ES2582637T3 - Una célula de levadura para la producción de terpenos y usos de los mismos - Google Patents
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-
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Abstract
Una célula de levadura, en la que a) dicha célula comprende un gen funcional que codifica para hidroximetilglutaril-coenzima-A (HMG-CoA) reductasa soluble; b) uno o más genes que codifican para esterilaciltransferasas en dicha célula son defectuosos o eliminados; y c) dicha célula es prototrófica para histidina, leucina y uracilo.
Description
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por magneto. Preferiblemente, el vector es un vector de ADN circular, más preferiblemente, el vector es un plásmido. El plásmido puede ser cualquier plásmido conocido en la técnica tal como, por ejemplo, un plásmido YEpH2 o un pUC19. Sin embargo, se puede entender que también cualquier otro vector puede ser usado.
El gen insertado puede ser activo o pasivo en la célula. Preferiblemente, el gen insertado es transcrito activamente y expresado en la célula. El gen puede ser transcrito activamente expresado como un plásmido extranuclear, como un plásmido intranuclear, como un vector lineal extranuclear, como un vector lineal intranuclear, o puede ser insertado dentro del genoma de la célula de levadura. Como es usado aquí, el término "genoma" se refiere a la entidad de información genética en la célula de levadura. Preferiblemente, el gen que codifica para reductasa soluble HMG-CoA se inserta dentro del genoma de dicha célula de levadura. Opcionalmente, la reductasa HMG-CoA puede reemplazar otro gen, tal como por ejemplo, un gen para prototrofía de uracilo tal como, por ejemplo, el gen ura3. La célula resultante es entonces auxotrófica para uracilo.
Preferiblemente, dicho gen que codifica para reductasa soluble HMG-CoA es expresada en la célula de levadura, así, la reductasa soluble HMGCoA es producida por dicha célula.
Como es usado a través de la invención, el término "células que seleccionan" se refiere al enriquecimiento de la fracción deseada de la población de células. Más preferiblemente, las células son seleccionadas como se muestra a manera de ejemplo en los ejemplos.
En el contexto de las células que comprenden un gen que codifica para dicha reductasa soluble HMG-CoA, las células que comprenden dicho gen están enriquecidas en la población. La selección de las células puede ser ejecutada en un cultivo en suspensión o sobre una placa de cultivo de material sólido tal como, por ejemplo, una placa de agar. Las células pueden ser seleccionadas por dilución de las células y colocándolas por estrías para generar colonias originarias de únicamente una célula individual. Preferiblemente, a continuación en estas colonias se evalúa la presencia de un gen que codifica para dicha reductasa soluble HMG-CoA. Alternativamente, las células pueden ser evaluadas en su funcionalidad por determinación de productividad de terpenos. Alternativamente o adicionalmente, las células también pueden ser seleccionadas sometiéndolas a una presión de selección. Esta presión de selección puede ser un antibiótico para el cual únicamente la población de célula deseada es resistente a, o puede ser una condición de crecimiento preferida por la población deseada. En el contexto de selección de células que comprenden un gen que codifica para dicha reductasa soluble HMG-CoA, las células pueden haber crecido sobre o en un medio preferido por las células que comprenden dicho gen. A manera de ejemplo, sin incorporación del gen que codifica para dicha reductasa soluble HMG-CoA, dentro del genoma de las células de levadura reemplaza un gen por prototrofía de uracilo, el medio de cultivo celular puede contener 5-FOA (ácido 5fluoroorótico) (Boeke et al., 1987) que promueve la selección de levaduras de auxotróficas para uracilo.
Como es usado aquí, el término "eliminar un gen" se puede entender como la remoción de un gen o una o más partes de dicho gen. Después, el gen no es transcrito y no se produce producto de gen, por lo tanto no se produce polipéptido correspondiente. Se puede entender que no necesariamente todo el gen se ha removido del genoma. Preferiblemente más de 50% del gen, más preferiblemente más de 60% del gen, incluso más preferiblemente más de 70% del gen, incluso más preferiblemente más de 80% del gen, incluso más preferiblemente más de 90% del gen, incluso más preferiblemente más de 95% del gen, y lo más preferiblemente 100% del gen es eliminado. La eliminación puede ser una eliminación terminal o una eliminación de manera intercalada. Puede ser causada por un experimentador o por la naturaleza. Un gen puede ser eliminado por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, un gen puede ser eliminado por entrecruzamiento o por uso de procedimientos de crerecombinasa (Guldener et al, 1996). Más preferiblemente, el uno o más genes pueden ser eliminados como se muestra a manera de ejemplo en los ejemplos.
Como es usado aquí, el término "mutar un gen" se puede entender en el sentido más amplio como una alteración de la secuencia de ácido nucleico de dicho gen. La mutación resultante puede ser un intercambio de nucleótido individual (mutación de punto) o puede ser una mutación de desplazamiento de marco. Preferiblemente, el gen es mutado en una forma que no resulta en un producto de gen, es decir, un polipéptido, o en un polipéptido con actividad disminuida comparada con la del polipéptido de tipo silvestre. Una mutación puede ser causada por cualquier medio conocido en la técnica (por ejemplo, por radiación o agentes químicos), o por mutagénesis dirigida al sitio (por ejemplo, por PCR). La mutación puede también ocurrir espontáneamente debido a la rata de mutación que ocurre naturalmente. La mutación puede causar un desplazamiento del marco o una mutación de punto (nucleótido individual). Por ejemplo, la mutación puede ser obtenida por mutagénesis no específica, causada por un experimentador o por la naturaleza. Más preferiblemente, el uno o más genes pueden ser mutados como se muestra a manera de ejemplo en los ejemplos.
Una mutación puede ser causada por, por ejemplo, radiación (por ejemplo, radiación ultravioleta (UV), radiación de rayos X, radiación reactiva/nuclear (por ejemplo, radiación alfa, beta o gamma) o radiación cósmica) o uno o más agentes mutagénicos (por ejemplo, agente de introducción de grupo alquilo (por ejemplo, mostazas de nitrógeno (por ejemplo, por ejemplo, ciclofosfamida, mecloretamina o mustina (HN2), uramustina o mostaza de uracilo,
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células pueden ser cultivadas en condiciones adecuadas para células de levadura. A manera de ejemplo, las células de levadura pueden ser cultivadas en cultivo en suspensión o en placas tal como, por ejemplo, placas de agar. El medio de suspensión o agar puede contener nutrientes adecuados para las células de levadura tales como, por ejemplo, uno o más aminoácidos, uno o más péptidos, uno o más lípidos, una o más vitaminas, elementos de traza, y/o sales, uno o más factores de crecimiento y uno o más amortiguadores. Las células pueden ser cultivadas en condiciones aeróbicas o anaeróbicas. La temperatura puede estar en un intervalo adecuado para las células, conocido por aquellos expertos en la técnica. A manera de ejemplo para levaduras, la temperatura puede estar típicamente en el intervalo de entre 18°C y 40°C, preferiblemente entre 20°C y 37°C, más preferiblemente en el intervalo de entre 20°C y 30°C, incluso más preferiblemente en 25°C a 30°C, más preferiblemente en 30°C. El valor de pH del medio puede estar en un intervalo adecuado para la célula de levadura. Para la mayoría de células de levadura el pH adecuado puede estar en un pH neutro o ligeramente básico. Más preferiblemente, las células son cultivadas como se muestra a manera de ejemplo en los ejemplos.
Preferiblemente, el cultivo de células conduce a la reproducción de las células. La reproducción puede ocurrir desde la división celular de las células de levadura, gemación de las células de levadura, formación de esporas, formación de uno o más gametos y/o reproducción sexual. Más preferiblemente, la reproducción de las células de levadura es división celular o gemación.
El cultivo de células puede incluir el cultivo en escala de laboratorio, es decir, cultivos de varias placas de cultivo o cultivos en suspensión de varios mililitros hasta algunos litros de caldo de cultivo. Los cultivos de las células pueden incluir adicionalmente cultivos en una escala semitécnica, es decir, cultivo de cultivos en suspensión de varios litros de caldo de cultivo y cultivo en una escala industrial, es decir cultivo de cultivos en suspensión de varios litros o incluso varios metros cuadrados de caldo de cultivo. Como es usado aquí, el término "caldo de cultivo" comprende las células y el medio. Un cultivo en suspensión puede opcionalmente ser agitado o sacudido. Un cultivo en suspensión puede ser opcionalmente aireado, ventilado y/o se le puede eliminar el gas. Las células pueden ser cultivadas a una presión adecuada, la presión puede ser presión atmosférica, exceso de presión o bajo presión. Típicamente las células pueden ser cultivadas a presión atmosférica o ligero exceso de presión.
Para producción de terpeno, las células pueden ser cultivadas por cualquier tiempo, preferiblemente por lo menos 30 min, por lo menos 2 h, por lo menos 10 h, por lo menos 24 h, por lo menos 48 h, por lo menos 72 h, o incluso hasta por una semana, hasta por un mes, o hasta por varios meses. Las células pueden ser cultivadas por varias generaciones. Las células pueden ser cultivadas por más de 1 generación, por más de 5 generaciones, por más de 10 generaciones, por más de 15 generaciones, por más de 20 generaciones, por más de 25 generaciones, por más de 30 generaciones, por más de 35 generaciones, por más de 50 generaciones, por más de 100 generaciones, o incluso más.
Como es usado en el contexto de la presente invención, el término "aislamiento" en el contexto de las células se refiere, en el sentido más amplio, a la concentración de células de la presente invención. Las células pueden ser cosechadas. Las células pueden ser aisladas por cualquier método conocido en la técnica tal como, por ejemplo, centrifugación, filtración, filtración de flujo cruzado, cromatografía (por ejemplo, cromatografía de afinidad, exclusión por tamaño, intercambio iónico), o abrasión o aplicación de hisopo a una superficie sólida o una placa de cultivo. Alternativamente, las células pueden descender con el tiempo o pueden flotar debido a la formación de gases del contenedor que comprende dichas células. Alternativamente, las células no son aisladas, sino que las células y el medio son tratados adicionalmente juntos.
Las células aisladas pueden ser lavadas adicionalmente con un amortiguador o medio de cultivo adecuados. Preferiblemente, las células pueden ser lavadas por centrifugación, filtración, filtración de flujo cruzado, o cromatografía (por ejemplo, cromatografía de afinidad, exclusión por tamaño, intercambio iónico). Las células aisladas pueden ser analizadas por cualquier medio conocido en la técnica. Las células aisladas pueden ser interrumpidas, colocadas en estría sobre placas de cultivo, inoculadas en un cultivo en suspensión o pueden ser estabilizadas. Más preferiblemente, las células son aisladas como se muestra a manera de ejemplo en los ejemplos.
Como es usado en el contexto de la presente invención, el término "estabilizar" en el contexto de células se refiere, a cualquier medio de conservación de células. Preferiblemente, las células son estabilizadas en una forma que pueden ser almacenadas por un tiempo comparativamente largo y pueden ser usadas para formar un cultivo de célula viable posteriormente.
Las células pueden ser estabilizadas por congelamiento, liofilización o secado. Preferiblemente, las células son congeladas. Las células pueden ser congeladas a -20°C, -80°C, en hielo seco o en nitrógeno líquido. Preferiblemente, las células pueden ser congeladas en un medio adecuado para congelar las células de levadura. Este medio puede contener glicerol. Preferiblemente, las células pueden ser estabilizadas en amortiguadores acuosos o en agua suplementada con más de 2% (v/v), más de 5% (v/v), más de 10% (v/v), más de 20% (v/v), más de 30% (v/v), más de 40% (v/v), o más de 50% (v/v) de glicerol. A manera de ejemplo, las células de levadura
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cepa AH22tH3ura8 (que incluye regiones que codifican URA3 (véase Fig. 4D)).
1.3. Eliminación de los genes ARE1, ARE2 en la cepa AHZ2tH3ura8
El casete de eliminación con el gen marcador kanMX (que codifica para la resistencia de geniticina) se amplificó desde el plásmido pUG6 (Guldener et al., 1996) (véase figura 6) con cebadores (arelcrelox hacia delante (fw), are1crelox en reversa (rev) y are2crelox fw, are2crelox rev, respectivamente; Tabla 1) introduciendo secuencias cortas de flanque, que son homólogas al objetivo locus ARE1 y ARE2 (véase Figura 5). Los casetes de eliminación (secuencias de SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5) fueron transformados dentro de levaduras a través del método de acetato de litio descrito por Gietz et al. (Gietz, D., et al., 1992).
Después de la integración del casete dentro del locus objetivo, que conduce a una pérdida del gen correspondiente, se recuperó el gen marcador kanMX por el procedimiento de crerecombinasa (Guldener et al., 1996) con el fin de ser capaz de rehusar este marcador para eliminaciones o integraciones cromosómicas, respectivamente.
El procedimiento de crerecombinasa requiere la transformación de las cepas de levadura con el plásmido pSH47 (véase figura 6), que porta un gen para la crerecombinasa de enzima. Esta enzima es capaz de recombinar los dos sitios loxP flanqueando el gen de resistencia kanMX. Este evento de recombinación conduce a una pérdida de este gen marcador dejando un sitio loxP en el locus objetivo.
Las colonias, que han perdido el plásmido pSH47 fueron identificadas a través de selección en contador en placas con ácido 5-fluoroorótico (Guldener et al., 1996) y recogidas para propósitos de construcción adicionales o como cepas finales.
Tabla 1: Oligonucleótidos (cebador) usados para construir la cepa AH22tH3ura8∆are1∆are2
- Número
- Nombre Secuencia
- 1
- tHMG-5’ ACTATG GACCAATTGGTGAAAACTG
- 2
- tHMG-3’ AGTCACATGGTGCTGTTGTGCTT
- 3
- are1crelox fw
- 4
- are1crelox rev
- 5
- are2crelox fw
- 6
- are2crelox rev
Se prepararon 10 soluciones madre de glicerol de la cepa AH22tH3ura8∆are1∆are2. Las letras mayúsculas en la Tabla 1 representan las áreas homólogas del loci objetivo, en el que el casete de gen integrador respectivo es integrado/ha sido integrado. Estas áreas pueden ser responsables de la integración cromosómica del casete de gen en el loci objetivo (a través de recombinación homóloga; por ejemplo, ARE1 y ARE2, respectivamente). En consecuencia, estas áreas pueden estar localizadas en el inicio y en el final de un casete de integración.
Ejemplo 2
La composición neutra de lípido y los esteroles libres de las cepas construidas se evaluaron a través de cromatografía de capa delgada (TLC). Se ejecutaron la extracción de lípido completa y cromatografía de capa delgada de acuerdo al protocolo de abajo.
Análisis de TLC (cromatografía de capa delgada):
Procedimiento de cultivo:
El procedimiento de cultivo de las cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae para análisis de TLC fue:
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Viabilidad de las células del Inóculo 2: 98.6% e.) Pureza y fenotipo: Tabla 3: 50 µl de Inóculo 2 (diluido a 10-5 con agua o sin diluir como se indicó) fueron colocados en estrías en placas indicadas e incubadas por 48 h a temperaturas indicadas para determinar pureza y fenotipo (auxotrofías)
- Cepa (Inóculo 2)
- Placas Temperatura de incubación Observación
- AH22tH3ura8∆are1∆ar e2H
- YE 30°C colonias de levadura individuales (Inóculo 2 se diluyo a 10-5 antes de aplicación por estría en una placa)
- WMVIII + Ura + Leu
- 30°C colonias de levadura individuales (Inóculo 2 se diluyo a 10-5 antes de aplicación por estría en una placa)
- LB
- 37°C sin crecimiento (no diluido)
- WMVIII (sin aminoácidos)
- 30°C sin crecimiento (no diluido)
- WMVIII + Ura + His
- 30°C sin crecimiento (no diluido)
- WMVIII + Ura + His
- 30°C sin crecimiento (no diluido)
5
En el Inóculo 2 se evaluó también contaminaciones bacterianas bajo el microscopio → No se pudo detectar contaminación bacteriana.
3.3 Construcción de la cepa 2 intermedia y preparación de soluciones madre de glicerol de la cepa 2 intermedia AH22tH3ura8∆are1∆are2HL
10 Construcción (procedimiento técnico):
Se ejecuta la transformación y prueba de PCR en integración correcta del casete de expresión LEU2 dentro del locus LEU2 por medios bien conocidos en la técnica y descritos abajo.
Resultados de transformación de levadura:
La transformación fue llevada a cabo como se describe por Gietz et al. (Gietz, D., et al., 1992). La eficiencia de 15 trasformación (transformación integradora) varía entre 102-103 transformante es por µg de ADN.
La muestra 1 cultivada en una placa de control (AH22tH3ura8∆are1∆are2H y sin ADN) no conduce al crecimiento de colonia. El cultivo de muestra 2 en el que el casete AH22tH3ura8∆are1∆are2H + LEU2 fue insertado conduce a colonias con diferencias detectables.
Se recogieron 15 colonias en una placa nueva WMVIII y se incubaron por 72 h a 30°C. Se evaluaron cinco colonias
20 por PCR. La colonia más grande fue seleccionada para preparación de solución madre de glicerol. La evaluación experimental de las cinco colonias reveló que todas las cinco colonias eran usables. Todas las cinco muestras mostraron que el ADN analizado contenía el gen LEU2.
PCR:
Se obtuvo la plantilla de colonias de Transformación de Levadura, del Inóculo 2 en placas de agar nuevas. Se usan 25 PuRe Taq Ready To Go-Beads (GE Healthcare: Lot: 384777) como una polimerasa de Taq en un volumen de 25 µl.
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unidades formadoras de colonia se determinaron por colocación de estrías de una dilución apropiada del Inóculo 2 en una placa de agar WMVIII suplementada con uracilo (100 mg/L).
c.) Cámara de recuento de Thoma: dilución 1:10 del Inóculo 2
- 1.
- recuento: 33; 36; 32; 37; 39
- 2.
- recuento: 28; 37; 41; 33; 31
d.) Colonias en placa: 50 µl de una dilución 10-5 veces del Inóculo 2 aplicado en una placa WMVIII, resulto en: recuento de 142 colonias x 105 x 20 = 2.8 x 108 colonias/mL del Inóculo 2,
10 viabilidad: 2.8 x 108 x100/4.3 x 108, resultados en 65.1% Viabilidad de las células del Inóculo 2: 65.1%
e. Pureza y fenotipo:
Tabla 4: 50 µl de Inóculo 2 (diluido a 10-5 con agua o sin diluir como se indicó) fueron colocados en estrías en placas indicadas e incubadas por 48 h a temperaturas indicadas para determinar pureza y fenotipo (auxotrofías)
- Cepa (Inóculo 2)
- Placas Temperatura de incubación Observación
- AH22tH3ura8∆are1∆areHL
- YE 30°C colonias de levadura individuales (Inóculo 2 se diluyo a 10-5 antes de colocación de estría en una placa)
- WMVIII +Ura
- 30°C colonias de levadura individuales (Inóculo 2 se diluyo a 10-5 antes de colocación de estría puesto en una placa)
- LB
- 37°C sin crecimiento (no diluido)
- WMVIII (sin aminoácidos)
- 30°C sin crecimiento (no diluido)
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En el Inóculo 2 se evaluó también contaminaciones bacterianas bajo el microscopio. No se pudo detectar contaminación bacteriana.
3.4. Construcción de preparación del terreno de la cepa final de soluciones madre de glicerol de la cepa 1 final AH22tH3ura8∆are1∆are2HUL 20 Construcción (procedimiento técnico): Transformación y prueba de PCR en integración correcta del casete de expresión URA3 dentro del locus HO.
Resultados de Transformación de Levadura: La transformación fue llevada a cabo como se describe por Gietz et al. (Gietz, D., et al., 1992). La eficiencia de trasformación (transformación integradora) varía entre 102-103 transformantes por µg de ADN.
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El cultivo de muestra 1 conduce a una placa de control (AH22tH3ura8∆are1∆are2HL y sin ADN) sin crecimiento de colonia, mientras que la muestra 2 que comprende células con el casete AH22tH3ura8∆are1∆are2HL + URA 3 conduce a la formación de diferentes colonias.
Se recogieron 15 colonias y se inocularon en una placa nueva WMVIII y se incubaron por 72 h a 30°C. Se usaron
5 transformantes positivos para la reparación de soluciones madre de glicerol (colonia 6 y 8). Las colonias grandes fueron recogidas seleccionadas en otra placa, y evaluadas a través de PCR y usadas para la preparación de soluciones madre de glicerol.
PCR:
Plantilla: colonias de Transformación de Levadura
10 Cepa de levadura: AH22tH3ura8∆are1∆are2HUL
Se usó PuRe Taq Ready To Go-Beads (GE Healthcare: Lot: 384777) como una polimerasa de TAQ en un volumen de 25 µl. Las perlas fueron disueltas en 23 µl de H2O-HPLC estéril y se añadió 1 µl de cada cebador fw./ rev.(véase Tabla 6). La máquina de PCR usada fue obtenida de Flex Cycle Analytik, Jena.
Programa de PCR
- 15 1. paso:94°C 3 min
- 2.
- paso:94°C 30 seg
- 3.
- paso:51°C 30 seg, nueva temperatura de fusión por PCR
- 4.
- paso:72°C 2 min A paso 2 por 40 ciclos
- 5.
- paso:72°C 3 min
- 20 6. paso:4°C Tabla 5. Desempeño de PCR
- Muestra
- Cepa Par de cebadores de cada dirección 1 µl de 10pmol/ µl de dilución
- 1
- AH22tH3 ura8 ∆are1∆are2HUL colonia 1
- 2
- " colonia 2 5’HO fw.
- 3
- " colonia 3 3’HO rev.
- 4
- " colonia 4 Integración del casete URA 3 en locus HO, el fragmento tiene 1435 pb en caso de integración correcta, si no entonces 1902 pb
- 5
- " colonia 5
- 6
- colonia 6
- 7
- " colonia 7
- 8
- " colonia 8
- 9
- " colonia 9
- 10
- " colonia 10
- 11
- colonia 6 3’HO rev.
- 12
- " colonia 7 URA 3 Not 1 fw.
- 13
- " colonia 8
- 14
- " colonia 9
25
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-
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