JP2013512663A - 酵母による非酵母ステロールの生成 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)などの酵母中における、7−デヒドロコレステロール、25−ヒドロキシ−7−デヒドロコレステロール、および25−ヒドロキシエルゴステロールをはじめとする、ステロールの生成に関する。それはまた、チモステロール、コレスタ−7,24−ジエノール、およびコレスタ−5,7,24−トリエノールの24位における二重結合の還元;またはエルゴステロール、7−デヒドロコレステロール、コレスタ−8−エノール、およびコレスタ−7−エノールの25位におけるヒドロキシル化を触媒する、様々な酵素にも関する。それはまた、コレステロールC25−ヒドロキシラーゼおよびステロールΔ24−還元酵素をコードする様々な核酸に関し、7−デヒドロコレステロールまたはエルゴステロールを生成してヒドロキシル化するためのそれらの使用にも関する。それはまた、このようにして生成された酵母株に関し、形質転換酵母細胞を培養するステップと、得られたステロールを収集するステップを含んでなる、これらのステロールを生成する方法にも関する。
酵母中のステロール経路には、多数の段階が関与する。酵母ステロール経路のダイアグラムを図14に示し、それを参照して、下で先行技術を考察する。
本発明に従って、酵素コレステロールC25−ヒドロキシラーゼ(その基質は常態ではコレステロールである)は、7−デヒドロコレステロールおよびエルゴステロールに作用して、それぞれ25−ヒドロキシ−7−デヒドロコレステロールおよび25−ヒドロキシエルゴステロールを生成し得ることが分かった。
TDH3pは、TDH3(S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)からのグリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素イソ酵素3)のプロモーター領域であり;
Ori−pBRは、大腸菌(E.coli)のpBR322からのColE1複製起点であり;
blaは、大腸菌(E.coli)中でアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子であり;
2μは、S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)の複製起点を保有する2μ多コピー型ベクターの大型断片であり;
PGK1tは、PGK1(S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)からの3−ホスホグリセリン酸キナーゼ)のターミネーター領域であり;
URA3は、ウラシルに対するS.セレヴィシエ(S.cerevisiae)URA3栄養要求性マーカーであり;
Bam HI、Eco RI、Hin dIII、Bgl II、Age Iは、対応する制限酵素の制限部位を指し;
ベクター上の部位の位置は、ユニークなBam HI部位の1位から始まる括弧によって示される。
本明細書および請求の範囲の全体を通じて、以下の定義が適用される。
したがって本発明の一態様は、7−デヒドロコレステロールまたはエルゴステロールをコレステロールC25−ヒドロキシラーゼに接触させるステップと、25−ヒドロキシ−7−デヒドロコレステロールまたは25−ヒドロキシエルゴステロールを得るステップを含んでなる、酵母細胞中で25−ヒドロキシ−7−デヒドロコレステロールまたは25−ヒドロキシエルゴステロールを生成する方法である。好適には、コレステロールC25−ヒドロキシラーゼは脊椎動物起源であり、より好適にはラット、ブタ、イヌ、ウマ、ヒト、チンパンジー、アガゲザル(Macaca mulatta)(Macaca mulata)、マウス、ニワトリ(Gallus gallus)、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)またはカモノハシ(Ornithorhynchus anatinus)(Ornithorynchus anatinus)からの酵素である。さらに機能する能力を保持しさえすれば、これらの天然酵素の誘導体、すなわちアミノ酸配列が天然酵素ともはや同一でないものを使用してもよい。例えば、本発明は、天然脊椎動物C25−ヒドロキシラーゼと、少なくとも90%の同一性、好適には少なくとも95%の同一性、より好適には少なくとも99%の同一性を有する酵素の使用を包含するが、ただし誘導体酵素はその機能性を保持する。
C25H1(ブタヒドロキシラーゼをベースとする;配列番号.5)、
C25H3(イヌヒドロキシラーゼをベースとする:配列番号8)
Ecab_HYまたはEcab25OH_opt2.0(ウマヒドロキシラーゼをベースとする:配列番号25および26)
ConHYD opt 20(配列番号30)
Rnor HY(ラットヒドロキシラーゼをベースとする:配列番号23)
Sscr HY(配列番号28)
Sscr opt 20(配列番号27)
Sscr Pompon(配列番号5)
本発明の別の態様は、ステロールΔ24−還元酵素をコードする新規核酸であり、それは酵母によって発現され得て、ラノステロール、ジメチルチモステロール、メチルチモステロール、チモステロール、コレスタ−7,24−ジエノールまたはコレスタ−5,7,24−トリエノールからなる群から選択される基質を3β−ヒドロキシ−8−ラノスタ−8−エン、4,4−ジメチル−コレスタ−8−エノール、4α−メチル−コレスタ−8−エノール、コレスタ−8−エノール、ラソステロールおよび7−デヒドロコレステロールからなる群から選択される生成物に変換し得るが、ただし核酸配列はヒト核酸配列でもマウス核酸配列でもない。
ラノステロールを3β−ヒドロキシ−8−ラノスタ−8−エンに、またはジメチルチモステロールを4,4−ジメチル−コレスタ−8−エノールに;
メチルチモステロールを4α−メチル−コレスタ−8−エノールに;
チモステロールをコレスタ−8−エノールに;
コレスタ−7,24−ジエノールをラソステロールに;または
コレスタ−5,7,24−トリエノールを7−デヒドロコレステロール)に変換し得るように、機能性ステロールΔ24−還元酵素をコードし;
酵素をコードする核酸は、ストリンジェントな条件下でS24R1またはS24R2とハイブリダイズし得るが、ただし脊椎動物核酸配列はヒトから単離された拡散配列でもマウスから単離された核酸配列でもない。
および配列番号2または4と少なくとも90%、および好適には95%の同一性を示すもの、および酵母細胞環境内で、
ラノステロールを3β−ヒドロキシ−8−ラノスタ−8−エンに、
ジメチルチモステロールを4,4−ジメチル−コレスタ−8−エノールに、
メチルチモステロールを4α−メチル−コレスタ−8−エノールに、
チモステロールをコレスタ−8−エノールに、
コレスタ−7,24−ジエノールをラソステロール、または
コレスタ−5,7,24−トリエノールを7−デヒドロコレステロールに
変換できるものである。
ラノステロールを3β−ヒドロキシ−8−ラノスタ−8−エンに、
ジメチルチモステロールを4,4−ジメチル−コレスタ−8−エノールに、
メチルチモステロールを4α−メチル−コレスタ−8−エノールに、
チモステロールをコレスタ−8−エノールに、
コレスタ−7,24−ジエノールをラソステロールに、または
コレスタ−5,7,24−トリエノールを7−デヒドロコレステロールに変換する。この方法では、核酸は、好適にはS24R1、S24R2であり、またはストリンジェントな条件下でS24R1またはS24R2とハイブリダイズし得る核酸であるが、ただし脊椎動物核酸配列はヒト核酸配列でもマウス核酸配列でもない。
C25−ヒドロキシラーゼまたはステロールΔ24還元酵素をコードする本発明の遺伝子コンストラクトは全て、典型的には、関心のある遺伝子を制御する、ADH1プロモーター、TEF1プロモーター、酵母GPD(TDH3)プロモーター、酵母HXT7プロモーター、酵母GALl/10プロモーターまたは酵母PGK1プロモーターなどの標準法を使用して制御し得る、既知のプロモーター制御下にある外来遺伝子を一般的に有する、発現カセットの一部である。さらに発現カセットは、上述の遺伝子の少なくとも1つのコード配列と作動可能なように結合している、ターミネーター配列および/または他の調節要素などの上流および下流配列を含んでなってもよい。本発明の遺伝子コンストラクトを保有するベクターは、従来の方法を用いて酵母に導入される。
参考文献の完全な一覧は実施例の終わりに記載した。全ての参考文献は、参照によって本明細書に援用する。
[異なる生物からのΔ24(25)−ステロール還元酵素の選択および合成遺伝子設計]
ステロールΔ24−還元酵素は、コレステロール生合成の最終段階の1つを触媒する。それはかなり非特異的酵素であり、基質として少なくともチモステロールおよびデスモステロールを受け入れる。2004年には、対応する遺伝子がヒトで同定された(Waterman HRら,2001年)。ヒトおよびマウスからの遺伝子産物についてのみ、ステロールΔ24−還元酵素活性が正式に(formally)立証されている(Crameri Aら、2006年;国際公開第03/064650号パンフレット)。ラットからの相同遺伝子の匹敵する機能についてもまた記載されるが(Wu C.ら 2004年: Nature 432 (7017):640−5)、遺伝子産物の酵素活性は確認されていない。
配列番号1
配列番号3
[ヒト(Homo sapiens)からのコレステロールC25−ヒドロキシラーゼアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列の選択、およびS.セレヴィシエ(S.cerevisiae)中での発現について最適化された代案のDNA配列の計算]
ヒト(H.sapiens)およびハツカネズミ(M.musculus)遺伝子産物について、コレステロールC25−ヒドロキシラーゼ活性が示されている(Lundら,1998年;米国特許第6562609号明細書)。ヒトコレステロールC25−ヒドロキシラーゼと相同的な酵素についてのGENBANKまたはEMBLなどの公共データベースの検索は、標準条件下で、公的に入手可能なプログラムBLASTpを用いて実施した。見つかった配列間で、ヒト(H.sapiens)アミノ酸配列と82%のアミノ酸同一性、ハツカネズミ(M.musculus)配列と79%のアミノ酸同一性を示すイノシシ(S.scrofa)配列(表2)、およびヒトおよびマウス配列と70%のアミノ酸同一性を示すイヌ(C.familiaris)配列(表4)をさらなる調査のために選択した。
配列番号5
配列番号7
配列番号8
[発現プラスミドV51TDH−S24R1の構築]
発現ベクターは、Sambrookら(1989年)によって記載されるような古典的分子生物学技術を使用して構築され、DNA制限酵素および修飾酵素は、供給元(New England Biolabs,Ipswich,MA 01938−2723,USA)が推奨するようにして(as recommender)使用された。
[発現プラスミドV51TDH−S24R2の構築]
S24R2の構成的発現のためのV51TDH−S24R2ベクター(実施例1参照)は、基本的に、実施例3で既に述べたようにして構築された。Bam HIおよびEco RIで制限酵素消化されたV51TDHベクターに、合成遺伝子S24R2の1564bp長さのBam HI−Eco RI制限酵素産物をライゲートした。V51TDH−S24R2の制限酵素地図を図2に示す。
[動原体発現プラスミドpFLAde−S24R1の構築]
酵母動原体および自律複製配列(ARSCEN)およびADE2選択マーカーを保有する空のpFLAde大腸菌(E.coli)/S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)シャトルベクターに、V51TDH−S24R1(実施例3に記載)からのTDH3p−S24R1−PGK1t発現カセットを挿入することにより、遺伝子S24R1の構成的発現のための動原体pFLAde−S24R1ベクター(実施例1参照)を構築した。pFLAdeベクターは、以下のプライマーを使用して、URA3遺伝子をコードするpFL38の1.1kbのBgl II断片(Bonneaudら,1991年)を、酵母ゲノムDNA上でのPCR増幅によって得られるADE2遺伝子をコードする2.7kbのBam HI断片で置換して構築された。
[発現ベクターV51−C25H1の構築]
C25H1からの826bpのBam HI−Eco RI断片をV51に挿入し、Bam HIおよびEco RIで消化して、C25H1(実施例2参照)のガラクトース誘導性発現のためのV51−C25H1プラスミドを構築した。得られたV51−C25H1発現プラスミドは、ガラクトース誘導性GAL10−CYC1ハイブリッドプロモーター(Guarenteら,1982年)およびPGK1ターミネーターの制御下にある合成遺伝子C25H1をコードする。V51−C25H1の制限酵素地図を図4に示す。
[発現ベクターV51−C25H3の構築]
合成遺伝子C25H3(実施例2参照)のガラクトース誘導性発現のためのV51−C25H3ベクターは、実施例6に既に記載したようにして、Bam HIおよびEco RIで消化されたV51に、合成遺伝子C25H3の826bpのBam HI−Eco RI断片を挿入して構築した。得られた発現プラスミドV51−C25H3は、ガラクトース誘導性GAL10−CYC1ハイブリッドプロモーターおよびPGK1ターミネーターの制御下にある、C25H3をコードする。V51−C25H3の制限酵素地図を図5に示す。
[酵母株形質転換およびステロール抽出]
上述の異なる発現プラスミドによって、W303−1B株(MATalpha;ura3−52;trp1−1;leu2−3,112;his3−11;ade2−1;can1−100;ThomasおよびRothstein,1989年)、およびそのerg6変異体ERT(MATalpha;erg6::TRP1;ura3−52;trp1−1;leu2−3,112;his3−11;ade2−1;can1−100)を形質転換した。ERT株のERG6の不活性化は、ERG6に機能性TRP1遺伝子を挿入して得られた。pFL45からのTRP1遺伝子(Bonneaudら,1991年)は、ERG6配列が隣接するTRP1プライマーを使用して、PCRによって増幅した。プライマーの配列は以下のとおりである。
ERGTRP−1:
[UVおよび質量分析検出を用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるステロール分析]
通常30μLである、実施例8に記載されるようにして調製されたステロール抽出物のアリコートを、UVおよび質量分析検出によってモニターされる逆相HPLCによって分析した。「Waters Alliance HT 2790」HPLCは、「Waters PDA 996」タイプからの光ダイオードアレーUV検出器に、そして質量検出器「Waters MicroMass ZQ」(Waters,Milford,MA01757,USA)に接続されていた。分離は、XTerra RP18 3.5μm 4.6×100mmカラム(Waters,Milford,MA01757,USA)上で、水/アセトニトリル勾配を含有する直線的0.03%(v/v)ギ酸を用いて、60℃で実施した。80%の緩衝液A(0.03%ギ酸添加水)と20%の緩衝液B(0.03%のギ酸添加アセトニトリル)とを含有する緩衝液で、カラムを安定化させた後に、サンプルを注入した。最初の5分間、緩衝液組成を80%の緩衝液Aおよび20%の緩衝液Bから、25%の緩衝液Aおよび75%の緩衝液Bに徐々に変化させた。次の15分間、緩衝液組成を25%の緩衝液Aおよび75%の緩衝液Bから、12.5%の緩衝液Aおよび87.5%の緩衝液Bに徐々に変化させた。最後の数分で、分離プロトコル100%の緩衝液Bに達した。この値を2分間保って、カラムを再生させた。
[ERG6−欠損S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)ERT株中におけるプラスミドV51TDH−S24R1からのS24R1遺伝子の発現]
プラスミドV51TDH−S24R1(実施例3参照)および対照として空ベクターV51TDHをリチウム−PEG技術(Gietzら,1995年)によって、ERT株に形質転換した。形質転換体をウラシルを含まない定義された最少培地上で選択した。各形質転換からの4つの独立した形質転換体をプラスミドの存在について分析した。確認された形質転換体の1つを無作為に選択し、それぞれERT/V51TDHおよびERT/V51TDH−S24R1と命名して、さらなる分析のために使用した。
[S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)ERT株中におけるプラスミドV51TDH−S24R2からの遺伝子S24R2の発現]
リチウム−PEGプロトコル(Gietzら,1995年)を使用して、S24R2を構成的に発現するプラスミドV51TDH−S24R2(実施例3)をERT株に形質転換する。形質転換体をウラシルを含まない最少培地上で選択した。4つの独立した形質転換体が分析され、同一諸特性を示した。それらの1つをERT/V51TDH−S24R2と命名し、さらなる分析のために使用した。
[S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)ERT株中における動原体プラスミドpFLAde−S24R1からの遺伝子S24R1の発現]
リチウム−PEG手順(Gietzら,1995年)を使用して、S24R1遺伝子の構成的発現のための動原体プラスミドpFLAde−S24R1(実施例5)をERT株に形質転換した。形質転換体をアデニンを含まない規定培地上で選択した。4つの独立した形質転換体をプラスミドpFLAde−S24R1の発生と、それらのステロールパターンについて分析した。それらの1つを無作為に選択してERT/pFLAde−S24R1と命名し、結果のさらなる例証のために使用した。
[S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)ERT株中における遺伝子S24R1およびC25H1の同時発現による25−ヒドロキシ−7−デヒドロコレステロールアセテートの生成]
リチウム−PEG法(Gietzら,1995)によって、遺伝子C25H1のガラクトース誘導性発現のためのプラスミドV51−C25H1(実施例6)、および対照としてのプラスミドV51を(実施例12に記載されるようにして)ERT株/pFLAde−S24R1に形質転換した。V51−C25H1およびpFLAde−S24R1は、適合性プラスミドである。それらの異なる2μおよびARS−CEN起源は、酵母中でそれらが同時発生できるようにする。形質転換体をウラシルおよびアデニンを含まない最少培地上で選択した。各形質転換からの4つの独立した形質転換体が分析され、同一諸特性を示した。各形質転換から1つの形質転換体を無作為に選択し、それぞれERT/pFLAde−S24R1/V51−C25H1およびERT/pFLAde−S24R1/V51と命名し、さらなる分析のために使用した。
[S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)ERT株中におけるS24R1およびC25H3の同時発現による25−ヒドロキシ−7−デヒドロコレステロールアセテートの生成]
リチウム−PEG法(Gietzら,1995年)によって、遺伝子C25H3のガラクトース誘導性発現のために構築されたV51−C25H3(実施例7)をERT/pFLAde−S24R1株(実施例13参照)に形質転換した。形質転換体をウラシルおよびアデニンを含まない最少培地上で選択した。双方のプラスミドの発生確認のために、4つの独立した形質転換体を分析した。それらの1つを無作為に選択してERT/pFLAde−S24R1/V51−C25H3と命名し、さらなる研究のために使用した。
[S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)W303−1B株およびBY4742株中におけるC25H1発現による25−ヒドロキシ−エルゴステロールアセテートの生成]
リチウム−PEG法(Gietzら,1995年)によって、遺伝子C25H1のガラクトース誘導性発現のために構築されたプラスミドV51−C25H1(実施例6)、および対照としての空ベクターV51をW303−1B株(実施例8に記載)に形質転換した。形質転換体をウラシルを含まない最少培地上で選択した。各形質転換からの4つの独立した形質転換体をプラスミドの発生について分析した。各形質転換から1つの陽性形質転換体を無作為に選択して、それぞれW303/V51−C25H1およびW303/V51と命名し、さらなる研究のために使用した。
[S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)W303−1B株中における遺伝子C25H3の発現による25−ヒドロキシ−エルゴステロールアセテートの生成]
リチウム−PEG法(Gietzら,1995年)を使用して、合成遺伝子C25H3のガラクトース誘導性発現のために構築されたプラスミドV51−C25H3(実施例7)をW303−1B株(実施例8に記載)に形質転換した。形質転換体をウラシルを含まない最少培地上で選択した。4つの独立した形質転換体をV51−C25H3の発生について分析した。1つの陽性形質転換体をW303/V51−C25H3と命名し、生成されるステロールのさらなる研究のために使用した。
[主にコレスタ−5,7,24−トリエノールを産生する酵母株へのC25H1およびC25H3の導入]
リチウム−PEG法(Gietzら,1995年)を用いて、遺伝子C25H1およびC25H3のガラクトース誘導性発現のためのプラスミドV51−C25H1(実施例6)およびプラスミドV51−CH25H3(実施例7)、および対照としてのプラスミドV51をERT erg5 erg6株(実施例12に記載;ERG5は遺伝子URA3の組み込みによって不活性化されていた)に形質転換した。形質転換体をウラシルおよびアデニンを含まない最少培地上で選択した。各形質転換からの4つの独立した形質転換体が分析され、同一諸特性を示した。各形質転換からの1形質転換体を無作為に選択して、それぞれERT erg5 erg6/V51−C25H1、ERT erg5 erg6/V51−C25H3、およびERT erg5 erg6/V51と命名し、さらなる分析のために使用した。
[追加的コレステロール25−ヒドロキシラーゼ遺伝子の選択]
イノシシ(S.scrofa)およびイヌ(C.familiaris)(Canis lupus)、からの選択された推定上のコレステロール25−ヒドロキシラーゼ遺伝子に加えて、ドブネズミ(R.norvegicus)(配列番号21、Genebank登録番号NP_001020586、XP_220063)、チンパンジー(P.troglodytes)(配列番号18、遺伝子bank登録番号XP_507901)、およびウマ(E.caballus)(配列番号24、Genebank登録番号XP_001503057)からの相同遺伝子もまたより詳細に調べた。
配列番号18:チンパンジー(P.troglodytes)からの推定上のコレステロール25−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列。
配列番号19:DNA配列チンパンジー(P.troglodytes)CH25OH_opt 2.0
配列番号20:チンパンジー(P.troglodytes)CH25OH_HYのDNA配列
配列番号21:ドブネズミ(R.norvegicus)からの推定上のコレステロール25−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列
配列番号22:ドブネズミ(R.norvegicus)CH25OH_opt 2.0のDNA配列
配列番号23:ドブネズミ(R.norvegicus)CH25OH_HYのDNA配列
配列番号24:ウマ(E.caballus)からの推定上のコレステロール25−ヒドロキシラーゼのアミノ酸配列
配列番号25:ウマ(E.caballus)CH25OH_opt 2.0のDNA配列
配列番号26:ウマ(E.caballus)CH25OH_HYのDNA配列
配列番号27:イノシシ(S.scrofa)CH25OH_opt 2.0のDNA配列
配列番号28:イノシシ(S.scrofa)CH25OH_HYのDNA配列
配列番号29:ConHyDのアミノ酸配列
配列番号30:ConHyD_opt 2.0のDNA配列
配列番号31:ConHyD_HYのDNA配列
[ERG6に組み込まれた発現コンストラクトからの新しい25−ヒドロキシラーゼ遺伝子の発現]
実施例18に示す新しい遺伝子をS.セレヴィシエ(S.cerevisiae)SC0554(erg5、erg6、TRP1−pARC300D、URA3−pARC304S、ARE1::TDH3p−S24R2−PGKt−URA3;2つのプラスミドに関する説明は米国特許第5,460,949号明細書を参照されたい)のERG6遺伝子座に組み込んだ。
S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)Ecab HY(配列番号26の遺伝子を有する組み込みコンストラクト)、
Ecab opt 2.0(配列番号25の遺伝子を有する組み込みコンストラクト)、
Ptro opt 2.0(配列番号19の遺伝子を有する組み込みコンストラクト)、
Ptro HY(配列番号20の遺伝子を有する組み込みコンストラクト)、
ConHyD HY(配列番号31の遺伝子を有する組み込みコンストラクト)、
ConHyD opt 2.0(配列番号30の遺伝子を有する組み込みコンストラクト)、
Rnor HY(配列番号23の遺伝子を有する組み込みコンストラクト)、
Rnor opt 2.0(配列番号22の遺伝子を有する組み込みコンストラクト)、
Sscr HY(配列番号28の遺伝子を有する組み込みコンストラクト)、
Sscr opt 2.0(配列番号27の遺伝子を有する組み込みコンストラクト)、および
実施例2に記載されるようにして最適化されたブタからの25−ヒドロキシラーゼを保有するScr Pompon。
[新しいHyDHC株の振盪フラスコアッセイ]
実施例19に記載されるようにして作成された株を震盪フラスコ内で培養し、新たに設計された推定上の25−ヒドロキシラーゼ遺伝子の過剰発現効果を評価した。20mlのKapelli培地(実施例1)に接種するために、4mlのYPD培地中の一晩培養物を使用した。24および48時間培養した後に10g/Lのグルコース、32および56時間後に20g/Lのグルコースを供給した。72時間の培養時間後、細胞を遠沈して鹸化し、実施例9に記載されるようにしてステロール含量を測定した。図15に示すように、全ての新しいヒドロキシラーゼ遺伝子は、S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)中で発現され、効率は様々であったが、遺伝子産物は全て7−DHCをHyDHCにヒドロキシル化できた。
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Claims (13)
- コレステロールC25−ヒドロキシラーゼまたはコレステロールC25−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含んでなる酵母。
- 25−ヒドロキシ−7−デヒドロコレステロールまたは25−ヒドロキシエルゴステロールをそれぞれ生成するための、7−デヒドロコレステロールまたはエルゴステロールをヒドロキシル化するコレステロールC25−ヒドロキシラーゼの使用。
- 前記生成が酵母細胞中で起きる、請求項2に記載の使用。
- 前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア属(Pichia)種、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)(Klyuveromyces)種、ハンゼヌラ(Hansenula)種、分裂酵母(Schizosaccharomyces)種、およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)からなる群から選択される、請求項2または3に記載の使用。
- a)7−デヒドロコレステロールを前記酵母によって産生されるコレステロールC25−ヒドロキシラーゼに接触させることで、25−ヒドロキシ−7−デヒドロコレステロールが生成するステップ
を含んでなる、25−ヒドロキシ−7−デヒドロコレステロールを遺伝子改変酵母中で生成する方法。 - 前記酵母が活性Erg5pおよびErg6p酵素を有さず、前記酵母がステロールΔ24−還元酵素もまた発現する、請求項5に記載の方法。
- 前記酵母がHMG1の切断型を発現する、請求項5または6に記載の方法。
- ステップa)に先だって、コレスタ−5,7,24−トリエノールを機能性ステロールΔ24−還元酵素をコードする核酸配列を含んでなる酵母に接触させることで、前記酵母がラノステロール、ジメチルチモステロール、メチルチモステロール、チモステロール、コレスタ−7,24−ジエノール、またはコレスタ−5,7,24−トリエノールをそれぞれ3β−ヒドロキシ−8−ラノスタ−8−エン、4,4−ジメチル−コレスタ−8−エノール、4α−メチル−コレスタ−8−エノール、コレスタ−8−エノール、ラソステロールまたは7−デヒドロコレステロールに変換するステップをさらに含んでなる、請求項5に記載の方法。
- a)前記酵母によって産生されるエルゴステロールを前記酵母によって産生されるコレステロールC25−ヒドロキシラーゼに接触させることで、25−ヒドロキシエルゴステロールが生成するステップ
を含んでなる、遺伝子改変酵母中で25−ヒドロキシエルゴステロール(25−ヒドロキシプロビタミンD2)を生成する方法。 - 前記酵母がHMG1の切断型を過剰発現する、請求項9に記載の方法。
- コレステロールC25−ヒドロキシラーゼをコードする、単離された核酸。
- コレステロールC25−ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含んでなる、ベクター。
- ステロールΔ24−還元酵素をコードし、酵母によって発現され得て、ラノステロール、ジメチルチモステロール、メチルチモステロール、チモステロール、コレスタ−7,24−ジエノール、またはコレスタ−5,7,24−トリエノールを3β−ヒドロキシ−8−ラノスタ−8−エン、4,4−ジメチル−コレスタ−8−エノール、4α−メチル−コレスタ−8−エノール、コレスタ−8−エノール、ラソステロールまたは7−デヒドロコレステロールに変換し得る単離された核酸であるが、ただし核酸配列がヒト核酸配列でもマウス核酸配列でもない、単離された核酸。
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