KR20140033002A - 테르펜을 생산하기 위한 효모 세포와 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 효모 세포(yeast cell)에 관한 것으로, 상기 세포는, 가용성 하이드록시메틸글루타릴-코엔자임-A(HMG-CoA) 환원 효소를 암호화하는 기능성 유전자를 포함하고; 상기 세포에서 스테릴 아실전이효소(acyltransferase)(들)를 암호화하는 하나 이상의 유전자(들)는 결함이 있거나 결실되며; 상기 세포는 적어도 히스티딘, 류신, 또는 우라실에 대해 자가영양성이다. 또한, 본 발명은, 하나 이상의 테르펜(들)을 생산하기 위한 상기 세포의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 세포를 생성시키고, 하나 이상의 테르펜(들)과 상기 테르펜(들)을 포함하는 약제학적 또는 화장용 조성물, 윤활제 또는 변압기 오일(transformer oil)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

테르펜을 생산하기 위한 효모 세포와 이의 용도{A YEAST CELL FOR THE PRODUCTION OF TERPENES AND USES THEREOF}
본 발명은, 효모 세포(yeast cell)에 관한 것으로, 상기 세포는, 가용성 하이드록시메틸글루타릴-코엔자임-A(HMG-CoA) 환원 효소를 암호화하는 기능성 유전자를 포함하고; 상기 세포에서 스테릴 아실전이효소(acyltransferase)(들)를 암호화하는 하나 이상의 유전자(들)는 결함이 있거나 결실되며; 상기 세포는 적어도 히스티딘, 류신, 또는 우라실에 대해 자가영양성이다. 또한, 본 발명은, 하나 이상의 테르펜(들)을 생산하기 위한 상기 세포의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 세포를 생성시키고, 하나 이상의 테르펜(들)과 상기 테르펜(들)을 포함하는 약제학적 또는 화장용 조성물, 윤활제 또는 변압기 오일(transformer oil)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
현재 제약, 화장품, 및 화학 산업에서, 여러 테르펜은 중요성이 커지고 있다. 테르펜은, 예를 들어, 약제 및 화장용 조성물에서 첨가제로, 백신에서 보조제로, 피부 보습제로, 뮤코다당 분해제(mucolytic agent)로, 페로몬(pheromone)으로, 호르몬으로, 병충해 방제(pest control)를 위해, 습윤제(humectant)로, 방향제(fragrance)로, 윤활제로, 항미생물제로, 항염증제로, 식품 첨가제로, 전기 절연제로, 변압기 오일로 또는 변압기 오일 첨가제로, 화학, 제약, 및 화장품 산업에서 유용한 원료 화학물질로 사용된다. 테르펜은 또한 화학적인 목적을 위한 천연 및 지속 가능한 공급원으로 사용될 수 있다.
화학적으로, 테르펜은, 프레닐 단위(prenyl unit)로도 표시된, 하나 이상의 이소프렌 단위(들)로부터 유도된다. 이소프렌은 식 CH2=C(CH3)-CH=CH2을 갖는다. 또한, 예를 들어, 산소 또는 질소와 같은 헤테로원자의 공액(conjugation)에 의해, 테르펜은 이소프레노이드(isoprenoid)라고도 알려진 테르페노이드(terpenoid)로 변형될 수 있다.
자연에서, 대부분의 테르펜은 식물, 진균류, 및 동물에서 이차 대사물질(secondary metabolite)로 발견된다. 또한, 수종의 세균이 테르펜을 생산한다. 테르펜은 서로 다른 개수의 이소프렌 단위를 포함할 수 있다. 헤미테르펜(hemiterpene)과 그 유도체는 단일 이소프렌 단위를 포함하고, 예를 들어, 프레놀(prenol)과 이소발레르산(isovaleric acid)을 포함한다. 모노테르펜과 그 유도체는 두 개의 이소프렌 단위를 포함하고, 예를 들어, 게라니올(geraniol), 리모넨(limonene) 및 테르피네올(terpineol)을 포함한다. 세스퀴테르펜(sesquiterpene)과 그 유도체는 세 개의 이소프렌 단위를 포함하고, 예를 들어, 파르네센(farnesene), 파르네솔(farnesol)을 포함한다. 디테르펜과 그 유도체는 네 개의 이소프렌 단위로 이루어지고, 예를 들어, 게라닐게라닐 파이로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate), 카페스톨(cafestol), 카베올(kahweol), 셈브렌(cembrene)과 탁사디엔(taxadiene)(탁솔의 전구체), 레티놀(retinol), 레티날(retinal), 및 피톨(phytol)을 포함한다. 세스터테르펜(sesterterpene)과 그 유도체는 다섯 개의 이소프렌 단위를 포함하고, 예를 들어, 세스터테르펜과 게라닐파르네솔(geranylfarnesol)을 포함한다. 트리테르펜은 여섯 개의 이소프렌 단위를 포함하고, 예를 들어, 스쿠알렌(squalene), 라노스테롤(lanosterol), 및 시클로아르테놀(cycloartenol)을 포함한다. 테트라테르펜은, 예를 들어, 비고리형 리코펜(acyclic lycopene), 단일고리 감마-카로틴(monocyclic gamma-carotene), 및 이중고리 알파와 베타 카로텐을 포함한다. 폴리테르펜은 여러 이소프렌 단위의 긴 사슬로 이루어지고, 예를 들어, 천연 고무와 구타 페르카(gutta percha)를 포함한다.
광범위한 대부분의 테르펜은 효소 촉매화된 메발로네이트(mevalonate) 경로로부터 유도된다. 여기에서, 테르펜의 형성은 아세틸-코엔자임 A(CoA)으로 출발한다. 두 개의 아세틸-CoA 분자는 반응해서 하나의 아세토아세틸-CoA 분자로 효소 촉매화된다. 다음 단계에서, 아세토아세틸-CoA는 추가의 아세틸-CoA 분자와 반응해서 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-CoA가 된다 (하이드록시메틸글루타릴-CoA; HMG-CoA). 다음 단계에서, HMG-CoA는 메발로네이트로 환원된다. 이 반응은 효소 HMG-CoA 환원효소에 의해 촉매화되고, 전형적으로 테르펜 생합성의 속도 결정 단계이다. 따라서, HMG-CoA 환원효소는 메발로네이트 경로의 중요 효소로 알려져 있다.
메발로네이트는 전형적으로 두 번 포스포릴화되고 이소펜테닐-파이로포스페이트(IPP)로 카르복시기가 제거된다. 이성질화, 응축, 및 탈수소의 연속 단계를 통해, IPP는 게라닐-파이로포스페이트로 전환되고, 이는 추가 IPP 단위와 결합하여 파르네실-파이로포스페이트가 된다. 두 개의 분자인 파르테실-파이로포스페이트는 환원 응축하여 스쿠알렌이 되고, 이는 콜레스테롤과 임의의 스테로이드 호르몬에서 전환될 수 있다.
대안적으로, 게라닐-파이로포스페이트와 파르네실-파이로포스페이트는, 테트라- 및 폴리테르펜과 같은 더 큰 테르펜으로 추가 반응할 수 있다.
매우 중요한 테르펜은 트리테르펜으로, 스쿠알렌이다. 세계적으로, 대략 2,000톤의 스쿠알렌이 매년 생산된다. 이는 대략 1억 2천 5백만 달러의 연간 매출을 낳는다. 기술적으로, 스쿠알렌은, 화장품과, 제약 산업에서 영양 보충제로 사용되는 것이 바람직하다. 추가로, 스쿠알렌은 생분해성 윤활제로 사용되고 변압기 오일로 또한 사용된다. 스쿠알렌은 산화방지제로 작용할 수 있고 또한 백신의 보조제(adjuvant)로 정식으로 사용된다.
종래부터, 스쿠알렌은, 예를 들어, 어유(fish oil), 특히 상어의 간유와 같은 생물학적 공급원으로부터 얻어진다. 그러면, 스쿠알렌은 수고스러운 절차를 통해 어유의 복합 조성물로부터 정제된다. 제약 분야에서, 승인될 제품의 추적가능성(traceability)은 보건 당국을 위해 매우 중요하다. 그러나, 이러한 추적가능성은, 제품이 동물 기원으로부터 온 생성물을 함유하면 보증하기가 어렵다. 예를 들어, 상어와 같은 생선이 잡히기 전에 무엇을 먹었는지 정확하게 알기 어렵다. 그래서, 제약품에 대해, GMP 적격 원료를 사용하는 것이 중요하고, 이는, 이들의 추적 가능성이 기원으로부터 바로 얻어질 수 있음을 의미한다. 또한, 여러 개의 상어 종(species)은 멸종(extinction) 위협을 받는 멸종위기에 처한 종이다. 스쿠알렌과 다른 테르펜은 생물학적 원료로부터 이와 유사하게 얻어지고, 힘들고 흔히 위험한 절차로 정제되어야만 한다.
따라서, 스쿠알렌과 같은 테르펜을 제조하기 위한 대안적인 방법에 대한 필요성이 있다. 보다 높은 수율의 스쿠알렌을 생산하는 유전자 변형 효모 균주(strain)의 사용이 증명되었다 (EP 0 486 290). 그러나, 상술한 효모 균주는, 에르고스테롤(ergosterol)과 같은 많은 양의 스테로이드를 추가로 생산한다. 스테로이드가 생산되면 스쿠알렌과 다른 테르펜의 수율은 감소된다. 또한, 더 많은 양의 스테로이드 불순물의 존재는 원료에서 스쿠알렌 및 이와 다른 테르펜을 정제하기 위한 복잡한 방법을 필요로 한다.
지금까지, 이 기술 분야에 알려진 유전자 변형 유기체(GMOs)는, 테르펜의 효율적인 산업상의 생산을 위해 지나치게 낮은 농도로 지나치게 많은 불순물과 함께 테르펜을 생산한다.
또한, 유전자 변형 유기체는 유전학적으로 비교적 불안정한 것으로 일반적으로 알려져 있고, 배양시, 대응하는 야생형 세포보다 전형적으로 더 낮은 생존성(viability) 및/또는 성장 역학(growth kinetics)을 갖는다. 따라서, 상기 세포의 배치(batch)를 배양하는 동안, 상기 배치의 생산성은 전형적으로 시간에 따라 빠르게 감소한다. 이는, 가변적인 산업상의 제조 방법에서 유전자 변형 유기체의 효율적인 사용 가능성을 정규적으로 방해한다.
또한, 하나 이상의 외래 유전자(들)를 삽입하여 유전자 변형 유기체를 생성시키면, 유기체의 하나 이상의 원래 유전자(들)는 상기 외래 유전자로 대체된다. 이것은, 세포가 특정 유기 영양소에 대해서 영양요구성 세포로 된다는 이점을 가질 수 있고, 이는 선택의 목적을 위해 사용될 수 있다. 또한, 특정 세포 배양 조건에서, 영양요구성(auxotrophy)은 세포의 재현성을 위한 이점을 가질 수 있는 것으로 알려져 있다. 특정 조건에서, 자가영양 세포(prototrophic cell)는 대응하는 영양 요구성 세포(auxotrophic cell)에 의해 제압된다. 일례로, 암모니아 제한 성장 조건에서, 히스티딘 자가영양 ho△::HIS3 효모 세포는, 30 세대(30 generation) 동안 배양시, 대응하는 히스티딘 영양요구성 세포 HO his3에 의해 제압되었다 (Pronk, 2002). 이에 따라, 유전자 변형 유기체는 영양요구성 균주로 흔히 배양되었다. 그러나, 영양요구성 세포의 사용은 배양 배지의 선택의 자유를 분명하게 제한한다.
상술한 내용으로부터, 유전학적으로 충분히 안정한 산업상 이용가능성을 위해 충분히 높은 농도와 순도로 테르펜을 생산하는 유기체에 대한 충족되지 않은 필요성이 여전히 존재한다.
따라서, 본 발명의 기저에 있는 기술적인 문제는, 테르펜의 향상된 생산성과, 향상된 유전학적 및 표현형(phenotypic) 안정성을 갖는 유기체를 제공하는 것이다.
놀랍게도, 가용성 하이드록시메틸글루타릴-코엔자임-A(HMG-CoA) 환원효소를 암호화하는 기능성 유전자를 포함하고, 스테릴 아실전이효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자가 제거되었으며, 히스티딘, 류신, 및 우라실에 대해 자가영양성인 효모 세포는 세포 컬쳐에서, 테르펜의 높은 생산성과, 향상된 유전학적 및 표현형 안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예상대로, 스테릴 아실전이효소를 암호화하는 유전자의 제거로 스테릴 에스테르의 수준이 더 낮아졌다. 그러나, 예상치 못하게, 스테릴 아실전이효소를 암호화하는 유전자의 제거는 스테롤의 축적으로 이끌지 않았고, 그 대신 스쿠알렌과 같은 테르펜의 축적으로 이끌었다.
상기 생성된 세포는 안정한 세포주를 형성하며 30 세대 이상 배양시 유전학적으로 안정하다. 여기서, 놀랍게도, 히스티딘, 류신 및 우라실에 대해 자가영양성인 세포는 대응하는 영양요구성 세포보다 더 높은 유전학적 및 표현형 안정성을 갖고 있음을 발견하였다.
첫번째 양태로, 본 발명은 효모 세포에 관한 것으로, 여기서
a) 상기 세포는 가용성 하이드록시메틸글루타릴-코엔자임-A(HMG-CoA) 환원 효소를 암호화하는 기능성 유전자를 포함하고;
b) 상기 세포에서 스테릴 아실전이효소(들)를 암호화하는 하나 이상의 유전자(들)가 결함이 있거나 제거되었으며;
c) 상기 세포가 적어도 히스티딘, 류신, 또는 우라실에 대해 자가영양성이고, 바람직하게는 상기 세포가 적어도 히스티딘과 류신, 히스티딘과 우라실, 또는 류신과 우라실에 대해 자가영양성이고, 특히, 상기 세포가 히스티딘, 류신 및 우라실에 대해 자가영양성이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효모 세포"는 최대의 광의적 의미로 효모 유기체의 임의의 세포로 이해될 수 있다. 바람직하게는, 상기 효모 세포가 사카로미세스(Saccharomyces) 세포일 수 있으며, 특히 사카로미세스(Saccharomyces) 세포는 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 델브뤼키(Saccharomyces delbruckii), 사카로미세스 이탈리쿠스(Saccharomyces italicus), 사카로미세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로미세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로미세스 크루세이(Saccharomyces krusei), 사카로미세스 락티스(Saccharomyces lactis), 사카로미세스 마륵시아누스(Saccharomyces marxianus), 사카로미세스 마이크로엘립소이데스(Saccharomyces microellipsoides), 사카로미세스 몬타누스(Saccharomyces montanus), 사카로미세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로미세스 올레아세우스(Saccharomyces oleaceus), 사카로미세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로미세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 사카로미세스 프레토리엔시스(Saccharomyces pretoriensis), 사카로미세스 로세이(Saccharomyces rosei), 사카로미세스 로욱시(Saccharomyces rouxii), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로미코데스 루드비기(Saccharomycodes ludwigii)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 상기 세포가 사카로미세스 세레비지애 세포이다. 상기 사카로미세스 세레비지애 세포는 임의의 균주의 세포일 수 있으며, 바람직하게는 실시예에서 예시적으로 사용되는 바와 같은 균주 AH22의 세포일 수 있다.
대안적으로, 상기 세포가 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로미세스 마륵시아누스 변이주 마륵시아누스(Kluyveromyces marxianus var. marxianus), 클루이베로미세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 칸디다 우틸리스(Candida utilis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica) 및 칸디다 베르사틸리스(Candida versatilis), 피키아 스티피디스(Pichia stipidis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 피키아 소르비토필라(Pichia sorbitophila)와 같은 피키아 속(genus Pichia), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 데바로미세스(Debaromyces), 한세눌라(Hansenula), 사카로미세콥시스(Saccharomycecopsis), 사카로미코데스(Saccaromycodes), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 비케르하미아(Wicherhamia), 데바요미세스(Debayomyces), 한세니아스포라(Hanseniaspora), 클로에케라(Kloeckera), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 오가태아(Ogataea), 쿠라이시아(Kuraishia), 코마가탤라(Komagataella), 메트쉬니코비아(Metshnikowia), 빌리옵시스(Williopsis), 나카자배아(Nakazawaea), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 토룰라스포라(Torulaspora), 불레라(Bullera), 로도토룰라(Rhodotorula), 빌롭시스(Willopsis) 또는 스포로볼로미세스(Sporobolomyces)로부터의 비-사카로미세스 세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기능성 유전자"는 효모 세포에서 활성일 수 있다. 따라서, 적합한 조건하에서, 상기 유전자는 효모 세포에서 전사되고 번역되어 가용성 하이드록시메틸글루타릴-코엔자임-A(HMG-CoA) 환원효소 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 본 발명을 통하여 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 이해될 수 있다.
용어 "가용성 하이드록시메틸글루타릴-코엔자임-A (HMG-CoA) 환원효소"는 최대의 광의적 의미로 하이드록시메틸글루타릴-코엔자임-A (HMG-CoA)가 메발로네이트로 환원되는 것을 촉매하는 효소의 가용성 형태로 이해될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "하이드록시메틸글루타릴-코엔자임-A", "하이드록시글루타릴-CoA", "3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-CoA", "3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA", "β-하이드록시-β-메틸-글루타릴-CoA", "β-하이드록시-β-메틸글루타릴-CoA", "베타-하이드록시-베타-메틸-글루타릴-CoA", "베타-하이드록시-베타-메틸글루타릴-CoA" 및 "HMG-CoA"는 상호교환적으로 이해될 수 있다.
바람직하게는, 야생형 형태의 HMG-CoA 환원효소와 대조적으로, 본 발명의 가용성 HMG-CoA 환원효소는 예를 들어, 메발로네이트, 글루카곤, 콜레스테롤, L-하이드록시콜레스테롤, 저밀도 지방단백질 및 담즙산과 같은 야생형 HMG-CoA의 억제제 하나 이상에 의해 억제될 수 없다.
가장 바람직하게는, 상기 가용성 HMG-CoA 환원효소가 실시예에서 예시적으로 사용되는 바와 같은 절단형 HMG-CoA 환원효소(tHMG1)이다. 상기 tHMG1은 Basson 등(Basson et al., 1988)에 의해 추가로 설명되며/되거나 서열 확인 번호: 1의 DNA 서열로 코드화된다.
본 발명의 가용성 HMG-CoA 환원효소가 또한 하나 이상의 번역후 변형(들)의 생성물일 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 번역후 변형은 당해 분야에 잘 알려져 있으며 지질화, 포스포릴화, 황산화, 글리코실화, 절단(truncation), 수개의 아미노산 잔기의 고리화, 폴리펩티드 스트랜드의 고리화, 산화, 환원, 탈카르복실화, 아세틸화, 아미드화, 탈아미드화, 이황화 결합 형성, 파이로글루타메이트 형성, 아미노산 첨가, 보조인자 첨가 (예, 비오티닐화, 헴(heme) 첨가) 및 금속 이온, 비-금속 이온, 펩티드 또는 작은 분자의 착화 및 황화철 클러스터의 첨가를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지는 않는다. 분명한 것은, 예를 들어, ATP, ADP, NAD+, NADH+H+, NADP+, NADPH+H+, 금속 이온, 음이온, 지질 등과 같은 보조인자가 이들 보조인자의 생물학적 영향에 대해서는 관계없이, 폴리펩티드에 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "가용성"은 막 결합 특성이 감소된 효소의 형태를 언급한다. 바람직하게는, 본 발명의 가용성 HMG-CoA 분자 중 50% 이상은 막에 통합되거나 부착되지 않으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 가용성 HMG-CoA 분자 중 60% 이상이 막에 통합되거나 부착되지 않으며, 더욱 더 바람직하게는 본 발명의 가용성 HMG-CoA 분자 중 70% 이상이 막에 통합되거나 부착되지 않으며, 더욱 더 바람직하게는 본 발명의 가용성 HMG-CoA 분자 중 80% 이상이 막에 통합되거나 부착되지 않으며, 더욱 더 바람직하게는 본 발명의 가용성 HMG-CoA 분자 중 90% 이상이 막에 통합되거나 부착되지 않으며, 가장 바람직하게는 본 발명의 가용성 HMG-CoA 분자 중 95% 이상이 막에 통합되거나 부착되지 않는다. 상기 가용성 HMG-CoA 환원효소는 바람직하게는, 본 발명의 효모 세포의 사이토졸(cytosol)에 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "스테릴 아실전이효소"는 스테릴 아실 에스테르의 형성을 촉매하는 임의의 효소를 언급한다. 상기 스테릴 아실전이효소는 스테롤 O-아실전이효소일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "스테롤 O-아실전이효소", "스테롤-에스테르 합성효소" 및 "아실-CoA:스테롤 아실전이효소"는 상호교환적으로 이해될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 상기 스테롤 O-아실전이효소가 바람직하게는 효모 스테롤 O-아실전이효소(EC 2.3.1.26)이다. 더욱 바람직하게는, 상기 스테롤 O-아실전이효소(들)는 본 발명의 실시예에서 예시적으로 사용되는 스테롤 O-아실전이효소 중 하나 또는 둘다의 유전자 생성물(들), 따라서, 효모의 ARE1 유전자 및/또는 ARE2 유전자이다.
상기 ARE1 유전자는 또한 정돈된 유전자 자리명 YCR048W 또는 ORF명 YCR48W인, SAT2 유전자로 알려져 있다. 상기 ARE2 유전자는 정돈된 유전자자리명 YNR019W 또는 ORF명 N3206인, SAT1 유전자로 알려져 있다.
본 발명의 효모 세포에서는, 스테릴 아실전이효소를 암호화하는 유전자가 결실되어 있거나 결함이 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결실된"이란 상기 유전자 또는 상기 유전자의 부분(들) 하나 이상이 제거되었음을 의미힌다. 상기 유전자는 전사되지 않으며 유전자 생성물이 없어, 대응하는 폴리펩티드가 생산되지 않는다. 반드시 상기 유전자 전체가 게놈으로부터 제거되어야 하는 것으로 이해되지 않을 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자의 50% 이상, 더욱 바람직하게는 상기 유전자의 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 상기 유전자의 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 상기 유전자의 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 상기 유전자의 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 상기 유전자의 95% 이상, 가장 바람직하게는 상기 유전자의 100%가 결실된다. 상기 결실은 말단 결실 또는 절간(intercalary) 결실일 수 있다. 이는 실험자에 의해 또는 자연적으로 일으킬 수 있다. 당해 분야에 알려져 있는 임의의 수단으로 유전자를 결실시킬 수 있다. 예를 들면, 교차법(crossing over)으로 또는 cre-재조합효소 공법을 사용하여 상기 유전자를 결실시킬 수 있다 (Guldener et al, 1996).
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "결함이 있는"은 상기 유전자가 전사되지 않거나 상기 유전자가 유전자 생성물을 암호화하여, 폴리펩티드가 기능성이 아님을 의미한다. 스테릴 아실 아실전이효소 유전자의 문맥에서, 상기 용어 "기능성이 아닌"은 폴리펩티드가 대응하는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 아실 전이효율이 50% 미만, 바람직하게는 40% 미만, 더욱 바람직하게는 30% 미만, 더욱 더 바람직하게는 20% 미만, 더욱 더 바람직하게는 10% 미만, 더욱 더 바람직하게는 5% 미만, 더욱 더 바람직하게는 4% 미만, 더욱 더 바람직하게는 3% 미만, 더욱 더 바람직하게는 2% 미만, 더욱 더 바람직하게는 1% 미만임을 의미한다.
실시예에서 예시적으로 나타낸 바와 같이, ARE1 및/또는 ARE2 유전자(들)는 바람직하게는 결실될 수 있으며, 특히 ARE1 및 ARE2 유전자가 결실된 것이 바람직하다. 당해 분야에 알려져 있는 방법으로 유전자가 결함이 있도록 만들 수 있다. 예를 들어, 실험자에 의해 또는 자연적으로 (예, 방사전조사, 화학약품에 의해, 또는 자발적으로) 일어나는 비특이적 돌연변이에 의해 또는 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 (예, PCR에 의해) 상기 유전자를 결함이 있는 것으로 바꿀 수 있다. 프레임이동(frameshift) 또는 점 돌연변이(단일 뉴클레오티드 교환)에 의해 일으킬 수 있다.
본 발명을 통하여, 용어 "자가영양성(prototrophic)"은 최대의 광의적 의미로 세포 생육에 요구되는 특정 유기 화합물을 합성할 수 있는 능력을 갖고 있는 것으로 이해될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 효모 세포는 히스티딘, 류신 및/또는 우라실에 대해 자가영양성일 수 있다. 그러므로, 상기 세포는 히스티딘, 류신 및/또는 우라실을 자체적으로 합성할 수 있으며, 따라서 히스티딘-, 류신- 및/또는 우라신-유리(free) 매지에서 및 히스티딘-, 류신- 및/또는 우라실-유리 세포 배양 플레이트상에서 생육할 수 있다. 효모 세포는 또한 다른 영양 인자에 대해 자가영양성일 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
바람직한 실시형태로, 본 발명의 효모 세포는 안정한 세포주, 바람직하게는 히스티딘, 류신 또는 우라실에 대해 적어도 영양요구성인 대응하는 세포보다 더욱 안정한, 더욱 바람직하게는 히스티딘과 류신, 히스티딘과 우라실, 또는 류신과 우라실에 대해 영양요구성인 대응하는 세포, 더욱 더 바람직하게는 히스티딘, 류신 및 우라실에 대해 영양요구성인 대응하는 세포보다 더욱 안정한 세포주의 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "안정한 세포주"는 본 발명의 문맥에서 관련한 이의 표현형 특성을 유지하는 세포 집단으로 이해될 수 있다. 이들 관련 특성은 주로 생존력, 생육 및/또는 테르펜 생산성, 가장 바람직하게는 생존력, 생육 및 테르펜 생산성이다.
상기 안정한 세포주가 바람직하게는 유전학적으로도 안정한 것임을 당해 분야의 숙련가는 이해할 것이다.
30세대 동안 배양시킬 때, 상기 테르펜 생산성이 30세대 동안 배양시키기 전의 효모 세포와 비교하여, 바람직하게는 50%보다 크지 않게 감소하고, 더욱 바람직하게는 30%보다 크지 않게 감소하며, 더욱 더 바람직하게는 20%보다 크지 않게 감소하고, 더욱 더 바람직하게는 10%보다 크지 않게 감소하며, 더욱 더 바람직하게는 8%보다 크지 않게 감소하고, 더욱 더 바람직하게는 6%보다 크지 않게 감소하며, 더욱 더 바람직하게는 4%보다 크지 않게 감소하고, 가장 바람직하게는 2%보다 크지 않게 감소한다.
또한, 30세대 동안 배양시킬 때, 세포 번식율이 30세대 동안 배양시키기 전의 효모 세포와 비교하여 바람직하게는 50%보다 크지 않게 감소하고, 더욱 바람직하게는 30%보다 크지 않게 감소하며, 더욱 더 바람직하게는 20%보다 크지 않게 감소하고, 더욱 더 바람직하게는 10%보다 크지 않게 감소하며, 더욱 더 바람직하게는 8%보다 크지 않게 감소하고, 더욱 더 바람직하게는 6%보다 크지 않게 감소하며, 더욱 더 바람직하게는 4%보다 크지 않게 감소하고, 가장 바람직하게는 2%보다 크지 않게 감소한다.
또한, 본 발명의 효모 세포의 테르펜 생산성은 10세대 이상, 20세대 이상, 30세대 이상, 40세대 이상, 50세대 이상, 60세대 이상, 70세대 이상, 80세대 이상, 90세대 이상, 100세대 이상, 150세대 이상, 또는 200세대 이상 배양시킬 때 20%이상 까지 감소되지 않는 것이 바람직하다.
마찬가지로, 본 발명의 효모 세포의 세포 번식율은 10세대 이상, 20세대 이상, 30세대 이상, 40세대 이상, 50세대 이상, 60세대 이상, 70세대 이상, 80세대 이상, 90세대 이상, 100세대 이상, 150세대 이상, 또는 200세대 이상 배양시킬 때 20%이상 까지 감소되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명을 통하여, 용어 "영양요구성"은 최대의 광의적 의미로 효모가 이의 생육에 요구되는 특정 유기 화합물을 합성할 수 없는 것으로 이해될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 효모 세포는 히스티딘, 류신 및/또는 우라실에 대해 영양요구성일 수 있다. 그러므로, 상기 세포는 히스티딘, 류신 및/또는 우라실을 자체적으로 합성할 수 없으며, 따라서 히스티딘-, 류신- 및/또는 우라실-유리(free) 배지에서 및 히스티딘-, 류신- 및/또는 우라실-유리 세포 컬쳐 플레이트상에서 생육할 수 없다. 상기 영양요구성 효모 세포는 배양 배지 중에 히스티딘, 류신 및/또는 우라실을 각각 보충할 필요가 있다. 효모 세포는 또한 이들로 제한되는 것은 아니나, 비타민, 아미노산, 슈가 및 지방산으로 이루어진 군의 다른 영양 인자에 대해서도 영양요구성인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "히스티딘, 류신 또는 우라실에 대해 적어도 영양요구성인 대응하는 세포"는 본 발명의 세포와 동일한 유전자 기원을 갖는 세포를 언급한다. 상기 히스티딘, 류신 또는 우라실에 대해 적어도 영양요구성인 대응하는 세포는 또한 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 기능성 유전자를 포함한다. 또한, 상기 세포에서 스테릴 아실전이효소(들)를 암호화하는 유전자(들) 하나 이상이 결핍되어 있거나 결실되어 있다. 본 발명의 세포와 히스티딘, 류신 또는 우라실에 대해 적어도 영양요구성인 대응하는 세포간의 유일한 유전적 차이는 후자가 히스티딘, 류신 및/또는 우라실에 대해 적어도 영양요구성이라는 것이다. 바람직하게는, 상기 세포가 사카로미세스 세포, 더욱 바람직하게는 사카로미세스 세레비지애 세포, 더욱 더 바람직하게는 균주 AH22의 사카로미세스 세레비지애 세포, 더욱 더 바람직하게는 균주 AH22로부터 유래된 효모 균주 AH22tH3로부터 기원하는 세포, 더욱 바람직하게는 균주 AH22tH3ura8로부터, 더욱 더 바람직하게는 AH22tH3ura8△are1 또는 AH22tH3ura8△are2 중 하나로부터 기원하는 세포이다. 가장 바람직하게는, 히스티딘, 류신 또는 우라실에 대해 적어도 영양요구성인, 상기 대응하는 세포가 실시예에서 예시적으로 나타내는 바와 같은 균주 AH22tH3ura8△are1△are2의 효모 세포이다.
바람직한 실시형태로, 상기 세포가 유전자 변형 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 변형 세포"는 최대의 광의적 의미로 당해 분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 게놈을 변형시킨 세포로, 유전자 변형 유기체(GMO)로도 표시되는 것으로 이해될 수 있다. 상기 세포 자체가 변형될 수 있거나 유전자 변형된 세포의 후손일 수 있다. 전형적으로, GMO는 방사선조사 (예, 자외선(UV) 조사, X-선 조사, 방사능/핵 조사(예, 알파-, 베타- 또는 감마-조사) 또는 우주방사선) 또는 돌연변이제(들) (예, 핵염기로의 알킬화제 (예, 질소머스타드 (예, 시클로포스파미드, 메클로르에타민 또는 머스틴(NH2), 우라머스틴 또는 우라실 머스타드, 멜팔란, 클로르암부실, 이포스마이드), 니트로소우레아 (예, 카르머스틴, 로머스틴, 스트렙토조신), 알킬 술포네이트 (예, 부설판), 티오테파 및 이의 유사체, 백금 유도체 (예, 시스플라틴, 카르보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트), 프로카르바진, 알트레타민, 아플라톡신과 이의 대사산물 및 유도체, 니트라이트, 아닐린과 이의 대사산물 및 유도체, 벤젠과 이의 대산산물 및 유도체, 폴리사이클릭 방향족과 이의 대사산물 및 유도체), 니트로소아민, 비소, 석면(asbestos), 베릴륨과 이의 화합물, 에틸렌 옥사이드, 6가 크롬(VI) 화합물, 라돈, 비닐 클로라이드, 연무(smoking) 등)를 사용한 비특이적 또는 특이적 돌연변이와 같은, 인간의 실험조작에 의해 생성된다. 그러나, 돌연변이는 또한 자발적으로 일어날 수 있다.
바람직한 실시형태로, 상기 세포가 사카로미세스 세포, 더욱 바람직하게는, 상기 세포가 사카로미세스 세레비지애 세포, 특히 상기 세포가 균주 AH22의 사카로미세스 세레비지애 세포로부터 유래된다.
균주 AH22의 효모 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 ATCC 번호 38626으로 상업적으로 입수가능하다. 원래, leu2- 이중 돌연변이와 유전자형 a'leu2-3 leu2-112 his4-519 can1을 갖는 AH22 균주는 야생형 균주 S288c로부터 유래한다 (Hinnen et al., 1978). 상기 S288c 균주 (Mortimer et al., 1985)도 ATCC 번호 26108로 상업적으로 입수가능하다. 바람직하게는, 본 발명의 효모 세포가 균주 AH22의 세포로부터 유래된 균주 AH22tH3으로부터 기원하는, 더욱 바람직하게는 균주 AH22tH3ura8로부터 기원하는, 더욱 더 바람직하게는 균주 AH22tH3ura8△are1, AH22tH3ura8△are2 또는 AH22tH3ura8△are1△are2 중 하나로부터 기원하는, 더욱 더 바람직하게는 균주 AH22tH3ura8△are1△are2로부터 기원하는, 더욱 더 바람직하게는 균주 AH22tH3ura8△are1△are2H, AH22tH3ura8△are1△are2U 또는 AH22tH3ura8△are1△are2L 중 하나로부터 기원하는 사카로미세스 세레비지애 세포이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 효모 세포가 실시예에서 예시적으로 나타낸 바와 같은 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 효모 세포이다.
추가의 바람직한 실시형태로, 가용성 HMG-CoA 환원효소가
a) 막-결합 영역이 결여되어 있는 절단형 가용성 HMG-CoA 환원효소 단백질이고;
b) 상기 세포에서 활성인 프로모터의 전자 조절하에서 벡터상에 암호화되며;
c) 구성적 프로모터의 조절하에서, 특히 강력한 구성적 프로모터의 조절하에서 발현됨을 특징으로 한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "절단형 가용성 HMG-CoA 환원효소 단백질"은 구성적 아미노산 스트랜드의 길이에 있어서 야생형 HMG-CoA 환원효소 단백질보다 더 짧은 길이를 갖는 HMG-CoA 환원효소 단백질을 언급한다. 바람직하게는, 상기 HMG-CoA 환원효소 단백질은 야생형 단백질의 막-결합 영역이 결여되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "막-결합 영역"은 막으로의 통합 또는 막으로의 부착과 관련한 폴리펩티드 스트랜드에서의 영역을 언급한다. HMG-CoA 환원효소의 아미노-말단 525개의 아미노산이 주로 막으로 통합되는 것으로 당해 분야에 알려져 있다 (Basson et al., 1988).
그러므로, 본 발명의 문맥에서, 바람직하게는 대략 450 부터 500 까지, 대략 500 부터 510 까지, 대략 510 부터 520 까지, 대략 520 부터 530 까지, 대략 530 부터 540 까지, 대략 540 부터 550 까지, 대략 550 부터 560 까지, 대략 560 부터 570 까지 또는 대략 570 부터 600 까지 범위에 있는 아미노산까지의 아미노-말단 아미노산이 절단될 수 있다. 일례로, 아미노산 552 까지의 아미노산, 따라서 아미노산 1 내지 552가 절단될 수 있다 (Polakowski et al., 1998). 가장 바람직하게는, 상기 절단형 가용성 HMG-CoA 환원효소가 Basson 등에 의해 기재된 바와 같은 tHMG1이다 (Basson et al., 1988). tHMG1은 서열 확인 번호:1의 DNA 서열에 의해 암호화된다.
야생형 HMG-CoA 환원효소와는 대조적으로, 본 발명의 절단형 가용성 HMG-CoA 환원효소는 예를 들어, 메발로네이트, 글루카곤, 콜레스테롤, L-하이드록시콜레스테롤, 저밀도 지방단백질 및 담즙산과 같은 야생형 HMG-CoA의 억제제 하나 이상에 의해 억제되지 않을 수 있다.
가장 바람직하게는, 상기 가용성 HMG-CoA 환원효소가 실시예에서 예시적으로 사용되는 바와 같은 절단형 HMG-CoA 환원효소인 tHMG1이다. 상기 tHMG1은 Basson 등(Basson et al., 1988)에 의해 추가로 설명되며/되거나 서열 확인 번호:1의 DNA 서열에 의해 암호화된다.
상기 지적한 바와 같이, 본 발명의 가용성 HMG-CoA 환원효소는 또한 하나 이상의 번역후 변형(들)의 생성물일 수 있다. 번역후 변형은 당해 분야에 잘 알려져 있으며 지질화, 포스포릴화, 황산화, 글리코실화, 절단(truncation), 수개의 아미노산 잔기의 고리화, 폴리펩티드 스트랜드의 고리화, 산화, 환원, 탈카르복실화, 아세틸화, 아미드화, 탈아미드화, 이황화 결합 형성, 파이로글루타메이트 형성, 아미노산 첨가, 보조인자 첨가 (예, 비오티닐화, 헴(heme) 첨가) 및 금속 이온, 비-금속 이온, 펩티드 또는 작은 분자의 착화 및 황화철 클러스터의 첨가를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지는 않는다. 분명한 것은, 예를 들어, ATP, ADP, NAD+, NADH+H+, NADP+, NADPH+H+, 금속 이온, 음이온, 지질 등과 같은 보조인자가 이들 보조인자의 생물학적 영향에 대해서는 관계없이, 폴리펩티드에 결합될 수 있다.
본 발명의 문맥에서 사용되는 바와 같은 용어 "벡터"는 효모 세포로 유전자 정보를 이동시키는 임의의 조성물로 언급될 수 있다. 상기 유전자 정보는 데옥시리보핵산(DNA) (이중사 DNA(dsDNA), 단일사 DNA(ssDNA)), 리보핵산(RNA) (단일사 RNA(ssRNA), 이중사 RNA(dsRNA))로서, 또는 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노(morpholino), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA) 또는 메틸화된 DNA와 같은 DNA 유사체로 암호화될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자 정보가 DNA로 암호화된다. 상기 벡터는 예를 들어, 선형 벡터, 환형 벡터, 바이러스성 벡터 또는 세균성 벡터와 같이 당해 분야에 알려져 있는 임의의 벡터일 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터가 선형 DNA 또는 환형 DNA, 더욱 바람직하게는 환형 DNA, 특히 플라스미드를 포함한다. 상기 벡터는 당해 분야에 알려져 있는 방법에 의해 세포중으로 삽입될 수 있으며, 형질감염제(들) (예, 리튬 아세테이트, 폴리에틸렌 이민(PEI), 퓨젠(fugene), LT-1, JetPEI, 트랜스펙타민, 리포펙타민, UptiFectin, PromoFectin, GenePORTER, Hilymax, 탄소 나노섬유, 탄소 나노튜브 세포-침투 펩티드(CPPs), 단백질 형질도입 도메인(PTDs), 리포좀, DEAE-덱스트란, 덴드리머), 전기자극법(electrophoration), 또는 유전자총, 광학적 형질감염법, 유전자 전기전달법, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection) 및/또는 자석-보조형 형질감염법과 함께 또는 이들 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터가 환형 DNA 벡터이고, 더욱 바람직하게는, 상기 벡터가 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 예를 들어, YEpH2 또는 pUC19 플라스미드와 같이, 당해 분야에 알려져 있는 임의의 플라스미드일 수 있다. 상기 벡터는 또한 표적 세포의 게놈에 통합될 수 있거나 되지 않을 수 있는 선형 발현 카세트일 수 있다. 그러나, 이들 이외의 다른 모든 벡터가 또한 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
용어 "전사 조절하에서"는 프로모터가 유전자의 전사비율을 조절함을 의미한다. 전사비율은 시간 간격당 생성되는 벡터 DNA의 안티센스 스트랜드의 절편에 상보적인 메신저 RNA(mRNA)의 비율이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "프로모터"는 최대의 광의적 의미로 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자의 전사를 용이하게 하는 DNA의 영역으로 이해될 수 있다. 상기 프로모터는 상기 유전자 근처에 위치할 수 있으며, 동일한 스트랜드와 업스트림상에 위치할 수 있다. 업스트림(upstream)은 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 센스 스트랜드의 5'영역쪽으로 위치하는 것을 의미한다. 상기 프로모터는 상동성(homologous) 프로모터 또는 비상동성(heterologous) 프로모터일 수 있다. 가장 바람직하게는, 실시예에서 예시적으로 나타낸 바와 같은 프로모터가 사용된다.
용어 "발현된"이란 최대의 광의적 의미로 유전자 정보가 폴리펩티드 스트랜드로 전환되는 것으로 이해될 수 있다.
용어 "구성적 프로모터"는 이의 관련한 유전자가 연속적으로 전사되도록하는 광범위하게 조절되지 않는 프로모터로 이해될 수 있다. 용어 "강력한 구성적 프로모터"는 높은 전사비율을 보유하는 프로모터를 언급한다.
또한, 바람직한 실시형태로, 스테릴 아실전이효소(들)를 암호화하는 유전자(들) 하나 이상이 ARE1 및/또는 ARE2이고, 바람직하게는 두 유전자, ARE1과 ARE2가 결함이 있거나 결실되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 스테릴 아실 에스테르의 형성에 영향을 주는 다른 유전자가 결함이 있거나 결실될 수 있다.
바람직한 실시형태로, 상기 세포의 테르펜 생산성, 바람직하게는 트리테르펜 생산성, 특히 스쿠알렌 생산성은 대응하는 야생형 세포 및/또는 히스티딘, 류신 또는 우라실에 대해 적어도 영양요구성, 바람직하게는 히스티딘과 류신, 히스티딘과 우라실, 또는 류신과 우라실에 대해 영양요구성, 더욱 바람직하게는 히스티딘, 류신 및 우라실에 대해 영양요구성인 대응하는 세포와 비교하여 적어도 대등하고, 바람직하게는 증가된다.
용어 "테르펜"은 최대의 광의적 의미로 이소프렌으로부터 구조적으로 유래되는 임의의 분자로 이해될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 테르펜은 적어도 2개의 이소프렌 단위를 포함하는 테르펜이고, 더욱 바람직하게는 테르펜이 적어도 3개의 이소프렌 단위를 포함하며, 더욱 더 바람직하게는 테르펜이 적어도 4개의 이소프렌 단위를 포함하고, 더욱 더 바람직하게는 테르펜이 적어도 5개의 이소프렌 단위를 포함하며, 더욱 더 바람직하게는 테르펜이 6개의 이소프렌 단위를 포함하고, 특히, 테르펜이 트리테르펜이다.
바람직하게는, 상기 테르펜이 메발로네이트 경로로부터 유래되는 테르펜이다. 이들 테르펜은 스쿠알렌, 카로텐 (예, α-카로텐, β-카로텐, γ-카로텐, δ-카로텐, ε-카로텐, ζ-카로텐), 카로테노이드, 레티노에이트, 레티노산 복합체, 레티닐 에스테르, 레티날(모두-트랜스 레티날, 11-시스-레티날), 레티놀 (비타민 A, 모두-트랜스 레티놀, 11-시스-레티놀), 파르네센, 파르네솔, 게라넨, 게라놀, 이소펜텐, 퀴놀롤 (예, 필로퀴놀롤, 플라스토퀴놀롤, 유비퀴놀롤, 메나퀴놀롤), 피텐, 페테놀, 게나릴게라넨, 게라닐게라네놀, 크산토필 (예, 비올라크산틴, 제아크산틴), 이소펜톨, 리모넨, 리모놀, 피넨, 피놀, 유충 호르몬 III, 운데카프렌, 운데카프레놀, 운데카프레닐, 슈가, 카우렌, 카우레놀, 피토알렉신, 카프시디올, 구아이아아줄렌, 지베릴린, 고무(rubber), 토코프메롤, 클로로필, 퀴논 (예, 필로퀴논, 플라스토퀴논, 유비퀴논, 메나퀴논), 돌리콜, 돌레킬 슈가, 프리피토엔, 피토엔, 피토에놀, 피토플루엔, 피토플루에놀, 뉴로스포렌, 라이코펜, 라이코페놀, 라이코프렌, 및 라이코프레놀, 카페스톨, 카베올(kahweol), 켐브렌(cembrene), 캄브레놀(cambrenol), 탁사디엔(taxadiene), 파클리탁셀, 탁솔, 세스테르테르펜, 시클로아르테놀, 천연 고무, 또는 구타-페르카(gutta-percha)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
상기 테르펜은 헤테로원자(들), 바람직하게는 산소 및/또는 질소를 하나 이상 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 하이드록실기(들)를 하나 이상 포함하는 테르펜이 또한 예를 들면, 포스페이트, 파이로포스페이트, 하나 이상의 지방산(들), 하나 이상의 아미노산(들), 하나 이상의 폴리펩티드(들) 및/또는 하나 이상의 짧은 펩티드(들)와 에스테르화될 수 있다. 또한, 하나 이상의 아미노기(들)를 포함하는 테르펜은 예를 들면, 포스페이트, 파이로포스페이트, 하나 이상의 지방산(들), 하나 이상의 아미노산(들), 하나 이상의 폴리펩티드(들) 및/또는 하나 이상의 짧은 펩티드(들)와 아미드화될 수 있다. 또한, 하나 이상의 카르복실기(들)를 포함하는 테르펜은 예를 들면, 하나 이상의 아미노산(들), 하나 이상의 폴리펩티드(들) 및/또는 하나 이상의 짧은 펩티드(들)와 아미드화될 수 있고/있으며 예를 들면, 하나 이상의 코엔자임(들) (예, 코엔자임 A(CoA)), 하나 이상의 슈가(들), 하나 이상의 아미노산(들), 하나 이상의 폴리펩티드(들) 및/또는 하나 이상의 짧은 펩티드(들)와 에스테르화될 수 있다. 바람직하게는, 상기 테르펜이 비공액되어있거나, 포스페이트, 파이로포스페이트 및/또는 CoA와 에스테르화되어 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 테르펜이 비공액되어 있다. 가장 바람직하게는, 상기 테르펜이 실시예에서 예시적으로 나타낸 바와 같은 스쿠알렌이다.
용어 "테르펜 생산성"은 본 발명의 효모 세포에 의한 테르펜의 생산성으로 이해될 수 있다. 바람직하게는, 테르펜 생산성이 메발로네이트 경로의 테르펜의 생산성, 더욱 바람직하게는 스쿠알렌 생산성을 언급한다.
본 발명을 통하여 사용되는 바와 같은 용어 "생산성"은 최대의 광의적 의미로 본 발명 세포의 특정 분자 생산 능력으로 이해될 수 있다. 상기 생산성은 세포가 특정 시간 간격으로 생산하는 상기 분자의 양으로 정량화될 수 있다. 그러므로, 생산성은 시간에 따른 특정 분자의 생산으로 이해될 수 있다. 바람직하게는, 세포의 배치 생산성은 배양액(culture broth) 용적 당 특정 분자의 질량으로, 세포당 상기 분자의 질량으로 또는 세포 건조 질량당 중량 당 퍼센트(%(w/w))로 정량화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 균주 대 대응하는 야생형 균주와 같이, 2종의 균주의 생산성을 서로 비교할 경우, 상대적 생산성은 중량 당 퍼센트로 테르펜의 생산의 증가 또는 감소로 정량화될 수 있다.
본 발명의 문맥에서 사용되는 바와 같은 용어 "야생형 세포"는 유전자 변형되지 않은 동일한 종의 효모 세포를 언급한다. 상기 야생형 세포가 바람직하게는 본 발명의 효모 세포가 유래되는 것과 동일한 균주의 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 야생형 세포가 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 기능성 유전자를 포함하지 않으며/않거나 상기 야생형 세포가 기능성 ARE1 유전자 및/또는 기능성 ARE2 유전자를 포함한다. 상기 야생형 세포는 천연 세포일 수 있으며/있거나 예를 들어, American Type Culture Collection(ATCC)과 같은 세포 은행으로부터 입수가능한 것일 수 있다.
용어 "대응하는 야생형 세포"는 본 발명의 세포와 동일한 유전적 기원으로부터 기원하는 야생형 세포를 언급하지만, 이 세포에서는 하나 이상의 유전자 돌연변이가 일어나지 않는다. 상기 대응하는 야생형 세포는 본 발명의 효모 세포와 동일한 종의 것이며 동일한 균주로부터 기원한다. 또한, 상기 대응하는 야생형 세포가 바람직하게는, ARE1 및/또는 ARE2 유전자, 특히 ARE1 및 ARE2 유전자에서 결실 또는 결핍이 없는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 야생형 세포가 효모 세포, 더욱 바람직하게는 사카로미세스 세포, 더욱 더 바람직하게는 사카로미세스 세레비지애 세포, 더욱 더 바람직하게는 상업적으로 입수가능한 균주의 사카로미세스 세레비지애 세포, 더욱 더 바람직하게는 균주 AH22 또는 S288c의 사카로미세스 세레비지애 세포이다. 가장 바람직하게는, 상기 야생형 세포가 균주 AH22의 사카로미세스 세레비지애 세포이다.
용어 "대등한(equivalent)"이란 +/-20%의 오차 범위내에서, 더욱 바람직하게는 +/-10%의 오차 범위내에서, 더욱 더 바람직하게는 +/-10%의 오차 범위내에서 상기 정의된 바와 같은 대응하는 야생형 세포 및/또는 대응하는 영양요구성 세포와 동일한 테르펜 생산성을 언급한다.
바람직한 실시형태로, 상기 세포는 감소된 양의 스테릴 아실 에스테르를 생산하며, 바람직하게는, 상기 세포가 스테릴 아실 에스테르의 생산에 대해 결핍되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "감소된 양"은 더 적은 양의 스테릴 에스테르를 생산함을 언급한다. 감소된 양의 생산은 대응하는 야생형 세포에 의해 생산되는 양의 100% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 8% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 심지어 1% 미만의 스테릴 아실 에스테르 생산성을 언급할 수 있다. 일례로, 상기 대응하는 야생형 세포는 AH22 균주의 효모 세포 또는 S288c 균주의 효모 세포, 특히 AH22 균주의 세포일 수 있다.
용어 "스테릴 아실 에스테르의 생산에 대해 결핍인"이란 스테릴 에스테르의 형성이 넓은 범위로 부재하는 것으로 이해될 수 있다. 생물학적 시스템에서는 기본적인 수준의 비특이적 활성이 항상 존재하는 것으로 이해될 수 있다. 그러므로, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "넓은 범위의 부재"는 대응하는 야생형 세포에서 발견되는 농도의 5% 미만, 바람직하게는 1% 미만, 더욱 바람직하게는 0.5% 미만의 농도를 언급할 수 있다.
본 발명의 두번째 양태는 본 발명의 세포를 생성시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은
a) 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자를 효모 세포중에 삽입시키는 단계;
b) 상기 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 선택하는 단계;
c) 상기 세포의 스테릴 아실전이효소(들)를 암호화하는 유전자(들)를 하나 이상 결실시키거나 돌연변이시키는 단계;
d) 상기 세포를
(i) 히스티딘, 류신 및/또는 우라실의 생산에 대한 효소(들) 하나 이상을 암호화하는 유전자 카세트(들)를 삽입 및/또는
(ii) 히스티딘, 류신 및/또는 우라실의 생산에 대한 효소를 암호화하는 결함이 있는 유전자(들) 하나 이상의 복귀 돌연변이유발(revertant mutagenesis)에 의해,
특히,히스티딘 생산에 관한 효소를 암호화하는 결함이 있는 유전자를 복귀 돌연변이유발시키고 류신과 우라실의 생산에 대한 효소를 암호화하는 유전자 카세트를 삽입시킴으로써, 히스티딘, 류신 및/또는 우라실, 바람직하게는 히스티딘과 류신, 히스티딘과 우라실, 또는 류신과 우라실, 더욱 더 바람직하게는 히스티딘, 류신 및 우라실에 대해 적어도 자가영양성인 세포로 전환시키는 단계;
e) 히스티딘, 류신 및/또는 우라실에 대해 자가영양성인 세포, 바람직하게는 히스티딘과 류신, 히스티딘과 우라실, 또는 류신과 우라실에 대해 적어도 자가영양성인 세포, 특히 히스티딘, 류신 및 우라실에 대해 자가영양성인 세포를 선택하는 단계; 및 임의로,
f) 상기 단계 e)의 세포를 배양시키는 단계; 및 임의로,
g) 상기 단계 e) 또는 f)의 세포를 분리하고 안정화시키는 단계를 포함한다.
상기 효모 세포와 이의 기능적 특징은 상기에 상세하게 기재되어 있다. 상기 정의된 특징은 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포에도 또한 적용되는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "세포 생성(generating a cell)"은 최대의 광의적 의미로 본 발명의 세포의 제공으로 이해될 수 있다. 부모세포는 임의의 효모 세포일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게는, 상기 세포가 야생형 균주의 세포이다. 일례로, 상기 상세하게 기재된 바와 같이, 상기 야생형 균주는 AH22 균주 또는 S288c 균주, 바람직하게는 AH22 균주일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 세포가 실시예에서 예시적으로 나타낸 바와 같이 생성된다.
상기 용어 "유전자 삽입"은 효모 세포중으로 유전자를 내포시키는 임의의 수단을 언급한다. 상기 유전자는 예를 들어, DNA (이중사 DNA(dsDNA), 단일사 DNA(ssDNA)), RNA (단일사 RNA(ssRNA), 이중사 RNA(dsRNA)), 또는 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노(morpholino), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA) 또는 메틸화된 DNA와 같은 DNA 유사체, 또는 이들의 하이브리드와 같은 유전자 정보의 임의의 담체상에 암호화될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자가 DNA 상에, 더욱 바람직하게는 이중사 DNA, 특히 환형 이중사 DNA 스트랜드, 특히 플라스미드 상에 암호화된다. 상기 플라스미드는 당해 분야에 알려져 있는 임의의 플라스미드일 수 있다. 일례로, 상기 플라스미드는 YEpH2 또는 pUC19 플라스미드일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 유전자(들) 하나 이상이 실시예에 예시적으로 나타낸 바와 같이 삽입될 수 있다.
상기 유전자 정보가 벡터로서 세포중으로 삽입될 수 있다. 상기 상세하게 기재한 바와 같이, 상기 벡터는 예를 들어, 선형 벡터, 환형 벡터, 바이러스성 벡터 또는 세균성 벡터와 같이 당해 분야에 알려져 있는 임의의 벡터일 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터가 선형 DNA 또는 환형 DNA, 더욱 바람직하게는 환형 DNA, 특히 플라스미드를 포함한다. 상기 벡터는 당해 분야에 알려져 있는 방법에 의해 세포중으로 삽입될 수 있으며, 형질감염제(들) (예, 폴리에틸렌 이민(PEI), 퓨젠(fugene), LT-1, JetPEI, 트랜스펙타민, 리포펙타민, UptiFectin, PromoFectin, GenePORTER, Hilymax, 탄소 나노섬유, 탄소 나노튜브 세포-침투 펩티드(CPPs), 단백질 형질도입 도메인(PTDs), 리포좀, DEAE-덱스트란, 덴드리머), 전기자극법(electrophoration), 또는 유전자총, 광학적 형질감염법, 유전자 전기전달법, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection) 및/또는 자석-보조형 형질감염법과 함께 또는 이들 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터가 환형 DNA 벡터이고, 더욱 바람직하게는, 상기 벡터가 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 예를 들어, YEpH2 또는 pUC19 플라스미드와 같이 당해 분야에 알려져 있는 임의의 플라스미드일 수 있다. 그러나, 이와 다른 모든 벡터가 또한 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
상기 삽입된 유전자는 상기 세포에서 활성적이거나 수동적일 수 있다. 바람직하게는, 상기 삽입된 유전자가 세포에서 활성적으로 전사되어 발현된다. 상기 유전자는 활성적으로 전사되어 핵외 플라스미드로서, 핵내 플라스미드로서, 핵외 선형 벡터로서, 핵내 선형 벡터로서 발현될 수 있거나, 효모 세포의 게놈중으로 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "게놈"이란 효모 세포중의 유전자 정보의 실체(entity)를 언급한다. 바람직하게는, 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자가 상기 효모 세포의 게놈 중으로 삽입된다. 임의로, 상기 HMG-CoA 환원효소는 예를 들어, ura3 유전자와 같은 우라실 자가영양성에 대한 유전자와 같은, 다른 유전자로 대체될 수 있다. 상기 생성된 세포는 이후 우라실에 대해 영양요구성이 된다.
바람직하게는, 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자가 효모 세포에서 발현되어, 가용성 HMG-CoA 환원효소가 상기 세포에 의해 생산된다.
본 발명을 통하여 사용되는 바와 같은 용어 "세포의 선택"은 세포 집단의 목적하는 분획을 농후화(enrichment)하는 것을 언급한다. 가장 바람직하게는, 세포를 실시예에서 예시적으로 나타낸 바와 같이 선택한다.
상기 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포의 문맥에서, 상기 유전자를 포함하는 세포를 집단에서 농후화한다. 세포의 선택은 현탁 배양법으로 또는 예를 들어, 아가 플레이트와 같은 고체 물질로 된 배양 플레이트상에서 수행할 수 있다. 세포를 희석하고 이들을 도말(streaking)하여 단일 세포만으로부터 기원하는 콜로니를 생성시킴으로써 세포를 선택할 수 있다. 바람직하게는, 이어서 이들 콜로니를 상기 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자의 존재에 대해 시험한다. 대안적으로, 상기 세포를 또한 테르펜의 생산성을 측정함으로써 기능적으로 시험할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 세포를 또한 세포를 선택압(selection pressure)을 가하여 선택할 수 있다. 상기 선택압은 목적하는 세포 집단만이 내성인 항생제일 수 있거나 목적하는 집단에 의해 선호되는 생육 조건일 수 있다. 상기 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포의 선택이라는 문맥에서, 상기 세포는 상기 유전자를 포함하는 세포에 의해 선호되는 배지에서 또는 배지상에서 생육할 수 있다. 일례로, 상기 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자가 효모 세포의 게놈중에 내포되어 우라실 자가영양성으로 대체되는 경우, 상기 세포 배양 배지는 우라실-영양요구성 효모의 선택을 촉진하는 5-FOA (5-플루오로오로트산)(Boeke et al., 1987)를 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 결실"은 유전자 또는 상기 유전자의 부분(들) 중 하나 이상의 제거로 이해될 수 있다. 이후, 상기 유전자는 전사되지 않으며 유전자 생성물, 따라서 대응하는 폴리펩티드가 생산되지 않는다. 반드시 유전제 전체가 게놈으로부터 제거되어야만하는 것은 아닌 것으로 이해될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자의 50% 이상, 더욱 바람직하게는 유전자의 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 유전자의 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 유전자의 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 유전자의 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 유전자의 95% 이상, 가장 바람직하게는 유전자의 100%가 결실된다. 상기 결실은 말단 결실 또는 절간(intercalary) 결실일 수 있다. 이는 실험자에 의해 또는 자연적으로 일으킬 수 있다. 당해 분야에 알려져 있는 임의의 수단으로 유전자를 결실시킬 수 있다. 예를 들면, 교차법(crossing over)으로 또는 cre-재조합효소 공법을 사용하여 상기 유전자를 결실시킬 수 있다 (Guldener et al, 1996). 가장 바람직하게는, 하나 이상의 유전자(들)를 실시예에 예시적으로 나타낸 바와 같이 결실시킬 수 있다.
본 명세서를 통하여 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 돌연변이"는 최대의 광의적 의미로 상기 유전자의 핵산 서열의 변화로 이해될 수 있다. 생성된 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 교환(점 돌연변이)일 수 있거나 프레임이동 돌연변이일 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자가 유전자 생성물, 즉, 폴리펩티드, 또는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 활성이 감소된 폴리펩티드를 생성하지 않는 방식으로 돌연변이된다. 돌연변이는 당해 분야에 알려져 있는 방법으로 (예, 방사선조사 또는 화학약품에 의해), 또는 부위-지시된 돌연변이유발 (예, PCR에 의해)에 의해 일으킬 수 있다. 돌연변이는 또한 자연에서 생성하는 돌연변이 비율에 기인하여 자발적으로 일어날 수 있다. 돌연변이는 프레임이동 또는 점 (단일 뉴클레오티드) 돌연변이를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 상기 돌연변이는 실험자에 의해 또는 자연적으로 일어나는, 비특이적 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 가장 바람직하게는, 하나 이상의 유전자(들)가 실시예에 예시적으로 나타낸 바와 같이 돌연변이될 수 있다.
돌연변이는 예를 들어, 방사선조사 (예, 자외선(UV) 조사, X-선 조사, 방사능/핵 조사(예, 알파-, 베타- 또는 감마-조사) 또는 우주방사선) 또는 돌연변이유발제(들) (예, 핵염기로의 알킬화제 (예, 질소머스타드 (예, 시클로포스파미드, 메클로르에타민 또는 머스틴(NH2), 우라머스틴 또는 우라실 머스타드, 멜팔란, 클로르암부실, 이포스파미드), 니트로소우레아 (예, 카르머스틴, 로머스틴, 스트렙토조신), 알킬 술포네이트 (예, 부설판), 티오테파 및 이의 유사체, 백금 유도체 (예, 시스플라틴, 카르보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트), 프로카르바진, 알트레타민, 아플라톡신과 이의 대사산물 및 유도체, 니트라이트, 아닐린과 이의 대사산물 및 유도체, 벤젠과 이의 대사산물 및 유도체, 다환(polycyclic) 방향족과 이의 대사산물 및 유도체), 니트로스아민, 비소, 석면(asbestos), 베릴륨과 이의 화합물, 에틸렌 옥사이드, 6가 크롬(VI) 화합물, 라돈, 비닐 클로라이드, 연무(smoking) 등)에 의해 일어날 수 있다. 돌연변이는 또한 자연적으로 발생한다.
바람직하게는, 상기 스테릴 아실전이효소(들)가 ARE1 및/또는 ARE2이다. 바람직하게는, 상기 ARE1 및/또는 ARE2 유전자(들)가 결실되어 있고, 더욱 바람직하게는, 상기 ARE1과 ARE2 유전자가 결실되어 있다.
상기 용어 "전환(converting)"은 최대의 광의적 의미로 세포의 유전자 특성의 변화로 이해될 수 있다. 히스티딘, 류신 및/또는 우라실의 생산에 대한 효소(들) 하나 이상을 암호화하는 유전자 카세트(들) 하나 이상을 히스티딘, 류신 및/또는 우라실의 생산에 대한 효소를 암호화하는 결함이 있는 유전자(들) 하나 이상의 복귀 돌연변이유발에 의해 상기 세포중으로 삽입시킬 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 세포를 실시예에 예시적으로 나타낸 바와 같이 전환시킨다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 카세트"는 최대의 광의적 의미로 단일 생화학적 기능에 대한 유전자(들) 하나 이상을 암호화하는 모듈형의 DNA 서열로 이해될 수 있다. 이는 상기 유전자(들) 하나 이상을 발현시킬 수 있으며 제한 부위의 세트(들)를 하나 이상 추가로 포함할 수 있는, 당해 유전자(들) 하나 이상을 포함하는 DNA의 조작가능한 단편으로 언급될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자(들) 하나 이상이 두개 이상의 제한 부위 사이에 위치한다. 임의로, 상기 유전자 카세트는 하나의 DNA 서열 (통상적으로 벡터상)로부터 게놈으로 전이되어 본 발명의 세포의 게놈의 DNA 서열을 대체할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 유전자 카세트(들)가 실시예에 예시적으로 나타낸 바와 같이 결실될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "복귀 돌연변이유발"은 전자(former)의 유전형 또는 특정의 표현형 특징(들)에 대해 대응하는 야생형 세포의 원래의 표현형을 회복하는 돌연변이를 언급한다. 따라서, 바람직하게는, 결함이 있는 유전자가 수복된다(repaired). 일례로, 히스티딘-영양요구성 세포에서 히스티딘의 생산에 대한 효소를 암호화하는 결함이 있는 유전자의 복귀 돌연변이로 히스티딘-자가영양성 세포가 될 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 복귀 돌연변이유발이 실시예에 예시적으로 나타낸 바와 같이 수행될 수 있다.
히스티딘의 생산에 대한 효소를 암호화하는 결함이 있는 유전자는 유전자 카세트를 삽입시킴으로써 또는 복귀 돌연변이유발에 의해 수복될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자가 복귀 돌연변이유발에 의해, 더욱 바람직하게는 HIS4 유전자의 복귀 돌연변이유발에 의해 수복된다.
류신의 생산에 대한 효소를 암호화하는 결함이 있는 유전자는 유전자 카세트를 삽입시킴으로써 또는 복귀 돌연변이유발에 의해 수복될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자가 온전한 형태의 상기 유전자를 포함하는 유전자 카세트를 삽입시킴으로써, 더욱 바람직하게는 LEU2 유전자를 암호화하는 유전자 카세트를 삽입시킴으로써 수복된다.
우라실의 생산에 대한 효소를 암호화하는 결함이 있는 유전자는 유전자 카세트를 삽입시킴으로써 또는 복귀 돌연변이유발에 의해 수복될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자가 온전한 형태의 상기 유전자를 포함하는 유전자 카세트를 삽입시킴으로써, 더욱 바람직하게는 URA3 유전자를 암호화하는 유전자 카세트를 삽입시킴으로써 수복된다.
히스티딘, 류신 및/또는 우라실에 대해 자가영양성인 세포의 문맥에서, 상기 자가영양성 세포를 집단에서 농후화한다. 세포의 선택은 현탁 배양법으로 또는 예를 들어, 아가 플레이트와 같은 고체 물질로 된 배양 플레이트상에서 수행할 수 있다. 세포를 희석하고 이들을 도말(streaking)하여 단일 세포만으로부터 기원하는 콜로니를 생성시킴으로써 세포를 선택할 수 있다. 이어서 이들 콜로니를 각각의 유전자의 존재에 대해 또는 이들의 표현형 특성으로 시험할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 세포에 선택압(selection pressure)을 가하여 세포를 또한 선택할 수 있다. 상기 선택압은 상기 각각의 화합물이 결여되어 있는 배지 또는 목적하는 세포 집단만이 내성인 항생제를 포함하는 배지일 수 있거나 목적하는 집단에 의해 선호되는 생육 조건일 수 있다. 바람직하게는, 상기 배지에 히스티딘, 류신 및/또는 우라실이 결여되어 있으며, 더욱 바람직하게는, 상기 배지에 히스티딘과 류신, 히스티딘과 우라실, 또는 류신과 우라실이 결여되어 있고, 특히 상기 배지에 히스티딘, 류신과 우라실이 결여되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "결여(lacks)"는 상기 화합물의 농도가 존재하지 않거나 미량으로만 존재하는 것을 의미한다.
상기 용어 "세포 배양"은 최대의 광의적 의미로 세포를 생존가능하도록 유지시키는 것으로 이해될 수 있다. 상기 세포는 효모 세포에 적합한 조건에서 배양될 수 있다. 일례로, 효모 세포는 현탁 배양법 또는 예를 들어, 아가 플레이트와 같은 플레이트상에서 배양시킬 수 있다. 상기 현탁 배지 또는 아가는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산(들), 하나 이상의 펩티드(들), 하나 이상의 지방(들), 하나 이상의 비타민(들), 미량원소, 및/또는 염, 하나 이상의 성장인자(들) 및 하나 이상의 완충제(들)와 같은, 효모 세포에 적합한 영양소를 함유할 수 있다. 상기 세포는 호기적 또는 혐기적 조건에서 배양될 수 있다. 온도는 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있는 상기 세포에 적합한 범위내일 수 있다. 일례로, 효모의 경우, 상기 온도는 전형적으로 18℃ 내지 40℃ 사이의 범위, 바람직하게는 20℃ 내지 37℃ 사이의 범위, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 30℃ 사이의 범위, 더욱 더 바람직하게는 25℃ 내지 30℃ 사이의 범위, 가장 바람직하게는 30℃일 수 있다. 상기 배지의 pH 값은 효모 세포에 대해 적합한 범위일 수 있다. 대부분의 효모 세포에 적합한 pH는 중성 또는 약염기성 pH일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 세포를 실시예에 예시적으로 나타낸 바와 같이 배양한다.
바람직하게는, 세포를 배양시켜 세포를 번식시킨다. 번식(reproduction)은 효모 세포(들)의 세포분열, 효모 세포(들)의 출아(budding), 포자의 형성, 하나 이상의 접합자(들)의 형성 및/또는 유성생식으로부터 일어날 수 있다. 더욱 바람직하게는, 효모 세포(들)의 번식은 세포분열 또는 출아이다.
상기 세포를 배양시키는 것은 실험실 규모의 배양, 즉, 수개의 배양 플레이트의 배양 또는 수 밀리리터에서 약간의 리터(few liter) 까지의 배양액의 현탁 컬쳐를 포함할 수 있다. 상기 세포의 배양은 또한 세미-기술적 규모의 배양, 즉, 수 리터 배양액의 현탁 컬쳐의 배양 및 산업적 규모의 배양, 즉, 수 리터 또는 심지어 수 제곱미터 배양액의 현탁 컬쳐의 배양을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "배양액(culture broth)"은 세포와 배지를 포함한다. 현탁 컬쳐는 임의로 교반시키거나 진탕시킬 수 있다. 상기 현탁 컬쳐는 임의로 호기, 배기 및/또는 탈기시킬 수 있다. 상기 세포는 적합한 압력에서 배양시킬 수 있으며, 상기 압력은 대기압, 초과압 또는 대기압보다 낮은 압력(underpressure)일 수 있다. 전형적으로, 상기 세포는 대기압 또는 약간의 초과압에서 배양시킬 수 있다.
테르펜 생산을 위하여, 상기 세포를 임의의 시간 동안, 바람직하게는 적어도 30분, 적어도 2시간, 적어도 10시간, 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 또는 심지어 일주일까지, 일개월까지, 또는 수개월까지 배양시킬 수 있다. 상기 세포를 수 세대 동안 배양시킬 수 있다. 상기 세포를 1세대 이상 동안, 5세대 이상 동안, 10세대 이상 동안, 15세대 이상 동안, 20세대 이상 동안, 25세대 이상 동안, 30세대 이상 동안, 35세대 이상 동안, 50세대 이상 동안, 100세대 이상 동안, 또는 심지어 더 긴 세대 동안 배양시킬 수 있다.
본 발명의 문맥에서 사용되는 바와 같이 세포의 문맥에서 용어 "분리(isolating)"는 최대의 광의적 의미로, 본 발명의 세포의 농축을 언급한다. 상기 세포를 하베스트할 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 원심분리, 여과, 교차류(crossflow) 여과, 크로마토그라피 (예, 친화성, 크기 배제, 이온-교환 크로마토그라피), 또는 고체 표면 또는 컬쳐 플레이트를 마모(abrasion) 또는 소제(swabbing)와 같은, 당해 분야에 알려져 있는 임의의 방법으로 분리시킬 수 있다. 대안적으로, 상기 세포는 시간이 경과함에 따라 하강할 수 있거나 상기 세포를 포함하는 용기에 가스가 생성함으로써 부유할 수 있다. 대안적으로, 상기 세포가 분리되진 않지만, 상기 세포와 배지를 추가로 함께 처리한다.
상기 분리된 세포는 적합한 완충제 또는 컬쳐 배지로 추가로 세척할 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포를 원심분리, 여과, 교차류 여과, 또는 크로마토그라피 (예, 친화성, 크기 배제, 이온-교환 크로마토그라피)로 세척할 수 있다. 상기 분리된 세포는 당해 분야에 알려져 있는 임의의 방법으로 분석할 수 있다. 상기 분리된 세포를 파괴시켜, 컬쳐 플레이트상에 도말하여, 현탁 컬쳐에 접종할 수 있거나 안정화시킬 수 있다. 가장 바람직하게는, 세포를 실시예에 예시적으로 나타낸 바와 같이 분리시킨다.
본 발명의 문맥에서 사용되는 바와 같은, 세포의 문맥에서 용어 "안정화"는 세포를 보존하는 임의의 방법을 언급한다. 바람직하게는, 세포를 상당히 장시간 동안 보관할 수 있으며 이후 사용시 생존가능한 세포 컬쳐를 형성할 수 있는 방법으로 안정화시킨다.
상기 세포를 동결, 동결-건조 또는 건조시켜 안정화시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포를 동결시킨다. 상기 세포를 -20℃, -80℃에서, 드라이아이스상에서 또는 액체 질소중에서 동결시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포를 효모 세포를 동결시키기에 적합한 배지중에 동결시킬 수 있다. 상기 배지는 글리세롤을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포를 글리세롤이 2%(v/v) 이상, 5%(v/v) 이상, 10%(v/v) 이상, 20%(v/v) 이상, 30%(v/v) 이상, 40%(v/v) 이상, 또는 50%(v/v) 이상 보충된 수성 완충액 또는 물에 안정화시킬 수 있다. 일례로, 효모 세포를 수중에 글리세롤 50%(v/v) 포함하는 배지중에 동결시킬 수 있다. 본 발명을 통하여 사용되는 바와 같은 약어 v/v는 용적 당 용적을 언급한다. 글리세롤 용액에 안정화시킨 세포의 배치는 글리세롤 스톡으로 표기할 수 있다. 대안적으로, 효모 세포를 건조시키거나 동결-건조시킬 수 있으며, 바람직하게는 예를 들어, 시트르산과 같은 유화제를 첨가할 수 있다. 상기 건조되거나 동결-건조된 세포는 예를 들어, 실온, 주위 온도, -4℃, -20℃, -80℃에서와 같은 임의의 온도의 건조 상태로, 드라이아이스 또는 액체 질소중에 보관할 수 있다.
상기 안정화된 세포는 적어도 1일 이상, 바람직하게는 5일 이상, 더욱 바람직하게는 1주일 이상, 더욱 더 바람직하게는 1개월 이상, 더욱 더 바람직하게는 1년 이상 안정할 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, "안정한"이란 보관 기간 후 세포를 사용하여 생존가능한 세포 컬쳐를 형성할 수 있음을 의미한다.
대안적으로, 상기 세포를 분리하지 않지만, 세포와 배지를 추가로 함께 처리한다.
바람직한 실시형태로, 본 발명의 방법에서 사용하는 세포가 효모 세포이고, 바람직하게는, 상기 세포가 사카로미세스 세포, 더욱 바람직하게는, 상기 세포가 사카로미세스 세레비지애 세포이고, 특히 상기 세포가 균주 AH22의 사카로미세스 세레비지애 세포로부터 유래한다.
본 발명의 바람직한 세포는 상기 상세하게 특징화되어 있다.
추가의 바람직한 실시형태로, 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자를 효모 세포중으로 삽입하는 단계가 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 벡터의 삽입을 포함하며, 이때 상기 가용성 HMG-CoA 환원효소의 발현은 상기 세포중에서 활성인 프로모터, 바람직하게는 구성적 프로모터, 특히 강력한 구성적 프로모터의 조절하에 있다.
추가의 바람직한 실시형태로, 스테릴 아실전이효소(들)를 암호화하는 유전자(들) 하나 이상은 ARE1 및/또는 ARE2이고, 바람직하게는 두 유전자, ARE1과 ARE2는 결함이 있거나 결실되어 있다.
본 발명의 세번째 양태는 하나 이상의 테르펜(들)의 생산, 바람직하게는 하나 이상의 트리테르펜(들)의 생산, 특히 스쿠알렌의 생산을 위하여 본 발명의 세포를 사용하는 것에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "생산"은 테르펜을 수득하기 위한 임의의 방법을 언급할 수 있다. 상기 생산은 임의의 규모의 생산을 포함할 수 있다. 상기 생산은 실험실 규모, 즉, 수 마이크로그램, 수 밀리그램, 또는 수 그램의 테르펜(들)의 생산을 포함할 수 있다. 생산은 세미-기술적 규모, 즉, 수 그램 또는 수 킬로그램의 테르펜(들)의 생산을 포함할 수 있다. 또한 생산은 산업적 규모, 즉 수 킬로그램 또는 수 톤(tons)의 테르펜(들)의 생산을 포함할 수 있다. 상기 생산은 또한 테르펜(들)의 정제 또는 보존을 위한 추가의 기술적 단계(들) 하나 이상을 포함할 수 있다.
대부분의 테르펜이 고도로 소수성이기 때문에, 테르펜(들)은 전형적으로 세포에 축적된다. 첫번째 단계로, 상기 세포를 예를 들면, 원심분리, 여과, 교차류 여과, 크로마토그라피(예, 친화성, 크기 배제, 이온-교환 크로마토그라피), 또는 고체 표면 또는 컬쳐 플레이트로부터 마모 또는 소제와 같은 임의의 방법으로 하베스트할 수 있다. 이어서, 세포 펠릿을 임의의 방법으로, 바람직하게는 원심분리, 여과 또는 교차류 여과에 의해 수득할 수 있다. 대안적으로, 상기 세포는 시간이 경과함에 따라 하강할 수 있거나 상기 세포를 포함하는 용기에 가스가 생성함으로써 부유할 수 있다. 임의로, 상기 세포를 예를 들면, 원심분리, 여과 또는 교차류 여과와 같이, 당해 분야에 알려져 있는 임의의 방법으로 세척한다. 상기 세포 펠릿은 건조시킬 수 있거나 건조시키지 않을 수 있다. 상기 세포를 당해 분야에 알려져 있는 임의의 방법으로 용해(lysis)시킬 수 있다. 상기 세포는 기계적 힘 (예, 균질화 (예, Potter 또는 Downs 균질화기에 의해), 예를 들어, French press와 같은 세포 프레스를 사용하여), 세제, 음파파쇄(sonication), 또는 용해성 파아지(lytic phages)로 용해시킬 수 있다. 임의로, 상기 테르펜(들)은 용매 추출법으로, 예를 들면, 유기 용매를 사용한 용매 추출법으로 추출할 수 있다. 임의로, 상기 유기 용매는 후속해서 증발시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 테르펜(들)을 이들의 특이적 화학적 특성에 따라, 크로마토그라피 방법 (예, 상 크로마토그라피, 이온-교환 크로마토그라피, 역상 크로마토그라피, 크기 배제 크로마토그라피, 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC), 초고압 액체 크로마토그라피(UPLC), 신속한 단백질 크로마토그라피(FPLC)), 전기영동법, 모세관 전기영동법(CE), 또는 증류법으로 분리시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 테르펜(들), 바람직하게는 트리테르펜(들), 더욱 특히 스쿠알렌 하나 이상의 생산 방법에 관한 것으로, 이 방법은
a) 본 발명의 세포를 적합한 컬쳐 배지에서 배양시키는 단계; 및
b) 단계 a)의 세포 또는 세포 컬쳐로부터 테르펜(들) 하나 이상, 바람직하게는 하나 이상의 트리테르펜(들), 더욱 특히 스쿠알렌을 분리시키는 단계를 포함한다.
당해 분야의 숙련가들은, 테르펜(들)의 효율적인 생산을 위하여, 상기 세포를 적어도 수 시간 동안, 바람직하게는 적어도 12시간 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 24시간 동안, 더욱 더 바람직하게는 적어도 48시간 또는 적어도 72시간 또는 더 긴 시간 동안 배양시켜야한다는 것을 이해할 것이다. 상기 세포는 수 세대 동안 배양시킬 수 있다. 상기 세포를 5세대 이상 동안, 10세대 이상 동안, 15세대 이상 동안, 20세대 이상 동안, 25세대 이상 동안, 30세대 이상 동안, 35세대 이상 동안, 50세대 이상 동안, 100세대 이상 동안, 또는 더 긴 세대동안 배양시킬 수 있다. 현탁 컬쳐를 교반시키거나 진탕시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "하나 이상의 테르펜(들)의 분리"는 최대의 광의적 의미로 배양액으로부터 테르펜(들)을 정제하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 테르펜(들)은 세포에 축적될 수 있거나 세포에 의해 분비될 수 있으므로, 컬쳐 배지에 존재할 수 있다.
상기 세포를 상기한 바와 같이 하베스트하고 임의로 세척한다. 이어서, 상기 세포를 당해 분야에 알려져 있으며 상기 표시한 바와 같은 임의의 방법으로 용해시킬 수 있다. 임의로, 테르펜(들)을 예를 들어, 유기 용매를 사용하여, 용매 추출법으로 추출할 수 있다. 임의로, 상기 유기 용매를 후속해서 증발시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 테르펜(들)을 이들의 특이적 화학적 특성에 따라, 크로마토그라피 방법 (예, 상 크로마토그라피, 이온-교환 크로마토그라피, 역상 크로마토그라피, 크기 배제 크로마토그라피, 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC), 초고압 액체 크로마토그라피(UPLC), 신속한 단백질 크로마토그라피(FPLC)), 전기영동법, 모세관 전기영동법(CE), 또는 증류법으로 분리시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 약제학적 또는 화장용 조성물, 윤활제 또는 변압기 오일(transformer oil)을 제조하기 위한 방법, 특히 백신 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 이 방법은
a) 본 발명에 따라서 하나 이상의 테르펜(들)을 생산하는 단계; 및
b) 상기 테르펜(들)을 상기 약제학적 또는 화장용 조성물, 상기 윤활제 또는 상기 변압기 오일, 특히 상기 백신 조성물에 혼합시키는 단계를 포함하며;
상기 하나 이상의 테르펜(들)은 임의로 하나 이상의 수소화 단계(들)에 적용시키고, 상기 하나 이상의 테르펜(들)은 바람직하게는 수소화된 트리테르펜(들), 특히 스쿠알렌이다.
상기 용어 "혼합"은 최대의 광의적 의미로 당해 조성물에 테르펜(들)을 첨가하는 것으로 이해될 수 있다.
약제학적 조성물은 본 발명의 세포에 의해 수득할 수 있는 테르펜을 포함하는 임의의 약제학적 조성물로 언급될 수 있다. 약제학적 조성물에서, 상기 테르펜은 바람직하게는 보조제로서, 피부 보습제로서, 뮤코다당 분해제(mucolytic agent)로, 호르몬으로, 방향제(fragrance)로, 윤활제로, 항미생물제로, 항염증제로, 또는 항산화제로서 사용될 수 있다.
화장용 조성물은 본 발명의 세포에 의해 수득할 수 있는 테르펜을 포함하는 임의의 화장용 조성물로 언급될 수 있다. 화장용 조성물에서, 상기 테르펜은 바람직하게는, 피부 보습제로서, 방향제로서, 또는 항산화제로서 사용될 수 있다. 상기 테르펜은 또한 식품 첨가제로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 테르펜은 페로몬 (예를 들어, 해충 방제를 위한 곤충 페로몬)으로서, 호르몬 (예, 해충 방제용 곤충 페로몬)으로서, 윤활제로서, 전기 절연제로서, 변압기 오일 또는 변압기 오일 첨가제로서, 및 화학, 제약 및 화장 산업에서 원료 화학물질로서 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법으로 수득한 테르펜이 스쿠알렌이다. 스쿠알렌은 약제학적 및 화장용 조성물에서 첨가제로서, 피부 보습제로서, 윤활제로서, 변압기 오일 또는 변압기 오일 첨가제로서, 및 화학 산업에 있어서 원료 화학물질로서 바람직하게 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 수득되는 스쿠알렌이 약제학적 및 화장용 조성물에, 특히 백신 보조제로서 사용될 수 있는 유액(emulsion)의 제조에 사용될 수 있다.
테르펜은 하나 이상의 수소화된 테르펜(들), 바람직하게는 하나 이상의 수소화된 트리테르펜(들)의 생산을 위하여 사용될 수 있다. 특히, 스쿠알렌은 스쿠알렌의 생산을 위하여 사용될 수 있다. 이 목적에 있어서, 스쿠알렌을 당해 분야에 알려져 있는 임의의 방법으로 하나 이상의 수소화 단계(들)에 적용시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "수소화 단계"는 하나 이상의 이중 또는 삼중결합, 바람직하게는 하나 이상의 이중결합, 특히 테르펜의 탄소 원자 사이의 하나 이상의 이중결합을 수소를 첨가함으로써 수소화시키는 것을 언급한다. 일례로, 테르펜은 촉매적 전환기 (예, 백금-, 팔라듐-, 로듐-, 니켈-, 이리듐- 및/또는 루테늄-기재 촉매)를 사용, 수소 또는 수소를 함유하는 기체의 혼합물로 가스생성, 예를 들어, 붕수소화나트륨과 같은 환원제와의 반응, 효소적 공법 (예, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드- (NADH-) 및/또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트- (NADPH-) 전환 효소(들)로) 또는 이들 2종 이상의 조합에 의해 수소화시킬 수 있다. 상기 NADH- 및/또는 NADPH-전환 효소(들)는 또한 본 발명의 세포의 게놈중으로 복제될 수 있다. 바람직하게는, 수소화된 테르펜에서, 테르펜 분자의 대부분의 또는 거의 모든 이중 및/또는 삼중결합이 수소화되고, 더욱 바람직하게는 테르펜 분자의 모든 이중 및/또는 삼중결합이 수소화된다. 바람직하게는, 상기 수소화된 테르펜이 수소화된 트리테르펜이고, 더욱 바람직하게는 수소화된 스쿠알렌이다. 가장 바람직하게는, 상기 수소화된 테르펜이 스쿠알렌이다. 스쿠알렌은 화장품 또는 약제학적 조성물에, 특히 화장품에 바람직하게 사용될 수 있다.
도 1은 벡터 pPTHTL에 대한 복제 전략을 나타낸다. pUC19-tHMG1으로부터 HMG1 단편을 EcoR1 및 BamHI로 절제하여 EcoR1 및 BamHI로 분해시킨 플라스미드 pT2b에 통합시킨다. LEU2 유전자를 평활 말단 단편으로 복제한다. 따라서, YEp13은 XhoI 및 SalI로 분해되었으며 점성이 있는 말단이 배열되었다. pPT2b-tHMG1을 NruI로 개방시킨다.
도 2는 벡터 YEpH2의 도식적 설명을 나타낸다. EcoRV/NruI 단편으로 pPT2b-tHMG1의 발현 카셋을 SphI로 개방되어 배열된 Yep13중에 결찰시킨다.
도 3은 통합형 벡터 YDpUHK3에 대한 복제 전략을 나타낸다. YEpH2로부터의 EcoRV/NruI 단편으로서 발현 카세트를 StuI로 분해시킨 YDpU에 결찰시킨다. pUCTK23으로부터의 HindIII 단편을 YDpUH2/12와 결찰시킨다.
도 4는 유전자 자리 URA3(빗금친 부분)으로 통합된 tHMG1 발현 카세트의 도식적 설명을 나타낸다. EcoRV(A)와 함께 선형화된 벡터 YDpUHK3을 염색체 URA3 유전자(B)중으로 통합시킨다. 상기 플라스미드는 단일 통합체(C)로서 또는 연쇄반복서열(tandem repeat)로 통합된다. 상동성 재조합을 통하여 벡터 전체가 소실되거나 (점선화살표) 상기 플라스미드의 일부가 소실된다(연속적 화살표). 상기 발현 카세트가 유지되는 경우, D에 나타낸 상황이 URA3 유전자 자리에서 구현된다.
도 5는 상기 공정의 도식적 설명을 나타내는 것으로, 이 공정은 균주 AH22tH3ura8에서 유전자 ARE1, ARE2를 결실시키기 위하여 사용되었다.
도 6은 플라스미드 pUG6 (도 6A) 및 pSH47 (도 6B)의 도식적 설명을 나타낸다.
도 7은 실험실-규모 발효기 (5 리터)에서 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 배양 결과를 나타낸다. 도 7A는 시간 경과에 따른 효모의 생육을 나타낸다. 발효 과정 중 g/L로 세포 건조 중량 (CDW) 및 광학밀도 (OD600nm/mL)가 나타나 있다. 도 7B는 66시간 및 72시간 후의 스쿠알렌 생산성을 나타낸다. 스쿠알렌 생산은 세포 건조 중량 당 퍼센트 및 발효 과정 중 g/발효액 L의 용적 생산성으로 나타낸다.
도 8은 효모 사카로미세스 세레비지애의 작제된 돌연변이체 균주로부터의 전체 지방 추출물의 박층 크로마토그라피를 나타낸다.
실시예
하기 실시예 뿐만 아니라 첨부되는 도면은 본 명세서 및 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 설명적 실시형태를 제공하기 위함이다. 이들 실시예는 본 발명의 주제의 범주에 대한 어떠한 제한을 제공하고자 함이 아니다.
실시예 1
균주 AH22tH3ura8△are1△are2의 작제
1.1 기본 균주 AH22tH3ura8 (Polakowski et al., 1998)
AH22tH3ura8은 S288c (Mortimer and Johnston, 1986)의 유도체인 균주 AH22 (Hinnen et al., 1978)를 기본으로 한다. 상기 균주 S288c 및 균주 AH22는 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 입수할 수 있다. 상기 균주 S299c는 ATCC 번호 제26108호로 ATCC로부터 입수할 수 있다. 상기 균주 AH22는 ATCC 번호 제38626호로 ATCC로부터 입수할 수 있다.
AH22는 다음과 같이 특징화된다:
유전형: MATa leu2-3 leu2-112 his4-519 can1
표현형: leu2, his4
효모 사카로미세스 세레비지애의 균주 AH22는 일반적으로 안전한 것으로 인정된 미생물 군 (biosafety level 1)에 속한다. 균주 AH22의 글리세롤 스톡을 제조하였다.
tHMG1 발현 카세트를 URA3 유전자 자리에 삽입하여 균주 AH22tH3ura8을 작제하였다 (Polakowski et al., 1998). 상기 발현 카세트는 절단된, 구성적 버젼의 ADH1 프로모터, 절단된 버젼의 HMG1 유전자 및 TRP1 종결부위를 포함한다 (작제의 상세 내용은 하기를 참조).
AH22tH3ura8 균주는 다음과 같이 특징화된다:
유전형: MATa leu2-3 leu2-112 his4-519 can1 ura3::tHMG1
표현형: ura3, leu2, his4
1.2 tHMG1 발현 카세트를 유전자 자리 URA3 에 통합 (복제 전략 및 통합)
벡터 pPTHTL에 대한 복제 전략
tHMG1 (Basson et al., 1988)에 대한 DNA 서열을 PCR을 통하여 사카로미세스 세레비지애 균주 S288c (Mortimer and Johnston, 1986)의 게놈 DNA로부터 표준 방법으로 증폭시켰다. 이 목적으로 사용된 프라이머는 DNA 올리고머 tHMG-5' 및 tHMG-3'(표 1)이다. 수득한 DNA-단편 (서열 확인 번호: 2)을 Klenow 처리 후 클로닝 벡터 pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985)의 SmaI 부위로 도입시켜, 벡터 pUC19-tHMG1을 수득하였다 (도 1 참조).
플라스미드를 분리시키고 엔도뉴클레아제 EcoR1 및 BamH1으로 pUC19-tHMG1을 제한시킨 후, 수득한 단편은 효모 발현 벡터 pPT2b (Lang and Looman, 1995)중으로 도입시키는데, 상기 벡터도 EcoR1 및 BamH1으로 처리하였다. 생성된 플라스미드 pPT2b-tHMG1은 절단된 ADH1-프로모터 (Bennetzen and Hall, 1982)와 TRP1-종결부위 (Tschumper and Carbon, 1980)를 tHMG1 암호화 영역 사이에 함유한다. LEU2 유전자를 효모 벡터 YEp13 (Parent et al., 1985)로부터 XhoI 및 SalI로 절제하고 Nru1으로 제한한 벡터 pPT2b-tHMG1 (소위 중간-길이 ADH1-프로모터, tHMG1 유전자 및 TRP1-종결부위를 함유)중으로 평활 말단 결찰시켜 벡터 pPTHTL을 생성시켰다 (도 1 참조).
벡터 YEpH2에 대한 복제 전략
선형화된 (SphI로 ) 벡터 YEp13를 벡터 pPT2b-tHMG1 (도 1)을 EcoRV와 Nru1로 잘라낸 tHMG1 발현 카세트 (더 짧은 형태의 ADH1 프로모터; EcoRV 부위의 다운스트림, Bennetzen and Hall, 1982)와 평활 말단 결찰시킴으로써 벡터 YEpH2 (도 2 참조)를 작제하였다.
통합형 벡터 YDpUHK3에 대한 복제 전략
벡터 YEpH2 (도 2 참조)로부터 EcoRV와 Nru1로 잘라낸 tHMG1 발현 카세트를 벡터 YDpU (Berben et al., 1991)에 도입시키는데, 이 벡터는 StuI로 처리하였다. 생성된 벡터 YDpUH2/12 (도 3 참조)를 엔도뉴클레아제 Sma1로 처리하고 가나마이신 내성을 암호화하는 벡터 pUCTK23 (Webster and Dickson, 1983)의 HindII 단편과 결찰시켰다. 상기 생산된 작제물 (YDpUHK3, 도 3 참조)을 효모 형질전환 전에 EcoRV로 처리하였다. 효모 균주 사카로미세스 세레비지애 AH22 (Hinnen et al., 1978)을 상기 작제물로 Gietz 등에 의해 기재된 리튬 아세테이트 방법 (Gietz, D., et al., 1992)을 통하여 형질전환시켰다. 상기 선형화된 벡터로 효모를 형질전환시킴으로써 URA3 유전자 자리에서 벡터 전체가 염색체 통합된다 (도 4 참조). 상기 발현 카세트의 일부가 아닌 통합된 벡터 (E. coli 기원, E. coli-암피실린 내성 유전자, TEF-프로모터 및 가나마이신 내성 유전자)로부터 상기 영역을 제거하기 위하여, 상기 형질전환된 효모에 우라실-영양요구성 효모를 촉진하는 5-FOA (Boeke et al., 1987)로 선택압을 적용시켰다. 5-FOA를 함유하는 플레이트 상에서 선택된 우라실-영양요구성 균주 (AH22tH3ura8)는 URA3 유전자 자리에서 염색체 통합으로서 tHMG1-발현 카세트를 나타낸다 (도 4 참조).
서열 확인 번호: 3은 균주 AH22tH3ura8 (URA3 암호화 영역을 포함함 (도 4D 참조))내 URA3 유전자 자리중으로 통합된 tHMG1 발현 카세트의 서열을 나타낸다.
1.3 균주 AH22tH3ura8에서 유전자 ARE1, ARE2의 결실
kanMX 마커 유전자 (제니티신 내성을 암호화함)가 있는 결실 카세트를 플라스미드 pUG6 (Guldener et al., 1996)(도 6 참조)로부터 표적 유전자 자리 ARE1 및 ARE2와 상동성인, 짧은 인근 서열(flanking sequences)을 도입하는 프라이머 (각각, are1crelox 전방(fw), are1crelox 역(rev) 및 are2crelox fw, are2crelox rev; 표 1)로 증폭시켰다 (도 5 참조). 상기 결실 카세트 (서열 확인 번호: 4와 서열 확인 번호: 5의 서열)를 Gietz 등에 의해 기재된 리튬 아세테이트 방법 (Gietz, D., et al., 1992)을 통하여 효모 중으로 형질전환시켰다.
표적 유전자 자리로 상기 카세트를 통합시켜, 대응하는 유전자를 소실시킨 후, 상기 마커 유전자 kanMX를 cre-재조합효소 공법 (Guldener et al., 1996)으로 회수하여 상기 마커를 각각 이후의 염색체 결실 또는 통합용으로 다시 사용할 수 있었다.
cre-재조합효소 공법은 효소 cre-재조합효소에 대한 유전자를 담지하고 있는, 플라스미드 pSH47 (도 6 참조)로 효모 균주를 형질전환시키는 것을 필요로 한다. 상기 효소는 kanMX 내성 유전자를 플랭킹시키는 2개의 loxP 부위를 재조합시킬 수 있다. 상기 재조합으로 표적 유전자 자리에 loxP 부위 하나만 남고 상기 마커 유전자가 소실된다.
플라스미드 pSH47을 소실한 콜로니는 플레이트 상에서 5-플루오로오로트산을 사용한 카운터-선택 (Guldener et al., 1996)을 통하여 확인하였으며 추가 작제 목적으로 또는 최종 균주로 뽑아 놓았다.
Figure pct00001
균주 AH22tH3ura8△are1△are2의 글리세롤 스톡 10개를 제조하였다. 상기 표 1에서 대문자는 표적 유전자 자리의 상동성 영역을 나타내며, 여기서 각각의 통합형 유전자 카세트가 통합되고/통합되어 있다. 이들 영역은 표적 유전자 자리에 상기 유전자 카세트가 염색체 통합되는데 관여할 수 있다 (상동성 재조합을 통하여; 예를 들면, 각각 ARE1 및 ARE2). 따라서, 이들 영역은 통합 카세트의 개시부 및 말단부에 위치할 수 있다.
실시예 2
상기 작제된 균주의 중성 지방 조성물과 유리(free) 스테롤을 박막 크로마토그라피(TLC)를 통하여 평가하였다. 전체 지방 추출 및 박막 크로마토그라피는 하기의 프로토콜에 따라서 수행하였다.
TLC (박막 크로마토그라피) 분석:
배양 공정: TLC 분석을 위한 효모 사카로미세스 세레비지애 균주의 배양 공정은 다음과 같다:
프리컬쳐(preculture): 100 mL 진탕 플라스크에서 WMVIII 배지 20 mL를 상기 대응하는 글리세롤 스톡 50 ㎕로 접종하여 48시간 동안 30℃에 150 rpm에서 배양시킨다.
메인컬쳐(main culture): 칸막이가 장착되어 있는 250 mL 진탕 플라스크에서 WMVIII 배지 50 mL를 1%의 상기 프리컬쳐로 접종하여 72시간 동안 30℃에 150 rpm에서 배양시킨다.
샘플 제조:
3 x 0.5 mL의 배양액(culture broth)을 에펜도르프관 (Eppendorf tubes)에 하베스트하여 (3회) 4000 rpm에서 5분간 원심분리를 통하여 펠릿화하였다. 상등액은 버린다. 상기 효모 펠릿을 TE-완충액 (pH=8.0) 200 ㎕에 다시 현탁시켰다. 200 ㎕ 유리 비드와 200 ㎕ 클로로포름/메탄올 (80:20 (용적%))을 가하였다.
상기 샘플을 5 x 1분간 볼텍싱시켰다 (중간에 빙상에서 냉각시킴). 바늘로 에펜도르프관의 바닥에 구멍을 뚫었다. 상기 반응 관을 다른 1.5 mL 에펜도르프관에 넣고 원심분리시켰다 (1000 g, 2분간). 유리 비드가 있는 상부의 에펜도르프관은 버렸다. 하부의 에펜도르프 관을 밀폐시켜 원심분리시켰다 (13,000 g, 15분). 원심분리 중, 펠릿의 상부와 하부에 상이 형성된다. 하부의 유기물을 1.5 mL 에펜도르프관으로 옮기고 박막 크로마토그라피를 통하여 분석하였다.
TLC (박막 크로마토그라피):
정지상: 실리카겔 60 F254, 10x20 cm, 실리카층의 두께 0.2 mm.
이동상: 석유에테르:디에틸에테르:아세트산 (90:10:1 (용적%))
샘플량: 10 ㎕
수행시간: 플레이트의 상부 아래로 1 cm가 될 때까지.
검출: 요오드 증기로 착색 (스쿠알렌, 트리아실글리세롤, 스테롤 및 스테릴-에스테르의 검출).
결과:
도 8은 야생형 균주 AH22ura3, 규제가 제거된 HMG-CoA 환원효소 AH22tH3ura8을 갖는 균주와 이중 결실 균주 AH22tH3ura8△are1△are2의 전체/중성 지방 조성을 나타낸다. 도 8은 야생형 균주 (AH22ura3, 레인 1과 2)는 레인 3 내지 6에서의 균주들(이들은 규제가 제거된 HMG-CoA 환원효소를 발현시키며 많은 양의 스쿠알렌을 생산한다)과 비교하여 매우 적은 양의 스쿠알렌을 생산하였음을 나타낸다. 스테릴 에스테르의 형성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자 (ARE1, ARE2)의 결실시키면 대응하는 균주에서 이들 성분이 완전히 결여되었다 (레인 5 내지 6에서 상부의 흑색 박스에 의해 표시되는 바와 같음). 스테릴 에스테르의 형성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자 (ARE1, ARE2)를 결실로 유리 스테롤이 축적되지는 않았다 (레인 3과 4를 레인 5와 6과 비교; 하부의 흑색 박스에 의해 표시되는 바와 같음). 이는 스테롤 에스테르로 스테롤을 저장하는 능력이 결여되어 있는 균주에서 유리 스테롤의 함량이 증가할 것으로 기대하였기에 놀라웠다.
지방 성분은 표준물질 스쿠알렌, 콜레스테릴-올레에이트, 트리올레에이트, 올레에이트 및 에르고스테롤을 통하여 확인하였다 (나타나 있지 않음)
실시예 3
균주 AH22tH3ura8△are1△are2의 작제 - 자가영양성 (최종 균주 1) 및 세포 은행 제조 및 보관
3.1 균주 작제 세부사항, 프라이머 및 서열화
균주 AH22tH3ura8△are1△are2H (중간 균주 1)의 작제:
균주 AH22tH3ura8△are1△are2의 HIS4 자가영양성 클론 (복귀돌연변이체)을 접종용 루프를 사용하여 AH22tH3ura8△are1△are2의 액체 컬쳐를 도말시킨 후 히스티딘이 결여되어 있는 플레이트 상에서 선택하였다 (하기 참조).
균주 AH22tH3ura8△are1△are2HL (중간 균주 2)의 작제:
유전자 LEU2의 암호화 영역을 프라이머 1 및 프라이머 2 (프라이머 서열의 경우 표 2를 참조)로 균주 S288c의 게놈성 DNA로부터 증폭시켰다. 생성된 유전자 카세트를 균주 AH22tH3ura8△are1△are2H로 형질전환시켰다. 상동성 재조합을 통하여 표적 유전자 자리 LEU2 (YCL018W)중으로 정확하게 통합되었는지 프라이머 3 및 프라이머 2를 사용한 PCR 분석을 통하여 체크하였다 (LEU2 유전자 자리의 5'UTR 영역 및 LEU2 암호화 영역에서 어닐링; 프라이머 서열의 경우 표 2를 참조).
균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL (최종 균주 1)의 작제:
유전자 URA3의 완전한 천연 발현 카세트 (천연 프로모터와 종결부위를 포함함)를 표적 통합 유전자 자리와 상동성인, 5'- 및 3'-돌출부 서열 (길이 40 bp)을 도입시키는 프라이머 4와 프라이머 5로 균주 S288c의 게놈성 DNA로부터 증폭시켰다. 유전자 URA3의 천연 유전자 자리를 표적 유전자 자리로 사용하지 않았는데, 이는 tHMG 발현 카세트가 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HL에서 상기 유전자 자리에 통합되어 있기 때문이다. 대안적 염색체 발현 유전자 자리로서 HO 유전자 자리를 선택하였다. 상기 천연 URA3 발현 카세트 (천연 프로모터와 종결부위를 포함함)를 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HL중으로 형질전환시켰다. 상동성 재조합을 통하여 표적 유전자 자리 HO (YDL227C)중으로 정확하게 통합되었는지 프라이머 6 및 프라이머 7을 사용한 PCR 분석을 통하여 체크하였다 (HO 유전자 자리의 5'UTR 영역 및 3' UTR 영역에서 어닐링; 프라이머 서열의 경우 표 2를 참조).
서열화:
돌연변이 his4-519의 복귀 (프레임이동 돌연변이, 야생형 5'-CCC-3' 글리신 코돈 (Gabor and Culbertson, 1982) 대신 5'-GGGG-3' mRNA 서열이 되도록 하는 염기 삽입을 포함한다)는 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 게놈성 DNA로부터 대응하는 HIS3 암호화 서열을 프라이머 8과 프라이머 9 (HIS4 암호화 영역의 중간 및 HIS4 유전자 자리의 3' UTR 영역에서 어닐링; 프라이머 서열의 경우 표 2를 참조)로 증폭시킴으로써 생성되는, PCR 증폭 생산물의 서열화를 통하여 증명되었다.
결과: 서열은 정확하다 (http://www.yeastgenome.org에 기탁되어 있는, S288c의 서열에 대응한다). 돌연변이 his4-519의 복귀가 일어났다. his4-519 돌연변이의 경우, 히스티딘 영양요구성 표현형의 복귀가 또한 글리신 tRNA에서의 유전자외 억제자 돌연변이를 통하여 일어날 수 있다 (Gaber and Culbertson, 1982).
균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL중의 LEU2 유전자 자리(YCL018W)에서 LEU2 암호화 영역의 정확한 서열은 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 게놈성 DNA로부터 LEU2 유전자 자리의 유전자 자리의 5' UTR의 일부를 포함하는 LEU2 암호화 서열을 프라이머 3과 프라이머 2 (프라이머 서열의 경우 표 2를 참조)로 증폭시킴으로써 생성되는, PCR 증폭 생산물의 서열화를 통하여 증명되었다.
결과:
서열은 정확하다 (http://www.yeastgenome.org에 기탁되어 있는, S288c의 서열에 대응한다).
균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL중의 HO 유전자 자리(YDL227C)로 통합된 유전자 URA3의 천연 발현 카세트 (천연 프로모터와 종결부위를 포함함)의 정확한 서열은 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 게놈성 DNA로부터 유전자 URA3의 발현 카세트를 프라이머 6 및 프라이머 7로 증폭시킴으로써 생성되는, PCR 증폭 생산물의 서열화를 통하여 증명되었다 (HO 유전자 자리의 5'UTR 영역 및 3' UTR 영역에서 어닐링; 프라이머 서열의 경우 표 2를 참조),
결과:
서열은 정확하다 (http://www.yeastgenome.org에 기탁되어 있는, S288c의 서열에 대응한다).
Figure pct00002
3.2 중간 균주 1 AH22tH3ura8△are1△are2H의 글리세롤 스톡의 제조
WMVIII 배지를 Lang과 Looman이 나타낸 바와 같이 제조하였다 (Lang and Loomann, 1995).
균주 AH22tH3ura8△are1△are2를 칸막이가 없는 100 mL 진탕 플라스크에서 우라실(100 mg/L)과 류신 (400 mg/L)이 보충되어 있는 WMVIII 배지 20 mL에 글리세롤 스톡 50 ㎕로 접종시켜, 72시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (접종물 0).
72시간 동안 30℃에서 배양시킨, 접종물 O을 우라실(100 mg/L)과 류신(400 mg/L)이 보충되어 있는 WMVIII 아가 플레이트 (히스티딘은 없음) (플레이트 1)상에 접종 루프를 사용하여 도말하였다. 콜로니수 (복귀돌연변이체의 수)가 측정되지 않았다.
접종물 1은 칸막이가 없는 100 mL 진탕 플라스크에서 우라실(100 mg/L)과 류신(400 mg/L)이 보충되어 있는 WMVIII 배지 20 mL에 플레이트 1로부터 집어낸 콜로니로 접종시켜 72시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (접종물 1).
접종물 2는 칸막이가 없는 100 mL 진탕 플라스크에서 우라실(100 mg/L)과 류신(400 mg/L)이 보충되어 있는 WMVIII 배지 35 mL에 350 ㎕의 접종물 1로 접종시켜 48시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (접종물 2).
접종물 2를 사용하여 중간 균주 1 (AH22tH3ura8△are1△are2H)의 글리세롤 스톡을 제조하였다. 상기 글리세롤 스톡은 0.5 mL의 접종물 2와 0.5 mL의 글리세롤 용액 (수중 글리세롤 50% (v/v))을 혼합하여 제조하였다. 중간 균주 1 (AH22tH3ura8△are1△are2H)의 글리세롤 스톡 10개를 드라이 아이스 상으로 옮길 수 있다.
접종물 2의 시험:
a) 접종물 2 의 광학밀도:
OD600/mL: 39.44
b) 접종물 2 세포의 생존성 (글리세롤 스톡의 제조 전):
접종물 2 세포의 생존성(%로)은 콜로니 형성 유니트를 세포수로 나누어 계산하였다 (x100). 세포수는 Thoma 계수 챔버에서의 계수를 통하여 측정하였다. 우라실(100 mg/L)과 류신(400 mg/L)이 보충되어 있는 WMVIII 아가 플레이트 상에 접종물 2의 적절한 희석물을 도말하여 측정하였다.
c) Thoma 계수 챔버: 접종물 2의 1:10 희석물
1. 계수: 34; 31; 38; 32; 39
2. 계수: 31; 37; 31; 33; 31
33.7 세포 x 1.25 x 106 x 10 = 4.2 x 108 세포/mL 접종물 2
d) 플레이트상의 콜로니:
접종물 2의 10-5 희석물 50 ㎕를 WMVIII 플레이트상에 플레이팅시켰다.
계수 결과: 207개의 콜로니 x 105 x 20 = 4.14 x 108 세포/mL 접종물 2
생존성: 4.1 x 108 x 100/4.2 x 108 → 98.6%
접종물 2의 생존성: 98.6%
e) 순도 및 표현형:
50 ㎕의 접종물 2(나타낸 바와 같이 물로 10-5로 희석하거나 희석하지 않은 것)를 표시된 플레이트상에 도말하여 48시간 동안 표시된 온도에서 배양시켜 순도와 표현형 (영양요구성)을 측정하였다.
균주 (접종물 2) 플레이트 배양 온도 관찰
AH22tH3Ura8△are1△are2H


 YE 30℃ 단일 효모 콜로니(플레이트상에 도말하기 전에 접종물 2를 10-5 희석시켰다)
WMVIII
+Ura+Leu		 30℃ 단일 효모 콜로니(플레이트상에 도말하기 전에 접종물 2를 10-5 희석시켰다)
LB 37℃ 생육 없음(희석시키지 않음)
WMVIII(아미노산없음) 30℃ 생육 없음(희석시키지 않음)
WMVIII
+Ura+His		 30℃ 생육 없음(희석시키지 않음)
WNVUUU
+Leu+His		 30℃ 생육 없음(희석시키지 않음)
접종물 2를 또한 현미경하에서 세균성 오염에 대해 체크하였다 → 세균성 오염이 검출되지 않았다.
3.3 중간 균주 2의 작제 및 중간 균주 2 AH22tH3ura8△are1△are2HL의 글리세롤 스톡의 제조
작제(기술적 공법):
형질전환 및 유전자 자리 LEU2로의 LEU2 발현 카세트의 정확한 통합에 대한 PCR 증명은 당해 분야에 잘 알려져 있으며 하기 설명되는 바와 같은 방법으로 수행한다.
효모 형질전환의 결과:
형질전환을 Gietz 등에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다 (Gietz, D., et al., 1992). 형질전환 효율 (통합형 형질전환)은 DNA ㎍ 당 102 내지 103개의 형질전환체 사이에서 변화되었다.
대조용 플레이트 상에서 배양시킨 샘플 1 (AH22tH3ura8△are1△are2H, DNA는 없음)은 콜로니 성장이 없었다. AH22tH3ura8△are1△are2H+LEU2 카세트가 삽입되어 있는 샘플 2를 배양시키면 상이한 콜로니를 검출할 수 있다.
15개의 콜로니를 새로운 WMVIII 플레이트상에 집어내어 72시간 동안 30℃에서 배양시켰다. 5개의 콜로니를 PCR로 체크하였다. 글리세롤 스톡의 제조를 위하여 가장 큰 콜로니를 선택하였다. 5개의 콜로니를 실험적으로 평가하였더니 5개의 콜로니가 모두 사용할 수 있었다. 5개의 샘플 모두 분석된 DNA가 LEU2 유전자를 함유하는 것으로 나타났다.
PCR:
주형은 새로운 아가 플레이트상에서 상기 2번을 접종시킴으로써, 효모 형질전환의 콜로니로부터 수득하였다. PuRe Taq Ready To Go-Beads (GE Healthcare; Lot:384777)을 Taq-폴리머라제로서 25 ㎕의 용적으로 사용한다.
이는 비드를 멸균 HPLC-H2O 23 ㎕에 용해시키며 각각의 프라이머 fw./rev. 1 ㎕가 첨가된다 (표 참조). 사용되는 PCR-기계는 Flex Cycle Analytik, Jena로부터 입수하였다.
PCR-프로그램:
단계 1: 94℃ 3분
단계 2: 94℃ 30초
단계 3: 53℃ 30초
단계 4: 72℃ 2분 내지 단계 2 40 사이클
단계 5: 72℃ 3분
단계 6: 4℃
AH22tH3ura8△are1△are2HL의 콜로니 1, 2, 3, 4 및 5와 각각 1 ㎕ 프라이머(10 pmol/㎕ 희석)의 프라이머 5'LEU2 fw 및 LEU2 rev를 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭 생성물은 대략 길이가 1185 bp이다.
1% 아가로스 겔 상에서 Gel 전기영동:
100 mL의 진탕 플라스크중의 Biozym으로부터의 Seakem LE Agarose 0.5 g + 1 x TAE-완충액 50 mL, 1 kb ladder (NEB) 6 ㎕ (500 ng/레인)를 하나의 레인에 부하하였다. 추가로 각각의 증폭물 샘플 10 ㎕를 6x 부하 완충액 2 ㎕와 혼합하고 혼합물을 상기 아가로스 겔 상에 부하하였다. 겔은 120V에서 45분간 1 x TAE-완충액 중에서 가동시켰다. 이어서, 상기 겔을 에티듐 브로마이드 (EtBr) 욕중에서 20 분간 배양시켰다 (EtBr 농축 스톡: 10 mg/mL; 욕: 30 ㎕/300 mL 1xTAE-완충액). 최종적으로, 상기 겔을 사진문서조사 (Alpha innotech: OrgBal 48; 광학 세팅: exp. 0.12 s, bin 1x1, b: 0, w: 66, g:0.95)로 분석하였다.
결과:
샘플이 부하된 5개의 레인 모두 균주가 AH22tH3ura8△are1△are2HL 균주인 것으로 나타났다. 5개의 콜로니는 대략 1200 bp의 증폭된 생성물을 나타낸다. 겔 전기영동에 따르면, 5개의 분석된 콜로니에 대한 결과는 정확한 삽입물을 함유하는 것으로 나타났다. 따라서, LEU2 유전자의 증폭은 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HL의 5개의 콜로니 모두에서 포지티브한 결과로 나타났다.
균주 AH22tH3ura8△are1△are2HL의 글리세롤 스톡의 제조
균주 AH22tH3ura8△are1△are2HL을 칸막이가 없는 100 mL 진탕 플라스크중의, 우라실 (100 mg/L)이 보충된 WMVIII 배지 20 mL 중에서 우라실 (100 mg/L)이 보충된 WMVIII 아가 플레이트 (플레이트 1; 하기 참조; 형질전환 플레이트와 같은 것은 아니다)로부터 집어낸 콜로니로 접종시켜 72시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (접종물 1).
플레이트 1은 균주 AH22tH3ura8△are1△are2H를 LEU2 암호화 서열을 포함하는 DNA 단편으로 형질전환시켜 생성시킨, 상기 형질전환 플레이트 (도 1 참조)로부터 단일 콜로니를 집어내어 생성시켰다. 형질전환 플레이트가 아닌, 플레이트 1은 추가 공정에 사용하였다.
접종물 2는 칸막이가 없는 100 mL 진탕 플라스크중의, 우라실 (100 mg/L)이 보충된 WMVIII 배지 35 mL 중에 350 ㎕의 접종물 1로 접종하여 48시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (접종물 2).
접종물 2를 사용하여 중간 균주 2 (AH22tH3ura8△are1△are2HL)의 글리세롤 스톡을 제조하였다. 상기 글리세롤 스톡은 0.5 mL의 접종물 2를 0.5 mL의 글리세롤 용액 (수중 50%(v/v) 글리세롤)과 혼합하여 제조하였다. 글리세롤 스톡 10개를 드라이아이스상으로 옮길 수 있다.
접종물 2의 시험:
a) 접종물 2 의 광학밀도:
OD600/mL: 37.04
b) 접종물 2 세포의 생존성 (글리세롤 스톡의 제조 전):
접종물 2 세포의 생존성(%로)은 콜로니 형성 유니트를 세포수로 나누어 계산하였다 (x100). 세포수는 Thoma 계수 챔버에서의 계수를 통하여 측정하였다. 우라실(100 mg/L)이 보충되어 있는 WMVIII 아가 플레이트 상에서 접종물 2의 적절한 희석물을 도말하여 측정하였다.
c) Thoma 계수 챔버: 접종물 2의 1:10 희석물
1. 계수: 33; 36; 32; 37; 39
2. 계수: 28; 37; 41; 33; 31
34.7 세포 x 1.25 x 106 x 10 = 4.3 x 108 세포/mL 접종물 2
d) 플레이트상의 콜로니:
접종물 2의 10-5배 희석물 50 ㎕를 WMVIII 플레이트상에 플레이팅시켰다;
계수 결과: 142개의 콜로니 x 105 x 20 = 2.8 x 108 콜로니/mL 접종물 2
생존성: 2.8 x 108 x 100/4.3 x 108 → 65.1%
접종물 2의 생존성: 65.1%
e) 순도 및 표현형:
접종물 2 50 ㎕ (나타낸 바와 같이 물로 10-5로 희석하거나 희석하지 않은 것)를 표시된 플레이트상에 도말하여 48시간 동안 표시된 온도에서 배양시켜 순도와 표현형 (영양요구성)을 측정하였다
균주(접종물 2) 플레이트 배양
온도		 관찰
AH22tH3ura8△are1
△are2HL


 YE 30℃ 단일 효모 콜로니(접종물 2를 플레이트에 도말하기전에 10-5으로 희석시켰다)
WMVIII+Ura 30℃ 단일 효모 콜로니(접종물 2를 플레이트에 도말하기전에 10-5으로 희석시켰다)
LB 37℃ 생육 없음(희석시키지 않음)
WMVIII
(아미노산 없음)		 30℃ 생육 없음(희석시키지 않음)
접종물 2를 또한 현미경하에서 세균성 오염에 대해 체크하였다. 세균성 오염이 검출되지 않았다.
3.4 최종 균주 1의 작제 및 최종 균주 1 AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 글리세롤 스톡의 제조
작제(기술적 공법):
형질전환 및 유전자 자리 HO로의 URA3 발현 카세트의 정확한 통합에 대한 PCR 증명.
효모 형질전환의 결과:
형질전환을 Gietz 등에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다 (Gietz, D., et al., 1992). 형질전환 효율 (통합형 형질전환)은 DNA ㎍ 당 102 내지 103개의 형질전환체 사이에서 변화되었다.
대조용 플레이트 상에서 배양시킨 샘플 1 (AH22tH3ura8△are1△are2HL, DNA는 없음)은 콜로니 성장이 없는 반면, AH22tH3ura8△are1△are2HL+URA3 카세트가 있는 세포를 포함하는 샘플 2를 배양시키면 상이한 콜로니가 형성된다.
15개의 콜로니를 새로운 WMVIII 플레이트상에 집어내어 72시간 동안 30℃에서 배양시켰다. 포지티브 형질전환체를 글리세롤 스톡의 제조용으로 사용하였다 (콜로니 6과 8). 큰 콜로니를 선택하여 다른 플레이트 상으로 집어내어 PCR을 통하여 체크한 다음 글리세롤 스톡의 제조용으로 사용하였다.
PCR:
주형: 효모 형질전환의 콜로니
효모 균주: AH22tH3ura8△are1△are2HUL
PuRe Taq Ready To Go-Beads (GE Healthcare; Lot:384777)을 Taq-폴리머라제로서 25 ㎕의 용적으로 사용하였다. 비드를 멸균 HPLC-H2O 23 ㎕에 용해시키고 각각의 프라이머 fw./rev.(표 6 참조) 1 ㎕를 첨가하였다. 사용되는 PCR-기계는 Flex Cycle Analytik, Jena로부터 입수하였다.
PCR-프로그램:
단계 1: 94℃ 3분
단계 2: 94℃ 30초
단계 3: 51℃ 30초, 새로운 어닐링 온도
단계 4: 72℃ 2분, 단계 2를 40 사이클
단계 5: 72℃ 3분
단계 6: 4℃
PCR 성능
샘플 균주 각 방향의 프라이머 쌍 1 ㎕, 10 pmol/㎕ 희석액
1 AH22tH3ura8△are1△are2HUL 콜로니 1 5'HOfw.
3'HOrev.
HO유전자 자리로의 URA3 카세트의 통합,
정확한 통합의 경우 단편은 1435 bp를 가지며, 그렇지 않을 경우, 1902 bp를 갖는다
2 ,, 콜로니 2
3 ,, 콜로니 3
4 ,, 콜로니 4
5 ,, 콜로니 5
6 ,, 콜로니 6
7 ,, 콜로니 7
8 ,, 콜로니 8
9 ,, 콜로니 9
10 ,, 콜로니 10
11 ,, 콜로니 6 3'HOrev.
URA 3은 1 fw.가 아님
12 ,, 콜로니 7
13 ,, 콜로니 8
14 ,, 콜로니 9
15 ,, 콜로니 10
1% 아가로스 겔을 제조:
250 mL 진탕 플라스크+100 mL 1xTAE-완충액중에 Biozym으로부터의 Seakem LE Agarose 1.0 g. 6 ㎕의 1 kb ladder(NEB)(500 ng/레인)를 하나의 레인에 부하하였다. 추가로, 각각의 증폭물의 10 ㎕ 샘플을 6x 부하 완충액 2 ㎕와 혼합하고 혼합물을 상기 아가로스 겔 상에 부하하였다. 상기 겔을 120V에서 45분간 1 x TAE-완충액 중에서 가동시켰다. 이어서, 상기 겔을 에티듐 브로마이드 (EtBr) 욕중에서 20 분간 배양시켰다 (EtBr 농축 스톡: 10 mg/mL; 욕: 30 ㎕/300 mL 1xTAE-완충액). 최종적으로, 상기 겔을 사진문서조사로 분석하였다.
결과:
대략 1435 bp의 정확한 크기를 갖는 증폭 생성물이 이후 사용되었다.
균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 글리세롤 스톡의 제조
균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL을 칸막이가 없는 100 mL 진탕 플라스크중의, WMVIII 배지(보충물이 없다) 20 mL 중에서, WMVIII 아가 플레이트 (콜로니 6, 도 4 및 5 참조; 플레이트 1; 하기 참조; 형질전환 플레이트와 같은 것은 아니며, 보충물이 없다)로부터 집어낸 콜로니로 접종시켜 72시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (접종물 1).
플레이트 1은 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HL을 천연 URA3 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편으로 형질전환시켜 생성시킨, 상기 형질전환 플레이트 (도 4 참조)로부터 단일 콜로니를 집어내어 생성시켰다. 형질전환 플레이트가 아닌, 플레이트 1은 추가 공정에 사용하였다.
접종물 2는 칸막이가 없는 100 mL 진탕 플라스크중의, WMVIII 배지(보충물이 없다) 35 mL 중에 350 ㎕의 접종물 1로 접종하여 48시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (접종물 2).
접종물 2를 사용하여 최종 균주 1 (AH22tH3ura8△are1△are2HUL)의 글리세롤 스톡을 제조하였다. 상기 글리세롤 스톡은 0.5 mL의 접종물 2를 0.5 mL의 글리세롤 용액 (수중 50%(v/v) 글리세롤)과 혼합하여 제조하였다. 글리세롤 스톡 10개를 드라이아이스상으로 옮길 수 있다.
접종물 2의 시험:
a) 접종물 2 의 광학밀도:
OD600/mL: 42.68
b) 접종물 2 세포의 생존성 (글리세롤 스톡의 제조 전):
접종물 2 세포의 생존성(%로)은 콜로니 형성 유니트를 세포수로 나누어 계산하였다 (x100). 세포수는 Thoma 계수 챔버에서의 계수를 통하여 측정하였다. 우라실(100 mg/L)이 보충되어 있는 WMVIII 아가 플레이트 상에서 접종물 2의 적절한 희석물을 도말하여 측정하였다.
c) Thoma 계수 챔버: 접종물 2의 1:10 희석물
1. 계수: 26; 29; 37; 30; 229
2. 계수: 39; 36; 28; 27; 33
31.4 세포 x 1.25 x 106 x 15 = 5.9 x 108 세포/mL 접종물 2
d) 플레이트상의 콜로니:
접종물 2의 10-5배 희석물 50 ㎕를 WMVIII 플레이트상에 플레이팅시켰다;
계수 결과: 280개의 콜로니 x 105 x 20 = 5.6 x 108 콜로니/mL 접종물 2,
생존성: 5.6 x 108 x 100/5.9 x 108. 이는 94.9%에 이른다.
접종물 2의 생존성: 94.9%
e) 순도 및 표현형:
접종물 2 50 ㎕ (나타낸 바와 같이 물로 10-5로 희석하거나 희석하지 않은 것)를 표시된 플레이트상에 도말하여 48시간 동안 표시된 온도에서 배양시켜 순도와 표현형 (영양요구성)을 측정하였다
균주(접종물 2) 플레이트 배양온도 관찰
AH22tH3ura8△are1△are2HUL

 YE 30℃ 단일 효모 콜로니(접종물 2를 플레이트에 도말하기전에 10-5으로 희석시켰다)
LB 37℃ 생육 없음(희석시키지 않음)
WMVIII(아미노산없음) 30℃ 단일 효모 콜로니(접종물 2를 플레이트에 도말하기전에 10-5으로 희석시켰다)
접종물 2를 또한 현미경하에서 세균성 오염에 대해 체크하였다. 세균성 오염이 검출되지 않았다.
3.5 결론
상기 통합형 단편(LEU2 및 URA3 발현 카세트)를 대응하는 표적 유전자 자리(LEU2 및 HO)에서 정확한 크기 및 정확한 통합에 대해 PCR을 통하여 체크하였다. PCR 결과는 상기 단편의 정확한 크기와 정확한 통합을 나타냈다.
최종 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 게놈성 DNA의 통합 유전자 자리(LEU2 및 HO)로부터 증폭시킨 통합형 단편(LEU2 및 URA3 발현 카세트)의 서열화 결과는 AH22tH3ura8△are1△are2HUL가 서열이 정확한 것으로 나타났다 (이들 서열은 htt://www.yeastgenome.org에 기탁되어 있는, S288c의 서열에 대응한다). 돌연변이 his4-519의 복귀돌연변이가 일어났으며, 이 서열 또한 최종 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL에서 상기한 바와 같이 체크되었다. 최종 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL은 정확한 표현형 (자가영양성)을 나타낸다. 최종의 자가영양성 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 작제가 성공적으로 완료되었다.
상기 균주는 이종성 유전자를 사용하지 않고 성공적으로 작제되었으며, 이는 이종성 유전자를 포함하는 균주를 사용하는 경우와 비교할 때, 산업적 구현을 단순화시킨다.
실시예 4
영양요구성 효모 균주 AH22tH3ura8△are1△are2와 비교한, 자가영양성 효모 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 생육 및 스쿠알렌 생산성 평가
하기 실험에서는 영양요구성 균주와 비교하여, 자가영양성 균주의 생육 성능과 스쿠알렌 생산성을 평가하였다.
추가로, 생산 사이클에 따른 생육 성능과 스쿠알렌 생산성에 관하여 상기 두 균주의 안정성을 평가하였다. 적어도 30세대에 걸쳐 유지되는, 컬쳐 (초기 글리세롤 스톡으로 접종시킨 것;프리 스톡)로부터 이에 대한 글리세롤 스톡(포스트 스톡)을 제조하였다. 상기 30세대는 1회의 생산 사이클 (산업적 규모의 발효기에서의 배양)을 나타낸다. 30세대 동안 배양시킨 후, 샘플을 다시 시험하였다 (포스트 스톡). 적어도 30세대에 걸친 배양중 생육 및 생산성에 관한 안정성은 산업적 생산에 적합한 균주가 나타내야 하는 바람직한 특성이다. 상기 안정성을 평가하기 위하여 프리 및 포스트 스톡으로 접종한 컬쳐를 동시에 평가하였다.
CDW (세포 건조 중량) - 측정:
3 x 6 mL의 배양액(culture broth)을 칭량한 15 mL 팔콘 튜브에 하베스트하여 4000 rpm에서 5분간 원심분리시켜 펠릿화하였다. 상등액은 버리고 펠릿을 추가의 분석에 사용하였다. 상기 펠릿을 5 mL의 물로 2회 세척하였다. 칭량 전에 세척한 펠릿을 80℃에서 24시간 동안 건조시키고 엑시케이터에서 냉각시켰다.
GC-MS 분석을 통한 스쿠알렌의 추출 및 정량적 측정
추출:
250 ㎕의 배양액을 에펜도르프관으로 옮겼다. 상기 액을 수초간 최대 속도로 볼텍싱(진탕)시켰다 (Vortex-Genie 2, Scientific Industries). 250 ㎕의 유리 비드 (450 ㎛ 내지 500 ㎛의 직경 범위, Sartorius BBI-8541701)를 가하였다. 이어서, 400 ㎕의 클로로포름:메탄올 (80:20; v:v)을 가하였다. 상기 용액을 13,200 rpm에서 5분간 원심분리 (Hettich Mikro 200 R 실험실 원심분리기)시키기 전에 5분간 최대 속도로 볼텍싱시켰다 (Vortex-Genie 2, Scientific Industries). 50 ㎕의 하부 유기상을 질소 흐름하에서 건조시키고 잔여물을 1.5 mL의 아세토니트릴에 가용화시켰다. 1 mL의 상기 아세토니트릴 용액을 GC-바이알로 옮기고 주입하였다.
정량화를 위한 외부 표준물질의 제조:
10 mg의 스쿠알렌 (Sigma, S3626, 최소 98% 순도)을 15 mL Greiner 튜브에 넣었다. 10 mL의 아세토니트릴을 가하고 (스쿠알렌 스톡 용액, 1 mg/mL), 하기 나타낸 바와 같이 상이한 농도로 제조하였다:
1. 5 ㎍/mL 스쿠알렌: 스쿠알렌 스톡 용액 5 ㎕를 아세토니트릴 995 ㎕에 피펫팅
2. 10 ㎍/mL 스쿠알렌: 스쿠알렌 스톡 용액 10 ㎕를 아세토니트릴 990 ㎕에 피펫팅
3. 20 ㎍/mL 스쿠알렌: 스쿠알렌 스톡 용액 20 ㎕를 아세토니트릴 980 ㎕에 피펫팅
4. 40 ㎍/mL 스쿠알렌: 스쿠알렌 스톡 용액 40 ㎕를 아세토니트릴 960 ㎕에 피펫팅
5. 80 ㎍/mL 스쿠알렌: 스쿠알렌 스톡 용액 80 ㎕를 아세토니트릴 920 ㎕에 피펫팅
GC-MS 분석:
GC-MS 분석은 Agilent 5975B VL MSD 사중극자 질량 선택성 검출기에 연결되어 있는 Agilent 6890N GC 시스템상에서 수행하였다. 상기 분석에 사용되는 컬럼은 Agilent HP-5MS였다. 상기 MS를 스캔 모드로 작동시켰다 (4분 후 시작, 질량 범위 29 내지 500 a.m.u, 3에서, 1 스캔/초). 온도는 처음에 70℃에서 0.5분간 유지하고 이후 분당 20℃의 구배로 120℃로 상승시킨 다음 분당 10℃의 구배로 325℃로 상승시키고, 이 온도에서 20분간 유지시켰다. 컬럼을 통한 유속은 1 mL He/분에서 일정하게 유지시켰다. 주입 용적은 1 ㎕였다 (비분취 방식: splitless mode). 주입구 온도와 계면 온도는 280℃ 였다.
4.1 적어도 30세대 동안 배양시킨 후 프리 글리세롤 스톡으로부터 포스트 글리세롤 스톡의 생성:
a) 배양 공정
포스트 스톡의 생성에 사용되는 균주
번호 균주 표현형 보충물질
1. AH22tH3ura8△are1△are2HUL 자가영양성 --
4. AH22tH3ura8△are1△are2 영양요구성,(his ura leu) His; Ura; Leu
접종물 1은 칸막이가 없는 100 mL 진탕 플라스크중 20 mL의 WMVIII 배지에서 글리세롤 스톡(100 ㎕)으로부터 접종시켜 48시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (표 7에 게시되어 있는 아미노산 보충).
접종물 2는 칸막이가 없는 100 mL 진탕 플라스크중 20 mL의 WMVIII 배지에서 접종물 1(1%)로부터 접종시켜 48시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (표 7에 게시되어 있는 아미노산 보충).
접종물 3은 칸막이가 있는 250 mL 진탕 플라스크중 50 mL의 WMVIII 배지에서 접종물 2(1%)로부터 접종시켜 48시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (표 7에 게시되어 있는 아미노산 보충).
접종물 4는 칸막이가 있는 250 mL 진탕 플라스크중 50 mL의 WMVIII 배지에서 접종물 3(1%)으로부터 접종시켜 48시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (표 7에 게시되어 있는 아미노산 보충).
접종물 5는 칸막이가 있는 250 mL 진탕 플라스크중 50 mL의 WMVIII 배지에서 접종물 4(1%)로부터 접종시켜 48시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (표 7에 게시되어 있는 아미노산 보충).
접종물 6은 칸막이가 있는 250 mL 진탕 플라스크중 50 mL의 WMVIII 배지에서 접종물 5(1%)로부터 접종시켜 48시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (표 7에 게시되어 있는 아미노산 보충).
b) 세대(generations) 수의 측정을 위한 세포의 계수:
0시간 (t=0시간; 접종 후) 및 48시간 (t=48시간)의 배양 후 컬쳐(접종물 1 내지 6)의 수
균주번호 1. 2. 3. 4.
접종물 1, t=48시간 3.68x108 3.78x108 3.50x108 4.89x108
접종물 2, t=0시간 6.38x106 6.38x106 6.50x106 7.63x106
접종물 2, t=48시간 3.46x108 3.58x108 3.86x108 3.66x108
접종물 3, t=0시간 8.13x106 9.00x106 9.75x106 10.38x106
접종물 3, t=48시간 3.39x108 3.41x108 3.44x108 5.15x108
접종물 4, t=48시간 3.03x108 3.04x108 2.99x108 3.87x108
접종물 5, t=48시간 3.09x108 3.46x108 3.79x108 4.15x108
접종물 6, t=48시간 5.61x108 5.39x108 5.74x108 6.73x108
세대의 총수:
접종물 1 내지 5: 대략 5.5세대
접종물 6: 대략 6.0세대
합: 대략 33.5세대
c) 생산후(post-production) 글리세롤 스톡의 제조:
생산후 글리세롤 스톡은 0.5 mL의, 48시간 배양 (표 7에 게시된 균주의 배양) 후 접종물 6을 0.5 mL의 글리세롤 용액 (수중 50%(v/v) 글리세롤)과 함께 혼합하여 제조하였다.
생산후 세포의 글리세롤 스톡의 표시
번호 균주(생산후 스톡) 표현형 보충물질
1. AH22tH3ura8△are1△are2post 영양요구성 His; Ura; Leu
2. AH22tH3ura8△are1△are2HULpost 자가영양성 --
생산후 글리세롤 스톡은 안정성 분석을 위하여 배양전에 적어도 24시간 동안 -80℃에서 보관하였다.
4.2. 균주 안정성(생산전 및 후) 분석
a) 배양 공정
- 접종물 1은 칸막이가 없는 100 mL 진탕 플라스크중 20 mL의 WMVIII 배지에서 표 7과 3에 게시된 글리세롤 스톡 (100 ㎕)(2종의 균주의 생산전 및 후 세포 = 4개의 스톡)으로부터 접종시켜 48시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (표 7에 게시되어 있는 아미노산 보충).
- 접종물 2는 칸막이가 있는 250 mL 진탕 플라스크중 50 mL의 WMVIII 배지에서 접종물 1 (1%)로부터 접종시켜 72시간 동안 30℃ 및 150 rpm에서 배양시켰다 (표 7에 게시되어 있는 아미노산 보충).
생육 및 스쿠알렌 생산성 분석을 위하여 사용되는 균주
번호 균주
1. AH22tH3ura8△are1△are2prae (영양요구성 균주; 프리 스톡)
2. AH22tH3ura8△are1△are2post (영양요구성 균주; 포스트 스톡)
3. AH22tH3ura8△are1△are2HULprae (자가영양성 균주; 프리 스톡)
4. AH22tH3ura8△are1△are2HULpost (자가영양성 균주; 포스트 스톡)
b) 결과
72시간 후 세포(접종물 2)를 하베스트하여 생육 및 생산성에 대해 평가하였다. 이 목적으로, 세포 건조 중량(CDW)을 측정하였다.
3 x 6 mL의 배양액(culture broth)을 칭량한 15 mL 팔콘 튜브에 하베스트하여(3회 중복), 4000 rpm에서 5분간 원심분리시켜 펠릿화하였다. 상등액은 버리고 펠릿을 추가의 분석에 사용하였다. 상기 펠릿을 5 mL의 물로 2회 세척하였다. 칭량 전에 세척한 펠릿을 80℃에서 24시간 동안 건조시키고 엑시케이터에서 냉각시켰다.
상기 세포 건조 중량(CDW)의 측정은 3회 중복해서 수행하고 추출 및 스쿠알렌 분석은 3회 중복으로 수행하였다.
표 10에 기재된 균주의 600nm에서의 광학밀도(OD600nm)를 측정하였더니, 자가영양성 AH22tH3ura8△are1△are2HUL 균주가 영양요구성 AH22tH3ura8△are1△are2 균주보다 더욱 안정한 것으로 나타났다. 72시간 후, 다음과 같은 결과를 수득하였다:
배양 후 균주의 생육
번호 균주 600nm에서의 광학밀도(OD600nm)/mL
1. AH22tH3ura8△are1△are2prae 58
2. AH22tH3ura8△are1△are2post 51
3. AH22tH3ura8△are1△are2HULprae 58
4. AH22tH3ura8△are1△are2HULpost 59
표 10에 게시된 균주의 세포 건조 중량(CDW)을 측정하였더니, 자가영양성 AH22tH3ura8△are1△are2HUL 균주가 영양요구성 AH22tH3ura8△are1△are2 균주보다 더 안정한 것으로 나타난다. 72시간 후, 다음과 같은 결과가 수득되었다:
배양 후 세포 건조 중량(CDW)
번호 균주 세포 건조 중량[g/L]
1. AH22tH3ura8△are1△are2prae 12.4
2. AH22tH3ura8△are1△are2post 10.2
3. AH22tH3ura8△are1△are2HULprae 13.0
4. AH22tH3ura8△are1△are2HULpost 13.1
표 10에 게시된 균주의 스쿠알렌 생산성을 측정하였더니, 자가영양성 AH22tH3ura8△are1△are2HUL 균주가 영양요구성 AH22tH3ura8△are1△are2 균주보다 더 안정하며 더 많은 양의 스쿠알렌을 생산하는 것으로 나타났다. 72시간 후, 다음과 같은 결과가 수득되었다:
배양 후 세포 건조 중량(CDW)
번호 균주 스쿠알렌
[g/L 배양액]		 스쿠알렌
[세포무수중량 당 %]
1. AH22tH3ura8△are1△are2prae 0.68 5.48
2. AH22tH3ura8△are1△are2post 0.49 4.81
3. AH22tH3ura8△are1△are2HULprae 0.90 6.97
4. AH22tH3ura8△are1△are2HULpost 0.88 6.84
4.3 결론
자가영양성 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL은 영양요구성 균주 AH22tH3ura8△are1△are2와 비교하여 용적, 특이적 및 총수율면에 있어서 더 많은 스쿠알렌을 생산하였다. 또한, 배양 말기에 자가영양성 균주의 세포 건조 중량이 영양요구성 균주와 비교하여 더 높았다. 영양요구성 균주와는 대조적으로, 자가영양성 균주는 적어도 33세대에 걸친 생육 성능 및 스쿠알렌 생산성에 있어서 안정하였다.
실시예 5
AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 평가
5.1. AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 실험실-규모 발효
균주: 사카로미세스 세레비지애 AH22tH3ura8△are1△are2HUL
배지: 멸균 여과시킨 (0.22 ㎛) 미량 원소와 비타민이 보충된, 멸균시킨 WMVIII 기본 배지 (20분/121℃)
예비배양:
접종물 1: 균주 AH22tH3ura8△are1△are2HUL의 글리세롤 스톡 20 ㎕로 접종한 20 mL WMVIII 배지 (칸막이가 있는 100 mL Erlenmeyer 플라스크).
배양: 48시간/30℃/150 rpm
접종물 2: 접종물 1 1.5 mL(1%)로 접종한 150 mL WMVIII 배지 (칸막이가 있는 500 mL Erlenmeyer 플라스크).
배양: 48시간/30℃/150 rpm
주배양:
3L WMVIII - 배지 (5L Applikon 발효기)를 100 mL(3.33%) 접종물 2로 접종시켜 72시간 동안 30℃ 및 250-585 rpm에서 배양시켰다. pH 조절은 없었다. 배양기는 압축 공기 10L/시간으로 배기시켰다.
교반: pO2-조절식 (pO2 값이 25% 미만일 경우 700 rpm의 최대치까지 교반을 계속 증가시켰다)
발효
AH22tH3ura8△are1△are2HUL 세포를 39번째 주(2010년)에 발효시켰다.
기록된 변수: 배양 시작할 때의 pH 및 pO 2
시작: 0시간
pH: 5.24
pO2: 99%
교반 속도: 250 rpm
배기: 압축된 공기 10L/시간
배양 중, 화학적 분석 및 광학밀도 측정을 위하여 샘플을 분석하였다. 샘플은 0시간, 11시간, 15시간, 19시간, 22시간, 37시간, 40시간, 44시간, 62시간, 66시간, 및 72시간후 취하였다.
기록된 변수: 배양 말기의 pH 및 pO 2
시작: 72시간
pH: 5.26
pO2: 59%
교반 속도: 250 rpm
배기: 압축된 공기 10L/시간
결과
결과를 도 7에 나타낸다. 성장 역학은 60시간 이상의 배양 동안 광범위하게 선형이었다. 컬쳐의 스쿠알렌 생산성은 60시간까지 증가하였다. 스쿠알렌 생산성은 72시간의 발효 후 1.07 g/L (역가) 각각 7.8%(CDW 당 스쿠알렌)였다.
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EP 0 486 290 A2
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gctggcggtg gtgcaacaac tgttttaact aaggatggta tgacaagagg cccagtagtc 660 cgtttcccaa ctttgaaaag atctggtgcc tgtaagatat ggttagactc agaagaggga 720 caaaacgcaa ttaaaaaagc ttttaactct acatcaagat ttgcacgtct gcaacatatt 780 caaacttgtc tagcaggaga tttactcttc atgagattta gaacaactac tggtgacgca 840 atgggtatga atatgatttc taaaggtgtc gaatactcat taaagcaaat ggtagaagag 900 tatggctggg aagatatgga ggttgtctcc gtttctggta actactgtac cgacaaaaaa 960 ccagctgcca tcaactggat cgaaggtcgt ggtaagagtg tcgtcgcaga agctactatt 1020 cctggtgatg ttgtcagaaa agtgttaaaa agtgatgttt ccgcattggt tgagttgaac 1080 attgctaaga atttggttgg atctgcaatg gctgggtctg ttggtggatt taacgcacat 1140 gcagctaatt tagtgacagc tgttttcttg gcattaggac aagatcctgc acaaaatgtt 1200 gaaagttcca actgtataac attgatgaaa gaagtggacg gtgatttgag aatttccgta 1260 tccatgccat ccatcgaagt aggtaccatc ggtggtggta ctgttctaga accacaaggt 1320 gccatgttgg acttattagg tgtaagaggc ccgcatgcta ccgctcctgg taccaacgca 1380 cgtcaattag caagaatagt tgcctgtgcc gtcttggcag gtgaattatc cttatgtgct 1440 gccctagcag ccggccattt ggttcaaagt catatgaccc acaacaggaa acctgctgaa 1500 ccaacaaaac ctaacaattt ggacgccact gatataaatc gtttgaaaga tgggtccgtc 1560 acctgcatta aatcctaa 1578 <210> 2 <211> 1635 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> based on vector pUC19 <400> 2 actatggacc aattggtgaa aactgaagtc accaagaagt cttttactgc tcctgtacaa 60 aaggcttcta caccagtttt aaccaataaa acagtcattt ctggatcgaa agtcaaaagt 120 ttatcatctg cgcaatcgag ctcatcagga ccttcatcat ctagtgagga agatgattcc 180 cgcgatattg aaagcttgga taagaaaata cgtcctttag aagaattaga agcattatta 240 agtagtggaa atacaaaaca attgaagaac aaagaggtcg ctgccttggt tattcacggt 300 aagttacctt tgtacgcttt ggagaaaaaa ttaggtgata ctacgagagc ggttgcggta 360 cgtaggaagg ctctttcaat tttggcagaa gctcctgtat tagcatctga tcgtttacca 420 tataaaaatt atgactacga ccgcgtattt ggcgcttgtt gtgaaaatgt tataggttac 480 atgcctttgc ccgttggtgt tataggcccc ttggttatcg atggtacatc ttatcatata 540 ccaatggcaa ctacagaggg ttgtttggta gcttctgcca tgcgtggctg taaggcaatc 600 aatgctggcg gtggtgcaac aactgtttta actaaggatg gtatgacaag aggcccagta 660 gtccgtttcc caactttgaa aagatctggt gcctgtaaga tatggttaga ctcagaagag 720 ggacaaaacg caattaaaaa agcttttaac tctacatcaa gatttgcacg tctgcaacat 780 attcaaactt gtctagcagg agatttactc ttcatgagat ttagaacaac tactggtgac 840 gcaatgggta tgaatatgat ttctaaaggt gtcgaatact cattaaagca aatggtagaa 900 gagtatggct gggaagatat ggaggttgtc tccgtttctg gtaactactg taccgacaaa 960 aaaccagctg ccatcaactg gatcgaaggt cgtggtaaga gtgtcgtcgc agaagctact 1020 attcctggtg atgttgtcag aaaagtgtta aaaagtgatg tttccgcatt ggttgagttg 1080 aacattgcta agaatttggt tggatctgca atggctgggt ctgttggtgg atttaacgca 1140 catgcagcta atttagtgac agctgttttc ttggcattag gacaagatcc tgcacaaaat 1200 gttgaaagtt ccaactgtat aacattgatg aaagaagtgg acggtgattt gagaatttcc 1260 gtatccatgc catccatcga agtaggtacc atcggtggtg gtactgttct agaaccacaa 1320 ggtgccatgt tggacttatt aggtgtaaga ggcccgcatg ctaccgctcc tggtaccaac 1380 gcacgtcaat tagcaagaat agttgcctgt gccgtcttgg caggtgaatt atccttatgt 1440 gctgccctag cagccggcca tttggttcaa agtcatatga cccacaacag 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gcttgctttt caaaaggcct gcaggcaagt gcacaaacaa tacttaaata 1500 aatactactc agtaataacc tatttcttag catttttgac gaaatttgct attttgttag 1560 agtcttttac accatttgtc tccacacctc cgcttacatc aacaccaata acgccattta 1620 atctaagcgc atcaccaaca ttttctggcg tcagtccacc agctaacata aaatgtaagc 1680 ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ccccagtcac atggtgctgt tgtgcttctt 1740 tttcaagaga ataccaatga cgtatgacta agtttaggat ttaatgcagg tgacggaccc 1800 atctttcaaa cgatttatat cagtggcgtc caaattgtta ggttttgttg gttcagcagg 1860 tttcctgttg tgggtcatat gactttgaac caaatggccg gctgctaggg cagcacataa 1920 ggataattca cctgccaaga cggcacaggc aactattctt gctaattgac gtgcgttggt 1980 accaggagcg gtagcatgtg ggcctcttac acctaataag tccaacatgg caccttgtgg 2040 ttctagaaca gtaccaccac cgatggtacc tacttcgatg gatggcatgg atacggaaat 2100 tctcaaatca ccgtccactt cttccatcaa tgttatacag ttggaacttt caacattttg 2160 tgcaggatct tgtcctaatg ccaagaaaac agctgtcact aaattagctg catgtgcgtt 2220 aaatccacca acagacccag ccattgcaga tccaaccaaa ttcttagcaa tgttcaactc 2280 aaccaatgcg 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tcttctaaag gacgtatttt cttatccaag ctttcaatat cgcgggaatc 3180 atcttcctca ctagatgatg aaggtcctga tgagctcgat tgcgcagatg ataaactttt 3240 gactttcgat ccagaaatga ctgttttatt ggttaaaact ggtgtagaag ccttttgtac 3300 aggagcagta aaagacttct tggtgacttc agttttcacc atttggtcca tagtgggtac 3360 cgagctcgaa ttccttgatt gtatgcttgg tatagcttga aatattgtgc agaaaaagaa 3420 acaaggaaga aagggaacga gaacaatgac gaggaaacaa aagattaata attgcaggtc 3480 tatttatact tgatagcaag acagcaaact tttttttatt tcaaattcaa gtaactggaa 3540 ggaaggccgt ataccgttgc tcattaaaga gtagtgtgcg tgaatgaagg aaggaaaaag 3600 tttcgtgtgc ttcgagatac ccctcatcag ctctggaaca acgacatctg ttggtgctgt 3660 ctttgtcgtt aattttttcc tttagtgtct tccatcattt ttttgtcatt gcggatatgg 3720 tgagacaaca acgggggaga gagaaaagaa aaaaaaagaa aagaagttgc atgcgcctat 3780 tattacttca atagatggca aatggaaaaa gggtagtgaa acttcgatat gatgatggct 3840 atcaagtcta gggctacagt attagttcgt tatgtaccac catcaatgag gcagtgtaat 3900 tggtgtagtc ttgtttagcc cattatgtct tgtctggtat ctgttctatt gtatatctcc 3960 cctccgccac 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gcaaaactaa 4820 <210> 4 <211> 1694 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> integrative cassette used for deletion of gene ARE1 <400> 4 atgacggaga ctaaggattt gttgcaagac gaagagtttc ccagctgaag cttcgtacgc 60 tgcaggtcga caacccttaa tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattaggt 120 ctagagatct gtttagcttg cctcgtcccc gccgggtcac ccggccagcg acatggaggc 180 ccagaatacc ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg 240 cccgtacatt tagcccatac atccccatgt ataatcattt gcatccatac attttgatgg 300 ccgcacggcg cgaagcaaaa attacggctc ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc 360 tcccctcaca gacgcgttga attgtcccca cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg 420 ttaggatttg ccactgaggt tcttctttca tatacttcct tttaaaatct tgctaggata 480 cagttctcac atcacatccg aacataaaca accatgggta aggaaaagac tcacgtttcg 540 aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat 600 aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag 660 ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga 720 ctaaactggc 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Claims (15)

  1. 효모 세포로서,
    a) 상기 세포가 가용성 하이드록시메틸글루타릴-코엔자임-A (HMG-CoA) 환원효소를 암호화하는 기능성 유전자를 포함하며;
    b) 상기 세포에서 스테릴 아실전이효소(들)를 암호화하는 하나 이상의 유전자(들)가 결함이 있거나 제거되었으며,
    c) 상기 세포가 적어도 히스티딘, 류신, 또는 우라실에 대해 자가영양성이고, 바람직하게는 상기 세포가 적어도 히스티딘과 류신, 히스티딘과 우라실, 또는 류신과 우라실에 대해 자가영양성이고, 특히, 상기 세포가 히스티딘, 류신 및 우라실에 대해 자가영양성인 효모 세포.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 안정한, 바람직하게는 적어도 히스티딘, 류신 또는 우라실에 대해 영양요구성, 더욱 바람직하게는 히스티딘과 류신, 히스티딘과 우라실, 또는 류신과 우라실에 대해 영양요구성, 더욱 더 바람직하게는 히스티딘, 류신 및 우라실에 대해 영양요구성인 대응하는 세포보다 더욱 안정한 세포주의 세포인 세포.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세포가 유전자 변형 세포인 세포.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 사카로미세스(Saccharomyces) 세포, 더욱 바람직하게는 상기 세포가 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 세포, 특히 상기 세포가 균주 AH22의 사카로미세스 세레비지애 세포로부터 유래되는 것인 세포.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 HMG-CoA 환원효소가
    a) 막-결합 영역이 결여되어 있는 절단형 가용성 HMG-CoA 환원효소 단백질이고;
    b) 상기 세포에서 활성인 프로모터의 전자 조절하에서 벡터상에 암호화되며;
    c) 구성적 프로모터의 조절하에서, 특히 강력한 구성적 프로모터의 조절하에서 발현됨을 특징으로 하는 것인 세포.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 스테릴 아실전이효소(들)를 암호화하는 하나 이상의 유전자(들)가 ARE1 및/또는 ARE2이고, 바람직하게는 상기 두 유전자, ARE1 및 ARE2가 결함이 있거나 결실되어 있는 세포.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 테르펜 생산성, 바람직하게는 트리테르펜 생산성, 특히 스쿠알렌 생산성이 대응하는 야생형 세포 및/또는 적어도 히스티딘, 류신 또는 우라실에 대해 영양요구성, 바람직하게는, 히스티딘과 류신, 히스티딘과 우라실, 또는 류신과 우라실에 대해 영양요구성, 더욱 바람직하게는 히스티딘, 류신 및 우라실에 대해 영양요구성인 대응하는 세포와 비교하여 적어도 대등한, 바람직하게는 증가된 세포.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 감소된 양의 스테릴 아실 에스테르를 생산하고, 바람직하게는 상기 세포가 스테릴 아실 에스테르의 생산에 대해 결핍인 세포.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 세포를 생성시키는 방법으로,
    a) 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자를 효모 세포중에 삽입시키는 단계;
    b) 상기 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 선택하는 단계;
    c) 상기 세포의 스테릴 아실전이효소(들)를 암호화하는 유전자(들)를 하나 이상 결실시키거나 돌연변이시키는 단계;
    d) 상기 세포를
    (i) 히스티딘, 류신 및/또는 우라실의 생산에 대한 효소(들) 하나 이상을 암호화하는 유전자 카세트(들)를 삽입 및/또는
    (ii) 히스티딘, 류신 및/또는 우라실의 생산에 대한 효소를 암호화하는 결함이 있는 유전자(들) 하나 이상의 복귀 돌연변이유발(revertant mutagenesis)에 의해,
    특히, 히스티딘 생산에 관한 효소를 암호화하는 결함이 있는 유전자를 복귀 돌연변이유발시키고 류신과 우라실의 생산에 대한 효소를 암호화하는 유전자 카세트를 삽입시킴으로써, 히스티딘, 류신 및/또는 우라실, 바람직하게는 히스티딘과 류신, 히스티딘과 우라실, 또는 류신과 우라실, 더욱 더 바람직하게는 히스티딘, 류신 및 우라실에 대해 적어도 자가영양성인 세포로 전환시키는 단계;
    e) 히스티딘, 류신 및/또는 우라실에 대해 자가영양성인 세포, 바람직하게는 히스티딘과 류신, 히스티딘과 우라실, 또는 류신과 우라실에 대해 적어도 자가영양성인 세포, 특히 히스티딘, 류신 및 우라실에 대해 자가영양성인 세포를 선택하는 단계; 및 임의로,
    f) 상기 단계 e)의 세포를 배양시키는 단계; 및 임의로,
    g) 상기 단계 e) 또는 f)의 세포를 분리하고 안정화시키는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 세포가 사카로미세스(Saccharomyces) 세포, 더욱 바람직하게는 상기 세포가 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 세포, 특히 상기 세포가 균주 AH22의 사카로미세스 세레비지애 세포로부터 유래되는 것인 방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 단계 a)가 가용성 HMG-CoA 환원효소를 암호화하는 벡터의 삽입을 포함하고, 상기 가용성 HMG-CoA 환원효소의 발현은 상기 세포에서 활성인 프로모터, 바람직하게는 구성적 프로모터, 특히 강력한 구성적 프로모터의 조절하에 있는 방법.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스테릴 아실전이효소(들)를 암호화하는 하나 이상의 유전자(들)가 ARE1 및/또는 ARE2이고, 바람직하게는 상기 두 유전자, ARE1과 ARE2가 결함이 있거나 결실되어 있는 방법.
  13. 하나 이상의 테르펜(들)의 생산, 바람직하게는 하나 이상의 트리테르펜(들)의 생산, 특히 스쿠알렌의 생산을 위한, 제1항 내지 8항 중 어느 한 항의 세포 또는 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 세포의 용도.
  14. 하나 이상의 테르펜(들), 바람직하게는 트리테르펜(들), 더욱 특히 스쿠알렌의 제조 방법으로서,
    a) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 세포 또는 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 세포를 적합한 컬쳐 배지중에서 배양시키는 단계; 및
    b) 하나 이상의 테르펜(들), 바람직하게는 하나 이상의 트리테르펜(들), 더욱 특히 스쿠알렌을 상기 단계 a)의 세포 또는 세포 컬쳐로부터 분리시키는 단계를 포함하는 방법.
  15. 약제학적 또는 화장용 조성물, 윤활제 또는 변압기 오일(transformer oil)의 제조, 특히 백신 조성물의 제조 방법으로서,
    a) 제 14 항에 따라서 하나 이상의 테르펜(들)을 생산하는 단계; 및
    b) 상기 테르펜(들)을 상기 약제학적 또는 화장용 조성물, 상기 윤활제 또는 상기 변압기 오일, 특히 상기 백신 조성물에 혼합하는 단계를 포함하며;
    상기 하나 이상의 테르펜(들)을 임의로 하나 이상의 수소화 단계(들)로 추가 처리하고, 상기 하나 이상의 테르펜(들)이 바람직하게는 수소화된 트리테르펜(들), 특히 스쿠알렌인 방법.
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