KR20200039645A - 세포 소기관이 변이된 재조합 효모 및 이를 이용한 아이소프레노이드 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 조작을 통하여 세포 소기관이 변이된 재조합 효모 및 이를 이용한 다양한 아이소프레노이드 생산 방법에 관한 것이다. 유전자 재조합을 통해 세포 소기관인 퍼옥시좀의 개수 또는 크기가 증가된 변이된 효모에 유용산물인 아이소프레노이드 대사 경로를 도입하는 경우, 세포 소기관 변이가 없는 효모에 비하여 아이소프레노이드 생산량을 현저하게 증대시킬 수 있어 아이소프레노이드의 대량 생산이 가능하며, 이를 통해 아이소프레노이드가 적용되는 다양한 산업 분야에 유용하게 활용 가능하다.
Description
본 발명은 유전자 조작을 통하여 세포 소기관이 변이된 재조합 효모 및 이를 이용한 다양한 아이소프레노이드 생산 방법에 관한 것이다.
기능성 대사 경로를 조절하는 작업은 비효율적 조절 반응, 최적화되지 않은 물리화학적 환경, 경쟁 대사에 대한 대사중간물질의 손실, 대사산물 독성 등 여러가지 문제를 야기한다. 효모는 낮은 pH에서의 성장, 단순한 영양 요구, 바이러스 감염에 대한 낮은 확률 및 기질 및 대사산물 독성에 대한 높은 내성으로 인해 선호되는 산업 유기체이며, 유전자 조작의 용이성, 복잡한 이종 효소들의 발현 능력이 손쉬운 장점이 있다. 효모 대사 공학은 주로 세포질에서 대사 경로를 구축함에 집중되어왔다. 단백질 융합 및 합성 단백질 스케폴드와 같은 대사 경로 최적화 전략은 일부 대사 조절에 따른 생산성을 효과적으로 향상시킬 수 있으나, 스케폴드에 구축 가능한 효소의 수는 이용 가능한 결합 도메인에 의해 제한되며, 단백질 융합체와 스케폴드는 효소 활성에 부정적 영향을 미친다. 따라서 이를 극복하기 위한 다양한 전략이 연구되고 있다.
아이소프레노이드는 테르페노이드(der-penoid), 테르펜(terpene)이라고도 불리는 이소프렌을 구성단위로 하는 유기화합물을 총칭하는 것을 말한다. 천연고무(gum) 등인 탄수화물 이외에 말단관능기가 알코올, 알데히드, 카르복실산(carboxylic acid) 또는 피로인산이 된 화합물이 식물세포 또는 동물세포 내에 나타나는 것으로 알려져 있다. 구성 이소프렌 단위(C5)의 수에 따라 모노테르펜(C10), 세스키테르펜(C15), 디테르펜(C20), 트리테르펜(C30), 테트라테르펜(C40) 등으로 분류하기도 한다.
이소프레노이드 화합물은 23,000가지 이상이 알려져 있는 화학적으로 매우 다양한 물질이다. 이들 화합물 중 대표적인 물질은 콜레스테롤, 퀴논(quinone), 카로티노이드, polyprenyl phosphate와 고무 등으로 기능은 물론 구조에 있어서도 다양성을 보여준다. 11개의 isoprene으로 이루어진 polyprenyl phosphate 는 원핵 세포의 세포벽 합성에 직접 관여한다.
아이소프레노이드는 상업적으로 매우 중요한 형태의 지질이며, 탁월한 윤활성, 산화적 안정성, 낮은 유동점, 낮은 빙점, 수월한 생분해성을 가지고 있다. 또한 동물은 아이소프레노이드의 일종인 카로티노이드를 합성할 수 없기 때문에 반드시 음식을 통해 섭취해야만 한다. 이와 같은 아이소프레노이드의 중요성 및 필요성 때문에, 보다 손쉽게 아이소프레노이드를 제공하기 위하여 인공적으로 합성하거나 일부 조류에서 추출하는 방법이 연구되었고, 최근에는 유전체학과 생물정보학의 발달에 힘입어 미생물세포를 이용한 대사공학적인 대량생산 방법이 시도되고 있다.
그러나 아직까지 아이소프레노이드를 효과적으로 생산할 수 있도록 대사공정이 변경된 미생물이 널리 보고되지 않았으며, 이에 대한 연구의 필요성이 있다.
이에 본 발명자들은 아이소프레노이드를 효과적으로 생산할 수 있는 방법을 연구하던 중, 효모의 세포 소기관을 변이시키고, 아이소프레노이드 생산 관련 대사 공정에 변이를 유발하는 경우, 보다 효과적으로 다양한 아이소프레노이드 생산을 달성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 세포 소기관 조절을 통해 아이소프레노이드의 생산능이 향상될 수 있도록 유전자 조작된 재조합 효모 및 이를 이용한 아이소프레노이드 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 PEX34 (Peroxisomal membrane protein 34) 유전자의 과발현, PEX11 (Peroxisomal membrane protein 11) 유전자의 결실 및 ATG36 (Peroxisome autophagy-related protein 36) 유전자의 결실로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 변이가 도입된, 세포 소기관이 변이된 재조합 효모를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포 소기관이 변이된 재조합 효모에 i) tHMG1 (truncated hydroxy-methyl glutaryl-CoA reductase), CrtE (Geranylgeranyl pyrophosphate synthase) CrtYB (Phytoene synthase-lycopene cyclase), CrtI (Phytoene desaturase) 유전자 세트 및 ii) tHMG1, CrtE, CDPS/KS (ent-copalyl diphosphate/kaurene synthase) 유전자 세트로 이루어진 군에서 선택된 1종의 유전자 세트가 도입된 아이소프레노이드 생산성이 증대된 재조합 효모를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 아이소프레노이드 생산성이 증대된 재조합 효모를 배양하는 단계; 를 포함하는 아이소프레노이드 생산 방법을 제공한다.
유전자 재조합을 통해 세포 소기관인 퍼옥시좀의 개수 또는 크기가 증가된 변이된 효모에 유용산물인 아이소프레노이드 대사 경로를 도입하는 경우, 세포 소기관 변이가 없는 효모에 비하여 아이소프레노이드 생산량을 현저하게 증대시킬 수 있어 아이소프레노이드의 대량 생산이 가능하며, 이를 통해 아이소프레노이드가 적용되는 다양한 산업 분야에 유용하게 활용 가능하다.
도 1은 인위적 세포 소기관 조절능 부여에 의해 퍼옥시좀 (peroxisome) 의 수와 크기가 증가된 변이를 갖는 재조합 효모의 모식도이다.
도 2는 녹색 형광 단백질 (GFP)를 이용해 인위적 세포 소기관 조절능을 가지는 재조합 효모에서의 퍼옥시좀의 개수와 크기 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 에너지 여과 투과전자현미경을 통해 인위적 세포 소기관 조절능을 갖는 재조합 효모의 구조 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 카로티노이드 중 하나인 베타카로틴 생합성 대사 경로의 모식도이다.
도 5는 대조군 효모 CEN-βCN과 인위적 세포 소기관 조절능을 갖는 재조합 효모를 형질전환시킨 베타카로틴 발현 균체(A), PX1-βCN의 균주 성장 곡선(B), 및 베타카로틴 생산량 비교(C) 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 지베렐린 대사물질 중 하나인 카우린 생합성 대사 경로의 모식도이다.
도 7은 대조군 효모 CEN-KRN과 인위적 세포 소기관 조절능을 갖는 재조합 효모를 형질전환시킨 PX1-KRN의 균주 성장 곡선(A) 및 카우린 생산량 비교(B) 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 녹색 형광 단백질 (GFP)를 이용해 인위적 세포 소기관 조절능을 가지는 재조합 효모에서의 퍼옥시좀의 개수와 크기 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 에너지 여과 투과전자현미경을 통해 인위적 세포 소기관 조절능을 갖는 재조합 효모의 구조 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 카로티노이드 중 하나인 베타카로틴 생합성 대사 경로의 모식도이다.
도 5는 대조군 효모 CEN-βCN과 인위적 세포 소기관 조절능을 갖는 재조합 효모를 형질전환시킨 베타카로틴 발현 균체(A), PX1-βCN의 균주 성장 곡선(B), 및 베타카로틴 생산량 비교(C) 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 지베렐린 대사물질 중 하나인 카우린 생합성 대사 경로의 모식도이다.
도 7은 대조군 효모 CEN-KRN과 인위적 세포 소기관 조절능을 갖는 재조합 효모를 형질전환시킨 PX1-KRN의 균주 성장 곡선(A) 및 카우린 생산량 비교(B) 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 PEX34 (Peroxisomal membrane protein 34) 유전자의 과발현, PEX11 (Peroxisomal membrane protein 11) 유전자의 결실 및 ATG36 (Peroxisome autophagy-related protein 36) 유전자의 결실로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 변이가 도입된, 세포 소기관이 변이된 재조합 효모를 제공한다.
본 발명에 있어서, '세포 소기관 변이' 란, 상기와 같은 유전자 변이의 도입에 의하여 종래 야생형 효모 대비 퍼옥시좀 (peroxisome)의 개수 또는 크기가 증가된 변이를 의미한다. 따라서 본 발명의 세포 소기관의 변이는 퍼옥시좀의 개수 또는 크기 증대일 수 있다. 퍼옥시좀은 세포 내 소기관의 하나로 내부에 산화효소와 카탈라아제를 포함하며, 산화작용을 통해 과산화수소를 생성하고 과산화수소를 물로 전환시키는 역할을 한다.
본 발명에 있어, 세포 소기관 변이를 갖는 인위적 세포 소기관 조절능을 갖는 재조합 효모는 PEX34 (Peroxisomal membrane protein 34) 유전자의 과발현, PEX11 (Peroxisomal membrane protein 11) 유전자의 결실 및 ATG36 (Peroxisome autophagy-related protein 36) 유전자의 결실로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 변이가 도입된 효모일 수 있고, 상기 PEX34 (NCBI number: 850302), PEX11 (NCBI number: 854018) 및 ATG36 (NCBI number: 853254) 유전자는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 유전자일 수 있다.
본 발명의 바람직한 예에서, 상기 세포 소기관이 변이된 재조합 효모는 i) ATG36 유전자가 결실된 재조합 효모, ii) PEX34 유전자가 과발현된 재조합 효모, iii) PEX11 유전자 결실 및 PEX34 유전자가 과발현된 재조합 효모 및 iv) PEX11 유전자 결실, ATG36 유전자 결실 및 PEX34 유전자가 과발현된 재조합 효모로 이루어진 군에서 선택된 1종의 효모일 수 있다.
상기 i 내지 iv 의 재조합 효모들은 모두 다양한 형태의 변화된 세포 소기관을 가지고 있으며, 바람직하게는 야생형 효모 대비 퍼옥시좀의 크기 및/또는 개수가 증대된 특징을 나타낼 수 있다. 또한 i 내지 iv 의 재조합 효모들은 모두 세포 소기관이 변이됨으로써, 이에 아이소프레노이드 관련 생합성 대사를 도입하는 경우 세포 소기관이 변이되지 않은 야생형 효모와 비교하여 보다 향상된 아이소프레노이드 생산능을 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명의 세포 소기관이 변이된 재조합 효모는 아이소프레노이드 생산 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 재조합 효모는 상기 유전자의 변이에 의하여 세포 소기관의 변이를 달성할 수 있는 효모를 제한없이 포함하며, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스(S.bayanus), 사카로마이세스 보울라디(S. boulardii), 사카로마이세스 불데리(S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스(S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스(S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리(S.chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스(S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스(S.ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스(S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스(S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스(S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리(S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에(S.martiniae), 사카로마이세스 모나센시스(S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스(S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스(S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스(S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸(S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스(S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스(S.unisporus), 사카로마이세스 우바룸(S. uvarum), 및 사카로마이세스 조나투스(S. zonatus)로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 세포 소기관이 변이된 재조합 효모에 아이소프레노이드 관련 생합성 경로를 도입하여, 아이소프레노이드 생산성이 증대된 재조합 효모를 제공한다.
상기 아이소프레노이드 생산성이 증대된 재조합 효모는 i) tHMG1 (truncated hydroxy-methyl glutaryl-CoA reductase, CrtE (Geranylgeranyl pyrophosphate synthase), CrtYB (Phytoene synthase-lycopene cyclase) 및 CrtI (Phytoene desaturase) 유전자 세트 및 ii) tHMG1, CrtE 및 CDPS/KS (ent-copalyl diphosphate/kaurene synthase) 유전자 세트로 이루어진 군에서 선택된 1종의 유전자 세트가 도입된 아이소프레노이드 생산성이 증대된 재조합 효모일 수 있다.
본 발명의 재조합 효모를 이용하면, 카로티노이드 중 하나인 베타 카로틴, 지베렐린 대사 물질 중 하나인 카우린 생산능을 증가시킬 수 있으므로, 상기 유전자 세트의 도입 및 세포 소기관 변이에 따라 아이소프레노이드 생산능이 증대됨을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어 아이소프레노이드는 본 발명의 유전자 세트 도입에 따라 생산이 증대될 수 있는 다양한 당 분야에 공지된 아이소프레노이드를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 베타 카로틴, 카우린, 카로티노이드 또는 지베렐린인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 유전자 세트에 포함되는 tHMG1 (NCBI number: 854900)은 사카로마이세스 세레비지에 유래이며, 상기 CrtE (NCBI number: DQ016502) , CrtYB (NCBI number: AY177204) 및 CrtI (NCBI number: KR779665) 는 잔토필로마이시스 덴드로하우스(xanthophyllomyces dendrorhous) 유래이고, 상기 CDPS/KS (NCBI number: AB013295) 는 푸자리움 푸지쿠로이(Fusarium fujikuroi) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 재조합 효모는 i) tHMG1, CrtE, CrtYB 및 CrtI 유전자 세트가 도입된 효모일 수 있으며, 상기 유전자 세트가 도입된 효모는 카로티노이드 중 하나인 베타 카로틴의 생산성이 증대되고, 따라서, 상기 유전자 세트가 도입된 효모를 이용하면 아이소프레노이드 중 카로티노이드의 생산성이 증대될 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 재조합 효모는 ii) tHMG1, CrtE 및 CDPS/KS 유전자 세트가 도입된 효모일 수 있으며, 상기 유전자 세트가 도입된 효모는 지베렐린의 대사산물인 카우린의 생산성이 증대되고, 따라서, 상기 유전자 세트가 도입된 효모를 이용하면 아이소프레노이드 중 지베렐린의 생산성이 증대될 수 있다.
본 발명의 재조합 효모를 제조하기 위하여, 당 분야에 알려진 통상의 방법을 이용하여 유전자 재조합 방법을 이용할 수 있고, 예컨대 상기 관련 유전자들을 적절한 발현 벡터에 삽입하여 도입하는 방법을 이용할 수 있다. 이 때 발현 벡터로는 선택된 숙주 미생물에 통상적으로 사용하는 발현 벡터는 어느 것이나 사용 가능하며, 예를 들면 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자 및 바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 벡터를 이용할 수 있고, 보다 바람직하게는 pRS series, YEplac series, 및 pCEV series 등의 당 업계에 상용화된 벡터를 이용할 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에서 아이소프레노이드 생합성 관련 효소들을 암호화하는 유전자들은 유전체 상에 직접 도입될 수 있으며, 해당 유전자 조합을 구성하는 유전자들 중 일부는 세포 소기관 조절 효모의 염색체 상에 직접 도입시키고 나머지는 벡터에 삽입하여 도입시킬 수 있다. 이러한 염색체상에 도입시키는 방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나 통상적으로 사용되는 상동성 재조합 (Homologous recombination) 또는 CRISPR Cas9 과 같은 공지의 방법들을 이용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 효모를 배양하는 단계; 를 포함하는 아이소프레노이드 생산 방법을 제공하며, 앞서 기술한 내용과의 중복을 피하기 위해 중복되는 설명에 대해서 생략한다.
본 발명에 있어서, "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.
본 발명의 방법에 있어, 상기 재조합 효모는 세포 내 소기관이 변이된 효모이며, 이를 통해 도입된 아이소프레노이드 생합성 경로의 효율이 증가됨에 따라 목적하는 아이소프레노이드를 더욱 높은 효율로 생산될 수 있도록 할 수 있다.
상기 효모는 통상의 배지에서 생육 가능하며, 일 예로 뉴트리엔트 브로스(Nutrient broth) 배지에서 배양할 수 있다. 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 바람직한 배양배지는 예컨대 LB, YT 또는 M9 배지일 수 있으며, 이는 형질전환체의 생장을 위한 배지이다.
본 발명에서 목적 물질인 아이소프레노이드는 HPLC 등을 통해 화합물을 분리하거나 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 화합물을 분리하여 수득할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모 제조
1.1. 세포 소기관 조절 관련 효소에 대한 유전자 조합을 포함하는 재조합 벡터의 제조
세포 소기관 중 하나인 퍼옥시좀 (peroxisome)의 대사에 관여하는 효소인 퍼옥시좀 세포막 단백질 PEX34 (Peroxisomal membrane protein 34)의 코딩 유전자인 PEX34, 퍼옥시좀 세포막 단백질 PEX11 (Peroxisomal membrane protein 11)의 코딩 유전자인 PEX11, 및 퍼옥시좀 자기소화 관련 단백질 ATG36 (Peroxisome autophagy-related protein 36) 을 코딩하는 유전자인 ATG36을 중합효소 연쇄반응을 이용해 분리, 증폭시켰다. 또한 효모 내 세포 소기관의 조절에 따른 변화 유무를 확인하기 위해 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 로부터 세포 소기관 중 하나인 퍼옥시좀의 세포막 단백질 중 하나인 3-케토아실-CoA 싸이올레이즈 (3-ketoacyl-CoA thiolase, POT1)을 중합효소 연쇄반응을 이용해 분리, 증폭시켰다. 상기 중합효소 연쇄반응에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는, 사카로마이세스 세레비지에의 퍼옥시좀 및 소포체 대사 관련 효소를 암호화하는 유전자의 염기서열 정보를 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 있는 정보와 비교 분석한 결과를 토대로 제작하였으며, 각 유전자의 증폭에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머의 염기서열 및 프라이머에 포함된 제한효소의 종류를 하기 표 1에 나타내었다.
| 균주 | 유전자 | 벡터 | 방향 | 염기서열 | 제한효소 |
| 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) |
PEX34 | pRS424-PGK1 | 정방향 | 서열번호: 1 | BamHI |
| 역방향 | 서열번호: 2 | SalI | |||
| ATG36 Del cassette | pUC57_URA Blast | 정방향 | 서열번호: 3 | - | |
| 역방향 | 서열번호: 4 | - | |||
| PEX11 Del - PEX34 O/E cassette | pUC57_URA Blast-PGK1-PEX34 | 정방향 | 서열번호: 5 | - | |
| 역방향 | 서열번호: 6 | - | |||
| PEX34 O/E cassette | 정방향 | 서열번호: 7 | - | ||
| 역방향 | 서열번호: 8 | - | |||
| POT1-EGFP cassette | pUC57_URA Blast | 정방향 | 서열번호: 9 | - | |
| 역방향 | 서열번호: 10 | - | |||
| * Del : deletion, O/E : over-expression | |||||
사카로마이세스 세레비지에의 염색체 DNA 주형 및 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PEX34 유전자를 증폭하였으며, 증폭된 유전자 단편을 BamHI 와 SalI으로 처리한 후 동일 효소로 절단된 pRS426-PGK1 벡터에 삽입하여 플라스미드 pRS426-PGK1-PEX34를 제조하였다. 이후, pRS426-PGK1-PEX34 플라스미드의 유전자, PGK1 프로모터, 및 터미네이터를 포함한 DNA 주형을 SacI 및 KpnI 으로 처리하여 동일 효소로 절단된 플라스미드 pUC57_URA Blast에 삽입하여 플라스미드 pUC57_URA Blast-PGK1-PEX34를 제조하였다.
이후, pUC57_URA Blast 및 pUC57_URA Blast-PGK1-PEX34 플라스미드의 영양 요구 인자 선택 지표 (Auxotroph selection marker) 유전자인 URA3 또는 프로모터 및 터미네이터를 포함한 각 유전자 모듈과 영양 요구 인자 선택 지표 (Auxotroph selection marker) 유전자인 URA3를 포함한 DNA 주형을 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 증폭하여 상동성 재조합(Homologous recombination)을 이용한 효모 형질 전환을 위한 ATG36 Del-URA3, PEX11Del-PGK1-PEX34-CYC1-URA3, 및 PGK1-PEX34-CYC1-URA3, 세포 소기관의 녹색 형광 단백질 지표 제작 형질 전환을 위한 POT1-EGFP-CYC1-URA3 카세트를 제조하였다.
1.2 재조합 효모의 제조 및 세포 소기관 변화 검증
상기 1.1에서 제조된 상동성 재조합 형질전환 카세트 PEX11Del-URA3, ATG36 Del-URA3, 및 PGK1-PEX34-CYC1-URA3를 각각 야생형 효모 CEN PK2.1D에 도입시켜 형질전환하여 다음과 같은 표 2 의 재조합 효모를 제조하였다.
| 명칭 | 유전자 조합 |
| CEN | CEN-PK2.1D 야생형 |
| PX1 | CEN-ΔATG36 |
| PX2 | CEN-PEX34 |
| PX3 | CEN-ΔPEX11-PEX34 |
| PX4 | CEN-ΔATG36-ΔPEX11-PEX34 |
상기 1.1에서 제조된 상동성 재조합 형질전환 카세트 POT1-EGFP-CYC1-URA3를 야생형 효모 Saccharomyces cerevisiae CEN PK2.1D, 재조합 효모 PX1, PX2, PX3, 및 PX4의 POT1 유전자의 C-말단에 종결 코돈을 제거하며 도입시키고 형질전환하여 CEN-POT1-EGFP, PX1-POT1-EGFP, PX2-POT1-EGFP, PX3-POT1-EGFP, 및 PX4-POT1-EGFP 재조합 효모를 제작하였다. 형질전환된 각 재조합 효모의 단일 콜로니를 0.77 g/L 의 DO supplement-URA (Clontech)가 함유된 SD배지 (6.7 g/L 효소 질소 기반 아미노산 불포함 배지(yeast nitrogen base without amino acids), 및 20g/L 포도당(glucose)) 5㎖에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕 배양하였으며, 얻어진 배양액 5㎖씩을 각각 100 ㎍/㎖의 DO supplement-URA를 함유한 SD배지 100㎖에 접종한 후 30℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 이 후 24시간 간격으로 배양액 1㎖씩을 취하여 형광현미경을 이용해 세포 소기관의 변화 유무를 녹색 형광 단백질의 발현을 통해 확인하였다. 형광 현미경을 통해 확인된 재조합 효모 PX1, PX2, PX3 및 PX4 의 세포 소기관 변화 유무를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 재조합 효모 PX1, PX2, PX3 및 PX4에 해당하는 pex34 가 과발현되고, atg36 및/또는 pex11이 결실된 조합의 재조합 효모에서는 모두 녹색 형광 단백질 발현이 변화하였으며, 이를 통해 대조군 대비 모두 세포 소기관이 변화된 것을 확인하였다. 특히 pex30 또는 pex34 를 결실시킨 비교군의 경우 세포 소기관의 변화가 관찰되지 않았으며, pex34 를 결실시킨 실험군에서는 야생형과 유사한 정도의 형광만이 관찰되었다. 따라서, pex34 가 과발현되고, atg36 및/또는 pex11이 결실된 조합이 세포 소기관인 퍼옥시좀의 발현을 변화시킬 수 있는 최적의 조합임을 확인하였다.
또한, 형질전환된 각 재조합 효모의 단일 콜로니를 0.77 g/L 의 DO supplement -URA (Clontech)가 함유된 SD배지 (6.7 g/L 효소 질소 기반 아미노산 불포함 배지(yeast nitrogen base without amino acids), 및 20g/L 포도당(glucose)) 5㎖에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕 배양하였으며, 얻어진 배양액 5㎖씩을 각각 100 ㎍/㎖의 DO supplement-URA를 함유한 SD배지 100㎖에 접종한 후 30℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 이 후 배양액 10㎖씩을 원심분리하여 균체를 얻은 후 이를 5㎖ 인산완충식염수 (Phosphate buffered saline, PBS)로 풀어 전자투과현미경 (Transmission electron microscopy, TEM) 분석을 위한 샘플을 준비하였다. TEM 분석을 위한 샘플 준비 및 분석은 서울대학교 농생명과학공동기기원 (NICEM)에서 진행되었다.
TEM 분석을 위해 인산완충식염수에 풀어진 균체를 원심분리하여 균체를 분리한 후, 개랑된 karnovsky의 고정화 용액(modified karnovsky's fixation solution, 2% paraformaldehyde & 2% glutaraldehyde in 0.05M sodium cacodylate buffer(pH 7.2))을 넣고 4시간동안 고정화를 진행하고, 0.05M 나트륨 카코딜산 완충액 (Sodium cacodylate buffer (pH7.2))로 3번 세척을 진행하였다. 세척 후 원심분리하여 상등액을 제거하고, 2% 오스뮴 사산화이질소 (Osmium tetroxide) 1ml과 0.1M 카코딜산 완충액 (Cacodylate buffer) 1ml을 첨가하여 2차 고정화를 진행했으며, 멸균수를 이용해 2회 세척을 진행하고 0.5% 우라닐 아세테이트 (Uranyl acetate)를 첨가하여 균체를 풀어준 후, 24시간 동안 엔-블록 (en-bloc)염색을 진행하였다. 다양한 농도의 에탄올 (30, 50, 70, 80, 90, 및 100%)로 농도를 순차적으로 높여가며 탈수소화반응 (Dehydration)을 3번 진행하고, 프로필렌 옥사이드 (Propylene oxide)를 첨가하여 10분 동안 반응을 진행한 후, 프로필렌 옥사이드 (Propylene oxide)와 스퍼 레진(spurr's resin, 4.1g ERL 4221, 1.43g D.E.R. 736, 5.9g NSA, 및 0.1g DMAE)으로 충진하여 1일동안 교반 반응을 진행하였다. 원심분리 후 균체를 분리하여 스퍼 레진 (spurr's resin, 4.1g ERL 4221, 1.43g D.E.R. 736, 5.9g NSA, 및 0.1g DMAE)으로 재충진 후, 70°C에서 건조시켜 EM UC7 초박편미세절단기 (Ultramicrotome)를 이용해 절단 박편을 준비하여 LIBRA 120 에너지여과 투과전자현미경 (Energy-filtering transmission electron microscopy, TEM)을 이용해 야생형 효모와 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모의 세포 소기관의 변화 차이를 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포 소기관 중 하나인 퍼옥시좀 대사에 관여하는 효소인 퍼옥시좀 세포막 단백질 PEX34, 퍼옥시좀 세포막 단백질 PEX 11, 및 퍼옥시좀 자기소화 관련 단백질 ATG36을 암호화하는 유전자 PEX34, PEX11, 및 ATG36이 조절된 재조합 효모 PX1 내지 PX4 가 모두 퍼옥시좀의 수가 증가하고 크기가 증가하였음을 확인하였다.
이를 통해, PEX34, PEX11, 및 ATG36의 조절을 통해, 세포소기관인 퍼옥시좀의 개수와 크기가 현저하게 증가된 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모를 생산할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 카로티노이드 생산능 향상 효모의 제조
실시예 1을 통해 제조된 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모를 이용하여, 유용물질인 아이소프레노이드 (isoprenoid) 중 카로티노이드를 생산할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 카로티노이드 생합성 대사 경로를 가지고 있지 않은 효모에 새로운 유전자 카세트를 도입하여 대표적인 C40 카로티노이드 물질 중 하나인 베타 카로틴을 생산하고 세포 소기관 조절을 통한 생산성을 비교하였다.
2.1. 카로티노이드 생합성 관련 효소 유전자 조합을 포함하는 재조합 벡터의 제조
사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 로부터 카로틴노이드 전구체 생합성에 관여하는 효소인 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소의 코딩 유전자인 HMG1의 유전자 활성 억제 부분을 일부 제거한 truncated HMG1 (tHMG1), 잔토필로마이시스 덴드로하우스(xanthophyllomyces dendrorhous)로부터 카로틴노이드 생합성에 관여하는 효소인 제라닐제라닐 피로인산 합성효소를 코딩하는 유전자인 CrtE, 파이토엔 합성 및 라이코펜 환상화효소를 코딩하는 유전자인 CrtYB, 및 파이토엔 불포화효소를 코딩하는 유전자인 CrtI를 중합효소 연쇄반응을 이용해 이를 분리, 증폭시켰다. 카로티노이드 중 하나인 베타카로틴 합성을 위한 MVA 및 MEP 경로를 포함하는 베타카로틴 생합성 대사 경로의 모식도를 도 4에 나타내었다.
상기 중합효소 연쇄반응에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는, 사카로마이세스 세레비지에, 잔토필로마이시스 덴드로하우스의 카로틴노이드 및 전구체 생합성 경로 관련 효소를 암호화하는 유전자의 염기서열 정보를 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 있는 정보와 비교 분석한 결과를 토대로 제작하였으며, 각 유전자의 증폭에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머의 염기서열 및 프라이머에 포함된 제한효소의 종류를 하기 표 3에 나타내었다.
| 균주 | 유전자 | 벡터 | 방향 | 염기서열 | 제한효소 |
| 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) | tHMG1 | pRS424-GPD | 정방향 | 서열번호: 11 | NotI |
| 역방향 | 서열번호: 12 | SpeI | |||
| 잔토필로마이시스 덴드로하우스 (xanthophyllomyces dendrorhous) |
CrtE | pRS426-TEF1 | 정방향 | 서열번호: 17 | SpeI |
| 역방향 | 서열번호: 18 | XmaI | |||
| CrtYB | pRS424-PGK1 | 정방향 | 서열번호: 19 | BamHI | |
| 역방향 | 서열번호: 20 | SalI | |||
| CrtI | pRS423-PGK1 | 정방향 | 서열번호: 21 | BamHI | |
| 역방향 | 서열번호: 22 | SalI | |||
| 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) |
ypl062w | pSNR52-sgTEF1 | 정방향 | 서열번호: 23 | EcoRI |
| 역방향 | 서열번호: 24 | - | |||
| 정방향 | 서열번호: 25 | - | |||
| 역방향 | 서열번호: 26 | KpnI | |||
| ROX1 | 정방향 | 서열번호: 23 | EcoRI | ||
| 역방향 | 서열번호: 27 | - | |||
| 정방향 | 서열번호: 28 | - | |||
| 역방향 | 서열번호: 26 | KpnI | |||
| yjl064w | 정방향 | 서열번호: 23 | EcoRI | ||
| 역방향 | 서열번호: 29 | - | |||
| 정방향 | 서열번호: 30 | - | |||
| 역방향 | 서열번호: 26 | KpnI | |||
| GPD-tHMG1 | YIplac128 | 정방향 | 서열번호: 13 | PstI | |
| 역방향 | 서열번호: 14 | SalI | |||
| GPD-tHMG1-LEU2 | YIplac128-GPD -tHMG1 |
정방향 | 서열번호: 15 | - | |
| 역방향 | 서열번호: 16 | - | |||
| 잔토필로마이시스 덴드로하우스 (xanthophyllomyces dendrorhous) |
TEF1-CrtE-CYC1 | pRS426-TEF1-CrtE | 정방향 | 서열번호: 31 | - |
| 역방향 | 서열번호: 32 | - | |||
| PGK1-CrtYB-CYC1 | pRS424-PGK1-CrtYB | 정방향 | 서열번호: 33 | - | |
| 역방향 | 서열번호: 34 | - | |||
| PGK1-CrtI-ADH2 | pRS423-PGK1-CrtI | 정방향 | 서열번호: 35 | - | |
| 역방향 | 서열번호: 36 | - |
먼저, 사카로마이세스 세레비지에의 유전자 정보를 바탕으로 합성된 유전자의 DNA 주형 및 서열번호 11 및 12의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 tHMG1 유전자를 증폭하였으며, 증폭된 유전자 단편을 NotI 과 SpeI으로 처리한 후 동일 효소로 절단된 pRS424-GPD 벡터에 삽입하여 플라스미드 pRS424-GPD-tHMG1을 제조하였다.
이후, pRS424-GPD-tHMG1 플라스미드의 유전자, GPD 프로모터, 및 터미네이터를 포함한 DNA 주형을 서열번호 13 및 14의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 이를 PstI 과 SalI으로 처리하여 동일 효소로 절단된 플라스미드 YIplac128에 삽입하여 플라스미드 YIplac128-GPD-tHMG1을 제조하였다.
이후, YIplac126-GPD-tHMG1 플라스미드의 프로모터 및 터미네이터를 포함한 각 유전자 모듈과 영양 요구 인자 선택 지표 (Auxotroph selection marker) 유전자인 LEU2 를 포함한 DNA 주형을 서열번호 15 및 16의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 증폭하여 상동성 재조합을 이용한 효모 형질 전환을 위한 GPD-tHMG1-CYC1-LEU2 카세트를 제조하였다.
또한, 잔토필로마이세스 덴드로하우스의 전령 RNA를 주형으로 하여 역전사 효소 반응을 통해 cDNA를 합성하였으며, 합성된 cDNA 주형 및 서열번호 17, 18, 19, 20, 21 및 22의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 crtE, crtYB, crtI 각각의 유전자를 증폭하고, 증폭된 유전자 단편을 제한효소 SpeI 과 XmaI, BamHI 과 SalI, 또는 BamHI과 SalI으로 처리하였다. 이후 동일 효소로 절단된 pRS426-TEF1, pRS423-PGK1, 및 pRS424-PGK1 벡터에 삽입하여 플라스미드 pRS426-TEF1-crtE, pRS423-PGK1-crtYB, 및 pRS424-PGK1-crtI를 제조하였다.
상기 유전자들을 염색체 상에 도입시키기 위하여 CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9) 방법을 이용해 CrtE, CrtYB, 및 CrtI를 효모의 ypl062w, ROX1, 및 yjl064w에 도입하였다. 형질전환을 위한 ypl062w, ROX1, 및 yjl064w 염기서열을 인식하는 sgRNA 발현 벡터의 제작을 위해 pSRNR52-sgTEF1 벡터를 주형가닥으로 하여 EcoRI 효소의 인식부위가 포함된 서열번호 23의 염기서열을 갖는 프라이머와 PAM 서열이 포함된 서열번호 24, 27, 및 29의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 첫 번째 절편을 증폭하고, 5'-NGG-3'를 포함한 PAM 서열이 포함된 서열번호 25, 28, 및 30의 염기서열을 갖는 프라이머와 KpnI 효소의 인식부위가 포함된 서열번호 26의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 두 번째 절편을 증폭하였다. 이 두 절편을 주형 가닥으로 하여 EcoRI 효소의 인식부위가 포함된 서열번호 23의 염기서열을 갖는 프라이머와 KpnI 효소의 인식부위가 포함된 서열번호 26의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용한 overlap extension PCR을 진행하여 sgRNA 서열이 포함된 DNA 절편을 확보하였다. 이 DNA 절편을 KpnI 과 EcoRI 효소로 처리한 후, 동일 효소로 처리된 pSNR52-sgTEF1 벡터에 삽입하여 CrtE, CrtYB, 및 CrtI를 도입할 ypl062w, ROX1, 및 yjl064w 부위를 인식하는 pSNR52-sgypl062w, SNR52-sgROX1, SNR52-sgyjl064w 벡터를 제조하였다.
이후, pRS426-TEF1-CrtE, pRS423-PGK1-CrtYB, 및 pRS424-PGK1-CrtI 플라스미드의 프로모터 및 터미네이터를 포함한 각 유전자 모듈을 포함한 DNA 주형을 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 및 36의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 증폭하여 CRISPR-Cas9 방법을 이용한 효모 형질 전환을 위한 TEF1-CrtE-CYC1, PGK1-CrtYB-CYC1, 및 PGK1-CrtI-ADH1 카세트를 제조하였다.
2.2 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모를 이용한 카로티노이드 생산성 향상 비교
상기 2.1 에서 제조된 형질전환 카세트 GPD-tHMG1-CYC1을 야생형 효모와 실시예 1에서 제작한 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모 PX 1에 도입시켜 형질전환 시켰으며, 이후 상기 2.1 에서 제조된 형질전환 카세트 TEF1-CrtE-CYC1, PGK1-CrtYB-CYC1, 및 PGK1-CrtI-ADH2, Cas9 발현 벡터인 Cas9-NAT(Addgene, Plasmid #64329) 벡터, 및 ypl062w, ROX1, yjl064w 부위를 각각 인식하는 sgRNA 발현 벡터인 pSNR52-sg 벡터를 야생형 효모와 실시예 1에서 제작한 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모 중 퍼옥시좀 자기소화 관련 단백질 ATG36 (ATG36)을 제거한 효모 PX1 에 도입시켰다. 형질전환된 각각의 재조합 효모를 CEN-βCN(대조군)과 PX1-βCN 으로 명명하였다.
형질전환된 각 재조합 효모의 단일 콜로니를 YPD배지 (10g/L 효소추출물(yeast extract), 20g/L 펩톤 (peptone), 및 20g/L 포도당(glucose)) 5㎖에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕 배양하였으며, 얻어진 배양액 5㎖씩을 각각 YPD배지 (10g/L 효소추출물(yeast extract), 20g/L 펩톤 (peptone), 및 20g/L 포도당(glucose)) 50㎖에 접종한 후 30℃에서 144시간 진탕 배양하였다. 이 후 배양액 1㎖씩을 취하여 분광광도계를 이용해 600 nm의 파장에서 흡광도를 측정한 후 희석배수를 곱하여 균체량을 확인하였다. 또한, 배양된 각 50㎖ 배지를 원심분리 하여 균체를 얻은 후 이를 5㎖ 100% 아세톤(acetone)으로 풀어 발현된 카로틴노이드를 추출하고, 10㎖ 헥산(hexane)과 물(H2O)로 카로틴노이드 층을 나눠 카로틴노이드를 분리 시켰다. 분리된 카로틴노이드를 유리시험관으로 옮긴 후 고압건조기를 이용해 30분간 건조 시키고, 건조된 카로틴노이드 추출물을 1㎖ 에틸아세테이트로 녹인 다음 20㎕의 추출물을 고압액체크로마토그래피(HPLC) 광다이오드배열 검출기(DAD)를 이용해 베타카로틴을 측정하였다. 측정값을 검량선을 통해 얻은 방정식에 대입하였고, 희석 배수를 계산하여 베타카로틴양을 계산하였다. 이때, 검량선 작성을 위해서 표준 베타카로틴(Sigma aldrich)을 구입하여 에틸아세테이트에 용해시킨 후 각각 다른 농도로 에틸아세테이트에 희석하여 고압액체크로마토그래피 광다이오드배열 검출기를 이용해 베타카로틴 양을 측정하고 이를 이용해 표준 검량선을 작성하였다. 수행한 고압액체크로마토그래피의 조건은 하기와 같다.
- 고압액체크로마토그래피: 시료주입장치(auto-sampler)가 장착된 에이질런트 테크놀로지 1200 시리즈 (Agilent Technologies 1200 series) 모델
- 광다이오드배열 검출기: 에이질런트 테크놀로지 1200 시리즈 (Agilent Technologies 1200 series) 모델
- 컬럼: Agilent Zorbax XDB-C18 (4.6 × 150 mm, 5-micron)
- Mobile phase: Acetonitrile: 80/ Methanol: 15/ Isoprepanol: 5 (v/v %)
- 속도: 1.0 ㎖/분
- Column 온도: 35℃
- 측정기: DAD (Diode array detector)
- 시료주입량: 20㎕
- 검출: spectrometry 방식 (190nm ~ 900nm)
상기 방법으로 확인된, 인위적 세포 소기관 조절을 통해 향상된 베타카로틴의 생산능을 가진 재조합 효모의 균체량 및 각 베타카로틴의 생산량을 하기 표 4 및 도 5에 나타내었다.
| 최대 성장치 (OD600) |
베타카로틴 절대정량값 (mg/L) |
|
| CEN-βCN (대조군) | 6.38±0.24 | 4.85±0.29 |
| PX1-βCN | 5.06±0.12 | 6.31±0.01 |
상기 표 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모에 카로틴노이드 중 하나인 베타카로틴을 생산하는 효소인 개량된 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소, 제라닐제라닐 피로인산 합성효소, 파이토엔 합성 및 라이코펜 환상화효소, 및 파이토엔 불포화효소를 암호화하는 유전자 조합이 발현되는 형질전환 카세트 GPD-tHMG1-CYC1, TEF1-CrtE-CYC1, PGK1-CrtYB-CYC1, 및 PGK1-CrtI-ADH2를 도입하는 경우, 동일한 형질전환 카세트를 도입한 야생형 효모와 비교하여, 최대 성장치는 다소 감소하였으나 베타 카로틴의 절대 생산량은 증가하는 것을 확인하였다. 도 5A 에 나타낸 바와 같이, 세포 성장치가 감소하더라도 균체 회수 시 야생형과 크게 차이나지 않았으며, 야생형 대비 베타카로틴의 증가로 인해 짙은 주황색을 나타내었다. 도 5B 에 나타낸 바와 같이, 카로티노이드가 미생물 내 과발현되는 경우 카로티노이드가 세포막에 축적되어 세포 성장이 저해되는 문제가 발생하기 때문에 인위적 세포 소기관 조절을 통해 향상된 베타카로틴의 생산능을 가진 재조합 효모의 최대 성장치는 다소 낮아졌으나, 도 5C에 나타낸 바와 같이 베타 카로틴의 생산량은 오히려 증대하였다. 구체적으로 베타카로틴 생산량이 배양 부피 기준 최대 130% 및 단위 세포 기준 최대 165%까지 더욱 증가하였으며, 이를 통해 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모를 이용하는 경우, 높은 카로틴노이드 생산성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 4. 지베렐린 대사물질 생산능 향상 효모의 제조
실시예 1을 통해 제조된 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모를 이용하여, 유용물질인 아이소프레노이드 (isoprenoid) 중 지베렐린 주요 대사물질인 카우린(Kaurene)을 생산할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 지레렐린 생합성 대사 경로를 가지고 있지 않은 효모에 새로운 유전자 카세트를 도입하여 카우린을 생산하고 세포 소기관 조절을 통한 생산성을 비교하였다.
4.1 지베렐린 대사물질 생합성 관련 효소 유전자 조합을 포함하는 재조합 벡터의 제조
사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 로부터 지베렐린 전구체 생합성에 관여하는 효소인 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소의 코딩 유전자인 HMG1의 유전자 활성 억제 부분을 일부 제거한 truncated HMG1 (tHMG1), 잔토필로마이시스 덴드로하우스(xanthophyllomyces dendrorhous)로부터 지베렐린 대사물질 생합성에 관여하는 효소인 제라닐제라닐 피로인산 합성효소를 코딩하는 유전자인 CrtE, 푸자리움 푸지쿠로이 (Fusarium fujikuroi)로부터 지베렐린 대사물질 생합성에 관여하는 효소 중 코파릴 피로인산 및 카우린 합성효소를 코딩하는 유전자인 CDPS/KS를 분리, 증폭시켰다. 지베렐린 대사물질 중 하나인 카우린 생합성을 위한 MVA 및 MEP 경로를 포함하는 대사 경로의 모식도를 도 6에 나타내었다.
상기 중합효소 연쇄반응에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는, 사카로마이세스 세레비지에, 잔토필로마이시스 덴드로하우스, 및 푸자리움 푸지쿠로이의 지베렐린 및 전구체 생합성 경로 관련 효소를 암호화하는 유전자의 염기서열 정보를 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 있는 정보와 비교 분석한 결과를 토대로 제작하였으며, 각 유전자의 증폭에 사용된 정방향 및 역방향 프라이머의 염기서열 및 프라이머에 포함된 제한효소의 종류를 하기 표 5에 나타내었다.
| 균주 | 유전자 | 벡터 | 방향 | 염기서열 | 제한효소 |
| 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) | tHMG1 | pRS424-GPD | 정방향 | 서열번호: 11 | NotI |
| 역방향 | 서열번호: 12 | SpeI | |||
| 잔토필로마이시스 덴드로하우스(xanthophyllomyces dendrorhous) | CrtE | pRS426-TEF1 | 정방향 | 서열번호: 17 | SpeI |
| 역방향 | 서열번호: 18 | XmaI | |||
| 푸자리움 푸지쿠로이 (Fusarium fujikuroi) |
CDPS/KS | pRS426-PGK1 | 정방향 | 서열번호: 37 | SpeI |
| 역방향 | 서열번호: 38 | XhoI | |||
| 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) |
ypl062w | pSNR52-sgTEF1 | 정방향 | 서열번호: 23 | EcoRI |
| 역방향 | 서열번호: 24 | - | |||
| 정방향 | 서열번호: 25 | - | |||
| 역방향 | 서열번호: 26 | KpnI | |||
| ROX1 | 정방향 | 서열번호: 23 | EcoRI | ||
| 역방향 | 서열번호: 27 | - | |||
| 정방향 | 서열번호: 28 | - | |||
| 역방향 | 서열번호: 26 | KpnI | |||
| GPD-tHMG1 | YIplac128 | 정방향 | 서열번호: 13 | PstI | |
| 역방향 | 서열번호: 14 | SalI | |||
| GPD-tHMG1-LEU2 | YIplac128-GPD -tHMG1 |
정방향 | 서열번호: 15 | - | |
| 역방향 | 서열번호: 16 | - | |||
| 잔토필로마이시스 덴드로하우스 (xanthophyllomyces dendrorhous) |
TEF1-CrtE-CYC1 | pRS426-TEF1-CrtE | 정방향 | 서열번호: 31 | - |
| 역방향 | 서열번호: 32 | - | |||
| 푸자리움 푸지쿠로이 (Fusarium fujikuroi) |
PGK1-CDPS/KS-TEF2 | pRS426-PGK1-CDPS/KS | 정방향 | 서열번호: 33 | - |
| 역방향 | 서열번호: 34 | - |
먼저, 사카로마이세스 세레비지에의 유전자 정보를 바탕으로 합성된 유전자의 DNA 주형 및 서열번호 11, 및 12의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 tHMG1 유전자를 증폭하였으며, 증폭된 유전자 단편을 NotI 과 SpeI으로 처리한 후 동일 효소로 절단된 pRS424-GPD 벡터에 삽입하여 플라스미드 pRS424-GPD-tHMG1을 제조하였다.
이후, pRS424-GPD-tHMG1 플라스미드의 유전자, GPD 프로모터, 및 터미네이터를 포함한 DNA 주형을 서열번호 13 및 14의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 이를 PstI 과 SalI으로 처리하여 동일 효소로 절단된 플라스미드 YIplac128에 삽입하여 플라스미드 YIplac128-GPD-tHMG1을 제조하였다.
이후, YIplac126-GPD-tHMG1 플라스미드의 프로모터 및 터미네이터를 포함한 각 유전자 모듈과 영양 요구 인자 선택 지표 (Auxotroph selection marker) 유전자인 LEU2 를 포함한 DNA 주형을 서열번호 15 및 16의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 증폭하여 상동성 재조합을 이용한 효모 형질 전환을 위한 GPD-tHMG1-CYC1-LEU2 카세트를 제조하였다.
또한, 잔토필로마이세스 덴드로하우스 및 푸자리움 푸지쿠로이의 전령 RNA를 주형으로하여 역전사 효소 반응을 통해 cDNA를 합성하였으며, 합성된 cDNA 주형 및 서열번호: 17, 18, 37 및 38의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 crtE 및 CDPS/KS 각각의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자 단편을 제한효소 SpeI과 XmaI 및 SpeI 과 XhoI으로 처리한 후 동일 효소로 절단된 pRS426-TEF1 및 pRS426-PGK1 벡터에 삽입하여 플라스미드 pRS426-TEF1-crtE 및 pRS426-PGK1-CDPS/KS를 제조하였다.
이후, CRISPR-Cas9 방법을 이용해 CrtE 및 CDPS/KS를 효모의 ypl062w 및 ROX1에 도입하였으며, 형질전환을 위한 ypl062w 및 ROX1 염기서열을 인식하는 sgRNA 발현 벡터의 제작을 위해 pSRNR52-sgTEF1 벡터를 주형가닥으로 하여 EcoRI 효소의 인식부위가 포함된 서열번호 23의 염기서열을 갖는 프라이머와 PAM 서열이 포함된 서열번호 24 및 27의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 첫 번째 절편을 증폭하였다. 5'-NGG-3'를 포함한 PAM 서열이 포함된 서열번호 25 및 28의 염기서열을 갖는 프라이머와 KpnI 효소의 인식부위가 포함된 서열번호 26의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 두 번째 절편을 증폭하였다. 이 두 절편을 주형 가닥으로 하여 EcoRI 효소의 인식부위가 포함된 서열번호 23의 염기서열을 갖는 프라이머와 KpnI 효소의 인식부위가 포함된 서열번호 26의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용한 overlap extension PCR을 진행하여 sgRNA 서열이 포함된 DNA 절편을 확보하였다. 이 DNA 절편을 KpnI 및 EcoRI 효소로 처리한 후, 동일 효소로 처리된 pSNR52-sgTEF1 벡터에 삽입하여 CrtE 및 CDPS/KS를 도입할 ypl062w 및 ROX1부위를 인식하는 pSNR52-sgypl062w 및 SNR52-sgROX1 벡터를 제조하였다.
이후, pRS426-TEF1-CrtE 및 pRS426-TEF1-CDPS/KS 플라스미드의 프로모터 및 터미네이터를 포함한 각 유전자 모듈을 포함한 DNA 주형을 서열번호 31, 32, 33, 및 34의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 증폭하여 CRISPR-Cas9 방법을 이용한 효모 형질 전환을 위한 TEF1-CrtE-CYC1 및 PGK1-CDPS/KS-TEF2 카세트를 제조하였다.
4.2 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모를 이용한 카우린 생산성 향상 비교
상기 3.1 에서 제조된 형질전환 카세트 GPD-tHMG1-CYC1을 야생형 효모와 실시예 1에서 제작한 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모 PX 1에 도입시켜 형질전환 시켰으며, 이후 상기 3.1 에서 제조된 형질전환 카세트 TEF1-CrtE-CYC1 및 PGK1-CDPS/KS-TEF2, Cas9 발현 벡터인 Cas9-NAT(Addgene, Plasmid #64329) 벡터, 및 ypl062w 및 ROX1 부위를 각각 인식하는 sgRNA 발현 벡터인 pSNR52-sgypl062w 및 SNR52-sgROX1 벡터를 야생형 효모와 실시예 1에서 제작한 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모 중 퍼옥시좀 자기소화 관련 단백질 ATG36 (ATG36)을 제거한 효모인 PX1에 도입시켜 형질전환을 수행하였으며, 각각 대조군 CEN-KRN과 형질전환된 PX1- KRN로 명명하였다.
형질전환된 각 재조합 효모의 단일 콜로니를 YPD배지 (10g/L 효소추출물(yeast extract), 20g/L 펩톤 (peptone), 및 20g/L 포도당(glucose)) 5㎖에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕 배양하였으며, 얻어진 배양액 5㎖씩을 각각 YPD배지 (10g/L 효소추출물(yeast extract), 20g/L 펩톤 (peptone), 및 20g/L 포도당(glucose)) 50㎖에 접종한 후 30℃에서 168시간 진탕 배양하였다. 이 후 배양액 1㎖씩을 취하여 분광광도계를 이용해 600 nm의 파장에서 흡광도를 측정한 후 희석배수를 곱하여 균체량을 확인하였다. 또한, 배양된 각 50㎖ 배지를 원심분리하여 균체와 배지를 분리한 후 균체를 5㎖ 100% 아세톤(acetone)으로 풀어 발현된 카우린을 추출하고, 10㎖ 헥산(hexane)과 물(H2O)로 카우린 층을 나눠 카우린을 분리시켰다. 분리된 카우린을 유리시험관으로 옮긴 후 고압건조기를 이용해 30분간 건조 시키고, 건조된 카우린 추출물을 1㎖ 헥산에 녹인 다음 1㎕의 추출물을 기체크로마토그래피(GC) 질량분광법 시스템(MS)을 이용해 균체의 카우린을 측정하였다. 배지의 경우 10㎖ 배지에 10㎖ 헥산을 넣어 카우린 층을 나눠 카우린을 분리시켰다. 분리된 카우린을 유리시험관으로 옮긴 후 고압건조기를 이용해 30분간 건조 시키고, 건조된 카우린 추출물을 1㎖ 헥산에 녹인 다음 1㎕의 추출물을 기체크로마토그래피(GC) 질량분광법 시스템(MS)을 이용해 배지의 카우린을 측정하였다. 측정값을 검량선을 통해 얻은 방정식에 대입하였고, 희석 배수를 계산하여 카우린양을 계산하였다. 이때, 검량선 작성을 위해서 자체 카우린을 정제하여 무게를 측정한 후, 헥산에 용해시키고 각각 다른 농도로 헥산에 희석하여 기체크로마토그래피 질량분광법 시스템을 이용해 카우린 양을 측정하고 이를 이용해 표준 검량선을 작성하였다. 실험에 사용한 기체크로마토그래피 조건은 하기와 같다.
- 기체크로마토그래피: 시료주입장치(auto-sampler)가 장착된 에이질런트 테크놀로지 7890A (Agilent Technologies 7890C) 모델
- 질량분광법 시스템: 에이질런트 테크놀로지 5975C (Agilent Technologies 5975C) 모델
- 컬럼: Agilent HP5-MS (0.25 mm × 30 m, 0.25-micron)
- 전자 이온화 모드: 70ev
- 속도: 1.0 ㎖/분
- 시료주입 온도: 80℃
- 오븐 온도: 80℃ 1분유지 후 15℃/분의 속도로 245℃까지 가열, 이후 5℃/분의 속도로 300℃까지 가열
- 시료주입량: 1㎕ (Splitless mode)
- 검출: MS 결과 (90 m/z ~ 600 m/z)
상기 방법으로 확인된, 인위적 세포 소기관 조절을 통해 향상된 카우린의 생산능을 가진 재조합 효모의 균체량 및 각 카우린의 생산량을 하기 표 6 및 도 7에 나타내었다.
| 최대 성장치 (OD600) |
카우린 절대정량값 (mg/L) |
|
| CEN-KRN (대조군) | 12.28±0.07 | 9.08±0.29 |
| PX1-KRN | 13.32±0.24 | 10.07±0.19 |
상기 표 6 및 도 7 에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모에 지베렐린 대사물질 중 하나인 카우린을 생산하는 효소인 개량된 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소, 제라닐제라닐 피로인산 합성효소 및 코파릴 피로인산 및 카우린 합성효소를 암호화 하는 유전자 조합이 발현되는 형질전환 카세트 GPD-tHMG1-CYC1, TEF1-CrtE-CYC1, 및 PGK1-CDPS/KS-TEF2를 도입하는 경우, 동일한 형질전환 카세트가 도입된 야생형 효모와 비교하여, 비록 세포 성장은 다소 감소하였으나 (도 7A) 카우린 생산량이 최대 120% 까지 더욱 증가(도 7B)하였으며, 이를 통해 인위적 세포 소기관 조절능을 가진 재조합 효모를 이용하는 경우, 높은 지베렐린 대사물질 생산성을 나타냄을 확인하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Recombinant yeast with artificial cellular organelles and
producing method for isoprenoids with same
<130> AJOU1-85P-1
<150> KR10-2017-0181134
<151> 2017-12-27
<160> 38
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PEX34 forward primer
<400> 1
agcggatcca aaatggtttc gaagaaaaat acg 33
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PEX34 reverse primer
<400> 2
tacgtcgact tatacaatta ttctacaaag tg 32
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ATG36 Del cassette forward primer
<400> 3
tgtattcagg gcttaaaata ctaaaatttg gtggtcagta cagttcatta gacgttgtaa 60
aacgac 66
<210> 4
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ATG36 Del cassette reverse primer
<400> 4
aactgatggt gttcggacaa cgttttagaa tgagggtatc taactttctt caggaaacag 60
ctatgacc 68
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PEX11 Del - PEX34 O/E cassette forward primer
<400> 5
tgtctacatc tactacttca aagacttcat caagtaatag tataatcaat gacgttgtaa 60
aacgacggcc 70
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PEX11 Del - PEX34 O/E cassette reverse primer
<400> 6
atcaaacata agcggagaat agccaaataa aaaaaaagat gaaaagaaag cacacaggaa 60
acagctatga cc 72
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PEX34 O/E cassette forward primer
<400> 7
ccaaaatttg tttactaaaa acacatgtgg atatcttgac tgatttttcc gacgttgtaa 60
aacgacggcc 70
<210> 8
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PEX34 O/E cassette reverse primer
<400> 8
gctctaattt gtgagtttag tatacatgca tttacttata atacagtttt cacacaggaa 60
acagctatga cc 72
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> POT1-EGFP cassette forward primer
<400> 9
gtatgtgtat cggtactggt atgggtgccg ccgccatctt tattaaagaa cggatccccg 60
ggttaattaa 70
<210> 10
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> POT1-EGFP cassette reverse primer
<400> 10
ttttaatact tgataatagt taatattctc cctttttatt atgctcatat gaattcgagc 60
tcgtttaaac 70
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> tHMG1 forward primer
<400> 11
cggcggccgc aaaatgtcta ttccagaaac tc 32
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> tHMG1 reverse primer
<400> 12
gcactagttt atttagaagt gtcaacaa 28
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GPD-tHMG1 forward primer
<400> 13
gcctgcagag tttatcatta tcaatactc 29
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GPD-tHMG1 reverse primer
<400> 14
cgcgtcgacg gccgcaaatt aaagc 25
<210> 15
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GPD-tHMG1-LEU2forward primer
<400> 15
acgttggtca agaaatcaca gccgaagcca ttaaggttct taaagctatt agtttatcat 60
tatcaatact c 71
<210> 16
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GPD-tHMG1-LEU2 reverse primer
<400> 16
atggccttac cttcttcagg caagttcaat gacaatttca acatcattgc attatcatga 60
cattaaccta t 71
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CrtE forward primer
<400> 17
gactagtaaa aatggattac gcgaacatc 29
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CrtE reverse primer
<400> 18
ccccccgggt cacagaggga tatcgg 26
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CrtYB forward primer
<400> 19
cgggatccaa aatgacggct ctcgcatatt a 31
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CrtYB reverse primer
<400> 20
acgcgtcgac ttactgccct tcccatcc 28
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CrtI forward primer
<400> 21
cgggatccaa aatgggaaaa gaacaagatc agg 33
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CrtI reverse primer
<400> 22
acgcgtcgac tcagaaagca agaacaccaa c 31
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ypl062w forward primer or ROX1 forward primer or yjl064w forward primer
<400> 23
gaattggagc tcactcg 17
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ypl062w reverse primer
<400> 24
cggcgcgccc accctctttt gatcatttat ctttcactgc 40
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ypl062w forward primer
<400> 25
aaaagagggt gggcgcgccg gttttagagc tagaaatagc a 41
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ypl062w reverse primer or ROX1 reverse primer or yjl064w reverse primer
<400> 26
gaacaaaagc tggtaccg 18
<210> 27
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ROX1 reverse primer
<400> 27
ccccctctat taccttctct gatcatttat ctttcactgc 40
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ROX1 forward primer
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agagaaggta atagaggggg gttttagagc tagaaatagc a 41
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<220>
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gggactcatg tgtcagcacc gttttagagc tagaaatagc a 41
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TEF1-CrtE-CYC1 forward primer
<400> 31
caggtcagga actgccgtca catacgacac tgcccctcac gtaagggcaa gcgcgcaatt 60
aaccc 65
<210> 32
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> TEF1-CrtE-CYC1 reverse primer
<400> 32
aatccccctc accccgaatt tattacgaat ttgcccacat ggtcggtgct atagggcgaa 60
ttgggtac 68
<210> 33
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PGK1-CrtYB-CYC1 forward primer or PGK1-CDPS/KS-TEF2 forward primer
<400> 33
ccagaaaata ctaatacttc ttcacacaaa agaacgcagt tagacaatcc aagcgcgcaa 60
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<210> 34
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PGK1-CDPS/KS-TEF2 reverse primer or PGK1-CrtYB-CYC1 reverse
primer
<400> 34
gttaaaggga atatagtata atataatata acggaaagaa gaaatgggca gattgtactg 60
agagtg 66
<210> 35
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PGK1-CrtI-ADH2 forward primer
<400> 35
cggagccgta tcgttcacca cataggcgga gtaaacttca ttagggggcg cgcgcaatta 60
accctca 67
<210> 36
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PGK1-CrtI-ADH2 reverse primer
<400> 36
cagaagaaac aagagagaat agcgtcagga tagctcgctc gatgtgacac tatagggcga 60
attggg 66
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CDPS/KS forward primer
<400> 37
ggactagtca aaatgcctgg caaaatcga 29
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CDPS/KS reverse primer
<400> 38
ccgctcgagt cacttcatgc tgcttgaaag 30
Claims (4)
- PEX34 (Peroxisomal membrane protein 34) 유전자의 과발현, PEX11 (Peroxisomal membrane protein 11) 유전자의 결실 및 ATG36 (Peroxisome autophagy-related protein 36) 유전자의 결실 변이가 도입된, 세포 소기관이 변이된 재조합 효모.
- 제1항에 있어서, 상기 PEX34 유전자, PEX11 유전자 및 ATG36 유전자는 사카로마이세스 세레비지애 유래인 것을 특징으로 하는, 세포 소기관이 변이된 재조합 효모.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 효모는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스(S.bayanus), 사카로마이세스 보울라디(S. boulardii), 사카로마이세스 불데리(S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스(S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스(S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리(S.chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스(S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스(S.ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스(S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스(S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스(S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리(S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에(S.martiniae), 사카로마이세스 모나센시스(S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스(S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스(S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스(S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸(S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스(S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스(S.unisporus), 사카로마이세스 우바룸(S. uvarum), 및 사카로마이세스 조나투스(S. zonatus)로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 세포 소기관이 변이된 재조합 효모.
- 제1항에 있어서, 상기 세포 소기관의 변이는 퍼옥시좀 (peroxisome) 의 개수 또는 크기 증대인, 세포 소기관이 변이된 재조합 효모.
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