．１７ｋｂｐの断片と、ｐＡＤ−ＵＲＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断した後Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）で処理したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）で連結し、上記と同様にエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出を行った。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる切断で約１．１７ｋｂｐと７．６６ｋｂｐの断片が確認でき、且つＰｓｔ Ｉによる切断で約４．１８ｋｂｐと４．６６ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、これをｐＡＵ−ＥＲＧ３と名付けた（図８）。
【００７４】
（３）プラスミドｐＡＤ−Δ７を導入したｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株（ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株）へのプラスミドｐＡＵ−ＥＲＧ３の導入
上記（２）で作成したプラスミドｐＡＵ−ＥＲＧ３を実施例２で作成したｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株に酢酸リチウム法（Ｉｔｏ， Ｈ．， Ｆｕｋｕｄａ， Ｙ．， Ｍｕｒａｔａ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｉｍｕｒａ， Ａ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３（１）， １６３−１６８）で形質転換し、ＳＤ寒天培地に播き、３０℃で３日から５日間培養した。プラスミドが確実に導入されていることを調べるために、生育してきたコロニーを再度ＳＤ寒天培地に移し、ウラシル非要求性を確認し、プラスミドｐＡＤ−Δ７およびｐＡＵ−ＥＲＧ３が導入されたｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株Ｅ３−４．１（ｐＡＤ−Δ７， ｐＡＵ−ＥＲＧ３／ＫＡΔ５Δ６−４）を得た。
【００７５】
実施例６ ステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子過剰発現株 Ｅ３−４．１ の生産するステロール類の分析
実施例４と同様に、ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子およびステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子が過剰発現されたｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株Ｅ３−４．１（ｐＡＤ−Δ７， ｐＡＵ−ＥＲＧ３／ＫＡΔ５Δ６−４）を培養し、約１０ｇの酵母菌体を回収した。菌体の２〜３倍量（２０〜３０ｍｌ）のクロロホルムを加えて海砂とともに乳鉢中で磨砕した。磨砕液を１０分間超音波にかけたのち、デカンテーションによりクロロホルム層を回収し、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。
この試料を０．５ｍｌのクロロホルムに溶解し、ヘキサン−ジエチルエーテル−酢酸（体積比８０：２６：１）の溶媒系を用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィーをおこない、リンモリブデン酸で発色させた。ステロール画分を掻き取り、２−３ｍｌのアセトンで溶出し、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。１ｍｌのクロロホルムに再溶解したのち、含まれるシリカゲル等を除くため、試料をメンブレンフィルターで濾過した。さらに窒素ガス充填により溶媒を除去し、０．０２ｍｌのアセトンに溶解し、その十分の一量をガスクロマトグラフィー（ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＣＧ−１４Ｂ、島津製作所製）にかけステロールの分析をおこなった。
標準試料としては、デスモステロール、エルゴステロール、コレステロール、および化学合成したコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルを用いて、その保持時間とサンプルのクロマトグラムに現れるピークの保持時間を比較した。その結果、図９ｃに示すとおりデスモステロールの保持時間と一致する位置に主ピークが現れたが、図９ｂのｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株で見られたコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの保持時間と考えられる位置のピークはほとんど消失していた。図９ｃ中のピークの面積計算をおこなったところ、デスモステロールは全ステロールの９０％を占めていることがわかった。このことより、ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入したｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株に更にステロールΔ５−デサチュラーゼ（ＥＲＧ３）遺伝子を過剰発現させることにより、変換されずに残っていたコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルがほとんど全てデスモステロールに変換されたことが明らかになった。
【００７６】
【配列表】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明により真菌類で生産されるステロール類の化学構造を示す図である。
【図２】代謝工学的に改変された酵母によるデスモステロールの生合成経路を示す図である。
【図３】本発明に用いたプラスミドベクターｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１、ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３及びｐＡＤ−Δ７の構成を示す図である。
【図４】サッカロミセス・セレビシエ染色体上のＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子の遺伝子破壊の結果を示す電気泳動写真である。図中、レーン１はｐＳＫ−ＥＲＧ５、２はｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１、３は親株ＫＡ３１１Ａ、４はＫＡΔ５−５、５は二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−１、６は二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−４、７は二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−５、８はｐＵＣ−ＥＲＧ６、９はｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３、１１はＫＡΔ５−５、１２は二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−１、１３は二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−４、１４は二重遺伝子破壊株 ＫＡΔ５Δ６−５を示す。
【図５】サッカロミセス・セレビシエの親株、遺伝子破壊株、遺伝子導入株のＹＰＤ培地における増殖速度の比較を示す図である。図中、「ＫＡ３１１Ａ」は親株、「Ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ」はｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株（ＫＡΔ５Δ６−４）、「Δ７−ｒｅｄ」はシロイヌナズナ由来ステロール Δ７−リダクターゼ遺伝子を導入したｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株（ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４）を示す。
【図６】ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。図中、ａ）はＫＡΔ５Δ６−４株の生産するステロール類の分析結果を示し、ｂ）はｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株の生産するステロール類の分析結果を示す。
【図７】ＭＳスペクトルによるステロール類生産の検出結果を示す図である。図中、ａ）はデスモステロールに相当するピークのＭＳスペクトルを示し、ｂ）はコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルに相当するピークのＭＳスペクトルを示す。
【図８】本発明に用いたプラスミドベクターｐＡＵ−ＥＲＧ３の構成を示す図である。
【図９】ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。図中、ａ）はＫＡΔ５Δ６−４株の生産するステロール類の分析結果を示し、ｂ）はｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株の生産するステロール類の分析結果を示し、ｃ）はＥ３−４．１株（ｐＡＤ−Δ７， ｐＡＵ−ＥＲＧ３／ＫＡΔ５Δ６−４）の生産するステロール類の分析結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬、食品工業において有用なステロール類を製造する真菌類およびそれを用いたステロール類の製造法に関し、更に詳しくは、酵母、カビ等の真菌類を用いて、培養液からチモステロール、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物を製造する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ステロール類は動物、植物、真菌類に含まれている生命活動に必須の物質であり、細胞膜に遊離型ステロール（Ｆｒｅｅ ｓｔｅｒｏｌ）の状態で含まれるほか、一部は脂肪酸とのエステル型（Ｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒ）として貯蔵される。酵母、カビ等の真菌類ではエルゴステロール（ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ）が主ステロールとなっているが、エルゴステロールは紫外線を照射することによりビタミンＤ３に変換されるので、医薬品の原料として産業上利用することができる。
【０００３】
植物ではシトステロール（ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ）、カンペステロール（ｃａｍｐｅｓｔｅｒｏｌ）、スチグマステロール（ｓｔｉｇｍａｓｔｅｒｏｌ）が主ステロールであるが、これら植物由来ステロール類には抗肥満効果があることが明らかになっており、すでに食用油脂に添加して食品産業に利用されはじめている。さらに特定の植物においては、多くの種類のステロール類が配糖体として存在し、植物体ごと生薬として、あるいは抽出物が生薬成分として利用されている。
【０００４】
一方、動物ではコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）が主ステロールであるが、コレステロールは化粧品のベースオイルとして利用されるほか、誘導体のコール酸（ｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、デオキシコール酸は界面活性剤として利用される。さらにデオキシコール酸の異性体であるウルソデオキシコール酸は医薬品として利用されている。またコレステロールから誘導される各種ステロイドホルモンも、医薬品として利用されている。このように、ステロール類には多岐にわたる用途があり、産業上極めて有用な物質である。
【０００５】
産業上用途が広いステロールであるコレステロールおよびその類縁体の製造には、現在動物組織の抽出物を原料とし用いているが、より安価で安定的に供給可能な代替原料の製造法の開発が求められている。
真菌類のエルゴステロールや植物のシトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなどは、その側鎖の２４位にメチル基ないしはエチル基があり、さらに真菌類のエルゴステロールは母核のＢ環の５位および７位にそれぞれ１つ、側鎖２２位に１つの二重結合を持ち、動物由来のステロールとは物性が大きく異なっている。これらの理由から真菌類のエルゴステロールは、そのままではコレステロール類縁体・誘導体原料を代替することはできない。
【０００６】
動物原料の代替ステロールを真菌類で効率的に生産するためには、少なくとも（１）母核の二重結合は５位の１つのみで（図１母核１）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロール、（２）母核の二重結合は７位の１つのみで（図１母核２）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロール、又は（３）母核の二重結合は５位および７位の２つで（図１母核３）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロールが主ステロールとなるように蓄積させることが必要である。
【０００７】
酵母、カビ等の真菌類においては、生合成酵素欠損株あるいは生合成酵素遺伝子の過剰発現によりステロール組成を変えた研究例は知られていた。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシエでステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を欠損させることにより、側鎖２４位にメチル基を持たないステロールのみが蓄積するようにした例（Ｘｕ， Ｓ．， ａｎｄ Ｎｅｓ， Ｗ． Ｄ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８１， ５０９−５１７）、また酵母でステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ５）を欠損させアラビドプシスのΔ７−ステロールリダクターゼを高発現するように代謝工学的に改変し、エルゴスタ−５，２４−ジエノール、エルゴスタ−５−エネノール、エルゴスタ−５，２２−ジエノールが蓄積するようにした例はあった（Ｌｅｃａｉｎ， Ｅ．， Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ， Ｘ．， Ｓｐａｇｎｏｌｉ， Ｒ．， ａｎｄ Ｐｏｍｐｏｎ， Ｄ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（１８）， １０８６６−１０８７３）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、真菌類を用いて、産業上有用な、（１）母核の二重結合は５位の１つのみで（図１母核１）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロール、（２）母核の二重結合は７位の１つのみで（図１母核２）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロール、又は（３）母核の二重結合は５位および７位の２つで（図１母核３）、側鎖の２２位に二重結合がなく２４位にはメチル基もエチル基もない（図１側鎖ＡもしくはＢ）ステロールが主ステロールとして生成されるように改変された例はこれまでなく、培養の容易な酵母、カビ等の真菌類微生物を用いた新規な製造菌株および該菌株を用いた上記ステロール類の製造法の開発が望まれていた。
【０００９】
本発明は、従来コレステロール類縁体や誘導体の原料にはなり得なかった真菌類由来のステロール類を、代謝工学的手法を用いて改変した微生物を用いて、産業上有用なステロール類、すなわちチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルもしくはその由来生合成化合物を製造する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、真菌類を用いた産業上有用なステロール類、すなわちチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルもしくはその由来生合成化合物を製造する方法において、代謝工学的手法により真菌類の菌株の改変を鋭意検討した結果、真菌類のステロールＣ−２２デサチュラーゼ（Ｃ−２２ ｓｔｅｒｏｌ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）（ＥＣ１．１４．１４．−）、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼ（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：Δ２４−ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ＥＣ２．１．１．４１）の両方の活性を低減化し、ステロールΔ７−リダクターゼ（ｓｔｅｒｏｌΔ７−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＥＣ１．３．１．２１）が高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類（酵母、カビ）、または該真菌類のステロールΔ５−デサチュラーゼ（ｓｔｅｒｏｌΔ５−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）が高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類を培養することにより、チモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物を効率的に生産することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明により、ステロールＣ−２２デサチュラーゼおよびステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化するように代謝工学的に改変されていることを特徴とする真菌類、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの活性を低減化し、ステロールΔ７−リダクターゼを高発現するように代謝工学的に改変されていることを特徴とする真菌類、ステロールＣ−２２デサチュラーゼおよびステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化し、かつステロールΔ７−リダクターゼを高発現化するように代謝工学的に改変されていることを特徴とする真菌類、および、上記いずれかの真菌類のステロールΔ５−デサチュラーゼを高発現化するように代謝工学的に改変されていることを特徴とする真菌類が提供される。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の真菌類を培養し、培養物からチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物を採取することを特徴とするチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物（図１で側鎖Ｂの場合）の製造方法、および、上記した本発明の真菌類またはその処理物を、チモステロール、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルまたはコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オルに接触させて、デスモステロールを生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするデスモステロールの製造方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の製造方法で得られたステロール類を、ステロールΔ２４−リダクターゼに接触させることによりステロール類の２４（２５）位の二重結合を還元することを特徴とする、ステロール類（図１で側鎖Ａの場合）の製造方法、および、上記した本発明の製造方法で得られたステロール類の側鎖二重結合を水酸化することにより２５−ヒドロキシステロール、又は、２４，２５−ジヒドロキシステロールの製造方法、および、該誘導体の１α位を水酸化し、Ｂ環を開環し、最終的に２５−ヒドロキシビタミンＤ３類、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３類、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール等の活性型ビタミンＤ類に変換することを特徴とする、活性型ビタミンＤ類の製造方法が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明はステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化し、ステロールΔ７−リダクターゼを高発現するように代謝工学的に改変（図２参照）された真菌類（酵母、カビ）、または該真菌類のステロールΔ５−デサチュラーゼを高発現するように代謝工学的に改変された真菌類を培養し、培養物からチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物を採取することを特徴とするチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物の製造方法を提供する。
【００１５】
コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル由来生合成化合物とは、真菌類生物内でコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルから生合成可能な化合物のことであり、具体的には、コレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オル、デスモステロール、あるいは、コレステロール等が挙げられる。
宿主微生物として用いる真菌類としては、中間体としてチモステロールを経由しエルゴステロールを主ステロールとして生産する（図２参照）真菌類であればいかなる真菌類でも良い。とりわけ、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、または、トルロプシス属、または、ピキア属に属する酵母であることが好ましく、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、デバリオマイセス・ニルソニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｎｉｌｓｓｏｎｉｉ）、トルロプシス・コリキュロサ（Ｔｏｌｕｌｏｐｓｉｓ ｃｏｌｌｉｃｕｌｏｓａ）、ピキア・ファリノサ（Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ）が挙げられる（Ｋａｎｅｋｏ，Ｈ．ら（１９７６） Ｌｉｐｉｄｓ １１（１２）、８３７−８４４）。
【００１６】
これらの中で、代謝工学的手法が用いやすいことからサッカロミセス属が好適である。さらに、サッカロミセス属は、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３などの栄養要求性の遺伝型であることが望ましく、例えば、サッカロミセス・セレビシエ ＫＡ３１１Ａ株（ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）（Ｉｒｉｅ， Ｋ．， Ｔａｋａｓｅ， Ｍ．， Ｌｅｅ， Ｋ． Ｓ．， Ｌｅｖｉｎ， Ｄ． Ｅ．， Ａｒａｋｉ， Ｈ．， Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， Ｋ．， ａｎｄ Ｏｓｈｉｍａ， Ｙ． （１９９３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３， ３０７−３０８３）やサッカロミセス・セレビシエ ＹＰＨ５００株 （ＭＡＴα ａｄｅ２ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｌｙｓ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を挙げることができる。
尚、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＫＡ３１１Ａ株（ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）は、独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９０５３として寄託されている。
【００１７】
本発明においてステロールＣ−２２デサチュラーゼは、各種ステロール類の側鎖の２２（２３）位に二重結合を導入する能力を有する酵素であり、具体的には、例えばコレスタ−５，７，２４−トリエノールをコレスタ−５，７，２２，２４−テトラエノールに、エルゴスタ−５，７−ジエノールをエルゴスタ−５，７，２２−トリエノールに、エルゴスタ−５，２４（２５）−ジエノールをエルゴスタ−５，２２，２４（２５）−トリエノールに、エルゴスタ−５，７，２４（２５）−トリエノールをエルゴスタ−５，７，２２，２４（２５）−テトラエノールに変換する能力を有する酵素を指す。
【００１８】
また、本発明におけるステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼは、Ｓ−アデノシルメチオニンから各種ステロール類の２４位にメチル基を転移させる能力、さらには転移により付加されたメチル基にさらにメチル基を転移させる能力を有する酵素であり、具体的には、例えばチモステロールをフェコステロールに変換する能力を有する酵素を指す。
【００１９】
また、これら酵素をコードする遺伝子は、既に単離され塩基配列が決定されているものもあり、例えば、ステロールＣ−２２デサチュラーゼとしては、サッカロミセス・セレビシエ由来の遺伝子が報告されており（Ｖｅｎｋａｔｒａｍｅｓｈ， Ｍ．， Ｇｕｏ，Ｄ．， Ｊｉａ， Ｚ．， Ｎｅｓ， Ｗ．Ｄ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２９９， ３１３−３２４）、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼとしては、サッカロミセス・セレビシエ由来の遺伝子が報告されている（Ｓｋａｇｇｓ， Ｂ．Ａ．， Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｊ．Ｆ．， Ｐｉｅｒｓｏｎ， Ｃ．Ａ．， Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ， Ｋ．Ｓ．， Ｃｈｕｎ， Ｋ．Ｔ．， Ｋｏｅｇｅｌ， Ｃ．， Ｂａｒｂｕｃｈ， Ｒ．， ａｎｄ Ｂａｒｄ， Ｍ． （１９９６） Ｇｅｎｅ １６９， １０５−１０９）。
【００２０】
ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性低減化方法としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの化学物質あるいはＵＶなどの変異源処理によって得られた両酵素遺伝子の欠損突然変異株を交配する方法、両遺伝子の転写をアンチセンス遺伝子の導入によりおさえる方法、両遺伝子の転写産物をＲＮＡｉ技術によって抑制する方法、両酵素の特異的阻害剤で酵素活性を抑える方法などを用いることができる。
【００２１】
真菌類においては、ステロールＣ−２２デサチュラーゼおよびステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをそれぞれコードしている遺伝子断片中に、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性遺伝子ＤＮＡないしはカナマイシンやオーレオバシジンなどの抗生物質や抗真菌薬に対する耐性遺伝子が挿入された遺伝子断片、あるいはその遺伝子断片がさらにベクターに挿入されたプラスミドを作成し、相同組換えにより宿主染色体中の該遺伝子を破壊する方法が好適に用いられる。
【００２２】
例えば、サッカロミセス・セレビシエにおいては、ステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ５）を含むＤＮＡ断片、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を含むＤＮＡ断片を制限酵素切断ないしはポリメラーゼチェーンリアクション法（以下これを「ＰＣＲ」と略称することがある）によって得てベクターに組み込んで中間ベクターｐＥＲＧ５およびｐＥＲＧ６を作成する。この中間ベクターをＥＲＧ５遺伝子およびＥＲＧ６遺伝子の遺伝子内部にある任意の制限酵素部位で２つに切断し、酵母のＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性遺伝子ｃＤＮＡのいずれか１つを２つの中間ベクター同士で重ならないように選択し挿入することにより遺伝子破壊用ベクターないしはそれをＰＣＲで増幅して得られる遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を作成する。次いでこの遺伝子破壊用ベクターないしは遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を酵母に遺伝子導入することで相同組換えを誘発し、目的遺伝子を破壊することができる。
【００２３】
酵母において、遺伝子破壊用ベクター作成ないしは遺伝子破壊用ＤＮＡ断片作成に用いるベクター系としては、ｐＵＣ系（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ， Ｃ．， Ｖｉｅｉｒａ， Ｊ． ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ｊ． （１９８５） Ｇｅｎｅ ３３（１）， １０３−１１９）やｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（Ｓｈｏｒｔ， Ｊ． Ｍ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｊ． Ｍ．， Ｓｏｒｇｅ， Ｊ． Ａ． ａｎｄ Ｈｕｓｅ， Ｗ． Ｄ． （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６（１５）， ７５８３−７６００、Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ， Ｍ． Ａ． ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ， Ｊ． Ｍ． （１９８９） ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７（２２）， ９４９４）などがあげられる。これらのベクターは市販されており容易に入手可能である。
【００２４】
かくして構築される遺伝子破壊用ＤＮＡ断片若しくは遺伝子破壊用ベクターの具体例として、ＥＲＧ５遺伝子の内部３７１ｂｐを欠失させ、この欠失部分にＴＲＰ１遺伝子が挿入されているＤＮＡ断片（ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１）若しくは該ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１、ＥＲＧ６遺伝子の内部４７６ｂｐを欠失させ、この欠失部分にＨＩＳ３遺伝子が挿入されているＤＮＡ断片（ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３）若しくは該ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３等が挙げられる。
【００２５】
遺伝子導入の方法としては、例えば、電気穿孔法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法があげられるが、酢酸リチウム法が特に好ましい。酵母における遺伝子破壊の確認は、特定の栄養要求性遺伝子が挿入された遺伝子部分が相同組換えにより酵母ゲノム中に組み込まれるために、宿主株が持っていた複数の栄養要求性のうち該当する栄養要求性が消失することで知ることができる。さらにＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子の５’末端と３’末端にそれぞれ設定したＰＣＲプライマーを用いて、遺伝子破壊操作を受けた酵母株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片の長さが挿入した栄養要求性遺伝子の長さだけ大きくなっていることを確認することにより遺伝子破壊の確認を行うことができる。
【００２６】
かくして得られる遺伝子破壊株の具体例としては、遺伝子破壊用ベクターｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１のｅｒｇ５：：ＴＲＰ１断片でＥＲＧ５遺伝子を破壊した、サッカロミセス・セレビシエＫＡΔ５−５株、さらに該Δ５−５株のＥＲＧ６遺伝子をｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３のｅｒｇ６：：ＨＩＳ３断片で破壊したＫＡΔ５Δ６−１株、ＫＡΔ５Δ６−４株、ＫＡΔ５Δ６−５株等が挙げられる。
ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性が低減化された宿主微生物に、さらにステロールΔ７−リダクターゼおよび／またはステロールΔ５−デサチュラーゼが高発現化されるように代謝工学的に改変することができる。
【００２７】
この改変に用いるステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子としては、人、マウスなどの動物由来の遺伝子、およびシロイヌナズナ（Ｌｅｃａｉｎ， Ｅ．， Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ， Ｘ．， Ｓｐａｇｎｏｌｉ， Ｒ．， ａｎｄ Ｐｏｍｐｏｎ， Ｄ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（１８）， １０８６６−１０８７３）、イネ、トマト、大豆などの植物由来遺伝子を挙げることができる。
また、この改変に用いるステロールΔ５−デサチュラーゼとしては、酵母由来の遺伝子（Ａｒｔｈｉｎｇｔｏｎ， Ｂ．Ａ．， Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｌ．Ｇ．， Ｓｋａｔｒｕｄ， Ｐ．Ｌ．， Ｇｕｙｎｎ， Ｃ．Ｊ．， Ｂａｒｂｕｃｈ， Ｒ．Ｊ．， Ｕｌｂｒｉｇｈｔ， Ｃ．Ｅ．， ａｎｄ Ｂａｒｄ， Ｍ． （１９９１） Ｇｅｎｅ １０２（１）， ３９−４４）、ヒトなどの動物由来の遺伝子（Ｍａｔｕｓｈｉｍａ， Ｍ．， Ｉｎａｚａｗａ， Ｊ．， Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｅ．， Ｓｕｚｕｍｏｒｉ， Ｋ．， ａｎｄ Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｙ． （１９９６） Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ７４（４）， ２５２−２５４）、およびシロイヌナズナ（Ｇａｃｈｏｔｔｅ， Ｄ．， Ｈｕｓｓｅｌｓｔｅｉｎ， Ｔ．， Ｂａｒｄ， Ｍ．， Ｌａｃｒｏｕｔｅ， Ｆ．， ａｎｄ Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ， Ｐ． （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ９（３）， ３９１−３９８）、イネ、トマト、大豆などの植物由来遺伝子を挙げることができる。
これらの遺伝子を真菌類で高発現させるためには、染色体組込型プラスミドのうち多コピーが染色体に組み込まれるベクターを用いる方法（Ｓａｋａｉ， Ａ．， Ｏｚａｗａ， Ｆ．， Ｈｉｇａｓｈｉｚａｋｉ， Ｔ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｙ．， ａｎｄ Ｈｉｓｈｉｎｕｍａ， Ｆ． （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． ９， １３８２−１３８５）および非組み込み型プラスミドのうち２μｍプラスミド由来のｐＡＵＲベクター（タカラバイオ社製）やｐＥＳＣベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）などの多コピー型を用いる方法が好適である。
【００２８】
好ましくはフォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子あるいはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子などの恒常的プロモーターないしはＧＡＬ１ＧＡＬ１０（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， Ｒ． Ｗ． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４（８）， １４４０−１４４８）などの誘導型プロモーター（例えば、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）の下流にステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子またはステロールΔ５−デサチュラーゼをつないで２μｍプラスミドなどの多コピー型プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した発現ベクターを構築し、それを宿主となる真菌類の二重遺伝子破壊株に導入する方法が好適である。
【００２９】
さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビシエのｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株にアラビドプシスのｍＲＮＡからＰＣＲを用いて取得したステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を酵母のアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター下流につなぎ、ＬＥＵ２遺伝子をつないだ２μｍプラスミドに挿入して発現ベクターを構築する方法、および酵母の染色体からＰＣＲを用いて取得したステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子を酵母のアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター下流につなぎ、ＵＲＡ３遺伝子をつないだ２μｍプラスミドに挿入して発現ベクターを構築する方法が好適である。
【００３０】
かくして構築される発現ベクターの具体例として、シロイヌナズナ由来のステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を改変型２μｍベクターｐＡＤＮＳΔＥへ組み込むことにより構築されるプラスミドｐＡＤ−Δ７、およびサッカロミセス・セレビシエ由来のステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子（ＥＲＧ３）を改変型２μｍベクターｐＡＤ−ＵＲＡへ組み込むことにより構築されるプラスミドｐＡＵ−ＥＲＧ３が挙げられる。
遺伝子導入の方法としては、電気穿孔法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等があげられるが、中でも酢酸リチウム法が特に好ましい。遺伝子導入は、例えばシロイヌナズナのステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子ｃＤＮＡの５’末端と３’末端に設定したプライマー、あるいは酵母のステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子ｃＤＮＡの５’末端と３’末端に設定したプライマーを用い、形質転換処理した二重遺伝子破壊株から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことで確認できる。
【００３１】
かくして得られるｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株にステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入した菌株の例としては、ＫＡΔ５Δ６−４株に、プラスミドｐＡＤ−Δ７を導入したｐＡＤ−Δ７／ ＫＡΔ５Δ６−４株を挙げることができる。このようにして改変された菌株は、（１）ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの活性を低減化することにより、フェコステロールを経てエルゴステロールを合成する流れを止め、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの合成方向へ導き、（２）Δ７−ステロールリダクターゼを高発現化することにより、中間産物であるコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルおよびコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オル等を効率よくデスモステロールまで導き、さらに、（３）ステロールＣ−２２デサチュラーゼの活性を低減化することにより、生成したコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルおよびコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オル、デスモステロール等のステロールの２２位が不飽和化されることを防ぐことができる。
また、かくして得られるｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株にステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子およびステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子を導入した菌株の例としては、ＫＡΔ５Δ６−４株に、プラスミドｐＡＤ−Δ７およびｐＡＵ−ＥＲＧ３を導入したＥ３−４．１株を挙げることができる。このようにして改変された菌株は、（１）ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの活性を低減化することにより、フェコステロールを経てエルゴステロールを合成する流れを止め、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの合成方向へ導き、（２）ステロールΔ５−デサチュラーゼを高発現化することにより、中間産物であるコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルをコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オルへより効率良く変換し、（３）Δ７−ステロールリダクターゼを高発現化することにより、中間産物であるコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルおよびコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オル等を効率よくデスモステロールまで導き、さらに、（４）ステロールＣ−２２デサチュラーゼの活性を低減化することにより、生成したコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルおよびコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オル、デスモステロール等のステロールの２２位が不飽和化されることを防ぐことができる。
【００３２】
ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化し、Δ７−ステロールリダクターゼを高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類、または該真菌類のステロールΔ５−デサチュラーゼを高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類によるチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物の生産は、発酵法によるエルゴステロールの製造に用いられる方法と同様の方法により行うことができる。すなわち、上記生産株を炭素源、窒素源、無機塩、アミノ酸、ビタミンなどを含有する培地中、好気条件下、温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えば、真菌類菌体中にチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物が蓄積するのでこれを採取する。
【００３３】
炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール、フルクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜、などの炭水化物、ピルビン酸、メバロン酸などの各種有機酸が使用できる。さらに真菌類の資化性によって、炭化水素、アルコールなども用いられる。特に廃糖蜜は好適にもちいられる。
【００３４】
窒素源としては、例えばアンモニア、または塩化アンモニウム、炭酸アンモニウムなどの各種無機塩および有機アンモニウム塩類あるいはペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物など種々のものが使用可能である。
無機塩としては、例えばリン酸第一水素カリウム、リン酸水素第二カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどを使用する。ビタミン、アミノ酸としては、使用する真菌類の種類によってことなるが、必要に応じ添加する。また使用する菌株が、栄養要求性を示す場合は、その要求物質を添加する。さらに培地には、チモステロール、あるいは、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル、あるいは、コレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オルを加えて菌株ないしはその処理物に接触させることで、チモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物を蓄積させても良い。
【００３５】
培養は使用する菌株に応じて適切な条件で行うが、通常は、震盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下に行う。生産株として、サッカロミセス・セレビシエを用いる場合は、培養温度は２０〜４０℃が好適であり、培地のｐＨは弱酸性付近に維持する事が望ましい。培養期間は通常１〜５日間で菌体中にチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物が蓄積する。
【００３６】
培養終了後のステロールの抽出は一般に生物組織からステロール類を抽出する方法により行うことができる。具体的には、例えば、菌体を海砂とともにそのままアセトン中で破砕し酢酸エチルで抽出するか、又は、２ＭのＮａＯＨを含む５０％エタノール中で２時間煮沸し鹸化したのちヘプタンないしはクロロホルム／メタノール／水（体積比８６：１６：１）混液で抽出し、薄層クロマトグラフィーにかけステロール画分を掻き取って、窒素気流下で乾燥させメタノール／クロロホルム混液に溶解することで総ステロールを菌体から抽出する。
【００３７】
次いでステロールの種類の同定は、薄層クロマトグラフィーで分離抽出したステロール画分を、それ自体公知の適当な溶媒およびカラムの組み合わせでガスクロマトグラフィーないしは高速液体クロマトグラフィーにかけて、現れるピークの保持時間を標準試料の保持時間と比較することで行うことができる。また、同定された各種ステロールの総ステロール中にしめる割合は各ピークの面積から算出することができる。さらに、これらの主要なステロールのピークが目的化合物であることの確認は、マススペクトロメトリーを用いて、分子量および開裂パターンを調べることで行うことができる。また、ＧＣ−ＭＳあるいはＨＰＬＣ−ＭＳを用いることによりさらに効率よく抽出されたステロール類を同定することができる。
【００３８】
また、本発明の真菌類またはその処理物を、チモステロール、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルまたはコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オルに接触させて、デスモステロールを生成蓄積させることができる。真菌類は培養した菌体をそのまま用いてもよいし、得られた菌体を超音波破砕、フレンチプレス若しくはホモジェナイザー等の機械的破壊法、又はリゾチームを用いた酵素的破壊法等によって処理したものを用いても良い。接触させる際には反応液にグルコース、シュークロース、フルクトース等の炭素源をエネルギー源として添加し、収量が向上する場合はそれらの炭素源を適宜添加することも可能である。その他溶液には界面活性剤、有機物及び無機物等を必要により添加することもできる。
【００３９】
得られたチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物は各種医薬等の中間体となりうる。例えば、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル由来生合成化合物であるデスモステロールは、その側鎖２４（２５）位の二重結合を化学的にあるいは還元酵素によって生物学的に還元することでコレステロールを生産することができる。具体的には、例えば、ヒトでその遺伝子が単離されているステロールΔ２４−リダクターゼ（ＳｔｅｒｏｌΔ２４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）とデスモステロールとを、酵素反応が起こりうる適当な条件下で接触させることにより２４（２５）位の二重結合が還元され、コレステロールが生成する。
【００４０】
すなわち、例えばフォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子あるいはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子などの恒常的プロモーターないしはＧＡＬ１ＧＡＬ１０などの誘導型プロモーターの下流にヒトのステロールΔ２４−リダクターゼをコードする遺伝子（Ｗａｔｅｒｈａｍ， Ｈ．Ｒ．， Ｋｏｓｔｅｒ， Ｊ．， Ｒｏｍｅｉｊｎ， Ｇ．Ｊ．， Ｈｅｎｎｋａｍ， Ｒ．Ｃ．Ｍ．， Ｖｒｅｋｅｎ， Ｐ．， Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｈ．Ｃ．， ＦｉｔｚＰａｔｒｉｃｋ， Ｄ．Ｒ．， Ｋｅｌｌｙ， Ｉ．， ａｎｄ Ｗａｎｄｅｒｓ， Ｒ．Ｊ．（２００１） Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ． ６９， ６８５−６９４）を連結して発現ベクターを作成し、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化しステロールΔ７−リダクターゼを高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類、例えば前記ｐＡＤ−Δ７／ ＫＡΔ５Δ６−４株、あるいはステロールＣ−２２デサチュラーゼ、および、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化しステロールΔ７−リダクターゼおよびステロールΔ５−デサチュラーゼを高発現化するように代謝工学的に改変された真菌類、例えば前記Ｅ３−４．１株に遺伝子導入し発現させることでコレステロールを産生する形質転換株を作製することができる。得られた形質転換株はデスモステロールの生産に用いたと同様の方法で培養し、ステロールを抽出することでコレステロールを得ることができる。
【００４１】
また、デスモステロールのような側鎖二重結合を持つステロイドは、この二重結合を利用してＨｇ（ＯＡｃ）２次いでＮａＢＨ４処理することで２５−ヒドロキシステロールに、あるいはＯｓＯ４で酸化するかｅｐｏｘｉｄｅ化後酸処理で２４，２５−ジヒドロキシステロールに誘導できる。ついでＢａｒｔｏｎ法（Ｂａｒｔｏｎ， Ｄ．Ｈ．Ｒ．， Ｈｅｓｓｅ， Ｒ．Ｈ．， Ｐｅｃｈｅｔ， Ｍ．Ｍ．， Ｒｉｚｚａｒｄｏ， Ｅ． （１９７３） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ９５， ２７４８）によりこれらの誘導体の１α位を水酸化し、ＵＶ照射によりＢ環を開環し熱異性化することで、最終的に２５−ヒドロキシビタミンＤ３類、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３類、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール等の活性型ビタミンＤ類に変換することができる（池川信夫、竹下徹、「有機合成化学」、（１９７９）第３７巻、第９号、７５５−７７１頁参照）。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１ サッカロミセス・セレビシエ ＫＡ３１１Ａ 株の ＥＲＧ５ および ＥＲＧ６ 遺伝子の二重遺伝子破壊株の作成
（１）酵母染色体ＤＮＡの調製
サッカロミセス・セレビシエ ＫＡ３１１Ａ株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９０５３）をＹＰＤ液体培地（１％ 酵母エキス、２％ ポリペプトン、２％ グルコース）１０ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養をおこなった。培養液から菌体を集菌し、ＳＴＥＳ緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下「トリス」と略す）、０．００１Ｍ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（以下「ＥＤＴＡ」と略す）、０．１％ ラウリル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５）０．１ｍｌに懸濁後、石英砂を細胞と同体積加えた。サンプルを３０秒間ボルテックスミキサーで撹拌した後、１分間氷上に静置した。この操作を３回繰り返した。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（体積比２５：２４：１）を０．１ｍｌ加えて、同様に３０秒間の撹拌と１分間の氷上静置を２回繰り返した。
微量用遠心機により二層に分離させ、水層を回収した。等容積のクロロホルムを加えて撹拌した後、同様に微量用遠心機により二層に分離させ、水層を回収した。１０分の１容の３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）、２．５倍容の９９％ エタノールを加えてＤＮＡを沈殿回収後、０．０５ｍｌのＴＥ緩衝液（０．０１Ｍ トリス、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解した。
【００４３】
（２）遺伝子破壊用の酵母ＥＲＧ５、ＥＲＧ６遺伝子断片の調製
サッカロミセス・セレビシエ由来ステロールＣ−２２デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ５）を含むＤＮＡ断片、ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ６）を含むＤＮＡ断片は、上記（１）で取得したサッカロミセス・セレビシエ ＫＡ３１１Ａ株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにて合成、単離した。以下にその方法の詳細を示す。
【００４４】
ＥＲＧ５遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＥＲＧ５−５Ａ（配列番号１）、リバースプライマーＥＲＧ５−３Ａ（配列番号２）を用いた。このプライマーの組み合わせでＥＲＧ５の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの４塩基前から終始コドンの３塩基後までを増幅することができる。また、５’側に制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、Ｓａｃ Ｉの認識配列を、３’側にＫｐｎ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。
【００４５】
ＥＲＧ６遺伝子断片のＰＣＲによる合成には、フォワードプライマーＥＲＧ６−５Ｂ（配列番号３）、リバースプライマーＥＲＧ６−３Ｂ（配列番号４）を用いた。このプライマーの組み合わせでＥＲＧ６の蛋白質コード領域を含み、開始コドンの１１塩基前から終始コドンの１２塩基後までを増幅することができる。また、５’側にに制限酵素ＢａｍＨ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉの認識配列を、３’側にＥｃｏＲ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。ＰＣＲはＴａｑ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、▲１▼９４℃、２分、▲２▼９４℃、１分、▲３▼５５℃、２分、▲４▼７２℃、４分、▲２▼から▲４▼の反応を３０回繰り返し、▲５▼７２℃、４分間反応させた後、４℃で冷却の条件で反応を行った。次に、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．１１ｋｂｐのＥＲＧ５遺伝子断片および約１．２ｋｂｐのＥＲＧ６遺伝子断片を確認した。
【００４６】
（３）遺伝子破壊用組換え体プラスミドｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１、ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３の調製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（東洋紡社製）を制限酵素Ｓａｃ Ｉ（タカラバイオ社製、以下、特に記載のない限り、制限酵素はタカラバイオ社製である）およびＫｐｎ Ｉで切断したものと、ＰＣＲ合成したＥＲＧ５遺伝子断片をＳａｃ ＩおよびＫｐｎ Ｉで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。これをエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’（インビトロジェン社製）に形質転換し、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、２％ 寒天、０．００５Ｎ ＮａＯＨ）上に生育したコロニーからアルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｓａｃ ＩおよびＫｐｎ Ｉによる切断で約２．９ｋｂｐと１．１ｋｂｐの断片が確認でき、且つＰｓｔ ＩおよびＳｃａ Ｉによる切断で約２．５７ｋｂｐと１．３２ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、ｐＳＫ−ＥＲＧ５と名付けた。
【００４７】
次に、ｐＳＫ−ＥＲＧ５をＢｇｌ ＩＩおよびＨｉｎｃ ＩＩで切断し、ＥＲＧ５遺伝子の内部３７１ｂｐを欠失させた。この欠失部分に、プラスミドｐＳＫ−ＴＲＰ１をＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｃＩＩで切断して得た約０．９１ｋｂｐの酵母トリプトファン合成系の遺伝子であるＴＲＰ１遺伝子断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により和合連結させた。なお、ｐＳＫ−ＴＲＰ１は、ＴＲＰ１遺伝子を含むプラスミドｐＪＪ２８１（Ｊｏｎｅｓ， Ｓ． ａｎｄ Ｐｒａｋａｓｈ，Ｌ． （１９９０） Ｙｅａｓｔ ６， ３６３−３６６の記載に準じて調製）をＳａｃ ＩおよびＢｇｌ ＩＩで切断して得た約０．８７ｋｂｐのＴＲＰ１遺伝子断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋をＳａｃ ＩおよびＢａｍＨＩで切断したものと和合連結させたプラスミドである。
ｐＳＫ−ＥＲＧ５とＴＲＰ１遺伝子断片との和合連結物を上記と同様にエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出をおこなった。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉによる切断で約３．６８ｋｂｐと０．８６ｋｂｐの断片が確認でき、且つＳａｃ ＩおよびＫｐｎ Ｉによる切断で約２．９ｋｂｐと１．６３ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、ｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１と名付けた（図３）。
【００４８】
ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３に関しても、ｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１の作成と同様に、まずｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）をＰｓｔ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉで切断したものと、ＰＣＲ合成したＥＲＧ６遺伝子断片をＰｓｔ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結した。連結物をエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出をおこなった。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｐｓｔ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉによる切断で約２．６６ｋｂｐと１．２ｋｂｐの断片が確認でき、且つＳｃａ Ｉによる切断で約１．８ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、ｐＵＣ−ＥＲＧ６Ｂと名付けた。
【００４９】
次に、ｐＵＣ−ＥＲＧ６ＢをＮｓｐＶ（東洋紡社製）およびＸｂａ Ｉで切断し、ＥＲＧ６遺伝子の内部４７３ｂｐを欠失させた。この欠失部分に、ｐＵＣ１８−ＨＩＳ３から酵母ヒスチジン合成系の遺伝子であるＨＩＳ３遺伝子断片をＣｌａ ＩおよびＸｂａ Ｉで切断して得た約１．５３ｋｂｐのＤＮＡ断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により和合連結させた。
【００５０】
なお、ｐＵＣ１８−ＨＩＳ３は以下の方法で作成した。プラスミドｐＹｅｈｉｓ２（Ｋａｓｕｎｉｃ， Ｄ．Ａ． ａｎｄ Ｋｕｓｈｎｅｒ， Ｓ． Ｒ． （１９８０） Ｇｅｎｅ １２， １−１０の記載に準じて調製）を鋳型として、フォワードプライマーＨＩＳ３−５Ｂ（配列番号５）、リバースプライマーＨＩＳ３−３Ａ（配列番号６）を用いてＰＣＲによるＨＩＳ３遺伝子合成をおこなった。このプライマーの組み合わせでＨＩＳ３の蛋白質コード領域とプロモーター、ターミネーター領域を含む配列を増幅することができる。具体的には、プロモーター領域として蛋白質コード領域の４７０ｂｐ上流から、ターミネーター領域として蛋白質コード領域の３９０ｂｐ下流を含む配列である。また、５’側に制限酵素ＢａｍＨ Ｉの認識配列を、３’側にＥｃｏＲ Ｉ、Ｃｌａ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。ＨＩＳ３遺伝子のＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて、上記（２）と同じ温度条件で反応をおこなった。
【００５１】
ＰＣＲ合成したＨＩＳ３遺伝子断片をＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで切断したものと、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）をＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで切断したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結し、上記と同様にエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出をおこなった。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨ Ｉによる切断で約２．６６ｋｂｐと１．５３ｋｂｐの断片が確認でき、且つＰｓｔ Ｉによる切断で約２．９９ｋｂｐと１．２０ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとした。
【００５２】
ｐＵＣ−ＥＲＧ６ＢとＨＩＳ３遺伝子断片との和合連結物を上記と同様にエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出をおこなった。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｐｓｔ Ｉによる切断で約３．９６ｋｂｐと０．９３ｋｂｐの断片が確認でき、且つＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉによる切断で約２．８１ｋｂｐと１．１２ｋｂｐと０．７７ｋｂｐと０．１９ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３と名付けた（図３）。
【００５３】
（４）遺伝子破壊用断片ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１の導入によるＥＲＧ５遺伝子破壊株ＫＡΔ５−５株の作成
上記（３）で作成したプラスミドｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１をＳａｃ ＩおよびＫｐｎ Ｉで切断し、アガロースゲルから約１．６３ｋｂｐのＤＮＡ断片（ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１）をＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ ＩＩ ＫＩＴ（フナコシ社製）により抽出した。このＤＮＡ断片をサッカロミセス・セレビシエＫＡ３１１Ａ株（ＭＡＴａ ｈｉｓ３ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｕｒａ３）に酢酸リチウム法（Ｉｔｏ， Ｈ．， Ｆｕｋｕｄａ，Ｙ．， Ｍｕｒａｔａ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｉｍｕｒａ， Ａ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３（１）， １６３−１６８）で形質転換し、各２０ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、ウラシルを含むＳＤ寒天培地（０．１７％ ＹＥＡＳＴ ＮＩＴＲＯＧＥＮ ＢＡＳＥ ｗ／ｏ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ（ＤＩＦＣＯ社製）、２％ グルコース、２％ 寒天）に播き、３０℃で３日から５日間培養した。
【００５４】
寒天培地上で生育してきたトリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％ 酵母エキス、２％ ポリペプトン、２％ グルコース）５ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養をおこなった。この培養液から上記（１）で述べた方法で染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＥＲＧ５−５ＡとリバースプライマーＥＲＧ５−３Ａの組み合わせでＰＣＲを行い、ＥＲＧ５遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件でおこなった。比較対照として、ＫＡ３１１Ａ株の染色体ＤＮＡ、プラスミドｐＳＫ−ＥＲＧ５、ｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１を鋳型にして、同様にＰＣＲをおこなった。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＫＡΔ５−５と名付けた形質転換体はｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１と同じ約１．６３ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された（図４参照）。従って、ＫＡΔ５−５株は相同組換えによりＥＲＧ５遺伝子が破壊されたことが確認できた。
【００５５】
（５）ＫＡΔ５−５株への遺伝子破壊用断片ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３の導入による二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−１， ＫＡΔ５Δ６−４， ＫＡΔ５Δ６−５株の作成
上記（３）で作成したプラスミドｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３をＳｃａ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉで切断し、アガロースゲルから約２．０９ｋｂｐのＤＮＡ断片（ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３）をＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ ＩＩ ＫＩＴ（フナコシ社製）により抽出した。このＤＮＡ断片を上記（４）で作成したＫＡΔ５−５株に酢酸リチウム法（Ｉｔｏ， Ｈ．， Ｆｕｋｕｄａ， Ｙ．， Ｍｕｒａｔａ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｉｍｕｒａ， Ａ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３（１）， １６３−１６８）で形質転換し、各２０ｍｇ／ｍｌのＬ−ロイシン、ウラシルを含むＳＤ寒天培地に播き、３０℃で５日から７日間培養した。
【００５６】
寒天培地上で生育してきたヒスチジンおよびトリプトファン非要求性のコロニーをＹＰＤ液体培地（１％ 酵母エキス、２％ ポリペプトン、２％ グルコース）５ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間、振とう培養をおこない、上記（４）と同様に染色体ＤＮＡを抽出した。これを鋳型としてフォワードプライマーＥＲＧ６−５ＢとリバースプライマーＥＲＧ６−３Ｂの組み合わせでＰＣＲを行い、ＥＲＧ６遺伝子座上での相同組換えの有無を調べた。ＰＣＲは上記（２）で述べた条件でおこなった。比較対照として、ＫＡ３１１Ａ株、ＫＡΔ５−５株の染色体ＤＮＡ、プラスミドｐＵＣ−ＥＲＧ６、ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３を鋳型にして、同様にＰＣＲをおこなった。
【００５７】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ＫＡΔ５Δ６−１、ＫＡΔ５Δ６−４、ＫＡΔ５Δ６−５と名付けた形質転換体はｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３と同じ約２．２３ｋｂｐのＤＮＡ断片が検出された（図４参照）。従って、ＫＡΔ５Δ６−１、ＫＡΔ５Δ６−４、ＫＡΔ５Δ６−５株は相同組換えによりＥＲＧ６遺伝子が破壊されたことが確認できた。
【００５８】
実施例２ ｅｒｇ５ ｅｒｇ６ 二重変異株へのシロイヌナズナ由来ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子の導入
（１）シロイヌナズナ全ＲＮＡからのステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子ｃＤＮＡの調製
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ， ｃｖ， Ｃｏｌｕｍｂｉａ）をパーライトとバーミキュライトの１：１混合土上で発芽させ、２３℃、短日条件で弱光下４週間生育させ、花芽を形成させた。この植物体全体を取り、フェノール／ＳＤＳとＬｉＣｌを用いる方法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ， Ｊ．Ｍ．， Ｐｒｚｙｂｙｌａ， Ａ．Ｅ．， ＭａｃＤｏｎａｌｄ， Ｒ．Ｊ． （１９７９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８， ５２９４−５２９９）で全ＲＮＡを抽出した。
【００５９】
次いで、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用い、３’側プライマーとしては４５塩基からなる合成オリゴマー（配列番号７）を用いてＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。このＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型として、５’側プライマーとしては５７塩基からなる合成オリゴマー（配列番号８）を、３’側プライマーとしては前述の４５塩基からなる合成オリゴマーを用い、開始コドンから終止コドンまでを含み５’端に制限酵素Ｎｏｔ Ｉサイトを、３’端に制限酵素ＥｃｏＲ Ｉサイトを持つ二重鎖ｃＤＮＡ断片Δ７−１を合成した。Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ合成反応の溶液組成および反応条件は全てｃＤＮＡ合成キットのプロトコルに従って行った。二重鎖合成反応に関しては、反応液組成はｃＤＮＡ合成キットのプロトコルに従い、ＰＣＲ反応は最初に９４℃で１分反応させたあと、９４℃３０秒、６０℃２分、７２℃２分のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分反応させることで行った。
【００６０】
（２）ステロールΔ７−リダクターゼｃＤＮＡを含む酵母用発現ベクターｐＡＤ−Δ７の調製
ＰＣＲ合成したステロールΔ７−リダクターゼｃＤＮＡ断片Δ７−１をＴＡクローニングキット ｗｉｔｈ ＩＮＶαＦ’ Ｅ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン社製）を用いてクローン化し、プラスミドｐＣＲ−Δ７を作成した。
【００６１】
ｐＣＲ−Δ７をＮｏｔ Ｉで切断後、ＥｃｏＲ Ｉによる部分切断をおこない、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。酵母導入用ベクターには、酵母用マーカー遺伝子としてロイシン合成系のＬＥＵ２遺伝子、大腸菌用マーカー遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子を含み、外来遺伝子を酵母細胞内で構成的に発現させるためのアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（ＡＤＨ１）のプロモーター、ターミネーター領域を含む２μｍベクターｐＡＤＮＳ（Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ， Ｊ．， Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ， Ｃ．， Ｍｉｃｈａｅｌｉ， Ｔ．， Ｏ’Ｎｅｉｌｌ， Ｋ．， Ｒｉｇｇｓ， Ｍ． ａｎｄ Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６（１０）， ３５９９−３６０３の記載に準じて調製）を改変したｐＡＤＮＳΔＥ （Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｍ． ａｎｄ Ｎｉｋａｗａ， Ｊ． （２００１） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８３（１７）， ４９８５−４９９３の記載に準じて調製） を用いた。
【００６２】
ｐＡＤＮＳΔＥをＮｏｔ Ｉ およびＥｃｏＲ Ｉで切断したものと、上記１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片とをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）により連結し、上記と同様にエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出をおこなった。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉによる切断で約８．８ ｋｂｐと０．４３ｋｂｐの断片が確認でき、且つＣｌａ Ｉによる切断で約５．４ ｋｂｐと３．９ ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、このプラスミドをｐＡＤ−Δ７と名付けた（図４）。
【００６３】
（３）二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−４へのプラスミドｐＡＤ−Δ７の導入
上記（２）で作成したプラスミドｐＡＤ−Δ７を実施例１で作成したＫＡΔ５Δ６−４株に酢酸リチウム法（Ｉｔｏ， Ｈ．， Ｆｕｋｕｄａ， Ｙ．， Ｍｕｒａｔａ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｉｍｕｒａ， Ａ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３（１）， １６３−１６８）で形質転換し、２０ｍｇ／ｍｌのウラシルを含むＳＤ寒天培地に播き、３０℃で３日から５日間培養した。プラスミドが確実に導入されていることを調べるために、生育してきたコロニーを再度２０ｍｇ／ｍｌのウラシルを含むＳＤ寒天培地に移し、ロイシン非要求性を確認し、プラスミドｐＡＤ−Δ７が導入された二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−４（ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４）を得た。
【００６４】
実施例３ 親株、二重遺伝子破壊株、遺伝子導入株の ＹＰＤ 培地における増殖速度の比較
親株（ＫＡ３１１Ａ株）、二重遺伝子破壊株（ＫＡΔ５Δ６−４株）、遺伝子導入株（ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株）の増殖を比較するために、各株をＳＤ培地で２日間前培養を行い、ＹＰＤ液体培地にＯＤ６００が約０．３になるよう植菌した。３０℃で培養を行い、培養開始６時間までは２時間毎に、６時間から１２時間までは１．５時間毎に、その後は２４時間、３０時間、３６時間、４８時間後に、分光光度計（ＵＶ−１６００， 島津）でＯＤ６００値を測定した。図４に示すように、二重遺伝子破壊株は親株よりも増殖が劣っていたが、シロイヌナズナ由来ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入した組換え酵母は親株と同程度に増殖することが確認できた（図５）。
【００６５】
以上の結果より、ＥＲＧ５、ＥＲＧ６遺伝子の二重破壊により二重遺伝子破壊株は若干の生育の低下が認められたものの死には至らないことから、遺伝子破壊を起因とするステロール組成の変化、即ち、細胞中に含まれる主ステロールがエルゴステロールからコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルに変わることによる酵母の生育への影響は比較的小さいものと推定された。さらに、同二重遺伝子破壊株にステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入することにより生育の低下が回復することが明らかになった。
【００６６】
実施例４ 親株、二重遺伝子破壊株、遺伝子導入株の生産するステロール類の 分析
ｅｒｇ５ ｅｒｇ６遺伝子二重破壊株（ＫＡΔ５Δ６−４株）、およびステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入した二重遺伝子破壊株（ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株）をあらかじめＳＤ培地で２日培養し、種菌を作成したのち、ＹＰＤ液体培地に全量接種して３０℃で２日培養した。酵母培養液を４℃、３０００ｒｐｍで遠心分離し、１０〜１３ｇの酵母菌体を回収した。酵母菌体の２〜３倍量（２０〜４０ｍｌ）の７０％アセトン水溶液を加えて海砂とともに乳鉢中で磨砕した。磨砕液を３重のミラクロスで濾過したのち、ミラクロス上の固形物に再度７０％アセトン水溶液を加えてよく混ぜ３０分間超音波をかけ再度濾過して、最初の濾液と一緒にした。この濾液を室温で減圧濃縮機にかけて液量が１ｍｌ位になるまでアセトンを飛ばした。
【００６７】
この試料に酢酸エチルを加え脂質を再抽出し、濃縮した後、ヘキサン−ジエチルエーテル−酢酸（体積比８０：２０：１）の溶媒系を用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィーにかけ、ローダミン６Ｇや２’，７’−ジクロロフルオロセインなどで発色させた。発色程度を指標としてステロール画分を掻き取り、クロロホルム：メタノール：エーテル（体積比１：１：１）溶出溶媒で抽出し、０．５ｍｇをガスクロマトグラフィーあるいは、ＧＣ／ＭＳにかけステロールの分析を行った。
【００６８】
標準試料としては、デスモステロール、および、エルゴステロールを用いて、その保持時間とサンプルのクロマトグラムに現れるピークの保持時間を比較したところ、二重破壊株酵母からの抽出サンプルでは、図６ａに示すとおりコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの保持時間と考えられる位置に主ピークが現れた。また、デスモステロールの保持時間と一致する位置にもピークが現れた。
【００６９】
さらにＧＣ／ＭＳ分析の結果、すなわち分子量および開裂パターンから、組換え酵母の主ステロールは確かにデスモステロールであることが確認できた（図７ａ）。さらに、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルと考えられたピークに関しても、ＧＣ／ＭＳ分析の結果から、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルであることが明らかになった（図７ｂ）。
【００７０】
これらのピークの面積計算をおこなったところ、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルは全ステロールの６０％、デスモステロールは全ステロールの１０％を占めていることがわかった。このことより、酵母のＥＲＧ５、ＥＲＧ６遺伝子の二重破壊により、酵母におけるエルゴステロール方向への合成を停止させ、チモステロールからコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル合成の方向にステロールの代謝経路を変えることが可能であることが明らかになった。
【００７１】
一方、ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入した二重破壊株からの抽出サンプルでは、図６ｂに示すとおりデスモステロールの保持時間と一致する位置に主ピークが現れた。また、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの保持時間と考えられる位置にもピークが現れた。これらのピークの面積計算をおこなったところ、デスモステロールは全ステロールの７１％、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルは全ステロールの２０％を占めていることがわかった。このことより、二重遺伝子破壊株へのステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子の導入により、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの大部分が、デスモステロールに変換されることが明らかになった。
【００７２】
実施例５ ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入した ｅｒｇ５ ｅｒｇ６ 二重遺伝子破壊株へのステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子の導入
（１）酵母染色体ＤＮＡからのステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子の断片の調製
ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入したＥＲＧ５ ＥＲＧ６二重遺伝子破壊株ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株中に存在する約２０％のコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルを全てデスモステロールに変換させる目的で、ステロールΔ５−デサチュラーゼを過剰発現させるために、サッカロミセス・セレビシエ由来ステロールΔ５−デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＥＲＧ３）を含む遺伝子断片をＰＣＲにより合成、単離した。
鋳型ＤＮＡとして実施例１（１）で取得したＫＡ３１１Ａ株の染色体ＤＮＡを用い、フォワードプライマーＥＲＧ３−５Ａ（配列番号９）、リバースプライマーＥＲＧ３−３Ａ（配列番号１０）により、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて、実施例１（２）の反応条件でＰＣＲを行った。これら２つのプライマーにより、ＥＲＧ３遺伝子の開始コドンから終始コドンまでを含む１０９８ｂｐを増幅することができる。また、５’側に制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩの認識配列を、３’側にＮｏｔ Ｉの認識配列を含んだ形で合成することができる。ＥＲＧ３遺伝子断片合成の確認は、アガロースゲル電気泳動で行った。
【００７３】
（２）ステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子過剰発現ベクターｐＡＵ−ＥＲＧ３の調製
ＰＣＲ合成したＥＲＧ３遺伝子断片をＴＡクローニングキット ｗｉｔｈ ＩＮＶαＦ’ Ｅ． ｃｏｌｉ（インビトロジェン社製）を用いてクローン化し、プラスミドｐＣＲ−ＥＲＧ３を作成した。
酵母用ベクターとして、酵母用マーカー遺伝子にウラシル合成系のＵＲＡ３遺伝子を、大腸菌用マーカー遺伝子にアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＡＤ−ＵＲＡを用いた。このベクターは、多コピー型酵母−大腸菌シャトルベクターｐＲＳ４２６ （Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ， Ｔ． Ｗ．， Ｓｉｋｏｒｓｋｉ， Ｒ． Ｓ．， Ｄａｎｔｅ， Ｍ．， Ｓｈｅｒｏ， Ｊ． Ｈ． ａｎｄ Ｈｉｅｔｅｒ， Ｐ． （１９９２） Ｇｅｎｅ １１０（１）， １１９−１２２）をＳａｃ ＩとＫｐｎ Ｉで切断したのち、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）で平滑化した部分に、ｐＡＤＮＳΔＥのＡＤＨ１プロモーター／マルチクローニングサイト／ＡＤＨ１ターミネーターをＢａｍＨ Ｉで切断しＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）で平滑化した約２ｋｂｐの断片をＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）で連結して作成したものである。
ｐＣＲ−ＥＲＧ３をＨｉｎｄ ＩＩＩで切断して得た約１．１７ｋｂｐの断片と、ｐＡＤ−ＵＲＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断した後Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ７５）（タカラバイオ社製）で処理したものとをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）で連結し、上記と同様にエッシェリシア・コリＩＮＶαＦ’に形質転換し、得られたコロニーからプラスミド抽出を行った。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる切断で約１．１７ｋｂｐと７．６６ｋｂｐの断片が確認でき、且つＰｓｔ Ｉによる切断で約４．１８ｋｂｐと４．６６ｋｂｐの断片が確認できたものを目的のプラスミドとし、これをｐＡＵ−ＥＲＧ３と名付けた（図８）。
【００７４】
（３）プラスミドｐＡＤ−Δ７を導入したｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株（ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株）へのプラスミドｐＡＵ−ＥＲＧ３の導入
上記（２）で作成したプラスミドｐＡＵ−ＥＲＧ３を実施例２で作成したｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株に酢酸リチウム法（Ｉｔｏ， Ｈ．， Ｆｕｋｕｄａ， Ｙ．， Ｍｕｒａｔａ， Ｋ． ａｎｄ Ｋｉｍｕｒａ， Ａ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３（１）， １６３−１６８）で形質転換し、ＳＤ寒天培地に播き、３０℃で３日から５日間培養した。プラスミドが確実に導入されていることを調べるために、生育してきたコロニーを再度ＳＤ寒天培地に移し、ウラシル非要求性を確認し、プラスミドｐＡＤ−Δ７およびｐＡＵ−ＥＲＧ３が導入されたｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株Ｅ３−４．１（ｐＡＤ−Δ７， ｐＡＵ−ＥＲＧ３／ＫＡΔ５Δ６−４）を得た。
【００７５】
実施例６ ステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子過剰発現株 Ｅ３−４．１ の生産するステロール類の分析
実施例４と同様に、ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子およびステロールΔ５−デサチュラーゼ遺伝子が過剰発現されたｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株Ｅ３−４．１（ｐＡＤ−Δ７， ｐＡＵ−ＥＲＧ３／ＫＡΔ５Δ６−４）を培養し、約１０ｇの酵母菌体を回収した。菌体の２〜３倍量（２０〜３０ｍｌ）のクロロホルムを加えて海砂とともに乳鉢中で磨砕した。磨砕液を１０分間超音波にかけたのち、デカンテーションによりクロロホルム層を回収し、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。
この試料を０．５ｍｌのクロロホルムに溶解し、ヘキサン−ジエチルエーテル−酢酸（体積比８０：２６：１）の溶媒系を用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィーをおこない、リンモリブデン酸で発色させた。ステロール画分を掻き取り、２−３ｍｌのアセトンで溶出し、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。１ｍｌのクロロホルムに再溶解したのち、含まれるシリカゲル等を除くため、試料をメンブレンフィルターで濾過した。さらに窒素ガス充填により溶媒を除去し、０．０２ｍｌのアセトンに溶解し、その十分の一量をガスクロマトグラフィー（ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＣＧ−１４Ｂ、島津製作所製）にかけステロールの分析をおこなった。
標準試料としては、デスモステロール、エルゴステロール、コレステロール、および化学合成したコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルを用いて、その保持時間とサンプルのクロマトグラムに現れるピークの保持時間を比較した。その結果、図９ｃに示すとおりデスモステロールの保持時間と一致する位置に主ピークが現れたが、図９ｂのｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株で見られたコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルの保持時間と考えられる位置のピークはほとんど消失していた。図９ｃ中のピークの面積計算をおこなったところ、デスモステロールは全ステロールの９０％を占めていることがわかった。このことより、ステロールΔ７−リダクターゼ遺伝子を導入したｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株に更にステロールΔ５−デサチュラーゼ（ＥＲＧ３）遺伝子を過剰発現させることにより、変換されずに残っていたコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルがほとんど全てデスモステロールに変換されたことが明らかになった。
【００７６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明により真菌類で生産されるステロール類の化学構造を示す図である。
【図２】代謝工学的に改変された酵母によるデスモステロールの生合成経路を示す図である。
【図３】本発明に用いたプラスミドベクターｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１、ｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３及びｐＡＤ−Δ７の構成を示す図である。
【図４】サッカロミセス・セレビシエ染色体上のＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子の遺伝子破壊の結果を示す電気泳動写真である。図中、レーン１はｐＳＫ−ＥＲＧ５、２はｐＳＫ−ｅｒｇ５：：ＴＲＰ１、３は親株ＫＡ３１１Ａ、４はＫＡΔ５−５、５は二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−１、６は二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−４、７は二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−５、８はｐＵＣ−ＥＲＧ６、９はｐＵＣ−ｅｒｇ６：：ＨＩＳ３、１１はＫＡΔ５−５、１２は二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−１、１３は二重遺伝子破壊株ＫＡΔ５Δ６−４、１４は二重遺伝子破壊株 ＫＡΔ５Δ６−５を示す。
【図５】サッカロミセス・セレビシエの親株、遺伝子破壊株、遺伝子導入株のＹＰＤ培地における増殖速度の比較を示す図である。図中、「ＫＡ３１１Ａ」は親株、「Ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ」はｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株（ＫＡΔ５Δ６−４）、「Δ７−ｒｅｄ」はシロイヌナズナ由来ステロール Δ７−リダクターゼ遺伝子を導入したｅｒｇ５ ｅｒｇ６二重遺伝子破壊株（ｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４）を示す。
【図６】ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。図中、ａ）はＫＡΔ５Δ６−４株の生産するステロール類の分析結果を示し、ｂ）はｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株の生産するステロール類の分析結果を示す。
【図７】ＭＳスペクトルによるステロール類生産の検出結果を示す図である。図中、ａ）はデスモステロールに相当するピークのＭＳスペクトルを示し、ｂ）はコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルに相当するピークのＭＳスペクトルを示す。
【図８】本発明に用いたプラスミドベクターｐＡＵ−ＥＲＧ３の構成を示す図である。
【図９】ガスクロマトグラフィーによるステロール類の分析結果を示す図である。図中、ａ）はＫＡΔ５Δ６−４株の生産するステロール類の分析結果を示し、ｂ）はｐＡＤ−Δ７／ＫＡΔ５Δ６−４株の生産するステロール類の分析結果を示し、ｃ）はＥ３−４．１株（ｐＡＤ−Δ７， ｐＡＵ−ＥＲＧ３／ＫＡΔ５Δ６−４）の生産するステロール類の分析結果を示す。
Claims (13)
- ステロールＣ−２２デサチュラーゼおよびステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化するように代謝工学的に改変されていることを特徴とする真菌類。
- ステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの活性を低減化し、ステロールΔ７−リダクターゼを高発現するように代謝工学的に改変されていることを特徴とする真菌類。
- ステロールＣ−２２デサチュラーゼおよびステロールＣ−２４メチルトランスフェラーゼの両方の活性を低減化し、かつステロールΔ７−リダクターゼを高発現化するように代謝工学的に改変されていることを特徴とする真菌類。
- ステロールΔ５−デサチュラーゼを高発現化するように代謝工学的に改変されている請求項１〜３のいずれかに記載の真菌類。
- 代謝工学的に改変されている真菌類が、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、トルロプシス属、または、ピキア属に属する酵母である請求項１〜４のいずれかに記載の真菌類。
- 請求項１〜５のいずれかに記載の真菌類を培地中で培養し、培養物からチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物を採取することを特徴とするチモステロールまたはコレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル若しくはその由来生合成化合物の製造方法。
- コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オル由来生合成化合物が、デスモステロールである請求項６に記載の方法。
- 培地が、炭素源として糖質またはアルコールを含むものである請求項６または７に記載の方法。
- 請求項１〜５のいずれかに記載の真菌類またはその処理物を、チモステロール、コレスタ−７，２４−ジエン−３β−オルまたはコレスタ−５，７，２４−トリエン−３β−オルに接触させて、デスモステロールを生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするデモステロールの製造方法。
- 請求項６〜９のいずれかに記載の方法で得られたステロール類を、ステロールΔ２４−リダクターゼに接触させることによりステロール類の２４（２５）位の二重結合を還元することを特徴とする、ステロール類の製造方法。
- 製造するステロール類が、コレステロールである請求項１０に記載の製造方法。
- 請求項６〜９のいずれかに記載の方法で得られたステロール類の側鎖二重結合を水酸化することにより２５−ヒドロキシステロール、又は２４，２５−ジヒドロキシステロールに変換することを特徴とする、２５−ヒドロキシステロール、又は、２４，２５−ジヒドロキシステロールの製造方法。
- 請求項１２に記載の方法で得られた２５−ヒドロキシステロール、又は２４，２５−ジヒドロキシステロールの１α位を水酸化し、Ｂ環を開環し、最終的に２５−ヒドロキシビタミンＤ３類、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３類、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、又は、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを含む活性型ビタミンＤ類に変換することを特徴とする、活性型ビタミンＤ類の製造方法。
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