JP2021158992A

JP2021158992A - 微生物由来トリテルペン酸化酵素を用いたグリチルレチン酸の製造方法

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Publication number: JP2021158992A
Application number: JP2020064237A
Authority: JP
Inventors: 靖也藤田; Yasuya Fujita; 建偉唐; Keni Kara; 和季斉藤; Kazusue Saito; 俊哉村中; Toshiya Muranaka; 光關; Hikari Seki; 康平宮奥; Kohei Miyaoku; 剛阪本; Takeshi Sakamoto
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Osaka University NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Osaka University NUC; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2021-10-11
Anticipated expiration: 2040-03-31
Also published as: JP7493175B2

Abstract

【課題】本発明は、グリチルレチン酸を安価にかつ効率的に製造することができる新たな手法を提供することを目的とする。【解決手段】麹菌のチトクロームＰ４５０を１１−オキソ−β−アミリンに作用させる工程を含む、グリチルレチン酸の製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、麹菌由来のトリテルペン酸化酵素を利用したグリチルレチン酸の製造方法に関する。

グリチルレチン酸やグリチルリチン酸は、抗炎症作用や美白作用といった産業上有用な生理活性を有することが知られており、様々な薬剤や化粧品等において利用されている。グリチルリチン酸は、マメ科植物である甘草の根（甘草根）からアルコール含有水溶液等で抽出・精製することができる。また、グリチルレチン酸は、グリチルリチン酸を硫酸等の強酸で、又は微生物の酵素で加水分解することにより製造することができる（特許文献１、非特許文献１）。

しかし、原料となる甘草の生産が不安定であること、甘草根には不純物が多いためグリチルリチン酸の抽出及び精製が容易ではないこと、ならびに、グリチルリチン酸からグリチルレチン酸への加水分解において、強酸条件による副産物の発生や、微生物由来の酵素を用いることによる夾雑物の混入等、様々な課題を有しており、グリチルリチン酸やグリチルレチン酸を安価に効率よく製造することは容易ではなかった。

このような課題を解決する手法として、グリチルレチン酸の生合成経路に関与し、オレアナン型トリテルペンを酸化する活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入された微生物を用いてグリチルレチン酸を製造する方法が開発・報告されている（特許文献２）。

図１に模式的に示すとおり、グリチルレチン酸の生合成の過程は、〈１〉２，３−オキシドスクアレンを開環しβ−アミリンを生成する工程、〈２〉β−アミリンの１１位の炭素を酸化して、１１−オキソ−β−アミリンを生成する工程、〈３〉（ｉ）１１−オキソ−β−アミリンの３０位の炭素を酸化して３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンを生成する工程、（ｉｉ）３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンの３０位を酸化してグリチルレトアルデヒドを生成する工程、（ｉｉｉ）グリチルレトアルデヒドの３０位を酸化してグリチルレチン酸を生成する工程、を包含する。

特許文献２には、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来のβ−アミリン合成酵素（上記〈１〉の工程の反応を触媒する）、ならびに、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓ）由来のβ−アミリン１１位酸化酵素（上記〈２〉の工程の反応を触媒する）とβ−アミリン３０位酸化酵素（上記〈３〉の工程の反応を触媒する）をコードする遺伝子が導入された形質転換酵母が開示されており、この酵母ではβ−アミリン合成酵素及びβ−アミリン１１位酸化酵素により１１−オキソ−β−アミリンを生じ、これよりβ−アミリン３０位酸化酵素がグリチルレチン酸及びその異性体である２０−エピ−グリチルレチン酸を生成したことが記載されている。

しかしながら、このような形質転換酵母におけるグリチルレチン酸の蓄積量は高くなく、また、その量は生合成中間体（β−アミリン、１１−オキソ−β−アミリン、３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン、グリチルレトアルデヒド及び３０−ヒドロキシ−β−アミリン）や本来酵母が生産するエルゴステロールの蓄積量に基づいて推定される量と比べて低いものであった。

したがって、当該分野においては依然として、グリチルリチン酸やグリチルレチン酸を安価にかつ効率的に製造することができる新たな手法が切望されていた。

中国特許出願公開第１０１６０７９８０号公報ＷＯ２０１０／０２４４３７

Ｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．４，ｐｐ．４２１−４２５

本発明は、グリチルレチン酸を安価にかつ効率的に製造することができる新たな手法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ由来のチトクロームＰ４５０がオレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有することを見出した。そして、当該酵素を導入して作製した形質転換体を利用してグリチルレチン酸を製造できること、また当該形質転換体を利用することによってグリチルレチン酸の高い蓄積が得られる一方で、２０−エピ−グリチルレチン酸といった夾雑物の蓄積は極めて少ないことを見出した。

本発明はこれらの知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチド、
を１１−オキソ−β−アミリンに作用させる工程を含む、グリチルレチン酸の製造方法。
［２］細胞内で行なう、［１］の製造方法。
［３］前記細胞が、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドを発現する形質転換体である、［２］の製造方法。
［４］前記細胞が、さらに、β−アミリン合成酵素、及び／又は、オレアナン型トリテルペン１１位酸化酵素を発現する形質転換体である、［３］の製造方法。
［５］前記形質転換体の宿主が微生物である、［３］又は［４］の製造方法。
［６］以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチド、
を発現する、グリチルレチン酸産生能を有する形質転換体。
［７］さらに、β−アミリン合成酵素、及び／又は、オレアナン型トリテルペン１１位酸化酵素を発現する、［６］の形質転換体。
［８］前記形質転換体の宿主が微生物である、［６］又は［７］の形質転換体。

本発明によれば、グリチルレチン酸を安価にかつ効率的に製造することができる。

図１は、グリチルレチン酸の生合成の過程を模式的に示す。図２は、下記試料のＴＭＳ化物のＧＣ−ＭＳ分析のトータルイオンクロマトグラムを示す。（Ａ）ＣＹＰ５１０６Ａ１を発現する酵母株と１１−オキソ−β−アミリンを接触させた反応から抽出した試料；矢印は３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン（１３．０分）、及び、グリチルレチン酸（１４．３分）のピークを示す。（Ｂ）ＣＹＰ５１０６Ａ１を発現しない酵母株と１１−オキソ−β−アミリンを接触させた反応から抽出した試料。（Ｃ）３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン。（Ｄ）グリチルレチン酸。図３は、下記試料のＴＭＳ化物のＧＣ−ＭＳ分析のトータルイオンクロマトグラムの下記ピーク付近のマススペクトルを示す。（Ａ）ＣＹＰ５１０６Ａ１を発現する酵母株と１１−オキソ−β−アミリンを接触させた反応から抽出した試料；１３．０分付近ピーク。（Ｂ）ＣＹＰ５１０６Ａ１を発現する酵母株と１１−オキソ−β−アミリンを接触させた反応から抽出した試料；１４．３分付近ピーク。（Ｃ）３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン；１３．０分付近ピーク。（Ｄ）グリチルレチン酸；１４．３分付近ピーク。図４は、ＣＹＰ５１０６Ａ１のアミノ酸配列（配列番号１）とＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇのアミノ酸配列（配列番号１３５）とＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）のアミノ酸配列（配列番号１３６）との配列アライメントの結果を示す。図５は、形質転換酵母ＹＪＴ１７７株及びＹＪＴ２０１株における、２９−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン及び２０−エピ−グリチルレチン酸について、ＧＣ保持時間の測定結果を示す。各ピークはそれぞれ以下を示す：（１）：β−アミリン；ＯＡ：オレアノール酸（内部標準）；（２）：１１−オキソ−β−アミリン；（３）：３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−ｂ−アミリン；（４）：２９−ヒドロキシ−１１−オキソ−ｂ−アミリン；ＧＡ：グリチルレチン酸；（６）：２０−エピ―グリチルレチン酸。

本発明において利用される「ポリペプチド」は、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチドである。「オレアナン型トリテルペン」とは、５環性のオレアナン骨格を有し、６個のイソプレン単位からなるＣ３０のイソプレノイドを意味する。このようなオレアナン型トリテルペンとしては、例えば、オレアノール酸、ヘデラゲニン、β−アミリン、カメリアゲニン、ソヤサポゲノール、サイコゲニン、１１−オキソ−β−アミリン、３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン、グリチルレトアルデヒド等が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明において、「オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性」とは、特に、１１−オキソ−β−アミリンの３０位の炭素を酸化して３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンを生成する反応を触媒する活性、３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンの３０位を酸化してグリチルレトアルデヒドを生成する反応を触媒する活性、及びグリチルレトアルデヒドの３０位を酸化してグリチルレチン酸を生成する反応を触媒する活性からなる群から選択される一以上、好ましくは全ての活性を意味する。

本発明において利用される「ポリペプチド」は、上記活性を有するポリペプチドであればよく、特に限定はされないが、例えば、チトクロームＰ４５０に属するポリペプチドを利用することができる。チトクロームＰ４５０（「シトクロムＰ４５０」、「ＣＹＰ」とも称される）とは、薬物代謝酵素として知られる一群の還元型プロトヘム含有タンパク質酵素をいう。この酵素は、適切な電子伝達体タンパク質（本酵素の場合は、ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０還元酵素またはチトクロームｂ５を利用する）を介してもたらされるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ等の電子供与体に由来する電子と酸素を用いて基質に一酸素原子を結合させ、同時に水を発生させる一原子酸素添加反応を触媒する。本発明においては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する微生物に由来するチトクロームＰ４５０を利用することができる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する微生物としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｍｉｎｉｓｃｌｅｒｏｔｉｇｅｎｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｏｂｏｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｅｒｇｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｒａｎｓｍｏｔａｎｅｎｓｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｒａｃｈｉｄｏｃｏｌａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｐｓｅｕｄｏｔａｍａｒｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｐｓｅｕｄｏｃａｅｌａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃａｅｌａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔａｍａｒｉｉ等が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明において利用される上記「ポリペプチド」は、具体的には以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドとして特定することができる。

（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなるポリペプチド。
本ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列で示される麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅに由来するチトクロームＰ４５０の一分子種である「ＣＹＰ５１０６Ａ１」（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＪ０４４６７．１にて登録されている）に相当する。

（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなり、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチド。

ここで「１もしくは数個」とは、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個を意味する。（ｂ）のポリペプチドには、例えば、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有する、（ａ）に示すＣＹＰ５１０６Ａ１のアミノ酸置換、欠失、もしくは付加変異体等が含まれる（これらに限定はされない）。

（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなり、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチド。

ここで「配列同一性」とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の全長に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、よりさらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、とりわけ好ましくは９９％以上の配列同一性を示すことを意味する。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のプログラムを用いて求めることができる。（ｃ）のポリペプチドには、例えば、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有する、（ａ）に示すＣＹＰ５１０６Ａ１の他生物種に由来するオルソログ等が含まれる（これらに限定はされない）。

なお、上記（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１３０〜１４２番目のアミノ酸残基に対応する配列領域にはアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加等の変異は含まれないことが好ましい。当該領域に変異が含まれる場合、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性の低下、又は欠失を生じる場合がある。「対応する配列領域」は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のプログラムを用いた配列アライメントにより同定することができる。

また、本発明において利用される「ポリペプチド」には、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有する限り、前記（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドの断片であってもよい。ここで「ポリペプチドの断片」とは、上記（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドにおいて少なくとも５０、１００、２００、３００、又は４００アミノ酸の連続する領域を意味する。

本発明のポリペプチドは、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する微生物から従来公知の方法を用いて取得されたものであってもよいし、あるいは、公知の化学合成法によって合成されたものであってもよく、あるいは、従来公知の遺伝子組換え技術に準じて、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて作製された形質転換体により生合成されたものであってもよい。

特に、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドは、（ａ）のポリペプチドに従来公知の手法を用いて変異を導入することによって得ることができる。変異を導入する方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法、部位特異的突然変異誘発法、市販の変異導入用キット（例えば、Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴａＫａＲａ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴａＫａＲａ社））、ＬＡＰＣＲｉｎｖｉｔｒｏＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット（ＴａＫａＲａ社）等を用いた変異導入法、突然変異誘発剤（例えば、メタンスルホン酸エチル、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等のアルキル化剤）を利用する方法、紫外線を照射する方法等が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明においては、上記のポリペプチドを１１−オキソ−β−アミリンに作用させることにより、グリチルレチン酸を製造することができる。

上記のポリペプチドを１１−オキソ−β−アミリンに作用させて行うグリチルレチン酸の製造は、インビトロにて、又は細胞内にて行うことができる。インビトロで行う場合には、前記ポリペプチドを、適当な反応液内で１１−オキソ−β−アミリンと反応させることによって行うことができる。反応液の組成は、ＮＡＤＰＨ等の電子供与体、電子伝達体タンパク質等を有し、ｐＨ、及び塩濃度等が前記ポリペプチドの至適活性条件にあればよく、特に限定されない。本発明において利用可能な「電子伝達体タンパク質」としては、ＮＡＤＰＨを用いて前記ポリペプチドを還元する活性を有するタンパク質であればよく、例えば、ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０還元酵素やチトクロームｂ５等が挙げられる。「電子伝達体タンパク質」には前記活性を有する限り、当該タンパク質の断片も含まれる。電子伝達体タンパク質の由来となる生物種に限定はない。例えば、ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０還元酵素は、植物のＭｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ、微生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等に由来するものを利用することができる。また、チトクロームｂ５は、例えば、植物のＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓ、微生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等に由来するものを利用することができる。

細胞内で作用させる場合には、上記のポリペプチドを適当な宿主（生物又は細胞）に直接付与して、培養することによって行うことができる。あるいは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んで構築した発現ベクターを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体を培養することによって行うことができる。（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればよく、特に限定はされない。例えば、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのポリヌクレオチドが挙げられる。

（ｄ）配列番号２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド。
配列番号２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ由来のＣＹＰ５１０６Ａ１をコードする。

（ｅ）配列番号２に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、前記ポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。

ここで「１もしくは数個」とは、１〜６０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜９個、よりさらに好ましくは３〜６個を意味する。

（ｆ）配列番号２に示す塩基配列に対して８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、前記ポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。

ここで「配列同一性」とは、配列番号２に示す塩基配列の全長に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、よりさらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、とりわけ好ましくは９９％以上の配列同一性を示すことを意味する。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のプログラムを用いて求めることができる。

（ｇ）配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、前記ポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。

ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、１５〜７５０ｍＭ、好ましくは１５〜５００ｍＭ、より好ましくは１５〜３００ｍＭのナトリウム塩の存在下、２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６８℃の温度にてハイブリダイゼーションを行った後、１５〜７５０ｍＭ、好ましくは１５〜５００ｍＭ、より好ましくは１５〜３００ｍＭのナトリウム塩の存在下、５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃の温度にて洗浄する条件をいう。

また、本発明において利用されるポリヌクレオチドは、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチドをコードする限り、前記（ｄ）〜（ｇ）のポリヌクレオチドの断片であってもよい。ここで「ポリヌクレオチドの断片」とは、上記（ｄ）〜（ｇ）のポリヌクレオチドの塩基配列において少なくとも１５０、３００、６００、９００、又は１２００塩基の連続する領域を意味する。このような断片には、上記ポリペプチドの断片をコードするものが含まれる。

また、本発明において利用されるポリヌクレオチドは、スプライシングされる前の塩基配列、すなわちイントロンを含むｍＲＮＡ前駆体に対応する塩基配列を有していてもよい。

本発明において利用されるポリヌクレオチドは、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する微生物のＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーより従来公知の手法により取得されたものであってもよいし、あるいは、化学合成法等の従来公知の核酸配列合成法によって合成されたものであってもよい。

特に、（ｅ）及び（ｆ）のポリヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列に上述の変異を導入する方法で変異を導入することによって得ることができる。

「発現ベクター」は、従来公知の遺伝子組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，（２０１２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を用いて構築することができ、前記ポリヌクレオチドを適当なベクターに導入して得ることができる。ベクターの種類は特に限定されず、従来公知のベクター、例えば、ｐＥＳＣ系、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＴｒｉＥＸＴＭ系等のプラスミドベクターや、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等のウイルスベクター、又はｐＢＩ系等のバイナリーベクター等（これらに限定はされない）より、導入する宿主にて利用可能なものを適宜選択することができる。

発現ベクターには、上記ポリヌクレオチドの他に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の発現調節領域を含めることができ、当該発現調節領域に上記ポリヌクレオチドを作動可能に連結することができる。「作動可能に連結する」とは、当該発現調節領域の制御下において上記ポリヌクレオチドが発現されるように、当該ポリヌクレオチドを配置、連結することを意味する。発現ベクターに含めるプロモーター、エンハンサー、ターミネーターの種類は特に限定されず、導入する宿主に応じて従来公知のものを適宜選択することができる。

例えば、プロモーターとしては、宿主が酵母である場合には、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーター等を利用することができる（これらに限定されない）。宿主が真菌である場合には、ＡＤＨ３プロモーター、ｔｐｉＡプロモーター等を利用することができる（これらに限定されない）。宿主が細菌である場合には、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子若しくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージ・ラムダのＰＲもしくはＰＬプロモーター、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーター等を利用することができる（これらに限定されない）。

エンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエンハンサー等を利用することができる（これらに限定されない）。

ターミネーターとしては、ＴＥＦ１ターミネーター、ＰＧＫ１ターミネーター、ＣＹＣ１ターミネーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、大腸菌リポポリプロテインｌｐｐの３’ターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター、ａｍｙＢターミネーター、ＡＤＨ１遺伝子のターミネーター等を利用することができる（これらに限定されない）。

発現ベクターにはまた、選抜マーカーを含めてもよい。選抜マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、等）、蛍光又は発光レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ））、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）、ジヒドロ葉酸還元酵素等を利用することができる（これらに限定されない）。

発現ベクターの宿主への導入は、従来公知の手法、例えば、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法等により行うことができる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主のゲノムＤＮＡ中に組み込まれて保持もしくは一過的に保持されてもよいし、あるいは、発現ベクターに含まれたままで保持もしくは一過的に保持されてもよい。

本発明において利用可能な「宿主」としては、前記ポリペプチドが当該宿主内で機能可能である、及び／又は、発現ベクターにより導入されたポリヌクレオチドが当該宿主内で発現し前記ポリペプチドを産生可能なものであればよく、特に限定はされない。例えば、宿主は、微生物（酵母、大腸菌、枯草菌、真菌等）、植物、動物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。微生物としては、好ましくは酵母、大腸菌、枯草菌、真菌等の微生物であり、特に好ましくは酵母である。宿主として微生物を利用することで、容易に培養することがき、大量に増殖させることができるため、簡便に、安定的に、かつ安価にて、グリチルレチン酸を製造することができ有効である。植物としては、好ましくはマメ科植物であり、より好ましくはマメ亜科植物である。本発明において「植物」とは、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、それらの培養物、種子を含む。

宿主がオレアナン型トリテルペンを生合成できないものである場合には、β−アミリン及び１１−オキソ−β−アミリンの一又は複数を宿主に直接付与することでグリチルレチン酸を製造できる。あるいは、宿主にオレアナン型トリテルペンの生合成能を付与するために、一以上の適当なオレアナン型トリテルペン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを導入することでグリチルレチン酸を製造できる。これにより、本来オレアナン型トリテルペンを生合成できない生物種又は生物細胞も宿主として選択することができ、グリチルレチン酸の製造を可能とする。

上記「オレアナン型トリテルペン合成酵素」としては、β−アミリン合成酵素（本明細書中、「ＯＳＣ１」と記載する場合がある）、及び、オレアナン型トリテルペン１１位酸化酵素が挙げられる。「ＯＳＣ１」は、２，３−オキシドスクアレンを開環しβ−アミリンを生成する反応を触媒する酵素である。本発明において「ＯＳＣ１」には、前記酵素の活性を保持する限り、前記酵素の断片も含まれる。「オレアナン型トリテルペン１１位酸化酵素」は、β−アミリンの１１位の炭素を酸化して、１１−オキソ−β−アミリンを生成する反応を触媒する酵素（本明細書中、「ＣＹＰ８８Ｄ６」と記載する場合がある）である。本発明において「オレアナン型トリテルペン１１位酸化酵素」には、前記酵素の活性を保持する限り、前記酵素の断片も含まれる。ＯＳＣ１及びオレアナン型トリテルペン１１位酸化酵素は、宿主において発現し、機能することができる限り、任意の生物種に由来するものを利用することができる。したがって、ＯＳＣ１及びオレアナン型トリテルペン１１位酸化酵素は同一の生物種に由来するものであってもよいし、それぞれ異なる生物種に由来するものであってもよい。例えば、本発明においてはマメ科植物（ミヤコグサ属等）由来のＯＳＣ１と、マメ科植物（カンゾウ属等）由来のオレアナン型トリテルペン１１位酸化酵素を利用することができる。

一以上の適当なオレアナン型トリテルペン合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、上記オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチドコードするポリヌクレオチドと同じ発現ベクターに含めて宿主に導入してもよいし、あるいは、それぞれ別々の発現ベクターに含めて宿主に導入してもよい。各ポリヌクレオチドの発現は、それぞれ独立に、又は同調して制御してもよい。独立した発現制御は、例えば、前記ポリヌクレオチドをそれぞれ誘導条件の異なるプロモーターに連結する、又は発現強度の異なるプロモーターに連結することにより達成できる。同調的発現制御は、例えば、それぞれのポリヌクレオチドを同一種のプロモーターに連結することで達成できる。

また、宿主が上記電子伝達体タンパク質を持たない場合は、上記電子伝達体タンパク質を直接付与してもよいし、あるいは、当該電子伝達体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主に導入してもよい。当該電子伝達体タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主において発現し、機能することができる限り、任意の生物種に由来するものを利用することができる。したがって、当該電子伝達体タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０還元酵素をコードするポリヌクレオチド及びチトクロームｂ５をコードするポリヌクレオチドを用いる場合、各ポリヌクレオチドは同一の生物種に由来するものであってもよいし、それぞれ異なる生物種に由来するものであってもよい。電子伝達体タンパク質をコードするポリヌクレオチドの宿主への導入は発現ベクターを用いて行うことができる。電子伝達体タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｃ）をコードするポリヌクレオチドと同一の発現ベクターであってもよいし、異なる発現ベクターであってもよい。各ポリヌクレオチドの発現は、それぞれ独立に、又は同調して制御してもよい。独立した発現制御は、例えば、前記ポリヌクレオチドをそれぞれ誘導条件の異なるプロモーターに連結する、又は発現強度の異なるプロモーターに連結することにより達成できる。同調的発現制御は、例えば、それぞれのポリヌクレオチドを同一種のプロモーターに連結することで達成できる。

宿主又は形質転換体の培養は、用いた宿主に適した条件下にて培養する。培地には、炭素源（例えば、グルコース、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトース、エタノール、酢酸等）、窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機窒素、カゼイン分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等の有機窒素源）、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウム、二リン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等）、ビタミン（ビタミンＢ１等）、薬剤（アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等の抗生物質）等を適宜配合することができる。培地は用いた宿主に適した公知のものを利用することが可能であり、宿主として酵母を使用した場合には、ＹＰＤ培地、ＹＰＭ培地、ＹＰＧ培地、ＹＰＤＭ培地、ＳＭＭ培地等を用いることができる。また、β−アミリン及び１１−オキソ−β−アミリンの一又は複数を宿主に直接付与する場合には、これらの化合物を培地中に含めることによって行ってもよいし、あるいは、β−アミリン及び／又は１１−オキソ−β−アミリンを産生する他の微生物と一緒に培養することによって行ってもよい。

培養は、１０〜５０℃の温度にて、必要に応じて通気、攪拌しながら、数時間〜数日間行うことができる。

培養される宿主又は形質転換体の細胞内において、前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ由来のオレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチドは、１１−オキソ−β−アミリンに作用して３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンを生成し、３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンに作用してグリチルレトアルデヒドを生成し、及び、グリチルレトアルデヒドに作用してグリチルレチン酸を生成する。当該ポリペプチドを利用したグリチルレチン酸の生成反応においては、夾雑物（例えば、２０−エピ−グリチルレチン酸等）の生成を抑えることができ、純度の高いグリチルレチン酸を製造することができる。

培養後、製造されたグリチルレチン酸は、固相抽出、液液分配抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等の分離、精製手段の一又は複数を用いて回収することができる。
以下、本発明を実施例により、更に詳しく説明する。

＜実施例１＞ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＲＩＢ４０由来ＣＹＰ５１０６Ａ１を発現する酵母株の構築
麹菌ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＲＩＢ４０株（ＮＢＲＣ１００９５９）のｍＲＮＡを用いて構築したＣＹＰ５１０６Ａ１遺伝子を含むｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ（Ｎａｚｉｒ，Ｋ．Ｈ．Ｍ．Ｎ．Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９２，３９５−４０８，２０１０）を鋳型として、２種類のプライマーＣＹＰ５１０６Ａ１−Ｆ（ＣＣＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＡＧＣＡＣＴＣＡＴ）（配列番号３）及びＣＹＰ５１０６Ａ１−Ｒ（ＧＧＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＣＧＣＣＣＣＡＣＣＣＡ））（配列番号４）と混合後、ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社）により、９６℃で３分間処理した後、（９６℃、３０秒間→５５℃、２０秒間→７２℃、６０秒間）×４０サイクルからなるＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約１．６ｋｂの増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（キアゲン社）で精製した。このＤＮＡ断片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ社）で処理したのち、ＸｂａＩ（タカラバイオ社）で消化した。得られたＤＮＡ断片を、発現用プラスミドＤＮＡ（Ｎａｚｉｒ，Ｋ．Ｈ．Ｍ．Ｎ．Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７７，３１４７−３１５０，２０１１）をＰｓｈＡＩ（タカラバイオ社）及びＳｐｅＩ（タカラバイオ社）で
線状化して得られたＤＮＡ断片と混合してライゲーション反応を行い、ＧＡＰＤＨプロモーター下流でＣＹＰ５１０６Ａ１を発現するプラスミドを構築した。得られたＣＹＰ５１０６Ａ１発現プラスミドのＤＮＡを用いて、Ｆａｓｔ^TM−ＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｏｍａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により出芽酵母ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＨ２２株（ＭＡＴａｌｅｕ２−３ｌｅｕ２−１１２ｈｉｓ４−５１９ｃａｎ１）を形質転換し、ＣＹＰ５１０６Ａ１遺伝子を発現する酵母株を構築した。

＜実施例２＞Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ由来ＣＹＰ５１０６Ａ１を発現する酵母株の１１−オキソ−β−アミリン酸化活性の確認
＜実施例１＞にて構築した酵母株を１リットル中に８０ｇグルコース、２６．８ｇ酵母ニトロゲンベース（アミノ酸不含）（ＦｏｒＭｅｄｉｕｍ社）、１．０ｇＤＯＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（−Ｌｅｕ）（タカラバイオ社）、６６ｍｇ５−アミノレブリン酸（富士フイルム和光純薬社）、及び、０．１ｇの１１−オキソ−β−アミリンを含む人工培地５００μｌに植菌し、暗所下、２８℃にて振盪培養した。３日間後、２００μｌの培養液を取り出して等容のアセトン：メタノール（１：１）溶液と混合したのち、全量を濾過（孔径０．４５μｍ、ワットマン社）した。濾液に８００μｌの酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社）を添加して激しく振盪したのち、上層（有機層）を回収した。これを３回繰り返し、得られた有機層の溶媒を減圧乾燥にて除去し、残渣を乾固した。この残渣をＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（シグマ―アルドリッチ社製、以後、ＭＳＴＦＡ）５０μｌとＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド５０μｌの添加により溶解し、６０℃、３０分間加熱によりトリメチルシリル化反応（以後、ＴＭＳ化）したものを測定試料とした。また、３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン及びグリチルレチン酸（富士フイルム和光純薬社）についてもそれぞれ同様にＴＭＳ化して測定試料を作製した。これらをＧＣ−ＭＳ（分析条件は下記表１）にて分析したところ、ＣＹＰ５１０６Ａ１を発現する酵母株と１１−オキソ−β−アミリンを接触させた反応から抽出した試料のトータルイオンクロマトグラムでは、３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン（１３．０分）、及び、グリチルレチン酸（１４．３分）のＴＭＳ化物と同じリテンションタイムにピークが検出された（図２）。また、これら二つのピークのマススペクトルはそれぞれ３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン及びグリチルレチン酸ＴＭＳ化物と一致した（図３）。他方、ＣＹＰ５１０６Ａ１遺伝子を持たないコントロール酵母と１１−オキソ−β−アミリンの培養から抽出し、ＴＭＳ化した試料のＧＣ−ＭＳではこれらに該当するピークを検出できなかったことから、ＣＹＰ５１０６Ａ１が１１−オキソ−β−アミリンの３０位酸化活性を有しており、これを発現する酵母では１１−オキソ−β−アミリンから３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン及びグリチルレチン酸を生産できることが示された。上記試験に用いた基質の調製及び同定はＳｅｋｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５，１４２０４−１４２０９，２００８、及び、Ｓｅｋｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２３，４１１２−４１２３，２０１１に記載の方法に基づいて実施した。

＜実施例３＞酵母株の構築
出芽酵母ＹＰＨ５００（ＭＡＴａｌｐｈａｕｒａ３−５２ｌｙｓ２−８０１ａｍｂｅｒａｄｅ２−１０１ｏｃｈｒｅｔｒｐ１−Δ６３ｈｉｓ３−Δ２００ｌｅｕ２−Δ１）はナショナルバイオリソースプロジェクト（以後、ＮＢＲＰ）から分譲された。以下、出芽酵母の形質転換は、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて行った。

＜実施例４＞ｐＰｅｒｇ７＿ＨＩＳ３＿Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７ベクターの構築
出芽酵母ＢＹ４７４２（ＭＡＴａｌｐｈａｌｅｕ２Δ ｕｒａ３Δ ｈｉｓ３−Δ１ｌｙｓ２Δ、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）よりＹｅａｓｔＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。このＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤＰｌｕｓＮｅｏＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、Ｐｍｅｔ−Ｆ２（ＧＡＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＴＡＧＴＡＣＴＡＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡ）（配列番号５）及びＰｍｅｔ−Ｒ３（ＡＡＡＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＴＡＣＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＴＡ）（配列番号６）の両プライマーにて、ＰＣＲをおこないＭｅｔ３遺伝子プロモーター領域のＤＮＡ断片を増幅し、増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。

続いて、同じゲノムＤＮＡを鋳型として、ＥＲＧ７−Ｆ１（ＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＣＡＧＡＡＴＴＴＴＡＴＴＣＴＧＡＣＡＣ）（配列番号７）およびＥＲＧ７−Ｒ１（ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＣ）（配列番号８）の両プライマーにて、ＫＯＤＰｌｕｓＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＥＲＧ７遺伝子ＤＮＡ断片を増幅し、増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約２．２ｋｂｐのＤＮＡを精製した。Ｍｅｔ３遺伝子プロモーター領域のＤＮＡ断片およびＥＲＧ７遺伝子ＤＮＡ断片を混合し、Ｐｍｅｔ−Ｆ２（ＧＡＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＴＡＧＴＡＣＴＡＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡ）（配列番号５）及びＥＲＧ７−Ｒ１（ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＣ）（配列番号８）の両プライマーにて、ＫＯＤＰｌｕｓＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより、Ｍｅｔ３遺伝子プロモーター＿ＥＲＧ７遺伝子（以後、Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７断片）ＤＮＡ断片を増幅し、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。次に、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用い、ベクターｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ＤＮＡを鋳型として、ｐＹＥＳ−ＵＲＡｔ−Ｒ（ＡＡＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡＴＡＡＧＴＡＡＡＴＧＣＡＴＧ）（配列番号９）及びｐＹＥＳ−ＸｈｏＩ−Ｆ１（ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＧ）（配列番号１０）の両プライマーとして、ＫＯＤＰｌｕｓＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりｐＹＥＳ由来Ａｍｐ−ｐＵＣｏｒｉを含むＤＮＡ断片（以後、Ａｍｐ−ｐＵＣｏｒｉ断片）を増幅し、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約２．２ｋｂｐのＤＮＡを取得した。このあと、出芽酵母ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、Ｐｅｒｇ７−３４０Ｆ（ＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＴＡＡＣＡＴＴＡＣＴＡＴＴＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡ）（配列番号１１）及びＰｅｒｇ７−Ｒ（ＡＧＣＴＣＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＴＴＴＴＧＴＡＣＴＴＴＣＴＴＴＧＴＧ）（配列番号１２）の両プライマーにて、ＰＣＲによりＥＲＧ７遺伝子プロモーター領域を増幅し、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し約０．３４ｋｂｐのＤＮＡ断片（以後、Ｐｅｒｇ７断片）を取得した。また、ベクターｐＥＳＣ−Ｈｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）ＤＮＡを鋳型といて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、Ｈｉｓ−Ｆ（ＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣ）（配列番号１３）及びＨｉｓ−Ｒ（ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣ）（配列番号１４）の両プライマーにて、ＨＩＳ３遺伝子ＤＮＡ断片を増幅し、約０．９ｋｂｐのＤＮＡ（以後、ＨＩＳ３断片）を取得した。

先に得られたＰｍｅｔ３＿ＥＲＧ７断片を鋳型といて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、Ｐｍｅｔ−Ｆ５（ＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＴＴＡＧＴＡＣＴＡＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＴＴＧ）（配列番号１５）及びＥＲＧ７−ＨｐａＩ−Ｒ（ＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＧＧＴＧＣＴＡＴＡＣＡＣＡＡＧ）（配列番号１６）の両プライマーにて、ＰＣＲを行い、Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７の３’部位に制限酵素ＨｐａＩ部位を追加したＤＮＡ断片（以後、Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７＿ＨｐａＩ断片）を増幅し、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製した。

つぎに、Ｐｅｒｇ７のＤＮＡ断片及びＨＩＳ３断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、Ｐｅｒｇ７−３４０Ｆ（ＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＴＡＡＣＡＴＴＡＣＴＡＴＴＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡ）（配列番号１１）及びＨｉｓ−Ｒ（ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣ）（配列番号１４）の両プライマーを添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、Ｐｅｒｇ７＿ＨＩＳ３のＤＮＡを増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、Ｐｅｒｇ７＿ＨＩＳ３に相当する約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。

続いて、Ｐｅｒｇ７＿ＨＩＳ３とＰｍｅｔ３＿ＥＲＧ７＿ＨｐａＩのＤＮＡ断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、Ｐｅｒｇ７−３４０Ｆ（ＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＴＡＡＣＡＴＴＡＣＴＡＴＴＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡ）（配列番号１１）及びＥＲＧ７−ＨｐａＩ−Ｒ（ＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＧＧＴＧＣＴＡＴＡＣＡＣＡＡＧ）（配列番号１６）の両プライマーを添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、Ｐｅｒｇ７＿ＨＩＳ３−Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７のＤＮＡを増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、Ｐｅｒｇ７＿ＨＩＳ３−Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７に相当する約４．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。さらに、得られたＰｅｒｇ７＿ＨＩＳ３−Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７とＡｍｐ−ｐＵＣｏｒｉ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、プラスミドｐＰｅｒｇ７＿ＨＩＳ３−Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７を構築した。

＜実施例５＞プラスミドｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−ＧｕＣＰＲ１−ＧｕＣＹＢ５の構築
ＧｅｎｅＡｒｔ^TMＳｔｒｉｎｇｓ^TM ＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔｓ合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にてウラルカンゾウ由来ＣＰＲ１（ＧｅｎｂａｎｋにＱＣＺ３５６２４．１で登録；配列番号１３７）をコードする遺伝子（以後、ＧｕＣＰＲ１；配列番号１３８）をその５’末端と３’末端の非翻訳領域にそれぞれ制限酵素ＳａｃＩ及びＮｏｔＩ部位を構築する配列のＤＮＡ断片を合成した。得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＥＳＣ−Ｈｉｓベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社））のＤＮＡ断片と混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、Ｇａｌ１０プロモーター下流にＧｕＣＰＲ１を接続したｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−ＧｕＣＰＲ１を構築した。

次にクソニンジン由来チトクロームＢ５（Ｐａｄｄｏｎ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，４９６，５２８−５３２，２０１３、ＧｅｎＰｅｐｔ登録ＡＦＸ８２６７９．１；配列番号１３９）とアミノ酸配列一致性の高いポリペプチドをＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｎｇｓ−ｄａｔａ−ａｒｃｈｉｖｅ．ｐｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／Ｇｕｒ／ｂｌａｓｔ．ｐｌ）にて探索し、アミノ酸配列一致性が７８％であるポリペプチド（Ｕｎｉｇｅｎｅ２３３０９、以後、ＧｕＣＹＢ５（配列番号１４０））を見出した。これをＧｅｎｅＡｒｔ^TMＳｔｒｉｎｇｓ^TM ＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔｓ合成にてこのＧｕＣＹＢ５をコードする遺伝子（配列番号１４１）をその５’末端と３’末端の非翻訳領域にそれぞれ制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位を構築する配列のＤＮＡ断片を合成した。得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで（いずれもタカラバイオ社）消化したｐＥＳＣ−Ｈｉｓ―ＧｕＣＰＲ１のＤＮＡ断片と混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、Ｇａｌ１プロモーター下流にＧｕＣＹＢ５を接続したｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−ＧｕＣＰＲ１−ＧｕＣＹＢ５を構築した。

＜実施例６＞プラスミドｐＰｅｒｇ７−Ｐｇａｌ１＿ＧｕＣＹＢ５−Ｐｇａｌ１０＿ＧｕＣＰＲ１−ＨＩＳ３−Ｐｍｅｔ＿ＥＲＧ７の構築
＜実施例５＞にて得られたプラスミドｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−ＧｕＣＰＲ１−ＧｕＣＹＢ５を鋳型として、Ｔｃｙｃ１−Ｒ−ＳａｌＩ（ＴＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣＧＴＣＣＣＡＡＡＡＣＣ）（配列番号１７）及びｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−１８８１−Ｆ（ＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧ）（配列番号１８）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲを行い、ＧｕＣＰＲ１及びＧｕＣＹＢ５の発現ユニットを増幅した。これを＜実施例４＞で構築したｐＰｅｒｇ７−ＨＩＳ３−Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７を制限酵素ＳａｌＩ及びＳａｃＩ（いずれもタカラバイオ社）で消化して得られるＤＮＡ断片と混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合して、プラスミドｐＰｅｒｇ７−Ｐｇａｌ１＿ＧｕＣＹＢ５−Ｐｇａｌ１０＿ＧｕＣＰＲ１−ＨＩＳ３−Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７ｔ３＿ＥＲＧ７を構築した。

＜実施例７＞ｅｒｇ７：：Ｐｇａｌ１＿ＧｕＣＹＢ５−Ｐｇａｌ１０＿ＧｕＣＰＲ１−ＨＩＳ３−Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７のＤＮＡ断片取得
＜実施例６＞にて得られたプラスミドｐＰｅｒｇ７−Ｐｇａｌ１＿ＧｕＣＹＢ５−Ｐｇａｌ１０＿ＧｕＣＰＲ１−ＨＩＳ３−Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７を制限酵素ＨｐａＩ（タカラバイオ社）で消化し、ｅｒｇ７：：Ｐｇａｌ１＿ＧｕＣＹＢ５−Ｐｇａｌ１０＿ＧｕＣＰＲ１−ＨＩＳ３−Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７のＤＮＡ断片を取得した。

＜実施例８＞プラスミドｐＰｇａｌ１＿ＥＲＧ２０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１の構築
ベクターｐＥＳＣ−ＨｉｓのＤＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、ＧＡＬ１０−ＥｃｏＲＩ−Ｆ（ｇａａｔｔｃｇａａｔｔｔｔｃａａａａａｔｔｃｔｔａｃ）（配列番号１９）及びＧＡＬ１−ＢａｍＨ−Ｒ（ｇｇａｔｃｃｇｇｇｇｔｔｔｔｔｔｃｔｃｃ）（配列番号２０）の両プライマーにて、Ｇａｌ１０プロモーター及びＧａｌ１プロモーターを含む領域のＤＮＡ断片を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し約０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片（Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１）を取得した。また、ｐＥＳＣ−ＨｉｓのＤＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ３０８９−Ｆ（ＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＡＧＣ）（配列番号２１）およびｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−３４３０Ｒ（ＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣ）（配列番号２２）の両プライマーにて、ＣＹＣ１ターミネーターを含む領域を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片（以後、ＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ａ）を取得した。同様に、ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ１７５１−Ｆ（ＧＣＣＧＧＣＧＡＡＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡＡＡＧ）（配列番号２３）およびｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−２２６８−Ｒ（ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧ）（配列番号２４）の両プライマーにて、ＡＤＨ１ターミネーターを含む領域を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。次にベクターｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２を鋳型としてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、ＤＥＳＴ５２−ＧＡＬ１ｐ−ＤｒａＩＩＩ−Ｆ（ａｇｇｇｃｇａｔｇｇｃｃｃａｃｔａｃｇｔｇＡＣＧＧＡＴＴＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧ）（配列番号２５）及びＧＡＬ１−ＢａｍＨ−Ｒ（ｇｇａｔｃｃｇｇｇｇｔｔｔｔｔｔｃｔｃｃ）（配列番号２０）の両プライマーにて、Ｇａｌ１プロモーター含む領域を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ｂ）を取得した。ｐＹＥＳ−ＣＹＣ１ｔ−Ｆ（ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＧＴ）（配列番号２６）およびｐＹＥＳ−ＣＹＣ１ｔ−Ｒ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇｇＣＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＴ）（配列番号２７）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲを行い、ＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ｂを増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し取得した。

さらに、出芽酵母ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＥＲＧ１−ＧＡＬ１−Ｆ（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＣＧＴＴＧＣＡＣ）（配列番号２８）及びＥＲＧ１−ＣＹＣ１ｔ−Ｒ（ＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣｔｔａａｃｃａａｔｃａａｃｔｃａｃｃａａａｃａ）（配列番号２９）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＥＲＧ１遺伝子のＤＮＡ断片を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．５ｋｂｐのＤＮＡ（ＥＲＧ１断片）を精製し取得した。同様にＥＲＧ９−ＧＡＬ１０−Ｆ（ａａｇａａｔｔｔｔｔｇａａａａｔｔｃｇａａｔｔｃＡＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＧＧＣ）（配列番号３０）及びＥＲＧ９−ＡＤＨ１ｔ−Ｒ（ＧＡＡＧＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣｔｃａｃｇｃｔｃｔｇｔｇｔａａａｇｔｇｔａ）（配列番号３１）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＥＲＧ９遺伝子のＤＮＡ断片を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．３ｋｂｐのＤＮＡ（ＥＲＧ９断片）を精製し取得した。さらに同様に、ＥＲＧ２０−ＧＡＬ１−Ｆ（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＧＧ）（配列番号３２）及びＥＲＧ２０−ＣＹＣ１ｔ−Ｒ（ＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡｃｔａｔｔｔｇｃｔｔｃｔｃｔｔｇｔａａａｃｔｔｔｇ）（配列番号３３）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＥＲＧ２０のＤＮＡ断片を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．１ｋｂｐのＤＮＡ（ＥＲＧ２０断片）を取得した。

続いて同様に、Ｔｒｐ−３０３−Ｈｉｓ３４３０−Ｆ（ｇｇｃｇａｇｃｇｇｔａｔｃａｇｃｔｃａＡＴＡＧＣＴＴＧＴＣＡＣＣＴＴＡＣＧＴＡＣ）（配列番号３４）及びＴｒｐ−ＰｍａｃＩ−Ｈｉｓ−３４３５−Ｒ（ａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔＣＡＣＧＴＧＣＴＣＡＡＴＡＧＴＣＡＣＣ）（配列番号３５）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＴＲＰ１遺伝子の５‘非翻訳領域（以後、ＴＲＰ１＿５’ｌｉｎｋｅｒ）を増幅したのち、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約約０．１ｋｂｐのＤＮＡを精製し取得した。次にこのＤＮＡを鋳型にＧＡＬ１−ＣＹＣ１ｔ−Ｆ（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃｇａｇＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＡ）（配列番号３６）及びＴｒｐ−ＰｍａｃＩ−Ｈｉｓ−３４３５−Ｒ（ａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔＣＡＣＧＴＧＣＴＣＡＡＴＡＧＴＣＡＣＣ）（配列番号３５）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲを行い、末端にＧＡＬ１プロモーターの３’末端と相補する配列を有するＴＲＰ１＿５‘ｌｉｎｋｅｒを増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約０．１ｋｂｐのＤＮＡを精製し取得した。このＤＮＡ断片とベクターｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２を鋳型として増幅したＧＡＬ１プロモーターのＤＮＡ断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ｐＥＳＣ−ＤｒａＩＩＩ−Ｆ（ａｇｇｇｃｇａｔｇｇｃｃｃａｃｔａｃ）（配列番号３７）及びＴｒｐ−ＰｍａｃＩ−Ｈｉｓ−３４３５−Ｒ（ａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔＣＡＣＧＴＧＣＴＣＡＡＴＡＧＴＣＡＣＣ）（配列番号３５）の両プライマーを添加して、さらにＰＣＲ反応を続けることで、ＧＡＬ１プロモーター＿ＴＲＰ１＿５’ｌｉｎｋｅｒのＤＮＡ断片を接続したＤＮＡを増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。次にｐＥＳＣ−ＴＲＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＤＮＡを鋳型にｐＥＳＣ−Ｈｉｓ３４３５−Ｆ（ａｇｇｃｇｇｔａａｔａｃｇｇｔｔａｔｃｃ）（配列番号３８）及びｐＥＳＣ−ＤｒａＩＩＩ−Ｒ（ｇｔｇｇｇｃｃａｔｃｇｃｃｃｔｇａｔａｇ）（配列番号３９）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりｐＥＳＣ−ＴＲＰプラスミドのＡＤＨ１ターミネーターからＣＹＣ１ターミネーターを除く領域を増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約４．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片とＧＡＬ１プロモーター＿ＴＲＰ１＿５‘ｌｉｎｋｅｒのＤＮＡ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、ＧＡＬ１プロモーター＿ＴＲＰ１＿５‘ｌｉｎｋｅｒをｐＥＳＣ−ＴＲＰに挿入したプラスミド（以後、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−Ｐｇａｌ１＿ＴＲＰ１ｌｉｎｋｅｒ）を構築した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−Ｐｇａｌ１＿ＴＲＰ１ｌｉｎｋｅｒのＤＮＡ断片を得た。ｐＥＳＣ−ＴＲＰを鋳型として増幅したＡＤＨ１ターミネーターのＤＮＡ断片とＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ｂを混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ｐＹＥＳ−ＣＹＣ１ｔ− Ｆ（ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＧＴ）（配列番号２６）およびｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−２２６８−Ｒ（ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧ）（配列番号２４）を添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＡＤＨ１ターミネーターとＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ｂ（以後、Ｔｃｙｃ１−ｂ−Ｔａｄｈ１）を接続したＤＮＡを増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。Ｔｃｙｃ１−ｂ−Ｔａｄｈ１のＤＮＡ断片及びＥＲＧ２０のＤＮＡ断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＥＲＧ２０−ＧＡＬ１−Ｆ２（ａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＧＣＴ）（配列番号４０）とｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−２２６０−Ｒ（ＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＧＡＧ）（配列番号４１）の両プライマーを添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＥＲＧ２０＿Ｔｃｙｃ１−ｂ−Ｔａｄｈ１のＤＮＡを増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。次に、Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１のＤＮＡ断片及びＥＲＧ９のＤＮＡ断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＥＲＧ９−ＡＤＨ１ｔ−Ｒ（ＧＡＡＧＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣｔｃａｃｇｃｔｃｔｇｔｇｔａａａｇｔｇｔａ）（配列番号３１）およびＧＡＬ１−ＢａｍＨ−Ｒ（ｇｇａｔｃｃｇｇｇｇｔｔｔｔｔｔｃｔｃｃ）（配列番号２０）を添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＥＲＧ９をＰｇａｌ１０の下流に接続したＥＲＧ９＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１断片を増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。また、ＥＲＧ１のＤＮＡ断片及びＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ａを混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＥＲＧ１−ＧＡＬ１−Ｆ（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＣＧＴＴＧＣＡＣ）（配列番号２８）およびｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−３４３０Ｒ（ＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣ）（配列番号２２）を添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＥＲＧ１の下流にＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ａを接続したＥＲＧ１＿Ｔｃｙｃ１−ａ断片を増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。そして、ＥＲＧ９＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１断片及びＥＲＧ１＿Ｔｃｙｃ１−ａ断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＥＲＧ９−ＡＤＨ１ｔ−Ｒ（ＧＡＡＧＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣｔｃａｃｇｃｔｃｔｇｔｇｔａａａｇｔｇｔａ）（配列番号３１）およびＣＹＣ１ｔ−ＸｈｏＩ−３４３０Ｒ（ＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧｇｃａｇｃｃｇａａｃ）（配列番号４２）を添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＥＲＧ９＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１＿Ｔｃｙｃ１を増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。上記で得たｐＥＳＣ−ＴＲＰ−Ｐｇａｌ１＿ＴＲＰ１ｌｉｎｋｅｒのＤＮＡ断片及びＥＲＧ９＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１＿Ｔｃｙｃ１断片並びにＥＲＧ２０＿Ｔｃｙｃ１−ｂ−Ｔａｄｈ１断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ２０＿Ｔｃｙｃ１−Ｔａｄｈ１＿ＥＲＧ９＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１＿Ｔｃｙｃ１の断片がｐＥＳＣ−ＴＲＰに挿入されたプラスミドｐＰｇａｌ１＿ＥＲＧ２０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１を構築した。

＜実施例９＞ｐＴｒｐ１Ｇｅｎｅプラスミドの構築
出芽酵母ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡを鋳型にＴｒｐ−ＢｇｌＩＩ−Ｆ（ａｃｇａｇｇｃｃｃｔｔｔｃｇｔＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＡＣＴＧＧＴＣ）（配列番号４３）およびＴｒｐ−ＢｇｌＩＩ−Ｒ（ａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＴＴＴＡＴＧＣＴＴＧＣ）（配列番号４４）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりプロモーター領域を含むＴＲＰ１遺伝子約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．４ｋｂｐのＤＮＡを精製し取得した。次にｐＥＳＣ−ＴＲＰベクターＤＮＡを鋳型として、ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ３４３５−Ｆ（ａｇｇｃｇｇｔａａｔａｃｇｇｔｔａｔｃｃ）（配列番号３８）及びｐＥＳＣ−ｔｒｐ−６５２６Ｒ（ａｃｇａａａｇｇｇｃｃｔｃｇｔｇａｔａｃ）（配列番号４５）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＴＲＰ１遺伝子を含まないｐＥＳＣベクター領域のＤＮＡ断片を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約５．８ｋｂｐのＤＮＡを精製し取得した。ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡよりＰＣＲで増幅したＴＲＰ１遺伝子ＤＮＡ及びｐＥＳＣ−ＴＲＰより増幅したＴＲＰ１以外の領域のＤＮＡを混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合しｐＴｒｐ１Ｇｅｎｅプラスミドを得た。

＜実施例１０＞ｔｒｐ１：：Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ２０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１−ＴＲＰ１のＤＮＡ断片取得
＜実施例８＞により得られたプラスミドｐＰｇａｌ１＿ＥＲＧ２０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１のＤＮＡ断片を制限酵素ＤｒａＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ社）及びＸｈｏＩで消化し、Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ２０−Ｐｇａｌ１
０＿ＥＲＧ９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１のＤＮＡ断片を得た。＜実施例９＞により得られたｐＴｒｐ１ＧｅｎｅのＤＮＡを鋳型として、Ｐｔｒｐ−２２５−Ｆ（ｇｔｔｃｇｇｃｔｇｃＣＴＣＧＡＡＴＡＴＡＴＧＴＧＴＡＣＴＴＴＧＣＡＧＴ（配列番号４６））およびＰｔｒｐ−３７３−Ｒ（ＣＴＴＣＴＡＡＴＣＣＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＣＧＧ（配列番号４７））の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりｐＥＳＣベクター含むＤＮＡ断片を増幅した。これらをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応して、Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ２０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１のＤＮＡ断片をｐＴｒｐ１ＧｅｎｅのＴＲＰ１プロモーター上流（−３７３〜−２２５領域）に挿入したプラスミドｐＴｒｐ−ＥＲＧ２０−９−１を構築した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩ（タカラバイオ社）で消化し、ｔｒｐ１：：Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ２０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１−ＴＲＰ１のＤＮＡ断片を取得した。

＜実施例１１＞プラスミドｐＰｇａｌ１＿ＥＲＧ１０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１２の構築
出芽酵母ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＥＲＧ１０−ＧＡＬ１−Ｆ（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＴＣＴＣＡＧＡＡＣＧＴＴＴＡＣＡＴＴＧ）（配列番号４８）およびＥＲＧ１０−ＣＹＣ１ｔ−Ｒ（ＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＡＡＴＡＧＡＧ）（配列番号４９）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＥＲＧ１０のＤＮＡ断片を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．２ｋｂｐのＤＮＡ（ＥＲＧ１０断片）を取得した。同様に、ＥＲＧ１２−ＧＡＬ１−Ｆ（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＴＣＡＴＴＡＣＣＧＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＣ）（配列番号５０）、ＥＲＧ１２−ＣＹＣ１ｔ−Ｒ（ＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＴＴＣＧ）（配列番号５１）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＥＲＧ１２のＤＮＡ断片を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．３ｋｂｐのＤＮＡ（ＥＲＧ１２断片）を取得した。さらに同様に、ＥＲＧ１９−ＧＡＬ１０−Ｆ（ａａｇａａｔｔｔｔｔｇａａａａｔｔｃｇａａｔｔｃＡＴＧＡＣＣＧＴＴＴＡＣＡＣＡＧＣＡＴＣＣ）（配列番号５２）およびＥＲＧ１９−ＡＤＨ１ｔ−Ｒ（ＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧＴＴＡＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＣＴ）（配列番号５３）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＥＲＧ１９のＤＮＡ断片を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．２ｋｂｐのＤＮＡ（ＥＲＧ１９断片）を取得した。＜実施例８＞で作製したＴｃｙｃ１−ｂ−Ｔａｄｈ１のＤＮＡ断片及びＥＲＧ１０のＤＮＡ断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＥＲＧ１０−ＧＡＬ１−Ｆ２（ａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＴＣＴ）（配列番号５４）及びＡＤＨ１ｔ−Ｌｉｎｋ−Ｒ（ＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＴＧＧＴＣＡＡＧＴＣ）（配列番号５５）の両プライマーを添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＥＲＧ１０＿Ｔｃｙｃ１−ｂ−Ｔａｄｈ１のＤＮＡを増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。次に、＜実施例８＞で得たＰｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１のＤＮＡ断片及びＥＲＧ１９のＤＮＡ断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＥＲＧ１９−ＡＤＨ１ｔ−Ｒ（ＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧＴＴＡＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＣＴ）（配列番号５３）およびＧＡＬ１−ＢａｍＨ−Ｒ（ｇｇａｔｃｃｇｇｇｇｔｔｔｔｔｔｃｔｃｃ）（配列番号２０）を添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＥＲＧ１９をＰｇａｌ１０の下流に接続したＥＲＧ１９＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１断片を増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。また、ＥＲＧ１２のＤＮＡ断片及び＜実施例８＞で得たＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ａを混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＥＲＧ１２−ＧＡＬ１−Ｆ（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＴＣＡＴＴＡＣＣＧＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＣ）（配列番号５０）及びｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−３４３０Ｒ（ＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣ）（配列番号２２）を添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＥＲＧ１２の下流にＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ａを接続したＥＲＧ１２＿Ｔｃｙｃ１−ａ断片を増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。そして、ＥＲＧ１９＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１断片及びＥＲＧ１２＿Ｔｃｙｃ１−ａ断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＥＲＧ１９−ＡＤＨ１ｔ−Ｒ（ＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧＴＴＡＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＡＧＡＣＣＡＧＴＣＴ）（配列番号５３）およびＣＹＣ１ｔ−ＸｈｏＩ−３４３０Ｒ（ＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧｇｃａｇｃｃｇａａｃ）（配列番号４２）を添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＥＲＧ１９＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１２＿Ｔｃｙｃ１を増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約３．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。＜実施例８＞で得たｐＥＳＣ−ＴＲＰ−Ｐｇａｌ１＿ＴＲＰ１ｌｉｎｋｅｒのＤＮＡ断片及びＥＲＧ１９＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１２＿Ｔｃｙｃ１断片並びにＥＲＧ１０＿Ｔｃｙｃ１−ｂ−Ｔａｄｈ１断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１０＿Ｔｃｙｃ１−Ｔａｄｈ１＿ＥＲＧ１９＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１２＿Ｔｃｙｃ１の断片がｐＥＳＣ−ＴＲＰに挿入されたプラスミドｐＰｇａｌ１＿ＥＲＧ１０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１２を構築した。

＜実施例１２＞ｐＵｒａ３Ｇｅｎｅプラスミドの構築
出芽酵母ＩＮＶＳｃ１（ＭＡＴａｈｉｓ３Δ１ｌｅｕ２ｔｒｐ１−２８９ｕｒａ３−５２／ＭａｔａｌｐｈａｈｉｓΔ１ｌｅｕ２ｔｒｐ１−２８９ｕｒａ３−５２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からＹｅａｓｔＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。そのゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｕｒａ−ＳｍａＩ−Ｆ（ａｃｇａｇｇｃｃｃｔｔｔｃｇｔＣＣＣＧＧＧＣＧＧＡＴＴＡＣＴＡＣＣＧＴＴＧ）（配列番号５６）及びＵｒａ−６００−Ｆ＿Ｃ（ＣＴＧＴＴＣＧＧＡＧＡＴＴＡＣＣＧＡＡＴＣ）（配列番号５７）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＵＲＡ３遺伝子のプロモーター及びその上流領域を含む領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約０．６ｋｂｐのＤＮＡのＤＮＡ断片を取得した。プラスミドｐＥＳＣ−Ｕｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＤＮＡを鋳型として、Ｕｒａ−６００−Ｆ（ＧＡＴＴＣＧＧＴＡＡＴＣＴＣＣＧＡＡＣＡＧ）（配列番号５８）及びＵｒａ−ＳｍａＩ−Ｒ（ａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔＣＣＣＧＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＧＡＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧ）（配列番号５９）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＵｒａ３遺伝子の後半部分を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．０ｋｂｐのＤＮＡのＤＮＡ断片を取得した。これらのＤＮＡ断片を混合して鋳型とし、Ｕｒａ−ＳｍａＩ−Ｆ（ａｃｇａｇｇｃｃｃｔｔｔｃｇｔＣＣＣＧＧＧＣＧＧＡＴＴＡＣＴＡＣＣＧＴＴＧ（配列番号５６）及びＵｒａ−ＳｍａＩ−Ｒ（ａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔＣＣＣＧＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＧＡＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧ）（配列番号５９）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＵｒａ３プロモーター及びその上流領域並びにＵＲＡ３遺伝子を含むＤＮＡを増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．６ｋｂｐのＤＮＡのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片と＜実施例９＞で作製したｐＥＳＣ−ＴｒｐからＴＲＰ１を除いた約５．８８ｋｂｐのＤＮＡ断片と混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、ｐＵｒａ３Ｇｅｎｅプラスミドを構築した。

＜実施例１３＞ｕｒａ３：：Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１２−ＵＲＡ３のＤＮＡ断片取得
＜実施例１１＞で構築したｐＰｇａｌ１＿ＥＲＧ１０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１２のＤＮＡを鋳型として、ｐＥＳＣ−ＤｒａＩＩＩ−Ｆ（ａｇｇｇｃｇａｔｇｇｃｃｃａｃｔａｃ）（配列番号３７）およびＣＹＣ１ｔ−ＸｈｏＩ−３４３０−Ｒ（ＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧｇｃａｇｃｃｇａａｃ）（配列番号４２）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＰｇａｌ１＿ＥＲＧ１０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１２を含む領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約５．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。＜実施例１２＞で構築したｐＵｒａ３ＧｅｎｅプラスミドのＤＮＡを鋳型として、Ｐｕｒａ−２３９−Ｆ（ＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣ）（配列番号６０）およびＰｕｒａ−２３９−Ｒ（ｇｔｇｇｇｃｃａｔｃｇｃｃｃｔＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＣＴＴＣ）（配列番号６１）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりｐＵｒａ３Ｇｅｎｅ全体を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔでＤＮＡ断片を取得した。これらのＤＮＡ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１２をｐＵｒａ３ＧｅｎｅのＵＲＡ３プロモーター上流領域に挿入したプラスミドｐＵｒａ−ＥＲＧ１０−１９−１２を構築した。そしてｐＵｒａ−ＥＲＧ１０−１９−１２プラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩ（タカラバイオ社）で消化し、ｕｒａ３
：：Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１２−ＵＲＡ３のＤＮＡ断片を取得した。

＜実施例１４＞プラスミドｐＰｇａｌ１＿ＩＤＩ１−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１３−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ８の構築
出芽酵母ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＥＲＧ８−ＧＡＬ１−Ｆ（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＡＧＡＧＣＣＴＴＣ）（配列番号６２）及びＥＲＧ８−ＣＹＣ１ｔ−Ｒ（ＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＴＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＧＴＴＴＣＣＧＧ）（配列番号６３）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＥＲＧ８のＤＮＡ断片を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．４ｋｂｐのＤＮＡ（ＥＲＧ８断片）を取得した。同様に、ＥＲＧ１３−ＧＡＬ１０−Ｆ（ａａｇａａｔｔｔｔｔｇａａａａｔｔｃｇａａｔｔｃＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＣＴＡＡＡＣＴＴＴＧＴＴ）（配列番号６４）及びＥＲＧ１３−ＡＤＨ１ｔ−Ｒ（ＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＣＡＴＣＧＴＡＡＧＡＴＣＴＴＣ）（配列番号６５）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＥＲＧ１３のＤＮＡ断片を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．５ｋｂｐのＤＮＡ（ＥＲＧ１３断片）を取得した。さらに同様に、ＩＤＩ１−ＧＡＬ１−Ｆ（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＣＴＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＡＴＡＧＴＡ）（配列番号６６）およびＩＤＩ１−ＣＹＣ１ｔ−Ｒ（ＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＡＧＣＡＴＴＣＴＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧ）（配列番号６７）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＩＤＩ１のＤＮＡ断片を増幅しＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約０．９ｋｂｐのＤＮＡ（ＩＤＩ１断片）を取得した。＜実施例８＞で作製したＴｃｙｃ１−ｂ−Ｔａｄｈ１のＤＮＡ断片及びＩＤＩ１のＤＮＡ断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＩＤＩ１−ＧＡＬ１−Ｆ２（ａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＣＴ）（配列番号６８）とＡＤＨ１ｔ−Ｌｉｎｋ−Ｒ（ＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＴＧＧＴＣＡＡＧＴＣ）（配列番号５５）の両プライマーを添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＩＤＩ１＿Ｔｃｙｃ１−ｂ−Ｔａｄｈ１のＤＮＡを増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。次に、＜実施例８＞で得たＰｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１のＤＮＡ断片及びＥＲＧ１３のＤＮＡ断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＥＲＧ１３−ＡＤＨ１ｔ−Ｒ（ＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＣＡＴＣＧＴＡＡＧＡＴＣＴＴＣ）（配列番号６５）及びＧＡＬ１−ＢａｍＨ−Ｒｓｈｏｒｔ（ＣＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧ）（配列番号２０）の両プライマーを添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＥＲＧ１３をＰｇａｌ１０の下流に接続したＥＲＧ１３＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１断片を増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。また、ＥＲＧ８のＤＮＡ断片及び＜実施例８＞で得たＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ａを混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＥＲＧ８−ＧＡＬ１−Ｆ（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＡＧＡＧＣＣＴＴＣ）（配列番号６２）及びｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−３４３０Ｒ（ＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣ）（配列番号２２）を添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＥＲＧ８の下流にＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ａを接続したＥＲＧ８＿Ｔｃｙｃ１−ａ断片を増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。そして、ＥＲＧ１３＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１断片及びＥＲＧ８＿Ｔｃｙｃ１−ａ断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりプライマーを添加せずにＰＣＲ反応を進めたのち、ＥＲＧ１３−ＡＤＨ１ｔ−Ｒ（ＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＣＡＴＣＧＴＡＡＧＡＴＣＴＴＣ）（配列番号６５）及びＣＹＣ１ｔ−ＸｈｏＩ−３４３０Ｒ（ＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧｇｃａｇｃｃｇａａｃ）（配列番号４２）を添加してさらにＰＣＲ反応を続けることで、ＥＲＧ１３＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ８＿Ｔｃｙｃ１を増幅した。その後、得られた増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製し、約３．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。＜実施例８＞で得たｐＥＳＣ−ＴＲＰ−Ｐｇａｌ１＿ＴＲＰ１ｌｉｎｋｅｒのＤＮＡ断片及びＥＲＧ１３＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ８＿Ｔｃｙｃ１断片並びにＩＤＩ１＿Ｔｃｙｃ１−ｂ−Ｔａｄｈ１断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、Ｐｇａｌ１＿ＩＤＩ１＿Ｔｃｙｃ１−Ｔａｄｈ１＿ＥＲＧ１３＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ８＿Ｔｃｙｃ１の断片がｐＥＳＣ−ＴＲＰに挿入されたプラスミドｐＰｇａｌ１＿ＩＤＩ１−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１３−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ８を構築した。

＜実施例１５＞ｐＡｄｅ２Ｇｅｎｅプラスミドの取得
出芽酵母ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡを鋳型にＡｄｅ２−ＨｐａＩ−Ｆ（ａｃｇａｇｇｃｃｃｔｔｔｃｇｔＴＡＡＣＡＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＡＴ）（配列番号６９）及びＡｄｅ２−ＨｐａＩ−Ｒ（ａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔＧＴＴＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＴＧ）（配列番号７０）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＡＤＥ２プロモーター及びその上流領域並びにＡＤＥ２遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．４ｋｂｐのＤＮＡを精製し取得した。このＤＮＡ断片と＜実施例９＞で作製したｐＥＳＣ−ＴｒｐからＴＲＰ１を除いた約５．８８ｋｂｐのＤＮＡ断片と混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、ｐＡｄｅ２Ｇｅｎｅプラスミドを構築した。

＜実施例１６＞ａｄｅ２：：Ｐｇａｌ１＿ＩＤＩ１−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１３−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ８−ＡＤＥ２のＤＮＡ断片取得
＜実施例１４＞により得られたプラスミドｐＰｇａｌ１＿ＩＤＩ１−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１３−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ８のＤＮＡを鋳型として、ｐＥＳＣ−ＤｒａＩＩＩ−Ｆ（ａｇｇｇｃｇａｔｇｇｃｃｃａｃｔａｃ）（配列番号３７）およびＣＹＣ１ｔ−ＸｈｏＩ−３４３０−Ｒ（ＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧｇｃａｇｃｃｇａａｃ）（配列番号４２）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＰｇａｌ１＿ＩＤＩ１−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１３−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ８−ＡＤＥ２の領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約５．７ｋｂｐのＤＮＡを精製し取得した。＜実施例１５＞により得られたプラスミドｐＡｄｅ２ＧｅｎｅのＤＮＡを鋳型として、Ｐａｄｅ２−４００Ｆ（ＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＡＣＣＴＴＴＴＧＡＴＧＣＧＧＡＡＴＴＧＡＣ）（配列番号７１）およびＰａｄｅ２−４３０Ｒ（ＧＴＧＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＣＴＣＡＴＧＡＡＡＣＴＡＧＧＣＡＡＣＴＴＴＴＣＧ）（配列番号７２）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりｐＡｄｅ２ＧｅｎｅのＡＤＥ２プロモーター上流領域の一部を除く領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔでＤＮＡ断片を精製し取得した。これらのＤＮＡ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、Ｐｇａｌ１＿ＩＤＩ１−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１３−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ８をｐＡｄｅ２ＧｅｎｅのＡＤＥ２プロモーター上流領域に挿入したプラスミドｐＡｄｅ−ＩＤＩ１−ＥＲＧ１３−８を構築した。そしてｐＡｄｅ−ＩＤＩ１−ＥＲＧ１３−８プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｐａＩで消化し、ａｄｅ２：：Ｐｇａｌ１＿ＩＤＩ１
−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１３−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ８−ＡＤＥ２のＤＮＡ断片を取得した。

＜実施例１７＞プラスミドｐＥＳＣ−ＯＳＣ１ｔａｄｈ１−ｕｐｃ２−１−ｔＨＭＧ１の構築
出芽酵母ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＵＰＣ２−Ｆ１（ｔｔｇａａａａｔｔｃｇａａｔｔｃＡＴＧＡＧＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＴＡＣＡＧ）（配列番号７３）及びｕｐｃ２−１−Ｒ１（ＡＴＧＣＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧ）（配列番号７４）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＵＰＣ２のＮ末端から８８８残基のグリシンをアスパラギン酸に置換する変異を導入したＵＰＣ２遺伝子の前半の領域（以後、ｕｐｃ２−１ａ）を含むＤＮＡ断片を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約２．７ｋｂｐのＤＮＡを取得した。次にｕｐｃ２−１−Ｆ１（ＧＧＴＧＧＴＧＡＴＡＴＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＣ）（配列番号７５）及びＵＰＣ２−Ｒ１（ｔｔａａｇａｇｃｔｃａｇａＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＧ）（配列番号７６）の両プライマーにて同様にＰＣＲを行い、ＵＰＣ２のＮ末端から８８８残基のグリシンをアスパラギン酸に置換する変異を導入したＵＰＣ２遺伝子の後半の領域（以後、ｕｐｃ２−１ｂ）を含むＤＮＡ断片を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約０．１ｋｂｐのＤＮＡを取得した。

次に、ｕｐｃ２−１ａのＤＮＡ断片及びｕｐｃ２−１ｂのＤＮＡ断片を混合して鋳型とし、ＵＰＣ２−Ｆ１（ｔｔｇａａａａｔｔｃｇａａｔｔｃＡＴＧＡＧＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＴＡＣＡＧ（配列番号７３）およびＵＰＣ２−Ｒ１（ｔｔａａｇａｇｃｔｃａｇａＴＣＴＡＴＣＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＧ）（配列番号７６）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＵＰＣ２全長を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約２．８ｋｂｐのＤＮＡを精製し、ＵＰＣ２変異体のＤＮＡ（以後、ｕｐｃ２−１）を取得した。プラスミドベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）で消化して得られるＤＮＡ断片とｕｐｃ２−１のＤＮＡ断
片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、プラスミドｐＥＳＣ−ｕｐｃ２−１を構築した。次にｐＥＳＣ−ｕｐｃ２−１のＤＮＡを制限酵素ＤｒａＩＩＩ及びＮｇｏＭＩＶ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ社）で消化し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約９．１ｋｂｐのＤＮＡを取得した。同様に、ｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ＯＳＣ１プラスミド（Ｓｅｋｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５，１４２０４−１４２０９，２００８）を鋳型として、ＡＤＨ１ｐ−Ｆ（ａｇｇｇｃｇａｔｇｇｃｃｃａｃｃＧＴＴＴＣＣＴＣＧＴＣＡＴＴＧＴＴＣＴＣＧ）（配列番号７７）及びＡＤＨ１ｔ−Ｒ１（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇｇａｔｃｃｇｔｇｔｇｇａａｇａａｃ）（配列番号７８）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲにより増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔでＡＤＨ１プロモーターの一部＿ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｍ）由来オキシドスクアレン環化酵素遺伝子（ＬｊＯＳＣ１）＿ＡＤＨ１ターミネーターの領域を含む約２．８ｋｂｐのＤＮＡ（Ｐａｄｈ１ｐ＿ＬｊＯＳＣ１＿Ｔａｄｈ１）を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、プラスミドｐＥＳＣ−ＯＳＣ１ｔａｄｈ１−ｕｐｃ２−１を構築した。出芽酵母ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＭＧＲ−Ｆ１（ＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＡＣａｔｇｇＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＡＴＴＧＧ）（配列番号７９）及びＨＭＧＲ−Ｒ１（ＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣ）（配列番号８０）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより、膜結合領域とリンカー領域の一部を除いたＨＭＧ１遺伝子（以後、ｔＨＭＧ１）のＤＮＡ断片を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．６ｋｂｐのＤＮＡを取得した。このＤＮＡをプラスミドｐＥＳＣ−ＯＳＣ１ｔａｄｈ１−ｕｐｃ２−１を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化して得られるＤＮＡ断片と混合した上で、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、プラスミドｐＥＳＣ−ＯＳＣ１ｔａｄｈ１−ｕｐｃ２−１−ｔＨＭＧ１を構築した。

＜実施例１８＞ｐＬｙｓ２Ｇｅｎｅプラスミドの構築
出芽酵母ＩＮＶＳｃ１のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｌｙｓ２−１８１２−ＨｐａＩ−Ｆ（ａｃｇａｇｇｃｃｃｔｔｔｃｇｔＴＡＡＣＡＧＧＡＡＣＧＡＴＣＧＴＡＣＴＣ）（配列番号８１）及びＬｙｓ２−ＨｐａＩ−Ｒ（ａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔＧＴＴＡＡＣＧＡＴＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＣ（配列番号８２）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＬＹＳ２遺伝子のＣ末端側部分及びターミネーター下流を含む領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約２．０ｋｂｐのＤＮＡを精製した。このＤＮＡを＜実施例９＞でｐＥＳＣ−ＴＲＰより増幅して得られた約５．８ｋｂｐのＤＮＡ断片と混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、プラスミドｐＬｙｓ２Ｇｅｎｅを構築した。

＜実施例１９＞ｌｙｓ２：：ＬＹＳ２−Ｐｇａｌ１０＿ｕｐｃ２−１−Ｐｇａｌ１＿ｔＨＭＧ１のＤＮＡ断片取得
＜実施例１７＞にて得られたプラスミドｐＥＳＣ−ＯＳＣ１ｔａｄｈ１−ｕｐｃ２−１−ｔＨＭＧ１を制限酵素ＨｐａＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔでＴａｄｈ１−Ｔａｄｈ１＿ｕｐｃ２−１＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１＿ｔＨＭＧ１の領域からなる５．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。また、ｐＥＳＣ−ＯＳＣ１ｔａｄｈ１−ｕｐｃ２−１−ｔＨＭＧ１のＤＮＡを鋳型として、ＨＭＧＲ−ＸｈｏＩ−Ｆ（ＴＡＡＡＴＣＣＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＣ）（配列番号８３）及びＣＹＣ１ｔ−ＸｈｏＩ−３４３０Ｒ（ＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧｇｃａｇｃｃｇａａｃ）（配列番号４２）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。また、＜実施例１８＞にて得られたｐＬｙｓ２Ｇｅｎｅプラスミドを鋳型としてＴｌｙｓ２−Ｆ（ＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＴＴＧＡＧＣＡＴＴＡＣＧＴＡＴＧ）（配列番号８４）及びＬｙｓ２−Ｔａｄｈ１−Ｒ（ＧＡＡＡＴＴＣＧＣＴＴＡＧＴＴＴＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＴＴＣ）（配列番号８５）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＬＹＳ２遺伝子のターミネーター領域からｐＥＳＣベクター部分及びＬＹＳ２遺伝子のＣ末端側の領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約６．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。これら三つＤＮＡ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、Ｔａｄｈ１−Ｔａｄｈ１＿ｕｐｃ２−１＿Ｐｇａｌ１０−Ｐｇａｌ１＿ｔＨＭＧ１＿Ｔｃｙｃ１のユニットがｐＬｙｓ２ＧｅｎｅのＬＹＳ２遺伝子の３’非翻訳領域に挿入されたプラスミドｐＬｙｓ２−Ｐｇａｌ１０＿ｕｐｃ２−１−Ｐｇａｌ１０＿ｔＨＭＧ１を構築した。このｐＬｙｓ２−Ｐｇａｌ１０＿ｕｐｃ２−１−Ｐｇａｌ１０＿ｔＨＭＧ１プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｐａＩで消化し、ｌｙｓ２：：ＬＹＳ２−Ｐｇａｌ１０＿ｕｐｃ２−１−Ｐｇａｌ１＿ｔＨＭＧ１のＤＮＡ断片を取得した。

＜実施例２０＞ｐＹＥＳ−ｇａｌ７−Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ２のプラスミド構築
＜実施例４＞で得たＰｍｅｔ３−ＥＲＧ７断片を鋳型にＰｍｅｔ−Ｆ５（ＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＴＴＡＧＴＡＣＴＡＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＴＴＧ）（配列番号１５）及びＥＲＧ７＿６６０−Ｒ５（ＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＡＧＴＡＡＣＣＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＡＧＧ）（配列番号８６）にて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＰｍｅｔ３−ＥＲＧ７に制限酵素ＳｐｈＩ部位を接続したＤＮＡ断片を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで１．２ｋｂｐ（Ｐｍｅｔ３−ＥＲＧ７＿Ｓ）を得た。プラスミドｐＥＮＴＲ（登録商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＤＮＡを鋳型として、ＵＲＡｐ−Ｋａｎ−Ｆ（ＡＡＣＡＡＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＡＧＧＧＧＴＧＴＴＡＴＧ）（配列番号８７）及びＫａｎ−ＵＲＡｔ−Ｒ（ＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧ）（配列番号８８）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりカナマイシン耐性遺伝子（以後、ＫａｎＲ）を含む領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約０．９ｋｂｐのＤＮＡを取得した。ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏプラスミド（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を鋳型として、ＴＥＦ１−ＥＭ−７−Ｆ−ｌｉｎｋ（ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣ）（配列番号８９）及びＥＭ７−Ｋａｎ−Ｒ（ＴＴＧＡＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＣ）（配列番号９０）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＴＥＦ１プロモーター領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約０．５ｋｂｐのＤＮＡ（Ｐｔｅｆ１）を取得した。プラスミドｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２のＤＮＡを鋳型にｐＹＥＳ−ＣｌａＩ−Ｒ（ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣ）（配列番号９１）及びｐＹＥＳ−ＸｈｏＩ−Ｆ１（ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＧ）（配列番号１０）の両方のプライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲにより当該プラスミドのＧＡＬ１プロモーターからＣＹＣ１ターミネーターを含む部分を除いた領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約３．０ｋｂｐのＤＮＡ（ｐＹＥＳ−ＵＲＡ３）を取得した。次に、ｐＹＥＳ−ＵＲＡ３断片とＰｍｅｔ３−ＥＲＧ７＿Ｓ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、プラスミドｐＹＥＳ−Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７−ＵＲＡ３を得た。このプラスミドＤＮＡを鋳型として、ｐＹＥＳ−ＵＲＡｐ−Ｒ（ＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣ）（配列番号９２）及びｐＹＥＳ−ＵＲＡｔ−Ｆ（ＡＡＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡＴＡＡＧＴＡＡＡＴＧＣＡＴＧ）（配列番号９）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲにより、このプラスミドのＵＲＡ３遺伝子を除く領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約３．５ｋｂｐのＤＮＡを取得した。このＤＮＡ断片とＫａｎＲのＤＮＡ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、ｐＹＥＳ−Ｐｍｅｔ７＿ＥＲＧ７−ＵＲＡ３のＵＲＡ３遺伝子をＫａｎＲで置換したｐＹＥＳ−Ｐｍｅｔ７＿ＥＲＧ７−ＫａｎＲを得た。さらにこのプラスミドＤＮＡを鋳型として、Ｐｍｅｔ−Ｆ５（ＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＴＴＡＧＴＡＣＴＡＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＴＴＧ）（配列番号１５）及びＫｍ−Ｆ（ＡＴＧＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡ）（配列番号９３）の両プライマーにてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲにより、このプラスミドのＵＲＡ３遺伝子上流部分を除く領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約４．２ｋｂｐのＤＮＡを取得した。このＤＮＡ断片とＰｔｅｆ１のＤＮＡ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、ＫａｎＲの上流にＰｔｅｆ１が挿入されたプラスミドｐＹＥＳ−Ｐｍｅｔ３−ＥＲＧ７−Ｐｔｅｆ１＿ＫａｎＲを構築した。このプラスミドｐＹＥＳ−Ｐｍｅｔ３−ＥＲＧ７−Ｐｔｅｆ１＿ＫａｎＲを鋳型として、ＴＥＦ１−ＥＭ−７−Ｆ−ｌｉｎｋ（ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣ）（配列番号８９）及び−ｐＹＥＣ−Ｔｕｒａ＿Ｒ（ＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＧ）（配列番号９４）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＰｔｅｆ１＿ＫａｎＲ＿Ｔｕｒａ３の領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．５ｋｂｐのＤＮＡを取得した。

次に、出芽酵母ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐｇａｌ８０−Ｆ（ＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＧＴＴＡＡＣＣＡＡＣＣＴＡＡＡＧＧＴＡＴＴＡＡＣ）（配列番号９５）及びＰｇａｌ８０−Ｒ（ＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＡＡＧＡＡＣＧＧ）（配列番号９６）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲを行い、ＧＡＬ８０のプロモーター領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約０．４ｋｂｐのＤＮＡ（Ｐｇａｌ８０）を取得した。同様に、Ｔｇａｌ８０−Ｆ（ＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＴＧ）（配列番号９７）及びＴｇａｌ８０−Ｒ（ａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔＧＴＴＡＡＣＡＧＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴ）（配列番号９８）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲを行い、ＧＡＬ８０のターミネーター領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約０．４ｋｂｐのＤＮＡ（Ｔｇａｌ８０）を取得した。また、ｐＹＥＳ−Ｐｍｅｔ３−ＥＲＧ７−Ｐｔｅｆ１＿ＫａｎＲのプラスミドＤＮＡを鋳型として、の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲにより同ベクターのＰｍｅｔ３＿ＥＲＧ７＿Ｔｃｙｃ１及びＰｔｅｆ１＿ＫａｎＲ＿Ｔｕｒａ３領域を除く部分を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＰＹＥＳ＿ｐＵＣｏｒｉ）を取得した。ＰＹＥＳ＿ｐＵＣｏｒｉ断片、Ｐｇａｌ８０断片、Ｔｇａｌ８０断片、及び、Ｐｔｅｆ１＿ＫａｎＲ＿Ｔｕｒａ３断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、プラスミドｐＰｇａｌ８０−ＫａｎＲ−Ｔｇａｌ８０を得た。ＧｅｎｅＡｒｔ^TMＳｔｒｉｎｇｓ^TMＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔｓ合成にてタルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）由来ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０還元酵素（ＧｅｎＰｅｐｔ登録ＸＰ＿００３６０２８９８．１；配列番号１４２）の遺伝子（以後、ＭｔＣＰＲ２；配列番号１４３）配列を有するＤＮＡを合成した。このＤＮＡを、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＥＳＣ−ＴＲＰプラスミドのＤＮＡ断片と混合したのちＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、ｐＥＳＣ−ＭｔＣＰＲ２−ＴＲＰを構築した。このプラスミドＤＮＡを鋳型として、Ｐｇａｌ１−Ｆ−ＮｇｏＭＩＶ（ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＧＧＡＴＴＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧ）（配列番号９９）及びＭｔＣＰＲ−Ｒ（ＧＧＣＡＡＧＡＴＧＣＴＡＴＣＧＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣ）（配列番号１００）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＰｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ２の領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約２．６ｋｂｐのＤＮＡを取得した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｇｏＭＩＶ及びＣｌａＩで消化したｐＧａｌ８０−ＫａｎＲ−Ｔｇａｌ８０のＤＮＡ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、プラスミドｐＧａｌ８０−ＫａｎＲ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ２＿Ｔｇａｌ８０を得た。ＹｅａｓｔＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により調製した出芽酵母ＹＰＨ５００のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｇａｌ７−１０１０−Ｒ（ＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＧ）（配列番号１０１）及びＧａｌ７−３０−Ｆ（ＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＴＡＧＡＣＧＴＴＡＣ）（配列番号１０２）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＧＡＬ７遺伝子の３０番目の塩基から１０１０番目の塩基までを増幅したのち、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片（ｇａｌ７内部断片）を取得した。同様に、Ｔｇａｌ１−１６０５Ｆ（ＴＧＴＴＴＧＧＴＡＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＡＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＣ）（配列番号１０３）及びＴｇａｌ１−２３８６−Ｒ（ａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔＧＴＴＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＡＴＧＧ）（配列番号１０４）の両プライマーにて、ＫＯＤＦｘＮｅｏＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによりＧＡＬ１ターミネーター領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片（Ｔｇａｌ１）を取得した。上記にて得られたプラスミドｐＧａｌ８０−ＫａｎＲ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ２＿Ｔｇａｌ８０を鋳型にｐＹＥＣ−Ｔｕｒａ＿Ｒ１（ＴＣＧＡＧＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＧ）（配列番号１０５）及びＭｔＣＰＲ−Ｒ１（ＡＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＡＡＡＣＡＴＣＴＣＴＴＡＡＧ）（配列番号１０６）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲにより、ＫａｎＲ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ２の領域を増幅した。その後、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約４．０ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＫａｎＲ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ２）を取得した。このＤＮＡ断片及びＴｇａｌ１断片を混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてプライマーを添加しないＰＣＲを進めた後、ｐＹＥＣ−Ｔｕｒａ＿Ｒ１（ＴＣＧＡＧＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＧ）（配列番号１０５）及びＴｇａｌ１−２３８６−Ｒ（ａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔＧＴＴＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＡＴＧＧ）（配列番号１０４）の両プライマーを添加してさらにＰＣＲを行い、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約４．８ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＫａｎＲ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ２＿Ｔｇａｌ１）を取得した。このＫａｎＲ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ２＿Ｔｇａｌ１断片、ｇａｌ７０内部断片、及び、ＰＹＥＳ＿ｐＵＣｏｒｉ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、プラスミドｐＹＥＳ−ｇａｌ７−Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ２を構築した。

＜実施例２１＞Δｇａｌ１，７，１０：：Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１−ＭｔＣＰＲ２のＤＮＡ断片取得
＜実施例２０＞にて得られたプラスミドｐＹＥＳ−ｇａｌ７−Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ２のＤＮＡを制限酵素ＨｐａＩで消化しΔｇａｌ１，７，１０：：Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１−ＭｔＣＰＲ２のＤＮＡ断片を取得した。

＜実施例２２＞ｐＹＥＳ−ｇａｌ７−Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ１のプラスミド構築
タルウマゴヤシ由来ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０還元酵素（ＧｅｎＰｅｐｔ登録ＸＰ＿００３６１０１０９．１（配列番号１４４））は＜実施例２０＞記載の同じくタルウマゴヤシ由来ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０還元酵素（ＧｅｎＰｅｐｔ登録ＸＰ＿００３６０２８９８．１）とのアミノ酸配列同一性が７０％である。この遺伝子（以後、ＭｔＣＰＲ１（配列番号１４５））配列を有するＤＮＡ断片をＧｅｎｅＡｒｔ^TMＳｔｒｉｎｇｓ^TMＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔｓ合成にて取得した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＥＳＣ−ＴＲＰプラスミドのＤＮＡ断片と混合してＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、ｐＥＳＣ−ＭｔＣＰＲ２−ＴＲＰを構築した。このプラスミドＤＮＡを鋳型として、Ｐｇａｌ１−Ｆ−ＮｇｏＭＩＶ（ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＧＧＡＴＴＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧ）（配列番号９９）及びＭｔＣＰＲ−Ｒ（ＧＧＣＡＡＧＡＴＧＣＴＡＴＣＧＡＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣ）（配列番号１００）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによりＰｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ１の領域を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約２．６ｋｂｐのＤＮＡを取得した。これで得られたＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩで消化してＰｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ１／ＸｈｏＩ断片を取得した。また、＜実施例２０＞で取得したプラスミドｐＹＥＳ−ｇａｌ７−Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ２のＤＮＡを鋳型にＴＥＲ−ＥＭ−７−Ｆ−ｌｉｎｋ（ＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣ）（配列番号８９）及びＴｇａｌ１−１６０５Ｆ（ＴＧＴＴＴＧＧＴＡＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＡＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＣ）（配列番号１０３）にて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲにより、Ｐｇａｌ１−ＭｔＣＰＲ２を除くベクター部分を増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約５．０ｋｂｐのＤＮＡ断片（Ｔｇａｌ１−ｇａｌ７−ＫａｎＲ＿Ｐｔｅｆ１）を取得した。このＤＮＡ断片をさらに制限酵素ＮｇｏＭＩＶで消化したうえで、Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ１／ＸｈｏＩ断片と混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、プラスミドｐＹＥＳ−ｇａｌ７−Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ１を構築した。

＜実施例２３＞Δｇａｌ１，７，１０：：Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ１のＤＮＡ断片取得
＜実施例２２＞にて得られたプラスミドｐＹＥＳ−ｇａｌ７−Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ１のＤＮＡを制限酵素ＨｐａＩで消化し、Δｇａｌ１，７，１０：
：Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ１のＤＮＡ断片を取得した。

＜実施例２４＞酵母株ＹＪＴ８の構築
出芽酵母ＹＰＨ５００を＜実施例７＞で取得したｅｒｇ７：：Ｐｇａｌ１＿ＧｕＣＹＢ５−Ｐｇａｌ１０＿ＧｕＣＰＲ１−ＨＩＳ３−Ｐｍｅｔ３＿ＥＲＧ７のＤＮＡ断片で形質転換した。次に、得られた形質転換酵母株を＜実施例１０＞で取得したｔｒｐ１：：Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ２０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１−ＴＲＰ１のＤＮＡ断片を用いて形質転換した。これにより得られた形質転換酵母株を＜実施例１３＞で取得したｕｒａ３：：Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１０−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１９−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ１２−ＵＲＡ３のＤＮＡ断片を用いて形質転換した。これにより得られた形質転換酵母株を続いて＜実施例１６＞で取得したａｄｅ２：：Ｐｇａｌ１＿ＩＤＩ１−Ｐｇａｌ１０＿ＥＲＧ１３−Ｐｇａｌ１＿ＥＲＧ８−ＡＤＥ２のＤＮＡ断片で形質転換した。これにより得られた形質転換酵母株をさらに＜実施例１９＞で取得したｌｙｓ２：：ＬＹＳ２−Ｐｇａｌ１０＿ｕｐｃ２−１−Ｐｇａｌ１＿ｔＨＭＧ１のＤＮＡ断片により形質転換し酵母株ＹＪＴ８を得た。

＜実施例２５＞酵母株の構築
酵母株ＹＪＴ８を＜実施例２３＞で取得したΔｇａｌ１，７，１０：：Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１＿ＭｔＣＰＲ１のＤＮＡ断片、または、＜実施例２１＞で取得したΔｇａｌ１，７，１０：：Ｐｔｅｆ１＿Ｋａｎ−Ｐｇａｌ１−ＭｔＣＰＲ２のＤＮＡ断片で形質転換し、それぞれ酵母株ＹＪＴ８ａ、または、酵母株ＹＪＴ８ｂを得た。

＜実施例２６＞オレアナン型トリテルペン１１位酸化酵素（ＣＹＰ８８Ｄ６）酵母発現ベクターであるｐＥＳＣ−ＣＹＰ８８Ｄ６の構築
ｐＵＣ−５７にクローニングされたウラルカンゾウＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓ β−アミリン１１位酸化酵素ＣＹＰ８８Ｄ６（配列番号１４６）の合成遺伝子配列ＣＹＰ８８Ｄ６（配列番号１４７）を鋳型として、ｓｙｎＣＹＰ８８Ｄ６−Ｆ１（ａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＣＴＧ）（配列番号１０７）及びｓｙｎＣＹＰ８８Ｄ６−Ｒ１（ｃｃｇｃｇｇｔａｃｃａａｇｃｔｔＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＴＡＣＴＴＴＧＡＴＧ）（配列番号１０８）の両プライマーを用い、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）により９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×２６サイクルからなるＰＣＲを行い、ＣＹＰ８８Ｄ６を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約１．５ｋｂｐの増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製した。一方、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＤＮＡを鋳型として、ＬＥＵ２ｄ−Ｆ（ａａａａａｇｇｃｇｃｃＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＴＣ）（配列番号１０９）及びＬＥＵ２ｄ−Ｒ（ＴＴＴＣｇｇｃｇｃｃｔｔｔｔｔｔａｔａｔａｔａｔｔｔｃａａｇｇａｔａｔａｃ）（配列番号１１０）の両プライマーにて、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてｐＥＳＣ−ＬＥＵのＬＥＵ２遺伝子の上流を除く領域を増幅した。ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約７．０ｋｂｐのＤＮＡを取得した。このＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて環化し、ＬＥＵ２遺伝子のプロモーター領域を短縮したプラスミドｐＥＳＣ−ＬＥＵｄを得た。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。これらをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応して、ＣＹＰ８８Ｄ６酵母発現ベクターであるｐＥＳＣ−ＣＹＰ８８Ｄ６を得た。

＜実施例２７＞ＣＹＰ８８Ｄ６とβ−アミリン合成酵素（ＬｊＯＳＣ１）の酵母での同時発現ベクターｐＥＳＣ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６の構築
ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）エントリーベクターにクローニングされたミヤコグサＬｏｔｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓのβ−アミリン合成酵素（ＯＳＣ１）（配列番号１４８）の人工合成遺伝子配列（配列番号１４９）を鋳型として、ＯＳＣ１−ＮｏｔＩ−Ｆ（ＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣ）（配列番号１１１）及びＯＳＣ１−ＳａｃＩ−Ｒ（ＧＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＧＡＴＧＧＣ）（配列番号１１２）を用い、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）により９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃３０秒間）×３６サイクルからなるＰＣＲを行い、ＯＳＣ１を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約２．３ｋｂの増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製した。一方、実施例２６で作製したｐＥＳＣ−ＣＹＰ８８Ｄ６も同様に制限酵素ＮｏｔＩ及びＳａｃＩで消化し、これらをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応して、ＣＹＰ８８Ｄ６とＬｊＯＳＣ１の酵母での同時発現ベクターｐＥＳＣ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を得た。

＜実施例２８＞出芽酵母ＡＤＨ２プロモーターＤＮＡ断片の調製
ＹｅａｓｔＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により調製した出芽酵母ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐａｄｈ２−ＮｇｏＭＩＶ−Ｆ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇＧＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ）（配列番号１１３）及びＰａｄｈ２−Ｒ（ＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＧＡＴＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＧ）（配列番号１１４）の両プライマーを用い、ＫＯＤＦＸＮｅｏＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）により９４℃で１分間処理した後、（９８℃１０秒間→６０℃３０秒間→６８℃６０秒間）×３３サイクルからなるＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約０．５９ｋｂの増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し、出芽酵母ＡＤＨ２プロモーターのＤＮＡ断片を得た。

＜実施例２９＞出芽酵母ＴＥＦ１ターミネーターＤＮＡ断片の調製
出芽酵母ＢＹ４７４２のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＴＥＦ１ｔｅｒ−Ｆ（ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＴＧＡＴＡＡＧＡＣＴＴＴＴＣＴＡＧ）（配列番号１１５）及びＴＥＦ２ｔｅｒ−Ｒ（ａｔａｔａａａａａａｇｇｃｇｃｃＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＧ）（配列番号１１６）の両プライマーを用い、ＫＯＤＦＸＮｅｏＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）により９４℃で１分間処理した後、（９８℃１０秒間→６０℃３０秒間→６８℃６０秒間）×３３サイクルからなるＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約０．１７ｋｂの増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し、出芽酵母ＴＥＦ１ターミネーターＤＮＡ断片を得た。

＜実施例３０＞
麹菌ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅのＣＹＰ５１０６Ａ１遺伝子の調製
ＧｅｎｅＡｒｔ^TM Ｓｔｒｉｎｇｓ^TM ＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔｓ合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にてＣＹＰ５１０６Ａ１−Ｎ末端ＤＮＡ断片（７４０ｂｐ）及びＣＹＰ５１０６Ａ１−Ｃ末端側ＤＮＡ断片（９１５ｂｐ）をそれぞれ合成した。両ＤＮＡ断片を混合後、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）により９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×１３サイクルからなるＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約１．６ｋｂの増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し、麹菌ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅのＣＹＰ５１０６Ａ１のＤＮＡ断片（配列番号１３２）を得た。

＜実施例３１＞ＡＤＨ２プロモーター＿ＣＹＰ５１０６Ａ１ＤＮＡ断片の調製
＜実施例２８＞により得られたＡＤＨ２プロモーターＤＮＡ断片と＜実施例３０＞により得られたＣＹＰ５１０６Ａ１ＤＮＡ断片を混合後、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）により９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５０℃１０秒間→７２℃２０秒間）×４サイクルからなるＰＣＲを行った後、Ｐａｄｈ２−ＮｇｏＭＩＶ−Ｆ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇＧＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ）（配列番号１１３）及びｌｉｎｋｔｏ＃８８−Ｒ（ＡＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡ）（配列番号１１７）の両プライマーを添加、更に９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５０℃５秒間→７２℃２０秒間）×３３サイクルからなるＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約２．２ｋｂの増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し、ＡＤＨ２プロモーター＿ＣＹＰ５１０６Ａ１のＤＮＡ断片を取得した。

＜実施例３２＞ＡＤＨ２プロモーター＿ＣＹＰ５１０６Ａ１＿Ｔｔｅｆ１ＤＮＡ断片の調製
＜実施例３１＞により得られたＡＤＨ２プロモーター＿ＣＹＰ５１０６Ａ１のＤＮＡ断片と＜実施例２９＞により得られた出芽酵母ＴＥＦ１ターミネーターＤＮＡ断片を混合後、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）により９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５０℃１０秒間→７２℃２０秒間）×４サイクルからなるＰＣＲを行った後、Ｐａｄｈ２−ＮｇｏＭＩＶ−Ｆ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇＧＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ）（配列番号１１３）及びＴＥＦ１ｔｅｒ−Ｒ（ａｔａｔａａａａａａｇｇｃｇｃｃＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＧ）（配列番号１１６）の両プライマーを添加、更に９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃２０秒間）×３３サイクルからなるＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約２．４ｋｂの増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し、ＡＤＨ２プロモーター＿ＣＹＰ５１０６Ａ１＿Ｔｔｅｆ１のＤＮＡ断片を取得した。

＜実施例３３＞ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＣＹＰ５１０６Ａ１−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６の構築
ｐＥＳＣ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を制限酵素ＮｇｏＭＩＶ、及び、ＫａｓＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ社）で消化したのち、＜実施例３２＞により得られたＡＤＨ２プロモーター＿ＣＹＰ５１０６Ａ１＿Ｔｔｅｆ１のＤＮＡ断片と混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応して、酵母での同時発現ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＣＹＰ５１０６Ａ１−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を得た。

＜実施例３４＞ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−Ｐａｄｈ２＿ＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉ−Ｔｃｙｃ１−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６の構築
タルウマゴヤシＣＹＰ７２Ａ６３の合成遺伝子配列（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）を含むｐＵＣ−５７プラスミドＤＮＡを鋳型として、ｓｙｎＣＹＰ７２Ａ６３−Ｆ１（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＣＴＡＣ）（配列番号１１８）及びｓｙｎＣＹＰ７２Ａ６３−Ｒ１（ＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＡＡＴＡＧＡＡＧ）（配列番号１１９）の両プライマー並びにＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加して、９５℃で２分間処理した後、（９８℃、１０秒間→５５℃、５秒間→７２℃２０秒間）×３７サイクルからなるＰＣＲを行い、ＣＹＰ７２Ａ６３を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約１．６ｋｂの増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで精製した。得られたＣＹＰ７２Ａ６３のＤＮＡ断片と＜実施例８＞により得られたＣＹＣ１ターミネーターＤＮＡ断片−ｂのＤＮＡ断片を混合後、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加して、９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃２０秒間）×４サイクルからなるＰＣＲを行った後、ｓｙｎＣＹＰ７２Ａ６３−Ｆ１（ｇａｇａａａａａａｃｃｃｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＣＴＡＣ）（配列番号１１８）及びＤＥＳＴ５２−ＣＹＣ１ｔ−Ｒ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇｇＣＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＴ）（配列番号２７）の両プライマーを添加、更に９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃２０秒間）×２４サイクルからなるＰＣＲにより、ＣＹＰ７２Ａ６３−ＣＹＣ１ターミネーターを増幅し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔで約１．８ｋｂｐのＤＮＡを精製した。このＣＹＰ７２Ａ６３−ＣＹＣ１ターミネーターのＤＮＡ断片と＜実施例２８＞により得られたＡＤＨ２プロモーターＤＮＡ断片を混合後、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加して、９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５０℃１０秒間→７２℃２０秒間）×４サイクルからなるＰＣＲを行った後、Ｐａｄｈ２−ＮｇｏＭＩＶ−Ｆ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇＧＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ）（配列番号１１３）およびＤＥＳＴ５２−ＣＹＣ１ｔ−ＫａｓＩ−Ｒ（ａｔａｔａａａａａａｇｇｃｇｃｃＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＴ）（配列番号１２０）の両プライマーを添加、更に９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃２０秒間）×２４サイクルからなるＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔでＡＤＨ２プロモーター＿ＣＹＰ７２Ａ６３＿ＣＹＣ１ターミネーター（以後、Ｐａｄｈ２＿ＣＹＰ７２Ａ６３＿Ｔｃｙｃ１）に相当する約２．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。このＰａｄｈ２＿ＣＹＰ７２Ａ６３＿Ｔｃｙｃ１のＤＮＡ断片を鋳型として、Ｐａｄｈ２−ＮｇｏＭＩＶ−Ｆ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇＧＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ）（配列番号１１３）およびＡ６３ｏｐｔ＿４４３＿Ｒ（ＡＴＡＣＣＴＡＣＴＧＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＧＧ）（配列番号１２１）の両プライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加して、９５℃で４分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×２７サイクルからなるＰＣＲを行い、ＡＤＨ２プロモーターからＣＹＰ７２Ａ６３遺伝子の５’末端４４３ｂｐまでのＤＮＡ（以後、ＣＹＰ７２Ａ６３−ａ）を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。続いて、ＣＹＰ７２Ａ６３の１４９番目のアミノ酸残基ロイシンのコドン（ＣＴＡ）をイソロイシンのコドン（ＡＴＴ）に置換したプライマーＡ６３ｏｐｔ−１４９Ｉ＿Ｆ（ＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＧＧＴＡＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＧＧ）（配列番号１２２）及びプライマーＤＥＳＴ５２−ＣＹＣ１ｔ−Ｒ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇｇＣＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＴ）（配列番号２７）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅにより９５℃で４分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×２７サイクルからなるＰＣＲを行い、ＣＹＰ７２Ａ６３遺伝子の５’末端スタートコドンから４２８番目塩基からＣＹＣ１ターミネーターまでのＤＮＡ断片（以後、ＣＹＰ７２Ａ６３−ｂ）を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。ｐＥＳＣ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を制限酵素ＮｇｏＭＩＶ及びＫａｓＩ（いずれもＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ社）で消化したのち、上記により得られたＣＹＰ７２Ａ６３−ａ及びＣＹＰ７２Ａ６３−ｂのＤＮＡ断片と混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、酵母での発現ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−Ｐａｄｈ２＿ＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉ＿Ｔｃｙｃ１−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を構築した。

＜実施例３５＞発現ベクター―ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−Ｐａｄｈ２＿ＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６の構築
＜実施例３４＞で構築したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−Ｐａｄｈ２＿ＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉ＿Ｔｃｙｃ１−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６のＤＮＡを鋳型として、
Ｐａｄｈ２−ＮｇｏＭＩＶ−Ｆ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇＧＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ）（配列番号１１３）およびｌｉｎｋｔｏ＃８８−Ｒ（ＡＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡ）（配列番号１１７）の両プライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅにより９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃２０秒間）×３０サイクルからなるＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いＰａｄｈ２＿ＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉに相当する約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。続いて、このＤＮＡ断片及び＜実施例２９＞で取得した出芽酵母ＴＥＦ１ターミネーターのＤＮＡ断片並びに制限酵素ＮｇｏＭＩＶとＫａｓＩで消化したｐＥＳＣ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６のＤＮＡ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて反応して、酵母での同時発現ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−Ｐａｄｈ２＿ＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を得た。

＜実施例３６＞ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｏｍｉｎｕｓＮＲＲＬ１３１３７由来のチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子の調製
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ由来ＣＹＰ５１０６Ａ１とアミノ酸配列一致性が７９％であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｏｍｉｕｓＮＲＲＬ１３１３７由来のチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（以下、「ＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ」と記載）について、ＧｅｎｅＡｒｔ^TM Ｓｔｒｉｎｇｓ^TM ＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔｓ合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により、同アミノ酸配列のＮ末端側に相当する約６００ｂｐからなるＤＮＡ断片、及び、同じくアミノ酸配列のＣ末端側に相当する約１０００ｂｐからなるＤＮＡ断片をそれぞれ合成した。両ＤＮＡ断片を混合後、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）により９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×１３サイクルからなるＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約１．６ｋｂのＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇのＤＮＡ断片（配列番号１３３）の増幅を確認した。

＜実施例３７＞ＡＤＨ２プロモーター＿ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ＿Ｔｔｅｆ１のＤＮＡ断片の調製
＜実施例３６＞により得られたＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇのＤＮＡ断片と＜実施例２９＞により得られた出芽酵母ＴＥＦ１ターミネーターＤＮＡ断片を混合後、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）により９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５０℃１０秒間→７２℃１５秒間）×４サイクルからなるＰＣＲを行った後、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ−Ｆ（ＣＴＡＴＴＡＡＣＴＡＴＡＴＣＧＴＡＡＴＡＣＡＣＡＡＴＧＴＣＣＴＴＣＧＴＴＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＴ）（配列番号１２３）及びＴＥＦ１ｔｅｒ−Ｒ（ａｔａｔａａａａａａｇｇｃｇｃｃＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＧ）（配列番号１１６）の両プライマーを添加、更に９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５０℃５秒間→７２℃１５秒間）×２７サイクルからなるＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約１．８ｋｂのＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ＿Ｔｔｅｆ１のＤＮＡ断片の増幅を確認した。次に、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ＿Ｔｔｅｆ１のＤＮＡ断片と＜実施例２８＞により得られたＡＤＨ２プロモーターＤＮＡ断片を混合後、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）により９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５０℃１０秒間→７２℃２０秒間）×４サイクルからなるＰＣＲを行った後、Ｐａｄｈ２−ＮｇｏＭＩＶ−Ｆ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇＧＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ）（配列番号１１３）及びＴＥＦ１ｔｅｒ−Ｒ（ａｔａｔａａａａａａｇｇｃｇｃｃＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＧ）（配列番号１１６）の両プライマーを添加、更に９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃２０秒間）×２７サイクルからなるＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約２．４ｋｂの増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し、ＡＤＨ２プロモーター＿ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ＿Ｔｔｅｆ１のＤＮＡ断片を取得した。

＜実施例３８＞ベクターｐＥＳＣ−ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６の構築
ｐＥＳＣ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を制限酵素ＮｇｏＭＩＶ、及び、ＫａｓＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ社）で消化したのち、＜実施例３７＞により得られたＡＤＨ２プロモーター＿ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ＿Ｔｔｅｆ１のＤＮＡ断片と混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応して、酵母での発現ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を得た。

＜実施例３９＞ＡＤＨ２プロモーター＿ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）＿Ｔｔｅｆ１のＤＮＡ断片を調製
ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（配列番号１３５）とＣＹＰ５１０６Ａ１の全長アミノ酸配列一致性は７９％であるが、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇはＣＹＰ５１０６Ａ１のＮ末端から１３０番目のアミノ酸から１４２番目のアミノ酸まで連続１３残基の欠損がある（図４）。そこで、ＣＹＰ５１０６Ａ１のＮ末端から１３０−１４２番目の１３アミノ酸の配列をＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇの１２９番目のグルタミン酸残基後に挿入したＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）（配列番号１３６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３４）を含む発現ユニットとしてＡＤＨ２プロモーター＿ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）＿Ｔｔｅｆ１のＤＮＡ断片を調製した。

まず、ＡＤＨ２プロモーターからＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇのＮ末端から１２９番目までのアミノ酸配列とその直後に挿入する１３アミノ酸配列のＮ末端側部分を含む領域のＤＮＡ（以後、「ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ａ」と記載）を増幅するため、＜実施例３７＞で得られたＡＤＨ２プロモーター＿ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ＿Ｔｔｅｆ１のＤＮＡ断片を鋳型として、Ｐａｄｈ２−ＮｇｏＭＩＶ−Ｆ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇＧＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ）（配列番号１１３）及びＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ−ＧＦ−Ｒ（ＧＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＡＣＣＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＴＴＧ）（配列番号１２４）の両プライマーを用い、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）により９５℃で２分間処理した後、更に９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×２７サイクルからなるＰＣＲを行い、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ａのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約１ｋｂの増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製した。続いて、挿入する１３アミノ酸配列のＣ末端側部分からＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇのＮ末端より１３０番目からＣ末端までのアミノ酸配列とＴｔｅｆ１までのＤＮＡ（以後、「ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ｂ」と記載）を増幅するため、＜実施例３７＞で得られたＡＤＨ２プロモーター＿ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ＿Ｔｔｅｆ１のＤＮＡ断片を鋳型として、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ−ＧＦ−Ｆ（ＣＧＧＴＡＡＧＡＡＣＴＴＧＧＣＴＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＡＡＡＧ）（配列番号１２５）及びＴＥＦ１ｔｅｒ−Ｒ（ａｔａｔａａａａａａｇｇｃｇｃｃＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＧ）（配列番号１１６）の両プライマーを用い、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）により９５℃で２分間処理した後、更に９５℃で２分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×２７サイクルからなるＰＣＲを行い、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ｂのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、約１．４ｋｂの増幅断片をＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ｂのＤＮＡ断片を取得した。

＜実施例４０＞ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６の構築
ｐＥＳＣ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を制限酵素ＮｇｏＭＩＶ、及び、ＫａｓＩ（いずれもＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ社）で消化したのち、＜実施例３９＞により得られたＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ａ及びＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ｂのＤＮＡ断片と混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応して、酵母での発現ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を得た。

＜実施例４１＞ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）とＣＹＰ５１０６Ａ１のキメラ遺伝子Ａ２１／Ａ１４の発現ベクターの構築
＜実施例４０＞により得られたベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を鋳型として、Ｐａｄｈ２−ＮｇｏＭＩＶ−Ｆ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇＧＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ）（配列番号１１３）及びＣＹＰ５１０６Ａ−４２５−Ｒ（ＴＣＡＡＣＡＧＴＡＧＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＡＣ）（配列番号１２６）の両プライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅにより９５℃で４分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×３０サイクルからなるＰＣＲを行い、ＡＤＨ２プロモーターからＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）のＮ末端１３７番アミノ酸残基までのＤＮＡ断片（以後、Ａ２−１ＤＮＡ断片）を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。同時に、＜実施例３３＞により得られたベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＣＹＰ５１０６Ａ１−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６のＤＮＡを鋳型として、ＣＹＰ５１０６Ａ−４１１−Ｆ（ＣＴＴＧＧＣＴＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＧ）（配列番号１２７）及びＴＥＦ１ｔｅｒ−Ｒ（ａｔａｔａａａａａａｇｇｃｇｃｃＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＧ）（配列番号１１６）の両プライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加して９５℃で４分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×３０サイクルからなるＰＣＲを行い、ＣＹＰ５１０６Ａ１のＮ末端１３８番アミノ酸残基からＴＥＦ１ターミネーターまでのＤＮＡ断片（以後、Ａ１−４ＤＮＡ断片）を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。続いて、Ａ２−１ＤＮＡ断片、Ａ１−４ＤＮＡ断片と制限酵素ＮｇｏＭＩＶ、及び、ＫａｓＩで消化したｐＥＳＣ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６の断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）（１−１４１ａａ）／ＣＹＰ５１０６Ａ１（１４２−５３４ａａ）のキメラ遺伝子（Ａ２１／Ａ１４）発現ユニットを含む酵母での同時発現ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−Ａ２１／Ａ１４−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を得た。

＜実施例４２＞ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）とＣＹＰ５１０６Ａ１のキメラ遺伝子Ａ２２／Ａ１５の発現ベクターの構築
＜実施例４０＞により得られたベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を鋳型として、Ｐａｄｈ２−ＮｇｏＭＩＶ−Ｆ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇＧＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ）（配列番号１１３）及びＣＹＰ５１０６Ａ１−８５９−Ｒ（ＴＡＧＡＧＧＡＣＡＡＣＡＡＡＴＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣ）（配列番号１２８）の両プライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅにより９５℃で４分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×３０サイクルからなるＰＣＲを行い、ＡＤＨ２プロモーターからＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）のＮ末端２８２番アミノ酸残基までのＤＮＡ断片（以後、Ａ２−２ＤＮＡ断片）を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。

次に、＜実施例３３＞により得られたベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＣＹＰ５１０６Ａ１−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６のＤＮＡを鋳型として、ＣＹＰ５１０６Ａ１−８４５−Ｆ（ＡＴＴＴＧＴＴＧＴＣＣＴＣＴＡＴＴＴＴＧＧＣＴＣＣ）（配列番号１２９）及びＴＥＦ１ｔｅｒ−Ｒ（ａｔａｔａａａａａａｇｇｃｇｃｃＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＧ）（配列番号１１６）の両プライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加して９５℃で４分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×３０サイクルからなるＰＣＲを行い、ＣＹＰ５１０６Ａ１のＮ末端２８３番アミノ酸残基からＴＥＦ１ターミネーターまでのＤＮＡ断片（以後、Ａ１−５ＤＮＡ断片）を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。続いて、Ａ２−２ＤＮＡ断片、Ａ１−５ＤＮＡ断片と制限酵素ＮｇｏＭＩＶ、及び、ＫａｓＩで消化したｐＥＳＣ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６の断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）（１−２８６ａａ）／ＣＹＰ５１０６Ａ１（２８７−５３４ａａ）のキメラ遺伝子（Ａ２２／Ａ１５）発現ユニットを含む酵母での同時発現ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−Ａ２２／Ａ１５−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を得た。

＜実施例４３＞ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）とＣＹＰ５１０６Ａ１のキメラ遺伝子Ａ２３／Ａ１６の発現ベクターの構築の作製
＜実施例４０＞により得られたベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を鋳型として、Ｐａｄｈ２−ＮｇｏＭＩＶ−Ｆ（ｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇＧＣＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣ）（配列番号１１３）及び−ＣＹＰ５１０６Ａ−１２８６−Ｒ（ＡＡＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＣＡＴＴＧ）（配列番号１３０）の両プライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅにより９５℃で４分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×３０サイクルからなるＰＣＲを行い、ＡＤＨ２プロモーターからＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）のＮ末端４２４番アミノ酸残基までのＤＮＡ断片（以後、Ａ２−３ＤＮＡ断片）を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて約１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。次に、＜実施例３３＞により得られたベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＣＹＰ５１０６Ａ１−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６のＤＮＡを鋳型として、ＣＹＰ５１０６Ａ−１２７２−Ｆ（ＧＧＧＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＴＴＧＧＣＴＴＧ）（配列番号１３１）及びＴＥＦ１ｔｅｒ−Ｒ（ａｔａｔａａａａａａｇｇｃｇｃｃＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＧ）（配列番号１１６）の両プライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加して９５℃で４分間処理した後、（９８℃１０秒間→５５℃５秒間→７２℃１５秒間）×３０サイクルからなるＰＣＲを行い、ＣＹＰ５１０６Ａ１のＮ末端４２５番アミノ酸残基からＴＥＦ１ターミネーターまでのＤＮＡ断片（以後、Ａ１−６ＤＮＡ断片）を増幅した。ＰＣＲ溶液を電気泳動し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを用いて約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。続いて、Ａ２−３ＤＮＡ断片、Ａ１−６ＤＮＡ断片と制限酵素ＮｇｏＭＩＶ、及び、ＫａｓＩで消化したｐＥＳＣ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６の断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔを用いて結合し、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）（１−４２８ａａ）／ＣＹＰ５１０６Ａ１（４２９−５３４ａａ）のキメラ遺伝子（Ａ２３／Ａ１６）発現ユニットを含む酵母での同時発現ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−Ａ２３／Ａ１６−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６を得た。

＜実施例４４＞酵母株ＹＪＴ２０１及びＹＪＴ１７９の作製
＜実施例２５＞で取得した酵母株ＹＪＴ８ａを＜実施例３３＞で構築したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＣＹＰ５１０６Ａ１−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６、または、＜実施例３４＞で構築したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６で形質転換し、それぞれ酵母株ＹＪＴ２０１、又は、酵母株ＹＪＴ１７９を得た。

＜実施例４５＞形質転換酵母のＹＪＴ１８４及びＹＪＴ１７７の作製
＜実施例２５＞で取得した酵母株ＹＪＴ８ｂを＜実施例３３＞で構築したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＣＹＰ５１０６Ａ１−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６、又は、＜実施例３４＞で構築したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６で形質転換し、それぞれ酵母株ＹＪＴ１８４、又は、酵母株ＹＪＴ１７７を得た。

＜実施例４６＞菌株ＹＪＴ２２３及びＹＪＴ２２４の作製
＜実施例２５＞で構築した酵母ＹＪＴ８ｂ株を＜実施例３８＞で構築したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６、または、＜実施例４０＞で構築したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６で形質転換し、それぞれ菌株ＹＪＴ２２３、又は、菌株ＹＪＴ２２４を得た。

＜実施例４７＞菌株ＹＪＴ２２５及びＹＪＴ２２６の作製
＜実施例２５＞で構築した酵母ＹＪＴ８ａ株を＜実施例３８＞で構築したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６、又は、＜実施例４０＞で構築したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６で形質転換し、それぞれ菌株ＹＪＴ２２５、又は、菌株ＹＪＴ２２６を得た。

＜実施例４８＞菌株ＹＪＴ２４７、ＹＪＴ２４８、及び、ＹＪＴ２４９の作製
＜実施例２５＞で取得した酵母株ＹＪＴ８ａを＜実施例４１＞で構築した発現ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−Ａ２１／Ａ１４−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６、または、＜実施例４２＞で構築した発現ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−Ａ２２／Ａ１５−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６、あるいは、＜実施例４３＞で構築した発現ベクターｐＥＳＣ−Ｌｅｕ２ｄ−Ａ２３／Ａ１６−ＯＳＣ１−ＣＹＰ８８Ｄ６で形質転換し、それぞれ菌株ＹＪＴ２４７，または、ＹＪＴ２４８、あるいは、ＹＪＴ２４９を得た。

＜実施例４９＞酵母株ＹＪＴ２０１、ＹＪＴ１７９、ＹＪＴ１８４、及び、ＹＪＴ１７７における生成物の蓄積量の確認
＜実施例４４＞及び＜実施例４５＞で構築した酵母株ＹＪＴ２０１、ＹＪＴ１７９、ＹＪＴ１８４、及び、ＹＪＴ１７７を４％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＳＣ−Ｈｉｓ／Ｔｒｐ／Ｌｅｕ／Ｕｒａ／Ｌｙｓ／Ａｄｅ培地（１Ｌに４０ｇグルコース、６．７ｇ酵母ニトロゲンベース（アミノ酸不含）（ＢＤＤｉｆｃｏ^TM社）、及び、それぞれ０．０５ｍｇのＬ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンを含む）に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養した。３０時間後、各酵母株の培養液について、ＯＤ６００ｎｍ値に培養液の容量（ｍＬ）を乗じた値が０．６になる培養液量を２，１００×ｇ、室温で５分間遠心し、その沈殿を１０ｍＬＳＰ培地（２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．５％（ｗ／ｖ）ガラクトース、及び、１ｍＭＬ−メチオニンを含むＳＣ−Ｈｉｓ／Ｔｒｐ／Ｌｅｕ／Ｕｒａ／Ｌｙｓ／Ａｄｅ培地）に懸濁し、３０℃、２３０ｒｐｍで振盪培養した。培養を開始して３日間後、それぞれの培養液に２ｍｌ添加培地（１０％（ｗ／ｖ）グルコース及び２．５％（ｗ／ｖ）ガラクトースを含む水溶液）を添加し、培養開始して７日間後に２ｍｌの２．５％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液を添加した。培養を開始してから１０日間後、０．５ｍｌ培養液に０．４ｍｌの酢酸エチル（富士フイルム和光純薬社）を加えて混合した後、その上層（酢酸エチル層）をできるだけ回収した。この操作を３回繰り返し、回収した酢酸エチル層を合わせたのち、減圧乾燥で酢酸エチル層を除去した。残渣に０．５ｍｌのメタノール：クロロホルム（１：１）を添加してよく混合後、１５，０００ｒｐｍ、５分間、室温で遠心分離した。上清１５ｕｌをガラス製容器にて減圧乾固後、ＭＳＴＦＡ５０μｌに溶解し、８０℃で５０分間加熱したものをＧＣ−ＭＳ分析の試料とした。用いたＧＣ−ＭＳの条件は下記表２に示す。生産物の同定及び定量はβ−アミリン（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社）、グリチルレチン酸（富士フイルム和光純薬社）、及び、Ｓｅｋｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５，１４２０４−１４２０９，２００８、及び、Ｓｅｋｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２３，４１１２−４１２３，２０１１に記載の方法で調製した１１−オキソ−β−アミリン、３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン及び３０−ヒドロキシ−β−アミリンを標品としてＧＣの保持時間ならびにＭＳスペクトルを比較することにより決定したただし、グリチルレトアルデヒドの同定及び定量は想定される分子量及びＧＣ保持時間並びに３０−ヒドロキシ−β−アミリン標品のシグナル強度を参考にした。

その結果、グリチルレチン酸の蓄積量については、酵母ＹＪＴ８ａ株をベースにＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉを発現するＹＪＴ１７９株が平均１８ｍｇ／Ｌであったのに対して、同じ株をベースにＣＹＰ５１０６Ａ１を発現するＹＪＴ２０１株は平均６２ｍｇ／Ｌであった。また、酵母ＹＪＴ８ｂ株をベースとしてＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉを発現するＹＪＴ１７７株が平均４５ｍｇ／Ｌのグリチルレチン酸蓄積であったのに対して、同じ株をベースにＣＹＰ５１０６Ａ１を発現するＹＪＴ１８４株は平均４９ｍｇ／Ｌであり、育種の元株及びオレアナン型トリテルペン３０位酸化酵素への電子伝達蛋白質として用いるＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０還元酵素の分子種に関わらずＣＹＰ５１０６Ａ１を発現する酵母株はＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉを発現する酵母株よりグリチルレチン酸の蓄積量が高く、グリチルレチン酸の発酵生産には好ましいことが示唆された。（下記表３）

また、ＣＹＰ７２Ａ６３Ｌ１４９Ｉを有するＹＪＴ１７７の抽出物において、２９−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリン及び２０−エピ−グリチルレチン酸（ＧＣの保持時間及びＭＳスペクトルを比較することにより決定した）に対応するピークを検出したが、ＣＹＰ５１０６Ａ１を有するＹＪＴ２０１の抽出物において、これらのピークは検出されなかった（図５）。この結果からＣＹＰ５１０６Ａ１を発現する酵母は既存のＣＹＰ７２Ａ６３やその変異体と比較してグリチルリチン酸以外の副産物蓄積がなく、グリチルリチン酸の発酵生産に好ましいことが示唆された。

＜実施例５０＞酵母株ＹＪＴ２２３，ＹＪＴ２２４，ＹＪＴ２２５，ＹＪＴ２２６におけるＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ及びＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）における生成物の蓄積量の確認
＜実施例４６＞及び＜実施例４７＞で得られた酵母株ＹＪＴ２２３、ＹＪＴ２２４、ＹＪＴ２２５、及び、ＹＪＴ２２６株を＜実施例４９＞に記載の方法で培養し、それぞれの菌体から抽出したオレアナン型トリテルペンの蓄積量を比較した。結果を下記表４に示す。ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ遺伝子を導入した酵母株（ＹＪＴ２２３，ＹＪＴ２２５）からは３０位炭素が酸化されたオレアナン型トリテルペンは検出されなかった。一方、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）遺伝子を導入した酵母株（ＹＪＴ２２４，ＹＪＴ２２６）からは３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンが検出されたが、グリチルレトアルデヒド及びグリチルレチン酸はほとんど検出されなかった。この結果から、１１−オキソ−β−アミリンの３０位水酸化活性だけでなく、それをグリチルレチン酸に至るまで酸化する活性をＣＹＰ５１０６Ａ１が有すること、及び、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇに欠失している１３アミノ酸からなる配列はオレアナン型トリテルペンの３０位炭素水酸化活性に重要であるが、それに続く酸化活性への寄与は高くないことが示唆された。

＜実施例５１＞酵母株ＹＪＴ２０１、ＹＪＴ２２６，ＹＪＴ２４７，ＹＪＴ２４８，及び，ＹＪＴ２４９におけるＣＹＰ５１０６Ａ１とＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）のキメラ分子のオレアナン型トリテルペン３０位酸化酵素活性の検証
＜実施例４４＞及び＜実施例４７＞並びに＜実施例４８＞で得られた酵母株ＹＪＴ２０１、ＹＪＴ２２６，ＹＪＴ２４７，ＹＪＴ２４８，及び，ＹＪＴ２４９を＜実施例４９＞記載の方法で培養し、それぞれの菌体から抽出したオレアナン型トリテルペンの蓄積量を比較した。結果を下記表５に示す。ＹＪＴ２２６は＜実施例５０＞と同様に３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンの蓄積を確認したが、その酸化体であるグリチルレトアルデヒド及びグリチルレチン酸の蓄積は検出できなかった。他方、ＡｎＣＹＰ５１０６Ａ１ｈｏｍｏｌｏｇ（ｇａｐ−ｆｉｌｌｅｄ）の全長５３４アミノ酸のうち、Ｃ末端側１１０アミノ酸（Ｎ末端から４２５番目〜５３４番目）の配列をＣＹＰ５１０６Ａ１の同じ位置のアミノ酸配列に置き換えたポリペプチドをコードするキメラ遺伝子Ａ２３／Ａ１６を発現するＹＪＴ２４９ではグリチルレトアルデヒド及びグリチルレチン酸の蓄積を検出できたことから、このアミノ酸領域は３０−ヒドロキシ−１１−オキソ−β−アミリンの３０位水酸基をさらにカルボン酸にまで酸化する機能に重要であることが示唆された。また、本キメラとＣＹＰ５１０６Ａ１のアミノ酸一致性は８５％であった。ＹＪＴ２４７及びＹＪＴ２４８のオレアナン型トリテルペンの蓄積プロファイルはほぼ同等であり、そのグリチルレチン酸蓄積量はＹＪＴ２０１とほぼ同等であったことから、ＣＹＰ５１０６Ａ１のＮ末端から２８３番目〜４２４番目のアミノ酸配列はオレアナン型トリテルペンの３０位水酸基の酸化を促進する機能を有していることが示唆された。

Claims

以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチド、
を１１−オキソ−β−アミリンに作用させる工程を含む、グリチルレチン酸の製造方法。
細胞内で行なう、請求項１に記載の製造方法。
前記細胞が、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドを発現する形質転換体である、請求項２に記載の製造方法。
前記細胞が、さらに、β−アミリン合成酵素、及び／又は、オレアナン型トリテルペン１１位酸化酵素を発現する形質転換体である、請求項３に記載の製造方法。
前記形質転換体の宿主が微生物である、請求項３又は４に記載の製造方法。
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、オレアナン型トリテルペンの３０位の炭素を酸化する活性を有するポリペプチド、
を発現する、グリチルレチン酸産生能を有する形質転換体。
さらに、β−アミリン合成酵素、及び／又は、オレアナン型トリテルペン１１位酸化酵素を発現する、請求項６に記載の形質転換体。
前記形質転換体の宿主が微生物である、請求項６又は７に記載の形質転換体。