WO2015121168A1 - Hefe-stamm und mikrobielles verfahren zur produktion von pentazyklischen triterpenen und/oder triterpenoiden - Google Patents

Hefe-stamm und mikrobielles verfahren zur produktion von pentazyklischen triterpenen und/oder triterpenoiden Download PDF

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Anna LEWANDOWSKI
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    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99041—Lupeol synthase (5.4.99.41)

Definitions

  • the invention relates to a yeast strain and a method for the microbial production of pentacyclic triterpenes and / or triterpenoids in yeast.
  • the invention relates to a modified yeast strain for the production of pentacyclic triterpenoids comprising at least one copy of a gene coding for an oxidosqualene cyclase, at least one copy of a gene encoding an NADPH cytochrome P450 reductase and / or at least one copy of a gene coding for a cytochrome P450 monooxygenase ,
  • Terpenoids are a group of natural products or related compounds that are structurally derived from isoprene. Of the similar terpenes, they differ in that they contain functional groups, while terpenes are pure hydrocarbons.
  • the cyclic triterpenes are a diverse group of
  • rings A to D are 6-membered and ring E is five- or six-membered.
  • Triterpenoids are nowadays usually by elaborate extraction of higher
  • Lupeol or ⁇ / ⁇ -amyrin are the most important starting substances for the
  • Biosynthesis of a variety of pentacyclic triterpenes include e.g. Betulinic, ursolic, and oleanolic acids, which are of high interest to the pharmaceutical and food industries due to their among others antibacterial, antiviral, anti-inflammatory and anti-tumor activities (Fukushima et al., 201 1, Saleem et al., 2009 ; Siddique et al., 201 1; Holanda et al., 2008; Melo et al., 201 1; Chintharlapalli et al., 201 1; Shanmugam et al., 201 1, Suzuki et al., 2002).
  • Betulinic, ursolic, and oleanolic acids which are of high interest to the pharmaceutical and food industries due to their among others antibacterial, antiviral, anti-inflammatory and anti-tumor activities (Fukushima et al., 201 1, Saleem et al.,
  • CN102433347 describes the production of the triterpenoid lupeol and betulinic acid in yeast. From Fukushima et al., 201 1 S. cerevisiae strains are known to produce oleanolic acid, ursolic acid or betulinic acid. From Huang et al., 2012 S. cerevisiae strains are known which produce between 0.045 and 0.1 mg / L oleanolic acid, ursolic acid or betulinic acid. Dai et al., 2013 describe the synthesis of the triterpenoid protopanaxadiol with overexpression of the tHMG1 gene and NADPH cytochrome P450 reductase in S.
  • betulinic acid The great interest in betulinic acid is mainly due to the therapeutic use of betulinic acid and betulinic acid derivatives against cancer or HIV (DE69908397T2, DE19713768B4, DE19713768A1, DE69634951T2, DE69633398T2).
  • the extraction of betulinic acid is nowadays carried out by extraction from higher plants, eg from the bark of Picramnia pentandra (Ruzicka et al., 1938), Arbutus menziesii (Robinson et al ., 1970) or Ziziphus mauritiana (Pisha et al., 1995) and in particular Platanus occidentalis.
  • pentacyclic triterpenes and / or triterpenoids occur in plant resources only in the form of mixtures, so that the purification of individual components is very expensive.
  • Taxol which is used in the cancer therapy
  • betulinic acid among other applications (anti-inflammatory, antibacterial, antiviral) holds the potential for use in cancer therapy.
  • the world annual demand for taxol is currently around 1000 kg (Cameron et al., 2002). However, it must be noted that taxol compared to
  • Betulinic acid is used in much lower doses for therapy.
  • this relates to a modified yeast strain for the production of pentacyclic triterpenoids comprising
  • a gene coding for an oxidosqualene cyclase comprising a sequence selected from the group comprising nucleic acids according to Accession Number AB05551 1 (SEQ ID No 1), AB025343 (SEQ ID No 2),
  • AB663343 (SEQ ID No 3), NMJ 79572 (SEQ ID No 4), AB181245 (SEQ ID No 5), DQ268869 (SEQ ID No 6), AB025345 (SEQ ID No 7), AB1 16228 (SEQ ID No 8), JQ087376 (SEQ ID No 9), HM623871 (SEQ ID No 10), AB289586 (SEQ ID No 1 1), AB055512 (SEQ ID No 12) and nucleic acid sequence variants with at least 70% sequence identity to SEQ ID No 1 to 12, or wherein the gene comprises a sequence which codes for an amino acid sequence according to SEQ ID Nos. 54 to 65, or for an amino acid sequence variant with at least 85% sequence identity to SEQ ID Nos. 54 to 65;
  • the gene comprises a sequence selected from the group comprising nucleic acids according to Accession Number AB433810 (SEQ ID No 13), X66016 (SEQ ID No 14), X69791 (SEQ ID No 15), XM_003602850 (SEQ ID No 16), NM_001 179172 (SEQ ID No 17), X66017 (SEQ ID No 18), JN594507 (SEQ ID No 19), DQ984181 (SEQ ID No 20), DQ318192 (SEQ ID No 21), AF302496 (SEQ ID No 22), AF302497 (SEQ ID No 23), AF302498 (SEQ ID No 24), L07843 (SEQ ID No 25), AF024635 (SEQ ID No 26), AF024634 (SEQ ID No 27), FJ719368 (SEQ ID No 28), FJ719369 (SEQ ID No. 29) and nucleic acid sequence variants with at least 70% sequence identity to SEQ ID No
  • the gene comprises a sequence which codes for an amino acid sequence according to SEQ ID Nos. 66 to 82, or for an amino acid sequence variant with at least 85% sequence identity to SEQ ID Nos. 66 to 82;
  • Monooxygenase wherein the gene comprises a sequence selected from the group comprising nucleic acids according to Accession Number AB619802 (SEQ ID No 30), AB619803 (SEQ ID No 31), DQ335781 (SEQ ID No 32), JN565975 (SEQ ID No 33), XM_002331391 (SEQ ID No 34), XM_003525274 (SEQ ID No 35), JF803813 (SEQ ID No 36), XM_004139039 (SEQ ID No 37), GU997666 (SEQ ID No 38), JX036032 (SEQ ID No 39), XM_002522891 ( SEQ ID No 40), AM457725 (SEQ ID No 41), XM_002265988 (SEQ ID No 42), XM_002527956 (SEQ ID No 43), BT147421 (SEQ ID No 44),
  • XM_003530477 (SEQ ID No 45), BT096613 (SEQ ID No 46), XM_002309021 (SEQ ID No 47), BT051785 (SEQ ID No 48), XM_002513137 (SEQ ID No 49), XM_002264607 (SEQ ID No 50), XM_002324633 ( SEQ ID No 51), XM_003531801 (SEQ ID No 52), XM_002280933 (SEQ ID No 53) and nucleic acid sequence variants with at least 70% sequence identity to SEQ ID No 30 to 53,
  • the gene comprises a sequence which codes for an amino acid sequence according to SEQ ID Nos. 83 to 105, or for an amino acid sequence variant with at least 85% sequence identity to SEQ ID Nos. 83 to 105.
  • the modified yeast strain according to the invention preferably comprises for the production of pentacyclic triterpenoids:
  • Oxidosqualene cyclase according to i., At least one copy of a gene for coding a NADPH cytochrome P450 reductase according to ii. and at least one copy of a gene coding for a cytochrome P450 monooxygenase according to iii.
  • the invention encompasses yeast strains comprising one of the following combinations of genes:
  • AB663343 (GuLUPI), AB433810 (LjCPRI) and DQ335781 (CYP716A12);
  • NM_179572 (AtLUPI), X66016 (ATR1) and JN565975 (CYP716AL1).
  • Triterpenoids so these are to be preferred.
  • the invention encompasses yeast strains which have an intracellular concentration of pentacyclic triterpenoids greater than 1 mg per gram of bio-dry matter, preferably greater than 2 mg per gram of bio-dry matter, CH20Y
  • the invention encompasses yeast strains which have an intracellular concentration of lupeol of preferably more than 5 mg per gram of bio-dry substance, or more preferably more than 7 mg per gram of bio-dry matter.
  • the yeast strains of the present invention are therefore characterized, in some embodiments, as having an intracellular concentration of pentacyclic triterpenoids of greater than 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 mg per gram of biosolde substance.
  • a measurement of the intracellular concentration of pentacyclic triterpenoids is readily possible for a person skilled in the art of microbiology. The following methods can be used for this: Most pentacyclic triterpenoids are hydrophobic and can accumulate in cells.
  • the cells In a first step, the cells by means of various methods such. Centrifugation, filtration, crossflow filtration, chromatography (e.g.
  • the cell pellet may be obtained in some way preferably by centrifugation, filtration or cross-flow filtration. Alternatively, the cells may decrease over time.
  • the cells may be prepared in any known manner in the art, e.g. Centrifugation, filtration or crossflow filtration.
  • the cell pellet can be dried or not dried.
  • the cells may be lysed in any known manner in the art.
  • the cells can be stimulated by mechanical action, e.g.
  • pentacyclic triterpenoids may be removed via extraction with solvents, e.g. extracted with organic solvents.
  • solvents e.g. extracted with organic solvents.
  • the organic solvent could subsequently be evaporated.
  • pentacyclic triterpenoids may be purified by chromatography methods (e.g., phase chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, size exclusion chromatography,
  • UltraHPLC High Performance Liquid Chromatography
  • FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
  • CE capillary electrophoresis
  • pentacyclic triterpenoids e.g. B in Verharen invention for the preparation of pentacyclic triterpenoids.
  • Tables 7 to 14 disclose some preferred gene combinations which, regardless of the yeast strain or type of genetic modification of the strain, give favorable yields.
  • the invention comprises yeast strains which have the following gene combinations:
  • the following genes or gene combinations may result in an intracellular concentration of lupeol greater than 10 mg per gram
  • genes or gene combinations may result in an intracellular concentration of lupeol greater than 7.5 mg per gram
  • genes or gene combinations can lead to an intracellular concentration of lupeol of more than 5 mg per gram of biosoluble substance:
  • the following genes or gene combinations may result in an intracellular concentration of betulin greater than 10 mg per gram
  • genes or gene combinations can lead to an intracellular concentration of betulin of more than 3 mg per gram of biosoluble substance:
  • genes or gene combinations can lead to an intracellular concentration of betulin of more than 1 mg per gram of biosoluble substance:
  • the following genes or gene combinations may result in an intracellular concentration of betulin aldehyde greater than 3 mg per gram
  • genes or gene combinations may result in an intracellular concentration of betulin aldehyde greater than 2 mg per gram
  • the following genes or gene combinations may result in an intracellular concentration of betulin aldehyde greater than 1 mg per gram
  • the following genes or gene combinations can lead to an intracellular concentration of betulinic acid of more than 5 mg per gram
  • the following genes or gene combinations can lead to an intracellular concentration of betulinic acid of more than 2 mg per gram
  • the following genes or gene combinations may result in an intracellular concentration of betulinic acid greater than 1 mg per gram
  • the yield of pentacyclic triterpenoids can be - alternatively to intracellular
  • Genkombinationen but proved to be advantageous if they lead to a relatively high yield of pentacyclic triterpenoid per liter of culture medium.
  • genes or gene combinations can lead to a concentration of lupeol of more than 100 mg per liter of culture medium:
  • the following genes or gene combinations can lead to a concentration of betulin of more than 50 mg per liter of culture medium: OEW CrCPR A15 AB619802
  • the following genes or gene combinations can lead to a concentration of betalaldehyde of more than 25 mg per liter of culture medium:
  • the following genes or gene combinations can lead to a concentration of betulinic acid of more than 25 mg per liter of culture medium:
  • a measurement of the concentration of the pentacyclic triterpenoids per liter of culture medium is possible without difficulty for a person skilled in the art of microbiology. The above methods can be used for this.
  • pentacyclic triterpenoids differ from triterpenes by at least one functional group.
  • compounds with functional groups are called triterpenes.
  • Such compounds also represent triterpenoids in the sense of the invention.
  • the pentacyclic triterpenes and the resulting terpenoids are classified into groups or types or series and assigned to the underlying C3o-terpan.
  • terpanoiden types include the following C3oHs2 backbones: Baueran type, Friedelan type, Gammaceran type, Glutinan type, Hopan type, Lupan type,
  • Multifloran-type, oleanan-type, 18a-oleanane-type, taraxeran-type and the Ursan-type are Multifloran-type, oleanan-type, 18a-oleanane-type, taraxeran-type and the Ursan-type.
  • the pentacyclic triterpenes and / or triterpenoids are preferably defined by a structure according to one of the formulas I, II or II I, namely: CHCH.
  • R1 Me, CH 2 OH, CH2OY 1, CH2O-X-OH, CH 2 O-X-OY 1, CH2O-XY 2, CH2O-XY 3, CH2NHY 1,
  • R2, R3 H, OH, OY 1, OX-OH, OX-OY 1, OXY 2, Y 3, NHY 1, NY 1 2, Y 3, NH-X-OH, NH-XY 2, NH- XY 3 , NH-X-OY 1 , NY 1 -X-OH, NY 1 -XY 2 , NY 1 -XY 3 or NY 1 -X-OY 1 ; provided that one of R2 or R3 is H, or that R2 and R3 are together
  • R4 H, OH, OY 1 or Y 3;
  • Y 1 H, alkyl having 1-30 C atoms, straight-chain or branched, cycloalkyl having 3-30 C atoms, alkanyl of 3-30 C atoms, oxyalkyl of 4-30 C atoms, phenylalkyl having 7-30 C atoms or phenoxyalkyl of 7-30 C atoms;
  • Y 2 NH 2 , NHY 1 or NY 1 2 ;
  • pentacyclic triterpenoids in yeast could occur on an industrial scale. Previous research on this topic did not suggest such a possibility in any way.
  • the production of pentacyclic triterpenoids in yeast is particularly advantageous because they show little or no formation of other cyclic triterpenes (apart from sterols). As these are not native metabolites of yeast, fewer forms of mixtures are formed, which makes it much easier to purify the target products.
  • the gene for encoding an oxidosqualene cyclase is preferably selected from Table 1.
  • the gene for coding a NADPH cytochrome P450 reductase is preferably selected from Table 2.
  • the gene for coding a cytochrome P450 monooxygenase is preferably selected from Table 3. Especially in the compilation These tables provide much of the inventive effort on which this application is based. There was no suggestion in the prior art for the combination of these genes.
  • the genes are preferably transformed into the yeast strain, whereby the genes are functionally linked to promoter sequences which allow the expression of these genes in yeasts.
  • the gene OSCBPW AB055511 from Betula platyphylla (var. Japonica) (Birch) has been described by Zhang et al., 2003. Birch bark contains large amounts of betulin.
  • the gene belongs to the Lupeolsynthase family.
  • OEW AB025343 from Olea europaea (olive tree) was described by Shibuya et al., 1999. OEW transformants accumulate Lupeol as an exclusive product. Also this gene belongs to the Lupeolsynthase family.
  • CYP716A15 Arabidopsis thaliana AtLUPI NM_179572 has been described by Huang et al., 2012, Husselstein-Muller et al., 2001, and Herrera et al., 1998. Huang et al. describes a co-expressed with ATR1 and CYP716AL1.
  • the gene RcLUSI DQ268869 from Ricinus communis has been described by Guhling et al., 2006 and Gallo et al., 2009. This gene is not known as part of the Lupeol synthesis family and is a highly specific LUS responsible for the production of Lupeol in Ricinus strain.
  • the TRW AB025345 gene from Taraxacum officinale was obtained in 1999 from Shibuya et al. described.
  • GgLUSI AB116228 from Glycyrrhiza glabra was discovered in 2004 by Hayashi et al. described.
  • KdLUS HM623871 from Kalanchoe daigremontiana has been described by Wang et al., 2010.
  • the gene Bglus AB289586 from Bruguiera gymnorhiza was described by Basyuni et al., 2007.
  • OSCBPY AB055512 from Betula platyphylla (var. Japonica) birch was described by Zhang et al., 2003 and Phillips et al., 2006.
  • Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana (Acker-Schmalwand) genes ATR1 X66016 and ATR2 X66017 were described by Pompon et al., 1996, Urban et al., 1997 and Urbank, 2012. Huang et al., 2012 describes co-expression of ATR1 with AtLUPI and CYP716AL1. In addition, ATR2 has a low FMN affinity (Louerat-Oriou et al., 1998).
  • NCP1 (CPR1) NM_001 179172 from Saccharomyces cerevisiae is known from
  • VrCPR L07843 gene from Vigna radiata was described by Shet et al., 1993 and Urban et al. , 1997.
  • GhCPRI FJ719368 and GhCPR2 FJ719369 from Gossypium hirsutum were described by Yang et al., 2010.
  • CYPs cytochrome P450 monooxygenases
  • Glycine max Predicted: Glycine max XM_003530477 1449
  • cytochrome P450 716B2 like LOCI 00813159
  • Vitis vinifera (grapevine) CYP716A15 AB619802 gene has been described by Fukushima et al., 201 1. Fukushima describes co-expression with GuLUPI and LjCPRI.
  • Vitis vinifera (grapevine) CYP716A17 AB619803 gene produces oleanolic acid with ⁇ -amyrin as a substrate and has been described by Fukushima et al., 201 1.
  • Fukushima et al., 201 1. Fukushima describes co-expression with GuLUPI and LjCPRI.
  • the gene CYP716A9 XM_002331391 is from Populus trichocarpa (poplar)
  • Cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00801007) XM_003525274 is derived from Glycine max (soybean) containing soybean saponins of the oleanan type.
  • CYP716A41 JF803813 from Bupleurum chinense (Chin's rabbit ear) was described by Pistelli et al., 2005, and contains oleanan-type saponins. Bupleurum flavum is also known to contain betulin and betulinic acid.
  • CYP716A52v2 JX036032 from Panax ginseng with the products erythrodiol and oleanolic acid was used by Han et al., 2013. CYP716A52v2 is a ⁇ -amyrin 28 oxidase.
  • transcript variant X1 XM_002264607 from Vitis vinifera, POPTR_0018s13390g XM_002324633 from Populus trichocarpa and cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00815640), transcript variant X1
  • Glycine max XM_003531801 were also included in Table 3.
  • genes have not yet been transformed into yeast in the prior art: X69791, XM_003602850, L07843, FJ719368, FJ719369, AB619803, XM_002331391, XM_003525274, JF803813, XM_004139039, GU997666, XM_002522891, AM457725, XM_002265988,
  • the yeast strain comprises at least one copy of a gene encoding an NADPH cytochrome P450 reductase, the gene comprising a sequence selected from the group comprising nucleic acids according to Accession Number X69791, XM_003602850, L07843, FJ719368, FJ719369, or sequence variants with analog functions. Since these sequences are not required for the production of, for example, lupeol, it was completely surprising that these gene sequences lead to a particularly high and stable yield.
  • the yeast strain comprises at least one copy of a gene coding for a cytochrome P450 monooxygenase, said gene comprising a sequence selected from the group comprising nucleic acids according to Accession Number AB619802, AB619803, DQ335781, JN565975, XM_002331391, XM_003525274, JF803813 , XM_004139039, GU997666, JX036032, XM_002522891, AM457725, XM_002265988,
  • the strain produces betulin.
  • betulin numerous pharmacological effects are described.
  • Betulin has anti-inflammatory, antibacterial, antiviral, hepatoprotective, antitumoral and cholesterol-lowering effects. Betulin is of particular interest to the scientific and pharmaceutical industries due to this broad spectrum of activity. The increased production by the yeast strains of the invention is therefore particularly significant.
  • Lupeol shows besides its antiprotozoic and antimicrobial effect as well
  • Lupeol can be used as adjuvant therapeutic. Lupeol thus also represents an interesting substance that could previously only be synthesized with great effort. The industrial production in yeast is therefore a great advantage compared to the prior art. Lupeol can then be used to prepare a large number of pharmaceutically relevant triterpenes / triterpenoids. It is particularly preferred to use Lupeol overproducing yeast strains for the production of betulin, betalaldehyde and / or betulinic acid.
  • the intermediate Lupeol or the byproduct ⁇ -amyrin are themselves molecules which, if readily available, are of great commercial interest.
  • the invention preferably relates to a "toolbox" with the aid of which an increased microbial production of pentacyclic triterpenoids, preferably betulin, betulinaldehyde and / or betulinic acid, is possible.
  • a yeast strain was first constructed, which accumulates large amounts of acetyl-CoA and / or 2, 3-Oxidosqualen due to an optimized lipid metabolism.
  • An acetyl-CoA and / or 2,3-oxidosqualene overproducing strain provides an excellent platform for the production of a variety of biologically highly active triterpenes / triterpenoids.
  • Betulinic acid was selected as the target substance as a particularly relevant pentacyclic triterpenoid from an ecological and economic point of view.
  • yeast strain produces betulin aldehyde.
  • yeast strain produce betulinic acid.
  • Betulinic acid was found to be non-toxic to eukaryotic cells and experimental animals, unlike conventional drugs.
  • the good compatibility of betulinic acid has been described in Pisha et al. (1995) against other natural products such as taxol.
  • the very good tolerability of betulinic acid was shown in studies in mice, where Medications of up to 500 mg / kg had no toxic effects (Udeani et al., 1999).
  • the pharmacological in vivo effect (mouse models) including the good tolerability of betulinic acid is described in a review by Mullauer et al. (2010) on page 8 ("Betuli never acid in vivo").
  • Betulinic acid is, inter alia, an inhibitor of melanoma and other cancer cells.
  • some derivatives of betulinic acid are currently the focus of several clinical trials in the treatment of HIV and AIDS. It is therefore a great advance in science and research that the invention can now provide betulinic acid more cheaply and easily in large quantities.
  • the amount produced is strain-dependent. This was shown, inter alia, using the example of Lupeol. Thus, the claimed strains showed particularly good results in terms of yield and purity of the products.
  • CEN.PK strains behaved differently than AH22 strains.
  • S. cerevisiae strains could be created, which allow the synthesis and enrichment of pentacyclic triterpenoids in high quantities by the extension of the Postqualenbiosynthesewegs in the yeast S. cerevisiae.
  • the yeast may be selected from the group consisting of Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces delbrückii, Saccharomyces italicus, Saccharomyces ellipsoideus,
  • Saccharomyces fermentati Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Saccharomyces paradoxus,
  • Saccharomyces pastorianus Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei,
  • Saccharomyces rouxii Saccharomyces uvarum and Saccharomyces ludwigii, and yeasts of the genus Kluyveromyces such as K. lactis K. marxianus var. Marxianus, K.
  • thermotolerans and yeasts of the genus Candida such as Candida utilis, Candida tropicalis, Candida albicans, Candida lipolytica and Candida versatilis, and yeasts of the genus Pichia such as Pichia stipidis, Piachia pastoris and Pichia sorbitophila, and yeasts of the genera Cryptococcus, Debaromyces, Hansenula, Saccharomycecopsis, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Wickerhamia, Debayomyces, Hanseniaspora, Kloeckera, Zygosaccharomyces, Ogataea, Kuraishia,
  • yeast strain is more preferably Saccharomyces cerevisiae.
  • yeast strain is a tHMG1
  • the parent strain preferably S. cerevisiae
  • An advantageous starting point for the modification is the amount of acetyl-CoA.
  • Acetyl-CoA is converted into squalene, which in turn is a precursor in triterpenoid synthesis. It is therefore desirable to provide a high level of acetyl-CoA.
  • Possibility of modification is to reduce unwanted side reactions. This can be achieved, for example, by reducing alcoldehydrogenase activity to reduce the synthesis of ethanol from acetaldehyde, e.g. by deletion of one or more of the isoenzymes Adh1, Adh3, Adh4, Adh5. Another possibility is the inactivation or repression of ACC1 (acetyl-CoA carboxylase) to reduce the synthesis of fatty acids from acetyl-CoA.
  • ACC1 acetyl-CoA carboxylase
  • the reduction in the transport of pyruvate into the mitochondria to prevent / reduce the loss of pyruvate in the citric acid cycle has been found to be advantageous by deletion / modification of MPC1, YIA6 or YEA6. It is also possible to reduce the transport of acetyl-CoA into the mitochondria by reducing the activity of the carnitine shuttle by genetically modifying the genes YAT1, YAT2 or CRC1.
  • acetaldehyde occurs, for example by reducing the Alcohol dehydrogenase activity or by reducing acetaldehyde dehydrogenase activity (ALD6).
  • APD6 acetaldehyde dehydrogenase activity
  • overexpression of the yeast's own genes pyruvate decarboxylase (PDC1, PDC5, and / or PDC6) and acetaldehyde dehydrogenase (ALD6) and acetyl-CoA synthetase (ACS1 and / or ACS2) has provided good results.
  • heterologous genes can also be used.
  • a third possibility to optimize the base strain is to increase the gene activities in the upper Stero Istoff Playweg. This can be done for example by an overexpression of the yeast genes ERG9, ERG20, ERG1, ERG8.
  • strain is a Saccharomyces cerevisiae CEN.PK.
  • yeast strain is a CEN.PK1 1 1 -61 A strain.
  • yeast strain is an AH22tH3ura8 strain.
  • the invention makes it possible to produce large quantities of betulinic acid in yeast. As a result, both the high amounts of solvents and those due to the multiple
  • a further decisive advantage is that pentacyclic triterpenes / triterpenoids occur in vegetable resources only in the form of mixtures, so that the purification of individual components is very expensive.
  • yeast there is little to no formation of other cyclic triterpenes / triterpenoids (apart from sterols) since these are not native metabolites in yeast.
  • high purity of the pentacyclic triterpenes is achieved in yeast in the synthesis of the yeast Cleaning costs for the product significantly reduced.
  • Another significant disadvantage of plant production are the fluctuations in quality and quantity of the plants or trees, which occur particularly in open-air cultivation due to unpredictable environmental influences.
  • the invention relates to a method for
  • Oxidosqualenzyklase (wherein the gene comprises a sequence selected from the group comprising nucleic acids according to Accession Number AB05551 1, AB025343, AB663343, NMJ 79572, AB181245, DQ268869,
  • NADPH cytochrome P450 reductase (wherein the gene comprises a sequence selected from the group comprising nucleic acids according to Accession
  • Cytochrome P450 monooxygenase (, wherein the gene comprises a sequence selected from the group comprising nucleic acids according to Accession
  • Particularly preferred are methods for producing a previously described modified yeast strain comprising the steps only b), b) and c), b) and d) or b), c) and d).
  • the resulting yeast strains are still to be considered as the subject of the invention.
  • the method additionally comprises the step of transformation with a vector comprising the tHMG1 gene.
  • any known vector with any possible transformation method can be used according to the invention, such.
  • the vector comprises linear DNA or circular DNA, preferably circular DNA, in particular a plasmid.
  • the vector can be introduced into the cell by any method and can preferably be transformed in combination with transfection reagents (eg lithium acetate, polyethyleneimine (PEI), Fugene, LT-1, jetPEI, transfectamine, lipofectamine, UptiFectin, PromoFectin, Geneporter, Hilymax, carbon nanofibers, carbon nanotube cell-penetrating peptides (CPP), protein transduction domains (PTDs), liposomes, DEAE-dextran, dendrimers).
  • transfection reagents eg lithium acetate, polyethyleneimine (PEI), Fugene, LT-1, jetPEI, transfectamine, lipofectamine, UptiFectin, PromoFectin, Geneporter, Hilymax, carbon nanofibers, carbon nanotube cell-penetrating peptides (CPP), protein transduction domains (PTDs), liposomes, DEAE-dextran, dendrimers).
  • Transformation may optionally be performed with electroporation, a gene gun, optical transfection, electro-transfer, impalefection, magnetofection, and / or magnet-assisted transfection.
  • the vector is a circular DNA vector, more preferably the vector is a plasmid.
  • the plasmid may be any known plasmid such as YEpH2, pUC19, pMA or pMK.
  • the vector may also be a linear expression cassette that may not be integrated into the genome of the target cell.
  • the method according to the invention is therefore characterized, in some embodiments, by the fact that the pentacyclic triterpenoids produced by the process are anti-inflammatory, inter alia.
  • this relates to a process for the preparation of pentacyclic triterpenoids, wherein a previously described modified yeast strain is used for the production.
  • Triterpenoids via a cyclic intermediate the plant genes from the groups (Tab. 1 - 3) were selected in various combinations and introduced into a suitable yeast strain.
  • Triterpenoid preferably betulin, betulinaldehyde and / or betulinic acid
  • Triterpenoid preferably betulin, betulinaldehyde and / or betulinic acid
  • Triterpenoid producing and enriching yeast strain
  • the establishment of an environmentally friendly and sustainable fermentation and purification process are provided. It is now possible to produce eg 20 g betulinic acid by means of the newly established production process.
  • the triterpene / triterpenoid manufacturing process of the invention preferably utilizes resource-conserving wastes and by-products of the sugar industry (e.g., molasses) or biodiesel production (e.g., glycerin) as substrates.
  • resource-conserving wastes and by-products of the sugar industry e.g., molasses
  • biodiesel production e.g., glycerin
  • Organic solvents can only be needed in the extraction. Due to the higher product concentration, the need for organic solvents is 70 to 90% lower than in the plane tree comparison process.
  • the new process has a higher mass index (feed masses in kg / kg of product) than the prior art reference processes.
  • CPRs NADPH cytochrome P450 reductase
  • CYPs cytochrome P450 monooxygenases
  • SEQ ID No 35 Glycine max cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00801007), mRNA, XM_003525274
  • SEQ ID No 37 Cucumis sativus cytochrome P450 716B1-like (LOC101206033), mRNA,
  • SEQ ID No 45 Glycine max cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00813159), mRNA, XM_003530477
  • Populus trichocarpa hypothetical protein (POPTR_0018s 13390g) mRNA, complete cds, XM_002324633
  • sequence identity of at least 70%, preferably 75%, 80% or 85%, particularly preferably 90% or 95% is advantageous.
  • sequence identity between two sequences can be analyzed by conventional methods, e.g. With NCBI Blast or Clustal.
  • the functionally analogous sequence variants encode the same amino acid sequences which are encoded by the explicitly mentioned sequences SEQ ID Nos. 1 to 53.
  • the invention therefore encompasses the use of nucleic acid sequences and yeast strains comprising those sequences which code for one or more of the abovementioned enzymes (preferably according to one of the sequences SEQ ID Nos. 54 to 105).
  • Nucleic acid sequences are preferably selected from the group comprising:
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence according to SEQ ID no. 1 to SEQ ID no. 53;
  • nucleic acid molecule which hybridizes with a nucleotide sequence according to a) or b) under stringent conditions (hybridization conditions are known to a person skilled in the art, and are described, for example, in Sambrook, Molecular Cloning, Ed. 1-3, Cold Spring Harbor, NY, described);
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence which has a sufficient
  • nucleic acid molecule which is degenerate as a result of the genetic code to a Nükleotidsequenz according to a) to c);
  • nucleic acid sequence provided that has sufficient sequence identity to be functionally analogous to the nucleic acid sequence according to item a), b) and / or c). In the sense of the
  • Invention means to be functionally analogous to said nucleotide sequences or sequences hybridizing to said nucleotide sequences such that the sequence variant can effectively produce the desired production of the pentacyclic triterpenoids in the same or similar amounts.
  • Functionally analogous sequences within the meaning of the invention are all sequences which the person skilled in the art can identify as having the same effect by routine experiments.
  • the present invention comprises nucleic acid sequences and their use, as well as yeast strains comprising those sequences which code for the following amino acid sequences (according to the sequences SEQ ID Nos. 54 to 105):
  • Oxidosqualene Cyclases (OSCs):
  • CPRs NADPH cytochrome P450 reductase
  • Ncp1p Sacharomyces cerevisiae S288c
  • Cytochrome P450 monooxygenases > gi
  • the invention therefore encompasses the use of nucleic acid sequences, as well as yeast strains comprising those sequences which encode proteins, which proteins have sufficient sequence identity to the abovementioned sequences (SEQ ID Nos. 54 to 105) in order to be functionally analogous to one another ,
  • amino acid sequences to be functionally analogous that the sequence variant can effectively produce the desired production of the pentacyclic triterpenoids in the same or similar amounts.
  • Functionally analogous sequences within the meaning of the invention are all sequences which the person skilled in the art can identify as having the same effect by routine experiments.
  • the sequence identity between two sequences can be analyzed by conventional methods, e.g. With NCBI Blast or Clustal.
  • FIG. 1 shows the biosynthesis of triterpenoids in S. cerevisiae. Enzymes have already been expressed in yeast and compounds detected (Moses et al., 2013). The figure shows an overview of the pre- and postsqualen biosynthetic pathway as well as the extension of the
  • oxidosqualene cyclase (OSC), NADPH cytochrome P450 reductase (CPR) and cytochrome P450 monooxygenase (CYP).
  • OSC oxidosqualene cyclase
  • CPR NADPH cytochrome P450 reductase
  • CYP cytochrome P450 monooxygenase
  • Step is cyclized 2,3-oxidosqualene by means of a multi- or monofunctional OSC.
  • the intermediate product is 3-fold oxidized by means of a CYP and CPR to arrive at the final product.
  • Figure 2 shows the pre- and Postsqualenbiosyntheseweg in the yeast S. cerevisiae and the extension of the metabolic pathway to establish the synthesis of pentacyclic
  • Triterpenoids on the example of betulinic acid.
  • the heterologous genes to be expressed for the synthesis are shown in red and are referred to as oxidosqualene cyclase (OSC), NADPH cytochrome P450 reductase (CPR) and cytochrome P450 monooxygenase (CYP).
  • OSC oxidosqualene cyclase
  • CPR NADPH cytochrome P450 reductase
  • CYP cytochrome P450 monooxygenase
  • the cyclic triterpenoids were extracted from yeast and analyzed by GC-MS.
  • strains The construction of the strains is based on the strain CEN.PK1 1 1-61 A (MATalpha; ura3-52; Ieu2-3_1 12; TRP1; his3delta1; MAL2-8C; SUC2) and on the strain AH22tH3ura8
  • Table 4 Overview of the plasmids used for the parent construction
  • the tHMG1 integration module (cADH1r-tHMG1-TRP1t-loxP-kanMX-loxP) was synthesized by GeneArt and cloned into a pMK vector via the restriction sites Asel and Pacl.
  • the tHMG1-Ger ⁇ (t truncated, shortened) codes for a shortened HMG-CoA reductase, which consists only of the catalytic subunit of the protein and thus no longer subject to the feedback inhibition by Sterolintermediate.
  • a pMK vector with kanamycin resistance was used.
  • the tHMG1 module was amplified from the pMK plasmid via PCR with the following primers:
  • the 4.5 kbp fragment contains the KanMX marker (for the resistance of Geneticin G418 in yeasts) flanked with ⁇ sites (for the recovery of the marker), the tHMG1 gene under the control of a constitutive / ADH7 promoter and TRP1 Terminator as well as homologous
  • YE medium 0.5% yeast extract; 2% glucose; pH 6.3.
  • agar plates 1.5% agar was added to the medium.
  • the glucose is prepared as a 40% glucose solution and autoclaved separately. After autoclaving, 25 ml of glucose solution are added to the medium
  • the gene GuLUPI was synthesized by GenScript codon for the yeast and cloned into a pUC57 vector via the EcoRV restriction site.
  • the pUC57 vector contains an ampicillin resistance gene and an origin of replication pMB1 for replication in E. coli.
  • the gene GuLUPI from the pUC57 plasmid was amplified by PCR with the following primers:
  • a GeneArt gene cassette was synthesized and cloned into a pMA vector via the KpnI site.
  • This gene cassette contains a CEN / ARS sequence for autonomous replication in yeast, the URA3 selection marker for yeast, MR-Seq Uenzen (URA3 recovery via selection on agar plates with 5-FOA) and flanked regions homologous to the integration locus 5 'are YHRCdelta14 and allow the genomic integration of the gene cassette into the integration locus 5 ' YHRCdelta14.
  • the pMA vector contains an ampicillin resistance gene as a selection marker for E. coli and an origin of replication Col E1 for replication in E. coli.
  • the amplified fragment (gene: GuLUPI) was cloned via the restriction sites Sacl and Notl into the pMA vector under the control of an EN01 promoter and EN01 terminator.
  • the resulting plasmid is called pTT1-GuLUP1.
  • the plasmid was transformed into competent E. coli cells. Selection was via ampicillin resistance on LB agar plates.
  • LB medium 1% casein peptone; 0.5% yeast extract; 1% NaCl; pH 7.0.
  • agar plates 1.5% agar was added to the medium.
  • Antibiotics ampicillin (Boehringer, Mannheim) 100 ⁇ g / ml
  • strain Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2U from example 1 and the strain AH22tH3ura8 were used for the episomal transformation. After transformation by means of the lithium acetate method according to Gietz et al. (1992) strains were plated for selection on WMVIII agar plates without uracil.
  • the yeasts were grown at 28 ° C and 150 rpm for 72 h on a rotary shaker.
  • CEN.PK1 1 1-61 A and CEN.PK2U are auxotrophic for uracil, histidine and leucine. Therefore, the medium was supplemented with uracil (100 mg / L), histidine (100 mg / L) and leucine (400 mg / L). In order to exert a selection pressure on a transformed plasmid, the corresponding supplement was omitted in the medium.
  • NH 4 H 2 PO 4 2.8 g of NH 4 Cl; 250 mg MgCl 2 x 6H 2 O; 100 mg CaCl 2 x 2H 2 O; 2 g of KH 2 P0 4 ; 550 mg MgSO 4 ⁇ 7H 2 O; 75 mg meso-inositol; 10 g of Na-glutamate with the following change: 50 g of glucose instead of sucrose are prepared as a 40% glucose solution and autoclaved separately.
  • Trace elements 1000x concentrated: 1.75 g ZnS0 4 x 7H 2 O; 0.5 g FeSO 4 ⁇ 7 H 2 O; 0.1 g CuSO 4 ⁇ 5 H 2 O; 0.1 g MnCl 2 x 4 H 2 O; 0.1 g NaMo0 4 x 2 H 2 0 for 1 liter.
  • Vitamin solution 250x concentrated: 2.5 g nicotinic acid; 6.25 g of pyridoxine; 2.5 g of thiamine; 0.625 g of biotin; 12.5 g of Ca-pantothenate for 1 liter.
  • agar plates 1.5% agar was added to the medium.
  • the cultivation is carried out according to Example 3.
  • Main culture transferred It can be continued directly with the extraction or the samples can also be frozen at -20 ° C and extracted at a later date.
  • Yeast strains transformed with the genes for an OSC, CPR and CYP on a pTT1 and pTT2 plasmid The extracting agent chloroform / methanol (4 + 1) is added with stigmasterol to a concentration of 50 ⁇ g / ml.
  • 800 .mu.l culture broth with 80 ⁇ 1 M HCl, 250 ⁇ glass beads (0.4-0.6 mm) and 800 .mu. ⁇ extractant are added and then shaken for 20 min in TissueLyser II at 30Hz. After subsequent centrifugation for 5 min. at 18,000 xg the organic phase is transferred to a new 1.5 ml reaction vessel.
  • the removed organic phase is evaporated under vacuum (SpeedVac, 35 ° C, 0.1 mbar, 30 min).
  • the evaporated samples are dissolved in 100 ⁇ M N-methyl-N-trimethylsilyl trifluoroacetamide (MSTFA, Sigma) and transferred to glass gelled brown GC vials.
  • MSTFA N-methyl-N-trimethylsilyl trifluoroacetamide
  • the samples are derivatized for 1 h at 80 ° C.
  • the final samples and thus the identification and quantification of cyclic triterpenes were performed by GC-MS.
  • the extracting agent chloroform / methanol (4 + 1) is added with stigmasterol to a concentration of 50 ⁇ g / ml.
  • 250 ⁇ 1M HCl 250 ⁇ glass beads and 400 ⁇ extractant are added to 250 ⁇ culture broth and then shaken for 20 min in TissueLyser I I at 30 Hz. After subsequent centrifugation for 5 min. at 18,000 x g, 250 ⁇ of organic phase are transferred to a new 1.5 ml reaction vessel. The removed organic phase is evaporated under vacuum (SpeedVac, 35 ° C, 0.1 mbar, 30 min). The evaporated samples are dissolved in 250 ⁇ L of chloroform and 100 ⁇ L are transferred to glass gelled brown GC vials. The finished samples and thus the identification and the
  • a dilution series is prepared with the respective substances.
  • the ESTDs also contain, as well as the samples, as an internal standard stigmasterol at a concentration of 50 ⁇ g / ml.
  • the ESTDs are made in chloroform.
  • the ESTDs are derivatized analogously to the samples in a brown GC vial with MSTFA for 1 h at 80 ° C. or underivatized by GC-MS.
  • GC analysis was performed on an Agilent 6890N gas chromatograph (Agilent, Waldbronn) equipped with an Agilent 7683B autosampler.
  • the detector used was an Agilent 5975 VL mass spectrometer. The following conditions were selected: The column used was a 30 m long HP-5MS column (Agilent) with an internal diameter of 0.25 mm and a film thickness of 0.25 ⁇ m. Helium served as a mobile phase.
  • the GC / MS system was run with a temperature program (150 ° C 0.5 min, 40 ° C / min to 280 ° C, 2 ° C / min to 310 ° C, 40 ° C / min to 340 ° C, 340 ° C C for 2.5min) in splitless mode.
  • the injector temperature was 280 ° C
  • the detector (MS quadrupole) 150 ° C.
  • the injection volume of the samples was 1 ⁇ .
  • the gas chromatographic analysis of the pentacyclic triterpenes is shown in Table 6.
  • the tables show the biosolde substance (BTS) as well as the volumetric and specific product yield.
  • the strains were cultured as in Example 3.
  • the produced Quantities based on the example of lupeol, betulin, betulinaldehyde and betulinic acid are strain-dependent. With the same gene combination, CEN.PK strains behave differently than AH22 strains.
  • Table 7 shows the biosynthetic substances and the magnification activities of CEN.PK1 11 -61 A and CEN.PK2U transformed with the plasmid pTT1-OEW and with the deregulated HMG-CoA reductase.
  • the strains were cultured as in Example 3, but with
  • Triterpenoid has.
  • AarelAare2 GuLUPl - - Cl. 10,43 60,96 5,84 11,90 90,37 7,59 11,82 96,74 8,1 £
  • Example 7 Yields of lupeol, betulin, betulin aldehyde and betulinic acid after episomal expression of various OSC, CPR and CYP
  • Tables 9 and 10 show the biotrass substances (BTS) and the formed concentrations of the triterpenoids lupeol, betulin, betulin aldehyde and betulinic acid after 72 h cultivation in WMVIII medium.
  • BTS biotrass substances
  • Tables 1 1, 12, 13 and 14 show the preferred combinations of genes and the respective yields (independent of yeast strain) of the pentacyclic triterpenoids.
  • Betulinic acid inhibits colon cancer cell and tumor growth and induces proteasome-dependent and -independent downregulation of specificity proteins (Sp) transcription factors.
  • CYP716A subfamily members are M ultifunctional oxidases in triterpenoid biosynthesis. Plant Cell Physiol. 201 1 Oct 28. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 22039103.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Hefe-Stamm und ein Verfahren zur mikrobiellen Produktion von pentazyklischen Triterpenen und/oder Triterpenoiden in Hefe. Insbesondere betrifft die Erfindung einen modifizierten Hefestamm zur Produktion von pentazyklischen Triterpenoiden umfassend mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Oxidosqualenzyklase, mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450 Reduktase und/oder mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Cytochrom P450 Monooxygenase.

Description

HEFE-STAMM UND MIKROBIELLES VERFAHREN ZUR PRODUKTION VON PENT AZYKLISCHEN TRITERPENEN UND/ODER TRITERPENOIDEN
Beschreibung
Die Erfindung betrifft einen Hefe-Stamm und ein Verfahren zur mikrobiellen Produktion von pentazyklischen Triterpenen und/oder Triterpenoiden in Hefe. Insbesondere betrifft die Erfindung einen modifizierten Hefestamm zur Produktion von pentazyklischen Triterpenoiden umfassend mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Oxidosqualenzyklase, mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450 Reduktase und/oder mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Cytochrom P450 Monooxygenase.
Hintergrund zur Erfindung
Terpenoide sind eine Stoffgruppe an Naturstoffen oder verwandten Verbindungen, die sich strukturell vom Isopren ableiten. Von den ähnlichen Terpenen unterscheiden sie sich darin, dass sie funktionelle Gruppen enthalten, während es sich bei Terpenen um reine Kohlenwasserstoffe handelt.
Bei den zyklischen Triterpenen handelt es sich um eine diverse Gruppe von
Sekundärmetaboliten, welche aus dem Stoffwechselweg des Squalen hervorgehen. Sie kommen hauptsächlich in Pflanzen vor und sind aufgrund ihrer biologischen (unter anderem antifungalen, antibakteriellen, antiinflammatorischen, antioxidativen, antiviralen und anti-tumorallen) Aktivitäten von hohem Interesse für die Pharma- und Lebensmittelindustrie. Eine besonders relevante Untergruppe der zyklischen Triterpene stellen die pentazyklischen Triterpene dar. Die
Grundstrukturen der pentazyklischen Triterpene bestehen aus 5-Ring-Systemen mit
unterschiedlichen Substitutionsmustern der Methyl-Gruppen; die Ringe A bis D sind hierbei 6- gliedrig und Ring E ist fünf- oder sechsgliedrig.
Triterpenoide werden heutzutage meist durch aufwendige Extraktionsverfahren aus höheren
Pflanzen gewonnen (WO 2011/074766 A2, WO 201 1/074766 A3R4, Muffler et al., 2011 ). Jedoch kommen sie in dieser Ressource nur in sehr geringen Mengen vor, so dass eine
Kommerzialisierung und Industrialisierung dieser Substanzklasse bisher kaum möglich ist (Madsen et al., 201 1 ; Fukushima et al., 201 1 ).
Des Weiteren ist die chemische Synthese von biologisch aktiven Triterpenen aufgrund der komplexen Strukturen ebenso nicht wirtschaftlich und nachhaltig.
Die mikrobielle Produktion von Triterpenen oder Triterpenoiden ist noch nicht etabliert. Dass die Synthese von pentazyklischen Triterpenoiden in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) nach heterologer Expression entsprechender Gene prinzipiell möglich ist, wurde bereits gezeigt (Moses et al., 2013).
Einige Gene, welche die Synthese von Triterpenen katalysieren, sind bereits bekannt (Fukushima et al. , 201 1 , Philips et al., 2006, Wang et al., 201 1 ). Diese Gene kodieren für Enzyme, welche die Synthese von z.B. Cycloartenol oder Lanosterol (nicht-pentazyklische Triterpene) oder Lupeol oder ß-Amyrin (pentazyklische Triterpen) katalysieren, aber auch entsprechende Folgeprodukte (Huang et al., 2012, Kirby et al., 2008).
Lupeol beziehungsweise α/β-Amyrin stellen die wichtigsten Ausgangssubstanzen für die
Biosynthese einer Vielzahl von pentazyklischen Triterpenen dar. Zu diesen Verbindungen zählen z.B. Betulin-, Ursol-, und Oleanolsäure, welche aufgrund ihrer unter anderem antibakteriellen, antiviralen, antiinflammatorischen und anti-tumoralen Aktivitäten von hohem Interesse für die pharmazeutische sowie Nahrungsmittel-Industrie sind (Fukushima et al., 201 1 ; Saleem et al., 2009; Siddique et al., 201 1 ; Holanda et al., 2008; Melo et al. , 201 1 ; Chintharlapalli et al., 201 1 ; Shanmugam et al., 201 1 , Suzuki et al., 2002).
Aus der CN102433347 ist die Produktion von dem Triterpenoid Lupeol und Betulinsäure in Hefe beschrieben. Aus Fukushima et al., 201 1 sind S. cerevisiae Stämme bekannt, die Oleanolsäure, Ursolsäure beziehungsweise Betulinsäure produzieren. Aus Huang et al., 2012 sind S. cerevisiae Stämme bekannt, die zwischen 0,045 und 0,1 mg/L Oleanolsäure, Ursolsäure beziehungsweise Betulinsäure produzieren. Aus Dai et al., 2013 ist die Synthese des Triterpenoids Protopanaxadiol mit der Überexpression des tHMG1 Gens sowie einer NADPH-Cytochrom P450 Reduktase in S. cerevisiae beschrieben. Um Squalen und 2,3-Oxidosqualen zu erhöhen, wurden folgende Gene überexprimiert: tHGMGI , ERG20, ERG9 und ERG1. In Fukushima et al., 2013 ist die Synthese der pentazyklischen Triterpenoide Soyasapogenol B, Gypsogeninsäure und 4-epi-Hederagenin in S. cerevisiae beschrieben. In Kunii et al., 2012 ist die Oxidation von beta-Amyrin zum 12,13-Epoxid in S. cerevisiae beschrieben. In Seki et al., 2008 ist die Oxidation von beta-Amyrin zum 1 1 -oxo- beta-Amyrin in S. cerevisiae mit einer Ausbeute von 1 ,6 mg/L beschrieben.
Aus Wang et al. 201 1 ist bekannt, dass etwa 50 Oxidosqualenzyklasen aus Pflanze, welche die Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen in unterschiedliche Triterpenalkohole katalysieren, mittels heterologer Genexpression in Hefe kloniert und charakterisiert wurden. Aus Kirby et al., 2008 ist ein S. cerevisiae Stamm bekannt, der eine beta-Amyrin Synthase der Pflanze Artemisia annua exprimiert und 6 mg/L des Triterpenoids beta-Amyrin produziert sowie das tHMG1 Gen exprimiert.
Es ist bekannt, dass die Überexpression der HMG-CoA-Reduktase in Hefe zur Anreicherung des Triterpens Squalen führt (Polakowski et al., 1998). Des Weiteren führen überexprimierte Gene der Ergosterol-Biosynthese zur Akkumulierung von Sterolen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae (Veen et al., 2003).
Li et al. 2013 konstruierten S. cerew's/ae-Stämme, welche das pentazyklische Triterpenoid Betulinsäure in unterschiedlichen Mengen (0,01-1 ,92 mg L"1 OD-1) produzieren. Die erzielten Mengen sind jedoch in keiner Weise ausreichend für eine Produktion im industriellen Maßstab.
Phytochemikalien wie Terpene und Sterole machen derzeit einen hohen Anteil an pflanzlich gewonnenen Wirkstoffen aus. Der jährliche Umsatz beläuft sich auf ca. 12.4 Mrd USD (Raskin et al., 2002). Besonderes großes Interesse gilt dabei der Betulinsäure, welche sich als Inhibitor von Melanom- und anderer Krebszellen erwiesen hat (Pisha et al., 1995; Sunder et al., 2000). Eine ebenso große Rolle spielen einige Derivate der Betulinsäure, welche zurzeit im Mittelpunkt verschiedener klinischer Studien zur Behandlung des HI-Virus stehen. Das große Interesse an der Betulinsäure wird vor allem durch die therapeutische Anwendung von Betulinsäure und Betulinsäure-Derivaten gegen Krebs oder HIV begründet (DE69908397T2, DE19713768B4, DE19713768A1 , DE69634951T2, DE69633398T2). Neben der veralteten und ineffizienten synthetischen Produktion (Ruzicka et al., 1938), erfolgt die Gewinnung der Betulinsaure heutzutage durch Extraktion aus höheren Pflanzen, z.B. aus der Baumrinde von Picramnia pentandra (Ruzicka et al., 1938), Arbutus menziesii (Robinson et al., 1970) oder Ziziphus mauritiana (Pisha et al., 1995) und insbesondere Platanus occidentalis. Dabei werden trotz kontinuierlicher Verbesserung der Extraktionsverfahren große Mengen an organischen Lösungsmitteln verbraucht. In der US2007/0149490A1 ist dazu eines der neuesten Verfahren beschrieben, bei dem die Betulinsaure aus der Rinde der Platane mittels chemischer Extraktion gewonnen wird. Der Druckschrift ist zu entnehmen, dass für die Gewinnung von Betulinsaure hohe Mengen an organischen Lösungsmitteln sowie große Mengen an Energie verbraucht werden.
Weiterhin kommen die pentazyklischen Triterpene und/oder Triterpenoide in pflanzlichen Ressourcen nur in Form von Gemischen vor, so dass die Aufreinigung einzelner Komponenten sehr aufwendig ist.
Zur Abschätzung des zukünftigen We Itj a hres bedarf s an Betulinsaure kann ein Vergleich mit Taxol, welches in der Krebstherapie eingesetzt wird, herangezogen werden. Auch Betulinsaure birgt, neben anderen Anwendungen (antiinflammantorisch, antibakteriell, antivirale), das Potential zur Nutzung in der Krebstherapie. Der Weltjahresbedarf an Taxol liegt derzeit bei ca. 1000 kg (Cameron et al., 2002). Allerdings muss beachtet werden, dass Taxol im Vergleich zur
Betulinsaure in weitaus geringeren Dosen zur Therapie angewendet wird.
Die Nachteile des Standes der Technik liegen somit vor allem darin, dass durch die bisher verfügbaren industriellen Verfahren zur Herstellung von Triterpenen und Triterpenoiden, insbesondere Betulinsaure hohe Mengen an Lösungsmittel und Energie notwendig sind. Es handelt sich außerdem um besonders zeitintensive und teure Herstellungsverfahren. Die beschriebenen Verfahren zur mikrobiellen Produktion erreichen derzeit keine Ausbeute, die einen industriellen Maßstab erlaubt.
Es war daher Aufgabe der Erfindung, einen Stamm und ein Verfahren zur mikrobiellen
Produktion von pentazyklischen Triterpenoiden bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe wird durch die unabhängigen Ansprüche gelöst. Besonders vorteilhafte
Ausführungsformen finden sich in den abhängigen Ansprüchen.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung betrifft diese einen modifizierten Hefestamm zur Produktion von pentazyklischen Triterpenoiden, umfassend
i. mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Oxidosqualenzyklase, wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number AB05551 1 (SEQ ID No 1 ), AB025343 (SEQ ID No 2),
AB663343 (SEQ ID No 3), NMJ 79572 (SEQ ID No 4), AB181245 (SEQ ID No 5), DQ268869 (SEQ ID No 6), AB025345 (SEQ ID No 7), AB1 16228 (SEQ ID No 8), JQ087376 (SEQ ID No 9), HM623871 (SEQ ID No 10), AB289586 (SEQ ID No 1 1 ), AB055512 (SEQ ID No 12) und Nukleinsäuresequenzvarianten mit mindestens 70% Sequenzidentität zu SEQ ID No 1 bis 12, oder wobei das Gen eine Sequenz umfasst, die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 54 bis 65, oder für eine Aminosäuresequenzvariante mit mindestens 85% Sequenzidentität zu SEQ ID No 54 bis 65, kodiert;
und/oder
ii. mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450
Reduktase, wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number AB433810 (SEQ ID No 13), X66016 (SEQ ID No 14), X69791 (SEQ ID No 15), XM_003602850 (SEQ ID No 16), NM_001 179172 (SEQ ID No 17), X66017 (SEQ ID No 18), JN594507 (SEQ ID No 19), DQ984181 (SEQ ID No 20), DQ318192 (SEQ ID No 21 ), AF302496 (SEQ ID No 22), AF302497 (SEQ ID No 23), AF302498 (SEQ ID No 24), L07843 (SEQ ID No 25), AF024635 (SEQ ID No 26), AF024634 (SEQ ID No 27), FJ719368 (SEQ ID No 28), FJ719369 (SEQ ID No 29) und Nukleinsäuresequenzvarianten mit mindestens 70% Sequenzidentität zu SEQ ID No 13 bis 29,
oder wobei das Gen eine Sequenz umfasst, die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 66 bis 82, oder für eine Aminosäuresequenzvariante mit mindestens 85% Sequenzidentität zu SEQ ID No 66 bis 82, kodiert;
und/oder
iii. mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Cytochrom P450
Monooxygenase, wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number AB619802 (SEQ ID No 30), AB619803 (SEQ ID No 31 ), DQ335781 (SEQ ID No 32), JN565975 (SEQ ID No 33), XM_002331391 (SEQ ID No 34), XM_003525274 (SEQ ID No 35), JF803813 (SEQ ID No 36), XM_004139039 (SEQ ID No 37), GU997666 (SEQ ID No 38), JX036032 (SEQ ID No 39), XM_002522891 (SEQ ID No 40), AM457725 (SEQ ID No 41 ), XM_002265988 (SEQ ID No 42), XM_002527956 (SEQ ID No 43), BT147421 (SEQ ID No 44),
XM_003530477 (SEQ ID No 45), BT096613 (SEQ ID No 46), XM_002309021 (SEQ ID No 47), BT051785 (SEQ ID No 48), XM_002513137 (SEQ ID No 49), XM_002264607 (SEQ ID No 50), XM_002324633 (SEQ ID No 51 ), XM_003531801 (SEQ ID No 52), XM_002280933 (SEQ ID No 53) und Nukleinsäuresequenzvarianten mit mindestens 70% Sequenzidentität zu SEQ ID No 30 bis 53,
oder wobei das Gen eine Sequenz umfasst, die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 83 bis 105, oder für eine Aminosäuresequenzvariante mit mindestens 85% Sequenzidentität zu SEQ ID No 83 bis 105, kodiert.
Bevorzugt umfasst den erfindungsgemäßen modifizierten Hefestamm zur Produktion von pentazyklischen Triterpenoiden:
- mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Oxidosqualenzyklase gemäß i., wobei eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450 Reduktase gemäß ii. oder eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß iii. nicht vorhanden sind (z. B. für die Produktion von Lupeol); - mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Oxidosqualenzyklase gemäß i. und mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß iii., wobei eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450 Reduktase gemäß ii nicht vorhanden ist;
- eine Kombination aus mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer
Oxidosqualenzyklase gemäß i., mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450 Reduktase gemäß ii. und mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Cytochrom P450 Monooxygenase gemäß iii.
Insbesondere umfasst die Erfindung Hefestämme, welche eine der folgenden Kombinationen von Genen umfasst:
AB025343 (OEW) XM_003602850 (MTR), AB619802 (CYP716A15)
AB025343 (OEW) XM_003602850 (MTR), AB619803 (CYP716A17)
AB025343 (OEW) XM_003602850 (MTR), XM_002331391 (CYP716A9)
AB025343 (OEW) X69791 (CrCPR), AB619802 (CYP716A15)
AB025343 (OEW) X69791 (CrCPR), XM_003525274 (Cytochrome P450 716B2-like) AB025343 (OEW) X69791 (CrCPR), XM_002331391 (CYP716A9)
AB025343 (OEW) X69791 (CrCPR), AB619803 (CYP716A17)
AB025343 (OEW) AB433810 (LjCPRI ), AB619802 (CYP716A15)
AB025343 (OEW) AB433810 (LjCPRI ), XM_004139039 (cytochrome P450 716B1-like) AB025343 (OEW) X66016 (ATR1 ) und JN565975 (CYP716AL1 )
Es ist dabei bevorzugt, dass die folgenden Kombinationen nicht gewählt werden:
- AB663343 (GuLUPI ), AB433810 (LjCPRI ) und DQ335781 (CYP716A12);
- AB663343 (GuLUPI ), AB433810 (LjCPRI ) und AB619802 (CYP716A15);
- NM_179572 (AtLUPI ), X66016 (ATR1 ) und JN565975 (CYP716AL1 ).
Die übrigen Kombinationen zeigten eine deutlich höhere Ausbeute an pentazyklischen
Triterpenoiden, sodass diese zu bevorzugen sind.
Insbesondere umfasst die Erfindung Hefestämme, welche eine intrazelluläre Konzentration an pentazyklischen Triterpenoiden von mehr als 1 mg pro Gramm Biotrockensubstanz, bevorzugt mehr als 2 mg pro Gramm Biotrockensubstanz, , CH20Y
55555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555 55555555555555555555555555555555555555555 aufweisen.
Insbesondere umfasst die Erfindung Hefestämme, die eine intrazelluläre Konzentration an Lupeol von bevorzugt mehr als 5 mg pro Gramm Biotrockensubstanz, oder weiter bevorzugt mehr als 7 mg pro Gramm Biotrockensubstanz, aufweisen. Die Hefestämme der vorliegenden Erfindung sind in einigen Ausführungsformen daher dadurch gekennzeichnet, dass sie eine intrazelluläre Konzentration an pentazyklischen Triterpenoiden von mehr als 1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 mg pro Gramm Biotrockensubstanz aufweisen.
Das technische Problem deutlich mehr pentazyklische Triterpenoide in Hefe zu produzieren, wurde gelöst indem zum einen unterschiedliche Genkombinationen gewählt wurden und zum anderen durch den Einsatz neuer Gene. Im Lichte des Standes der Technik war es völlig überraschend, dass relativ große Mengen an pentazyklischen Triterpenoiden in Hefe durch die erfindungsgemäßen Gene produziert werden können.
Eine Messung der intrazellulären Konzentration der pentazyklischen Triterpenoiden ist für einen Fachmann auf dem Gebiet der Mikrobiologie ohne Schwierigkeiten möglich. Folgende Methoden können dafür verwendet werden: Die meisten pentazyklischen Triterpenoide sind hydrophob und können in Zellen akkumulieren. In einem ersten Schritt können die Zellen mittels verschiedener Verfahren wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Crossflow-Filtration, Chromatographie (z.B.
Affinitätschromatographie, lonenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie) oder durch Abkratzen von festen Oberflächen oder Kulturplatten geernet werden. Das Zellpellet kann auf irgendeine Weise bevorzugt mittels Zentrifugation, Filtration oder Crossflow-Filtration erzielt werde. Alternativ können die Zellen mit der Zeit absinken. Optional können die Zellen auf irgendeine bekannte Weise aus dem Stand der Technik wie z.B. Zentrifugation, Filtration oder Crossflow-Filtration gewaschen werden. Das Zellpellet kann getrocknet oder nicht getrocknet werden. Die Zellen können auf irgendeine bekannte Weise aus dem Stand der Technik lysiert werden. Die Zellen können über mechanische Einwirkung wie z.B. Homogenisierung (z.B. mithilfe eines Potter oder eines Downs Homogenisators) oder mittels Druckbehandlung (z.B. mithilfe einer French-Press) oder mittels Ultraschall oder mittels Detergentien oder mittels lytischer Phagen lysiert werden. Optional können pentazyklische Triterpenoide über Extraktion mit Lösemitteln, z.B. mit organischen Lösemitteln extrahiert werden. Optional könnte das organische Lösemittel im Anschluss verdampft werden. Alternativ oder zusätzlich können pentazyklische Triterpenoide in Abhängigkeit von ihrer chemischen Natur mittels Chromatographie-Methoden (z.B. Phasen-Chromatographie, lonenaustauschchromatographie, Umkehrphasen- Chromatographie, Größenausschlusschromatographie,
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Ultra-
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC), Schnelle-Protein-Flüssigkeits- Chromatographie (FPLC)) oder mittels Elektrophorese oder mittels Kapillarelektrophorese (CE) oder mittels Destillation isoliert bzw. vermessen werden.
Die oben genannten Methoden können ebenfalls für die Produktion und Isolierung der pentazyklischen Triterpenoiden verwendet werden, z. B im erfindungsgemäßen Verharen zur Herstellung von pentazyklischen Triterpenoiden.
In den Tabellen 7 bis 14 sind einige bevorzugte Genkombinationen offenbart, die, unabhängig vom Hefestamm oder Art der genetischen Modifikation des Stammes, zu vorteilhaften Ausbeuten führen.
Insbesondere umfasst die Erfindung Hefestämme, die folgende Genkombinationen aufweisen: In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Lupeol von mehr als 10 mg pro Gramm
Biotrockensubstanz führen:
Figure imgf000009_0001
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Lupeol von mehr als 7,5 mg pro Gramm
Biotrockensubstanz führen:
Figure imgf000009_0002
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Lupeol von mehr als 5 mg pro Gramm Biotrockensubstanz führen:
Figure imgf000009_0003
OEW ATR1 B2 XM 003525274
OEW LjCPRI - A17 AB619803
OEW LjCPRI - A9 XM 002331391
OEW NCP1 B2 XM 003525274
OEW LjCPRI - A12 DQ335781
OEW CrCPR A15 AB619802
OEW NCP1 A9 XM 002331391
OEW MTR A9 XM_002331391
OEW NCP1 A17 AB619803
OEW NCP1 A15 AB619802
OEW MTR A12 DQ335781
OEW ATR1 A15 AB619802
OEW ATR1 A17 AB619803
OEW LjCPRI - A41 JF803813
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Betulin von mehr als 10 mg pro Gramm
Biotrockensubstanz führen:
Figure imgf000010_0001
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Betulin von mehr als 3 mg pro Gramm Biotrockensubstanz führen:
Figure imgf000010_0002
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Betulin von mehr als 1 mg pro Gramm Biotrockensubstanz führen:
Figure imgf000010_0003
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Betulinaldehyd von mehr als 3 mg pro Gramm
Biotrockensubstanz führen: CYP-Gen
OSC-Gen CPR-Gen CYP-Gen
Accession
OEW MTR A15 AB619802
OEW MTR A17 AB619803
OEW LjCPRI - A17 AB619803
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Betulinaldehyd von mehr als 2 mg pro Gramm
Biotrockensubstanz führen:
Figure imgf000011_0001
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Betulinaldehyd von mehr als 1 mg pro Gramm
Biotrockensubstanz führen:
Figure imgf000011_0002
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Betuli nsäure von mehr als 5 mg pro Gramm
Biotrockensubstanz führen:
Figure imgf000011_0003
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Betuli nsäure von mehr als 2 mg pro Gramm
Biotrockensubstanz führen:
Figure imgf000011_0004
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer intrazellulären Konzentration an Betulinsäure von mehr als 1 mg pro Gramm
Biotrockensubstanz führen:
Figure imgf000012_0001
Die Ausbeute der pentazyklischen Triterpenoide kann - alternativ zur intrazellulären
Konzentration im mg pro g Biotrockensubstanz - als mg pro Liter Kulturmedium ausgedruckt werden. Es kann sein, dass einige Genkombinationen zwar zur geringen intrazellulären
Konzentration von pentazyklischen Triterpenoiden pro Gramm Biotrockensubstanz aufgrund eines sub-optimalen Wachstumsrates führen. Nichtsdestotrotz können sich solche
Genkombinationen doch als vorteilhaft erwiesen, wenn sie zu einer relativ hohen Ausbeute des pentazyklischen Triterpenoids pro Liter von Kulturmedium führen.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer Konzentration an Lupeol von mehr als 100 mg pro Liter Kulturmedium führen:
Figure imgf000012_0002
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer Konzentration an Betulin von mehr als 50 mg pro Liter Kulturmedium führen:
Figure imgf000012_0003
OEW CrCPR A15 AB619802
OEW LjCPRI - A15 AB619802
OEW LjCPRI - B2 XM 003525274
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer Konzentration an Betuli naldehyd von mehr als 25 mg pro Liter Kulturmedium führen:
Figure imgf000013_0001
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können folgende Gene oder Genkombinationen zu einer Konzentration an Betuli nsäure von mehr als 25 mg pro Liter Kulturmedium führen:
Figure imgf000013_0002
Eine Messung der Konzentration der pentazyklischen Triterpenoiden pro Liter Kulturmedium ist für einen Fachmann auf dem Gebiet der Mikrobiologie ohne Schwierigkeiten möglich. Die oben genannten Methoden können dafür verwenet werden.
Im Sinne der Erfindung unterscheiden sich pentazyklische Triterpenoide von Triterpenen durch mindestens eine funktionelle Gruppe. Im Stand der Technik wird oft nicht sauber zwischen den beiden Begriffen unterschieden, so dass auch Verbindungen mit funktionellen Gruppen als Triterpene bezeichnet werden. Auch solche Verbindungen stellen Triterpenoide im Sinne der Erfindung dar.
Die pentazyklischen Triterpene und die sich daraus ableitenden Terpenoide sind in Gruppen bzw. Typen oder Reihen eingeteilt und dem zugrunde liegenden C3o-Terpan zugeordnet.
Namensgeber dieser terpanoiden Typen sind unter anderem folgende C3oHs2-Grundgerüste: Baueran-Typ, Friedelan-Typ, Gammaceran-Typ, Glutinan-Typ, Hopan-Typ, Lupan-Typ,
Multifloran-Typ, Oleanan-Typ, 18a-Oleanan-Typ, Taraxeran-Typ und der Ursan-Typ.
Die pentazyklischen Triterpene und/oder Triterpenoide sind vorzugsweise durch eine Struktur gemäß einer der Formeln I, II oder II I definiert, nämlich: C H C H .
C H .
C H
C H .
C H
C H .
C H
R L C H ,
C H . II
Figure imgf000014_0001
R1 : Me, CH2OH, CH2OY1, CH2O-X-OH, CH2O-X-OY1, CH2O-X-Y2, CH2O-X-Y3, CH2NHY1,
CH2NY1 2, CH2Y3, CH2NH-X-OH, CH2NH-X-Y2, CH2NH-X-Y3, CH2NH-X-OY1 , CH2OC(0)-OY1, CH2O-X-OY1, CO2Y1, COY3, COY2, CHO,
CH=N(CH2)m(0(CH2)m)nR4, oder CH=N(CH2)m(0(CH2)m)nY2;
R2, R3: H, OH, OY1, O-X-OH, O-X-OY1, O-X-Y2, Y3, NHY1, NY1 2, Y3, NH-X-OH, NH-X-Y2, NH- X-Y3, NH-X-OY1, NY1-X-OH, NY1-X-Y2, NY1-X-Y3 oder NY1-X-OY1; vorausgesetzt, dass eines von R2 oder R3 H ist, oder dass R2 und R3 zusammen
Carbonylsauerstoff darstellen;
R4: H, OH, OY1 oder Y3;
Y1: H, Alkyl mit 1-30 C-Atomen, geradkettig oder verzweigt, Cycloalkyl mit 3-30 C- Atomen, Alkanyl von 3-30 C-Atomen, Oxyalkyl von 4-30 C-Atomen, Phenylalkyl mit 7- 30 C-Atomen oder Phenoxyalkyl von 7-30 C-Atomen;
Y2: NH2, NHY1 oder NY1 2;
Y3: -(0(CH2)m)nR4 oder -(0(CH2)m)nY2, wobei m = 2-4 und n = 1-230;
X: -OC(CH2)pCO-, wobei p
Es war nicht zu erwarten, dass die Produktion von pentazyklischen Triterpenoiden in Hefe in einem industriellen Maßstab erfolgen kann. Bisherige Forschungsergebnisse zu diesem Thema legten eine solche Möglichkeit in keiner Weise nahe. Die Produktion von pentazyklischen Triterpenoiden in Hefe ist besonders vorteilhaft, da diese keine oder nur eine sehr geringe Bildung weiterer zyklischer Triterpene (abgesehen von Sterolen) zeigen. Da es sich hierbei nicht um native Metabolite der Hefe handelt, entstehen somit weniger Formen von Gemischen, sodass die Aufreinigung der Zielprodukte um ein Vielfaches erleichtert wird.
Das Gen zur Kodierung einer Oxidosqualenzyklase wird bevorzugt ausgewählt aus Tabelle 1. Das Gen zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450 Reduktase wird bevorzugt ausgewählt aus Tabelle 2. Das Gen zur Kodierung einer Cytochrom P450 Monooxygenase wird bevorzugt ausgewählt aus Tabelle 3. Vor allem in der Zusammenstellung dieser Tabellen liegt ein Großteil der erfinderischen Leistung auf der diese Anmeldung basiert. Im Stand der Technik gab es keinerlei Anregungen für die Kombination dieser Gene.
Die Gene werden dabei bevorzugt in den Hefestamm transformiert, wobei die Gene funktional mit Promotersequenzen verbunden sind, welche die Expression dieser Gene in Hefen erlauben.
Tabellel : Oxidosqualenzyklasen (OSCs)
Figure imgf000015_0001
Das Gen OSCBPW AB055511 aus Betula platyphylla (var. Japonica) (Birke) wurde von Zhang et al., 2003 beschrieben. Birkenrinde enthält große Mengen an Betulin. Das Gen gehört zu der Lupeolsynthase-Familie.
Das Gen OEW AB025343 aus Olea europaea (Olivenbaum) wurde von Shibuya et al., 1999 beschrieben. OEW-Transformanten häufen Lupeol als ausschließliches Produkt an. Auch dieses Gen gehört zu der Lupeolsynthase-Familie.
GuLUPI AB663343 aus Glycyrrhiza uralensis (Süßholz) wurde von Fukushima et al., 201 1 beschrieben. Fukushima beschreibt eine Co-Expression mit LjCPRI und CYP716A12 /
CYP716A15. AtLUPI NM_179572 aus Arabidopsis thaliana (Acker-Schmalwand oder auch Schotenkresse) wurde von Huang et al., 2012, Husselstein-Muller et al., 2001 und Herrera et al., 1998 beschrieben. Huang et al. beschreibt dabei eine Co-Expressed mit ATR1 und CYP716AL1.
Das Gen OSC3 AB181245 aus Lotus japonicus (Hornklee) wurde 2006 von Sawai et al.
beschrieben.
Das Gen RcLUSI DQ268869 aus Ricinus communis (Wunderbaum) wurde von Guhling et al., 2006 und Gallo et al., 2009 beschrieben. Dieses Gen ist nicht als Teil der Lupeolsynthese- Familie bekannt und stellt eine hoch spezifische LUS dar, welches für die Produktion von Lupeol in Ricinus Stamm zuständig ist. Das Gen TRW AB025345 aus Taraxacum officinale wurde 1999 von Shibuya et al. beschrieben.
Das Gen GgLUSI AB116228 aus Glycyrrhiza glabra wurde 2004 von Hayashi et al. beschrieben.
Das Gen EtLUS JQ087376 aus Eleutherococcus trifoliatus wurde 2012 von Ma et al.
beschrieben.
KdLUS HM623871 aus Kalanchoe daigremontiana wurde beschrieben von Wang et al., 2010. Das Gen BgLUS AB289586 aus Bruguiera gymnorhiza wurde von Basyuni et al., 2007 beschrieben.
OSCBPY AB055512 aus Betula platyphylla (var. Japonica) Birke wurde von Zhang et al., 2003 und Phillips et al., 2006 beschrieben.
Figure imgf000016_0001
Gossypium hirsutum GhCPRI FJ719368 2082 (cultivar CRH 2) GhCPR2 FJ719369 2133
Das Gen LjCPRI AB433810 aus Lotus japonicus (Hornklee) wurde von Seki et al., 2008 beschrieben. In Fukushima et al., 201 1 wird eine Co-Expression mit GuLUPI und CYP716A12 / CYP716A15 offenbart.
Die Gene ATR1 X66016 und ATR2 X66017 aus Arabidopsis thaliana (Acker-Schmalwand) wurden von Pompon et al., 1996, Urban et al., 1997 und Urbank, 2012 beschrieben. Huang et al., 2012 beschreibt eine Co-Expression von ATR1 mit AtLUPI und CYP716AL1. Außerdem ist über ATR2 eine niedrige FMN Affinität bekannt (Louerat-Oriou et al., 1998).
CrCPR X69791 aus Catharanthus roseus (Hundsgiftgewächse) wurde von Meijer et al., 1993 und Jensen et al., 2010 beschrieben. Das korrespondierende CYP Protein ist bekannt und wurde getestet.
Auch das korrespondierende CYP Protein von MTR_3g100160 XM_003602850 aus Medicago truncatula (Schneckenklee) ist bekannt und wurde getestet.
Das Gen NCP1 (CPR1 ) NM_001 179172 aus Saccharomyces cerevisiae ist bekannt aus
Murakami et al., 1990 und Pompon et al., 1996.
Die Gene CPR JN594507, DQ984181 und DQ318192 aus Artemisia annua wurden von Misra et al., 2012, beziehungsweise Yang et al., 2008 beziehungsweise Ro et al., 2006 beschrieben.
Die CPR Isoformen 1 (AF302496), 2 (AF302497) und 3 (AF302498) aus Hybrid poplar (Pappeln (Populus trichocarpa x Populus deltoides)) wurden von Ro et al., 2002 beschrieben.
Das Gen VrCPR L07843 aus Vigna radiata (M ungbohne) wurde von Shet et al., 1993 und Urban et al. , 1997 beschrieben.
Die Gene PcCPRI AF024635 und PcCPR2 AF024634 aus Petroselinum crispum (Petersilie) wurden 1997 von Koopmann et al. beschrieben.
Die Gene GhCPRI FJ719368 und GhCPR2 FJ719369 aus Gossypium hirsutum ((cultivar CRH 2) Baumwolle) wurden von Yang et al., 2010 beschrieben.
Tab.3: Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs)
Figure imgf000017_0001
Bupleurum chinense CYP716A41 JF803813 1449
Cucumis sativus Gurke Predicted: cytochrome XM_004139039 1452
P450 716B1-like
Panax notoginseng cytochrome P450 GU997666 1446
Panax ginseng CYP716A52v2 JX036032 1446
Ricinus communis cytochrome P450, XM_002522891 1443
putative
Vitis vinifera VITISV_041935 AM457725 1443
Vitis vinifera Predicted: cytochrome XM_002265988 1443
P450 716B2
Ricinus communis cytochrome P450, XM_002527956 1416
putative
Medicago truncatula unknown BT 147421 1440
Glycine max Predicted: Glycine max XM_003530477 1449
cytochrome P450 716B2- like (LOCI 00813159)
Glycine max unknown BT096613 1335
Vitis vinifera Predicted: cytochrome XM_002280933 1449
P450 716B2
(LOCI 00242305)
Populus trichocarpa CYP716A8 XM_002309021 1455
(POPTR_0006s08560g)
Medicago truncatula unknown BT051785 1440
Ricinus communis cytochrome P450, XM_002513137 1434
putative
Vitis vinifera cytochrome P450 716B2- XM_002264607 1458
like (LOCI 00265713)
Populus trichocarpa POPTR_0018s 13390g XM_002324633 1455
Glycine max cytochrome P450 716B2- XM_003531801 1449
like (LOCI 00815640),
transcript variant X1
Das Gen CYP716A15 AB619802 aus Vitis vinifera (Weinrebe) wurde von Fukushima et al., 201 1 beschrieben. Fukushima beschreibt eine Co-Expression mit GuLUPI und LjCPRI .
Das Gen CYP716A17 AB619803 aus Vitis vinifera (Weinrebe) produziert Oleanolsäure mit ß- Amyrin als Substrat und wurde von Fukushima et al., 201 1 beschrieben.
Das Gen CYP716A12 DQ335781 aus Medicago truncatula (Schneckenklee) wurde von
Fukushima et al., 201 1 beschrieben. Fukushima beschreibt eine Co-Expression mit GuLUPI und LjCPRI .
Das Gen CYP716AL1 JN565975 aus Catharanthus roseus (Hundsgiftgewächse) wurde von Huang et al., 2012 beschrieben. Huang beschreibt eine Co-Expression mit AtLUPI und ATRI .
Das Gen CYP716A9 XM_002331391 stammt aus Populus trichocarpa (Pappel)
Das Gen Cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00801007) XM_003525274 stammt aus Glycine max (Sojabohne), welche Soyasaponine des Oleanantyps enthält.
CYP716A41 JF803813 aus Bupleurum chinense (Chin. Hasenohr) wurde von Pistelli et al., 2005 beschrieben und enthält Saikosaponine vom Oleanantyp. Bupleurum flavum ist außerdem bekannt dafür, dass er Betulin und Betuli nsäure enthält.
Das Gen cytochrome P450 716B1 -like XM_004139039 aus Cucumis sativus (Gurke) wurde von Zhou et al., 2012 beschrieben. Ursolsäure wurde in Cucumis sativus Wurzeln identifiziert.
CYP716A52v2 JX036032 aus Panax ginseng mit den Produkten Erythrodiol und Oleanolsäure wurde von Han et al., 2013. CYP716A52v2 ist eine ß-Amyrin 28-Oxidase.
Die Gene cytochrome P450 GU997666 aus Panax notoginseng, cytochrome P450
XM_002522891 aus Ricinus communis, VITISV_041935 AM457725 aus Vitis vinifera, cytochrome P450 716B2 XM_002265988 aus Vitis vinifera, cytochrome P450, XM_002527956 aus Ricinus communis, BT147421 aus Medicago truncatula, Glycine max cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00813159) XM_003530477 aus Glycine max, BT096613 aus Glycine max, cytochrome P450 716B2 (LOCI 00242305) aus Vitis vinifera, CYP716A8 (POPTR_0006s08560g) XM_002309021 aus Populus trichocarpa, BT051785 aus Medicago truncatula, cytochrome P450, XM_002513137 aus Ricinus communis, cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00265713)
XM_002264607 aus Vitis vinifera, POPTR_0018s13390g XM_002324633 aus Populus trichocarpa und cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00815640), Transkriptvariante X1
XM_003531801 aus Glycine max wurden ebenfalls in die Tabelle 3 aufgenommen.
Die folgenden Gene wurden im Stand der Technik noch nicht in Hefe transformiert: X69791 , XM_003602850, L07843, FJ719368, FJ719369, AB619803, XM_002331391 , XM_003525274, JF803813, XM_004139039, GU997666, XM_002522891 , AM457725, XM_002265988,
XM_002527956, BT147421 , XM_003530477, BT096613, XM_002280933, XM_002309021 , BT051785, XM_002513137, XM_002264607, XM_002324633, XM_003531801. Es war daher für einen Fachmann nicht abzusehen, dass gerade diese Gene und deren Kombinationen untereinander und mit Genen für die Kodierung einer Oxidosqualenzyklase dazu führen, dass die Ausbeute der Produktion von Triterpenoiden in Hefen um ein Vielfaches gesteigert werden konnte.
Es ist bevorzugt, dass der Hefestamm mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450 Reduktase umfasst, wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number X69791 , XM_003602850, L07843, FJ719368, FJ719369, oder Sequenzvarianten mit analogen Funktionen. Da diese Sequenzen für die Produktion von beispielsweise Lupeol nicht erforderlich sind, war es völlig überraschend, dass diese Gensequenzen zu einer besonders hohen und stabilen Ausbeute führen.
Es ist außerdem bevorzugt, dass der Hefestamm mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Cytochrom P450 Monooxygenase umfasst, wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number AB619802, AB619803, DQ335781 , JN565975, XM_002331391 , XM_003525274, JF803813, , XM_004139039, GU997666, JX036032, XM_002522891 , AM457725, XM_002265988,
XM_002527956, BT147421 , XM_003530477, BT096613, XM_002280933, XM_002309021 , BT051785, XM_002513137, XM_002264607, XM_002324633, XM_003531801.
Überraschenderweise lieferte der Einsatz dieser Gene in Kombination mit einem beliebigen Gen aus Tabelle 1 und Tabelle 2, bevorzugt jedoch X69791 , XM_003602850, L07843, FJ719368, FJ719369, besonders gute Ergebnisse in Hinblick auf die Ausbeute und die Wachstums rate der Hefen.
Weiterhin bevorzugt ist, dass der Stamm Betulin produziert. Für Betulin sind zahlreiche pharmakologische Wirkungen beschrieben. Betulin wirkt unter anderem antientzündlich, antibakteriell, antiviral, hepatoprotektiv, antitumoral und außerdem cholesterinsenkend. Durch dieses breite Wirkspektrum ist Betulin für die Wissenschaft und die Pharmaindustrie von besonderem Interesse. Die gesteigerte Produktion durch die Hefe-Stämme der Erfindung ist daher besonders bedeutsam.
Es kann auch bevorzugt sein, dass eine vermehrte Anreicherung der Vorstufe Lupeol erzielt wird. Dies kann durch eine entsprechende Wahl der zu transformierenden Gene erreicht werden. Lupeol zeigt neben seiner antiprotozoischen und antimikrobiellen Wirkung auch
entzündungshemmende Eigenschaften sowie eine Wachstumshemmung von Tumorzellen.
Außerdem kann Lupeol als adjuvantes Therapeutikum eingesetzt werden. Lupeol stellt damit ebenfalls einen interessanten Stoff dar, der bisher nur mit großem Aufwand synthetisiert werden konnte. Die industrielle Herstellung in Hefe stellt daher einen großen Vorteil im Vergleich zum Stand der Technik dar. Von Lupeol aus lassen sich dann eine Vielzahl pharmazeutisch relevanter Triterpene/Triterpenoide herstellen. Es ist besonders bevorzugt Lupeol überproduzierende Hefestämme für die Herstellung von Betulin, Betuli naldehyd und/oder Betuli nsäure zu verwenden. Das Zwischenprodukt Lupeol oder auch das Nebenprodukt ß- Amyrin sind selber Moleküle, die, wenn einfach zugänglich, kommerziell hoch interessant sind.
Die Erfindung betrifft bevorzugt eine„Toolbox" mit deren Hilfe eine erhöhte mikrobielle Produktion von pentazyklischen Triterpenoiden, bevorzugt Betulin, Betulinaldehyd und/oder Betulinsäure, möglich ist. Ein„Werkzeug" ist dabei die Stammkonstruktion. Hierbei wurde zunächst ein Hefestamm konstruiert, welcher aufgrund eines optimierten Lipidstoffwechsels große Mengen an Acetyl-CoA und/oder 2, 3-Oxidosqualen anreichert. Ein Acetyl-CoA und/oder 2, 3-Oxidosqualen überproduzierender Stamm stellt eine hervorragende Plattform für die Produktion einer Vielzahl biologisch hochaktiver Triterpene/Triterpenoide dar. Als ein aus ökologischer und ökonomischer Sicht besonders relevantes pentazyklisches Triterpenoid wurde Betulinsäure als Zielsubstanz ausgewählt. Ausgehend von einem Acetyl-CoA- und/oder 2, 3-Oxidosqualen-produzierenden Plattformstamm wurden daher mit dem zweiten„Werkzeug", dem Einsatz der ausgewählten Gene aus den Tabellen 1 , 2 und 3 und vor allem deren Kombination, weitere biosynthetische Stoffwechselenzyme zwecks der Überproduktion von Betulinsäure exprimiert.
Es ist besonders bevorzugt, dass der Hefestamm Betulinaldehyd produziert.
Außerdem bevorzugt ist, dass der Hefestamm Betulinsäure produziert.
Betulinsäure erwies sich im Gegensatz zu herkömmlichen Wirkstoffen als nicht-toxisch für eukaryotische Zellen und Versuchstiere. Die gute Verträglichkeit von Betulinsäure wurde in Pisha et al. (1995) gegenüber anderen Naturstoffen wie Taxol hervorgehoben. In späteren Arbeiten konnte die sehr gute Verträglichkeit von Betulinsäure in Studien an Mäusen gezeigt werden, wo Medikationen von bis zu 500 mg/kg keine toxischen Effekte hatte (Udeani et al., 1999). Die pharmakologische in vivo Wirkung (Mausmodelle) inklusive der guten Verträglichkeit von Betuli nsäure ist in einem Übersichtsartikel von Mullauer et al. (2010) auf Seite 8 („Betuli nie acid in vivo") beschrieben.
Betulinsäure ist unter anderem ein Inhibitor von Melanom- und anderer Krebszellen. Außerdem stehen einige Derivate der Betulinsäure zurzeit im Mittelpunkt verschiedener klinischer Studien zur Behandlung von HIV und AIDS. Es ist daher ein großer Fortschritt für die Wissenschaft und Forschung, dass durch die Erfindung Betulinsäure nun in großen Mengen kostengünstiger und einfacher bereitgestellt werden kann.
Durch die ausgewählten Genkombinationen durch jeweils ein Gen aus Tabelle 1 , 2 und 3, welche teilweise neue Gene enthalten, die zuvor noch nicht in Hefen eingesetzt wurden, konnten überraschenderweise deutlich höhere Konzentrationen an pentazyklischen Triterpenoiden produziert werden.
Überraschenderweise ist die produzierte Menge stammabhängig. Dies wurde unter anderem am Beispiel von Lupeol gezeigt. So zeigten die beanspruchten Stämme besonders gute Ergebnisse in Bezug auf Ausbeute und Reinheit der Produkte.
Mit der gleichen Genkombination verhielten sich CEN.PK-Stämme zum Beispiel anders als AH22-Stämme.
Durch gezielte genetische Modifikationen konnten S. cerevisiae Stämme erstellt werden, die durch die Erweiterung des Postsqualenbiosynthesewegs in der Hefe S. cerevisiae die Synthese und Anreicherung von pentazyklischen Triterpenoiden in hohen Mengen ermöglichen.
Die Hefe kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces delbrückii, Saccharomyces italicus, Saccharomyces ellipsoideus,
Saccharomyces fermentati, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Saccharomyces paradoxus,
Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei,
Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum und Saccharomycodes ludwigii, sowie Hefen der Gattung Kluyveromyces wie K. lactis K. marxianus var. marxianus, K. thermotolerans, sowie Hefen der Gattung Candida wie Candida utilis, Candida tropicalis, Candida albicans, Candida lipolytica und Candida versatilis, sowie Hefen der Gattung Pichia wie Pichia stipidis, Piachia pastoris und Pichia sorbitophila, sowie Hefen der Gattungen Cryptococcus, Debaromyces, Hansenula, Saccharomycecopsis, Saccharomycodes, Schizosaccharomyces, Wickerhamia, Debayomyces, Hanseniaspora, Kloeckera, Zygosaccharomyces, Ogataea, Kuraishia,
Komagataella, Metschnikowia, Williopsis, Nakazawaea, Cryptococcus, Torulaspora, Bullera, Rhodotorula, Yarrowia, Willopsis und Sporobolomyces.
Außerdem handelt es sich bei dem Hefestamm besonders bevorzugt um Saccharomyces cerevisiae.
Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, dass der Hefestamm eine tHMG1
Expressionskassette umfasst. Es hat sich gezeigt, dass durch die Modifikation von Genen des Prä- und
Postsqualenbiosynthesewegs eine weitere Verbesserung der Ausbeute erzielt werden kann. Dabei wurden Gene des Prä- und Postsqualenbiosynthesewegs entweder überexprimiert, herunterreguliert, inhibiert beziehungsweise deletiert, um letztlich die Produktion von
pentazyklischen Triterpenoiden zu erhöhen.
Im Sinne der Erfindung kann der Basisstamm, bevorzugt S. cerevisiae, auf unterschiedliche Weisen modifiziert sein, um zusätzlich zu einer erhöhten Produktion von Triterpenoiden zu führen. Eine vorteilhafte Ansatzstelle zur Modifikation ist die Menge von Acetyl-CoA. Acetyl-CoA wird zu Squalen umgesetzt, was wiederum eine Vorstufe in der Triterpenoidsynthese darstellt. Es ist daher wünschenswert eine hohe Menge an Acetyl-CoA zur Verfügung zu stellen. Eine
Möglichkeit der Modifikation ist es, unerwünschte Nebenreaktionen zu verringern. Dies kann zum Beispiel über die Reduktion der Alcoholdehydrogenase-Aktivität zur Verringerung der Synthese von Ethanol aus Acetaldehyde, z.B. durch Deletion eines oder mehrerer der Isoenzyme Adh1 , Adh3, Adh4, Adh5, geschehen. Eine weitere Möglichkeit ist die Inaktivierung oder Repression von ACC1 (Acetyl-CoA Carboxylase) zur Verringerung der Synthese von Fettsäuren aus Acetyl- CoA.
Vorteilhaft ist außerdem die Reduktion der Fettsäure Biosynthese durch Verringerung der Expression von FAS1 und/oder FAS2 oder die Reduktion des Glyoxylatzyklus durch Modifikation mindestens eines der Gene CIT2, ICL1 , MLS1 , MDH3, HAP2, HAP3, HAP4 und HAP5. Der Fachmann weiß, wie diese Gene modifiziert werden können, um zu dem gewünschten Ergebnis zu gelangen ohne selbst erfinderisch tätig zu werden.
Im Sinne der Erfindung kann die außerdem eine Reduktion der Pyruvat-Dehydrogenase Aktivität durch Modifikation der Untereinheiten des PDH-Komplexes PDA1 , PDB1 , LAT1 , LPD1 und PDX1 erfolgen.
Außerdem hat sich die Reduktion des Transportes von Pyruvat in die Mitochondrien um den Verlust von Pyruvat in den Citratzyklus zu verhindern/verringern, durch Deletion/Modifikation von MPC1 , YIA6 oder YEA6 als vorteilhaft erwiesen. Es ist weiterhin möglich eine Reduktion des Transportes von Acetyl-CoA in die Mitochondrien durch die Verringerung der Aktivität des Carnithin-Shuttles durch genetische Modifikation der Gene YAT1 , YAT2 oder CRC1 zu erzielen.
Durch die genannten Modifikationen werden unerwünschte Nebenreaktionen unterdrückt, sodass die Produktion von pentazyklischen Triterpenoiden unter optimierten Bedingungen ablaufen kann und somit eine höhere Ausbeute erzielt wird. Neben der Unterdrückung von Nebenreaktionen ist es außerdem möglich, eine Erhöhung der cytosolischen Acetyl-CoA Konzentration zu bewirken. Acetyl-CoA stellt den Baustein für die Synthese von Lipiden i.A. dar, sodass eine große Menge von Acetyl-CoA wünschenswert ist. Eine Möglichkeit stellt die heterologe Expression einer acetylierenden Acetyl-CoA Synthase (EC 1.2.1.10), welche cytosolisches Acetaldehyd in Acetyl-CoA umwandelt, dar. Dabei ist es zusätzlich bevorzugt, wenn es zu einer gleichzeitigen Anreicherung von Acetaldehyd kommt, beispielsweise durch Verringerung der Alcoholdehydrogenase-Aktivität oder durch Verringerung der Acetaldehyd-Dehydrogenase Aktivität (ALD6). Auch eine Überexpression der hefeeigenen Gene Pyruvat-Decarboxylase (PDC1 , PDC5, und/oder PDC6) und Acetaldehyd-Dehydrogenase (ALD6) und Acetyl-CoA Synthetase (ACS1 und/oder ACS2) hat gute Ergebnisse geliefert. Alternativ können auch heterologe Gene verwendet werden.
Eine dritte Möglichkeit den Basisstamm zu optimieren, stellt die Erhöhung der Genaktivitäten im oberen Stero Istoffwechselweg dar. Dies kann zum Beispiel durch eine Überexpression der hefeeigenen Gene ERG9, ERG20, ERG1 , ERG8 erfolgen.
Auch möglich ist die Verringerung der Genaktivitäten im unteren Stero Istoffwechselweg. Hier hat sich die Reduktion und/oder Eliminierung der Aktivität von ERG7 als besonders vorteilhaft erwiesen.
Es ist außerdem bevorzugt, alle heterologen Gensequenzen in codon-optimierter Form zu verwenden, um eine hohe Expression zu erreichen. Ein Fachmann ist in der Lage dies umzusetzen, ohne dabei selbst erfinderisch tätig zu werden.
In Sinne der Erfindung können die oben aufgezählten Modifikationsmöglichkeiten auch miteinander kombiniert werden, um zu weiteren bevorzugten Stämmen zu gelangen.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass der Stamm ein Saccharomyces cerevisiae CEN.PK ist.
Es ist außerdem bevorzugt, dass der Hefestamm ein CEN.PK1 1 1 -61 A Stamm ist.
Es ist außerdem bevorzugt, dass der Hefestamm ein AH22tH3ura8 Stamm ist.
Die Erfindung macht es möglich, große Mengen an Betulinsäure in Hefe zu produzieren. Dadurch können sowohl die hohen Mengen an Lösungsmitteln sowie die aufgrund der mehrfachen
Destillationsschritte große Mengen an Energie, die im Stand der Technik zur Produktion benötigt werden, eingespart werden. Neben diesen ökologisch relevanten Fakten ist die Gewinnung aus Baumrinden nicht wirtschaftlich und nachhaltig, da diese Bäume nicht für die Kultivierung in Plantagen geeignet sind. Des Weiteren wirft ein 20 Jahre alter Baum mit einer Höhe von 10 m nur einige Kilogramm der Rinde pro Jahr ab. Für die Gewinnung von 1 kg Betulinsäure müsste die Jahresproduktion an Borke von ca. 30 Platanen-Bäumen aufgearbeitet werden. Sofern eine Kultivierung in Plantagen möglich wäre, würde man eine Nutzfläche von mindestens 300 Quadratmetern für die Produktion von 1 kg Betulinsäure benötigen. Die tatsächliche Fläche ist aber weitaus höher, da eine Plantagenkultivierung der Platanen nicht möglich ist. Durch die Erfindung konnte eine Produktkonzentration von beispielsweise 10 % und mehr bezogen auf die Biotrockensubstanz erreicht werden. Man würde daher eine Nutzfläche von nur ca. 20
Quadratmetern pro kg Betulinsäure (für Zucker) mit dem neuen biotechnologischen Verfahren benötigen. Mit dem herkömmlichen Verfahren aus Weidenrinde wird ein Vielfaches der Fläche von 300 Quadratmetern pro kg Betulinsäure benötigt.
Ein weiter entscheidender Vorteil ist, dass pentazyklische Triterpene/Triterpenoide in pflanzlichen Ressourcen nur in Form von Gemischen vorkommen, so dass die Aufreinigung einzelner Komponenten sehr aufwendig ist. Im Gegensatz dazu kommt es in Hefe nur zu einer sehr geringen bis keiner Bildung weiterer zyklischer Triterpene/Triterpenoide (abgesehen von Sterolen), da diese keine nativen Metabolite in Hefe darstellen. Dadurch wird in Hefe bei der Synthese eine hohe Reinheit der pentazyklischen Triterpene erreicht, was die Aufreinigungs kosten für das Produkt deutlich verringert. Ein weiterer wesentlicher Nachteil der pflanzlichen Produktion sind die besonders bei Freiluftkultivierungen auftretenden Schwankungen in Qualität und Quantität der Pflanzen beziehungsweise Bäume aufgrund von unvorhersehbaren Umwelteinflüssen. Gerade für die pharmazeutische Industrie stellt dies häufig ein Problem dar, weil eine konstante Rohstoffqualität eine entscheidende Bedeutung für die spätere Qualität des Produktes hat. Zudem können Ernteausfälle zu massiven Engpässen des Produktes führen. Ein bemerkenswertes Beispiel dazu, ist die im Jahre 2005 infolge von Ernteausfällen und fehlenden alternativen Ressourcen aufgetretene Knappheit des Antimalaria Wirkstoffes Artemisinin, was zu einer dramatischen Unterversorgungen in der dritten Welt geführt hat (McNeil et al. , 2004). All diese Probleme werden durch die Stämme der Erfindung gelöst.
Durch den Einsatz eines mikrobiellen Herstellungsverfahrens können in hohem Maße
Ressourcen gespart werden. Einerseits werden natürliche Pflanzenressourcen geschützt und Limitierungen durch begrenztes Vorkommen der Ressourcen werden aufgehoben. Weiter werden Aufarbeitungshilfsmittel gespart, da in Hefe höhere Konzentrationen und höhere Reinheiten zu erwarten sind. Hinzu kommt, das umweltbelastende und teure Aufreinigungsverfahren ersetzt werden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung eines zuvor beschriebenen modifizierten Hefestamms umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellung eines Saccharomyces cerevisiae Stamms,
b) Transformation mit einem Vektor umfassend ein Gen zur Kodierung einer
Oxidosqualenzyklase, (wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number AB05551 1 , AB025343, AB663343, NMJ 79572, AB181245, DQ268869,
AB025345, AB1 16228, JQ087376, H M 623871 , AB289586, AB055512) und/oder, c) Transformation eines Vektors umfassend ein Gen zur Kodierung einer
NADPH-Cytochrom P450 Reduktase (wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession
Number AB433810, X66016, X69791 , XM_003602850, NM_001 179172, X66017, JN594507, DQ984181 , DQ318192, AF302496, AF302497, AF302498, L07843, AF024635, AF024634, FJ719368, FJ719369),
und/oder
d) Transformation eines Vektors umfassend ein Gen zur Kodierung einer
Cytochrom P450 Monooxygenase(, wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession
Number AB619802, AB619803, DQ335781 , JN565975, XM_002331391 ,
XM_003525274, JF803813, XM_004139039, GU997666, JX036032, XM_002522891 , AM457725, XM_002265988, XM_002527956, BT147421 , XM_003530477, BT096613, XM_002309021 , BT051785, XM_002513137, XM_002264607. XM_002324633, XM_003531801 , XM_002280933.) Besonders bevorzugt sind Verfahren zur Herstellung eines zuvor beschriebenen modifizierten Hefestamms umfassend die Schritte nur b), b) und c), b) und d) oder b), c) und d). Die daraus resultierenden Hefestämme sind weiterhin als Gegenstand der Erfindung zu betrachten.
Es ist bevorzugt, dass das Verfahren zusätzlich den Schritt der Transformation mit einem Vektor umfassend das tHMG1-Gen umfasst.
Als Vektor kann jeder bekannte Vektor mit jedem möglichen Transformationsverfahren erfindungsgemäß eingesetzt werden, wie z. B. einem linearen Vektor, einem zirkulären Vektor, einem viralen Vektor oder einem bakteriellen Vektor. Vorzugsweise umfasst der Vektor lineare DNA oder zirkuläre DNA, bevorzugte zirkuläre DNA, insbesondere ein Plasmid. Der Vektor kann durch ein beliebiges Verfahren in die Zelle eingebracht und kann bevorzugt in Kombination mit Transfektionsreagenzien transformiert werden (z. B. Lithiumacetat, Polyethylenimin (PEI), Fugene, LT-1 , jetPEI, transfectamine, Lipofectamin, UptiFectin, PromoFectin, Geneporter, Hilymax, Kohlenstoff-Nanofasem, Kohlenstoff-Nanoröhren zellpenetrierenden Peptide (CPP), Proteintransduktionsdomänen (PTDs ), Liposomen, DEAE-Dextran, Dendrimere). Die
Transformation kann optional mit Elektroporation, einer Genkanone, optische Transfektion, Elektrotransfer, impalefection, Magnetofektion und/oder Magnet-unterstützte Transfektion durchgeführt werden.
Vorzugsweise ist der Vektor ein zirkulärer DNA-Vektor, besonders bevorzugt ist der Vektor ein Plasmid. Das Plasmid kann jedes bekanntes Plasmid sein, wie zB YEpH2, pUC19, pMA oder pMK. Der Vektor kann auch eine lineare Expressionskassette sein, die möglicherweise nicht in das Genom der Zielzelle integriert werden kann.
Es war außerdem die Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu entwickeln, welches die mikrobielle Produktion von deutlich mehr pentazyklischen Triterpenoiden in Hefe ermöglicht. Das
erfindungsgemäße Verfahren ist daher in einigen Ausführungsformen dadurch gekennzeichnet, dass die durch das Verfahren produzierten pentazyklischen Triterpenoiden n ter anderem antientzündlich,
2323232323232323232323232323232323232323232323232323232323232323232323232323 2323232323232323232323232323232323232323232323232323232323232323232323232323 2323232323232323232323232323232323232323 eine intrazelluläre Konzentration von mehr als 1 , 2, 3, 4, oder 5 mg pro Gramm Biotrockensubstanz aufweisen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur Herstellung von pentazyklischen Triterpenoiden, wobei ein zuvor beschriebener modifizierter Hefestamm für die Produktion verwendet wird.
Für die heterologe Genexpression in Hefe und somit die Synthese von pentazyklischen
Triterpenoiden über ein zyklisches Zwischenprodukt wurden die Pflanzen-Gene aus den Gruppen (Tab. 1 - 3) in verschiedenen Kombinationen gewählt und in einen geeigneten Hefestamm eingebracht.
Ein wichtiger Vorteil der Erfindung liegt darin, dass ein besonders umweltschonender
Produktionsprozess zur mikrobiellen Produktion von pentazyklischen Triterpenoiden bereitgestellt wurde. Durch die Erfindung konnte somit neben der Konstruktion eines pentazyklischen
Triterpenoid (bevorzugt Betulin, Betulinaldehyd und/oder Betulinsäure) produzierenden und anreichernden Hefestammes, auch die Etablierung eines umweltschonenden und nachhaltigen Fermentations- und Aufreinigungsprozesses zur Verfügung gestellt werden. Es ist somit nun möglich z.B. 20 g Betuli nsäure mittels des neu etablierten Produktionsprozesses zu produzieren.
Durch den Triterpen/Triterpenoid-Herstellungsprozess der Erfindung werden bevorzugt ressourcenschonende Abfallstoffe und Nebenprodukte der Zuckerindustrie (z.B. Melasse) oder Biodieselproduktion (z.B. Glycerin) als Substrate genutzt. Zur Isolation der Betuli nsäure wurde ein bereits etabliertes und umweltschonendes Autolyseverfahren an den Prozess adaptiert.
Anstelle von organischen Lösungsmitteln wird im neuen Verfahren zum Großteil mit Wasser gearbeitet, was den Prinzipien der Grünen Chemie entspricht. Es werden für die Produktion von 1 kg Betulinsäure ca. 2000 Liter Wasser eingesetzt. Wasser ist aus ökologischer,
ökotoxikologischer und gesundheitlicher Sicht verträglicher als organische Lösungsmittel.
Organische Lösungsmittel können lediglich bei der Extraktion benötigt werden. Aufgrund der höheren Produktkonzentration ist der Bedarf an organischen Lösungsmitteln um 70 bis 90% geringer als beim Platanen-Vergleichsprozess.
Ungeachtet der ökologischen Vorteile, kann außerdem festgehalten werden, dass das neue Verfahren einen höheren Massenindex (Einsatzmassen in kg/kg Produkt) aufweist als die Referenzverfahren aus dem Stand der Technik.
Die Erfindung zeigt vor allem die folgenden Vorteile:
Vermeidung von direktem Eingriff in die Natur durch Gewinnung der Rinde
- Verringerung von Transportwegen durch zentrale Produktion ohne aufwändige
Bio massebeschaff ung
Verwendung von Abfall- oder Nebenprodukte als Substrat (Nebenprodukte der
Zuckerindustrie oder der Biodiesel-Produktion)
Hohe Raum-Zeit-Ausbeute und dadurch geringe Umweltbelastung (durch geringen Energieverbrauch da kleine Reaktorvolumina)
Hohe und einstellbare Produktkonzentration erlaubt geringen organischen
Lösungsmittelverbrauch
Hohe und konstante Qualität des Produktes durch Unabhängigkeit von Umwelteinflüssen
Einfache Produktion und Genehmigung des Verfahrens durch Wahl des industriell etablierten Wirtes Saccharomyces cerevisiae
Einfache Möglichkeit auf schwankende oder steigende Nachfrage zu reagieren
Die folgenden Gensequenzen werden besonders bevorzugt für die Kodierung von
Oxidosqualenzyklasen (OSCs) eingesetzt:
SEQ ID No 1. Betula platyphylla OSCBPW mRNA für Lupeolsynthase, complete cds, AB05551 1 ATGTGGAAGTTGAAGATAGCGGAAGGAGGGCCAGGGCTGGTGAGCGGAAATGATTTCATCGGG CGGCAACACTGGGAATTCGACCCGGATGCCGGCACTCCCCAAGAGCGTGCTGAAGTTGAAAAG GTCCGGGAGGAGTTCACCAAAAATCGGTTTCAGATGAAACAAAGCGCTGATCTTTTGATGAGGAT GCAGCTTAGGAAGGAGAACCCATGCCAACCAATTCCACCACCAGTGAAAGTGAAAGAAACAGAG GTGATAACAGAGGAAGCAGTGATTACTACACTGAGAAGATCACTAAGCTTTTATTCCTCCATTCAA GCTCATGATGGCCACTGGCCTGGTGAATCTGCTGGCCCCTTGTTTTTCCTTCAACCCTTTGTAAT GGCATTATACATCACTGGAGATCTCAATACTATTTTTTCCCCAGCACACCAGAAGGAAATTATTCG ATACTTGTATAATCATCAGAACGAAGATGGAGGCTGGGGGTTCCATATAGAGGGTCACAGCACAA TGTTTGGGTCAGCTTTGAGCTACATTGCCTTGAGAATACTTGGAGAGGGACTTGAAGATGGTGAA GATGGG GCTATG GCTAAAAGCCG G AAATGG ATTCTTGACCATG GTGGTTTAGTGGCTATTCCTTC ATGGGGAAAGTTTTGGGTCACGGTACTGGGACTGTATGAGTGGTCAGGCTGCAATCCACTGCCC CCAGAGTTCTGGTTTCTTCCTGATATCTTTCCCATACATCCAGGTAAAATGTTATGCTACTGTCGC TTGGTTTACATGCCAATGTCTTATTTATATGGGAAGAGGTTTGTTGGTCCAATCACTGGATTGATT CAATCACTTAGACAAGAGTTATATAACGAGCCTTACCATCAAATTAACTGGAATAAAGCCCGGAGT ACAGTTGCAAAGGAGGATCTCTACTATCCGCATCCCCTCATACAAGATCTGCTATGGGGATTTCTT CACCATGTAGCCGAGCCTGTCCTGACGCGTTGGCCCTTTTCAATGCTGAGAGAGAAGGCACTCA AAGCTGCAATTGGTCATGTACATTATGAGGACGAGAACAGCAAATACCTTTGCATTGGAAGCGTT GAAAAGGTATTATGTTTGATTGCCTGTTGGGCTGAAGATCCAAATGGGGAGGCATACAAGCTTCA TCTAGGAAGGATTCCAGACAACTATTGGGTTGCTGAAGATGGCTTAAAAATTCAGAGTTTCGGCT GTCAGATGTGGGATGCGGGTTTTGCTATTCAAGCAATTCTCTCTTGCAATTTAAACGAAGAGTATT GGCCAACACTTCGTAAAGCACATGAGTTTGTAAAGGCTTCACAGGTCCCAGAAAACCCTTCTGGG GACTTCAAAGCCATGTACCGCCACATAAACAAAGGAGCATGGACATTCTCGATGCAGGACCATGG ATGGCAGGTCTCTGACTGCACCGCTGAAGGGCTGAAGGTTGCAATCTTGTTCTCGCAAATGCCTC CGGACCTTGTTGGGGAAAAAATTGAGAAAGAGCGGTTATATGATGCTGTGAATGTCATTCTTTCTC TACAAAGTAGCAATGGTGGTTTCCCAGCATGGGAGCCTCAAAGAGCATATGGTTGGTTGGAGAA GTTCAACCCCACGGAATTCTTTGAAGATACCCTTATTGAGCGAGAGTACGTAGAGTGCACTTCAC CTGCAGTTCATGGTCTGGCACTCTTTAGGAAGTTCTATCCCCGGCACCGGGGGACGGAGATAGA TAGTAGCATTTACAGGGGAATTCAATACATTGAAGACGTGCAAGAACCTGATGGATCATGGTATG GTCATTGGGGGATTTGCTACACCTACGGTACATGGTTTGCTGTAGGGGCACTGGCAGCTTGTGG AAGAAACTACAAAAATTGTCCTGCATTGCGCAAATCTTGTGAATTTTTGCTATCAAAGCAGCTACC TAATGGTGGATGGGGAGAAAGTTACCTATCAAGCCAAAACAAGGTGTGGACGAATATAGAAGGCA ACCGTGCAAATTTGGTCCAAACAGCATGGGCCTTGTTATCCCTCATTGATGCTAGGCAGGCCGAG ATAGATCCAACACCAATTCATCGTGGAGTAAGAGTATTGATCAATTCACAGATGGAAGATGGTGA CTTTCCTCAACAGGAAATCACTGGAGTATTTATGCGAAACTGCACACTAAACTACTCATCATATAG AAACATTTTTCCGATATGGGCTCTTGGAGAATATCGGAGGCGAGTTCTATTTGCATGA
SEQ ID No 2. Olea europaea OEW mRNA for lupeol synthase, complete cds, AB025343
ATGTGGAAGTTGAAGATTGCTGATGGAACAGGGCCGTGGCTTACAACAACCAATAATCATATTGG AAGACAGCATTGGGAATTCGATCCTGAGGCTGGAACTCCAGATGAACGAGTCGAGGTTGAAAGA CTGCGTGAAGAGTTCAAGAAGAACAGATTTCGAACTAAACAAAGTGCTGATTTGCTGATGCGTAT GCAGCTTGTGAAGGAGAACCAACGTGTTCAAATCCCACCAGCGATCAAAATCAAAGAAACAGAAG GTATAACAGAGGAAGCAGTGATAACTACTCTAAGAAGAGCCATAAGTTTCTATTCCACAATTCAAG CTCACGATGGCCACTGGCCAGCTGAATCCGCCGGCCCTTTGTTTTTCCTCCCTCCTTTGGTCTTA GCCTTGTATGTGACTGGAGCAATCAATGTTGTTCTATCGCGAGAACATCAGAAAGAGATTACACG ATACATATACAATCATCAGAATGAAGATGGAGGTTGGGGGATACATATAGAGGGTCATAGCACCA TGTTTGGTTCTGTGCTTAGCTACATTACGCTTAGGTTGCTAGGAGAAGGACAAGAAGATGGTGAA GACAAGGCCGTAGCTAGAGGTCGAAAATGGATACTTGACCATGGTGGCGCCGTGGGGATACCAT CGTGGGGTAAGTTTTGGCTTACGGTGCTCGGAGTATACGAGTGGGATGGCTGCAACCCAATGCC CCCAGAATTCTGGCTGCTTCCCAATTTTTCCCCAATTCATCCAGGAAAGATGTTGTGTTATTGTCG GTTGGTATACATGCCCATGTCATATTTGTATGGCAAGAGGTTTGTTGGACCAATTACTGGATTGGT GCTATC ACTAAG GC AAG AG ATTTATACTG AACCTTATC ATGG AATAAATTG GAATAGG GC AAGG AA CACCTGTGCAAAGGAGGATCTTTACTACCCACACCCTCTGGCACAAGATATGCTTTGGGGATTCC TCCATCATTTTGCCGAGCCAGTTCTAACTCGATGGCCGTTTTCTAAACTAAGAGAGAAGGCTTTAA AAGTTGCAATGGAGCATGTTCATTATGAGGACATGAACAGCAGATACCTTTGCATTGGATGTGTA GAGAAGGTGTTATGTCTTATTGCTTGTTGGGTAGAAGATCCTAATTCTGAAGCATACAAAAGACAT ATAGCACGTATACCTGATTACTTCTGGGTCGCCGAAGATGGCCTGAAAATGCAGAGTTTTGGGTG TCAAATGTGGGATGCAGCTTTTGCTATTCAAGCCATATTATCATCCAATCTAGCTGAAGAGTACGG GCCGACCCTCATGAAAGCACACAACTTTGTGAAAGCCTCACAGGTCCAAGAAAATCCATCTGGAG ATTTTAATGAAATGTATCGTCACACTTCTAAAGGCGCCTGGACATTTTCTATGCAAGATCATGGTT GGCAAGTCTCAGATTGTACAGCTGAAGGACTTAAGGCCGCACTCTTATTCTCGCAAATGCCTATA GAACTAGTTGGAGCAGAAATCGAAACAGGACATTTATATGATGCTGTAAATGTCATTTTGACCCTT CAGAGTGCTAGTGGCGGTTTTCCAGCATGGGAGCCTCAGAAAGCATATCGATGGTTGGAGAAGC TCAACCCTACAGAGTTTTTTGAAGATGTTCTTATAGAGCGAGATTATGTAGAGTGCACATCATCAG CAGTCC AAGCCTTAAAG CTCTTTAAG CAGTTGC ATCC AGG AC AC AG AAG AAAG GAAATAGC AAGC TGCATCTCAAAAGCAATACAATACATCGAAGCTACTCAAAATCCTGATGGTTCATGGGATGGTAGT TGGGGAATATGCTTTACGTATGGCACGTGGTTTGCAGTAGAGGGCTTGGTCGCTTGTGGGAAAA ATTATCATAACTCTCCCACACTACGGAGAGCATGTGAATTTTTGTTGTCGAAACAATTACCGGATG GTGGATGGAGTGAAAGCTACCTTTCGAGCTCGAACAAGGTATATACTAATCTTGAAGGTAATCGG TCAAATTTGGTGCAAACCTCATGGGCTCTGTTGTCTCTCATCAAAGCTGGGCAGGTCGAGATTGA TCCTGGGCCTATACATCGTGGAATAAAACTGCTAGTAAATTCACAAATGGAAGATGGTGACTTTCC TCAAGAGGAAATTACAGGAGCATTCATGAAGAATTGTACTCTGAACTATTCATCGTACCGGAATAT CTTTCCAATATGGGCTCTCGGTGAGTATCGTCGTCGGATTCTTCATGCACAAACATAG SEQ ID No 3. Glycyrrhiza uralensis GuLUPI mRNA for lupeol synthase, complete cds, AB663343
ATGTGGAAGCTGAAGATAGGAGAAGGAGGAGCGGGGTTGATTTCCGTGAACAACTTCATCGGAC GGCAACACTGGGAGTTCGATCCAAATGCAGGAACTCCACAGGAACACGCTGAGATTGAAAGGCT ACGCCGGGAATTCACCAAAAACCGTTTTTCCATCAAACAAAGCGCTGACCTCTTGATGAGAATGC AGCTCAGAAAGGAGAACCATTACGGCACCAATAATAATATTCCAGCAGCAGTGAAATTGAGTGAC GCAG AG AACATAACGGTGG AAGCATTGGTTACAACAATTAG AAGGGCTATCAGTTTCTATTCCTC AATTCAAGCCCATGATGGACACTGGCCTGCAGAATCTGCTGGCCCTCTCTTTTTCCTTCAACCATT GGTAATGGCCCTATATATTACAGGATCCCTTGATGACGTTTTAGGACCTGAACATAAGAAGGAAAT TGTTCGCTATTTGTATAATCATCAGAATGAAGATGGTGGGTGGGGATTCCATATAGAGGGTCATA GCACAATGTTTGGATCTGCATTGAGCTACGTTGCATTAAGGATACTTGGAGAAGGGCCTGAAGAC AAGGCAATGGCCAAAGGCAGAAAATGGATCCTCGACCACGGTGGTTTAGTTGCTATTCCATCATG GGGAAAGTTCTGGGTCACGGTACTTGGAGCTTATGAGTGGTCAGGCTGCAATCCACTTCCACCA GAGTTATGGCTTCTGCCCAAATTCACCCCTTTTCATCCAGGAAAAATGTTGTGCTACTGTCGCTTG GTTTACATGCCCATGTCATATTTATATGGGAAGAAGTTCGTGGGCCCTATCACTGCCTTAATCAGA TCACTACGAGAAGAATTGTACAATGAGCCTTATAATCAAATTAACTGGAATACAGCTCGAAACACT GTTGCTAAGGAGGATCTCTACTACCCACATCCTCTGATCCAAGATATGTTATGGGGATTTCTTTAT CACGTGGGAGAGCGTTTTCTGAATTGCTGGCCCTTTTCCATGCTTAGACGGAAGGCATTAGAAAT CGCAATTAATCATGTACATTACGAGGACGAGAACAGTAGATACCTTTGCATTGGCAGTGTAGAGA AGGTGTTATGTTTGATTGCGCGTTGGGTTGAAGATCCCAACTCAGAGGCATACAAACTTCATTTAG CCCGAATCCCTGATTACTTCTGGCTCGCTGAAGATGGCTTGAAAATCCAGAGCTTTGGGTGCCAG ATGTGGGATGCAGCATTCGCTATACAAGCAATACTTGCCTGTAATGTGAGTGAGGAGTATGGACC TACGCTCCGGAAAGCACACCACTTCGTGAAGGCTTCGCAGGTTCGCGAAAACCCATCCGGTGAC TTCAACGCAATGTACAGACACATTTCGAAAGGAGCATGGACATTCTCAATGCATGATCACGGTTG GCAAGTCTCTGACTGCACCGCAGAAGGACTAAAGGCTGCACTGCTATTGTCAGAAATGCCAAGT GAACTAGTTGGGGGGAAAATGGAAACAGAGCGCTTCTACGACGCTGTTAATGTCATCCTCTCTCT ACAAAGCAGTAATGGCGGGTTCCCTGCTTGGGAGCCTCAGAAAGCGTACCGTTGGTTAGAGAAA TTCAATCCAACTGAATTCTTTGAAGACACTATGATTGAGAGGGAGTATGTTGAGTGCACTGGATCC GCAATGCAAGGGTTGGCTCTCTTCAGAAAGCAATACCCACAGCACAGAAGCAAGGAAATAGATC GCTGCATTGCCAAAGCAATCCGTTACATAGAAAACATGCAAAATCCTGATGGCTCTTGGTATGGG TGTTGGGGAATTTGCTATACATACGGTACATGGTTTGCCGTGGAGGGACTAACGGCCTGTGGGA AGAACTGCCACAACAGTCTTTCCTTGCGAAAAGCTTGTCAATTCTTGTTGTCAAAGCAGCTTCCTA ATGCGGGGTGGGGAGAAAGTTACTTGTCAAGCCAAAACAAGGTGTATACAAACCTAGAAGGAAA CCGTGCAAATTTAGTTCAAAGTTCGTGGGCTTTGTTGTCCCTTACTCATGCAGGGCAGGCCGAGA TAGATCCTACACCCATACACCGTGGAATGAAGTTACTCATCAATTCACAAATGGAAGATGGAGACT TCCCACAGCAGGAGATTACAGGAGTATTTATGAGGAACTGTACCCTGAACTACTCATCGTATCGA AACATCTTTCCCATATGGGCTATGGGAGAGTATCGTCGCCAAGTCTTGTGTGCTCACAGTTATTG A
SEQ ID No 4. Arabidopsis thaliana lupeol synthase 1 (LUP1 ) mRNA, complete cds, NM_179572
ATGTGGAAGTTGAAGATAGGAAAGGGAAATGGAGAAGATCCGCATTTATTCAGCAGCAATAACTT CGTCGGACGTCAAACATGGAAGTTTGATCACAAAGCCGGCTCACCGGAGGAACGAGCTGCCGTC GAAGAAGCTCGCCGGGGTTTCTTGGATAACCGTTTTCGTGTTAAAGGTTGCAGTGATCTATTGTG GCGAATGCAATTTCTAAGAGAGAAGAAATTCGAACAAGGCATACCACAACTAAAAGCTACTAACAT AGAAGAAATAACGTATGAAACAACGACAAATGCATTACGAAGAGGCGTTCGTTACTTCACGGCTT TGCAAGCCTCCGACGGCCATTGGCCGGGAGAAATCACCGGTCCGCTTTTCTTCCTTCCTCCTCTC ATATTTTGTTTGTACATTACCGGACATCTGGAGGAAGTATTCGATGCTGAACATCGCAAAGAGATG CTAAGACATATCTATTGTCACCAGAACGAAGATGGTGGATGGGGATTACACATCGAAAGCAAGAG TGTTATGTTCTGCACCGTGTTGAATTACATATGTTTACGTATGCTTGGAGAAAATCCTGAACAAGA CGCATGCAAACGAGCTAGACAATGGATTCTTGACCGCGGTGGAGTGATCTTTATTCCTTCTTGGG GGAAATTTTGGCTCTCGATACTTGGAGTCTATGATTGGTCTGGAACTAATCCGACGCCACCAGAA CTCTTGATGCTGCCTTCTTTTCTTCCAATACATCCAGGGAAAATTTTGTGTTATAGCCGGATGGTT AGTATACCTATGTCGTATCTATATGGGAAGAGGTTTGTTGGTCCAATTACACCTCTTATTTTACTCT TGCGCGAAGAACTTTACTTGGAACCTTATGAAGAAATCAATTGGAAAAAAAGTCGACGTCTATATG CAAAAGAAGACATGTATTATGCTCATCCTTTGGTTCAAGATTTGTTATCTGACACTCTTCAAAACTT TGTGGAGCCTTTACTTACACGTTGGCCATTGAACAAGCTTGTGAGGGAAAAAGCTCTTCAGCTTA CTATGAAACACATACACTATGAAGACGAAAATAGCCATTACATAACCATTGGATGTGTTGAAAAGG TACTGTGCATGCTAGCTTGTTGGGTTGAAAATCCGAATGGAGATTATTTCAAGAAGCATCTGGCTA GAATTCCAGATTATATGTGGGTCGCTGAAGATGGAATGAAAATGCAGAGCTTTGGATGTCAACTG TGGGATACTGGATTTGCTATTCAAGCTTTGCTTGCAAGTAATCTCCCTGATGAAACTGATGATGCA CTAAAGAGAGGACATAATTACATAAAGGCATCTCAGGTTAGAGAAAACCCTTCAGGTGATTTTAGG AGCATGTACCGCCACATTTCGAAAGGAGCATGGACATTTTCTGATCGAGATCATGGATGGCAAGT TTCAGATTGTACAGCTGAAGCTTTAAAGTGTTGCCTGCTGCTTTCCATGATGTCAGCTGATATCGT CGGCCAGAAAATAGATGATGAACAATTATATGACTCTGTTAACCTCTTGCTGTCTTTACAGAGCGG AAATGGAGGTGTCAATGCGTGGGAGCCATCCCGTGCATATAAATGGTTGGAACTGCTCAATCCTA CAGAATTCATGGCTAATACCATGGTCGAGCGGGAGTTTGTGGAATGCACCTCATCTGTTATACAA GCACTTGATCTATTTAGAAAATTGTATCCAGATCACAGGAAGAAAGAGATCAACAGGTCCATCGAA AAAGCTGTGCAATTTATACAAGACAATCAAACACCAGACGGTTCATGGTACGGAAATTGGGGTGT TTGCTTC ATTTACG CTACTTGGTTTG CTCTTGG AG GCCTAG CAGC AGCTGGTG AAACTTAC AACG ATTGTTTAGCTATGCGCAATGGTGTCCACTTTTTGCTCACGACACAAAGAGATGATGGAGGTTGG GGTGAAAGCTATTTATCATGCTCCGAACAGAGATATATACCATCAGAAGGAGAAAGATCAAACCTT GTGC AAAC ATC ATG GGCTATGATG GCTCTAATTC ATACGG G ACAGGCTG AG AG AG ATTTGATTCC TCTTCATCGTGCTGCCAAACTTATCATCAATTCACAACTTGAAAACGGCGATTTTCCTCAACAGGA AATAGTAGGAGCGTTCATGAATACATGCATGCTACACTATGCTACATACAGAAACACCTTCCCATT ATGGGCACTCGCAGAATACCGAAAAGTTGTGTTTATCGTTAATTAA SEQ ID No 5. Lotus japonicus OSC3 mRNA for lupeol synthase, complete cds, AB181245
ATGTGGAAGTTGAAGGTAGCAGAAGGAGGAAAAGGGTTGGTTTCTGTGAGCAATTTCATCGGAA GGCAACACTGGGTGTTCGACCCAAATGCAGGGACACCACAAGAACATGAGGAGATTGAAAGGAT GCGCCAAGAATTCACCAAAAATCGATTCTCCATCAAACAAAGTGCAGACCTCTTGATGAGAATGC AGCTGAGAAAGGAGAACCCTTGTGGGCCCATCCCACCAGCAGTTAAATTGAGAGATGTGGAAAA GGTAACTGCAGAAGCATTGATCACTACAATTAGAAGGTCCATCACCTTTTATTCTTCAATTCAAGC CCATGATGGCCACTGGCCTGCTGAATCTGCAGGCCCATTATTCTTCGTTCAACCTTTGGTAATGG CACTGTACATTACAGGATCCCTTGATGATGTATTAGGACCTCAACACAAGAAGGAAATTATTCGAT ATTTGTATAATCATCAGAACGAAGATGGGGGTTGGGGATTCCACATAGAGGGTCATAGTACCATG TTTGGATCTGCATTGAGCTACATTGCATTGAGGGTACTTGGACAAAGCCTTGAAGATGGTGAGGA CATGGCAGTGGCCAGAGGCAGAAAATGGATCCTCGATCATGGCGGTTTAGTAGCTATTCCATCAT GGGGAAAGTTCTGGGTCACGGTGCTAGGGGTTTATGAGTGGTCAGGGTGCAATCCCCTTCCACC AGAGTTCTGGCTTCTACCCAAAATTTTCCCTATTCATCCAGGGAAAATGTTATGTTACTGTCGCTT AGTTTACATGCCCATGTCATATTTATATGGAAAGAAGTTTGTAGGCCCAATCACTGCCTTAGTCAG ATCACTAAGAAAAGAATTGTACAATGAGCCTTATGATCGAGTTGACTGGAATAAGGCCCGCAACA CTGTTGCTAAGGAGGATCTATACTATCCCCATCCTCTAATCCAAGACATGTTATGGGGATTTCTTC ATCATGTGGGAGAGCGTGTTCTGAACACTTGGCCATTTTCAATGCTAAGACAGAAGGCAATAGAA GTTGCTATTAATCATGTACGTTACGAGGATGAGACCACTAGGTACCTTTGCATTGGAAGTGTAGA GAAGGTGTTATATTTGATTGCGCGTTGGGTTGAAGACCCCAACTCAGAGGCTTACAAACTTCATTT AGCCCGAATCCCTGATTACTTCTGGCTTGCAGAAGATGGCTTGAAAATCCAGAGTTTTGGCTGCC AAATGTGGGATGCAGCATTTGCTATTCAAGCAATACTGAGTGGTAATGTGAGTGAAGAGTATGGA CCAACATTAAAGAAAGCACACCACTTTGTGAAGGCTTCGCAGGTACGTGAAAACCCATCCGGTGA CTTCAAAGCAATGTACAGACACATTTCCAAAGGGGCATGGACATTCTCAATGCATGATCATGGAT GGCAAGTCTCTGATTGCACAGCAGAAGGACTAAAGGTTGCACTCCTACTGTCAGAAATGTCAGAT GATCTAGTTGGGGCAAAAATGGAAACAGAGCAATTCTATGATGCTGTTAATGTCATCCTCTCTCTA CAAAGCAGCAATGGTGGTTTCCCTGCTTGGGAGCCTCAAAGAGCCTACCAATGGTTAGAGAAATT CAATCCAACTGAATTCTTTGAAGAAACTCTGATTGAGAGGGAGTATGTAGAGTGCACTGGTTCAG CAATGCAAGCCCTGGCTCTTTTCAGAAAGCTATACCCGAAGCATAGGCGAAAGGAAATAGATCGC TGCATTTCCAAAGCAATCCGATACATTGAAAACACACAAAATCCTGATGGGTCTTGGTATGGTTGC TGGGGAATTTGCTACACTTATGGTACCTGGTTTGCAGTGGAAGGACTAACAGCTTGTGGGAAGAA CTTCCAAAATAGTGTTACCTTGCGTAGAGCATGTAAATTTTTGTTGTCAAAGCAGCTTCCTAATGG AGGGTGGGGAGAAAGTTACTTGTCAAGCCAAGACAAGGTGTACACAAACATTGAAGGAAAACGT GCAAATTTGGTTCAAAGTTCATGGGCTTTGTTGTCACTTATGCGTGCTGGGCAGGCTGAGATAGA TCCGACACCAATTCACCGTGGAATAAGGTTACTCATTAATTCACAAATGGATGATGGAGACTTCCC ACAACAGGAGATTACAGGAGTATTTATGAGGAACTGTACCCTAAACTACTCATCATATCGAAACAT CTTTCCTATATGGGCTCTTGGAGAGTACCGTCGCAGAGTCTTATGTGCATGA SEQ ID No 6. Ricinus communis lupeol synthase mRNA, complete cds, DQ268869
ATGTGGCGAATTAAAATAGCTGAGGGAGGAAATAACCCTTATATTTATAGCACAAACAATTTTCAG GGAAG GC AAATTTGGGTATTTG ATCCTAATGCTG GTACTCCTG AAG AAC AAGCCG AG GTTG AAG A AGCTCGTCAAAACTTCTGGAAAAATCGATTTCAGGTCAAGCCTAACTCTGATCTCCTTTGGCAACT CCAGTTTCTAAGGGAGAAAAATTTTAAGCAAAAAATTCCAAAAGTAAAGGTTGAAGATGGCGAGG AGATCACAAGTGAAATAGCTGCAGCCGCTTTGAGGAGAAGCGTCCACTTGTTTTCGGCCTTGCAG GCAAGCGATGGCCATTGGTGTGCAGAAAATGGAGGCCTGCTGTTCTTTTTGCCTCCCTTGGTTTT TGCTGTCTACATTACAGGACACCTTAATACTGTATTTTCTCCAGAGCATCGCAAAGAAATCCTCCG TTACATATACTGTCATCAGAATGAAGATGGTGGATGGGGAATACACATTGAAGGTCACAGCACTA TGTTTTGCACAGTTCTTAATTATATATGTATGCGTATACTTGGTGAAGCACGTGATGGTGGAATAG AAAATGCTTGTGAAAGAGGGCGAAAATGGATACTCGATCATGGTGGTGCAACTGGTATATCTTCT TGGGGAAAGACATGGCTTTCGATACTTGGTGTGTACGAGTGGGATGGGACCAATCCCATGCCCC CAGAGTTTTGGGCCTTTCCATCTTCTTTTCCCTTACACCCAGCAAAAATGTTTTGTTACTGTCGGA TCACTTACATGCCAATGTCGTACTTGTACGGGAAGAGGTTTGTTGGTCCAATCACACCACTCATTC TACAAATAAGAGAAGAAATCTATAATGAACCTTACAACAAAATCAAGTGGAATAGTGTGCGTCATT TATGTGCAAAGGAAGACAACTATTTTCCACATCCAACGATACAGAAACTGTTATGGGATGCTCTGT ATACATTTAGCGAGCCTCTATTCTCTCGTTGGCCCTTCAACAAATTGAGAGAGAAGGCTCTCAAGA TAACAATGGATCACATTCATTATGAAGATCACAACAGTCGGTACATCACTATTGGATGCGTTGAGA AGCCGTTATGCATGCTTGCCTGTTGGATTGAAGATCCTCATGGGGAAGCGTTTAAGAAGCACCTT GCCAGAATTGCAGATTACATATGGGTTGGAGAAGATGGAATAAAGATGCAGAGTTTCGGAAGTCA AACATGGGACACAAGTCTAGCTCTTCAGGCCCTGATAGCTAGCGACCTCTCTCATGAAATAGGAC CTACACTAAAACAAGGACACGTCTTCACGAAGAATTCTCAGGCAACTGAGAACCCTTCGGGCGAC TTCAGAAAAATGTTTCGTCATATCTCCAAAGGAGCTTGGACATTCTCTGATAAAGATCAAGGATGG CAAGTTTCTGATTGTACAGCAGAAAGCTTGAAGTGCTGCCTACTTTTCTCAATGATGCCTCCCGAA ATTGTTGGTGAGAAAATGGAACCTGAAAAGGTCTATGATTCAGTCAATGTCATACTTTCTCTTCAG AGCCAAAATGGTGGTTTCACAGCTTGGGAGCCAGCAAGAGCAGGATCATGGATGGAGTGGCTCA ACCCTGTAGAGTTCATGGAGGATCTTGTCGTTGAGCACGAGTATGTGGAGTGCACTTCATCAGCA ATCCAAGCACTAGTTCTTTTTAAAAAATTATATCCCCGACACAGGAACAAAGAGATTGAAAATTGTA TCATAAATGCTGCGCAGTTCATTGAAAATATACAAGAACCTGATGGTTCATGGTATGGAAATTGGG GGATATGCTTCTCTTATGGTACCTGGTTTGCACTGAAAGGATTAGCTGCTGCTGGAAGGACATAT GAAAATTGTTCTGCTATTCGTAAAGGTGTTGATTTTCTACTAAAATCACAAAGAGATGATGGTGGA TGGGCAGAGAGTTATCTTTCATGTCCAAAGAAGGTGTATGTTCCTTTTGAGGGTAATCGATCAAAT CTAGTTCAAACTGCTTGGGCAATGATGGGTTTGATTTATGGAGGACAGGCCAAAAGAGACCCTAT GCCTCTTCATCGCGCTGCAAAGTTATTAATTAATTCTCAAACAGATCTTGGTGATTTTCCTCAACA GGAACTTACAGGAGCATTCATGAGGAATTGCATGCTGCACTATGCACTATTTAGGAATACTTTTCC CATTTG GGCTTTGGCAGAATATCGGCGACATGTCTTATTCCCTTCTG CTG GATTTGGTTTTG GATT CACCAATAATTTATGA
SEQ ID No 7. Taraxacum officinale TRW mRNA for lupeol synthase, complete cds, AB025345
ATGTGGAAGCTGAAAATAGCAGAAGGTGGTGATGATGAGTGGCTGACCACCACCAACAACCACG TCGGCCGTCAGCACTGGCAGTTTGATCCGGATGCTGGAACCGAAGAGGAACGTGCTGAGATTGA AAAGATTCGTCTCAACTTCAAACTTAATCGTTTTCAATTCAAACAAAGTGCCGACTTGTTAATGCGT ACTCAACTAAGAAAAGAGAACCCAATCAATAAAATACCGGATGCAATAAAATTGAATGAAACAGAA GAAGTGACAAATGACGCAGTGACAACTACACTCAAAAGAGCCATTAGCTTTTACTCCACCATTCAA GCCCATGATGGGCACTGGCCAGCTGAGTCTGCTGGCCCTTTGTTCTTCCTTCCTCCATTGGTAAT AGCACTATATGTGACTGGAGCAATGAATGATATTCTAACACCCGCACATCAGCTAGAAATAAAACG TTACATATACAATCATCAGAATGAAGATGGAGGTTGGGGATTACATATAGAGGGTCATAGCACAAT ATTTGGATCAGTACTTAGTTACATAACTTTAAGATTACTTGGGGAAGAAGCTGATAGTGTTGCAGA GGACATGGCTTTGGTTAAGGGGCGTAAATGGATCCTTGACCATGGTGGTGCAGTTGGGATTCCTT CATGGGGAAAGTTTTGGCTTACGATACTTGGAGTATACGAATGGGGAGGCTGTAATCCTATGCCA CCCGAATTTTGGCTCATGCCTAAGTTTTTCCCAATTCATCCAGGCAAAATGTTGTGTTATTGTCGC TTAGTTTACATGCCCATGTCGTACTTATACGGCAAAAGATTTGTGGGAAAAATAACCGAGTTGGTT CGAGACCTAAGGCAAGAGCTTTATACGGACCCTTATGATGAGATTAATTGGAATAAAGCACGAAA CACGTGTGCAAAGGAAGATCTCTACTATCCACACCCTTTTGTTCAAGATATGGTATGGGGTGTACT TCATAATGTTGTTGAACCTGTATTAACAAGTCGTCCGATTTCCACACTAAGAGAAAAGGCTTTGAA AGTCGCAATGGATCATGTTCACTATGAAGATAAGAGCAGTAGATATCTTTGCATTGGATGTGTGGA AAAGGTGTTATGCTTGATTGCAACGTGGGTGGAAGATCCAAATGGTGATGCATATAAACGTCATC TTGCTAGAATTCCTGACTACTTTTGGGTTGCTGAGGATGGGATGAAAATGCAGAGTTTTGGATGT CAAATGTGGGATGCAGCATTTGCTATTCAAGCTATTTTTTCAAGTAATCTAACAGAAGAATACGGC CCGACTCTTAAAAAAGCACACGAGTTTGTAAAAGCATCACAGGTTCGTGATAATCCTCCTGGAGA TTTCAGTAAAATGTACCGACATACTTCTAAGGGTGCATGGACATTTTCCATACAAGACCACGGTTG GCAAGTCTCTGATTGTACCGCAGAAGGCTTGAAGGTTTCACTTTTGTACTCCCAAATGAACCCAAA ACTAGTGGGCGAAAAAGTTGAAACGGAGCATCTCTACGACGCTGTCAATGTCATTCTTTCATTACA AAGTGAAAATGGTGGCTTTCCTGCTTGGGAACCACAAAGGGCGTACGCTTGGCTGGAGAAATTC AACCCCACTGAATTCTTTGAAGATGTGTTGATTGAGCGAGAGTATGTTGAATGCACTTCATCTGCA ATCCAAGGTTTGACACTCTTCAAGAAGTTGCACCCAGGGCACAGAACCAAGGAGATCGAGCATTG TATATCAAGAGCTGTAAAGTACGTTGAAGACACACAAGAAAGTGATGGTTCATGGTATGGTTGTTG GGGAATTTGCTACACCTATGGTACATGGTTTGCGGTAGATGCGCTAGTAGCTTGTGGGAAGAACT ATCATAACTGTCCCGCTCTTCAAAAAGCTTGCAAATTTCTGTTATCCAAACAACTTCCGGATGGTG GATGGGGAGAGAGTTATCTTTCGAGCTCAAATAAGGTGTATACGAATTTGGAGGGAAATCGTTCG AATTTAGTGCATACATCATGGGCTTTAATATCCCTTATTAAAGCTGGACAGGCTGAAATTGATCCT ACACCAATATCTAATGGCGTACGGCTTCTCATCAATTCACAAATGGAAGAAGGGGACTTTCCTCAA CAGGAAATCACAGGAGTGTTCATGAAGAACTGTAACCTCAATTACTCATCATTTCGAAATATTTTTC CCATATGGGCACTTGGTGAATATCGTCGTATTGTTCAAAATATATGA SEQ ID No 8. Glycyrrhiza glabra GgLUSI mRNA for lupeol synthase, complete cds, AB1 16228
ATGTGGAAGCTGAAGATAGGAGAAGGAGGAGCGGGGTTGATTTCCGTGAACAACTTCATCGGAC GGCAACACTGGGAGTTCGATCCAAATGCAGGAACTCCACAGGAACACGCTGAGATTGAAAGGCT ACGCCGGGAATTCACCAAAAACCGTTTTTCCATCAAACAAAGCGCTGACCTCTTGATGAGAATGC AGCTCAGAAAGGAGAACCATTACGGCACCAATAATAATATTCCAGCAGCAGTGAAATTGAGTGAC GCAGAGAACATAACGGTGGAAGCATTGGTTACAACAATTACAAGGGCTATCAGTTTCTATTCCTCA ATTCAAGCCCATGATGGACACTGGCCTGCAGAATCTGCTGGGCCTCTCTTTTTCCTTCAACCATT GGTAATGGCCCTATATATTACAGGATCCCTTGATGACGTTTTAGGACCTGAACATAAGAAGGAAAT TGTTCGCTATTTGTATAATCATCAGAATGAAGATGGTGGGTGGGGATTCCATATAGAGGGTCATA GCACAATGTTTGGATCTGCATTGAGCTACGTTGCATTAAGGATACTTGGAGAAGGGCCTCAAGAC AAGGCAATGGCCAAAGGCAGAAAATGGATCCTCGACCACGGTGGTTTAGTTGCTATTCCATCATG GGGAAAGTTCTGGGTCACGGTACTTGGAGCTTATGAGTGGTCAGGCTGCAATCCACTTCCACCA GAGTTATGGCTTCTGCCCAAATTCGCCCCTTTTCATCCAGGAAAAATGTTGTGCTACTGTCGCTTG GTTTACATGCCCATGTCATATTTATATGGGAAGAAGTTCGTGGGCCCTATCACTGCCTTAATCAGA TCACTACGAGAAGAATTGTACAATGAGCCTTATAATCAAATTAACTGGAATACAGCTCGAAACACT GTTGCTAAGGAGGATCTCTACTACCCACATCCTCTGATCCAAGATATGTTATGGGGATTTCTTTAT CACGTGGGAGAGCGTTTTCTGAATTGCTGGCCCTTTTCCATGCTTAGACGGAAGGCATTAGAAAT CGCAATTAATCATGTACATTACGAGGACGAGAACAGTAGATACCTTTGCATTGGCAGTGTAGAGA AGGTGTTATGTTTGATTGCGCGTTGGGTTGAAGATCCCAACTCAGAGGCATACAAACTTCATTTAG CCCGAATCCCTGATTACTTCTGGCTCGCTGAAGATGGCTTGAAAATCCAGAGCTTTGGGTGCCAG ATGTGGGATGCAGCATTCGCTATACAAGCAATACTTGCCTGTAATGTGAGTGAGGAGTATGGACC TACGCTCCGGAAAGCACACCACTTCGTGAAGGCTTCGCAGGTTCGCGAAAACCCATCCGGTGAC TTCAACGCAATGTACAGACACATTTCGAAAGGAGCATGGACATTCTCAATGCATGATCACGGTTG GCAAGTCTCTGACTGCACCGCAGAAGGACTAAAGGCTGCACTGCTATTGTCAGAAATGCCAAGT GAACTAGTTGGGGGGAAAATGGAAACAGAGCGCTTCTACGACGCTGTTAATGTCATCCTCTCTCT ACAAAGCAGTAATGGCGGGTTCCCTGCTTGGGAGCCTCAGAAAGCGTACCGTTGGTTAGAGAAA TTCAATCCAACTGAATTCTTTGAAGACACTATGATTGAGAGGGAGTATGTTGAGTGCACTGGATCC GCAATGCAAGGGTTGGCTCTCTTCAGAAAGCAATTCCCACAGCACAGAAGCAAGGAAATAGATCG CTGCATTGCCAAAGCAATCCGTTACATAGAAAACATGCAAAATCCTGATGGCTCTTGGTATGGGT GTTGGGGAATTTGCTATACATACGGTACATGGTTTGCCGTGGAGGGACTAACGGCCTGTGGGAA GAACTGCCACAACAGTCTTTCCTTGCGAAAAGCTTGTCAATTCTTGTTGTCAAAGCAGCTTCCTAA TGCGGGGTGGGGAGAAAGTTACTTGTCAAGCCAAAACAAGGTGTATACAAACCTAGAAGGAAAC CGTGCAAATTTAGTTCAAAGTTCGTGGGCTTTGTTGTCCCTTACTCATGCAGGGCAGGCCGAGAT AGATCCTACACCCATACACCGTGGAATGAAGTTACTCATCAATTCACAAATGGAAGATGGAGACTT CCCACAGCAGGAGATTACAGGAGTATTTATGAGGAACTGTACCCTGAACTACTCATCGTATCGAA ACATCTTTCCCATATGGGCTATGGGAGAGTATCGTCGCCAAGTCTTGTGTGCTCACAGTTATTGA
SEQ ID No 9. Eleutherococcus trifoliatus lupeol synthase mRNA, complete cds, JQ087376
ATGTGGAAGCTGAAGATAGCCGAAGGAGATAAAAATGACCCGTATTTGTACAGCACCAATAATTTT GTCGGCCGGCAAACATGGGAGTTCGACCCGGATTATGTGGGTAGCCCCGGAGAGCTAGAGGAG GTGGAAGAGGCTCGGCGTCAGTTTTGGGAGAACAGGTACAAGGTCAAGCCTTGTGGCGATCTCC TCTGGCGTATGCAGTTCCTAAGAGAGAAGAATTTCAAACAAACAATCCCCCAAGTGAAGGTAGGA GATGACGAGGCAGTTACTTATGACGCCGCCACTACGACACTCCGAAGGGCCGTCCACTTCTTTTC AGCTTTGCAGGCCAGCGACGGTCATTGGCCTGCCGAGATCGCCGGACCTCTCTTTTTCCTTCCG CCCTTGGTGATGTGTGTATATATCACAGGGCATCTTGATACAGTGTTCCCAGCAAAACATCGAAAA GAAATTCTTCGCTACATATATTGTCATCAAAATGAAAATGGCGGGGGGGGATTACATATTGAGGG GCATAGCACCATGTTCGGCACAACTTTTAGCTACATTTGTATGCGTATACTTGGAAAAGGACCCG ATGGTGGTGTAAACAATGCATGTGCCAAAGGCCGAAAATGGATCCTTGACCACGGCAGTGCAAC CGCTATACCTTCATGGGGCAAGACTTGGCTTTCGATACTTGGTGTATATGAATGGACGGGAAGCA ACCCAATGCCCCCGGAATTCTGGCTTCTCCCTTCTTCCCTTTCTGTGCACCCAGCTAAAATGTTGT GTTATTGCCGGATGGTTTACTTGCCAATGTCATATTTATATGGGAAGAGGTTTGTTGGGCCAATCA CTCCTCTCATTTTACAATTAAAAGAAGAACTTTATGCTCAACCCTACAATGAAATCAGGTGGGGAA AAGTACGTCATGTGTGTGCCAAGGAGGACATCTACTATCCTCACCCTTTAATACAAGACCTGCTAT GGGATAGTCTCCATGTATTAGCTGAACCTCTTTTAACTCGTTGGCCATTTAACAAGTTGAGAGAGA AAGCTTTGCAGACTACCATGAAACACATTCACTATGAAGATGAGAACAGTCGATATATTACCATTG GATGTGTGGAAAAGATTTTGTGTATGCTTGCTTGTTGGGTTGAGGATCCAAATGGAGATTATTTCA AGAAACACCTTGCAAGGATTCCAGATTATTTATGGGTTGCTGAAGATGGAATGAAGATGCAGAGT TTTG GTAGTC AG GAATGG G ATATAGGTTTTG GC ATTC AAGC ATTGTTG GCTAGTG ATCTC ACTC AT GAACTTGGACCTACTCTTATGAAAGGACACGACTTCATCAAAAAGTCCCAGGTCAAGGATAATCC TTCCGGTGACTTCAAAAGCATGTATCGCCACATTTCTAAAGGATCGTGGACCTTCTCAGATCAAGA TCACGGATGGCAAGTTTCTGATTGTACTGCAGAAGGATTAAAGTGTTGCCTTATTTTCTCAACAAT GCCAGAGGAAATCGTTGGCAAGAAAATGGAACCAGAACTACTGTATAATTCTGTTAATGTATTGCT TTCCCTACAGAGCAAAAATGGTGGGGTAGCAGCATGGGAGCCTGCAACAGCACAGGACTGGTTA GAGTTGTTCAATCCTACGGAATTCTTTGCAGACACCATCATTGAGCACGAGTATGTAGAGTGCAC TTCATCGGCAATCCAAGCCCTGACTCTGTTTAAAAAGTTATATCCTGGGCACCGAAAGAAGGAGA TAGATAATTTTATTACGAATGCCATTCGTTTCATTGAAGACATACAAATACCTGATGGTTCATGGTA TGGAAACTGGGGTGTGTGTTTTACTTACGGTACCTGGTTTGCTCTTGGGGGGCTAGCGGCAGGT GGAAAGACATACAACAATTGTGCAGCTGTTCGTAAAGCTGTTAATTTTCTACTCGAATCACAATTG GATGATGGCGGTTGGGGAGAAAGCCATCTTTCTTGCCCCAGAAAGGTATATGTACCATT AGAAGG AAACCGCTCAAATTTGGTGCATACTGGATGGGCCTTAATGGGACTGATTCATTCTGGGCAGGCCG AGAGAGACCCAACACCTCTTCACCGTGCAGCCAAGTTATTGATCAATTCCCAGATGGAAGATGGT GATTTTCCCCAACAGGAAATAACCGGAGCTTTTATGAAGAATTGCATGTTGCACTATGCAGTTTAT CGAAATATATACCCATTGTGGGCTTTAGCAGAGTATCGGAGGCGGGTACCATTACCGACCCTAGG TGCCTAA SEQ ID No 10. Kalanchoe daigremontiana lupeol synthase mRNA, complete cds, HM623871
ATGTGGAAGTTAAAGATAGCGGACGGAGGGAGTAACCCTTACATCTTCACCACCAACAATTTTGT GGGAAGGCAGATATGGGAATTTGACCCCCAAGCCACCGACCCTCAGCAACTAGCTAAAGTCGAA GCTGCTCGTCTCGATTTCTACCATAACCGCTATAAACTCAAACCCAATTCCGATCTCCTCTGGCGC ATGCAGTTTCTTGAGGAGAAAGCTTTCACACAAACTATACCACAAGTTAAAGTTGAGGATGGTGAA GAGGTTAGTTACGAGGCAGTAACTGCAGCACTGAGAAGAGGAGTCCATCTCTATTCAGCTCTCCA AGCTAGTGATGGCCACTGGCCAGCTGAAAATGCTGGCCCTATGTTTTTCATGCCCCCTATGGTTA TGTGTCTATACATCACTGGACATCTTAATGCCATATTCACGGAAGAACATCGAAGTGAAACTCTTC GTTAC ATATATTATC ATCAG AATG AAG ATG GTG GCTGGGGGTTTC ATATTG AGGG CCACAGC ACC ATGTTTGGTACAGTTCTAAACTATATATGTATGCGGTTGCTTGGAGAGGGGCCTGAAGGAGGTCA AGACAATGCTGTTTCCAGAGGAAGGAAGTGGATCCTCGACCATGGTGGTGCCACCTCCATTCCAT CATGGGGAAAGACTTGGCTTTCGATTATGGGCTTGTGTGACTGGTCTGGATGCAATCCCATGCCC CCCGAGTTTTGGCTTCTTCCTTCCTATCTTCCTATGCATCCAGGCAAAATGTGGTGCTACTGCCGA ATGGTCTACATGCCGATGTCATATTTATATGGTAAAAGATTCACAGCTCGTATCACACCACTCATT CTTCAGTTGAGAGAAGAAATTCACATTCAACCATACGACCAAATCGACTGGAAAAAAGTGCGACA TGTGTGTTGTAAGGAGGATATGTACTATCCACATCCACTACTTCAAGACTTGTTATGGGACACTCT CTATCTCACTACTGAGCCTCTCCTTACTCGCTGGCCACTGAACAAACTGATCAGGAAAAGAGCTC TGCAGACGACAATGAAACATATACACTATGAAGATGAGAATAGCAGATACATCACGATTGGCTGT GTCG AG AAG GTTTTGTGC ATG CTTGCTTGCTGGGTTG AAG ATCC AAATG GAG ATTATTTTAAAAAA CATTTAGCTAGAATTCCAGACTATTTATGGATTGCTGAAGATGGCATGAAGATGCAGAGTTTCGGA AGTCAGCACTGGGATACAGCCTTTTCTATCCAAGCACTACTGGCTAGTAACATGGCTGAAGAAAT CGGAATAAC ACTTG CAAAAG GCC ACG ATTTTATTAAG AAATCTC AG GTGAAAG AC AACCCTTCTG GTGACTTCAAAGGCATGTACCGTCACATTTCAAAGGGGGCATGGACATTTTCAGATCAAGATCAT GGATGGCAAGTTTCAGATTGCACGGCAGAGGGCCTGAAGTGTTGTCTGCTTTTCTCAATGATGCA ACCTGAGGTTGTGGGTGAGAGCATGGCACCAGAGAGCCTGTACAACTCAGTAAATGTTCTCCTCT CTTTGCAGAGCCAGAACGGTGGATTACCAGCCTGGGAGCCAGCAGGTGCACCCGAGTGGTTGG AGCTTCTAAACCCGACCGAGTTTTTTGAGAACATTGTAATTGAGCACGAGTACGTCGAGTGCACT AGCTCGGCAGTTCAGGCTTTAGTCCTTTTCAAAAAGCTATACCCCCTACATCGTAGAAAAGAAGT GGAAAGATTTATCACAAACGGTGCGAAATACCTTGAAGATATACAGATGCCTGATGGGTCATGGT ATGGGAACTGGGGAGTTTGCTTCACCTATGGTGCATGGTTTGCTCTTGAAGGATTGTCAGCTGCT GGAAAGACATACAACAATTGTGCAGCAGTCCGCAAAGGCGTTGACTTTCTACTAAACATTCAACTT GAAGACGGTGGGTGGGGAGAGAGTTACCAATCATGTCCAGACAAGAAATATGTTCCTCTAGAAG ATAATAGATCAAATCTGGTTCAAACTTCATGGGCGTTAATGGGTCTAATTTACGCCGGACAGGCT GATAGGGATCCAACTCCTCTTCACCGGGCTGCACAATTACTGATTAACTCGCAGTTGGAAGATGG AGATTTTCCGCAACAAGAAATAACTGGAGTGTTTCAGAGGAACTGCATGTTGCATTATGCAGCATA CAGAAACATATTCCCTCTCTGGGCCCTTGCTGAGTATAGAAGACAGATTCAGTTACATTCAGAGG CTACC AAAATG GTCTAA
SEQ ID No 1 1. Bruguiera gymnorhiza BgLUS mRNA for lupeol synthase, complete cds, AB289586
ATGTGGAGGCTTAAGATTGCAGAGGGTGGCAACAACCCTTACATATACAGCACAAACAATTTCGT GGGAAGGCAAACATGGGAGTTTGACCCTGAAGCTGGGACCCCTGAGGAGCGAGCCCAGGTTGA AGAGGCTCGTGAAAATTTCTGGAGGGACCGCTTTCTCATCAAGCCCAGCTCCGACCTCCTTTGGC GATTCCAGTTTCTGAGTGAGAAAAAGTTTAAACAAAGGATTCCACAAGTGAAGGTTCAGGATGGT GAGGAAATCACACGTGAAATTGCCACAACCGCATTGAGGAGGAGCGTCCATTTGGTTTCTGCCTT GCAGGCCAGCGATGGGCATTGGTGCGCAGAAAATTCTGGCCCCATGTTCTTTGTTCCTCCTATG GTTTTTTCTCTGTATATCACAGGACATCTTAATGCTGTATTCTCTGCAGAGCACTGCAAAGAGATT CTGAGATACATATACTGTCATCCGAATGAGGATGGTGGGTGGGGATTACACATAGAGGGTCACA GCGCCATGTTCTCCACAGTTCTGAATTACAATTGGCTGGGGAAACTTGGCGAGGGACGAGATGG TGGGAAAGACAATGCTTGCGAAAGAGCGCGAAGGAGGATTCTTGATCACGGTAGTGCAACTGCA ATCAGCTCCTGGGGAAAGACATGGCTGGCGATACTTGGTGTGTATGAATGGGATGGTTGCAACC CAATGCCTCCAGAATTTTGGGCCTTCCCCACTTTTTTCCCAATACATCCAGCAAGAATGTTATGCT ACTGTCGGCTCACTTACATGGCCATGTCATACCTGTATGGGAAGAAATTTGTCGGTCCAATCACA CCTCTAATTTTACAACTGAGGGAGGAAATCTACAATGAACCATATGACCAAATCAATTGGAGCAGA ATGCGCCATTTGTGTGCAAAAGAGGATAACTACTATGCCCACACTCTAACACAAATCATTTTGTGG GATGCAATTTACATGTTGGGCGAACCTCTTCTCAAGCGCTGGCCATTCAACAAATTGAGAGAGAA GGCTCTCAAAATAACAATGGATCACATTCATTATGAAGATGAAAACAGTCAATACATTACAATTGG GAGTGTTGAAAAGCCATTACTCATGCTTGCTTGCTGGCATGAAGATCCCAATGGTGATGCTTTTAA GAAGCACCTCGCCAGAATACCAGATTATGTTTGGCTTGGTGAAGATGGAATAAAGATTCAGAGTT TTGGCAGCCAAGTGTGGGATACAAGTTTTGTTCTCCAAGCTTTGATTGCTAGCAATCTTCCCAGTG AAACAGGACCTACACTTGAGAAAGGGCACAATTTCATAAAGAACTCTCAGGTCACCCAGAACCCT TCTGGTGACTTCAGAAGAATGTTTCGTCATATCTCTAAAGGGTCATGGACATTCTCTGACAAAGAT CACGGATGGCAAGTTTCTGATTGCACTGCAGAAAGCCTGAAGTGTTGTCTACTTTTCTCGATGAT GCCCCCTGAACTTGTGGGTGAGAAGATGGGACCTCAGCGGATGTACGATGCCGTCAATGTGATA ATTTCTCTTCAGAGTAAAAATGGTGGCTGTTCAGCCTGGGAGCCAGCAGGAGCTGGGTCGTGGA TGGAGTGGCTTAACCCTGTGGAATTTCTAGCGGACCTTGTTATCGAACATGAGTATGTTGAGTGC ACTTCATCATCGTTGCAAGCATTAGTTCTATTCAAGAAGTTATATCCTGAGCACAGGAGGAAAGAG ATTGAAATTTTTATACTAAATGCTGTAAGATTCACTGAAGAAATTCAACAGCCTGATGGATCATGGT ATGGAAATTGGGGAATATGCTTCCTTTCTGGTACATGGTTTGGACTTAAAGGGCTGGCTGCTGCT GGCAAGACTTACTACAATTGCACTGCTGTGCGTAAAGGGGTCGAATTTCTACTCCAAACACAACG AGACGATGGTGGATGGGGAGAGAGTTACCTTTCATGCCCAAAGAAGATCTACGTACCTCTTGAG GGAAACCGATCAAATTTGGTACAAACTGCACTGGCCATGATGGGCTTAATTCTTGGTGGGCAGGG TGAGAGAGACCCTACACCCCTTCATCGAGCTGCAAAGTTGTTGATCAATTCTCAAACAGAACTTG GTGATTTTCCTCAGCAGGAACTCTCAGGTTGTTTCATGAGGAATTGCATGTTGCACTATTCAGAAT ATAGGGACATCTTTCCAACGTGGGCTCTAGCAGAATACTGCAAGCTTTTTCCATTGCCTTCCAAAA ATGATTGA
SEQ ID No 12. Betula platyphylla OSCBPY mRNA for beta-amyrin synthase, complete cds,
AB055512
ATGTGGAGGCTTAAGATCGCAGACGGTGGGAGTGACCCTTATATCTACTCTACAAACAACTTTGT TGGGAGGCAGACATGGGAGTTTGACCCTCAGGCTGGTTCCCCACAAGAGCGGGCTGAGGTTGA AGAGGCTCGTCGGAATTTCTACGACAACCGGTATCAGGTCAAACCTAGTGGTGATCTCCTATGGC GAATGCAGTTTCTTAAGGAGAAAAACTTCAAACAAACAATTCCTCCAGTAAAGGTTGAGGATGGA GAGGAAATCACATATGAAAAGTCCACAGCTGCATTGAGAAGGGCCGTCCATTTCTATTCGGCCTT GCAAGCTAGTGATGGCCATTGGCCTGCTGAAAATGCCGGTCCATTATTTTTCCTTCCCCCCTTGG TTATGTGTATGTACATTACAGGACATCTTAATACTGTGTTCCCTGCTGAGCATCAAAAGGAAATCC TTCGATACATATACTATCATCAGAATGAAGATGGTGGGTGGGGATTACACATAGAGGGTCACAGC ACCATGTTTTGCACTGCTCTCAGCTACATCTGTATGCGCATACTCGGGGAAGGGCCTGATGGTGG TCAGGACAATGCTTGTGCAAGAGCGCGAAAGTGGATCCTTGATCATGGTGGTGTAACACACATGC CTTCTTGGGGAAAGACCTGGCTTTCGATACTTGGTATATTCGAGTGGATTGGAAGCAACCCAATG CCTCCAGAATTTTGGATCCTTCCTTCATTTCTTCCCATGCATCCAGCCAAAATGTGGTGCTACTGC CGCATGGTGTACATGCCTATGTCATACCTCTATGGGAAAAGGTTTGTAGGCCCAATCACACCTCT CATTCTTCAATTGAGGGAGGAACTCTACACTCAACCTTACCACCAAGTTAACTGGAAGAAAGTGC GTCATCTATGTGCAAAGGAGGATATCTACTATCCCCACCCTTTGATACAAGATCTATTGTGGGATA GTCTATACATATTCACTGAGCCTCTTCTAACTCGTTGGCCCTTTAACAAGCTGGTCAGAGAGAAG GCTCTTCAAGTAACAATGAAGCACATTCATTATGAAGATGAGAACAGTCGATACATCACCATTGGA TGCGTGGAAAAGGTCCTCTGTATGCTTGCTTGTTGGGTTGAAGATCCAAATGGGGATTATTTCAA GAAACATATTGCTAGGATACCAGATTACATATGGGTTGCTGAAGATGGAATCAAGATGCAGAGTTT TGGAAGTCAAGAGTGGGATACCGGTTTTGCTATTCAAGCTTTGCTTGCTAGTAATCTAACTGATGA AATTG G ACCTAC ACTTGCG AG AG GGC ACG ACTTCATAAAG AAATCTC AG GTC AAG G AC AACCCTT CTGGAGACTTTGAAAGCATGCACCGTCACATTTCTAAAGGATCATGGACTTTCTCTGATCAAGATC ATGGATGGCAAGTTTCTGATTGCACTGCCGAAGGTTTGAAGTGTTGCTTGCTTTTCTCCATTATGC CACCAGAAATTGTTGGTGAGAAAATGGAACCTGAGCAATTGTATGATTCTGTAAATGTCCTACTTT CTCTACAGAGTAAAAATGGTGGTTTAGCTGCCTGGGAACCAGCAGGAGCCCAAGAATGGTTGGA ATTGCTTAATTCCACAGAATTCTTTGCGGACATTGTCATTGAGCATGAGTACATTGAGTGCACTGC ATCAGCAATGCAAACTTTAGTTTTGTTTAAGAAGTTATACCCCGGGCACCGNAAGAAAGAGATCG AAAATTTCATAAAAAATGCTGCTCAGTTCCTTCAAGTCATACAAATGCCTG ATGGTTCATGGTATG GAAATTGGGGAGTTTGCTTCACATATGGTACATGGTTTGCACTTGGAGGATTGGCTGCAGTTGGC AAGACTTACAACAATTGTCTAGCCGTGCGCAGAGCTGTTGATTTTCTACTCAGAGCACAAAGAGA TAATGGTGGTTGGGGAGAGAGCTATCTCTCATGTCCAAAGAAGGAGTATGTACCTCTTGAAGGAA ACAAATCAAATTTGGTACATACTGCATGGGCAATGATGGGTCTCATTCATGCTGGACAGGCTGAA AGAGACCCAACACCTCTTCACCGCGCAGCAAAGTTGATAATTAATTCTCAACTCGAAGATGGAGA TTTTCCTCAACAGGAAATCACTGGAGTCTTTATGAAGAACTGTATGTTACACTATGCAGCATACAA AAATATTTACCCACTGTGGGCTCTGGCAGAATACCGCAAGCATGTCCCATTGCCATTAGGAAAAA ATTTAAATCAAGTAGTGAACTGTATAGGTCAATCACTATATAAGAAGTATAAATAA
Die folgenden Gensequenzen werden besonders bevorzugt für die Kodierung von NADPH- cytochrome P450 Reduktase (CPRs) eingesetzt:
SEQ ID No 13. Lotus japonicus LjCPRI mRNA for cytochrome P450 reductase, complete cds, AB433810
ATGGAAGAATCAAGCTCCATGAAGATTTCGCCTCTGGATCTGATGTCCGCCATGATCAAGGGCAC ACTCGACCCTTCCAACGTCTCCTCCACCTCCGGCGCCGGCTCCGTCTTCCTCGAGAATCGTGAG TTCGTCATGGTGCTTACCACCTCCATCGCCGTCCTCATCGGATGCGTCGTCGTTTTCATTTGGCG CAGATCCACCGGTAACAAGGCTAAGTCCATCGAGCCTCCCAAGCGCGTCGTCGAGAAGCTTAGC GACGAGGCTGAGGTTGACGACGGTACCAGAAAGGTCACCATCTTCTTCGGTACTCAGACTGGTA CTGCTGAAGGATTCGCCAAGGCGATTGCGGAAGAGGCAAAAGTGCGATACGAAAAAGCCAAGTT CAAAATTGTTGATATGGATGATTATGCCCAGGACGATGATGAGTATGAGGAAAAGCTCAAGAAAG AGACACTGGCACTTTTCTTCTTAGCTACATATGGTGATGGTGAGCCAACTGATAATGCGGCGAGA TTTTACAAATGGTTTCTGGAGGGAGATGAGAAAGAAGAAGGATGGCTTCGAAATCTTGAGTATGC TGTTTTTGGTCTGGGGAACAGGCAGTATGAGCATTTTAATAAGGTCGCCATTGAAGTGGATGATA AGCTTGCTGATTTTGGTGGGAAGCGTCTTGTCAAAGTAGGTCTAGGAGATGATGATCAATGCATA GAAGATGACTTTACTGCATGGAAAGAAGAATTGTGGCCAGCATTGGATGAATTGCTTAGAGGTGA TGATGATACAACTGTGTCTACACCCTATACGGCTGCTGTGTTGGAGTATCGTGTTGTTATTCATGA TCCATTAGATGCATCTGTCGATGAAAAGAAGTGGCATAATGTTAATGGCCATGCTATTGTGGATGC TCAACATCCAGTCAGGTCAAATGTGGCTGTGCGAAAGGAGCTTCATACTCCTGTGTCAGATCGTT CTTGCACACATTTAGAATTTGACATTTCAGGCACTGGAGTTGCATATGAAACAGGGGACCATGTT GGTGTTTACTGTGAGAATTTATCTGAAACTGTGGAAGAAGCAGTAAGGTTACTAGGTTTGTCACCA GATACCTATTTCTCCGTCCATACTGATGATGAAGATGGGAAACCACTTAGTGGAAGCTCCTTGCC ACCTACTTTCCCACCATGTACTTTAAGAACAGCAATTGCCCGATATGCAGATGTCTTGAGTTCACC CAAAAAGTCTGTTTTGCTTGCCTTAGCTGCTCATGCATCTAATCCATCTGAAGCCGACCGCCTAC GACATCTTGCTTCACCTGCTGGAAAGGATGAATATTCAGAGTGGGTGATTGCCAGTCAAAGAAGT CTCCTTGAGGTCATGGCTGAATTTCCATCAGCCAAACCTCCAATTGGTGTCTTTTTCGCAGCAATT GCTCCTCGCCTGCAGCCAAGATTTTATTCGATCTCATCATCTCCTAGGATGGCTCCATCCAGAATT CACGTTACCTGTGCATTAGTGAATGATAAAATGCCCACTGGTAGGATTCATAGGGGAGTGTGTTC AACATGGATGAAGAATTCTGTGCCATTGGAGAAAAGTCAGGACTGCAGTTGGGCTCCAATATTTG TTAGACAGTCCAATTTTAAACTCCCTGCTGATAATAAAGTGCCTATAATCATGATAGGTCCTGGCA CAGGATTGGCTCCTTTCAGGGGTTTCTTGCAGGAAAGATTAGCTCTGAAAGAGGATGGAGCTGAA CTTGGCCCCTCCGTTTTATTCTTCGGATGCAGGAATCGTCAAATGGACTACATCTATGAAGATGA GTTGAACCACTTTGTCAACAGTGGTGCGCTTTCTGAGCTCATTGTTGCCTTCTCACGGGAGGGAC CTACCAAGGAATATGTGCAACATAAAATGATGGAGAAGGCTTCGGATATTTGGAACATGATATCTC AGGGAGCTTACATTTATGTGTGTGGGGATGCCAAGGGCATGGCTAGGGATGTGCACCGTACTCT GCACACAATTTTGCAAGAGCAGGGTTCTCTCGATAGTTCCAAGGCTGAGGGTATGGTTAAGAACC TACAATTGAATGGTAGGTATTTGCGTGATGTATGGTGA
SEQ ID No 14. A.thaliana ATR1 mRNA for NADPH-cytochrome P450 reductase, X66016
ATGACTTCTGCTTTGTATGCTTCCGATTTGTTTAAGCAGCTCAAGTCAATTATGGGGACAGATTCG TTATCCGACGATGTTGTACTTGTGATTGCAACGACGTCTTTGGCACTAGTAGCTGGATTTGTGGT GTTGTTATGGAAGAAAACGACGGCGGATCGGAGCGGGGAGCTGAAGCCTTTGATGATCCCTAAG TCTCTTATGGCTAAGGACGAGGATGATGATTTGGATTTGGGATCCGGGAAGACTAGAGTCTCTAT CTTCTTCGGTACGCAGACTGGAACAGCTGAGGGATTTGCTAAGGCATTATCCGAAGAAATCAAAG CGAGATATGAAAAAGCAGCAGTCAAAGTCATTGACTTGGATGACTATGCTGCCGATGATGACCAG TATGAAGAGAAATTGAAGAAGGAAACTTTGGCATTTTTCTGTGTTGCTACTTATGGAGATGGAGAG CCTACTGACAATGCTGCCAGATTTTCAAAATGGTTTACGGAGGAAAATGAACGGGATATAAAGCTT CAACAACTAGCATATGGTGTGTTTGCTCTTGGTAATCGCCAATATGAACATTTTAATAAGATCGGG ATAGTTCTTGATGAAGAGTTATGTAAGAAAGGTGCAAAGCGTCTTATTGAAGTCGGTCTAGGAGAT GATGATCAGAGCATTGAGGATGATTTTAATGCCTGGAAAGAATCACTATGGTCTGAGCTAGACAA GCTCCTCAAAGACGAGGATGATAAAAGTGTGGCAACTCCTTATACAGCTGTTATTCCTGAATACC GGGTGGTGACTCATGATCCTCGGTTTACAACTCAAAAATCAATGGAATCAAATGTGGCCAATGGA AATACTACTATTGACATTCATCATCCCTGCAGAGTTGATGTTGCTGTGCAGAAGGAGCTTCACACA CATGAATCTGATCGGTCTTGCATTCATCTCGAGTTCGACATATCCAGGACGGGTATTACATATGAA ACAGGTGACCATGTAGGTGTATATGCTGAAAATCATGTTGAGATAGTTGAAGAAGCTGGAAAATT GCTTGGCCACTCTTTAGATTTAGTATTTTCCATACATGCTGACAAGGAAGATGGCTCCCCATTGGA AAGCGCAGTGCCGCCTCCTTTCCCTGGTCCATGCACACTTGGGACTGGTTTGGCAAGATACGCA GACCTTTTGAACCCTCCTCGAAAGTCTGCGTTAGTTGCCTTGGCGGCCTATGCCACTGAACCAAG TGAAGCCGAGAAACTTAAGCACCTGACATCACCTGATGGAAAGGATGAGTACTCACAATGGATTG TTGCAAGTCAGAGAAGTCTTTTAGAGGTGATGGCTGCTTTTCCATCTGCAAAACCCCCACTAGGT GTATTTTTTGCTGCAATAGCTCCTCGTCTACAACCTCGTTACTACTCCATCTCATCCTGCCAAGAT TGGGCGCCAAGTAGAGTTCATGTTACATCCGCACTAGTATATGGTCCAACTCCTACTGGTAGAAT CCACAAGGGTGTGTGTTCTACGTGGATGAAGAATGCAGTTCCTGCGGAGAAAAGTCATGAATGTA GTGGAGCCCCAATCTTTATTCGAGCATCTAATTTCAAGTTACCATCCAACCCTTCAACTCCAATCG TTATGGTGGGACCTGGGACTGGGCTGGCACCTTTTAGAGGTTTTCTGCAGGAAAGGATGGCACT AAAAGAAGATGGAGAAGAACTAGGTTCATCTTTGCTCTTCTTTGGGTGTAGAAATCGACAGATGG ACTTTATATACGAGGATGAGCTCAATAATTTTGTTGATCAAGGCGTAATATCTGAGCTCATCATGG CATTCTCCCGTGAAGGAGCTCAGAAGGAGTATGTTCAACATAAGATGATGGAGAAGGCAGCACAA GTTTGGGATCTAATAAAGGAAGAAGGATATCTCTATGTATGCGGTGATGCTAAGGGCATGGCGAG GGACGTCCACCGAACTCTACACACCATTGTTCAGGAGCAGGAAGGTGTGAGTTCGTCAGAGGCA GAGGCTATAGTTAAGAAACTTCAAACCGAAGGAAGATACCTCAGAGATGTCTGGTGA SEQ ID No 15. Catharanthus roseus cpr mRNA for NADPH-ferri he moprote in reductase, X69791
ATGGATTCTAGCTCGGAGAAGTTGTCGCCGTTCGAATTGATGAGCGCGATCTTGAAGGGAGCTAA ATTAGATGGGTCTAACTCTTCAGATTCTGGCGTAGCTGTGTCGCCGGCAGTTATGGCTATGTTGT TGGAGAATAAGGAGTTAGTGATGATTTTGACTACTTCAGTGGCGGTTTTGATCGGTTGTGTCGTA GTTTTGATATGGCGGCGATCTTCCGGATCGGGTAAAAAAGTCGTGGAGCCTCCGAAGCTCATAGT GCCTAAATCTGTTGTAGAACCGGAGGAAATTGATGAAGGGAAGAAGAAATTTACCATATTTTTTGG AACACAAACTGGAACAGCTGAAGGCTTCGCTAAGGCTCTAGCTGAGGAAGCCAAAGCTCGATAT GAAAAGGCAGTTATCAAAGTGATTGATATAGATGATTATGCGGCTGATGATGAAGAATACGAGGA GAAATTCAGAAAAGAGACCTTGGCATTTTTCATCTTGGCCACGTATGGAGATGGTGAGCCAACCG ACAATGCTGCAAGGTTCTACAAATGGTTTGTAGAGGGAAATGATAGAGGGGACTGGCTAAAGAAT CTGCAATATGGAGTTTTTGGCCTTGGTAACAGACAATATGAGCATTTCAACAAGATTGCTAAAGTG GTGGATGAGAAAGTTGCTGAACAGGGTGGTAAGCGGATTGTTCCATTGGTTCTGGGAGACGATG ACCAGTGCATTGAAGATGACTTTGCTGCATGGCGTGAGAATGTATGGCCTGAGTTGGATAACTTG CTCCGGGATGAGGATGATACAACTGTTTCTACAACCTACACTGCTGCTATTCCAGAATATCGTGTT GTGTTCCCTGACAAATCAGATTCACTTATTTCAGAAGCAAATGGCCATGCCAATGGTTATGCTAAT GGCAACACCGTATATGATGCCCAGCATCCTTGCAGATCTAATGTTGCAGTGAGGAAGGAGCTTCA TACTCCAGCATCTGATCGTTCTTGCACCCATTTGGATTTTGACATTGCTGGCACTGGCCTTTCATA TGGAACTGGAGATCATGTTGGAGTGTACTGTGATAATCTATCTGAAACCGTGGAGGAGGCTGAGA GATTACTGAATTTACCCCCAGAAACTTATTTCTCGCTTCATGCTGATAAAGAGGATGGAACCCCAC TTGCTGGGAGCTCATTGCCTCCTCCTTTCCCACCTTGTACTCTAAGAACCGCCCTCACTCGTTAT GCAGATCTCTTAAATACTCCTAAGAAGTCTGCTTTGTTAGCTCTAGCAGCTTATGCATCTGATCCA AATGAGGCCGATCGTCTAAAATATCTTGCTTCTCCAGCCGGAAAGGATGAATATGCTCAGTCACT AGTTGCAAATCAGAGAAGCCTCCTCGAGGTCATGGCTGAATTTCCATCAGCAAAGCCTCCTCTTG GAGTATTCTTTGCAGCAATTGCTCCACGCCTCCAACCCAGATTCTATTCTATATCGTCTTCTCCAA GGATGGCACCATCTAGAATTCATGTCACTTGTGCACTTGTTTATGAAAAAACACCTGGAGGACGA ATTC AC AAG GGTGTGTGTTCG AC ATGG ATG AAG AATGCC ATTCC ATTGG AG GAAAG CCGTG ACTG CAGCTGGGCTCCTATCTTTGTCAGGCAGTCTAACTTCAAACTCCCTGCCGATCCTAAAGTGCCTG TTATAATGATCGGCCCTGGTACTGGACTAGCTCCCTTCAGAGGATTCCTTCAGGAAAGATTAGCT CTGAAGGAAGAAGGAGCTGAACTTGGTACTGCAGTTTTCTTTTTTGGATGCAGGAACCGCAAAAT GGATTACATCTATGAAGATGAGCTAAACCATTTCCTTGAAATTGGTGCACTTTCCGAGCTACTTGT TGCTTTCTCACGTGAGGGACCCACTAAGCAGTATGTGCAACACAAGATGGCAGAAAAGGCTTCTG ATATTTGGAGGATGATTTCTGATGGAGCATATGTTTACGTCTGCGGTGATGCCAAAGGCATGGCC AGGGATGTCCACAGAACTCTCCACACCATTGCTCAAGAGCAGGGATCGATGGATAGCACACAGG CTGAGGGTTTTGTGAAGAATCTGCAAATGACCGGAAGGTATCTCCGAGATGTCTGGTGA
SEQ ID No 16. Medicago truncatula NADPH cytochrome P450 reductase (MTR_3g100160) mRNA, complete cds, XM_003602850
ATGACTTCTTCCAATTCCGATTTAGTCCGTACAATCGAATCCGTACTCGGAGTTTCCCTCGGCGAC TCCGTTTCAGATTCGGTTGTTCTCATCGTTACCACCTCCGCCGCCGTCATAATTGGACTTCTCGTT TTTCTATGGAAGAAATCTTCGGATCGGAGCAAAGAGTTGAAACCGGTTATAGTTCCTAAGTCCTTG GTGAAAGAAGAAGATGATGATGCTGATATTGCTGATGGAAAAACCAAAGTTACCGTTTTCTTTGGT ACTCAAACTGGTACTGCTGAAGGATTCGCTAAGGCATTGGCAGAGGAGATCAAGGCAAGATATGA AAAAGCATTTGTCAAAGTTGTTGATATGGATGACTATGCAGCGGATGATGATCAATATGAAGAGAA GCTGAAGAAAGAAACTCTTGCATTTTTCATGCTGGCGACTTATGGAGATGGAGAGCCAACTGACA ATGCCGCAAGATTCTATAAATGGTTTACTGAGGGTAAAGACGAGAGGGGAACCTGGCTTCAACAG CTCACATATGGTGTTTTTGGCCTAGGTAACAGGCAATATGAACATTTTAACAAGATAGGTAAAGTT GTTGACGACGATCTCAGTGAACAAGGGGCAAAGCGTCTTGTTCCACTTGGAATGGGTGATGATG ATCAATCCATTGAGGATGATTTTAATGCCTGGAAAGAATCTCTGTGGCCTGAGTTGGATCAGTTGC TCCGAGATGAGGATGATGTAAATACTGTGTCTACTCCTTATACAGCTGCTATTTCTGAATATCGAG TAGTGTTTCACGACCCCACTGTCACGCCGTCCTACGAGAATCACTTTAACGCGGCAAATGGGGGT GCTGTATTTGATATTCATCATCCTTGTAGGGCGAATGTCGCTGTTCGAAGGGAGCTTCATAAACCT CAGTCTGACCGTTCTTGTATACATTTGGAGTTTGATGTATCAGGGACCGGCGTAACATACGAAAC TGGAGACCATGTGGGTGTTTATGCTGATAACTGTGATGAAACTGTTAAAGAAGCTGGGAAGTTGT TGGGTCAGGATTTAGATTTGCTGTTTTCTCTTCACACTGATAATGAGGATGGCACTTCCCTAGGTG GTTCTCTTCTACCTCCTTTCCCTGGTCCTTGCACAGTTCGCACTGCATTAGCACGTTATGCAGATC TCTTGAACCCCCCACGAAAGGCTGCTTTAATTGCATTAGCTGCTCATGCTTCCGAGCCTAGTGAA GCAGAAAGATTGAAGTTTCTCTCATCTCCTCAGGGAAAGGATGAATACTCCAAATGGGTTGTTGG AAGCCATAGAACTCTTCTTGAGGTGATGGCTGATTTTCCATCAGCAAAACCACCCCTTGGTGTGTT TTTTGCTGCCATAGCCCCTCGTTTACAACCTCGTTATTATTCTATTTCATCATCTCCTAGGTTTGCC CCACAAAGGGTACACGTAACTTGTGCCCTGGTAGAAGGTCCAACTCCAACTGGCAGAATTCACAA AGGAGTATGTTCAACCTGGATGAAGAATGCTATTCCCTCAGAGGAAAGCCGTGACTGTAGCTGG GCTCCCATTTTTATCAGGCCATCGAATTTCAAGCTACCTGCTGATCCTTCAATTCCTATT ATT ATGG TTGGACCTGGTACTGGTTTAGCACCTTTTAGGGGATTTTTACAGGAGAGATTTGCTCTCAAAGAG GACGGTGTTCAACTTGGTCCTGCATTACTATTCTTCGGGTGCAGGAACCGTCAAATGGATTTTATA TATGAGGAAGAGCTGAATAATTTTGTGGAACAAGGTTCTCTGTCAGAGTTGATAGTTGCATTCTCT AGAGAGGGGCCTGAAAAGGAGTATGTTCAACACAAAATGATGGATAAAGCATCATACTTCTGGAG TCTCATTTCTCAGGGAGGTTATCTTTATGTATGTGGTGATGCCAAGGGCATGGCCAGAGATGTTC ATCGAACTCTTCACACCATTGTCCAGCAGCAGGAAAATGCAGACTCTTCAAAGGCGGAGGCTACG GTG AAAAAACTCC AGATG GATG G ACGCTACCTTAGG GATGTCTGGTG A SEQ ID No 17. Saccharomyces cerevisiae S288c Ncpl p (NCP1 ), mRNA, NM_001 179172
ATGCCGTTTGGAATAGACAACACCGACTTCACTGTCCTGGCGGGGCTAGTGCTTGCCGTGCTAC TGTACGTAAAGAGAAACTCCATCAAGGAACTGCTGATGTCCGATGACGGAGATATCACAGCTGTC AGCTCGGGCAACAGAGACATTGCTCAGGTGGTGACCGAAAACAACAAGAACTACTTGGTGTTGTA TGCGTCGCAGACTGGGACTGCCGAGGATTACGCCAAAAAGTTTTCCAAGGAGCTGGTGGCCAAG TTCAACCTAAACGTGATGTGCGCAGATGTTGAGAACTACGACTTTGAGTCGCTAAACGATGTGCC CGTCATAGTCTCGATTTTTATCTCTACATATGGTGAAGGAGACTTCCCCGACGGGGCGGTCAACT TTGAAGACTTTATTTGTAATGCGGAAGCGGGTGCACTATCGAACCTGAGGTATAATATGTTTGGTC TGGGAAATTCTACTTATGAATTCTTTAATGGTGCCGCCAAGAAGGCCGAGAAGCATCTCTCCGCC GCGGGCGCTATCAGACTAGGCAAGCTCGGTGAAGCTGATGATGGTGCAGGAACTACAGACGAA GATTACATGGCCTGGAAGGACTCCATCCTGGAGGTTTTGAAAGACGAACTGCATTTGGACGAACA GGAAGCCAAGTTCACCTCTCAATTCCAGTACACTGTGTTGAACGAAATCACTGACTCCATGTCGC TTGGTGAACCCTCTGCTCACTATTTGCCCTCGCATCAGTTGAACCGCAACGCAGACGGCATCCAA TTGGGTCCCTTCGATTTGTCTCAACCGTATATTGCACCCATCGTGAAATCTCGCGAACTGTTCTCT TCCAATGACCGTAATTGCATCCACTCTGAATTTGACTTGTCCGGCTCTAACATCAAGTACTCCACT GGTGACCATCTTGCTGTTTGGCCTTCCAACCCATTGGAAAAGGTCGAACAGTTCTTATCCATATTC AACCTGGACCCTGAAACCATTTTTGACTTGAAGCCCCTGGATCCCACCGTCAAAGTGCCCTTCCC AACGCCAACTACTATTGGCGCTGCTATTAAACACTATTTGGAAATTACAGGACCTGTCTCCAGACA ATTGTTTTCATCTTTGATTCAGTTCGCCCCCAACGCTGACGTCAAGGAAAAATTGACTCTGCTTTC GAAAGACAAGGACCAATTCGCCGTCGAGATAACCTCCAAATATTTCAACATCGCAGATGCTCTGA AATATTTGTCTGATGGCGCCAAATGGGACACCGTACCCATGCAATTCTTGGTCGAATCAGTTCCC CAAATGACTCCTCGTTACTACTCTATCTCTTCCTCTTCTCTGTCTGAAAAGCAAACCGTCCATGTC ACCTCCATTGTGGAAAACTTTCCTAACCCAGAATTGCCTGATGCTCCTCCAGTTGTTGGTGTTACG ACTAACTTGTTAAGAAACATTCAATTGGCTCAAAACAATGTTAACATTGCCGAAACTAACCTACCT GTTCACTACGATTTAAATGGCCCACGTAAACTTTTCGCCAATTACAAATTGCCCGTCCACGTTCGT CGTTCTAACTTCAGATTGCCTTCCAACCCTTCCACCCCAGTTATCATGATCGGTCCAGGTACCGG TGTTGCCCCATTCCGTGGGTTTATCAGAGAGCGTGTCGCGTTCCTCGAATCACAAAAGAAGGGC GGTAACAACGTTTCGCTAGGTAAGCATATACTGTTTTATGGATCCCGTAACACTGATGATTTCTTG TACCAGGACGAATGGCCAGAATACGCCAAAAAATTGGATGGTTCGTTCGAAATGGTCGTGGCCC ATTCCAGGTTGCCAAACACCAAAAAAGTTTATGTTCAAGATAAATTAAAGGATTACGAAGACCAAG TATTTGAAATGATTAACAACGGTGCATTTATCTACGTCTGTGGTGATGCAAAGGGTATGGCCAAG GGTGTGTCAACCGCATTGGTTGGCATCTTATCCCGTGGTAAATCCATTACCACTGATGAAGCAAC AGAGCTAATCAAGATGCTCAAGACTTCAGGTAGATACCAAGAAGATGTCTGGTAA SEQ ID No 18. A.thaliana mRNA ATR2 for NADPH-cytochrome P450 reductase, X66017
ATGTCCTCTTCTTCTTCTTCGTCAACCTCCATGATCGATCTCATGGCAGCAATCATCAAAGGAGAG CCTGTAATTGTCTCCGACCCAGCTAATGCCTCCGCTTACGAGTCCGTAGCTGCTGAATTATCCTC TATGCTTATAGAGAATCGTCAATTCGCCATGATTGTTACCACTTCCATTGCTGTTCTTATTGGTTGC ATCGTTATGCTCGTTTGGAGGAGATCCGGTTCTGGGAATTCAAAACGTGTCGAGCCTCTTAAGCC TTTGGTTATTAAGCCTCGTGAGGAAGAGATTGATGATGGGCGTAAGAAAGTTACCATCTTTTTCGG TAC AC AAACTG GTACTGCTG AAGGTTTTG CAAAG GCTTTAGG AG AAG AAGCTAAAGC AAG ATATG AAAAGACCAGATTCAAAATCGTTGATTTGGATGATTACGCGGCTGATGATGATGAGTATGAGGAG AAATTGAAGAAAGAGGATGTGGCTTTCTTCTTCTTAGCCACATATGGAGATGGTGAGCCTACCGA CAATGCAGCGAGATTCTACAAATGGTTCACCGAGGGGAATGACAGAGGAGAATGGCTTAAGAAC TTGAAGTATGGAGTGTTTGGATTAGGAAACAGACAATATGAGCATTTTAATAAGGTTGCCAAAGTT GTAGATGACATTCTTGTCGAACAAGGTGCACAGCGTCTTGTACAAGTTGGTCTTGGAGATGATGA CCAGTGTATTGAAGATGACTTTACCGCTTGGCGAGAAGCATTGTGGCCCGAGCTTGATACAATAC TGAGGGAAGAAGGGGATACAGCTGTTGCCACACCATACACTGCAGCTGTGTTAGAATACAGAGTT TCTATTC ACG ACTCTG AAG ATGCC AAATTC AATG ATATAAC ATTG GCAAATGG G AATG GTTAC ACT GTGTTTGATGCTCAACATCCTTACAAAGCAAATGTCGCTGTTAAAAGGGAGCTTCATACTCCCGA GTCTGATCGTTCTTGTATCCATTTGGAATTTGACATTGCTGGAAGTGGACTTACGATGAAACTTGG AGATCATGTTGGTGTACTTTGTGATAACTTAAGTGAAACTGTAGATGAAGCTCTTAGATTGCTGGA TATGTCACCTGATACTTATTTCTCACTTCACGCTGAAAAAGAAGACGGCACACCAATCAGCAGCTC ACTGCCTCCTCCCTTCCCACCTTGCAACTTGAGAACAGCGCTTACACGATATGCATGTCTTTTGA GTTCTCCAAAGAAGTCTGCTTTAGTTGCGTTGGCTGCTCATGCATCTGATCCTACCGAAGCAGAA CGATTAAAACACCTTGCTTCACCTGCTGGAAAGGATGAATATTCAAAGTGGGTAGTAGAGAGTCA AAGAAGTCTACTTGAGGTGATGGCCGAGTTTCCTTCAGCCAAGCCACCACTTGGTGTCTTCTTCG CTGGAGTTGCTCCAAGGTTGCAGCCTAGGTTCTATTCGATATCATCATCGCCCAAGATTGCTGAA ACTAGAATTCACGTCACATGTGCACTGGTTTATGAGAAAATGCCAACTGGCAGGATTCATAAGGG AGTGTGTTCCACTTGGATGAAGAATGCTGTGCCTTACGAGAAGAGTGAAAAACTGTTCCTCGGGC GGCCGATATTTGTTAGGCAATCCAACTTCAAGCTTCCTTCTGATTCTAAGGTACCGATCATCATGA TCGGTCCAGGGACTGGATTAGCTCCATTCAGAGGATTCCTTCAGGAAAGACTAGCGTTGGTAGAA TCTGGTGTTGAACTTGGGCCATCAGTTTTGTTCTTTGGATGCAGAAACCGTAGAATGGATTTCATC TACGAGGAAGAGCTCCAGCGATTTGTTGAGAGTGGTGCTCTCGCAGAGCTAAGTGTCGCCTTCT CTCGTGAAGGACCCACCAAAGAATACGTACAGCACAAGATGATGGACAAGGCTTCTGATATCTGG AATATGATCTCTCAAGGAGCTTATTTATATGTTTGTGGTGACGCCAAAGGCATGGCAAGAGATGTT CACAGATCTCTCCACACAATAGCTCAAGAACAGGGGTCAATGGATTCAACTAAAGCAGAGGGCTT CGTGAAGAATCTGCAAACGAGTGGAAGATATCTTAGAGATGTATGGTAA
SEQ ID No 19. Artemisia annua cytochrome P450 reductase (CPR) mRNA, complete cds, JN594507 ATGCAATCAACAACTTCCGTTAAGTTATCTCCCTTCGATCTAATGACGGCGTTACTTAACGGCAAG GTATCGTTCGACACATCAAACACATCCGATACGAATATTCCGTTAGCGGTGTTTATGGAGAATCGT GAGCTTTTGATGATTTTAACTACTTCAGTTGCGGTGTTGATCGGATGCGTTGTGGTGCTTGTGTG GAGACGGTCGTCGTCGGCGGCGAAGAGAGCGGCGGAGTCGCCGGTGATTGTTGTGCCGAAGAA AGTGACGGAGGATGAGGTTGATGATGGACGGAAGAAAGTTACTGTGTTTTTTGGAACTCAGACTG GTACTGCTGAAGGTTTTGCTAAGGCGCTTGTTGAAGAAGCTAAAGCGCGATATGAAAAGGCGGT GTTTAAAGTGATTGATTTGGATGATTATGCTGCTGAAGATGATGAGTATGAGGAGAAGTTAAAGAA AGAATCTCTTGCTTTTTTCTTTTTAGCTACGTATGGAGATGGTGAGCCGACAGATAATGCTGCTAG ATTCTATAAATGGTTTACCGAGGGTGAAGAGAAAGGTGAATGGCTTGAAAAGCTTCAATACGCAG TGTTTGGACTTGGTAACAGACAGTATGAGCATTTCAACAAGATTGCGAAGGTGGTCGATGAAAAA CTTACGGAACAGGGTGCAAAGCGCCTTGTTCCTGTTGGCATGGGAGACGACGATCAATGTATTG AAG ACG ACTTC ACTGCATG G AAAGAGTTG GTGTG GCCTG AGTTG G ATC AATTACTTCGTG ATG AG GATGATACATCTGTTGCCACCCCATACACAGCTGCTGTTGCAGAATACCGTGTTGTGTTCCATGA TAAACCAG AG ACATATG ATCAGG ATCAACTG ACAAATGGCCATGCTGTTCATG ATGCTCAACATC CATGCAGATCCAATGTAGCTGTCAAAAAGGAGCTCCATTCCCCTCTATCTGACCGTTCTTGCACT CATTTGGAATTTGATATCTCTAATACTGGATTATCGTATGAAACTGGGGACCATGTTGGAGTCTAC GTTGAGAATCTAAGTGAAGTTGTGGACGAAGCTGAAAAATTAATAGGTTTACCGCCGCACACTTAT TTCTCAATACACGCTGATAACGAAGACGGGACACCACTTGGTGGAGCCTCTTTGCCACCTCCTTT CCCTCCATGCACTTTAAGAAAAGCATTGGCTTCCTATGCCGATGTTTTGAGCTCTCCTAAAAAGTC AGCTTTGCTTGCTTTAGCTGCTCATGCTACTGATTCTACTGAAGCTGATAGACTGAAATTTCTTGC GTCTCCTGCGGGAAAGGATGAATATGCTCAGTGGATAGTTGCAAGCCACAGAAGTCTCCTTGAG GTCATGGAGGCCTTCCCATCAGCTAAGCCTCCGCTTGGTGTTTTTTTTGCATCTGTCGCCCCACG TTTGCAGCCGAGATACTATTCCATTTCTTCTTCCCCAAAGTTTGCGCCAAATAGGATTCATGTAAC TTGTGCATTAGTGTATGAGCAAACACCATCAGGCCGCGTTCACAAGGGAGTCTGTTCAACATGGA TGAAGAATGCTGTGCCTATGACAGAAAGCCAGGATTGCAGTTGGGCCCCAATTTATGTTAGAACA TCCAATTTCAGACTTCCTTCTGATCCTAAGGTCCCAGTTATCATGATTGGCCCAGGCACTGGATTG GCTCCATTTAGAGGTTTCCTTCAGGAAAGGTTAGCTCAGAAGGAAGCTGGGACTGAGCTCGGAA CAGCCATCTTATTCTTCGGATGCAGGAATCGCAAAGTGGATTTCATATATGAGGACGAGCTTAATA ATTTCGTGGAGACTGGGGCTCTTTCCGAGCTTGTTACGGCCTTCTCTCGTGAAGGTGCCACTAAG GAGTACGTGCAACACAAGATGACTCAGAAGACTTCGGATATCTGGAATTTACTCTCTGAGGGAGC ATATTTGTATGTTTGCGGTGATGCCAAAGGCATGGCCAAAGATGTACATCGGACTCTGCACACTA TTGTGCAAGAACAGGGATCTCTAGACTCCTCAAAGGCGGAGCTCTACGTGAAGAATCTACAAATG GCAGGAAGATATCTCCGTGATGTATGGTAA SEQ ID No 20. Artemisia annua cytochrome P450 reductase mRNA, complete cds, DQ984181
ATGCAATCAACAACTTCCGTTAAGTTATCTCCCTTCGATCTAATGACGGCGTTACTTAACGGCAAG GTATCGTTCGACACATCAAACACATCGGATACGAATATTCCGTTAGCGGTGTTTATGGAGAATCGT GAGCTTTTGATGATTTTAACTACTTCGGTTGCGGTTTTGATCGGATGCGTTGTGGTGCTTGTGTGG AGACGGTCGTCGTCGGCGGCGAAGAAAGCGGCGGAGTCGCCGGTGATTGTTGTGCCGAAGAAA GTGACGGAGGATGAGGTTGATGATGGACGGAAGAAAGTTACTGTGTTTTTTGGAACTCAGACTGG TACTGCTGAAGGTTTTGCTAAGGCGCTTGTTGAAGAAGCTAAAGCGCGATATGAAAAGGCGGTGT TTAAAGTGATTGATTTGGATGATTATGCTGCTGAGGACGATGAGTATGAGGAGAAGTTAAAGAAA GAATCTCTTGCTTTTTTCTTTTTAGCTACGTATGGAGATGGTGAGCCGACAGATAATGCTGCTAGA TTCTATAAATGGTTTACCGAGGGTGAAGAGAAAGGTGAATGGCTTGACAAGCTTCAATACGCAGT GTTTGGACTTGGTAACAGACAGTATGAGCATTTCAACAAGATTGCGAAGGTGGTCGATGAAAAAC TTGTGGAGCAGGGTGCAAAGCGCCTTGTTCCTGTTGGCATGGGAGACGATGATCAATGTATTGAA GACGACTTCACTGCATGGAAAGAGTTGGTGTGGCCTGAGTTGGATCAATTACTTCGTGATGAGGA TGATACATCTGTTGCCACTCCATACACAGCTGCTGTTGCAGAATACCGTGTTGTGTTCCATGATAA ACCAGAGACATATGATCAGGATCAACTGACAAATGGCCATGCTGTTCATGATGCTCAACATCCAT GCAGATCCAATGTCGCTGTCAAAAAGGAGCTCCATTCCCCTCTATCTGACCGGTCTTGCACTCAT TTGGAATTTGATATCTCTAATACTGGATTATCGTATGAAACTGGGGACCATGTTGGAGTCTACGTT GAGAATCTAAGTGAAGTTGTGGACGAAGCTGAAAAATTAATAGGTTTACCGCCGCACACTTATTTC TCAGTACACGCTGATAACGAAGACGGGACACCACTTGGTGGAGCCTCTTTGCCACCTCCTTTCCC TCCATGCACTTTAAGAAAAGCATTGGCTTCCTATGCCGATGTTTTGAGCTCTCCTAAAAAGTCAGC TTTGCTTGCTTTAGCTGCTCATGCTACTGATTCTACTGAAGCTGATAGACTGAAATTTCTTGCGTC TCCTGCGGGAAAGGATGAATATGCTCAGTGGATAGTTGCAAGCCACAGAAGTCTCCTTGAGGTCA TGGAGGCCTTCCCATCAGCTAAGCCTCCGCTTGGTGTTTTTTTTGCATCTGTCGCCCCACGTTTG CAGCCGAGATACTATTCCATTTCTTCTTCCCCAAGGTTTGCGCCAAATAGGATTCATGTAACTTGT GCATTAGTGTATGAGCAAACACCATCAGGCCGCGTTCACAAGGGAGTCTGTTCAACATGGATGAA GAATGCCGTGCCTATGACAGAAAGCCAGGATTGCAGTTGGGCCCCAATTTATGTTAGAACATCCA ATTTCAGACTTCCTTCTGATCCTAAGGTCCCAGTTATCATGATTGGCCCAGGCACTGGATTGGCT CCATTTAGAGGTTTCCTTCAGGAAAGGTTAGCTCAGAAGGAAGCTGGGACTGAGCTCGGAACAG CCATCTTATTCTTCGGATGCAGGAATCGCAAAGTGGATTTCATATATGAGGACGAGCTTAATAATT TCGTGGAGACTGGGGCTCTTTCCGAGCTTGTTACGGCCTTCTCTCGTGAAGGTGCCACTAAGGA GTACGTGCAACACAAGATGACTCAGAAGGCTTCGGATATCTGGAATTTACTCTCTGAGGGAGCAT ATTTGTATGTTTGCGGTGATGCCAAAGGCATGGCCAAAGATGTACATCGGACTCTGCACACTATT GTGCAAGAACAGGGATCTCTAGACTCCTCAAAGGCGGAGCTCTACGTGAAGAATCTACAAATGG CAGGAAGATATCTCCGTGATGTATGGTAA
SEQ ID No 21 . Artemisia annua cytochrome P450 reductase mRNA, complete cds, DQ318192 ATGCAATCAACAACTTCCGTTAAGTTATCTCCCTTCGATCTAATGACGGCGTTACTTAACGGCAAG GTATCGTTCGACACATCAAACACATCGGATACGAATATTCCGTTAGCGGTGTTTATGGAGAATCGT GAGCTTTTGATGATTTTAACTACTTCGGTTGCGGTGTTGATCGGATGCGTTGTGGTGCTTGTGTG GAGACGGTCGTCGTCGGCGGCGAAGAAAGCGGCGGAGTCGCCGGTGATTGTTGTGCCGAAGAA AGTGACGGAGGATGAGGTTGATGACGGACGGAAGAAAGTTACTGTGTTTTTTGGAACTCAGACTG GTACTGCTGAAGGTTTTGCTAAGGCGCTTGTTGAAGAAGCTAAAGCGCGATATGAAAAGGCGGT GTTTAAAGTGATTGATTTGGATGATTATGCTGCTGAAGATGATGAGTATGAGGAGAAGTTAAAGAA AGAATCTCTTGCTTTTTTCTTTTTAGCTACGTATGGAGATGGTGAGCCGACAGATAATGCTGCTAG ATTCTATAAATG GTTTACCG AGG GTG AAG AG AAAGGTG AATG GCTTG AC AAGCTTC AATACGCAG TGTTTGGACTTGGTAACAGACAGTATGAGCATTTCAACAAGATTGCGAAGGTGGTCGATGAAAAA CTTGTGGAGCAGGGTGCAAAGCGCCTTGTTCCTGTTGGCATGGGAGACGATGATCAATGTATCG AAG ACG ACTTC ACTGCATG G AAAGAGTTG GTG TG GCCTG AGTTG G ATC AATTACTTCGTG ATG AG GATGATACATCTGTTGCCACTCCATACACAGCTGCTGTTGGAGAATACCGTGTTGTGTTCCATGA CAAACCAGAGACATATGATCAGGATCAACTGACAAATGGCCATGCTGTTCATGATGCTCAACATC CATGCAGATCCAATGTCGCTGTCAAAAAGGAGCTCCATTCCCCTCTATCTGACCGGTCTTGCACT CATTTGGAATTTGATATCTCTAATACTGGATTATCGTATGAAACTGGGGACCATGTTGGAGTCTAC GTTGAGAATCTAAGTGAAGTTGTGGACGAAGCTGAAAAATTAATAGGTTTACCGCCGCACACTTAT TTCTCAGTACATACTGATAACGAAGACGGGACACCACTTGGTGGAGCCTCTTTGCCACCTCCTTT CCCTCCATGCACTTTAAGAAAAGCATTGGCTTCCTATGCCGATGTTTTGAGCTCTCCTAAAAAGTC AGCTTTGCTTGCTTTAGCTGCTCATGCTACTGATTCTACTGAAGCTGATAGACTGAAATTTTTTGC GTCTCCTGCTGGAAAGGATGAATATGCTCAGTGGATAGTTGCAAGCCACAGAAGTCTCCTTGAGG TCATGGAGGCCTTCCCATCAGCTAAGCCTCCGCTTGGTGTTTTTTTTGCATCTGTCGCCCCACGT TTGCAGCCGAGATACTATTCCATTTCTTCTTCCCCAAAGTTTGCGCCAAATAGGATTCATGTAACT TGTGCATTAGTGTATGAGCAAACACCATCAGGCCGCGTTCACAAGGGAGTCTGTTCAACATGGAT GAAGAATGCCGTGCCTATGACAGAAAGCCAGGATTGCAGTTGGGCCCCAATTTATGTTAGAACAT CCAATTTCAGACTTCCTTCTGATCCTAAGGTCCCAGTTATCATGATTGGCCCAGGCACTGGATTG GCTCCATTTAGAGGTTTCCTTCAGGAAAGGTTAGCTCAGAAGGAAGCTGGGACTGAGCTCGGAA CAGCCATCTTATTCTTCGGATGCAGGAATCGCAAAGTGGATTTCATATATGAGGACGAGCTTAATA ATTTCGTGGAGACGGGGGCTCTTTCCGAGCTTGTTACGGCCTTCTCTCGTGAAGGTGCCACTAA GGAGTACGTGCAACACAAGATGACTCAGAAGGCTTCGGATATCTGGAATTTACTCTCTGAGGGAG CATATTTGTATGTTTGCGGTGATGCCAAAGGCATGGCCAAAGATGTACATCGGACTCTGCACACT ATTGTGCAAGAACAGGGATCTCTAGACTCCTCAAAGGCGGAGCTCTACGTGAAGAATCTACAAAT GGCAGGAAGATATCTCCGTGATGTATGGTAA
SEQ ID No 22. Hybrid poplar (Populus trichocarpa x P. deltoides) NADPH-cytochrome P450 oxydoreductase isoform 1 mRNA, complete cds, AF302496
ATGAGTTCAGGTGGTTCAAATTTGGCGAGGTTCGTTCAATCAGTGCTAGGGATATCTTTTGGCGA CTCCCTGTCTGACTCAGTTGTTGTGATAATTACCACGTCGTTTGCTGCTCTAGTTGGATTGGTGGT GCTTGTATTGAAGAGATCGTCCGATCGGAGCAAAGACGTCAAGCCGTTGGTGGTTCCTAAGTCAC TTTCAATTAAGGACGAGGAGGATGAGTCCGAGGCTCTGGGTGGGAAAACTAAGGTTACTATCTTT TATGGGACTCAGACCGGAACTGCGGAGGGTTTTGCTAAGGCTTTAGCTGAAGAGGTCAAAGCAA GATATGAGAAAGCAGCTGTTAAAGTGTTTGACCTGGATGATTATGCTATGGAAGATGATCAATATG AAGAAAAATTGAAGAAAGAGACTTTGGCATTATTCATGGTTGCCACTTATGGAGATGGAGAGCCA ACTGATAACGCTGCGAGATTTTATAAGTGGTTTACTGAGGGAAATGAAAGGGGAATCTGGCTTCA ACAGCTTTCTTATGGTGTTTTTGGTCTTGGTAACCGTCAATATGAACATTTTAATAAGATAGCGAAG GTGCTTGATGACCTGCTCTATGAACAAGGAGGAAAGCGTCTCGTTCCTGTTGGTCTTGGCGACGA TGATCAATGCATAGAGGATGATTTTTCTGCTTGGAAAGAATTTTTGTGGCCTGAGCTAGACCAGTT GCTCAGAGATGAAGATGATGTGAATGCTCCATCTACTCCTTATACAGCTGCTATACCTGAATATCG ATTAGTGATTCATGATCCTTCTATAATATCTGTTGAGGATAAATTCTCAAACTTGGCAAATGGGAAT GTGTCTTTTGATATTCACCATCCATGCAGAGTCAATGTTGCTGTCCAAAAAGAGCTTCACAAAGCA GAGTCTGACCGGTCTTGCATACATCTGGAATTTGACATCACAGGGACTGGAATTACATATGAAAC TGGAGACCATTTGGGGGTGTATGCTGAGAATAGTGATGAAACTGTTGAAGAAGCAGGGAAGTTG CTAGATAAACCTTTAGATTTGTTGTTTTCTATTCATGCTGATAATGAGGATGGCACAGCTATTGGAA GCTCATTGCCGCCTCCTTTCCCAGGTCCCTGCACACTTCACACTGCATTGGCATGCTATGCAGAT CTCTTGAGCCCTCCTAAAAAGGCTGCTTTGCTTGCTTTGGCTGCTCATGCCAGTGAACCTAGCGA GGCAGATAGACTCAAGTTTTTATCATCACCGCAAGGAAAGAATGAATACTCTCACTGGGTCATGG CAAGTCAGAGAAGTCTTCTCGAGGTAATGGCTGAGTTCCCATCTTCGAAACCTCCCCTTGGTATC TTTTTTGCTGCAGTGGCTCCTCGCCTACAGCCTCGCTACTATTCTATCTCATCCTCTCCTAGATAT ACTCCCAATAGAGTACATGTGACCTGTGCTTTAGTATATGGTCCAACTCCCACTGGTAGAATTCAC AAAGGGGTGTGTTCAACTTGGATGAAGAATGCAGTTCCTCTGGAGAAAAGTTATGAATGTAGTTG GGCTCCCATTTTCACCAGAACATCTAATTTCAAGTTACCAGCAGATCCTTCAACTCCAATTATAAT GGTG GGTCCTGGTACTG GATTGGC ACCTTTC AG AGG ATTTTTACAGG AAAG AATAG CCCTGAAAG AGGATGGTGTGAAGCTTGGTCCCGCCCTGCTTTTCTTTGGATGCAGAAATCGCCGAATGGATTTC ATATATGAGGATGAGCTCAATAATTTTGTCGAGCAAGGTGTGATATCCGAGTTGATAGTTGCATTC TCAAGGGAGGGGCCACAGAAGGAATATGTTCAACATAAGATGGTGGATAGAGCAGCAGAGATAT GGACTATAATTTCTCAAGGAGGTTATTTTTACGTGTGCGGTGATGCCAAGGGTATGGCTAGAGAT GTTCATAGGACTCTGCACACTATTGTGCAAGAGCAGGGAGGCCTGGACTCGTCGAAAACCGAGT CTATGGTGAAGAAGCTCCAAATGGAAGGACGGTATCTAAGAGATGTCTGGTGA
SEQ ID No 23. Hybrid poplar (Populus trichocarpa x P. deltoides) NADPH-cytochrome P450 oxydoreductase isoform 2 mRNA, complete cds, AF302497
ATGCAATCATCAAGCAGCTCGATGAAAGTGTCACCACTTGAACTTATGCAAGCCATAATCAAAGG CAAAGTGGACCCAACAAATGTTTCATCGGAATCCGGTGGTTCTGCTGCTGAGATGGCAACTTTGA TCCGCGAGAATCGTGAGTTTGTTATTATCTTAACTACTTCCATAGCGGTTTTGATCGGCTACGTTG TCGTTTTAATTTGGAGAAGATCATCCGGCTATCAGAAACCTAAAGTCCCTGTCCCTCCTAAGCCGT TGATTGTTAAAGACCTCGAACCTGAAGTTGATGATGGCAAGAAAAAGGTCACCATCTTTTTCGGCA CCCAAACTGGTACTGCTGAAGGATTTGCTAAGGCTCTAGCTGAGGAGGCAAAAGCTCGGTATGA GAAGGCTATATTTAAAACTGTTGATTTGGATGATTATGCGGAGGATGACGATGAATACGAAGAGA AATTGAAGAAAGAGTCTCTGGCCATTTTCTTCTTGGCCACATATGGAGATGGTGAGCCTACAGAT AACGCCGCGAGGTTTTATAAATGGTTTACAGATGGCAATGAGAGGGGGGAATGGCTTAAGGAAC TTCCATATGCTGTTTTTGGTCTTGGCAACAGGCAATACGAGCATTTTAATAAGATTGCCATAGTGG TGGATAAAATCCTTGGCAACCAGGGTGGGAAGCAGCTTGTTCCAGTGGGTCTTGGTGATGATGAT CAATGCATGGAAGATGACTTTGCCGCATGGCGAGAATTGTTGTGGCCTGAGTTGGACCAGTTGCT TCTTGATGGGGATGATCCAACTGGTGTTTCTACCCCTTATACTGCTGCCGTGGCAGAATATCGGG TTGTATTGCATGACCCTGAAGATGCACCATTAGAGGATGATAACTGGAGTAATGCGAATGGTCAT GCTATTTATGATGCTCAGCATCCATGCAGGGCTAATGTTACTGTGAGGAGGGAGCTTCATACCCC TGCATCTGATCGTTCATGTACCCATTTGGAGTTCGACATATCTGGCACTGGACTTGTATATGGAAC TGGTGATCATGTTGGTGTGTACTGTGAAAATCTAAGTGAAATTGTTGAGGAAGCACTGCAGTTGTT GGGTTTATCGCCAGATATTTACTTCACTATCCATACTGATAATGAGGATGGCACACCACTTAGTGG AAGTGCCTTGCCACCTCCATTCCCATCGTCCACCTTAAGAACAGCTCTAACTCGATATGCTGATCT TTTGAGTTCACCCAAAAAGTCTGCTTTAATGGCTTTAGCAGCTCATGCTACTAATCCAACCGAAGC TGATCGGCTAAGACATCTTGCATCACCTGCTGGAAAGGATGAATATGCACAATGGATAGTTGCAA ATCATAGAAGCCTCCTGGAAGTCATGGCTGAATTTCCATCAGCCAAACCCCCACTTGGAGTCTTC TTTGCTTCAGTTGCCCCGCGATTGCTGCCAAGATACTATTCTATTTCATCATCTCCAAGCATGGCA CCTTCAAGGATTCATGTTACATGTGCACTGGTTCTTGAGAAAACACCAGCAGGTCGAATTCACAAA GGAGTGTGCTCAACTTGGATGAAGAATGCTGTGCCTTTAGAGAAAAGCCATGATTGCAGCTGGG CACCTATTTTTGTTAGACAATCAAACTTCAAACTTCCAGCAGATACTAAAGTTCCCATCATTATGAT TGGCCCTGGAACTGGTTTAGCTCCTTTCAGGGGTTTCCTTCAGGAAAGATTAGCCCAGAAAGAAG CAGGAGCAGAACTGGGATCCTCTGTATTATTCTTTGGTTGCAGGAACCGTCAAATGGATTTTATCT ATGAAGATGAGCTCAACAATTTCGTTGAAAGTGGTGCACTTTCTGAACTATCTGTAGCCTTCTCAC GTGAGGGACCTACCAAGGAATATGTGCAGCATAAGATGATGCAGAAGGCTTCTGATATCTGGAAC ATGATTTCTCAAGGAGGATATTTATATGTTTGTGGAGATGCCAAGGGCATGGCTAAAGATGTCCA CAGAACTCTCCACACTATCGTGCAAGAGCAGGGATCTCTTGACAACTCCAAGACAGAGAGCTTTG TGAAGGGTCTGCAAATGAATGGCAGGTATCTGCGTGATGTATGGTAA
SEQ ID No 24. Hybrid poplar (Populus trichocarpa x P. deltoides) NADPH-cytochrome P450 oxydoreductase isoform 3 mRNA, complete cds, AF302498
ATGGAGTCATCAAGCAGCTCGATCAAAGTGTCTCCACTTGATCTTATGCAAGCCATAATCAAAGG CAAAGTGGACCCCGCGAATGTTTCATCGGAGTCCGGTGGTTCTGTTGCTGAGGTAGCAACTTTGA TCCTCGAGAATCGTGAGTTTGTTATGATCTTAACTACTTCCATCGCTGTTTTGATCGGCTGCGTCG TCGTTTTGATTTGGAGAAGATCATCTGGGTATCAGAGACCCAAAGTACCTGTGCCTCCCAAGCCC TTGATTGTTAAAGACCTTGAACCTGAAGTTGACGATGGCAAGAAAAAGGTCACCATCTTTTTCGGC ACCCAAACCGGTACGGCAGAAGGATTTGCTAAGGCTCTAGCTGAGGAGGCAAAAGCTCGGTATG ACAAGGCTACATTTAAAACTGTTGATATGGATGATTACGCGGGTGATGATGATGAATACGAAGAG AAATTGAAGAAAGAGGATCTGGTTATTTTCTTCTTGGCCACATACGGAGATGGTGAGCCTACTGAT AATGCGGCAAGGTTCTACAAATGGTTTACAGAGGGAAATGAGAGAGGGGAATGGCTCAAGGACC TTCCATATGCAGTTTTTGGCCTTGGCAACAGGCAGTACGAGCATTTTAACAAGATTGCTATAGTGG TGGATAAAATCTTTGCTGACCAGGGTGGGAAGCGCCTTGCCCCAGTGGGTCTTGGTGATGATGA TCAATGCATGGAAGATGACTTTGCTGCATGGCGGGAATTGTTGTGGCCTGAGATGGACCAGTTG CTTCTTGATGGAGACGATCCAACAGCTGTTTCTACTCCTTATGCTGCCACTGTATCAGAATATCGG GTTGTATTCCATAGCCCTGAAGATGCCCCATTAGAGGATGATAACTGGAGTAATGCAAATGGCCA TGCTGTCTATGATGCTCAGCATCCATGCAGGGCTAATGTTGCTGTGAGGAGGGAGCTTCATACCC CGGCATCTGATCGTTCATGTACCCATCTGGAGTTTGAAATATCAGGCACCGGACTTGCATATGGA ACTGGGGATCATGTTGGTGTGTACTGTGAAAATCTAAGTGAAACTGTAGAGGAAGCACTGCAGTT GTTGGGTTTATCACCAGATACTTATTTCTCTATCCACAATGATAATGAGGATGGCACGCCACTTAG TGGAGGCGCCTTGCCACCTCCATTCCCACCGTCCACCTTAAAAACTGCTCTAGCTCGATATGCTG ATCTTTTGAGTTTGCCCAAAAAGTCTGCTCTAATGGCTTTAGCAGCTCATGCTACTGATCCAACAG AAGCTGATCGACTAAGGCATCTTGCATCGCCTGCTGGGAAGGATGAATATGCACAATTGTTAGTT GCAAATCAGAGAAGCCTCCTTGAGGTCATGGCTGAATTTCCATCAGCCAAGCCCCCACTTGGTGT CTTCTTTGCTTCAGTTGCACCTCGGTTGCAGCCAAGATACTACTCTATTTCATCATCTCCAAGGAT GGCTCCATCAAGAATTCATGTTACATGTGCACTGGTTCTTGAGAAAACACTAGGAGGTCGTATTCA CAAAGGAGTTTGCTCAACTTGGATGAAGAACGCTGTGCCTCTGGAGAAAAGCCATGATTGCAGCT GGGCACCTGTTTTTGTTAGGCAATCAAACTTCAAACTTCCAGCAGATGCTAAAGTTCCCATCATTA TGATTGGCCCTGGAACTGGTTTAGCTCCCTTCAGAGGTTTCCTCCAGGAAAGATTAGCCCTGAAA GAAGCAGGATCAGAACTGGGATCCTCTGTATTATTCTTTGGTTGCAGGAACCGCAAAATGGATTT TATCTATGAAGACGAGCTCAACAACTTCGTTGAAAGTGGTGCACTTTCTGAACTAGTTGTTGCCTT CTCCCGTGAGGGACCTACCAAGGAATACGTGCAGCATAAGATGATGCAGAAGGCTTCTGATATCT GGAACATGATTTCACAAGGTGGATATTTATATGTTTGTGGTGATGCCAAAGGCATGGCTAAAGAT GTCCACAGAGCGCTCCACACTATTGTGCAAGAGCAGGGATCCCTTGACAACTCGAAGACGGAAA GCTTTGTGAAGAGTCTGCAAATGAATGGCAGGTATCTACGTGATGTATGGTAA
SEQ ID No 25. Vigna radiata NADPH cytochrome P450 mRNA, complete cds, L07843
ATGGCTTCCAATTCCGATTTGGTGCGCGCCGTTGAGTCGTTCCTTGGCGTTTCTCTAGGAGATTC
CGTTTCGGATTCGCTGCTTCTCATCGCCACCACCTCCGCGGCGGTTGTAGTCGGTCTTCTCGTGT
TTTTATGGAAGAAATCTTCGGATCGGAGCAAGGAGGTGAAGCCGGTGGTTGTGCCGAGGGATTT AATGATGGAGGAGGAAGAGGAAGTTGACGTTGCCGCCGGCAAGACTAAGGTCACCATTTTCTTC GGTACTCAGACCGGTACTGCTGAAGGCTTTGCTAAGGCGTTGGCAGAGGAGATCAAGGCAAGGT ATGAAAAAGCGGCTGTCAAAGTTGTTGACCTGGATGACTATGCAGCTGATGATGATCTATATGAG GAGAAGCTGAAGAAAGAGAGTCTTGTATTTTTCATGCTAGCAACTTACGGGGATGGAGAACCAAT AGACAATGCTGCAAGATTCTACAAATGGTTTACTGAGGGGAAAGACGAAAGGGGAATCTGGCTTC AAAAACTC ACCTATGG AGTTTTCG GCCTAGGTAAC AG GC AATACG AAC ATTTTAATAAG ATAG GTA AAGTTGTGGATGAAGAACTTGCTGAACAAGGTGCAAAGCGTCTAGTTGCAGTTGGATTAGGTGAT GATGATCAATCCATTGAAGATGATTTTTCTGCCTGGAAAGAAAGTTTATGGTCTGAGTTGGATCAG TTGCTCAGAGATGAGGATGATGCTAATACTGTCTCTACTCCCTATACAGCTGCTATTCTTGAATAC CGAGTAGTGATTCACGATCCCACTGCAGCATCAACCTATGATAATCACTCAACCGTGGCAAATGG GAATACTGAGTTTGATATTCATCATCCTTGCAGGGTGAATGTTGCTGTACAAAAGGAGCTTCACAA ACCTGAGTCTGATCGTTCTTGCATACATTTGGAATTTGATATATCGGGGACGAGCATAACATATGA TACTGGAGACCATGTGGGTGTTTATGCTGAGAACTGCAATGAAACTGTCGAAGAAACTGGGAAGT TGTTGGGTCAGAATTTGGATCTATTTTTTTCTCTTCACACAGACAAGGATGATGGCACTTCCCTAG GTGGTTCTCTCCTACCTCCTTTCCCTGGCCCTTGTTCACTGCGAACTGCATTAGCACGTTATGCT GATCTCTTGAACCCCCCACGAAAGGCTGCTTTACTTGCATTGGCTACTCATGCCTCTGAACCTAG CGACGAAAGATTAAAGTTCCTTTCATCTCCTCAGGGGAAGGATGAGTATTCCAAATGGGTGGTTG GAAGCCAGAGGAGTCTCGTTGAGGTGATGGCTGAGTTTCCATCAGCAAAACCTCCTCTTGGTGT GTTTTTTGCTGCAATAGCCCCTCGTTTACAGCCTCGTTATTATTCTATTTCATCCTCTCCAAGGTTT GCTCCTCAAAGGGTACATGTAACTTGTGCTTTGGTGTATGGTCCAACTCCCACTGGTAGAATTCA CAAAGGTGTATGTTCAACTTGGATGAAGAATGCTATTCCCTCAGAAAAAAGTCAAGACTGTAGCTC GGCTCCTATTTTTATTAGGCCATCAAATTTCAAGCTTCCAGTTGATCATTCAATACCTATTATTATG GTTGGACCTGGTACCGGTCTTGCACCTTTCAGGGGATTTTTGCAGGAAAGATATGCTCTCAAAGA GGATGGTGTTCAACTTGGCCCTGCATTACTCTTCTTTGGATGTAGAAATCGTCAAATGGATTTCAT TTATGAGGATGAGCTAAAGAGTTTTGTGGAACAAGGTTCTCTTTCAGAATTGATAGTTGCATTCTC TAGAGAGGGGGCTGAAAAGGAATATGTTCAACACAAGATGATGGACAAAGCTGCGCACCTTTGG AGTTTGATTTCTCAAGGAGGTTATCTTTACGTCTGTGGAGATGCCAAGGGCATGGCCAGAGATGT CCATCGAACTCTTCATTCCATTGTCCAGGAGCAGGAAAACGTGGACTCAACAAAAGCTGAAGCTA TAGTGAAAAAACTCCAGATGGACGGACGTTACCTTAGAGATGTATGGTGA
SEQ ID No 26. Petroselinum crispum NADPH cytochrome P450 reductase (CPR1 ) mRNA, complete cds, AF024635
ATGCAATCGGAATCAATGGAAGTGTCGCCGGTGGATTTGCTGGCGTCGATTCTGAAGATTGATTC GGTTGAATCGATGACGTTGCTGCTCGAGAACCGTGACGTCTTGATGTTACTTACGACGTCGTTTG CGGTGTTGATTGGATTAGGATTGGTGATGATGTGGCGGAGATCAACGACGATGACGAAGAGCGC GAAGAAGCTCGAGCCGGCGAAGATTGTGATCCCGAAATTTGAAATGGAGGAGGAAGTTGATGAC GGTAAAAAGAAGGTTACGATTTTTTACGGTACTCAGACCGGTACTGCTGAAGGTTTTGCTAAGGC ACTTGCGGAGGAGGCGAAAGCAAGATATCAGGATGCTATCTTTAAAACTATTGATTTGGATGATTA TGCGGGTGATGATGACGAGTATGAGACGAAACTTAAGAAAGAATCTATGGTGTTCTTCTTCTTAG CCACGTATGGTGATGGTGAACCAACCGACAATGCAGCGAGATTTTACAAGTGGTTTTGTGAGGGC AAAGAGAGAGGGGAGTGGCTTAACAATCTTCAATATGGTGTGTTTGGCCTTGGCAACAGGCAATA TGAGCATTTCAACAAGATTGCAGTGGTTGTGGATGACGGCCTTGTTGAGCAGGGTGCCAAGCGT CTTGTTCCAGTTGGTATGGGAGATGACGACCAATGTATTGAAGATGACTTTACTGCATGGCGGGA GTTAGTCTGGCCTGAGTTGGATCAACTGCTCTTGGACGAGGAGTCTAAGGCTGCTGCAACTCCAT ATACAGCTGCTGTGCTAGAATATCGTGTTCAGTTTTATAATCAAACTGATACATCATCTCCACTGG TTCGGAGTATGAGCAAATTAAATGGCCATGCTGTATATGATGCTCAACATCCCTGCAGGGCTAAT GTGGCTGTAAGAAGAGAGCTTCATACACCTGCATCGGATCGTTCCTGCACCCATCTGGAGTTCGA TATTTCCTCTACTGGACTTGCATATGAAACTGGTGACCATGTAGGAGTCTACACTGAAAATCTGAT TGAAATTGTTGAGGAGGCTGAAAGATTGATTGATATATCGCCAGATACTTATTTCTCCATTCATACT GAAAATGAAGATGGAACACCCCTTAGTGGGGGATCCCTGCCACCCCCCTTTCCCCCATGCAGCT TTAGAACTGCACTTACTAGATATGCAGATCTTTTGAGTACTCCAAAGAAGTCTGCTTTAGTTGCGT TGGCGGCTCATGCATCTGATCCTAGCGAAGCTGAACGATTGAGATTTCTTGCATCTCCTGTTGGA AAGGATGAATATGCGCAGTGGCTCGTCGCTAGTCAGAGGAGCCTGCTAGAAGTCTTGGCTGCGT TTCCATCAGCCAAACCCCCATTGGGAGTTTTCTTTGCATCTGTTGCCCCACGCTTGCAGCCCAGA TACTATTCCATCTCTTCCTCACCAAGGATGGCTCCATCAAGAATTCATGTAACTTGTGCATTAGTT CACGAGACAACGCCTGCAGGAAGAATACACAAAGGGCTCTGTTCTACTTGGATGAAGAATGCTGT CTCATTGGAGGATGCCCATGTGAGTAGCTGGGCTCCTATTTTTGTTAGGCAATCAAACTTCAGGC TTCCAACTGATTCGAAAGTACCTATTATTATGATTGGTCCTGGCACCGGGTTGGCTCCTTTTAGGG GTTTCATGCAGGAAAGGTTAGCTCTTAAGGAATCTGGAGCAGAACTTGGATCTGCAGTACTGTAC TTTGGATGCAGGAATAGAAAATTGGATTTCATTTACGAGGATGAGCTTAATCACTTTGTTGAAACT GGTGCAATATCTGAGATGGTTGTTGCTTTCTCACGTGAGGGTCCTGCTAAGGAATATGTCCAACA TAAGATGAGTCAAAAGGCTTCAGAGATATGGGACATGATATCTCATGGAGCATATATTTATGTCTG TGGTGATGCCAAAGGCATGGCCAGAGACGTGCACAGGATGCTCCACACAATTGCACAAGAGCAG GGAGCTCTGGACAGTAGCCATGCAGAGAGCTTGGTGAAAAATCTTCATATGAGTGGAAGATATTT ACGTGATGTATGGTAA SEQ ID No 27. Petroselinum crispum NADPH cytochrome P450 reductase (CPR2) mRNA, complete cds, AF024634
ATGGGTGGTGAGAGCTTGGCCACGTCACTGCCGGCGACGCTCCTCGAGAATCGTGACCTGTTAA TGCTCCTCACCACGTCAATCGCCGTTTTGATTGGATGCGCTGTCGTTTTGGTGTGGCGCAGATCG AGCCTGCGATCGGTTAAATCAGTTGAGCCGCCGAAGCTGATTGTACCGAAAGTTGAAATTGAAGA TGAAGTTGATGACGGTAAAAAGAAAGTTACCGTGTTTTTCGGCACTCAAACTGGTACTGCTGAAG GCTTTGCTAAGGCTTTTGCGGAGGAGGCGAAAGCGCGGTACGAGAAGGCGAAATTCAGAGTTGT TGATTTAGATGATTATGCGGCGGAGGATGAGGAGTACGAGGCGAAATTTAAGAAGGAATCTTTTG CGTTTTTCTTCTTAGCTACATATGGTGACGGTGAGCCAACTGACAATGCGGCTAGATTCTATAAGT GGTTTTCGGAGGGTGAAGAGAAAGGAGATTGGTTAAATAAGCTTCAATATGGAGTGTTTGGCCTT GGAAATAGGCAGTACGAACATTTTAACAAGATCGCGAAAGTTGTTGACGATGGTCTTGCAGATCA GGGAGCCAAGCGTATTGTTGAAGTGGGTATGGGTGATGATGATCAATGCATTGAAGATGACTTCA CCGCATGGCGGGAATTGGTCTGGCCTGAATTGGATAAGTTGCTTTTGGATGAGGATGACACATCT GCTGCAACTCCTTACACAGCTGCTGTTTTGGAATATCGGGTTGTGGTTTATGACCAACTTGATACA GCTACACTGGATCGGAGTTTAAGTACCCAAAATGGCCATACAGTTCATGATGCTCAACATCCGTG CAGGTCTAGCGTAGCTGCAAAGAAAGAGCTTCATAAACCTGCATCTGATCGTTCGTGCATTCACT TGGAGTTTGACATTTCACACACCGGGCTTGCATATGAAACTGGTGACCACGTCGGGGTCTACTGT GAGAATCTGGTTGAAATTGTTGAGGAGGCTGAAAAGCTATTAGGCATGCAACCAAACACTTACTT CTCTGTCCATATTGACGACGAAGATGGAACACCACTTACTGGAGGCTCTCTGCCACCTCCCTTCC CGCCATGCACTGTGAGAAGTGCACTGGCAAAATATGCAGATCTTTTGAGCTCTCCGAAGAAGTCT GCCTTGCTTGCTCTGGCGGCACATGCTTCTGATCCTACCGAGGCTGACCGATTAAGATTGTTAGC ATCTCCTGCTGGAAAGGATGAATATGCACAATGGGTAGTTGCTAGCCACAGAAGCCTTCTTGAAG TCTTGGCTGAATTTCCATCAGCCAAACCCCCACTGGGAGTATTCTTTGCATCAGTTGCACCACGC TTGCAGCCCAGATACTATTCTATCTCTTCTTCACCAAGGATGGTACCATCAAGGATTCATGTTACT TGTGCTTTAGTTTATGAGAAAACACCTACGGGGCGAATTCACAAAGGAGTGTGTTCAACTTGGAT GAAGAATGCTGTTTCTTTGGAGGAAAGCCATGATTGCAGTTGGGCACCCATTTTTGTTAGACAATC CAACTTCAAGCTTCCTTCTGATACGAAAGTCCCCATCATTATGATTGGCCCTGGAACTGGATTAGC TCCTTTCAGGGGTTTCCTGCAGGAAAGGCAAGCTCTGAAGGATGCTGGAGCAGAGCTGGGAACT GCTGTGTTATACTTTGGGTGCAGGAATAGAAATTTGGATTTTATTTACGAGGATGAGCTAAATAAG TTTGTCGAAAGTGGTTCAATCTCTGAGCTAATTGTAGCTTTCTCACGTGAGGGGCCCACTAAGGA GTATGTGCAACATAAGATGTTGCAGAAAGCGTCAGAGATCTGGAACTTGATTTCTGAGGGTGCAT ATATTTATGTCTGCGGTGATGCAAAAGGCATGGCCAGGGATGTCCATCGCATGCTTCACACAATT GCACAGGAGCAGGGAGCTCTTGACAGCAGCAAGGCGGAGAGCTGGGTTAAGAACCTTCAAATGA CTGGGAGGTATCTTCGTGATGTATGGTAA SEQ ID No 28. Gossypium hirsutum cultivar CRI 12 NADP cytochrome P450 reductase (CPR1) imRNA, complete cds, FJ719368
ATGAGTTCGAGTTCCGATTTGGTGGGTTTTGTTGAATCGGTATTGGGAGTGTCGTTAGAGGGTTC
GGTAACGGATTCTATGATAGTGATCGCGACGACGTCGTTAGCGGTGATTCTGGGGCTTTTGGTGT
TTTTCTGGAAGAAATCGGGTTCCGAACGGAGCCGTGATGTCAAACCGTTGGTGGCACCTAAGCC TGTTTCACTCAAGGACGAGGAAGACGACGACGCCGTTATCGCTGCCGGCAAAACTAAAGTTACC ATTTTCTACGGCACACAGACGGGAACGGCCGAGGGATTTGCTAAGGCTTTAGCCGAAGAGATCA AGGCAAGATATGAGAAAGCTGCTGTCAAAGTTGTTGACCTGGATGATTATGCCATGGACGATGAA CAATACGAAGAGAAGCTGAAAAAGGAGACTTTAGCTTTTTTCATGGTGGCCACTTATGGAGACGG AGAGCCAACCGATAACGCTGCTAGGTTTTACAAATGGTTTACTGAGGGAAATGAAAGGCTGCCGT GGCTTCAACAACTCACATATGGTGTATTTGGTCTGGGTAACCGTCAATATGAACATTTTAATAAGA TAGCAAAGGTGCTTGATGAGCAACTTTCCGAACAAGGTGCTAAACGTCTTATTGAAGTTGGTCTT GGAGATGATGATCAATGCATTGAAGATGATTTTACTGCATGGAGAGAACTGCTCTGGCCAGAGTT AGATCAACTGCTTAGAGATGAAGATGATGAAAATGCTACCTCTACCCCGTATACGGCAGCTATTC CTGAATATAGAGTAGTGGTTCATGATCCTGCTGTGATGCACGTAGAGGAGAATTACTCAAATAAG GCAAATGGGAATGCTACATATGACCTCCACCATCCATGCAGAGTTAATGTTGCCGTTCAGAGAGA GCTCCACAAGCCTGAATCTGATCGCTCCTGTATTCATTTGGAGTTTGACATATCAGGGACTGGTAT CACATATGAAACCGGAGATCACGTTGGTGTCTACGCGGATAATTGCGTTGAGACTGTTGAGGAAG CTGCAAGATTGTTGGGTCAACCTCTGGATTTGCTATTTTCTATACACACTGACAATGAGGACGGCA CATCTGCTGGAAGCTCATTGCCGCCACCTTTTGCCAGTCCATGTACACTGCGAATGGCATTGGCA CGATATGCAGATCTTTTAAACCCTCCACGGAAGGCTGCTTTGATTGCCTTGGCTGCTCATGCCAC TGAACCCAGTGAAGCAGAAAAGCTTAAGTTCTTATCGTCACCACAGGGGAAGGATGAGTACTCAC AATGGGTTGTTGCAAGTCAGAGAAGTCTTCTTGAGGTTATGGCTGAGTTCCCATCAGCAAAACCT CCTCTTGGTGTATTTTTTGCTGCAGTAGCTCCTCGTTTACAGCCTCGTTATTATTCTATCTCATCCT CCCCTAGGTTTGTACCTGCCAGGGTTCATGTAACCTGCGCTTTAGTTTATGGTCCAACTCCAACT GGAAGAATTCACCGGGGTGTGTGCTCAACATGGATGAAGAATGCAGTTCCTTTAGAGAAAAGCAA TGATTGTAGCTGGGCTCCTATTTTTATTCGGCAATCCAATTTTAAGCTACCAGCAGATCCTTCAGT TCCAATCATCATGGTTGGACCCGGGACTGGATTGGCACCTTTCAGAGGTTTTCTACAGGAAAGAT TGGTCCTCAAAGAAGATGGTGCAGAACTTGGCTCTTCTCTACTCTTTTTTGGATGTAGGAATCGG CGAATGGATTTCATTTATGAGGATGAGCTCAATAACTTTGTGGAACAAGGTGCCCTTTCTGAGCTT GTTGTTGCATTTTCACGAGAAGGTCCGCAGAAGGAATATGTTCAACACAAAATGATGGATAAAGC TGCAGATATATGGAACCTAATTTCTAAGGGTGGATATCTTTATGTTTGTGGTGATGCCAAGGGTAT GGCAAGAGATGTTCATCGCACTTTGCACACTATTATTCAGGAGCAGGAAAATGTGGATTCATCAA AGGCGGAGTCTATGGTGAAGAAACTCCAGATGGACGGACGATACCTTAGAGATGTGTGGTGA
SEQ ID No 29. Gossypium hirsutum cultivar CRI 12 NADP cytochrome P450 reductase (CPR2) mRNA, complete cds, FJ719369
ATGGATTCTTCATCATCATCATCATCTTCAGGTCCCTCACCTCTCGATCTCATGTCGGCTTTAGTC AAGGCCAAAATGGACCCTTCCAACGCTTCCTCCGACTCTGCTGCTCAAGTAACCACCGTCCTTTT CGAGAACAGAGAGTTCGTTATGATTTTAACTACCTCCATTGCTGTGCTCATCGGCTGCGTCGTCA TTTTGATCTGGCGTAGATCCGCTTCTCAAAAGCCTAAACAAATCCAGCTTCCTCTTAAGCCTTCGA TCATTAAAGAACCAGAACTTGAAGTTGACGATGGAAAGAAAAAAGTCACCATCCTCTTCGGTACTC AAACCGGCACCGCCGAAGGCTTCGCTAAGGCTCTAGTCGAGGAGGCAAAAGCACGCTATGAAAA GGCGACTTTTAATATTGTAGATTTGGATGATTATGCAGCAGATGATGAAGAATACGAGGAGAAGAT GAAGAAAGATAATTTGGCTTTCTTCTTCTTGGCCACTTATGGAGACGGTGAGCCAACAGATAATG CAGCCAGGTTCTATAAATGGTTCACTGAGGGAAAAGAGAGGGGAGAATGGCTTCAGAACATGAA GTATGGGATTTTCGGCCTTGGTAACAAACAGTATGAACATTTTAACAAGGTTGCAAAGGTGGTTGA TGAACTCCTTACCGAGCAGGGAGCGAAGCGCATAGTTCCTTTGGGTCTTGGAGATGATGACCAAT GCATAGAAGATGACTTCACTGCATGGCGTGAATTAGTGTGGCCCGAGTTAGATCAGCTTCTGCGT GATGAAGATGATGCAACTGTTTCTACCCCGTACACTGCTGCTGTTTTGGAATACCGTGTTGTATTT TATGATCCTGCAGATGCACCCCTTGAGGATAAGAACTGGAGTAATGCAAATGGTCATGCTACTTA TGATGCTCAACATCCTTGCAGGTCTAATGTGGCTGTGAGGAAGGAGCTTCATGCTCCTGAATCTG ATCGGTCTTGCACCCACCTTGAATTTGACATTGCTGGAACTGGACTTTCATACGAGACAGGCGAT CATGTCGGTGTTTACTGTGAGAACCTGGATGAAGTTGTAGATGAAGCATTGAGTTTACTGGGCTT ATCACCCGACACTTATTTCTCTGTTCACACTGATAAAGAGGATGGTACACCACTTGGTGGAAGTTC TTTACCTTCTTCTTTCCCCCCTTGTACTCTGAGAACAGCACTGGCACGATATGCTGATCTTTTGAG CTCGCCAAAAAAGGCTGCCTTACTTGCTTTGGCTGCTCATGCCTCTGATCCAACTGAAGCCGATC GACTAAGACACCTTGCATCACCTGCTGGAAAGGATGAGTATGCTCAATGGATTGTTGCAAACCAG AGAAGTCTCCTTGAGGTCATGGCGGAATTTCCTTCAGCCAAGCCTCCACTTGGTGTTTTCTTTGC AGCTGTTGCTCCAAGGTTGCAGCCTAGATATTATTCGATATCATCCTCACCAAGGTTGGCACCAT CAAGGATTCATGTAACTTGTGCATTGGTTTATGAGAAAACGCCAACAGGTCGTATTCACAAAGGT GTTTGTTCAACTTGGATGAAGAATGCTGTGTCCTCGGGGAAAAGCGATGACTGCGGCTGGGCAC CCATTTTTGTCAGGCAATCAAACTTTAAACTTCCTTCAGATACTAAAGTGCCCATCATAATGATTGG TCCTGGTACTGGATTGGCTCCTTTCAGGGGATTCCTTCAGGAAAGGCTTGCACTGAAAGAAGCTG GTGCTGAGTTGGGTCCATCTGTATTGTTCTTTGGCTGCAGAAACCGGAAAATGGATTTCATATATG AAGATGAGCTCAACAACTTTGTCAACAGTGGTGCACTATCTGAGCTTGTGGTTGCCTTTTCACGT GAGGGACCTACCAAGGAATATGTGCAACATAAAATGATGGAGAAGGCCAAGGACATATGGGACA TGATTTCTCAGGGAGGTTACCTGTATGTGTGTGGTGATGCCAAGGGCATGGCTAGAGATGTTCAT CGAGCTCTTCACACTATTTTCCAAGAGCAGGGATCACTAGACAGCTCAAAGGCTGAGAGCATGGT GAAAAATCTGCAAATGAGCGGCAGGTACCTACGCGATGTATGGTGA
Die folgenden Gensequenzen werden besonders bevorzugt für die Kodierung von Cytochrome P450 Monooxygenases (CYPs) eingesetzt:
SEQ ID No 30. Vitis vinifera CYP716A15 mRNA for cytochrome P450, complete cds, AB619802
ATGGAGGTGTTCTTCCTCTCCCTGCTCCTCATCTTTGTGCTCTCAGTCTCCATCGGACTTCACTTG CTCTTCTACAAGCATAGATCCCACTTCACTGGCCCCAATCTCCCTCCTGGCAAGATTGGTTGGCC TATGGTTG GTGAAAGCCTTG AATTCCTCTCC ACCG GCTGG AAAGGCC ACCCG GAAAAATTCATCT TCGATCGCATCTCCAAATACTCCTCTGAAGTCTTCAAGACCTCCCTCCTCGGAGAGCCTGCTGCC GTCTTTGCTGGCGCTGCGGGCAACAAGTTTTTGTTCTCCAACGAAAACAAACTTGTTCATGCGTG GTGGCCTAGCTCTGTCGACAAGGTCTTCCCCTCCTCCACCCAAACCTCATCCAAAGAGGAGGCC AAGAAGATGAGGAAGTTGCTCCCTCAGTTCTTTAAGCCTGAAGCCTTGCAACGTTACATTGGCAT CATGGATCACATTGCGCAGAGGCATTTTGCTGATAGCTGGGACAACAGAGATGAAGTCATTGTAT TTCCACTGGCCAAGAGGTTCACTTTCTGGCTAGCTTGCCGCCTGTTTATGAGCATAGAAGATCCT GCCCACGTCGCTAAATTTGAAAAGCCCTTCCATGTCTTGGCCTCAGGACTCATCACCGTCCCAAT TGACTTGCCTGGGACACCTTTCCACCGCGCTATCAAGGCCTCCAACTTCATCAGAAAGGAGCTTA GAGCCATCATCAAGCAAAGGAAGATCGATCTGGCTGAGGGCAAGGCCTCACAAAATCAAGATATA TTGTCCCACATGCTTCTGGCTACAGATGAAGATGGATGCCACATGAATGAAATGGAAATTGCTGA TAAAATCCTCGGTTTGTTGATTGGTGGCCATGACACTGCCAGTGCTGCCATTACATTCCTTATCAA GTACATGGCTGAGCTGCCTCACATCTACGAGAAAGTCTACGAGGAGCAAATGGAAATTGCCAATT CAAAAGCACCAGGTGAATTGCTGAACTGGGATGATGTTCAAAACATGAGATATTCATGGAATGTT GCCTGTGAAGTGATGAGACTTGCACCCCCACTCCAAGGAGCTTTCCGGGAAGCAATCACTGACT TCGTGTTCAACGGTTTCTCCATTCCTAAGGGTTGGAAGCTGTACTGGAGCGCAAACTCAACCCAC AAAAGCCCAGAATGCTTCCCTCAACCCGAAAATTTTGACCCTACAAGATTTGAAGGAAACGGGCC TGCTCCTTACACATTCGTTCCCTTTGGTGGCGGACCTAGGATGTGCCCTGGTAAAGAGTACGCCC GCTTGGAAATACTAGTCTTCATGCACAACGTGGTTAAAAGGTTCAAATGGGATAAATTGCTTCCTG ATGAGAAGATAATCGTTGACCCCATGCCCATGCCTGCTAAGGGACTTCCAGTTCGCCTCCATCCT CACAAACCATAG
SEQ ID No 31 . Vitis vinifera CYP716A17 mRNA for Cytochrome P450, complete cds, AB619803
ATGGAGGTGTTCTTCCTCTCCCTGCTCCTCATCTCTGTGCTCTCAGTCTCCATCAGACTTTACTTG CTCTTATACAAGCATAGATCCCACTTCACTGGCCCCAATCTCCCTCCTGGCAAGATTGGTTGGCC AATGGTTGGTGAAAGCCTTGAATTCCTCTCCACCGGCTGGAAAGGCCACCCGGAAAAATTCATCT TCGATCGCATCTCCAAATACTCCTCTGAAGTCTTCAAGACCTCCCTCCTCGGAGAGCCTGCTGCC GTCTTTGCTGGCGCTGCGGGCAACAAGTTTTTGTTCTCCAACGAAAACAAACTTGTTCATGCATG GTGGCCTAGCTCCGTCGACAAGGTCTTCCCCTCCTCCACCCAAACCTCATCCAAAGAGGAGGCC AAGAAGATGAGGAAGTTGCTCCCTCAGTTCCTTAAGCCTGAAGCCTTGCAACGTTACACCGGCAT CATGGATCACATTGCACAGAGGCATTTTGCTGATAGCTGGGACAACAGAGATGAAGTCATTGTAT TTCCACTGGCCAAGAGGTTCACTTTCTGGCTAGCTTGCCGCCTGTTTATGAGCATAGAAGATCCT GCCCACGTCGCTAAATTTGAAAAGCCCTTCCACGTCTTGGCCTCAGGACTCATCACCATCCCAAT TGACCTGCCTGGGACACCTTTCCACCGCGCTATCAAGGCCTCCAACTTCATCAGAAAGGAGCTTA GAGCCATCATCAAGCAAAGGAAGATCGATCTGGCTGAGAGCAAGGCCTCAAAAACTCAAGATATA TTGTCCCACATGCTTCTGGCTACAGATGAAGATGGATGCCACATGAATGAAATGAGTATTGCTGA TAAAATCCTCGGTTTGTTGATTGGTGGCCATGACACTGCCAGTTCTGCCATTACATTCCTTGTCAA GTACATGGCTGAGCTGCCTCACATCTACGAGAAAGTCTACAAGGAGCAAATGGAAATTGCCAATT CAAAAGCACCAGGTGAATTGCTGAACTGGGATGATGTTCAAAAGATGAGATATTCATGGAATGTT GCCTGTGAAGTGATGAGACTTGCACCCCCACTCCAAGGAGCTTTCCGGGAAGCAATCACTGACT TCGTGTTCAACGGTTTCTCCATTCCTAAGGGTTGGAAGCTGTACTGGAGCGCAAACTCAACCCAC AAAAGCCTAGAATGCTTCCCTCAACCCGAAAAATTTGACCCTACAAGATTTGAAGGAGCCGGGCC TGCTCCTTACACATTCGTTCCCTTTGGTGGCGGACCTAGGATGTGCCCTGGTAAAGAGTACGCCC GCTTGGAGATACTTATCTTCATGCACAACTTGGTTAAAAGGTTCAAATGGGATAAATTGCTTCCTG ATGAGAAGATAATCGTTGACCCCATGCCCATGCCTGCTAAGGGACTTCCAGTTCGCCTCCATCCT CACAAACCATAG
SEQ ID No 32. Medicago truncatula cytochrome P450 monooxygenase CYP716A12 (CYP716A12) imRNA, complete cds, DQ335781
ATGGAGCCTAATTTCTATCTCTCCCTTCTCCTTCTCTTTGTCACTTTCATATCTCTCTCTCTTTTTTT CATATTCTACAAACAGAAATCTCCATTAAATTTGCCACCTGGTAAAATGGGTTACCCAATCATAGG TGAAAGCCTTGAGTTCTTATCAACAGGATGGAAAGGACATCCTGAAAAATTCATTTTCGACCGTAT GCGTAAATATTCCTCAGAACTCTTTAAAACATCAATCGTAGGAGAATCTACGGTGGTTTGTTGCGG AGCAGCAAGTAACAAGTTTTTGTTTTCAAACGAGAATAAACTTGTGACTGCATGGTGGCCAGATAG TGTAAACAAAATCTTCCCTACTACTTCTCTTGACTCTAACTTGAAGGAAGAATCCATCAAGATGAG AAAATTGCTTCCACAATTCTTTAAACCCGAAGCTCTACAACGTTATGTTGGTGTCATGGATGTTATT GCTCAAAGACATTTTGTTACTCATTGGGATAATAAAAATGAAATCACCGTCTACCCCTTGGCCAAG AGGTACACCTTTTTGTTAGCTTGTCGGTTGTTCATGAGCGTTGAAGACGAGAATCATGTAGCAAAA TTTAGTGATCCATTTCAGTTAATTGCGGCCGGAATCATATCTCTACCAATTGATTTGCCAGGAACA CCATTCAACAAAGCTATAAAGGCCTCAAACTTTATAAGAAAGGAGTTGATTAAGATCATAAAGCAA AGGAGGGTAGATTTGGCAGAAGGGACAGCATCACCAACACAAGATATATTGTCTCACATGTTGTT GACAAGTGATGAAAATGGAAAGAGTATGAATGAACTTAATATTGCTGATAAGATTCTTGGCCTTTT GATCGGAGGACATGACACTGCTAGCGTCGCATGCACTTTCCTTGTCAAATATCTCGGCGAGTTAC CTCACATTTATGATAAAGTCTATCAAGAGCAAATGGAAATTGCAAAATCGAAACCAGCAGGAGAAT TGTTGAATTGGGATGACCTGAAGAAAATGAAATACTCTTGGAACGTAGCTTGTGAAGTAATGAGA CTTTCCCCTCCACTCCAAGGAGGTTTCAGGGAAGCCATCACTGACTTTATGTTCAATGGATTCTCA ATTCCTAAGGGATGGAAGCTTTATTGGAGTGCAAATTCAACACATAAGAACGCAGAATGTTTTCCC ATGCCAGAGAAATTTGACCCAACAAGATTTGAAGGAAATGGACCAGCTCCTTATACTTTTGTTCCC TTTGGTGGAGGACCAAGGATGTGTCCTGGAAAAGAGTATGCAAGATTAGAAATACTTGTTTTCAT GCACAATTTGGTGAAAAGGTTTAAGTGGGAAAAGGTGATTCCAGATGAGAAGATTATTGTTGATC CATTCCCCATCCCTGCAAAGGATCTTCCAATTCGCCTTTATCCACACAAAGCTTAA
SEQ ID No 33. Catharanthus roseus cytochrome P450 (CYP716AL1 ) mRNA, complete cds, JN565975
ATGGAGATCTTCTATGTCACTCTCCTTAGCTTATTCGTTCTCCTTGTTTCCCTTTCCTTTCATTTCC TCTTCTACAAAAACAAATCAACCTTGCCGGGACCGTTACCTCCGGGCCGGACCGGCTGGCCGAT GGTG GG AG AAAGTCTTC AATTTCTCTC AGCGGG CTG G AAAGGCC ATCCTGAAAAATTCATATTTG ATCGTATGGCTAAGTATTCTTCGAATGTCTTTAGGTCACATCTACTAGGTGAACCTGCCGCGGTAT TTTGTGGTGCAATTGGAAATAAATTTTTATTCTCAAATGAAAATAAACTTGTTCAAGCATGGTGGCC TGATTCAGTAAACAAAGTTTTCCCATCTTCAAATCAAACTTCTTCAAAAGAAGAAGCTATTAAAATG CGAAAGATGCTTCCGAATTTTCTTAAACCGGAAGCTTTACAACGTTACATAGGTTTAATGGACCAA ATTGCCCAAAAACATTTTTCTTCCGGTTGGGAAAATAGGGAACAAGTTGAAGTTTTTCCTTTAGCC AAAAATTATACTTTTTGGTTAGCTTCAAGATTATTTGTTAGTGTTGAAGATCCAATTGAAGTTGCAA AATTACTTGAACCCTTTAATGTTTTGGCCTCGGGACTAATTTCTGTCCCTATTGATTTGCCTGGTAC ACCTTTTAATCGTGCTATAAAGGCATCAAATCAAGTAAGAAAAATGCTTATTTCTATAATTAAACAA AG AAAAATTG ATTTAG CTG AAG G AAAAG CATCTCC AAC AC AAG ATATTTTGTC AC ATATGCTTTTAA CAAGTGATGAAAATGGTAAATTCATGCATGAATTGGATATTGCTGATAAAATCCTTGGTTTGTTAAT TGGTGGACATGATACTGCAAGTTCTGCATGTACTTTTATTGTCAAGTTTCTTGGAGAATTGCCAGA GATATATG AAG GAGTTTATAAAG AAC AAATGG AG ATTGCC AACTC AAAAGCCCCTG GTGAATTCTT GAATTGGGAAGATATTCAAAAGATGAAATATTCATGGAATGTAGCATGTGAAGTGTTGAGACTTGC ACCACCTCTCCAAGGTGCTTTTAGAGAAGCCCTAAATGATTTCATGTTCCATGGATTCTCTATTCC AAAAGGATGGAAGATTTACTGGAGTGTGAATTCAACACACAGAAATCCAGAATGTTTTCCAGATCC ACTTAAATTTGACCCGTCAAGATTTGATGGATCTGGACCTGCTCCATATACATTTGTACCATTTGG TGGAGGACCAAGAATGTGCCCTGGAAAAGAATACGCTAGGCTGGAAATTCTGGTTTTTATGCATA ATCTTGTGAAGAGATTCAAGTGGGAAAAAATTATCCCAAATGAAAAGATTGTTGTTGATCCAATGC CAATTCCTGAAAAAGGACTTCCTGTTCGACTTTATCCTCACATTAATGCATAA
SEQ ID No 34. Populus trichocarpa cytochrome P450 (CYP716A9), mRNA, XM_002331391
ATGGAGCTTCTCTTCCTCTCACTCCTCCTCGCCCTCTTTGTTTCCTCCGTCACTATTCCCCTCTTT CTCATCTTTTACAATCATCGATCCCAGAACAGCCACCCCAACCTCCCTCCAGGCAAGCTAGGCCT TCCCCTTGTTGGAGAAAGCTTTGAGTTCTTGGCCACGGGATGGAAAGGCCATCCTGAAAAGTTCA TCTTTGATCGCATAGCTAAATACTCATCTCACATCTTCAAGACAAATATTCTTGGTCAACCAGCAGT TGTCTTTTGTGGTGTTGCTTGTAACAAGTTTTTGTTTTCCAATGAGAACAAGCTCGTTGTATCCTG GTGGCCCG ACTCTGTTAACAAAATCTTTCCCTCTTCACTTCAAACATCATCTAAAG AGG AAGCCAA GAAAATGAGAAAACTTCTCCCTCAGTTCTTGAAACCTGAGGCCTTGCAAGGATACATTGGTATCAT GGATACCATTGCACAAAGACACTTCGCCTCGGAATGGGAACATAAAGAACAAGTGCTGGTGTTCC CTTTGTCAAAGAATTACACCTTTCGTTTGGCTTGTAGATTGTTTCTGAGTATTGAAGATCCAAGCC ACGTAGCTAAATTTTCTGACCCCTTTAATCTTTTAGCCTCGGGTATCATTTCCATCCCCATTGATTT GCCCGGG ACTCC ATTC AACCG AGCTATC AAAGCCTC AAACTTC ATCAG AACTG AGCTTTTAGCTT TTATAAGACAAAGAAAGAAGGATCTTGCAGAGGGAAAAGCTTCCCCCACGCAGGATATATTGTCA CACATGTTGTTGACATGTGATGAAAATGGAAAATGCATGAATGAGCTTGATATTGCTGATAAGATC ATTGGATTGTTGATTGGTGGGCATGATACAGCCAGCGCTGCTTGTACCTTCATTGTCAAGTATCTT GCAGAGCTTCCACATATATATGAGGAAGTTTACAAGGAACAAATGGAGATAGCCAAATCCAAAAC TCCTGGTGAATTCTTGAATTGGGATGACATTCAGAAGATGAAATACTCATGGAAAGTAGCTTGTGA AGTGATGAGGATCTCACCACCGCTTCAAGGTGCTTTTAGGGAAGCTCTCAATGATTTCATTTTCAA TGGCTTTACCATTCCAAAGGGTTGGAAGTTATATTGGAGCACCAACTCAACCCATAGAGATCCCG TCTACTTTCCTGAACCTGAGAAATTTGATCCTAGGAGGTTTGAAGGAAGTGGGCCAGCTCCATAC ACGTTTGTCCCCTTCGGTGGAGGACCTCGGATGTGCCCTGGAAAGGAGTATGCTCGCTTGGAAA TACTC GTTTTC ATG CATAATTTG GTC AG AAG GTTTAAATTTG ATAAGTTG ATTC AAG ATGAAAAG AT TGTAGTGAATCCACTGCCAATCCCTGATAAAGGACTTCCTGTTCGCCTTCATCCTCACAAGGCCT AG
SEQ ID No 35.: Glycine max cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00801007), mRNA, XM_003525274
ATGGACCATAATAACTTGTACCTCTCCCTCCTTCTCCTCTTCGTTTCTTTCGTGACCCTCTCCCTCT TCTTCCTCTTCTACAAACACAGGTCTCCATTCGTGGCCCCGAACCTGCCACCTGGAGCAACCGGT TACCCGGTGATCGGGGAGAGCCTGGAGTTCCTGTCAACAGGATGGAAGGGTCATCCGGAGAAG TTCATCTTCGACCGGATGATCAGGTACTCCTCCCAACTGTTCAAGACCTCCATCTTCGGGGAACC CGCGGTCATATTCTGTGGGGCCACCTGCAACAAGTTCTTGTTCTCTAACGAGAACAAGCTTGTTG CAGCGTGGTGGCCCAACAGCGTCAACAAGGTGTTCCCCTCCACGCTTCAGAGCAACTCCAAAGA AGAGTCCAAAAAGATGAGGAAGTTGCTCCCTCAGTTCCTCAAGCCCGAGGCTCTCCAACGCTAC GTTGGCATCATGGACACCATCGCTCAAAACCACTTCGCTTCCCTTTGGGACAACAAGACGGAACT CACCGTCTATCCCTTGGCTAAGAGGTACACGTTCTTGTTGGCTTGTCGTTTGTTTATGAGCGTTGA GGATGTGAATCACGTAGCAAAATTTGAGAACCCTTTTCACCTGTTGGCGTCTGGAATCATATCAGT GCCTATTGATCTTCCTGGAACGCCGTTCAACAAAGCAATCAAGGCAGCAAACGCAATCAGGAAGG AACTGTTAAAGATCATTAGACAGAGGAAGGTTGATTTAGCTGAAGGAAAAGCTTCACCAACACAA GACATTTTATCTCACATGTTGTTAACATGCAATGAGAATGGACAATTCATGAATGAATTGGATATTG CCGAC AAG ATTCTTG GCCTTTTG ATTG GAGGCC ATG AC ACTGCTAGTG CTG CATGC ACTTTC ATT GTCAAATATCTTGCTGAACTCCCTCACATTTATGATAGTGTCTATCAAGAACAAATGGAAATCGCA AAATCGAAATTGCCCGGAGAGTTATTGAATTGGGATGATATCAACAGGATGAAGTATTCTTGGAAT GTAGCTTGTGAAGTAATGAGAATCGCTCCTCCACTTCAAGGAGGTTTTAGGGAAGCTATCAATGA CTTTATTTTCAATGGCTTCTCAATTCCAAAGGGATGGAAGTTGTATTGGAGTGCAAATTCAACACA TAAAAATCCGGAATACTTTCCAGAGCCAGAGAAATTCGATCCAACTAGATTCGAAGGACAAGGGC CAGCTCCTTTTACTTTTGTACCATTTGGTGGAGGACCAAGGATGTGCCCCGGAAAAGAGTATGCT CGATTGGAAATATTGGTTTTCATGCACAACCTAGTGAAGAGGTTTAAGTGGGAAAAATTGATTCCA GATGAGAAGATTATCGTTGATCCCTTGCCCGTACCTGCAAAGAACCTCCCAATTCGTCTTCATCCT CACAAACCCTGA
SEQ ID No 36. Bupleurum chinense cytochrome P450 CYP716A41 mRNA, complete cds, JF803813
ATGATGATGTACTTGTATTTTTCAGTCATCAGCATTCTTGTTCTACTTCCTTGTGTATGGCTCTTCT TCTTACACTCGAACAGAAAATCAACCCAACAATCATACAAATCTCTCCCACCAGGAGAAACGGGC TATTTTCTCATCGGAGAAAGCTTAGAATTTCTGTCCACAGGAAGGAAAGGCCATCCTGAAAAGTTC ATTTTTGATCGCATGACAAAGTACGCCTCTAAAATTTTCAAATCATCGCTATTTGGAGAGAAAACAA TAGTCTTTTGTGGTGCTGCTAACAACAAGTTTTTGTTTTCTGACGAAAACAAGCTGGTGCAGTCGT GGTGGCCTAACTCCGTAAACAAACTCTTCCCTTCCTCTACACAAACTTCTTCGAAAGAAGAAGCCA TCAAAATGAGGAAAATGCTTCCAAACTTCTTCAAACCCGAGGCCTTGCAAAGATATGTTGGTGTTA TGGATGAAATAGCTCAAAAACACTTTGATTCTTGTTGGGAAAACAAACACACGGTCATTGTTGCAC CTCTCACCAAGCGTTTCACCTTTTGGCTTGCTTGTCGTTTGTTTGTCAGCCTTGAAGATCCTACAC AGGTAGCTAAATTTGCTGAGCCTTTCAATCTATTGGCCTCTGGAGTTTTTTCTATTCCTATTGATTT ACCGGGAACAGCATTCAATCGAGCTATTAAAGCCTCTAACTTCATTCGAAAAACGCTTATTGGCAT CATTAAAAAAAGAAAGGTTGATTTAGAGGATGGAACTGCATCAGCCACACAAGATATTTTGTCGCA TATGCTCTTGACAAGCGATGAGACTGGAAAGTTCATGACTGAAGCCGATATTGCTGATAAAATATT AGGTTTGTTGATAGGAGGTCATGATACTGCTAGCTCTGCTTGTGCTTTGATTGTCAAGTATCTTGC TGAACTCCCTCACATATATGATGGAGTCTATAGAGAGCAAATGGAAATTGCAAAATCTAAATCTCC AGGGGAGTTGCTAAACTGGGATGATGTACAAAAGATGAAATATTCATGGAATGTAGCATGTGAAG TTTTGAGACTTGCACCACCCCTCCAAGGAAGTTTTAGAGAAGTACTTTCTGATTTCATGCACAATG GTTTCTCCATACCCAAGGGATGGAAGATCTATTGGAGTGCGAATTCGACACATAAAAGTTCAGAA TATTTCCCAGAGCCAGAAAAGTTTGATCCGAGACGATTTGAAGGGTCAGGACCAGCACCCTACAC ATTTGTGCCATTTGGAGGTGGACCAAGAATGTGCCCTGGAAAAGAATATGGTAGATTGGAGATAC TTGTATTCATGCACCACTTGGTGAAGAGGTTCAGATGGCAAAAAATATATCCTCTGGAGAAGATTA CTGTTAATCCAATGCCTTTCCCTGACAAGGATCTTCCAATTCGCCTATTTCCTCACAAAGCATAG
SEQ ID No 37.: Cucumis sativus cytochrome P450 716B1 -like (LOC101206033), mRNA,
XM_004139039
ATGGAGCTTTTCCTCATCTCTCTCTTAATCCTTTTGTTCTTCTTTCTTTCTCTTACTCTTTTCATCCT CTTCCACAATCACAAATCCTTATTCTCTTATCCCAACACTCCTCCTGGCGCCATCGGCCTTCCCAT ACTCGGCGAGAGCGTCGAGTTCTTATCATCTGGTTGGAAAGGCCATCCTGAGAAGTTCATCTTCG ATCGTTTGAATAAGTACAAGTCAGATGTGTTCAAAACCTCGATCGTGGGAGTTCCAGCCGCCATT TTCTGCGGCCCTATTTGTAACAAGTTCCTCTTCTCTAACGAGAATAAACTGGTTACTCCTTGGTGG CCAGATTCCGTGAACAAGATCTTCCCCTCTACAACTCAGACTAGCACCAAAGAAGAAGCTAAGAA ACTCAAGAAACTCCTTCCGCAATTCCTTAAACCCGAAGCGCTTCAGCGTTATATTGGAATTATGGA CGAACTTGCTGAACGCCATTTCAATTCCTTTTGGAAGAACAGAGAAGAGGTCCTCGTGTTTCCTCT TGCTAAAAGCTTCACATTCTCAATAGCGTGCCGACTGTTCATGAGCGTGGAAGATGAAATTCACG TGGAGAGATTATCGGGACCATTCGAGCACATTGCAGCAGGAATCATATCGATGCCGATCGATTTA CCAGGAACGCCATTCAATAGAGCAATAAAGGCGTCAAAGTTCATCAGAAAGGAAGTGGTGGCGA TCGTGAGGCAGAGGAAACAGGATTTGGCGGAAGGAAAGGCGTTGGCGACGCAGGATATTTTGTC CCACATGCTTCTAACGTGCGATGAGAATGGTGTGTACATGAACGAATCAGATATCACCGATAAGA TTCTTGGGTTGTTGATCGGCGGCCATGACACTGCCAGTGTTGCATGCACCTTCATCGTTAAGTTC CTCGCTGAGCTTCCTCATATCTACGATGCTGTATATACAGAGCAAATGGAAATAGCAAGAGCAAA AGCGGAAGGGGAAACGTTGAAGTGGGAAGACATTAAGAAGATGAAATATTCATGGAATGTGGCTT GTGAGGTTCTAAGAATTGCTTCCCCACTCCAAGGTGCCTTTAGGGAAGCCTTAAGTGACTTCGTT TTCAATGGTTTTTTCATTCCCAAGGGTTGGAAGCTATATTGGAGTGCAAACTCGACACACAAAAAC CCCGAGTACTTCCCAGAACCTTATAAGTTCGATCCGGGAAGATTTGAAGGAAATGGACCATTACC CTACACATTTGTGCCGTTTGGGGGAGGGCCAAGGATGTGCCCTGGTAAGGAGTATGCAAAGCTT GAGATTTTGGTGTTCATGCATAATTTGGTGAAGAGATTCAAATGGACAAAGCTTCTTGAAAATGAA AACATCATTGTTAACCCAATGCCAATCCCTCAAAAAGGTCTCCCAGTTCGCCTTTTTCCTCATCAA CCTCTTTCTCTTTAA
SEQ ID No 38. Panax notoginseng ebne 00445η cytochrome P450 mRNA, complete eds, GU997666 ATGGAACTCTTCTATGTCCCTCTCCTCTCCCTCTTTGTTCTCTTCATCTCTTTATCATTCCACTTCC TCTTCTACAAGTCCAAATCCAGCTCCTCCGTCGGGCTTCCTCTCCCGCCGGGCAAGACCGGATG GCCCATTATCGGCGAGAGCTACGAGTTTCTCTCCACGGGGTGGAAAGGCTACCCGGAGAAGTTT ATATTTGACCGTATGACCAAGTACTCCTCAAATGTCTTTAAAACCTCTATTTTCGGAGAGCCCGCC GCAGTATTCTGCGGCGCGKCTTGTAACAAGTTCTTGTTCTCGAACGAAAACAAGCTTGTTCAGGC GTGGTGGCCTGACTCCGTAAACAAAGTTTTTCCTTCTTCAACTCAAACCTCTTCGAAAGAAGAGG CGATTAAGATGCGAAAAATGCTGCCAAACTTCTTTAAACCGGAGGCCTTGCAGCGCTACATCGGC CTCATGGACCAAATCGCTGCAAAGCACTTTGAATCCGGTTGGGAAAATAAAGACGAAGTGGTTGT ATTTCCCCTGGCAAAATCCTAYACGTTTTGGATCGCGTGTAAGGTATTTGTTAGCGTAGAGGAAC CTGCGCAGGTTGCGGAGCTGTTGGAACCATTTAGCGCGATTGCTTCTGGGATTATATCCGTGCCA ATAGATTTGCCCGGCACGCCGTTTAACAGTGCCATAAAATCATCGAAAATTGTTAGGAGAAAGCTT GTGG GG ATTATTAACC AGAGG AAAATTG ATTTAG GGG AGGG AAAG GCTTC ACC AAC AC AAG AC AT ATTGTCACACATGTTGTTGACGAGTGATGAAAGTGGCAAGTTTATGGGTGAGGGGGAAATTGCTG ATAAGATATTGGGGTTGTTGATTGGAGGACATGACACTGCAAGTTCTGCATGTACTTTTGTTGTCA AGTTTCTTGCTGAGCTGCCTCAGATTTATGRGGGAGTCTACCAGGAGCAAATGGAGATAGTGAAA TCTAAAAAGGCAGGAGAATTATTGAAGTGGGAGGACATACAAAAGATGAAATATTCGTGGAATGT AGCCTGTGAAGTGCTGAGACTTGCACCACCCCTTCAAGGAGCTTTTAGAGAAGCCCTCTCCGATT TCACCTACAACGGTTTCTCAATCCCCAAAGGCTGGAAGCTATATTGGAGTGCAAATTCAACCCAC AGAAACTCAGAAGTTTTCCCGGAGCCACTAAAATTTGATCCATCAAGATTCGACGGAGCCGGGCC GCCGCCGTTCTCGTTCGTGCCGTTCGGCGGCGGGCCGAGAATGTGCCCCGGAAAAGAGTATGC CCGGCTGGAAATACTGGTGTTTATGCACCATCTTGTCAAGAGGTTCAAGTGGGAAAAGGTTATTC CTGATGAGAAAATTGTTGTTAATCCCATGCCAATTCCTGCCAACGGACTTCCTGTTCGCCTATTTC CACACAAAGCCTAA SEQ ID No 39. Panax ginseng cytochrome P450 CYP716A52v2 mRNA, complete cds, JX036032
ATGGAACTCTTCTATGTCCCTCTCCTCTCACTCTTTGTTCTCTTCATCTCTTTATCATTCCACTTCC TCTTCTACAAGTCCAAACCCAGCTCCTCCGGCGGGTTTCCTCTCCCGCCGGGCAAGACTGGGTG GCCCATTATTGGAGAGAGCTACGAGTTTCTCTCCACGGGATGGAAAGGCTACCCGGAGAAGTTC ATATTTGACCGTATGACCAAGTACTCCTCAAATGTCTTTAAAACCTCTATTTTCGGAGAGCCCGCC GCAGTATTCTGCGGCGCGGCTTGTAACAAGTTCTTGTTCTCGAACGAGAATAAGCTTGTTCAGGC CTGGTGGCCTGACTCCGTGAACAAAGTTTTTCCTTCATCAACCCAAACCTCTTCGAAAGAAGAGG CGATTAAGATGCGAAAAATGCTGCCAAACTTCTTTAAACCGGAGGCTTTGCAGCGCTACATCGGC CTCATGGACCAAATCGCTGCAAATCACTTTGAATCCGGTTGGGAAAATAAAAACGAAGTGGTTGT ATTTCCCCTGGCAAAATCCTACACGTTTTGGATCGCGTGTAAGGTATTTGTTAGCGTAGAGGAAC CTGCGCAGGTTGCGGAGCTGTTGGAACCATTCAGCGCGATTGCTTCTGGGATTATATCCGTCCC AATAGATTTGCCCGGCACGCCGTTTAACAGTGCCATAAAATCATCGAAAATTGTTAGGAGGAAGC TTGTGGGGATTATTAAGCAGAGGAAAATTGATTTAGGGGAGGGAAAGGCTTCAGCAACACAAGAC ATATTGTCACACATGCTGTTGACAAGTGATGAAAGTGGCAAGTTTATGGGTGAGGGGGATATTGC CGATAAGATATTGGGGTTGTTGATTGGAGGCCATGACACTGCAAGTTCTGCATGTACTTTTGTTGT CAAGTTTCTTGCTGAGCTGCCTCAGATTTATGAGGGAGTCTACCAGGAGCAAATGGAGATAGTGA AATCTAAAAAGGC AG GAG AATTATTGAAGTG GG AGG AC ATAC AAAAGATG AAATATTCGTG G AAT GTAGCCTGTGAAGTGCTGAGACTTGCACCACCTCTTCAAGGAGCTTTTAGAGAAGCCCTCTCCGA TTTCACCTACAACGGTTTCTCAATCCCTAAAGGCTGGAAGCTATATTGGAGTGCAAATTCAACCCA CATAAACTCAGAAGTTTTCCCGGAGCCACTAAAATTTGATCCATCAAGATTCGACGGAGCCGGGC CGCCGCCGTTCTCGTTCGTGCCGTTCGGCGGCGGGCCGAGAATGTGCCCCGGAAAAGAGTATG CCCGGCTGGAAATACTGGTGTTTATGCACCATCTTGTCAAGAGGTTCAAGTGGGAAAAGGTTATT CCTGATGAGAAAATTGTTGTTAATCCCATGCCAATTCCTGCCAACGGACTTCCTGTTCGCCTATTT CCACACAAAGCCTAA
SEQ ID No 40. Ricinus communis cytochrome P450, putative, mRNA, XM_002522891
ATGGACCACTTCTATCTTACCCTTCTTTTCCTCTTCGTTTCCTTCATCACCTTTTCAATTTTTATCAT ATTTTACAAGCACAAATCTCAATACAATTATCCAAGTCTTCCTCCAGGGAAGCCTGGCCTCCCTTT TGTTGGTGAAAGCCTTGAATTTTTGTCTTCAGGTTGGAAGGGTCACCCTGAAAAGTTTGTGTTTGA TAGAACTTCTAAATATTCTTCTGAGATTTTTAAAACTAATCTTCTTGGCCAACCTGCTGCTGTCTTC TGTGGTGCTTCTGCCAACAAGTTTTTGTTCTCCAATGAAAACAAGCTTGTTCAGGCCTGGTGGCC TGATTCTGTTAACAAAATATTCCCTTCTTCTCTTCAAACTTCTTCTAAAGAAGAAGCCATTAAAATG AGAAAGCTTCTCCCTCAGTTCATGAAACCTGAAGCCCTCCAGCGTTATATTGGTATCATGGATACA ATTGCTCAGAGGCACTTTGCTTCGGGATGGGAAAAAAAAAATGAAGTAGTTGTGTTTCCTCTAGC GAAGAATTACACCTTCTGGTTAGCGTGCAGACTGTTTGTCAGCCTGGAAGATCCAGATCACATCG CTAAATTTGCAGACCCTTTTCAGGAATTGGCTTCAGGAATCATTTCCGTGCCAATAGATTTGCCTG GAACACCATTCAGAAGAGCAATCAAAGCTTCAAACTTCATCAGGAAAGAGCTTATAAGTATTATAA AGCAAAGAAAGATTGATCTAGCAGAAGGGAAAGCTTCTGGTACACAGGATATATTGTCCCATATG TTGTTAACATCAGATGAGGATGGAAAGTTTATGAATGAGATGGATATTGCCGACAAAATTCTTGGA TTGCTGATTGGTGGGCATGATACTGCTAGTGCTGCTTGTACTTTCATTATCAAGTACCTTGCTGAG CTCCCTCAAATCTATGATGCAGTTTACAAAGAGCAAATGGAGATTGCAAAATCAAAAGGAGAAGG AGAGTTGTTGAATTGGGAAGACATACAGAAGATGAAATATTCATGGAATGTGGCATGTGAAGTTAT GAGAGTTGCACCACCCCTTCAAGGTGCTTTCAGGGAAGCTATCAATGACTTTATCTTTAATGGCTT CTATATTCCAAAAGGCTGGAAGCTATATTGGAGTGCAAACTCAACACACAAAAGTGCAACATACTT TGAAGAACCAGAGAAATTTGATCCAAGTAGATTTGAAGGGAAAGGACCAGCCCCATACACATTTG TACCATTTGGAGGAGGACCAAGAATGTGCCCTGGGAAAGAGTATGCTAGACTGGAAATTCTTGTT TTCATGCATAATCTGGTCAAAAGATTCAATTTCCAAAAGATAATTCCTGATGAGAACATCATTGTTA ATCCTTTGCCTATCCCTGCTAAGGGTCTTCCAGTTCGCCTTCTTCCTCATCAAATTTAG
SEQ ID No 41 . Vitis vinifera contig W78X175946.8, whole genome shotgun sequence, AM457725 ATGGAGGTGTTCTTCCTCTCCCTGCTCCTCATCTGTGTGCTCTCAGTCTCCATCAGACTTTACTTG CTCTTATACAAGCATAGATCCCACTTCACTGGCCCCAATCTCCCTCCTGGCAAGATTGGTTGGCC AATGGTTGGTGAAAGCCTTGAATTCCTCTCCACCGGCTGGAAAGGCCACCCGGAAAAATTCATCT TCGATCGCATCTCCAAATACTCCTCTGAAGTCTTCAAGACCTCCCTCCTCGGAGAGCCTGCTGCC GTCTTTGCTGGCGCTGCGGGCAACAAGTTTTTGTTCTCCAACGAAAACAAACTTGTTCATGCGTG GTGGCCTAGCTCTGTCGACAAGGTCTTCCCCTCCTCCACCCAAACCTCATCCAAAGAGGAGGCC AAGAAGATGAGGAAGTTGCTCCCTCAGTTCCTTAAGCCTGAAGCCTTGCAACGTTACACCGGCAT CATGGATCACATTGCACAGAGGCATTTTGCTGATAGCTGGGACAACAGAGATGAAGTCATTGTAT TTCCACTGGCCAAGAGGTTCACTTTCTGGCTAGCTTGCCGCCTGTTTATGAGCATAGAAGATCCT GCCCACGTCGCTAAATTTGAAAAGCCCTTCCACGTCTTGGCCTCRGGACTCATCACCATCCCAAT TGACCTGCCTGGGACACCTTTCCACCGCGCTATCAAGGCCTCCAACTTCATCAGAAAGGAGCTTA GAGCCATCATCAAGCAAAGGAAGATCGATCTGGCTGAGAGCAAGGCCTCAAAAACTCAAGATATA TTGTCCCACATGCTTCTGGCTACAGATGAAGATGGATGCCACATGAATGAAATGARTATTGCTGAT AAAATCCTCGGTTTGTTGATTGGTGGCCATGACACTGCCAGTTCTGCCATTACATTCCTTGTCAAG TACATGGCTG AGCTGCCTCACATCTACG AG AAAGTCTACAAGG AGCAAATGG AAATTGCCAATTC AAAAGCACCAGGTGAATTGCTGAACTGGGATGATGTTCAAAAGATGAGATATTCATGGAATGTTG CCTGTGAAGTGATGAGACTTGCACCCCCACTCCAAGGAGCTTTCCGGGAAGCAATCACTGACTTC GTGTTCAACGGTTTCTCCATTCCTAAGGGTTGGAAGCTGTACTGGAGCGCAAACTCAACCCACAA AAGCCTAGAATGCTTCCCTCAACCCGAAAAATTTGACCCTACAAGATTTGAAGGAGCCGGGCCTG CTCCTTACACATTCGTTCCCTTTGGTGGCGGACCTAGGATGTGCCCTGGTAAAGAGTACGCCCG CTTGGARATACTTATCTTCATGCACAACTTGGTTAAAAGGTTCAAATGGGATAAATTGCTTCCTGA TGAGAAGATAATCGTTGACCCCATGCCCATGCCTGCTAAGGGACTTCCAGTTCGCCTCCATCCTC ACAAACCATAG
SEQ ID No 42. : Vitis vinifera cytochrome P450 716B24ike (LOCI 00262400), mRNA, XM_002265988 ATGGAGGTGTTCTTCCTCTCCCTGCTCCTCATCTGTGTGCTCTCAGTCTCCATCGGACTTCAGTTC CTCTTCTACAAGCACAGATCCCACTTCACTGGCCCCAACCTCCCCCCTGGCAGGATTGGTTGGC CTATGGTTGGTGAAAGCCTTGAATTCCTCTCCACCGGCTGGAAAGGCCACCCGGAAAAATTCATC TTCGATCGCATCTCCAAATACTCCTCTGAAGTCTTCAAGACCTCCCTCCTCGGAGAGCCTGCTGC CGTCTTTGCTGGCGCTGCGGGCAACAAGTTTTTGTTCTCCAACGAAAACAAGCTTGTTCATGCGT GGTGGCCTAGCTCCGTGGACAAGGTCTTCCCCTCCTCCACCCAAACCTCATCCAAAGAGGAGGC CAAGAAGATGAGGAAGTTGCTCCCTCGGTTCCTTAAGCCTGAAGCCTTGCAACGTTACATCGGCA TCATGGATCACATTGCGCAGAGGCACTTTGCTGATAGCTGGGACAACAGAGATGAAGTCATTGTG TTTCCACTGTCCAAGAGGTTCACTTTCTGGCTAGCTTGCCGCCTCTTTATGAGCATAGAAGATCCT GACCACATCGCTAAATTTGAAAAGCCCTTCCATGTCTTGGCCTCAGGACTCATCACCGTCCCGAT TGACTTGCCTGGGACACCTTTCCACCGCGCTATCAAGGCCTCCAACTTCATCAGAAAGGAGCTTA GAGCCATCATCAAGCAAAGGAAGATCGATCTGGCCGAGGGAAAAGCCTCACCAACTCAAGATAT ATTGTCCGACCTGCTTCTGGCCACAGATGAAGATGGACGCCACATGAACGAAATTAATATTGCTG ATAAAATCCTTGGCTTGTTGATTGGTGGCCATGATACGGCCAGTTCTGCCATTACATTCATTGTTA AGTACATGGCTGAGCTGCCTCATATGTACGAGAAAGTCTACGAAGAGCAAATGGAAATTGCCAAT TCAAAAGCACCAGGTGAATTATTGAACTGGGATGATGTTCAAAAGATGAGATATTCATGGAATGTT GCTTGTGAAGTGATGAGACTTGCACCCCCACTCCAAGGAGCTTTCCGAGAAGCAATCACTGACTT CGTGTTCAATGGTTTCTCCATTCCTAAGGGTTGGAAGTTGTACTGGAGCACAAGCTCAACCCACA AAAGCCCAAAATGCTTCCCTGAACCTGAAAAATTTGACCCTACAAGATTTGAAGGAGCTGGGCCT GCTCCTTACACATTCGTTCCCTTTGGTGGTGGACCTAGGATGTGCCCTGGTAAAGAGTACGCCCG CTTGGAAATACTTGTCTTCATGCATAACGTGGTTAAAAGGTTCAAATGGGATAAATTGCTTCCTGA TGAGAAGATAATAATTGACCCCATGCGCATGCCTGCTAAGGGACTTCCAGTTCGCCTCCGTCTTC ACAAACCATAA
SEQ ID No 43. Ricinus communis cytochrome P450, putative, mRNA, XM_002527956
ATGTTTCCCTTTGCCGTCCTCCTCATCGCTCTTTCAATCTCATACCTCATCTTCAAACACAAGTCCA ACGCCTCCAGCAGGAAGAATCTCCCACCTGGCAATACCGGTTGGCCTCTCATAGGCGAAAGCAT AGAGTTCCTAAGCACCGGGCGAAAGGGTCACCCGGAGAAGTTCATATTTGACCGAATGGAGAAG TTCTCGAGCAAGGTGTTCAAGACCTCATTGCTTCTGGAGCCGGCAGCAGTGTTTTGTGGGGCAG CAGGGAACAAGTTCTTGTTCTCCAATGAGAATAAACTAGTCACTGCATGGTGGCCTAACTCTGTTA ATAAAATCTTCCCATCCTCTCTCCAAACCTCTTCACAGGAGGAATCCAAGAGAATGAGAAAGCTTC TTCCTCAATTTCTGAAGCCAGAAGCTCTTCAAAGATATATAAGTATCATGGATGTTATTGCACAAA GACATTTCGCATTCGGATGGAACAACAAACAACAAGTGACAGTTTTCCCTCTAGCTAAGATGTATA CTTTCTGGTTAGCCTGTCGGTTGTTTCTAAGCATGGAAGACCGGGAAGAAGTCGAAAAGTTTGCA AAGCCATTCGATGTATTGGCATCAGGTATTATATCGATACCTATTGATTTTCCAGGGACGCCATTT AACCGAGGGATCAAAGCATCAAATGAGGTAAGAAGGGAGCTGATAAAGATGATCGAACAGAGGA AGATTGATCTAGCCGAGAATAAGGCATCCCCAACACAGGATATATTGTCTCACATGCTAACCACA GCAGACGAGTACATGAATGAAATGGATATAGCTGATAAGATTCTTGGTTTGCTTATTGGAGGCCA CGACACAGCCAGTGCTGCCATAACGTTTGTTGTCAAGTATCTTGCGGAGATGCCTCAAGTCTACA ATAAGGTGTTAGAGGAACAAATGGAGATTGCGAAAGCAAAAGCAGCTGGAGAGCTGTTGAACTG GGAAGACATCCAAAAGATGAGATATTCATGGAACGTAGCATGTGAAGTGATGAGACTTGCTCCTC CGCTACAAGGAGCCTTTAGAGAGGCCATGACAGACTTCACCTATGCAGGTTTCACTATTCCTAAA GGATGGAAGTTGTACTGGGGTGCTAACTCTACACACAGAAACCCCGAGTGTTTCCCAGAACCAG AAAAGTTCGACCCCTCAAGGTTTGAAGGCAAGGGACCTGCCCCTTACACATTCGTTCCTTTTGGA GGCGGACCCAGAATGTGCCCTGGAAAAGAATATGCTAGATTGGAGATCCTCGTTTTCATGCACAA CATTGTCAAAAAGTTCAGATGGGAGAAGCTGCTTCCTGAAGAGAAGATTATTGTTGATCCTCTCCC GATTCCCGCTAAAGGCCTTCCCCTTCGTCTTCATCCCCACACCTCCTAG
SEQ ID No 44. Medicago truncatula ebne JCVI-FLMt-11 H3 unknown mRNA, BT147421
ATGGAGCCTAATTTCTATCTCTCCCTTCTCCTTCTCTTTGTCACTTTCATATCTCTCTCTCTTTTTTT CATATTCTACAAACAGAAATCTCCATTAAATTTGCCACCTGGTAAAATGGGTTACCCAATCATAGG TGAAAGCCTTGAGTTCTTATCAACAGGATGGAAAGGACATCCTGAAAAATTCATTTTCGACCGTAT GCGTAAATATTCCTCAGAACTCTTTAAAACATCAATCGTAGGAGAATCTACGGTGGTTTGTTGCGG AGCAGCAAGTAACAAGTTTTTGTTTTCAAACGAGAATAAACTTGTGACTGCATGGTGGCCAGATAG TGTAAACAAAATCTTCCCTACTACTTCTCTTGACTCTAACTTGAAGGAAGAATCCATCAAGATGAG AAAATTGCTTCCACAATTCTTTAAACCCGAAGCTCTACAACGTTATGTTGGTGTCATGGATGTTATT GCTCAAAGACATTTTGTTACTCATTGGGATAATAAAAATGAAACCACCGTCTACCCCTTGGCCAAG AGGTACACCTTTTTGTTAGCTTGTCGGTTGTTCATGAGCGTTGAAGACGAGAATCATGTAGCAAAA TTTAGTGATCCATTTCAGTTAATTGCGGCCGGAATCATATCTCTACCAATTGATTTGCCAGGAACA CCATTCAACAAAGCTATAAAGGCCTCAAACTTTATAAGAAAGGAGTTGATTAAGATCATAAAGCAA AGGAGGGTAGATTTGGCAGAAGGGACAGCATCACCAACACAAGATATATTGTCTCACATGTTGTT GACAAGTGATGAAAATGGAAAGAGTATGAATGAACTTAATATTGCTGATAAGATTCTTGGCCTTTT GATCGGAGGACATGACACTGCTAGCGTCGCATGCACTTTCCTTGTCAAATATCTCGGCGAGTTAC CTCACATTTATGATAAAGTCTATCAAGAGCAAATGGAAATTGCAAAATCGAAACCAGCAGGAGAAT TGTTGAATTGGGATGACCTGAAGAAAATGAAATACTCTTGGAACGTAGCTTGTGAAGTAATGAGA CTTTCCCCTCCACTCCAAGGAGGTTTCAGGGAAGCCATCACTGACTTTATGTTCAATGGATTCTCA ATTCCTAAGGGATGGAAGCTTTATTGGAGTGCAAATTCAACACATAAGAACGCAGAATGTTTTCCC ATGCCAGAGAAATTTGACCCAACAAGATTTGAAGGAAATGGACCAGCTCCTTATACTTTTGTTCCC TTTGGTGGAGGACCAAGGATGTGTCCTGGAAAAGAGTATGCAAGATTAGAAATACTTGTTTTCAT GCACAATTTGGCGAAAAGGTTTAAGTGGGAAAAGGTGATTCCAGATGAGAAGATTATTGTTGATC CATTCCCCATCCCTGCAAAGGATCTTCCAATTCGCCTTTATCCACACAAAGCTTAA
SEQ ID No 45. : Glycine max cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00813159), mRNA, XM_003530477
ATGGAGGATAATAACTTGCATCTCTCCCTCCTTCTCCTCTTCGTTTCTATAGTGACCCTCTCCCTC TTCGTCCTCTTCTACAAGCACAGGTCTGCATTTGCGGCCCCGAACCTGCCACCGGGAGCCACCG GTTACCCGGTGATCGGGGAGAGCCTGGAGTTCCTGTCCACAGGATGGAAGGGTCATCCGGAGA AGTTCATCTTCGACCGGATGATCAGGTACTCCTCCCAGCTGTTCAAGACCTCCATCCTGGGGGAA CCGGCGGTAATATTCTGTGGGGCCACCTGCAACAAGTTCTTATTTTCGAACGAGAACAAGCTTGT TGCAGCGTGGTGGCCCAACAGCGTCAACAAGGTGTTCCCCACCACGCTTCTTAGCAACTCCAAA CAAGAGTCCAAAAAGATGAGGAAGTTGCTCCCTCAGTTCCTTAAGCCCGAGGCTCTCCAACGCTA CGTTGGAATCATGGACACCATTGCTCGAAACCACTTCGCTTCCCTTTGGGACAACAAGACGGAAC TCACCGTCTATCCCTTGGCCAAGAGGTACACGTTCTTGTTGGCTTGTCGTTTGTTTATGAGCATTG AGGACGTGAATCACGTAGCAAAATTTGAGAACCCTTTTCACCTGTTGGCGTCTGGAATCATATCA GTGCCTATTGATCTTCCCGGAACGCCGTTCAACAAAGCAATTAAAGCAGCAAACGCAATCAGGAA GGAGCTGTTGAAGATCATTAGACAGAGGAAGGTGGATTTAGCTGAAGGGAAAGCATCGCCAACA CAAGACATTTTGTCTCATATGTTGTTAACATGCGATGAGAAGGGACAGTTCATGAATGAATTGGAT ATTGCCGACAAGATTCTTGGCCTTTTGATTGGAGGCCATGACACTGCTAGTGCTGCAATCACTTT CATTGTCAAATATCTTGCTGAACTCCCTCACATTTATGATAGAGTCTATCAAGAGCAAATGGAAATT GCAAAACTGAAATCGCCAGGAGAGTTATTGAATTGGGATGATGTCAACAGGATGCAGTATTCTTG GAATGTAGCTTGTGAAGTAATGAGAATCGCTCCTCCACTTCAAGGAGGTTTTAGGGAAGCTATCA ATGACTTTATTTTCGATGGCTTTTCAATACCAAAGGGATGGAAGTTGTATTGGAGTGCAAATTCAA CACATAAAAGTCCAGAATATTTTCCAGAGCCAGAGAAATTCGATCCAACTAGATTCGAAGGACAA GGGCCAGCTCCTTATACTTTTGTACCATTTGGTGGAGGACCAAGGATGTGCCCCGGAAAAGAGTA TGCTCGATTGGAAATATTGGTTTTCATGCACAACCTAGTGAAGAGGTTTAAGTGGCAAAAATTGAT TCCAGATGAGAAAATTATCGTTGATCCCTTGCCCATACCTGCAAAGAACCTTCCAATTCGTCTTCA TCCTCACAAACCCTGA
SEQ ID No 46. Soybean ebne JCVI-FLGm-20N8 unknown mRNA, BT096613
ATGGAGGATAATAACTTGCATCTCTCCCTCCTTCTCCTCTTCGTTTCTATAGTGACCCTCTCCCTC TTCGTCCTCTTCTACAAGCACAGGTCTGCATTTGCGGCCCCGAACCTGCCACCGGGAGCCACCG GTTACCCGGTGATCGGGGAGAGCCTGGAGTTCCTGTCCACAGGATGGAAGGGTCATCCGGAGA AGTTCATCTTCGACCGGATGATCAGGTACTCCTCCCAGCTGTTCAAGACCTCCATCCTGGGGGAA CCGGCGGTAATATTCTGTGGGGCCACCTGCAACAAGTTCTTATTTTCGAACGAGAACAAGCTTGT TGCAGCGTGGTGGCCCAACAGCGTCAACAAGGTGTTCCCCACCACGCTTCTTAGCAACTCCAAA CAAGAGTCCAAAAAGATGAGGAAGTTGCTCCCTCAGTTCCTTAAGCCCGAGGCTCTCCAACGCTA CGTTGG AATC ATGG AC ACC ATTGCTCG AAACC ACTTCGCTTCCCTTTGGG AC AAC AAG ACGG AAC TCACCGTCTATCCCTTGGCCAAGAGGTACACGTTCTTGTTGGCTTGTCGTTTGTTTATGAGCATTG AGGACGTGAATCACGTAGCAAAATTTGAGAACCCTTTTCACCTGTTGGCGTCTGGAATCATATCA GTGCCTATTGATCTTCCCGGAACGCCGTTCAACAAAGCAATTAAAGCAGCGAACGCAATCAGGAA GGAGCTGTTGAAGATCATTAGACAGAGGAAGGTGGATTTAGCTGAAGGGAAAGCATCGCCAACA CAAGACATTTTGTCTCATATGTTGTTAACATGCGATGAGAAGGGACAGTTCATGAATGAATTGGAT ATTGCCGACAAGATTCTTGGCCTTTTGATTGGAGGCCATGACACTGCTAGTGCTGCAATCACTTT CATTGTCAAATATCTTGCTGAACTCCCTCACATTTATGATAGAGTCTATCAAGAGCAAATGGAAATT GCAAAACTGAAATCGCCAGGAGAGTTATTGAATTGGGATGATGTCAACAGGATGCAGTATTCTTG GAATGTAGCTTGTGAAGTAATGAGAATCGCTCCTCCACTTCAAGGAGGTTTTAGGGAAGCTATCA ATGACTTTATTTTCGATGGCTTTTCAATACCAAAGGGATGGAAGTTGTATTGGAGTGCAAATTCAA CACATAAAAGTCCAGAATATTTTCCAGAGCCAGAGAAATTCGATCCAACTAGATTCGAAGGACAA GGGCCAGCTCCTTACACTTTTGTACCATTTGGTGGAGGACCAAGGATGTGCCCCGGAAAAGAGT ATGCTCGATTGGAAATATTGGTTTTCATGTACAAC
SEQ ID No 47. : Vitis vinifera cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00242305), mRNA, XM_002280933 ATGGAGCTCTCTTTACTCCACATACTTCCATGGGCCACCCTCTTCACCACTCTTTCTCTTTCATTC CTCATCTACAAGCTCATGATCATCTCCCATGGCACACCCAGAAACCTTCCGTCCGGCAATACCGG TCTGCCCTATATCGGAGAAAGCATCCAGTTCCTCTCCAATGGCAGAAAGGGTCATCCCGAGAAGT TCATTTCTGAGAGAATGTTGAAGTTCTCATCCAAAGTTTTCAAGACCTCACTCTTCGGAGAAACTG CTGCAGTCTTCTGTGGCTCGGCCGGGAACAAGTTCTTGTTCTCCAACGAGAACAAGCTTGTGACC GCATGGTGGCCGAGCTCCGTAAACAAAATCTTCCCTTCCTCTCTGCAAACCTCCTCGCAGGAAGA ATCAAAGAAAATGAGAAAGCTGCTTCCGGGCTTTCTCAAACCCGAAGCCCTCCAAAGATATATCA GTATCATGGACGTGATAGCTCAGAGGCACTTTGAGTCCAGCTGGAACAACAAGGAAGAAGTCAC AGTCTTCCCGCTAGCCAAGATGTTCACATTCTGGCTGGCTTGTCGTCTGTTTTTGAGCGTAGAAG ACCCCGACCATGTCGAAAAGCTTGCAGAGCCCTTCAACGAACTGGCCGCCGGAATCATAGCCCT ACCTATTGATTTGCCTGGGACGTCATTTAACAAGGGGATCAAAGCTTCAAACCTGGTCAGAAAGG AGCTTCATGCAATAATCAAGAAGAGGAAGATGAATCTTGCGGACAACAAGGCGTCGACGACGCA GGACATATTGTCACATATGCTTCTCACTTGTGATGAGAATGGAGAGTACATGAATGAAGAGGATAT AGCTGATAAAATTCTTGGGTTGCTCGTCGGAGGTCATGACACAGCCAGTGCTACCATTACTTTTAT TGTCAAGTTTCTTGCAGAGCTGCCTCATGTTTACGATGAAGTTTTCAAGGAACAAATGGAGATAGC AAAATCAAAGGCCCCAGGTGAGCTGTTGAATTGGGAGGACATTCCAAAGATGAGGTATTCATGGA ATGTAGCATGTGAAGTGATGAGACTGGCACCACCCGTTCAAGGAGCTTTCCGAGAAGCCATGAAT GACTTCATCTTCGAGGGTTTCTCCATTCCAAAGGGATGGAAGCTGTACTGGAGCACGCACTCGAC CCACCGGAACCCGGAGTTCTTCCCCAAGCCGGAAAAATTCGACCCCTCGAGGTTTGACGGAAAG GGACCAGCCCCTTACACCTATGTGCCTTTCGGAGGAGGACCCAGGATGTGCCCTGGCAAAGAGT ATGCTAGATTGGAAGTACTAGTGTTCATGCACAATTTAGTGAGAAGGTTCAAATGGGAGAAGCTG CTGCCAGATGAGAAGATTATAGTAGACCCCATGCCCATTCCTGCAAAAGGCCTTCCCATTCGCCT CCATCATCACCAACCCTAG
SEQ ID No 48. Populus trichocarpa hypothetical protein (POPTR_0006s08560g) mRNA, complete eds, XM_002309021
ATGGAACTTCCCTTCATCTCCCTGCTTCCCTATGGAATCCTCTTCATCATCTCTGCAGTTTCACTAT CATACCTCATAAACAAACACAAATATTATCTCTCCTCCCTCAACAACCTCCCGCCTGGTAATACCG GTTTGCCATTAATCGGTGAAAGTCTGGAGTTCCTGACCACGGGGCAAAAGGGTCAGCCGGAGAA GTTCATATTAGACAGAATGGCAAAGTTCTCATCCAAAGTCTTCAAAACCTCGTTGTTTTGTGAACC AACTGCAGTATTCTGTGGTGCAGCAGGGAACAAGTTCTTGTTCTCTAATGAGAATAAGCTTGTCAC TGCATGGTGGCCTGATTCTGTCAACAAAATCTTCCCTTCCTCTCAACAAACTTCTTCACAAGAAGA ATCCAAGAAAATGAGAAAGCTTTTCCCACTTTTTTTCAAGCCAGAATCACTTCAAAGATATATTAGT GTGATGGATGTGATTGCACAAAGGCACTTGGCTTCTGATTGGGAAGGCAAACAGGAAGTCAGTG TTTTCCCTCTGGCTAAGACGTACACTTTTTGGTTAGCTTGCCGCTTATTTCTAAGCATGGAAGATC CTGAGGAAGTCCAAAAGTTCGCCAAACCCTTCAATGATTTAGCCGCTGGGATTATATCCATACCC ATTGATTTGCCCTGGACACCCTTTAATCGCGGGGTCAAAGCATCAAATGTGGTGCACAAGGAGCT TCTAAAGATCATAAAGCAGAGGAAGATTGATCTAGCGGAGAACAAGGCATCCCCCACACAAGATA TACTGTCCCATATGCTAACCACAGCAGACGATAATGGGCAATGCATGAAAAAGATCGATATTGCC GATAAGATACTTGGTTTGCTTGTTGGAGGTCACGACACAGCCAGTGCTGCTATAACTTTTATTGTC AAGTATCTTGCAGAGTTGCCTCATGTCTACAACAAGCTCTTGGAAGAACAAAGAGAGATCGCAAA AACGAAAACACCTGGAGAGCTGTTGAATTGGGAGGACATACAAAGGATGAGATATTCATGGAACG TTGCCTGTGAAGTGATGAGAGTTGCTCCCCCACTCCAAGGAGCTTTCCGAGAGGCCATGACCGA GTTCAACTACGCAGGTTTTACAATTCCGAAGGGATGGAAGCTGTATTGGAGCGCAAACACTACAC ACAAAAATCCTGAATGTTTCCCTGAGCCAGAGAATTTTGACCCATCAAGATTCGAAGGCAATGGA CCGGCCCCATACACCTTTGTTCCATTTGGAGGAGGTCCTAGGATGTGTCCAGGCAAAGAATATGC TAGACTGGAAATACTTGTTTTCTTGCACAACTTGGTTAAAAAGTTCAGATGGGAGAAGCTGCTTCC TAAAGAGAGGATAATTGTAGATCCAATGCCAATACCTTCAAAAGGCCTTCCGATCCGCCTCCACC CTCACGAGGCTGCCTAA
SEQ ID No 49. Medicago truncatula ebne MTYF5_F6_F7_F81 G-O-7 unknown im RNA, BT051785
ATGGAGCCTAATTTCTATCTCTCCCTTCTCCTTCTCTTTGTCACTTTCATATCTCTCTCTCTTTTTTT CATATTCTACAAACAGAAATCTCCATTAAATTTGCCACCTGGTAAAATGGGTTACCCAATCATAGG TGAAAGCCTTGAGTTCTTATCAACAGGATGGAAAGGACATCCTGAAAAATTCATTTTCGACCGTAT GCGTAAATATTCCTCAGAACTCTTTAAAACATCAATCGTAGGAGAATCTACGGTGGTTTGTTGCGG AGCAGCAAGTAACAAGTTTTTGTTTTCAAACGAGAATAAACTTGTGACTGCATGGTGGCCAGATAG TGTAAACAAAATCTTCCCTACTACTTCTCTTGACTCTAACTTGAAGGAAGAATCCATCAAGATGAG AAAATTGCTTCCACAATTCTTTAAACCCGAAGCTCTACAACGTTATGTTGGTGTCATGGATGTTATT GCTCAAAGACATTTTGTTACTCATTGGGATAATAAAAATGAAACCACCGTCTACCCCTTGGCCAAG AGGTACACCTTTTTGTTAGCTTGTCGGTTGTTCATGAGCGTTGAAGACGAGAATCATGTAGCAAAA TTTAGTGATCCATTTCAGTTAATTGCGGCCGGAATCATATCTCTACCAATTGATTTGCCAGGAACA CCATTCAACAAAGCTATAAAGGCCTCAAACTTTATAAGAAAGGAGTTGATTAAGATCATAAAGCAA AGGAGGGTAGATTTGGCAGAAGGGACAGCATCACCAACACAAGATATATTGTCTCACATGTTGTT GACAAGTGATGAAAATGGAAAGAGTATGAATGAACTTAATATTGCTGATAAGATTCTTGGCCTTTT GACCG G AGG AC ATG AC ACTGCTAG CGTCGC ATGC ACTTTCCTTGTC AAATATCTCG GCG AGTTAC CTCACATTTATGATAAAGTCTATCAAGAGCAAATGGAAATTGCAAAATCGAAACCAGCAGGAGAAT TGTTGAATTGGGATGACCTGAAGAAAATGAAATACTCTTGGAACGTAGCTTGTGAAGTAATGAGA CTTTCCCCTCCACTCCAAGGAGGTTTCAGGGAAGCCATCACTGACTTTATGTTCAATGGATTCTCA ATTCCTAAGGGATGGAAGCTTTATTGGAGTGCAAATTCAACACATAAGAACGCAGAATGTTTTCCC ATGCCAGAGAAATTTGACCCAACAAGATTTGAAGGAAATGGACCAGCTCCTTATACTTTTGTTCCC TTTGGTGGAGGACCAAGGATGTGTCCTGGAAAAGAGTATGCAAGATTAGAAATACTTGTTTTCAT GCACAATTTGGCGAAAAGGTTTAAGTGGGAAAAGGTGATTCCAGATGAGAAGATTATTGTTGATC CATTCCCCATCCCTGCAAAGGATCTTCCAATTCGCCTTTATCCACACAAAGCTTAA SEQ ID No 50. Ricinus communis cytochrome P450, putative, mRNA, XM_002513137
ATGGAGTTGTTCTTTCTCATAGCCTTAACCCTTTTCATTATTCTTGTCACTCTTCCAATTCTGGCTG TCTTATACAGACCAAATATTATCAATCTACCACCAGGCAAGACGGGCTTGCCATACATAGGAGAG AGCCTGGAATTTCTTTCCACAGGCAGAAAAGGTCATCCTGAGAAGTTTTTATCAGATAGAATGGAA AAATTCTCACGTCAAGTTTTCAGGACTTCAATTCTTGGTGAACAAACTGCAGTCGTCTGTGGCGCA CAAGGCAACAAGTTCTTGTTCTCTAATGAGAACAAGCTTGTCACTGCTTGGTGGCCAAAATCAATC CTGAGACTCTTCCCTTCCTCTAATCAAAGCACTATCCTAGCTGAAGGCATGAGGATGAGGAAGAT GCTACCTCACTTTCTCAAACCTGAGGCCCTGCAAAGATACATAGGTGTAATGGACCATATGGCAC AAGTTCACTTTCAGGATAGCTGGGAAAACAAGCAAGAAGTCACAGTTTATCCGCTTGCAAAGATG TATACATTTTCAGTTGCTTGCAAAGTGTTCTTGAGCATGGATGACCCAAAGGAGGTCGCAAAGTTC GCTGCTCCTTTCAATGATATGGCCTCAGGAATTATTTCTATTCCTATCAATTTTCCTGGAACATCTT TCAATCGTGGACTCAAGGCCTCGAAGATTATAAGGAACGAAATGTTGCGTATGATTAAGCAAAGA AGAAAAGATCTTGCTGAGAATAAAGCAACTCCTATGCAAGATATACTGTCCCATATGCTGGTAGCA ACTGATGAAGAAGGTCAGAGATTGGGAGAAGTTGGGATTGCTGATAAGATCATCTCTTTGCTCAT TGGTGGCCACGACACAGCAAGTGCTACAATCACTTTCGTTGTCAAGTTTCTTGCCGAGCTCCCAG ATATCTACGATCAAGTCTTGAAAGAGCAATTGGAGATTGCTAAATCAAAAGAACCAGGAGAATTAT TGACCTGGGAAGACATTCAGAAGATGAAGTACTCGTGGAATGTTGCTTGTGAAGTAATGAGATTA GCCCCACCTCTTCAGGGTTCTTTCAGAGAAGCCTTACATGACTTCGACTATGCTGGTTTCTCTATT CCAAAGGGTTGGAAATTATATTGGAGCACACATACAACACACAAAAATCCAGAATATTTTTCGGAT CCTGAAAAGTTTGATCCTTCAAGATTTGAAGGATCAGGGCCAGCACCTTACACATTTGTTCCATTT GGAGGAGGGCCAAGGATGTGTCCTGGAAAAGAGTATGCAAGATTGGAAATTCTTGTTTTCATGCA CAATATAGCGAAGAGGTTCAAGTGGAACAAGGTTATTCCTGACGAGAAAATTGTTGTTGACCCCA TGCCAATACCAGCTAAAGGCCTTCCAGTTCACCTCTATCCTCAAAAACATGAGTAA SEQ ID No 51 . : Vitis vinifera cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00265713), mRNA, XM_002264607
ATGATCATGCAGCAAAGCGACATGGAGCTCTTGCTCCTCTCCTTTCTCCTCCTCATGGCTCTCTCT CTCTCTTTTTGGATTCGCTTCTTTGTCCATAAACTCGAAAAAAGCAGTGGTATTAACCTGCCTCCA GGG AAAATGG GTTTTCC ATTC ATTGGTG AAAGTCTAG AATTCCTTCG GATG GGC AGG AAGG G AAC CCCTGAAAGGTTCATTCAAGATAGGATGGCCAAATACTCAACCCAGATCTTCAAAACTTGCTTACT CGGAGAACCAACTGCAGTTGTGTGTGGGGCTGCTGGAAACAAGTTGTTGTTCTCCAACGAGAAC AAGCTTGTTACTTCATGGTGGCCGCGCTCTGTGGAGAAGATATTTCCCTCTTCTCTTCAGACTTCG ACCAAAGAAGAGTCCATGAAAACTCGTAAGTTGCTTCCAGCCTTTCTCAAACCCGAGGCGTTGCA AAAGTATGTGGGGATCATGGATTCCATAGCGAAGTGGCATTTGGATAACCACTGGGACTTGAATG AAACCGTTACTGTTTTCCCTCTTGCCAAGCAATACACCTTCATGGTGGCTTGTAGATTGTTCTTGA GCATAG ATG ACCCTAAGCACATTGCAAAATTCGCTAACCCATTTCATATTTTGGCTGCTGGGGTCA TGTCAATACCTATAAACTTCCCTGGGACCCCATTCAACCGTGCTATCAAGGCTGCGGATTCCGTA AGAAAGGAGCTCAGAGCAATAATCAAGCAAAGGAAAATTCAAGTTTTAGCGGGGAAAAGTTCATC CTCTAAGCATGATATACTGTCCCATATGCTCACCACAACAGATGAGAATGGACAGTTCTTGAATGA GATGGACATTGCGGATAAGATACTTGGTTTGCTAATTGGTGGCCATGACACTGCAAGTGCTGTCA TAACTTTCATCATCAAGTATCTTGCAGAGTTGCCACAAGTCTACAATGAGGTTTTAAAGGAGCAAA TGGAGGTTGCAGCCGGGAAGAAAAGTGGAGAGATGCTTGATTGGGAGGACATACAAAAGATGAA GTATTCATGGAATGTGGCAAATGAAGTAATGAGGCTGGCACCACCACTTCAAGGTAGTTTCCGAG AGGCCATAACTGACTTCACCTATGCTGGTTTCTCCATTCCCAAAGGGTGGAAGTTGTACTGGAGC ACAAATGCAACACACAAGAACCCTGACTACTTCCCTGATCCGGAGAAATTTGATCCTTCAAGGTTT GAAGGAAATGGACCCATTCCTTACACCTATGTTCCTTTCGGAGGAGGACCACGAATGTGCCCTGG GAAAGAGTATGCTCGTTTGGAAATACTTGTTTTCATACACAATGTTGTGAGACGGTTCAGTTGGTA TAAACTGCATCCAAATGAAGATGTCATAGTGGATCCAATGCCAATGCCTGCAAAAGGACTTCCCA TTCGCCTTCGTCACCATTAA
SEQ ID No 52. Populus trichocarpa hypothetical protein (POPTR_0018s 13390g) mRNA, complete cds, XM_002324633
ATGGAGACTCTCTATTTCATCCTTCTCCTCTTTGTCCCCATCATTCTCTCCCTCGTTGCCATAATTT ACAAGCACAGATACCAGGATAAACTCCAAAACGTTCCTCCAGGCAATCTAGGCCTCCCTTTTGTG GGAGAGAGCCTAGATTTCCTGTCAAAAGGATGGAAAGGTTGCCCAGAAAACTTCATATTCGATCG CATTCGGAAATATTCGTCAGAAATATTCAAAACAAATCTTTTTCTTCAGCCTGTAGTGATGTTAAAT GGTGTTGCCGGAAACAAGTTCTTATTCTCCAACGAGAACAGACTTGTTGAAACATGGTGGCCTGA TTTTGTGAACAGGATATTTCCATCTGCAGTAGAAACGTCACCCAAAGAAGAAGCGAAAAGAATGC GTAGGTTGTTCCCTCGATTCTTGAAACCTGAGGCCTTGCAGAGGTATATAGGTACCATGGATATG GTTACCAAAAGACACTTTGCCTTGGAGTGGGGAAACAAAGCAGAGGTGGTTGTCTTCCCTCTGGC AAAAAGCTACACATTCGAGTTGGCTTGCCGCTTGTTTCTAAGTATTGAAGATCCCAGCCACATAGC CAGATTTTCCCACCCATTCAACCAAATAACCTCTGGTATTTTTACCATCCCCATTGATTTTCCTGGA ACTCCATTTAATCGAGCCATCAAGGCCTCAAAGTTAATCAGAATTGAGCTTTTGGCCATTATCAGG CAAAGAAAGAAGGATCTTGCAGAAGGAAAGGCATCCCCAACCCAGGACATTTTGTCACACATGCT GTTGAGCAATGATGCGGATGGAAAGTACATGAATGAGGTGCAGATTTCTGACAAGATTCTTGCAT TATTGATGGGTGGACATGAAAGCACTGCTGCTTCTTGTACTTTCATTGTCAAATATCTTGCTGAGC TGCCTCATATCTATGAAGCAGTTTACAAGGAACAAGCTGAGATCATTAAATCCAAAGCACCCGGT GAGTTGTTGAATTGGGATGACATTCAAAAGATGAAATATTCATGGAATGTAGCTTGTGAAACGTTG AGACTCTCACCACCGCTTATTGGTAACTTCAAAGAAGCCATCAAGGACTTCACATTCAACGGGTT CTCCATCCCAAAGGGCTGGAAGGCAAGTCATTTTCTCACTTTGTATTGGAGTGCAAGCTCGACCC ATAAAAATCCTGAATACTTTTCTGAGCCTGAAAAGTTCGATCCCAGTAGATTTGAAGGGAAAGGAC CAGCTCCTTACACGTTTATTCCATTTGGTGGAGGACCAAGGATGTGCCCTGGAAATGAATATGCT CGATTAGAAATTCTTGTTTTCATGCATAACTTGGTGAAGAGGTTCAAATTTGAAAGATTGATTCTCG ATGAGAAGATAGTATTCGATCCAACGCCAAAACCAGAAATGGGACTTCCAGTTCGTCTGCTTCCT CACAAAGCTTGA
SEQ ID No 53. : Glycine max cytochrome P450 716B2-like (LOCI 00815640), transcript variant X1 , mRNA; XM_003531801
ATGGAGCAGTTGTACTACCTCACCCTTGTGCTACTGTTTGTGTCCTTCGTCTCTGTCTCTTTTTTC ATCATTTTCTACAGGCATCGTTCTCCGTTCAGCGTCCCCAACTTGCCGCCGGGGAAGGCGGGGT TTCCGGTGATCGGCGAGAGCCTGGAGTTTCTGTCGGCGGGACGGAAGGGGCTTCCGGAGAAGT TCTTCTCCGATCGCATGACAGAGTACTCTTCCAAAGTGTTCAAGACCTCCATCTTAGGGGAGCCT ACAGTGATTTTCTGTGGAGCCGCATGTAACAAGTTCTTGTTTTCTAACGAGAACAAACACGTCATT TCGTGGTGGCCTGAAAATGTCAAGAAGTTGTTCCCAACGAATATTCAAACAAACTCTAAGGAAGA AGCCAAGAAGTTGAGAAACATTCTCCCTCAGTTCCTCAGCGCCAAAGCCATCCAACGTTACGTTG GTATTATGGACACTGTTGCCCAAAGACACTTTGCTCTGGAGTGGGAGAACAACACCCAAGTCACC GTATTGCCCTTGGCCAAGAGGTATACCTTTGGGGTGGCTAGCCGTGTGTTCATGAGCATTGATGA TTTGAATCAAGTGGCGAAATTGGCAGAACCTTTAAATCAGGTGAATGCAGGAATTATATCAATGCC CATTAACTTCCCCGGAACTGTGTTCAACCGAGGAATCAAGGCCTCCAAGTTCATTAGGAGGGAGC TGTTGAGGATTGTCAAGCAGAGGAAGGTGGAACTAGCTAATGGAATGTCCACACCAACACAAGAC ATTTTGTCTCACATGCTAATATATTGTGATGAGAATGGACAATATTTGGCTGAACATGATATTGTCA ACAAGATCCTTGGCTTGCTGATAGGTAGCCATGAAACCACAAGTACTGTTTGCACTTTCGTTGTCA AATACCTTGCCGAGCTCCCTCAAAATATTTATGAAAATGTCTATCAAGAACAAATGGCGATTGCAA AATCCAAAGCTCCAGGAGAGTTGTTGAATTGGGATGACATCCAGAAGATGAAATATTCATGGAAT GTAGCTTGTGAAGTAATAAGGCTTAACCCTCCAGCCCAAGGAGCTTTTAGGGAAGCCATCAATGA CTTTATCTTCGATGGATTCTCAATTCCAAAAGGCTGGAAGTTGTATTGGAGTGCAAATTCAACTCA CAAAAATCCAGAGTACTTCCCTGAGCCAGAGAAATTTGATCCAAGCAGATTTGAAGGAACTGGAC CAGCTCCTTATACTTATGTGCCATTTGGTGGAGGGCCAAGTATGTGCCCTGGAAAAGAGTATGCG CGAATGGAACTATTGGTGTTCATGCACAACTTAGTGAAGAGGTTCAAGTGTGAAACTCTTTTTCCT AATGGAAATGTTACTTATAACCCTACGCCTATTCCTGCCAAGGGCCTTCCTGTTCGTCTTATTCCT CACCGATCATGA
Es ist außerdem bevorzugt, dass Abwandlungen der oben genannten Sequenzen, sogenannte Sequenzvarianten, ausgewählt werden, wobei diese abgewandelten Sequenzen eine
ausreichende Sequenzidentität zu den oben genannten Sequenzen aufweisen, um zu einer solchen funktionsanalog zu sein. Dabei ist eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 75%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt 90% oder 95% vorteilhaft. Die Sequenzidentität zwischen zwei Sequenzen kann durch üblichen Methoden analysiert werden, z. B. mit NCBI Blast oder Clustal.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodieren die funktionsanalogen Sequenzvarianten für die gleichen Aminosäuresequenzen, die durch die explizit genannten Sequenzen SEQ ID No 1 bis 53 kodiert sind.
Die Erfindung umfasst daher die Anwendung von Nukleinsäuresequenzen, sowie Hefestämme umfassend solche Sequenzen, die für einem oder mehreren der oben genannten Enzyme (bevorzugt gemäß einer der Sequenzen SEQ ID No 54 bis 105) kodieren. Die
Nukleinsäuresequenzen sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
a) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 53;
b) ein Nukleinsäuremolekül, welches zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) komplementär ist,
c) Ein Nukleinsäuremolekül, welches mit einer Nukleotidsequenz gemäß a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert (Hybridisierungsbedingungen sind einem Fachmann bekannt, und sind z. B. in Sambrook, Molecular Cloning, Ed. 1-3, Cold Spring Harbor, N.Y., beschrieben);
d) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine ausreichende
Sequenzidentität aufweist, um zu einer Nukleotidsequenz gemäß a), b) oder c) funktionsanalog zu sein,
ein Nuklei nsäüremolekül, das infolge des genetisches Codes zu einer Nükleotidsequenz gemäß a) bis c) degeneriert ist; und
ein Nuklei nsäüremolekül gemäß einer Nükleotidsequenz nach a) bis e), welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder
Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nükleotidsequenz gemäß a) bis e) ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Anwendung einer
Nukleinsäuresequenz vorgesehen, die eine ausreichende Sequenzidentität aufweist, um mit der Nukleinsäuresequenz gemäß Punkt a), b) und/oder c) funktionsanalog zu sein. Im Sinne der
Erfindung heißt, um zu den genannten Nukleotidseq Uenzen bzw. mit diesen Nukleotidsequenzen hybridisierenden Sequenzen funktionsanalog zu sein, dass die Sequenzvariante effektiv die gewünschte Produktion von den pentazyklischen Triterpenoiden in den gleichen oder ähnlichen Mengen hervorrufen kann. Funktionsanaloge Sequenzen im Sinne der Erfindung sind alle Sequenzen, die der Fachmann durch Routineversuche als gleichwirkend identifizieren kann.
Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung Nukleinsäuresequenzen und deren Anwendung, sowie Hefestämme umfassend solche Sequenzen, die für folgende Aminosäuresequenzen (gemäß der Sequenzen SEQ ID No 54 bis 105) kodieren:
Oxidosqualenzyklasen (OSCs):
>gi| 18147594|dbj|BAB83087.1 | lupeol synthase [Betula platyphylla] SEQ ID No 54:
MWKLKIAEGGPGLVSGNDFIGRQHWEFDPDAGTPQERAEVEKVREEFTKNRFQMKQSADLLMRMQ LRKENPCQPIPPPVKVKETEVITEEAVITTLRRSLSFYSSIQAHDGHWPGESAGPLFFLQPFVMALYITG DLNTIFSPAHQKEIIRYLYNHQNEDGGWGFHIEGHSTMFGSALSYIALRILGEGLEDGEDGAMAKSRK WILDHGGLVAIPSWGKFWVTVLGLYEWSGCNPLPPEFWFLPDIFPIHPGKMLCYCRLVYMPMSYLYG KRFVGPITGLIQSLRQELYNEPYHQINWNKARSTVAKEDLYYPHPLIQDLLWGFLHHVAEPVLTRWPF SMLREKALKAAIGHVHYEDENSKYLCIGSVEKVLCLIACWAEDPNGEAYKLHLGRIPDNYWVAEDGLKI QSFGCQMWDAGFAIQAILSCNLNEEYWPTLRKAHEFVKASQVPENPSGDFKAMYRHINKGAWTFSM QDHGWQVSDCTAEGLKVAILFSQMPPDLVGEKIEKERLYDAVNVILSLQSSNGGFPAWEPQRAYGWL EKFNPTEFFEDTLIEREYVECTSPAVHGLALFRKFYPRHRGTEIDSSIYRGIQYIEDVQEPDGSWYGHW GICYTYGTWFAVGALAACGRNYKNCPALRKSCEFLLSKQLPNGGWGESYLSSQNK WTNIEGNRAN LVQTAWALLSLIDARQAEIDPTPIHRGVRVLINSQMEDGDFPQQEITGVFMRNCTLNYSSYRNIFPIWA LGEYRRRVLFA
>gi|6456434|dbj|BAA86930.1 | lupeol synthase [Olea europaea] SEQ ID No 55:
MWKLKIADGTGPWLTTTNNHIGRQHWEFDPEAGTPDERVEVERLREEFKKNRFRTKQSADLLMRMQ LVKENQRVQIPPAIKIKETEGITEEAVITTLRRAISFYSTIQAHDGHWPAESAGPLFFLPPLVLALYVTGAI NVVLSREHQKEITRYIYNHQNEDGGWGIHIEGHSTMFGSVLSYITLRLLGEGQEDGEDKAVARGRKWI LDHGGAVGIPSWGKFWLTVLGVYEWDGCNPMPPEFWLLPNFSPIHPGKMLCYCRLVYMPMSYLYGK RFVGPITGLVLSLRQEIYTEPYHGINWNRARNTCAKEDLYYPHPLAQDMLWGFLHHFAEPVLTRWPFS KLREKALKVAMEHVHYEDMNSRYLCIGCVEKVLCLIACWVEDPNSEAYKRHIARIPDYFWVAEDGLKM QSFGCQMWDAAFAIQAILSSNLAEEYGPTLMKAHNFVKASQVQENPSGDFNEMYRHTSKGAWTFSM QDHGWQVSDCTAEGLKAALLFSQMPIELVGAEIETGHLYDAVNVILTLQSASGGFPAWEPQKAYRWL EKLNPTEFFEDVLIERDYVECTSSAVQALKLFKQLHPGHRRKEIASCISKAIQYIEATQNPDGSWDGSW GICFTYGTWFAVEGLVACGKNYHNSPTLRRACEFLLSKQLPDGGWSESYLSSSNKVYTNLEGNRSNL VQTSWALLSLIKAGQVEIDPGPIHRGIKLLVNSQMEDGDFPQEEITGAFMKNCTLNYSSYRNIFPIWAL GEYRRRILHAQT
>gi|360038892|dbj|BAL41371.1 | lupeol synthase [Glycyrrhiza uralensis] SEQ ID No 56:
MWKLKIGEGGAGLISVNNFIGRQHWEFDPNAGTPQEHAEIERLRREFTKNRFSIKQSADLLMRMQLR
KENHYGTNNNIPAAVKLSDAENITVEALVTTIRRAISFYSSIQAHDGHWPAESAGPLFFLQPLVMALYIT GSLDDVLGPEHKKEIVRYLYNHQNEDGGWGFHIEGHSTMFGSALSYVALRILGEGPEDKAMAKGRK WILDHGGLVAIPSWGKFWVTVLGAYEWSGCNPLPPELWLLPKFTPFHPGKMLCYCRLVYMPMSYLY GKKFVGPITALIRSLREELYNEPYNQINWNTARNTVAKEDLYYPHPLIQDMLWGFLYHVGERFLNCWP FSMLRRKALEIAINHVHYEDENSRYLCIGSVEKVLCLIARWVEDPNSEAYKLHLARIPDYFWLAEDGLKI QSFGCQMWDAAFAIQAILACNVSEEYGPTLRKAHHFVKASQVRENPSGDFNAMYRHISKGAWTFSM HDHGWQVSDCTAEGLKAALLLSEMPSELVGGKMETERFYDAVNVILSLQSSNGGFPAWEPQKAYRW LEKFNPTEFFEDTMIEREYVECTGSAMQGLALFRKQYPQHRSKEIDRCIAKAIRYIENMQNPDGSWYG CWGICYTYGTWFAVEGLTACGKNCHNSLSLRKACQFLLSKQLPNAGWGESYLSSQNKVYTNLEGNR ANLVQSSWALLSLTHAGQAEIDPTPIHRGMKLLINSQMEDGDFPQQEITGVFMRNCTLNYSSYRNIFPI WAMGEYRRQVLCAHSY
>gi 130699380| ref|NP_849903.1 | lupeol synthase 1 [Arabidopsis thaliana] SEQ ID No 57:
MWKLKIGKGNGEDPHLFSSNNFVGRQTWKFDHKAGSPEERAAVEEARRGFLDNRFRVKGCSDLLW RMQFLREKKFEQGIPQLKATNIEEITYETTTNALRRGVRYFTALQASDGHWPGEITGPLFFLPPLIFCLY ITGHLEEVFDAEHRKEMLRHIYCHQNEDGGWGLHIESKSVMFCTVLNYICLRMLGENPEQDACKRAR QWILDRGGVIFIPSWGKFWLSILGVYDWSGTNPTPPELLMLPSFLPIHPGKILCYSRMVSIPMSYLYGK RFVGPITPLILLLREELYLEPYEEINWKKSRRLYAKEDMYYAHPLVQDLLSDTLQNFVEPLLTRWPLNKL VREKALQLTMKHIHYEDENSHYITIGCVEKVLCMLACWVENPNGDYFKKHLARIPDYMWVAEDGMKM QSFGCQLWDTGFAIQALLASNLPDETDDALKRGHNYIKASQVRENPSGDFRSMYRHISKGAWTFSDR DHGWQVSDCTAEALKCCLLLSMMSADIVGQKIDDEQLYDSVNLLLSLQSGNGGVNAWEPSRAYKWL ELLNPTEFMANTMVEREFVECTSSVIQALDLFRKLYPDHRKKEINRSIEKAVQFIQDNQTPDGSWYGN WGVCFIYATWFALGGLAAAGETYNDCLAMRNGVHFLLTTQRDDGGWGESYLSCSEQRYIPSEGERS NLVQTSWAMMALIHTGQAERDLIPLHRAAKLIINSQLENGDFPQQEIVGAFMNTCMLHYATYRNTFPL WALAEYRKVVFIVN
>gi|83016477|dbj|BAE53430.1 | lupeol synthase [Lotus japonicus] SEQ ID No 58:
MWKLKVAEGGKGLVSVSNFIGRQHWVFDPNAGTPQEHEEIERMRQEFTKNRFSIKQSADLLMRMQL RKENPCGPIPPAVKLRDVEKVTAEALITTIRRSITFYSSIQAHDGHWPAESAGPLFFVQPLVMALYITGS LDDVLGPQHKKEIIRYLYNHQNEDGGWGFHIEGHSTMFGSALSYIALRVLGQSLEDGEDMAVARGRK WILDHGGLVAIPSWGKFWVTVLGVYEWSGCNPLPPEFWLLPKIFPIHPGKMLCYCRLVYMPMSYLYG KKFVGPITALVRSLRKELYNEPYDRVDWNKARNTVAKEDLYYPHPLIQDMLWGFLHHVGERVLNTWP FSMLRQKAIEVAINHVRYEDETTRYLCIGSVEKVLYLIARWVEDPNSEAYKLHLARIPDYFWLAEDGLKI QSFGCQMWDAAFAIQAILSGNVSEEYGPTLKKAHHFVKASQVRENPSGDFKAMYRHISKGAWTFSM HDHGWQVSDCTAEGLKVALLLSEMSDDLVGAKMETEQFYDAVNVILSLQSSNGGFPAWEPQRAYQ WLEKFNPTEFFEETLIEREYVECTGSAMQALALFRKLYPKHRRKEIDRCISKAIRYIENTQNPDGSWYG CWGICYTYGTWFAVEGLTACGKNFQNSVTLRRACKFLLSKQLPNGGWGESYLSSQDKVYTNIEGKR ANLVQSSWALLSLMRAGQAEIDPTPIHRGIRLLINSQMDDGDFPQQEITGVFMRNCTLNYSSYRNIFPI WALGEYRRRVLCA
>gi|82468803|gb|ABB76766.1 | lupeol synthase [Ricinus communis] SEQ ID No 59:
MWRIKIAEGGNNPYIYSTNNFQGRQIWVFDPNAGTPEEQAEVEEARQNFWKNRFQVKPNSDLLWQL
QFLREKNFKQKIPKVKVEDGEEITSEIAAAALRRSVHLFSALQASDGHWCAENGGLLFFLPPLVFAVYI TGHLNTVFSPEHRKEILRYIYCHQNEDGGWGIHIEGHSTMFCTVLNYICMRILGEARDGGIENACERG RKWILDHGGATGISSWGKT LSILGVYEWDGTNPMPPEFWAFPSSFPLHPAKMFCYCRITYMPMSYL YGKRFVGPITPLILQIREEIYNEPYNKIKWNSVRHLCAKEDNYFPHPTIQKLLWDALYTFSEPLFSRWPF NKLREKALKITMDHIHYEDHNSRYITIGCVEKPLCMLACWIEDPHGEAFKKHLARIADYIWVGEDGIKM QSFGSQTWDTSLALQALIASDLSHEIGPTLKQGHVFTKNSQATENPSGDFRKMFRHISKGAWTFSDK DQGWQVSDCTAESLKCCLLFSMMPPEIVGEKMEPEKVYDSVNVILSLQSQNGGFTAWEPARAGSW MEWLNPVEFMEDLVVEHEYVECTSSAIQALVLFKKLYPRHRNKEIENCIINAAQFIENIQEPDGSWYGN WGICFSYGTWFALKGLAAAGRTYENCSAIRKGVDFLLKSQRDDGGWAESYLSCPKKVYVPFEGNRS NLVQTAWAMMGLIYGGQAKRDPMPLHRAAKLLINSQTDLGDFPQQELTGAFMRNCMLHYALFRNTF PIWALAEYRRHVLFPSAGFGFGFTNNL
>gi|6456467|dbj|BAA86932.1 | lupeol synthase [Taraxacum officinale] SEQ ID No 60:
MWKLKIAEGGDDEWLTTTNNHVGRQHWQFDPDAGTEEERAEIEKIRLNFKLNRFQFKQSADLLMRT QLRKENPINKIPDAIKLNETEEVTNDAVTTTLKRAISFYSTIQAHDGHWPAESAGPLFFLPPLVIALYVTG AMNDILTPAHQLEIKRYIYNHQNEDGGWGLHIEGHSTIFGSVLSYITLRLLGEEADSVAEDMALVKGRK WILDHGGAVGIPSWGKFWLTILGVYEWGGCNPMPPEFWLMPKFFPIHPGKMLCYCRLVYMPMSYLY GKRFVGKITELVRDLRQELYTDPYDEINWNKARNTCAKEDLYYPHPFVQDMVWGVLHNVVEPVLTSR PISTLREKALKVAMDHVHYEDKSSRYLCIGCVEKVLCLIATWVEDPNGDAYKRHLARIPDYFWVAEDG MKMQSFGCQMWDAAFAIQAIFSSNLTEEYGPTLKKAHEFVKASQVRDNPPGDFSKMYRHTSKGAWT FSIQDHGWQVSDCTAEGLKVSLLYSQMNPKLVGEKVETEHLYDAVNVILSLQSENGGFPAWEPQRAY AWLEKFNPTEFFEDVLIEREYVECTSSAIQGLTLFKKLHPGHRTKEIEHCISRAVKYVEDTQESDGSWY GCWGICYTYGTWFAVDALVACGKNYHNCPALQKACKFLLSKQLPDGGWGESYLSSSNKVYTNLEGN RSNLVHTSWALISLIKAGQAEIDPTPISNGVRLLINSQMEEGDFPQQEITGVFMKNCNLNYSSFRNIFPI WALGEYRRIVQNI
>gi|41687978|dbj|BAD08587.1 | lupeol synthase [Glycyrrhiza glabra] SEQ ID No 61 :
MWKLKIGEGGAGLISVNNFIGRQHWEFDPNAGTPQEHAEIERLRREFTKNRFSIKQSADLLMRMQLR KENHYGTNNNIPAAVKLSDAENITVEALVTTITRAISFYSSIQAHDGHWPAESAGPLFFLQPLVMALYIT GSLDDVLGPEHKKEIVRYLYNHQNEDGGWGFHIEGHSTMFGSALSYVALRILGEGPQDKAMAKGRK WILDHGGLVAIPSWGKFWVTVLGAYEWSGCNPLPPELWLLPKFAPFHPGKMLCYCRLVYMPMSYLY GKKFVGPITALIRSLREELYNEPYNQINWNTARNTVAKEDLYYPHPLIQDMLWGFLYHVGERFLNCWP FSMLRRKALEIAINHVHYEDENSRYLCIGSVEKVLCLIARWVEDPNSEAYKLHLARIPDYFWLAEDGLKI QSFGCQMWDAAFAIQAILACNVSEEYGPTLRKAHHFVKASQVRENPSGDFNAMYRHISKGAWTFSM HDHGWQVSDCTAEGLKAALLLSEMPSELVGGKMETERFYDAVNVILSLQSSNGGFPAWEPQKAYRW LEKFNPTEFFEDTMIEREYVECTGSAMQGLALFRKQFPQHRSKEIDRCIAKAIRYIENMQNPDGSWYG CWGICYTYGTWFAVEGLTACGKNCHNSLSLRKACQFLLSKQLPNAGWGESYLSSQNKVYTNLEGNR ANLVQSSWALLSLTHAGQAEIDPTPIHRGMKLLINSQMEDGDFPQQEITGVFMRNCTLNYSSYRNIFPI WAMGEYRRQVLCAHSY
>gi|392621787|gb|AFM82492.1 | lupeol synthase [Eleutherococcus trifoliatus] SEQ ID No 62:
MWKLKIAEGDKNDPYLYSTNNFVGRQTWEFDPDYVGSPGELEEVEEARRQFWENRYKVKPCGDLL WRMQFLREKNFKQTIPQVKVGDDEAVTYDAATTTLRRAVHFFSALQASDGHWPAEIAGPLFFLPPLV MCVYITGHLDTVFPAKHRKEILRYIYCHQNENGGGGLHIEGHSTMFGTTFSYICMRILGKGPDGGVNN ACAKGRKWILDHGSATAIPSWGKT LSILGVYEWTGSNPMPPEFWLLPSSLSVHPAKMLCYCRMVYL PMSYLYGKRFVGPITPLILQLKEELYAQPYNEIRWGKVRHVCAKEDIYYPHPLIQDLLWDSLHVLAEPLL TRWPFNKLREKALQTTMKHIHYEDENSRYITIGCVEKILCMLACWVEDPNGDYFKKHLARIPDYLWVA EDGMKMQSFGSQEWDIGFGIQALLASDLTHELGPTLMKGHDFIKKSQVKDNPSGDFKSMYRHISKGS WTFSDQDHGWQVSDCTAEGLKCCLIFSTMPEEIVGKKMEPELLYNSVNVLLSLQSKNGGVAAWEPA TAQDWLELFNPTEFFADTIIEHEYVECTSSAIQALTLFKKLYPGHRKKEIDNFITNAIRFIEDIQIPDGSWY GNWGVCFTYGTWFALGGLAAGGKTYNNCAAVRKAVNFLLESQLDDGGWGESHLSCPRKVYVPLEG NRSNLVHTGWALMGLIHSGQAERDPTPLHRAAKLLINSQMEDGDFPQQEITGAFMKNCMLHYAVYRN IYPLWALAEYRRRVPLPTLGA
>gi|300807980|gb|ADK35126.1 | lupeol synthase [Kalanchoe daigremontiana] SEQ ID No 63:
MWKLKIADGGSNPYIFTTNNFVGRQIWEFDPQATDPQQLAKVEAARLDFYHNRYKLKPNSDLLWRMQ FLEEKAFTQTIPQVKVEDGEEVSYEAVTAALRRGVHLYSALQASDGHWPAENAGPMFFMPPMVMCL YITGHLNAIFTEEHRSETLRYIYYHQNEDGGWGFHIEGHSTMFGTVLNYICMRLLGEGPEGGQDNAVS RGRKWILDHGGATSIPSWGKTWLSIMGLCDWSGCNPMPPEFWLLPSYLPMHPGKMWCYCRMVYM PMSYLYGKRFTARITPLILQLREEIHIQPYDQIDWKKVRHVCCKEDMYYPHPLLQDLLWDTLYLTTEPLL TRWPLNKLIRKRALQTTMKHIHYEDENSRYITIGCVEKVLCMLACWVEDPNGDYFKKHLARIPDYLWIA EDGMKMQSFGSQHWDTAFSIQALLASNMAEEIGITLAKGHDFIKKSQVKDNPSGDFKGMYRHISKGA WTFSDQDHGWQVSDCTAEGLKCCLLFSMMQPEVVGESMAPESLYNSVNVLLSLQSQNGGLPAWEP AGAPEWLELLNPTEFFENIVIEHEYVECTSSAVQALVLFKKLYPLHRRKEVERFITNGAKYLEDIQMPD GSWYGNWGVCFTYGAWFALEGLSAAGKTYNNCAAVRKGVDFLLNIQLEDGGWGESYQSCPDKKYV PLEDNRSNLVQTSWALMGLIYAGQADRDPTPLHRAAQLLINSQLEDGDFPQQEITGVFQRNCMLHYA AYRNIFPLWALAEYRRQIQLHSEATKMV
>gi| 157679393|dbj|BAF80444.1 | lupeol synthase [Bruguiera gymnorhiza] SEQ ID No 64:
MWRLKIAEGGNNPYIYSTNNFVGRQTWEFDPEAGTPEERAQVEEARENFWRDRFLIKPSSDLLWRF QFLSEKKFKQRIPQVKVQDGEEITREIATTALRRSVHLVSALQASDGHWCAENSGPMFFVPPMVFSLY ITGHLNAVFSAEHCKEILRYIYCHPNEDGGWGLHIEGHSAMFSTVLNYNWLGKLGEGRDGGKDNACE RARRRILDHGSATAISSWGKT LAILGVYEWDGCNPMPPEFWAFPTFFPIHPARMLCYCRLTYMAMS YLYGKKFVGPITPLILQLREEIYNEPYDQINWSRMRHLCAKEDNYYAHTLTQIILWDAIYMLGEPLLKRW PFNKLREKALKITMDHIHYEDENSQYITIGSVEKPLLMLACWHEDPNGDAFKKHLARIPDYVWLGEDGI KIQSFGSQVWDTSFVLQALIASNLPSETGPTLEKGHNFIKNSQVTQNPSGDFRRMFRHISKGSWTFSD KDHGWQVSDCTAESLKCCLLFSMMPPELVGEKMGPQRMYDAVNVIISLQSKNGGCSAWEPAGAGS WMEWLNPVEFLADLVIEHEYVECTSSSLQALVLFKKLYPEHRRKEIEIFILNAVRFTEEIQQPDGSWYG NWGICFLSGTWFGLKGLAAAGKTYYNCTAVRKGVEFLLQTQRDDGGWGESYLSCPKKIYVPLEGNR SNLVQTALAMMGLILGGQGERDPTPLHRAAKLLINSQTELGDFPQQELSGCFMRNCMLHYSEYRDIF PTWALAEYCKLFPLPSKND
>gi| 18147596|dbj|BAB83088.1 | beta-amyrin synthase [Betula platyphylla] SEQ ID No 65: MWRLKIADGGSDPYIYSTNNFVGRQTWEFDPQAGSPQERAEVEEARRNFYDNRYQVKPSGDLLWR MQFLKEKNFKQTIPPVKVEDGEEITYEKSTAALRRAVHFYSALQASDGHWPAENAGPLFFLPPLVMC MYITGHLNTVFPAEHQKEILRYIYYHQNEDGGWGLHIEGHSTMFCTALSYICMRILGEGPDGGQDNAC ARARKWILDHGGVTHMPSWGKTWLSILGIFEWIGSNPMPPEFWILPSFLPMHPAKMWCYCRMVYMP MSYLYGKRFVGPITPLILQLREELYTQPYHQVNWKKVRHLCAKEDIYYPHPLIQDLLWDSLYIFTEPLLT RWPFNKLVREKALQVTMKHI HYEDENSRYITIGCVEKVLCMLACWVEDPNGDYFKKHIARIPDYIWVA EDGIKMQSFGSQEWDTGFAIQALLASNLTDEIGPTLARGHDFIKKSQVKDNPSGDFESMHRHISKGS WTFSDQDHGWQVSDCTAEGLKCCLLFSIMPPEIVGEKMEPEQLYDSVNVLLSLQSKNGGLAAWEPA GAQEWLELLNSTEFFADIVIEHEYIECTASAMQTLVLFKKLYPGHRKKEIENFIKNAAQFLQVIQMPDGS WYGNWGVCFTYGTWFALGGLAAVGKTYNNCLAVRRAVDFLLRAQRDNGGWGESYLSCPKKEYVPL EGNKSNLVHTAWAMMGLIHAGQAERDPTPLHRAAKLIINSQLEDGDFPQQEITGVFMKNCMLHYAAY KNIYPLWALAEYRKHVPLPLGKNLNQVVNCIGQSLYKKYKD
NADPH-cytochrome P450 Reduktase (CPRs):
>gi| 197209812|dbj|BAG68945.1 | cytochrome P450 reductase [Lotus japonicus] SEQ ID No 66:
MEESSSMKISPLDLMSAMIKGTLDPSNVSSTSGAGSVFLENREFVMVLTTSIAVLIGCVVVFIWRRSTG NKAKSIEPPKRVVEKLSDEAEVDDGTRKVTIFFGTQTGTAEGFAKAIAEEAKVRYEKAKFKIVDMDDYA QDDDEYEEKLKKETLALFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFLEGDEKEEGWLRNLEYAVFGLGNRQYE HFNKVAIEVDDKLADFGGKRLVKVGLGDDDQCIEDDFTAWKEELWPALDELLRGDDDTTVSTPYTAA VLEYRVVI HDPLDASVDEKKWHNVNGHAIVDAQHPVRSNVAVRKELHTPVSDRSCTHLEFDISGTGVA YETGDHVGVYCENLSETVEEAVRLLGLSPDTYFSVHTDDEDGKPLSGSSLPPTFPPCTLRTAIARYAD VLSSPKKSVLLALAAHASNPSEADRLRHLASPAGKDEYSEWVIASQRSLLEVMAEFPSAKPPIGVFFA AIAPRLQPRFYSISSSPRMAPSRIHVTCALVNDKMPTGRIHRGVCSTWMKNSVPLEKSQDCSWAPIFV RQSNFKLPADNKVPIIMIGPGTGLAPFRGFLQERLALKEDGAELGPSVLFFGCRNRQMDYIYEDELNH FVNSGALSELIVAFSREGPTKEYVQHKMMEKASDIWNMISQGAYIYVCGDAKGMARDVHRTLHTILQE QGSLDSSKAEGMVKNLQLNGRYLRDVW
>gi| 16187|emb|CAA46814.1 | NADPH-ferri he moprote in reductase [Arabidopsis thaliana] SEQ ID No 67:
MTSALYASDLFKQLKSIMGTDSLSDDWLVIATTSLALVAGFVVLLWKKTTADRSGELKPLMIPKSLMA KDEDDDLDLGSGKTRVSIFFGTQTGTAEGFAKALSEEIKARYEKAAVKVIDLDDYAADDDQYEEKLKK ETLAFFCVATYGDGEPTDNAARFSKWFTEENERDIKLQQLAYGVFALGNRQYEHFNKIGIVLDEELCK KGAKRLIEVGLGDDDQSIEDDFNAWKESLWSELDKLLKDEDDKSVATPYTAVIPEYRVVTHDPRFTTQ KSMESNVANGNTTIDIHHPCRVDVAVQKELHTHESDRSCI HLEFDISRTGITYETGDHVGVYAENHVEI VEEAGKLLGHSLDLVFSI HADKEDGSPLESAVPPPFPGPCTLGTGLARYADLLNPPRKSALVALAAYA TEPSEAEKLKHLTSPDGKDEYSQWIVASQRSLLEVMAAFPSAKPPLGVFFAAIAPRLQPRYYSISSCQ DWAPSRVHVTSALVYGPTPTGRI HKGVCSTWMKNAVPAEKSHECSGAPIFIRASNFKLPSNPSTPIVM VGPGTGLAPFRGFLQERMALKEDGEELGSSLLFFGCRNRQMDFIYEDELNNFVDQGVISELIMAFSRE GAQKEYVQHKMMEKAAQVWDLIKEEGYLYVCGDAKGMARDVHRTLHTIVQEQEGVSSSEAEAIVKKL QTEGRYLRDVW
>gi| 18139|emb|CAA49446.1 | NADPH-ferri he moprote in reductase [Catharanthus roseus] SEQ ID No 68:
MDSSSEKLSPFELMSAILKGAKLDGSNSSDSGVAVSPAVMAMLLENKELVMILTTSVAVLIGCVWLIW RRSSGSGKKVVEPPKLIVPKSVVEPEEIDEGKKKFTIFFGTQTGTAEGFAKALAEEAKARYEKAVIKVID IDDYAADDEEYEEKFRKETLAFFILATYGDGEPTDNAARFYKWFVEGNDRGDWLKNLQYGVFGLGNR QYEHFNKIAKVVDEKVAEQGGKRIVPLVLGDDDQCIEDDFAAWRENVWPELDNLLRDEDDTTVSTTY TAAIPEYRVVFPDKSDSLISEANGHANGYANGNTVYDAQHPCRSNVAVRKELHTPASDRSCTHLDFDI AGTGLSYGTGDHVGVYCDNLSETVEEAERLLNLPPETYFSLHADKEDGTPLAGSSLPPPFPPCTLRTA LTRYADLLNTPKKSALLALAAYASDPNEADRLKYLASPAGKDEYAQSLVANQRSLLEVMAEFPSAKPP LGVFFAAIAPRLQPRFYSISSSPRMAPSRIHVTCALVYEKTPGGRI HKGVCSTWMKNAIPLEESRDCS WAPIFVRQSNFKLPADPKVPVIMIGPGTGLAPFRGFLQERLALKEEGAELGTAVFFFGCRNRKMDYIY EDELNHFLEIGALSELLVAFSREGPTKQYVQHKMAEKASDIWRMISDGAYVYVCGDAKGMARDVHRT LHTIAQEQGSMDSTQAEGFVKNLQMTGRYLRDVW
>gi|357465233|ref|XP_003602898.1 | NADPH cytochrome P450 reductase [Medicago truncatula] SEQ ID No 69:
MTSSNSDLVRTIESVLGVSLGDSVSDSVVLIVTTSAAVIIGLLVFLWKKSSDRSKELKPVIVPKSLVKEED DDADIADGKTKVTVFFGTQTGTAEGFAKALAEEIKARYEKAFVKVVDMDDYAADDDQYEEKLKKETLA FFMLATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGKDERGTWLQQLTYGVFGLGNRQYEHFNKIGKVVDDDLSEQ GAKRLVPLGMGDDDQSIEDDFNAWKESLWPELDQLLRDEDDVNTVSTPYTAAISEYRVVFHDPTVTP SYENHFNAANGGAVFDIHHPCRANVAVRRELHKPQSDRSCIHLEFDVSGTGVTYETGDHVGVYADN CDETVKEAGKLLGQDLDLLFSLHTDNEDGTSLGGSLLPPFPGPCTVRTALARYADLLNPPRKAALIALA AHASEPSEAERLKFLSSPQGKDEYSKWWGSHRTLLEVMADFPSAKPPLGVFFAAIAPRLQPRYYSIS SSPRFAPQRVHVTCALVEGPTPTGRIHKGVCSTWMKNAIPSEESRDCSWAPIFIRPSNFKLPADPSIPII MVGPGTGLAPFRGFLQERFALKEDGVQLGPALLFFGCRNRQMDFIYEEELNNFVEQGSLSELIVAFSR EGPEKEYVQHKMMDKASYFWSLISQGGYLYVCGDAKGMARDVHRTLHTIVQQQENADSSKAEATVK KLQMDGRYLRDVW
>gi|6321832|ref|NP_011908.11 Ncp1 p [Saccharomyces cerevisiae S288c] SEQ ID No 70:
MPFGIDNTDFTVLAGLVLAVLLYVKRNSIKELLMSDDGDITAVSSGNRDIAQVVTENNKNYLVLYASQT GTAEDYAKKFSKELVAKFNLNVMCADVENYDFESLNDVPVIVSIFISTYGEGDFPDGAVNFEDFICNAE AGALSNLRYNMFGLGNSTYEFFNGAAKKAEKHLSAAGAIRLGKLGEADDGAGTTDEDYMAWKDSILE VLKDELHLDEQEAKFTSQFQYTVLNEITDSMSLGEPSAHYLPSHQLNRNADGIQLGPFDLSQPYIAPIV KSRELFSSNDRNCIHSEFDLSGSNIKYSTGDHLAVWPSNPLEKVEQFLSIFNLDPETIFDLKPLDPTVKV PFPTPTTIGAAIKHYLEITGPVSRQLFSSLIQFAPNADVKEKLTLLSKDKDQFAVEITSKYFNIADALKYLS DGAKWDTVPMQFLVESVPQMTPRYYSISSSSLSEKQTVHVTSIVENFPNPELPDAPPVVGVTTNLLRN IQLAQNNVNIAETNLPVHYDLNGPRKLFANYKLPVHVRRSNFRLPSNPSTPVIMIGPGTGVAPFRGFIR ERVAFLESQKKGGNNVSLGKHILFYGSRNTDDFLYQDEWPEYAKKLDGSFEMWAHSRLPNTKKVYV QDKLKDYEDQVFEMINNGAFIYVCGDAKGMAKGVSTALVGILSRGKSITTDEATELIKMLKTSGRYQED
W
>gi| 16189|emb|CAA46815.1 | NADPH-ferri he moprote in reductase [Arabidopsis thaliana] SEQ ID No 71 :
MSSSSSSSTSMIDLMAAIIKGEPVIVSDPANASAYESVAAELSSMLIENRQFAMIVTTSIAVLIGCIVMLV WRRSGSGNSKRVEPLKPLVIKPREEEIDDGRKKVTIFFGTQTGTAEGFAKALGEEAKARYEKTRFKIV DLDDYAADDDEYEEKLKKEDVAFFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGNDRGEWLKNLKYGVFGLG NRQYEHFNKVAKVVDDILVEQGAQRLVQVGLGDDDQCIEDDFTAWREALWPELDTILREEGDTAVAT PYTAAVLEYRVSIHDSEDAKFNDITLANGNGYTVFDAQHPYKANVAVKRELHTPESDRSCIHLEFDIAG SGLTMKLGDHVGVLCDNLSETVDEALRLLDMSPDTYFSLHAEKEDGTPISSSLPPPFPPCNLRTALTR YACLLSSPKKSALVALAAHASDPTEAERLKHLASPAGKDEYSKWWESQRSLLEVMAEFPSAKPPLG VFFAGVAPRLQPRFYSISSSPKIAETRIHVTCALVYEKMPTGRIHKGVCSTWMKNAVPYEKSEKLFLGR PIFVRQSNFKLPSDSKVPIIMIGPGTGLAPFRGFLQERLALVESGVELGPSVLFFGCRNRRMDFIYEEEL QRFVESGALAELSVAFSREGPTKEYVQHKMMDKASDIWNMISQGAYLYVCGDAKGMARDVHRSLHT IAQEQGSMDSTKAEGFVKNLQTSGRYLRDVW
>gi|397771304|gb|AFO64618.11 cytochrome P450 reductase [Artemisia annua] SEQ ID No 72:
MQSTTSVKLSPFDLMTALLNGKVSFDTSNTSDTNIPLAVFMENRELLMILTTSVAVLIGCVVVLVWRRS SSAAKRAAESPVIVVPKKVTEDEVDDGRKKVTVFFGTQTGTAEGFAKALVEEAKARYEKAVFKVIDLD DYAAEDDEYEEKLKKESLAFFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGEEKGEWLEKLQYAVFGLGNRQ YEHFNKIAKVVDEKLTEQGAKRLVPVGMGDDDQCIEDDFTAWKELVWPELDQLLRDEDDTSVATPYT AAVAEYRVVFHDKPETYDQDQLTNGHAVHDAQHPCRSNVAVKKELHSPLSDRSCTHLEFDISNTGLS YETGDHVGVYVENLSEVVDEAEKLIGLPPHTYFSIHADNEDGTPLGGASLPPPFPPCTLRKALASYAD VLSSPKKSALLALAAHATDSTEADRLKFLASPAGKDEYAQWIVASHRSLLEVMEAFPSAKPPLGVFFA SVAPRLQPRYYSISSSPKFAPNRIHVTCALVYEQTPSGRVHKGVCSTWMKNAVPMTESQDCSWAPIY VRTSNFRLPSDPKVPVIMIGPGTGLAPFRGFLQERLAQKEAGTELGTAILFFGCRNRKVDFIYEDELNN FVETGALSELVTAFSREGATKEYVQHKMTQKTSDIWNLLSEGAYLYVCGDAKGMAKDVHRTLHTIVQ EQGSLDSSKAELYVKNLQMAGRYLRDVW
>gi| 1 15499487|gb|ABI98819.11 cytochrome P450 reductase [Artemisia annua] SEQ ID No 73:
MQSTTSVKLSPFDLMTALLNGKVSFDTSNTSDTNIPLAVFMENRELLMILTTSVAVLIGCVVVLVWRRS SSAAKKAAESPVIVVPKKVTEDEVDDGRKKVTVFFGTQTGTAEGFAKALVEEAKARYEKAVFKVIDLD DYAAEDDEYEEKLKKESLAFFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGEEKGEWLDKLQYAVFGLGNRQ YEHFNKIAKVVDEKLVEQGAKRLVPVGMGDDDQCIEDDFTAWKELVWPELDQLLRDEDDTSVATPYT AAVAEYRVVFHDKPETYDQDQLTNGHAVHDAQHPCRSNVAVKKELHSPLSDRSCTHLEFDISNTGLS YETGDHVGVYVENLSEVVDEAEKLIGLPPHTYFSVHADNEDGTPLGGASLPPPFPPCTLRKALASYAD VLSSPKKSALLALAAHATDSTEADRLKFLASPAGKDEYAQWIVASHRSLLEVMEAFPSAKPPLGVFFA SVAPRLQPRYYSISSSPRFAPNRIHVTCALVYEQTPSGRVHKGVCSTWMKNAVPMTESQDCSWAPIY VRTSNFRLPSDPKVPVIMIGPGTGLAPFRGFLQERLAQKEAGTELGTAILFFGCRNRKVDFIYEDELNN FVETGALSELVTAFSREGATKEYVQHKMTQKASDIWNLLSEGAYLYVCGDAKGMAKDVHRTLHTIVQ EQGSLDSSKAELYVKNLQMAGRYLRDVW
>gi|83854017|gb|ABC47946.1 | cytochrome P450 reductase [Artemisia annua] SEQ ID No 74: MQSTTSVKLSPFDLMTALLNGKVSFDTSNTSDTNIPLAVFMENRELLMILTTSVAVLIGCVVVL WRRS SSAAKKAAESPVIVVPKKVTEDEVDDGRKKVTVFFGTQTGTAEGFAKALVEEAKARYEKAVFKVIDLD DYAAEDDEYEEKLKKESLAFFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGEEKGEWLDKLQYAVFGLGNRQ YEHFNKIAKVVDEKLVEQGAKRLVPVGMGDDDQCIEDDFTAWKELVWPELDQLLRDEDDTSVATPYT AAVGEYRVVFHDKPETYDQDQLTNGHAVHDAQHPCRSNVAVKKELHSPLSDRSCTHLEFDISNTGLS YETGDHVGVYVENLSEVVDEAEKLIGLPPHTYFSVHTDNEDGTPLGGASLPPPFPPCTLRKALASYAD VLSSPKKSALLALAAHATDSTEADRLKFFASPAGKDEYAQWIVASHRSLLEVMEAFPSAKPPLGVFFA SVAPRLQPRYYSISSSPKFAPNRI HVTCALVYEQTPSGRVHKGVCSTWMKNAVPMTESQDCSWAPIY VRTSNFRLPSDPKVPVIMIGPGTGLAPFRGFLQERLAQKEAGTELGTAILFFGCRNRKVDFIYEDELNN FVETGALSELVTAFSREGATKEYVQHKMTQKASDIWNLLSEGAYLYVCGDAKGMAKDVHRTLHTIVQ EQGSLDSSKAELYVKNLQMAGRYLRDVW
>gi| 13183562|gb|AAK15259.1 |AF302496_1 NADPH-cytochrome P450 oxydoreductase isoform 1 [Populus trichocarpa x Populus deltoides] SEQ ID No 75:
MSSGGSNLARFVQSVLGISFGDSLSDSWVIITTSFAALVGLVVLVLKRSSDRSKDVKPLVVPKSLSIKD EEDESEALGGKTKVTIFYGTQTGTAEGFAKALAEEVKARYEKAAVKVFDLDDYAMEDDQYEEKLKKET LALFMVATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGNERGIWLQQLSYGVFGLGNRQYEHFNKIAKVLDDLLYEQ GGKRLVPVGLGDDDQCIEDDFSAWKEFLWPELDQLLRDEDDVNAPSTPYTAAIPEYRLVIHDPSIISVE DKFSNLANGNVSFDI HHPCRVNVAVQKELHKAESDRSCI HLEFDITGTGITYETGDHLGVYAENSDETV EEAGKLLDKPLDLLFSIHADNEDGTAIGSSLPPPFPGPCTLHTALACYADLLSPPKKAALLALAAHASEP SEADRLKFLSSPQGKNEYSHWVMASQRSLLEVMAEFPSSKPPLGIFFAAVAPRLQPRYYSISSSPRYT PNRVHVTCALVYGPTPTGRIHKGVCSTWMKNAVPLEKSYECSWAPIFTRTSNFKLPADPSTPIIMVGP GTGLAPFRGFLQERIALKEDGVKLGPALLFFGCRNRRMDFIYEDELNNFVEQGVISELIVAFSREGPQK EYVQHKMVDRAAEIWTIISQGGYFYVCGDAKGMARDVHRTLHTIVQEQGGLDSSKTESMVKKLQME GRYLRDVW
>gi| 13183564|gb|AAK15260.1 |AF302497_1 NADPH-cytochrome P450 oxydoreductase isoform 2 [Populus trichocarpa x Populus deltoides] SEQ ID No 76:
MQSSSSSMKVSPLELMQAIIKGKVDPTNVSSESGGSAAEMATLIRENREFVIILTTSIAVLIGYVVVLIWR
RSSGYQKPKVPVPPKPLIVKDLEPEVDDGKKKVTIFFGTQTGTAEGFAKALAEEAKARYEKAIFKTVDL
DDYAEDDDEYEEKLKKESLAIFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFTDGNERGEWLKELPYAVFGLGNRQ YEHFNKIAIVVDKILGNQGGKQLVPVGLGDDDQCMEDDFAAWRELLWPELDQLLLDGDDPTGVSTPY TAAVAEYRVVLHDPEDAPLEDDNWSNANGHAIYDAQHPCRANVTVRRELHTPASDRSCTHLEFDISG TGLVYGTGDHVGVYCENLSEIVEEALQLLGLSPDIYFTIHTDNEDGTPLSGSALPPPFPSSTLRTALTRY ADLLSSPKKSALMALAAHATNPTEADRLRHLASPAGKDEYAQWIVANHRSLLEVMAEFPSAKPPLGVF FASVAPRLLPRYYSISSSPSMAPSRIHVTCALVLEKTPAGRIHKGVCSTWMKNAVPLEKSHDCSWAPI FVRQSNFKLPADTKVPIIMIGPGTGLAPFRGFLQERLAQKEAGAELGSSVLFFGCRNRQMDFIYEDEL NNFVESGALSELSVAFSREGPTKEYVQHKMMQKASDIWNMISQGGYLYVCGDAKGMAKDVHRTLHT IVQEQGSLDNSKTESFVKGLQMNGRYLRDVW
>gi| 13183566|gb|AAK15261 .1 |AF302498_1 NADPH-cytochrome P450 oxydoreductase isoform 3 [Populus trichocarpa x Populus deltoides] SEQ ID No 77:
MESSSSSIKVSPLDLMQAIIKGKVDPANVSSESGGSVAEVATLILENREFVMILTTSIAVLIGCVVVLIWR RSSGYQRPKVPVPPKPLIVKDLEPEVDDGKKKVTIFFGTQTGTAEGFAKALAEEAKARYDKATFKTVD MDDYAGDDDEYEEKLKKEDLVIFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGNERGEWLKDLPYAVFGLGN RQYEHFNKIAIVVDKIFADQGGKRLAPVGLGDDDQCMEDDFAAWRELLWPEMDQLLLDGDDPTAVST PYAATVSEYRVVFHSPEDAPLEDDNWSNANGHAVYDAQHPCRANVAVRRELHTPASDRSCTHLEFEI SGTGLAYGTGDHVGVYCENLSETVEEALQLLGLSPDTYFSIHNDNEDGTPLSGGALPPPFPPSTLKTA LARYADLLSLPKKSALMALAAHATDPTEADRLRHLASPAGKDEYAQLLVANQRSLLEVMAEFPSAKPP LGVFFASVAPRLQPRYYSISSSPRMAPSRI HVTCALVLEKTLGGRI HKGVCSTWMKNAVPLEKSHDCS WAPVFVRQSNFKLPADAKVPIIMIGPGTGLAPFRGFLQERLALKEAGSELGSSVLFFGCRNRKMDFIY EDELNNFVESGALSELVVAFSREGPTKEYVQHKMMQKASDIWNMISQGGYLYVCGDAKGMAKDVHR ALHTIVQEQGSLDNSKTESFVKSLQMNGRYLRDVW
>gi|295448|gb|AAA34240.1 | NADPH cytochrome P450 [Vigna radiata] SEQ ID No 78:
MASNSDLVRAVESFLGVSLGDSVSDSLLLIATTSAAVWGLLVFLWKKSSDRSKEVKPVVVPRDLMME EEEEVDVAAGKTKVTIFFGTQTGTAEGFAKALAEEIKARYEKAAVKVVDLDDYAADDDLYEEKLKKESL VFFMLATYGDGEPIDNAARFYKWFTEGKDERGIWLQKLTYGVFGLGNRQYEHFNKIGKWDEELAEQ GAKRLVAVGLGDDDQSIEDDFSAWKESLWSELDQLLRDEDDANTVSTPYTAAILEYRVVI HDPTAAST YDNHSTVANGNTEFDIHHPCRVNVAVQKELHKPESDRSCI HLEFDISGTSITYDTGDHVGVYAENCNE TVEETGKLLGQNLDLFFSLHTDKDDGTSLGGSLLPPFPGPCSLRTALARYADLLNPPRKAALLALATHA SEPSDERLKFLSSPQGKDEYSKWWGSQRSLVEVMAEFPSAKPPLGVFFAAIAPRLQPRYYSISSSPR FAPQRVHVTCALVYGPTPTGRIHKGVCSTWMKNAIPSEKSQDCSSAPIFIRPSNFKLPVDHSIPIIMVGP GTGLAPFRGFLQERYALKEDGVQLGPALLFFGCRNRQMDFIYEDELKSFVEQGSLSELIVAFSREGAE KEYVQHKMMDKAAHLWSLISQGGYLYVCGDAKGMARDVHRTLHSIVQEQENVDSTKAEAIVKKLQM DGRYLRDVW
>gi|2809387|gb|AAB97737.1 | NADPH cytochrome P450 reductase [Petroselinum crispum] SEQ ID No 79:
MQSESMEVSPVDLLASILKIDSVESMTLLLENRDVLMLLTTSFAVLIGLGLVMMWRRSTTMTKSAKKLE
PAKIVIPKFEMEEEVDDGKKKVTIFYGTQTGTAEGFAKALAEEAKARYQDAIFKTIDLDDYAGDDDEYE
TKLKKESMVFFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFCEGKERGEWLNNLQYGVFGLGNRQYEHFNKIAVV VDDGLVEQGAKRLVPVGMGDDDQCIEDDFTAWREL WPELDQLLLDEESKAAATPYTAAVLEYRVQ FYNQTDTSSPLVRSMSKLNGHAVYDAQHPCRANVAVRRELHTPASDRSCTHLEFDISSTGLAYETGD HVGVYTENLIEIVEEAERLIDISPDTYFSIHTENEDGTPLSGGSLPPPFPPCSFRTALTRYADLLSTPKKS ALVALAAHASDPSEAERLRFLASPVGKDEYAQWLVASQRSLLEVLAAFPSAKPPLGVFFASVAPRLQP RYYSISSSPRMAPSRIHVTCALVHETTPAGRIHKGLCSTWMKNAVSLEDAHVSSWAPIFVRQSNFRLP TDSKVPIIMIGPGTGLAPFRGFMQERLALKESGAELGSAVLYFGCRNRKLDFIYEDELNHFVETGAISE MVVAFSREGPAKEYVQHKMSQKASEIWDMISHGAYIYVCGDAKGMARDVHRMLHTIAQEQGALDSS HAESLVKNLHMSGRYLRD W
>gi|2809385|gb|AAB97736.1 | NADPH cytochrome P450 reductase [Petroselinum crispum] SEQ ID No 80:
MGGESLATSLPATLLENRDLLMLLTTSIAVLIGCAVVLVWRRSSLRSVKSVEPPKLIVPKVEIEDEVDDG KKKVTVFFGTQTGTAEGFAKAFAEEAKARYEKAKFRVVDLDDYAAEDEEYEAKFKKESFAFFFLATYG DGEPTDNAARFYKWFSEGEEKGDWLNKLQYGVFGLGNRQYEHFNKIAKVVDDGLADQGAKRIVEVG MGDDDQCIEDDFTAWREL WPELDKLLLDEDDTSAATPYTAAVLEYRVVVYDQLDTATLDRSLSTQN GHTVHDAQHPCRSSVAAKKELHKPASDRSCIHLEFDISHTGLAYETGDHVGVYCENLVEIVEEAEKLL GMQPNTYFSVHIDDEDGTPLTGGSLPPPFPPCTVRSALAKYADLLSSPKKSALLALAAHASDPTEADR LRLLASPAGKDEYAQWVVASHRSLLEVLAEFPSAKPPLGVFFASVAPRLQPRYYSISSSPRMVPSRIH VTCALVYEKTPTGRIHKGVCST MKNAVSLEESHDCSWAPIFVRQSNFKLPSDTKVPIIMIGPGTGLAP FRGFLQERQALKDAGAELGTAVLYFGCRNRNLDFIYEDELNKFVESGSISELIVAFSREGPTKEYVQHK MLQKASEIWNLISEGAYIYVCGDAKGMARDVHRMLHTIAQEQGALDSSKAESWVKNLQMTGRYLRDV
W
>gi|224551850|gb|ACN54323.1 | NADPH:cytochrome P450 reductase [Gossypium hirsutum] SEQ ID No 81 :
MSSSSDLVGFVESVLGVSLEGSVTDSMIVIATTSLAVILGLLVFFWKKSGSERSRDVKPLVAPKPVSLK DEEDDDAVIAAGKTKVTIFYGTQTGTAEGFAKALAEEIKARYEKAAVKWDLDDYAMDDEQYEEKLKK ETLAFFMVATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGNERLPWLQQLTYGVFGLGNRQYEHFNKIAKVLDEQLS EQGAKRLIEVGLGDDDQCIEDDFTAWRELLWPELDQLLRDEDDENATSTPYTAAIPEYRVVVHDPAV MHVEENYSNKANGNATYDLHHPCRVNVAVQRELHKPESDRSCIHLEFDISGTGITYETGDHVGVYAD NCVETVEEAARLLGQPLDLLFSIHTDNEDGTSAGSSLPPPFASPCTLRMALARYADLLNPPRKAALIAL AAHATEPSEAEKLKFLSSPQGKDEYSQWWASQRSLLEVMAEFPSAKPPLGVFFAAVAPRLQPRYYS ISSSPRFVPARVHVTCALVYGPTPTGRIHRGVCSTWMKNAVPLEKSNDCSWAPIFIRQSNFKLPADPS VPIIMVGPGTGLAPFRGFLQERLVLKEDGAELGSSLLFFGCRNRRMDFIYEDELNNFVEQGALSELW AFSREGPQKEYVQHKMMDKAADIWNLISKGGYLYVCGDAKGMARDVHRTLHTIIQEQENVDSSKAES MVKKLQMDG RYLRDVW
>gi|224551852|gb|ACN54324.1 | NADPH:cytochrome P450 reductase [Gossypium hirsutum] SEQ ID No 82:
MDSSSSSSSSGPSPLDLMSALVKAKMDPSNASSDSAAQVTTVLFENREFVMILTTSIAVLIGCVVILIW RRSASQKPKQIQLPLKPSIIKEPELEVDDGKKKVTILFGTQTGTAEGFAKALVEEAKARYEKATFNIVDL DDYAADDEEYEEKMKKDNLAFFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGKERGEWLQNMKYGIFGLGNK QYEHFNKVAKVVDELLTEQGAKRIVPLGLGDDDQCIEDDFTAWRELVWPELDQLLRDEDDATVSTPY TAAVLEYRVVFYDPADAPLEDKNWSNANGHATYDAQHPCRSNVAVRKELHAPESDRSCTHLEFDIAG TGLSYETGDHVGVYCENLDEVVDEALSLLGLSPDTYFSVHTDKEDGTPLGGSSLPSSFPPCTLRTALA RYADLLSSPKKAALLALAAHASDPTEADRLRHLASPAGKDEYAQWIVANQRSLLEVMAEFPSAKPPLG VFFAAVAPRLQPRYYSISSSPRLAPSRIHVTCALVYEKTPTGRIHKGVCSTWMKNAVSSGKSDDCGW APIFVRQSNFKLPSDTKVPIIMIGPGTGLAPFRGFLQERLALKEAGAELGPSVLFFGCRNRKMDFIYED ELNNFVNSGALSELVVAFSREGPTKEYVQHKMMEKAKDIWDMISQGGYLYVCGDAKGMARDVHRAL HTIFQEQGSLDSSKAESMVKNLQMSGRYLRDVW
Cytochrome P450 Monooxygenases (CYPs): >gi|326324797|dbj|BAJ84106.1 | cytochrome P450 [Vitis vinifera] SEQ ID No 83:
MEVFFLSLLLIFVLSVSIGLHLLFYKHRSHFTGPNLPPGKIGWPMVGESLEFLSTGWKGHPEKFIFDRIS KYSSEVFKTSLLGEPAAVFAGAAGNKFLFSNENKLVHAWWPSSVDKVFPSSTQTSSKEEAKKMRKLL PQFFKPEALQRYIGIMDHIAQRHFADSWDNRDEVIVFPLAKRFTFWLACRLFMSIEDPAHVAKFEKPFH VLASGLITVPIDLPGTPFHRAIKASNFIRKELRAIIKQRKIDLAEGKASQNQDILSHMLLATDEDGCHMNE MEIADKILGLLIGGHDTASAAITFLIKYMAELPHIYEKVYEEQMEIANSKAPGELLNWDDVQNMRYSWN VACEVMRLAPPLQGAFREAITDFVFNGFSIPKGWKLYWSANSTHKSPECFPQPENFDPTRFEGNGPA PYTFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNVVKRFKWDKLLPDEKIIVDPMPMPAKGLPVRLHPHKP
>gi|326324799|dbj|BAJ84107.1 | Cytochrome P450 [Vitis vinifera] SEQ ID No 84:
MEVFFLSLLLISVLSVSIRLYLLLYKHRSHFTGPNLPPGKIGWPMVGESLEFLSTGWKGHPEKFIFDRIS KYSSEVFKTSLLGEPAAVFAGAAGNKFLFSNENKLVHAWWPSSVDKVFPSSTQTSSKEEAKKMRKLL PQFLKPEALQRYTGIMDHIAQRHFADSWDNRDEVIVFPLAKRFTFWLACRLFMSIEDPAHVAKFEKPF HVLASGLITIPIDLPGTPFHRAIKASNFIRKELRAIIKQRKIDLAESKASKTQDILSHMLLATDEDGCHMNE MSIADKILGLLIGGHDTASSAITFLVKYMAELPHIYEKVYKEQMEIANSKAPGELLNWDDVQKMRYSWN VACEVMRLAPPLQGAFREAITDFVFNGFSIPKGWKLYWSANSTHKSLECFPQPEKFDPTRFEGAGPA PYTFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILIFMHNLVKRFKWDKLLPDEKIIVDPMPMPAKGLPVRLHPHKP
>gi|84514135|gb|ABC59076.11 cytochrome P450 monooxygenase CYP716A12 [Medicago truncatula] SEQ ID No 85:
MEPNFYLSLLLLFVTFISLSLFFIFYKQKSPLNLPPGKMGYPIIGESLEFLSTGWKGHPEKFIFDRMRKYS SELFKTSIVGESTVVCCGAASNKFLFSNENKLVTAWWPDSVNKIFPTTSLDSNLKEESIKMRKLLPQFF KPEALQRYVGVMDVIAQRHFVTHWDNKNEITVYPLAKRYTFLLACRLFMSVEDENHVAKFSDPFQLIA AGIISLPIDLPGTPFNKAIKASNFIRKELIKIIKQRRVDLAEGTASPTQDILSHMLLTSDENGKSMNELNIAD KILGLLIGGHDTASVACTFLVKYLGELPHIYDKVYQEQMEIAKSKPAGELLNWDDLKKMKYSWNVACE VMRLSPPLQGGFREAITDFMFNGFSIPKGWKLYWSANSTHKNAECFPMPEKFDPTRFEGNGPAPYTF VPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNLVKRFKWEKVIPDEKIIVDPFPIPAKDLPIRLYPHKA
>gi|365927744|gb|AEX07773.1 | cytochrome P450 [Catharanthus roseus] SEQ ID No 86:
MEIFYVTLLSLFVLLVSLSFHFLFYKNKSTLPGPLPPGRTGWPMVGESLQFLSAGWKGHPEKFIFDRM AKYSSNVFRSHLLGEPAAVFCGAIGNKFLFSNENKLVQAWWPDSVNKVFPSSNQTSSKEEAIKMRKM LPNFLKPEALQRYIGLMDQIAQKHFSSGWENREQVEVFPLAKNYTFWLASRLFVSVEDPIEVAKLLEPF NVLASGLISVPIDLPGTPFNRAIKASNQVRKMLISIIKQRKIDLAEGKASPTQDILSHMLLTSDENGKFMH ELDIADKILGLLIGGHDTASSACTFIVKFLGELPEIYEGVYKEQMEIANSKAPGEFLNWEDIQKMKYSWN VACEVLRLAPPLQGAFREALNDFMFHGFSIPKGWKIYWSVNSTHRNPECFPDPLKFDPSRFDGSGPA PYTFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNLVKRFKWEKIIPNEKIWDPMPIPEKGLPVRLYPHI NA
>gi|2241 18706|ref|XP_002331427.1 | cytochrome P450 [Populus trichocarpa] SEQ ID No 87:
MELLFLSLLLALFVSSVTIPLFLIFYNHRSQNSHPNLPPGKLGLPLVGESFEFLATGWKGHPEKFIFDRIA KYSSHIFKTNILGQPAVVFCGVACNKFLFSNENKLVVSWWPDSVNKIFPSSLQTSSKEEAKKMRKLLP QFLKPEALQGYIGIMDTIAQRHFASEWEHKEQVLVFPLSKNYTFRLACRLFLSIEDPSHVAKFSDPFNL LASGIISIPIDLPGTPFNRAIKASNFIRTELLAFIRQRKKDLAEGKASPTQDILSHMLLTCDENGKCMNEL DIADKIIGLLIGGHDTASAACTFIVKYLAELPHIYEEVYKEQMEIAKSKTPGEFLNWDDIQKMKYSWKVA CEVMRISPPLQGAFREALNDFIFNGFTIPKGWKLYWSTNSTHRDPVYFPEPEKFDPRRFEGSGPAPYT FVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNLVRRFKFDKLIQDEKIWNPLPIPDKGLPVRLHPHKA
>gi|356513241 |ref|XP_003525322.1 | : cytochrome P450 716B2-like [Glycine max] SEQ ID No 88: MDHNNLYLSLLLLFVSFVTLSLFFLFYKHRSPFVAPNLPPGATGYPVIGESLEFLSTGWKGHPEKFIFD RMIRYSSQLFKTSIFGEPAVIFCGATCNKFLFSNENKLVAAWWPNSVNKVFPSTLQSNSKEESKKMRK LLPQFLKPEALQRYVGIMDTIAQNHFASLWDNKTELTVYPLAKRYTFLLACRLFMSVEDVNHVAKFEN PFHLLASGIISVPIDLPGTPFNKAIKAANAIRKELLKIIRQRKVDLAEGKASPTQDILSHMLLTCNENGQF MNELDIADKILGLLIGGHDTASAACTFIVKYLAELPHIYDSVYQEQMEIAKSKLPGELLNWDDINRMKYS WNVACEVMRIAPPLQGGFREAI NDFIFNGFSIPKGWKLYWSANSTHKNPEYFPEPEKFDPTRFEGQG PAPFTFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNLVKRFKWEKLIPDEKIIVDPLPVPAKNLPIRLHPHKP
>gi|388827893|gb|AFK79029.1 | cytochrome P450 CYP716A41 [Bupleurum chinense] SEQ ID No 89: MMMYLYFSVISILVLLPCVWLFFLHSNRKSTQQSYKSLPPGETGYFLIGESLEFLSTGRKGHPEKFIFD RMTKYASKIFKSSLFGEKTIVFCGAANNKFLFSDENKLVQSWWPNSVNKLFPSSTQTSSKEEAIKMRK MLPNFFKPEALQRYVGVMDEIAQKHFDSCWENKHTVIVAPLTKRFTFWLACRLFVSLEDPTQVAKFAE PFNLLASGVFSIPIDLPGTAFNRAIKASNFIRKTLIGIIKKRKVDLEDGTASATQDILSHMLLTSDETGKFM TEADIADKILGLLIGGHDTASSACALIVKYLAELPHIYDGVYREQMEIAKSKSPGELLNWDDVQKMKYS WNVACEVLRLAPPLQGSFREVLSDFMHNGFSIPKGWKIYWSANSTHKSSEYFPEPEKFDPRRFEGS GPAPYTFVPFGGGPRMCPGKEYGRLEILVFMHHLVKRFRWQKIYPLEKITVNPMPFPDKDLPIRLFPH KA
>gi|449442637|ref|XP_004139087.11 : cytochrome P450 716B1-like [Cucumis sativus] SEQ ID No 90: MELFLISLLILLFFFLSLTLFILFHNHKSLFSYPNTPPGAIGLPILGESVEFLSSGWKGHPEKFIFDRLNKY KSDVFKTSIVGVPAAIFCGPICNKFLFSNENKLVTPWWPDSVNKIFPSTTQTSTKEEAKKLKKLLPQFLK PEALQRYIGIMDELAERHFNSFWKNREEVLVFPLAKSFTFSIACRLFMSVEDEIHVERLSGPFEHIAAGII SMPIDLPGTPFNRAIKASKFIRKEVVAIVRQRKQDLAEGKALATQDILSHMLLTCDENGVYMNESDITDK ILGLLIGGHDTASVACTFIVKFLAELPHIYDAVYTEQMEIARAKAEGETLKWEDIKKMKYSWNVACEVLR IASPLQGAFREALSDFVFNGFFIPKGWKLYWSANSTHKNPEYFPEPYKFDPGRFEGNGPLPYTFVPF GGGPRMCPGKEYAKLEILVFMHNLVKRFKWTKLLENENIIVNPMPIPQKGLPVRLFPHQPLSL
>gi|332071098|gb|AED99868.1 | cytochrome P450 [Panax notoginseng] SEQ ID No 91 :
MELFYVPLLSLFVLFISLSFHFLFYKSKSSSSVGLPLPPGKTGWPIIGESYEFLSTGWKGYPEKFIFDRM TKYSSNVFKTSIFGEPAAVFCGAXCNKFLFSNENKLVQAWWPDSVNKVFPSSTQTSSKEEAIKMRKM LPNFFKPEALQRYIGLMDQIAAKHFESGWENKDEVVVFPLAKSYTFWIACKVFVSVEEPAQVAELLEP FSAIASGIISVPIDLPGTPFNSAIKSSKIVRRKLVGIINQRKIDLGEGKASPTQDILSHMLLTSDESGKFMG EGEIADKILGLLIGGHDTASSACTFVVKFLAELPQIYXGVYQEQMEIVKSKKAGELLKWEDIQKMKYSW NVACEVLRLAPPLQGAFREALSDFTYNGFSIPKGWKLYWSANSTHRNSEVFPEPLKFDPSRFDGAGP PPFSFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHHLVKRFKWEKVIPDEKIWNPMPIPANGLPVRLFPHKA
>gi|397741002|gb|AFO63032.1 | cytochrome P450 CYP716A52v2 [Panax ginseng] SEQ ID No 92: MELFYVPLLSLFVLFISLSFHFLFYKSKPSSSGGFPLPPGKTGWPIIGESYEFLSTGWKGYPEKFIFDRM TKYSSNVFKTSIFGEPAAVFCGAACNKFLFSNENKLVQAWWPDSVNKVFPSSTQTSSKEEAIKMRKM LPNFFKPEALQRYIGLMDQIAANHFESGWENKNEVVVFPLAKSYTFWIACKVFVSVEEPAQVAELLEP FSAIASGIISVPIDLPGTPFNSAIKSSKIVRRKLVGIIKQRKIDLGEGKASATQDILSHMLLTSDESGKFMG EGDIADKILGLLIGGHDTASSACTFVVKFLAELPQIYEGVYQEQMEIVKSKKAGELLKWEDIQKMKYSW NVACEVLRLAPPLQGAFREALSDFTYNGFSIPKGWKLYWSANSTHINSEVFPEPLKFDPSRFDGAGPP PFSFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHHLVKRFKWEKVIPDEKIWNPMPIPANGLPVRLFPHKA
>gi 1255563874 |ref|XP_002522937.11 cytochrome P450, putative [Ricinus communis] SEQ ID No 93: MDHFYLTLLFLFVSFITFSIFIIFYKHKSQYNYPSLPPGKPGLPFVGESLEFLSSGWKGHPEKFVFDRTS KYSSEIFKTNLLGQPAAVFCGASANKFLFSNENKLVQAWWPDSVNKIFPSSLQTSSKEEAIKMRKLLP QFMKPEALQRYIGIMDTIAQRHFASGWEKKNEWVFPLAKNYTFWLACRLFVSLEDPDHIAKFADPFQ ELASGIISVPIDLPGTPFRRAIKASNFIRKELISIIKQRKIDLAEGKASGTQDILSHMLLTSDEDGKFMNEM DIADKILGLLIGGHDTASAACTFIIKYLAELPQIYDAVYKEQMEIAKSKGEGELLNWEDIQKMKYSWNVA CEVMRVAPPLQGAFREAINDFIFNGFYIPKGWKLYWSANSTHKSATYFEEPEKFDPSRFEGKGPAPYT FVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNLVKRFNFQKIIPDENIIVNPLPIPAKGLPVRLLPHQI
>gi| 147784145|emb|CAN72302.1 | hypothetical protein VITISV_041935 [Vitis vinifera] SEQ ID No 94: MEVFFLSLLLICVLSVSIRLYLLLYKHRSHFTGPNLPPGKIGWPMVGESLEFLSTGWKGHPEKFIFDRIS KYSSEVFKTSLLGEPAAVFAGAAGNKFLFSNENKLVHAWWPSSVDKVFPSSTQTSSKEEAKKMRKLL PQFLKPEALQRYTGIMDHIAQRHFADSWDNRDEVIVFPLAKRFTFWLACRLFMSIEDPAHVAKFEKPF HVLASGLITIPIDLPGTPFHRAIKASNFIRKELRAIIKQRKIDLAESKASKTQDILSHMLLATDEDGCHMNE MXIADKILGLLIGGHDTASSAITFLVKYMAELPHIYEKVYKEQMEIANSKAPGELLNWDDVQKMRYSWN VACEVMRLAPPLQGAFREAITDFVFNGFSIPKGWKLYWSANSTHKSLECFPQPEKFDPTRFEGAGPA PYTFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILIFMHNLVKRFKWDKLLPDEKIIVDPMPMPAKGLPVRLHPHKP
>gi|225460666|ref|XP_002266024.1 | : beta-amyrin 28-oxidase [Vitis vinifera] SEQ ID No 95:
MEVFFLSLLLICVLSVSIGLQFLFYKHRSHFTGPNLPPGRIGWPMVGESLEFLSTGWKGHPEKFIFDRIS KYSSEVFKTSLLGEPAAVFAGAAGNKFLFSNENKLVHAWWPSSVDKVFPSSTQTSSKEEAKKMRKLL PRFLKPEALQRYIGIMDHIAQRHFADSWDNRDEVIVFPLSKRFTFWLACRLFMSIEDPDHIAKFEKPFH VLASGLITVPIDLPGTPFHRAIKASNFIRKELRAIIKQRKIDLAEGKASPTQDILSDLLLATDEDGRHMNEI NIADKILGLLIGGHDTASSAITFIVKYMAELPHMYEKVYEEQMEIANSKAPGELLNWDDVQKMRYSWNV ACEVMRLAPPLQGAFREAITDFVFNGFSIPKGWKLYWSTSSTHKSPKCFPEPEKFDPTRFEGAGPAP YTFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNVVKRFKWDKLLPDEKIIIDPMRMPAKGLPVRLRLHKP
>gi 1255574173 |ref|XP_002528002.11 cytochrome P450, putative [Ricinus communis] SEQ ID No 96: MFPFAVLLIALSISYLIFKHKSNASSRKNLPPGNTGWPLIGESIEFLSTGRKGHPEKFIFDRMEKFSSKVF KTSLLLEPAAVFCGAAGNKFLFSNENKLVTAWWPNSVNKIFPSSLQTSSQEESKRMRKLLPQFLKPEA LQRYISIMDVIAQRHFAFGWNNKQQVTVFPLAKMYTFWLACRLFLSMEDREEVEKFAKPFDVLASGIIS IPIDFPGTPFNRGIKASNEVRRELIKMIEQRKIDLAENKASPTQDILSHMLTTADEYMNEMDIADKILGLLI GGHDTASAAITFVVKYLAEMPQVYNKVLEEQMEIAKAKAAGELLNWEDIQKMRYSWNVACEVMRLAP
PLQGAFREAMTDFTYAGFTIPKGWKLYWGANSTHRNPECFPEPEKFDPSRFEGKGPAPYTFVPFGG
GPRMCPGKEYARLEILVFMHNIVKKFRWEKLLPEEKIIVDPLPIPAKGLPLRLHPHTS
>gi|356523805|ref|XP_003530525.1 | : cytochrome P450 716B2 [Glycine max] SEQ ID No 97:
MEDNNLHLSLLLLFVSIVTLSLFVLFYKHRSAFAAPNLPPGATGYPVIGESLEFLSTGWKGHPEKFIFDR MIRYSSQLFKTSILGEPAVIFCGATCNKFLFSNENKLVAAWWPNSVNKVFPTTLLSNSKQESKKMRKLL PQFLKPEALQRYVGIMDTIARNHFASLWDNKTELTVYPLAKRYTFLLACRLFMSIEDVNHVAKFENPFH LLASGIISVPIDLPGTPFNKAIKAANAIRKELLKIIRQRKVDLAEGKASPTQDILSHMLLTCDEKGQFMNEL DIADKILGLLIGGHDTASAAITFIVKYLAELPHIYDRVYQEQMEIAKLKSPGELLNWDDVNRMQYSWNVA CEVMRIAPPLQGGFREAINDFIFDGFSIPKGWKLYWSANSTHKSPEYFPEPEKFDPTRFEGQGPAPYT FVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNLVKRFKWQKLIPDEKIIVDPLPIPAKNLPIRLHPHKP
>gi|255641079|gb|ACU20818.11 unknown, partial [Glycine max] SEQ ID No 98:
MEDNNLHLSLLLLFVSIVTLSLFVLFYKHRSAFAAPNLPPGATGYPVIGESLEFLSTGWKGHPEKFIFDR MIRYSSQLFKTSILGEPAVIFCGATCNKFLFSNENKLVAAWWPNSVNKVFPTTLLSNSKQESKKMRKLL PQFLKPEALQRYVGIMDTIARNHFASLWDNKTELTVYPLAKRYTFLLACRLFMSIEDVNHVAKFENPFH LLASGIISVPIDLPGTPFNKAIKAANAIRKELLKIIRQRKVDLAEGKASPTQDILSHMLLTCDEKGQFMNEL DIADKILGLLIGGHDTASAAITFIVKYLAELPHIYDRVYQEQMEIAKLKSPGELLNWDDVNRMQYSWNVA CEVMRIAPPLQGGFREAINDFIFDGFSIPKGWKLYWSANSTHKSPEYFPEPEKFDPTRFEGQGPAPYT FVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMYN
>gi|225429866|ref|XP_002280969.11 : beta-amyrin 28-oxidase [Vitis vinifera] SEQ ID No 99:
MELSLLHILPWATLFTTLSLSFLIYKLMIISHGTPRNLPSGNTGLPYIGESIQFLSNGRKGHPEKFISERM LKFSSKVFKTSLFGETAAVFCGSAGNKFLFSNENKLVTAWWPSSVNKIFPSSLQTSSQEESKKMRKLL PGFLKPEALQRYISIMDVIAQRHFESSWNNKEEVTVFPLAKMFTFWLACRLFLSVEDPDHVEKLAEPF NELAAGIIALPIDLPGTSFNKGIKASNLVRKELHAIIKKRKMNLADNKASTTQDILSHMLLTCDENGEYMN EEDIADKILGLLVGGHDTASATITFIVKFLAELPHVYDEVFKEQMEIAKSKAPGELLNWEDIPKMRYSWN VACEVMRLAPPVQGAFREAMNDFIFEGFSIPKGWKLYWSTHSTHRNPEFFPKPEKFDPSRFDGKGPA PYTYVPFGGGPRMCPGKEYARLEVLVFMHNLVRRFKWEKLLPDEKIIVDPMPIPAKGLPIRLHHHQP
>gi|224090683|ref|XP_002309057.1 | hypothetical protein POPTR_0006s08560g [Populus trichocarpa] SEQ ID No 100:
MELPFISLLPYGILFIISAVSLSYLINKHKYYLSSLNNLPPGNTGLPLIGESLEFLTTGQKGQPEKFILDRM AKFSSKVFKTSLFCEPTAVFCGAAGNKFLFSNENKLVTAWWPDSVNKIFPSSQQTSSQEESKKMRKL FPLFFKPESLQRYISVMDVIAQRHLASDWEGKQEVSVFPLAKTYTFWLACRLFLSMEDPEEVQKFAKP FNDLAAGIISIPIDLPWTPFNRGVKASNVVHKELLKIIKQRKIDLAENKASPTQDILSHMLTTADDNGQCM KKIDIADKILGLLVGGHDTASAAITFIVKYLAELPHVYNKLLEEQREIAKTKTPGELLNWEDIQRMRYSW NVACEVMRVAPPLQGAFREAMTEFNYAGFTIPKGWKLYWSANTTHKNPECFPEPENFDPSRFEGNG PAPYTFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFLHNLVKKFRWEKLLPKERIIVDPMPIPSKGLPIRLHPHEAA
>gi|217072174|gb|ACJ84447.11 unknown [Medicago truncatula] SEQ ID No 101 :
MEPNFYLSLLLLFVTFISLSLFFIFYKQKSPLNLPPGKMGYPIIGESLEFLSTGWKGHPEKFIFDRMRKYS SELFKTSIVGESTVVCCGAASNKFLFSNENKLVTAWWPDSVNKIFPTTSLDSNLKEESIKMRKLLPQFF KPEALQRYVGVMDVIAQRHFVTHWDNKNETTVYPLAKRYTFLLACRLFMSVEDENHVAKFSDPFQLIA AGIISLPIDLPGTPFNKAIKASNFIRKELIKIIKQRRVDLAEGTASPTQDILSHMLLTSDENGKSMNELNIAD KILGLLTGGHDTASVACTFLVKYLGELPHIYDKVYQEQMEIAKSKPAGELLNWDDLKKMKYSWNVACE VMRLSPPLQGGFREAITDFMFNGFSIPKGWKLYWSANSTHKNAECFPMPEKFDPTRFEGNGPAPYTF VPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNLAKRFKWEKVIPDEKIIVDPFPIPAKDLPIRLYPHKA
>gi 12555442421 ref|XP_002513183.11 cytochrome P450, putative [Ricinus communis] SEQ ID No 102: MELFFLIALTLFIILVTLPILAVLYRPNIINLPPGKTGLPYIGESLEFLSTGRKGHPEKFLSDRMEKFSRQVF RTSILGEQTAVVCGAQGNKFLFSNENKLVTAWWPKSILRLFPSSNQSTILAEGMRMRKMLPHFLKPEA LQRYIGVMDHMAQVHFQDSWENKQEVTVYPLAKMYTFSVACKVFLSMDDPKEVAKFAAPFNDMASG IISIPINFPGTSFNRGLKASKIIRNEMLRMIKQRRKDLAENKATPMQDILSHMLVATDEEGQRLGEVGIAD KIISLLIGGHDTASATITFVVKFLAELPDIYDQVLKEQLEIAKSKEPGELLTWEDIQKMKYSWNVACEVM RLAPPLQGSFREALHDFDYAGFSIPKGWKLYWSTHTTHKNPEYFSDPEKFDPSRFEGSGPAPYTFVP FGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNIAKRFKWNKVIPDEKIVVDPMPIPAKGLPVHLYPQKHE
>gi|731408064|ref|XP_002264643.3| : beta-amyrin 28-oxidase-like [Vitis vinifera] SEQ ID No 103: MVSFDLLYSNLIFCLLFSAIASIQMIMQQSDMELLLLSFLLLMALSLSFWIRFFVHKLEKSSGINLPPGKM GFPFIGESLEFLRMGRKGTPERFIQDRMAKYSTQIFKTCLLGEPTAVVCGAAGNKLLFSNENKLVTSW WPRSVEKIFPSSLQTSTKEESMKTRKLLPAFLKPEALQKYVGIMDSIAKWHLDNHWDLNETVTVFPLA KQYTFMVACRLFLSIDDPKHIAKFANPFHILAAGVMSIPINFPGTPFNRAIKAADSVRKELRAIIKQRKIQV LAGKSSSSKHDILSHMLTTTDENGQFLNEMDIADKILGLLIGGHDTASAVITFIIKYLAELPQVYNEVLKE QMEVAAGKKSGEMLDWEDIQKMKYSWNVANEVMRLAPPLQGSFREAITDFTYAGFSIPKGWKLYWS TNATHKNPDYFPDPEKFDPSRFEGNGPIPYTYVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFIHNVVRRFSWYKL HPNEDVIVDPMPMPAKGLPIRLRHH
>gi|224142653|ref|XP_002324669.1 | hypothetical protein POPTR_0018s 13390g [Populus trichocarpa] SEQ ID No 104:
METLYFILLLFVPIILSLVAIIYKHRYQDKLQNVPPGNLGLPFVGESLDFLSKGWKGCPENFIFDRIRKYS SEIFKTNLFLQPVVMLNGVAGNKFLFSNENRLVETWWPDFVNRIFPSAVETSPKEEAKRMRRLFPRFL KPEALQRYIGTMDMVTKRHFALEWGNKAEVVVFPLAKSYTFELACRLFLSIEDPSHIARFSHPFNQITS GIFTIPIDFPGTPFNRAIKASKLIRIELLAIIRQRKKDLAEGKASPTQDILSHMLLSNDADGKYMNEVQISD KILALLMGGHESTAASCTFIVKYLAELPHIYEAVYKEQAEIIKSKAPGELLNWDDIQKMKYSWNVACETL RLSPPLIGNFKEAIKDFTFNGFSIPKGWKASHFLTLYWSASSTHKNPEYFSEPEKFDPSRFEGKGPAP YTFIPFGGGPRMCPGNEYARLEILVFMHNLVKRFKFERLILDEKIVFDPTPKPEMGLPVRLLPHKA
>gi|356526487|ref|XP_003531849.11 : cytochrome P450 716B2 isoform X1 [Glycine max] SEQ ID No 105:
MEQLYYLTLVLLFVSFVSVSFFIIFYRHRSPFSVPNLPPGKAGFPVIGESLEFLSAGRKGLPEKFFSDRM TEYSSKVFKTSILGEPTVIFCGAACNKFLFSNENKHVISWWPENVKKLFPTNIQTNSKEEAKKLRNILPQ FLSAKAIQRYVGIMDTVAQRHFALEWENNTQVTVLPLAKRYTFGVASRVFMSIDDLNQVAKLAEPLNQ VNAGIISMPINFPGTVFNRGIKASKFIRRELLRIVKQRKVELANGMSTPTQDILSHMLIYCDENGQYLAE HDIVNKILGLLIGSHETTSTVCTFVVKYLAELPQNIYENVYQEQMAIAKSKAPGELLNWDDIQKMKYSW NVACEVIRLNPPAQGAFREAI NDFIFDGFSIPKGWKLYWSANSTHKNPEYFPEPEKFDPSRFEGTGPA PYTYVPFGGGPSMCPGKEYARMELLVFMHNLVKRFKCETLFPNGNVTYNPTPIPAKGLPVRLIPHR
Die Erfindung umfasst daher die Anwendung von Nukleinsäuresequenzen, sowie Hefestämme, die solche Sequenzen umfassen, welche für Proteine kodieren, wobei die Proteine eine ausreichende Sequenzidentität zu den oben genannten Sequenzen (SEQ ID No 54 bis 105) aufweisen, um zu einer solchen funktionsanalog zu sein. Dabei ist eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 75% oder 80%, besonders bevorzugt 85%, 90% oder 95%
Sequenzidentität vorteilhaft. Im Sinne der Erfindung heißt, um zu den genannten
Aminosäuresequenzen funktionsanalog zu sein, dass die Sequenzvariante effektiv die gewünschte Produktion von den pentazyklischen Triterpenoiden in den gleichen oder ähnlichen Mengen hervorrufen kann. Funktionsanaloge Sequenzen im Sinne der Erfindung sind alle Sequenzen, die der Fachmann durch Routineversuche als gleichwirkend identifizieren kann. Die Sequenzidentität zwischen zwei Sequenzen kann durch übliche Methoden analysiert werden, z. B. mit NCBI Blast oder Clustal.
Beispiele
Im Folgenden soll die Erfindung anhand von einigen Beispielen und Figuren erläutert werden, ohne dabei jedoch auf diese beschränkt zu sein.
In Figur 1 zeigt die Biosynthese von Triterpenoiden in S. cerevisiae. Enzyme wurden bereits in Hefe exprimiert und Verbindungen detektiert (Moses et al., 2013.). Die Abbildung zeigt eine Übersicht über den Prä- und Postsqualenbiosyntheseweg sowie die Erweiterung des
Stoffwechselweges zur Etablierung der Synthese von pentazyklischen Triterpenoiden in der Hefe Saccharomyces cerevisiae am Beispiel der Betuli nsäure dargestellt. Der Abbildung ist zu entnehmen, dass für die Synthese von pentazyklischen Triterpenoiden 1 , 2 oder 3 Gene in den Stoffwechsel der Hefe etabliert wurden. Die entsprechenden Enzyme werden als Oxidosqualenzyklase (OSC), NADPH-Cytochrom P450 Reduktase (CPR) und Cytochrom P450 Monooxygenase (CYP) bezeichnet. In einem 1 . Schritt wird 2,3-Oxidosqualen mittels einer multi- beziehungsweise monofunktionalen OSC zyklisiert. In einem 2. Schritt wird das Zwischenprodukt mittels einer CYP und CPR 3fach-oxidiert, um zum Endprodukt zu gelangen.
Figur 2 zeigt den Prä- und Postsqualenbiosyntheseweg in der Hefe S. cerevisiae sowie die Erweiterung des Stoffwechselweges zur Etablierung der Synthese von pentazyklischen
Triterpenoiden am Beispiel der Betuli nsäure. Die zu exprimierenden heterologen Gene für die Synthese sind in der Abbildung rot dargestellt und werden als Oxidosqualenzyklase (OSC), NADPH-Cytochrom P450 Reduktase (CPR) und Cytochrom P450 Monooxygenase (CYP) bezeichnet.
Um hohe Umsatzraten der heterologen Gene beziehungsweise der gebildeten Enzyme und somit auch hohe Titer an pentazyklischen Triterpenoiden zu gewährleisten, wurden mehrerer Gene für jede heterologe Enzymreaktion in verschiedenen Kombinationen zur Ermittlung der optimalen Gene und Kombination derselben mit hoher Produktivität getestet.
Die zyklischen Triterpenoide wurden aus Hefe extrahiert und mittels GC-MS untersucht.
Stammkonstruktion
Die Konstruktion der Stämme basiert auf dem Stamm CEN.PK1 1 1-61 A (MATalpha; ura3-52; Ieu2-3_1 12; TRP1 ; his3delta1 ; MAL2-8C; SUC2) sowie auf dem Stamm AH22tH3ura8
(Polakowski et al., 1998).
Tabelle 4: Übersicht der verwendeten Plasmide für die Stammkonstruktion
Figure imgf000066_0001
pTT2-LjCP l-Bl LEU2 LjCPRl (Lj) Predicted: XM_004139039 cytochrome P450
716Bl-like (Cs)
PTT2-ATR1-AL1 LEU2 - ATR1 (At) CYP716AL1 (Cr) JN565975 pTT2-ATRl-A15 LEU2 - ATR1 (At) CYP716A15 (Vv) AB619802 pTT2-ATRl-A17 LEU2 - ATR1 (At) CYP716A17 (Vv) AB619803 pTT2-ATRl-A9 LEU2 - ATR1 (At) CYP716A9 (Pt) XM_002331391 pTT2-ATRl-B2 LEU2 ATR1 (At) Predicted: XM_003525274
Cytochrome
P450 716B2-Iike
(LOC100801007)
(Gm)
pTT2-CrCPR-ALl LEU2 - CrCPR (Cr) CYP716AL1 (Cr) JN565975 pTT2-CrCPR-A15 LEU2 - CrCPR (Cr) CYP716A15 (Vv) AB619802 pTT2-CrCPR-A17 LEU2 - CrCPR (Cr) CYP716A17 (Vv) AB619803 pTT2-CrCPR-A9 LEU2 - CrCPR (Cr) CYP716A9 (Pt) XM_002331391 pTT2-CrCPR-B2 LEU2 CrCPR (Cr) Predicted: XM_003525274
Cytochrome
P450 716B2-Iike
(LOC100801007)
(Gm)
pTT2-MTR-A15 LEU2 - MTR_3gl00160 (Mt) CYP716A15 (Vv) AB619802 pTT2-MTR-A17 LEU2 - MTR_3gl00160 (Mt) CYP716A17 (Vv) AB619803 pTT2-MTR-A9 LEU2 - MTR_3gl00160 (Mt) CYP716A9 (Pt) XM_002331391 pTT2-MTR-B2 LEU2 MTR_3gl00160 (Mt) Predicted: XM_003525274
Cytochrome
P450 716B2-Iike
(LOC100801007)
(Gm)
pTT2-MTR-A12 LEU2 - MTR_3gl00160 (Mt) CYP716A12 (Mt) DQ335781 pTT2-NCPl-A15 LEU2 - NCP1 (Sc) CYP716A15 (Vv) AB619802 pTT2-NCPl-A17 LEU2 - NCP1 (Sc) CYP716A17 (Vv) AB619803 pTT2-NCPl-A9 LEU2 - NCP1 (Sc) CYP716A9 (Pt) XM_002331391 pTT2-NCPl-B2 LEU2 NCP1 (Sc) Predicted: XM_003525274
Cytochrome
P450 716B2-Iike
(LOC100801007)
(Gm)
Gu, Glycyrrhiza uralensis; Oe, Olea europaea; Rc Ricinus communis; Lj, Lotus japonicas; Cr, Catharanthus roseus; Vv, Vitis vinifera; Pt, Populus trichocarpa; Gm, Glycine max; Bc, Bupleurum chinense, Cs, Cucumis sativus; Mt, Medicago truncatula; At, Arabidopsis thaliana; Sc,
Saccharomyces cerevisiae
Tabelle 5: Übersicht der Basisstämme für die Stammkonstruktion
Name | Genotyp CEN.PK1 1 1-61A MATalpha; ura3-52; leu2-3 112; TRP1 ; his3delta1 ;
MAL2-8C; SUC2
CEN.PK2U CEN.PK1 1 1-61A ura3::tHMG1
AH22tH3ura8 MATa; Ieu2-3, 1 12; Acanl ; ura3::tHMG1
Beispiel 1 : Überexpression des Gens tHMG1 im Genlocus URA3
Das tHMG1-lntegrationsmodul (cADH1 r-tHMG1-TRP1t-loxP-kanMX-loxP) wurde von GeneArt synthetisiert und in einen pMK-Vektor über die Restriktionsschnittstellen Asel und Pacl kloniert. Das tHMG1-Ger\ (t = truncated, verkürzt) kodiert für eine verkürzte HMG-CoA-Reduktase, welche nur noch aus der katalytischen Untereinheit des Proteins besteht und somit nicht mehr der Feedback-Hemmung durch Sterolintermediate unterliegt. Es wurde ein pMK-Vektor mit einer Kanamycinresistenz verwendet. Für die genomische Integration wurde das tHMG1 -Modul aus dem pMK-Plasmid über PCR mit folgenden Primern amplifiziert:
U RA3_tH M G 1 _fw:
S'ATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCTACTCATCCAGTCAGGCACCGTGTATGAA ATC
U RA3_tH M G 1 _rev:
5TTAGTTTTGCTGGCCGCATCTTCTCAAATATGCTTCCCAGGGATCTGATATCACCTAATAAC TTC
Das 4,5 kbp-Fragment beinhaltet den KanMX-Marker (für die Resistent von Geneticin G418 bei Hefen) flankiert mit ΙοχΡ-Seiten (für die Rückgewinnung des Markers), das tHMG1-Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven /ADH7-Promotors und TRP1 -Terminators sowie homologe
Sequenzen zum URA3 Genlocus (die ersten und letzten 40 bp zu der kodieren Region vom URA3). Der Stamm Saccharomyces cerevisiae CEN.PK1 1 1-61 A wurde für die Transformation über homologe Rekombination am Genlocus URA3 verwendet. Nach der Transformation mittels der Lithium-Acetat-Methode gemäß Gietz et al. (1992) wurde der Stamm zur Selektion auf YE- Agarplatten mit Geneticin 418 ausplattiert. Der Stamm CEN.PK2U ist damit konstruiert.
YE-Medium: 0,5% Hefeextrakt; 2% Glucose; pH 6,3. Für Agarplatten wurde 1 ,5 % Agar zum Medium hinzugegeben. Die Glucose wird als 40% Glucose-Lösung hergestellt und separat autoklaviert. Nach dem Autoklavieren werden dem Medium 25 ml Glucose-Lösung
hinzugegeben.
Beispiel 2: Expression des Gens GuLUPI für die Produktion von zyklischen Triterpenen (z.B. Lupeol)
Das Gen GuLUPI wurde von GenScript codon optimiert für die Hefe synthetisiert und in einen pUC57-Vektor über die Restriktionsschnittstelle EcoRV kloniert. Der pUC57-Vektor beinhaltet ein Ampicillin-Resistenzgen und ein origin of replication pMB1 für die Replikation in E. coli. Für die Klonierung wurde das Gen GuLUPI aus dem pUC57-Plasmid über PCR mit folgenden Primern amplifiziert:
GuLUP_Sacl_fw:
S'GACTGACTGAGCTCAAAAATGTGGAAATTAAAAATCGGTGAAGGTGGTGC
GuLUP Notl rev: 5'GACTGACTGCGGCCGCCTATTAGTAAGAATGGGCGCACAAGACTTGTC Das amplifizierte Fragment hat eine Größe von 2,277 kbp.
Parallel dazu wurde eine Genkassette von GeneArt synthetisiert und in einen pMA-Vektor über die Schnittstelle Kpnl kloniert. Diese Genkassette beinhaltet eine CEN/ARS-Sequenz für eine autonome Replikation in Hefe, den URA3 Selektionsmarker für Hefe, MR-Seq Uenzen (URA3- Rückgewinnung über die Selektion auf Agarplatten mit 5-FOA) und flankierte Regionen, die homolog zum Integrations-Locus 5'YHRCdelta14 sind und die genomische Integration der Genkassette in den Integrations-Locus 5'YHRCdelta14 ermöglichen. Der pMA-Vektor beinhaltet ein Ampicillin-Resistenzgen als Selektionsmarker für E. coli und ein origin of replication Col E1 für die Replikation in E. coli.
Das amplifizierte Fragment (Gen: GuLUPI ) wurde über die Restriktionsschnittstellen Sacl und Notl in den pMA-Vektor unter der Kontrolle eines EN01 -Promotors und EN01-Terminators kloniert. Das resultierende Plasmid wird pTT1-GuLUP1 bezeichnet.
Das Plasmid wurde in kompetente E. co//-Zellen transformiert. Die Selektion erfolgte über Ampicillin-Resistenz auf LB-Agarplatten.
LB-Medium: 1 % Casein Pepton; 0,5% Hefeextrakt; 1 % NaCI; pH 7,0. Für Agarplatten wurde 1 ,5 % Agar zum Medium hinzugegeben.
Antibiotika: Ampicillin (Boehringer, Mannheim) 100 μg/ml
Der Stamm Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2U aus Beispiel 1 und der Stamm AH22tH3ura8 wurden für die episomale Transformation verwendet. Nach der Transformation mittels der Lithium-Acetat-Methode gemäß Gietz et al. (1992) wurden die Stämme zur Selektion auf WMVIII- Agarplatten ohne Uracil ausplattiert.
Beispiel 3: Kultivierunqsbedinqunqen für die Evaluierung der Stämme
Standardkultivierung der Hefe S. cerevisiae
1. Vorkultur: 20 ml WMVIII Medium: (Lang und Looman, 1995) in einem 100 ml
Erlenmeyerkolben wurden 0,1 % (v:v) aus einem Glycerolstock angeimpft. Die Hefen wurden bei 28°C und 150 rpm 72 h auf einem Rundschüttler angezogen.
2. Hauptkultur: 50ml WMVIII Medium in einem 250 ml Schikanekolben wurden aus der Vorkultur auf einen Start-Wert von OD600 = 0,5 angeimpft. Die Hefen wurden bei 28°C und 150 rpm 72 h auf einem Rundschüttler angezogen.
Stämme mit dem genetischen Hintergrund von CEN.PK1 1 1-61 A und CEN.PK2U sind auxotroph für Uracil, Histidin und Leucin. Daher wurde das Medium mit Uracil (100 mg/l), Histidin (100 mg/l) und mit Leucin (400 mg/l) supplementiert. Um einen Selektionsdruck auf ein transformiertes Plasmid auszuüben, wurde das entsprechende Supplement im Medium ausgelassen.
Stämme mit dem genetischen Hintergrund von AH22tH3ura8 sind auxotroph für Uracil und Leucin. Daher wurde das Medium mit Uracil (100 mg/l) und mit Leucin (400 mg/l) supplementiert. Um einen Selektionsdruck auf ein transformiertes Plasmid auszuüben, wurde das entsprechende Supplement im Medium ausgelassen. Bestandteile von WMVIII Medium für 1 Liter gemäß Lang und Looman, 1995: 250 mg
NH4H2P04; 2,8 g NH4CI; 250 mg MgCI2 x 6H20; 100 mg CaCI2 x 2H20; 2 g KH2P04; 550 mg MgS04 x 7H20; 75 mg meso-lnositol; 10 g Na-Glutamat mit folgender Änderung: 50 g Glucose statt Saccharose werden als 40% Glucose-Lösung hergestellt und separat autoklaviert.
Nach dem Autoklavieren werden dem Medium 125 ml Glucose-Lösung, 1 ml steril filtrierte Spurenelemente und 4 ml steril filtrierte Vitamine hinzugegeben.
Spurenelemente: 1000x konzentriert: 1 ,75 g ZnS04 x 7H20; 0,5 g FeS04 x 7 H20; 0,1 g CuS04 x 5 H20; 0,1 g MnCI2 x 4 H20; 0,1 g NaMo04 x 2 H20 für 1 einen Liter.
Vitaminlösung: 250x konzentriert: 2,5 g Nicotinsäure; 6,25 g Pyridoxin; 2,5 g Thiamin; 0,625 g Biotin; 12,5 g Ca-Pantothenat für 1 Liter.
Für Agarplatten wurde 1 ,5 % Agar zum Medium hinzugegeben.
Mediensupplemente: Leucin (400 mg/l); Histidin (100 mg/l); Uracil (100 mg/l) Die Stocklösungen werden mit einer Konzentration von 20 mg/ml hergestellt und steril filtriert.
Beispiel 4: Wachstums- und Produktivitätsanalvse (Identifizierung und Quantifizierung von zyklischen Triterpenen)
Die Kultivierung wird gemäß Beispiel 3 durchgeführt.
Bestimmung der Biotrockensubstanz (BTS)
Zur Bestimmung der Biotrockensubstanz wurden 2 mal 2 ml Kulturvolumen in vorher konditionierte und ausgewogene 2 ml Reaktionsgefäße überführt. Die Zellen wurden bei 18620 x g für 5 min abzentrifugiert und mit 1 ml Wasser gewaschen. Anschließend wurde das Zellpellet in einem Trockenschrank für 24 Stunden bei 80°C getrocknet. Die Proben kühlten im Exsikkator für 30 min. ab, bevor die Wägung erfolgte.
P ro benvo rbereit u ng
a) Hefestämme transformiert mit den Genen für eine OSC, CPR und CYP auf einem pTT1- und pTT2-Plasmid:
In ein 2 ml Reaktionsgefäß werden in einer Doppelbestimmung 800 μΙ Kulturbrühe einer Hauptkultur überführt. Es kann direkt mit der Extraktion fortgefahren werden oder die Proben können auch bei -20 °C eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt extrahiert werden. b) Hefestämme transformiert mit dem Gen für eine OSC auf einem pTT1-Plasmid:
In ein 1 ,5 ml Reaktionsgefäß werden in einer Doppelbestimmung 250 μΙ Kulturbrühe einer
Hauptkultur überführt. Es kann direkt mit der Extraktion fortgefahren werden oder die Proben können auch bei -20 °C eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt extrahiert werden.
Extraktion
Hefestämme transformiert mit den Genen für eine OSC, CPR und CYP auf einem pTT1- und pTT2-Plasmid Das Extraktionsmittel Chloroform/Methanol (4+1 ) wird mit Stigmasterol zu einer Konzentration von 50 μg/ml versetzt. Im ersten Schritt werden 800 μΙ Kulturbrühe mit 80 μΙ 1 M HCl, 250 μΙ Glas- Beads (0,4-0,6 mm) und 800 μΙ Extraktionsmittel versetzt und anschließend 20 min lang im TissueLyser II bei 30Hz geschüttelt. Nach anschließender Zentrifugation von 5 min. bei 18 000 x g wird die organische Phase in ein neues 1 ,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Die abgenommene organische Phase wird unter Vakuum eingedampft (SpeedVac; 35 °C; 0,1 mbar; 30 min). Die eingedampften Proben werden in 100 μΙ N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid (MSTFA, Sigma) gelöst und in mit Glaseinsätzen versehene braune GC-Vials überführt. Die Proben werden 1 h bei 80°C derivatisiert. Die fertigen Proben und somit die Identifizierung und die Quantifizierung von zyklischen Triterpenen wurden mittels GC-MS durchgeführt.
Hefestämme transformiert mit dem Gen für eine OSC auf einem pTT1 -Plasmid
Das Extraktionsmittel Chloroform/Methanol (4+1 ) wird mit Stigmasterol zu einer Konzentration von 50 μg/ml versetzt. Im ersten Schritt werden250 μΙ Kulturbrühe mit 25 μΙ 1 M HCl, 250 μΙ Glas- Beads und 400 μΙ Extraktionsmittel versetzt und anschließend 20 min lang im TissueLyser I I bei 30Hz geschüttelt. Nach anschließender Zentrifugation von 5 min. bei 18 000 x g werden 250μΙ organische Phase in ein neues 1 ,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Die abgenommene organische Phase wird unter Vakuum eingedampft (SpeedVac; 35 °C; 0,1 mbar; 30 min). Die eingedampften Proben werden in 250 μΙ Chloroform gelöst und 100 μΙ werden in mit Glaseinsätzen versehene braune GC-Vials überführt. Die fertigen Proben und somit die Identifizierung und die
Quantifizierung von zyklischen Triterpenen wurden mittels GC-MS durchgeführt.
Herstellung der externen Standards (ESTD)
Zur quantitativen Bestimmung von pentazyklischen Triterpenen wie z.B. Lupeol und Betulinsäure durch Gaschromatographie wird eine Verdünnungsreihe mit den jeweiligen Substanzen hergestellt. Die ESTDs enthalten zusätzlich, ebenso wie die Proben, als internen Standard Stigmasterol in einer Konzentration von 50 μg/ml. Die ESTDs werden in Chloroform hergestellt. Die ESTDs werden analog zu den Proben in einem braunen GC-Vial mit MSTFA 1 h bei 80°C derivatisiert oder underivatisiert mittels GC-MS vermessen.
Bedingungen für die Gaschromatographie (GC)
Die GC-Analytik wurde mit einem Agilent 6890N Gaschromatographen (Agilent, Waldbronn), ausgestattet mit einem Autosampier Agilent 7683B, durchgeführt. Als Detektor wurde ein Agilent 5975 VL Massenspektrometer verwendet. Es wurden folgende Bedingungen gewählt: Als Säule diente eine 30m lange HP-5MS Säule (Agilent) mit einem Innendurchmesser von 0,25 mm und einer Filmdicke von 0,25μιη. Helium diente als mobile Phase. Das GC/MS System wurde mit einem Temperaturprogramm (150°C 0,5 min, 40°C/min bis 280°C, 2°C/min bis 310°C, 40°C/min bis 340°C, 340°C für 2,5min) im Splitless-Modus gefahren. Die Injektortemperatur betrug 280°C, die des Detektors (MS-Quadrupol) 150°C. Das Injektionsvolumen der Proben betrug 1 μΙ.
Beispiel 5: Stammabhänqiqe Ausbeute von pentazyklischen Triterpenen
Die gaschromatographische Analyse der pentazyklischen Triterpene ist in Tabelle 6 dargestellt. In den Tabellen sind die Biotrockensubstanz (BTS) sowie die volumetrische und spezifische Produktausbeute abgebildet. Die Stämme wurden wie in Beispiel 3 kultiviert. Die produzierten Mengen am Beispiel von Lupeol, Betulin, Betulinaldehyd und Betulinsaure sind stammabhängig. Mit der gleichen Genkombination verhalten sich CEN.PK-Stämme anders als AH22-Stämme.
Tabelle 6: Vergleich der Ausbeuten von zyklischen Triterpenen zwischen dem CEN.PK2U und AH22tH3ura8 transformiert mit den Plasmiden pTT1-OEW und pTT2-LjCPR1-B2
Figure imgf000072_0001
Tab.6 (fortgesetzt)
Figure imgf000072_0002
Beispiel 6: Einfluss der HMG-CoA Reduktase
In Tabelle 7 sind die Biotrockensubstanzen und die Lupeolproduktivitäten von CEN.PK1 1 1 -61 A und CEN.PK2U transformiert mit dem Plasmid pTT1-OEW sowie mit der deregulierten HMG-CoA Reduktase dargestellt. Die Stämme wurden wie in Beispiel 3 kultiviert, jedoch mit
unterschiedlichen Hauptkultivierungszeiten (48h, 72h beziehungsweise 93h). Die
Lupeolproduktivität des CEN.PK2U ist höher als von CEN.PK1 1 1-61 A. Dies zeigt, dass die Deregulation der HMG-CoA Reduktase einen positiven Einfluss auf die Produktion von
Triterpenoiden hat.
Tabelle 7: Vergleich der Produktivitäten von CEN.PK1 1 1-61A und CEN.PK2U transformiert mit dem Plasmid pTT1-OEW
Figure imgf000072_0003
Tabelle 8: Vergleich der Produktivitäten zwischen AH22th3ura8 und AH22th3ura8AarelAare2
Figure imgf000072_0004
AH22th3ura8
AarelAare2 GuLUPl - - Kl 10,43 60,96 5,84 11,90 90,37 7,59 11,82 96,74 8,1£
Beispiel 7: Ausbeuten von Lupeol, Betulin, Betulinaldehvd und Betulinsäure nach episomaler Expression verschiedener OSC-, CPR- und CYP-
Gene in verschiedenen Hefestämmen
Tabelle 9: Ausbeute in CEN.PK2U
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
Tabelle 10: Ausbeute in AH22th3ura8
Figure imgf000075_0002
Figure imgf000076_0001
: Konzentration unter der Nachweisgrenze
k.A.: keine Angaben
In Tabellen 9 und 10 sind die Biotrockensubstanzen (BTS) und die gebildeten Konzentrationen der Triterpenoide Lupeol, Betulin, Betulinaldehyd und Betulinsaure nach 72 h Kultivierung in WMVIll Medium dargestellt. Getestet wurde der Einfluss der Expression unterschiedlicher OSC-, CPR- und CYP- Gene in den Stämmen AH22th3ura8, CEN.PK2U und CEN.PK1 1 1-61 A, welche mit den Genen für die CPR- und CYP-Enyzyme auf dem pTT2-Plasmid und/oder mit dem Gen für das OSC-Enzym auf dem pTT1-Plasmid transformiert wurden.
In den Tabellen 1 1 , 12, 13 und 14 sind die bevorzugte Kombinationen von Genen und die jeweiligen Ausbeuten (unabhängig von Hefestamm) der pentazyklischen Triterpenoiden dargestellt.
Tabelle 1 1 : Lupeol Ausbeute
Figure imgf000077_0001
Tabelle 12: Betulin
Figure imgf000077_0002
Tabelle 13: Betulinaldehyd
Figure imgf000078_0001
Tabelle 14: Betulinsaure
Figure imgf000078_0002
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PMC3075788.

Claims

Patentansprüche
1. Modifizierter Hefestamm zur Produktion von pentazyklischen Triterpenoiden, umfassend i. mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Oxidosqualenzyklase, wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number AB05551 1 (SEQ ID No 1 ), AB025343 (SEQ ID No 2), AB663343 (SEQ ID No 3), NMJ 79572 (SEQ ID No 4), AB181245 (SEQ ID No 5), DQ268869 (SEQ ID No 6), AB025345 (SEQ ID No 7), AB1 16228 (SEQ ID No 8), JQ087376 (SEQ ID No 9), HM623871 (SEQ ID No 10), AB289586 (SEQ ID No 1 1 ), AB055512 (SEQ ID No 12) und Nukleinsäuresequenzvarianten mit mindestens 70% Sequenzidentität zu SEQ ID No 1 bis 12,
oder wobei das Gen eine Sequenz umfasst, die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 54 bis 65, oder für eine Aminosäuresequenzvariante mit mindestens 85% Sequenzidentität zu SEQ ID No 54 bis 65, kodiert; und/oder ii. mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450
Reduktase, wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number AB433810 (SEQ ID No 13), X66016 (SEQ ID No 14), X69791 (SEQ ID No 15), XM_003602850 (SEQ ID No 16), NM_001 179172 (SEQ ID No 17), X66017 (SEQ ID No 18), JN594507 (SEQ ID No 19), DQ984181 (SEQ ID No 20), DQ318192 (SEQ ID No 21 ), AF302496 (SEQ ID No 22), AF302497 (SEQ ID No 23), AF302498 (SEQ ID No 24), L07843 (SEQ ID No 25), AF024635 (SEQ ID No 26), AF024634 (SEQ ID No 27), FJ719368 (SEQ ID No 28), FJ719369 (SEQ ID No 29) und Nukleinsäuresequenzvarianten mit mindestens 70% Sequenzidentität zu SEQ ID No 13 bis 29,
oder wobei das Gen eine Sequenz umfasst, die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 66 bis 82, oder für eine Aminosäuresequenzvariante mit mindestens 85% Sequenzidentität zu SEQ ID No 66 bis 82, kodiert; und/oder iii. mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Cytochrom P450
Monooxygenase, wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number AB619802 (SEQ ID No 30), AB619803 (SEQ ID No 31 ), DQ335781 (SEQ ID No 32), JN565975 (SEQ ID No 33), XM_002331391 (SEQ ID No 34), XM_003525274 (SEQ ID No 35), JF803813 (SEQ ID No 36), XM_004139039 (SEQ ID No 37), GU997666 (SEQ ID No 38), JX036032 (SEQ ID No 39), XM_002522891 (SEQ ID No 40), AM457725 (SEQ ID No 41 ), XM_002265988 (SEQ ID No 42), XM_002527956 (SEQ ID No 43), BT147421 (SEQ ID No 44),
XM_003530477 (SEQ ID No 45), BT096613 (SEQ ID No 46), XM_002309021 (SEQ ID No 47), BT051785 (SEQ ID No 48), XM_002513137 (SEQ ID No 49), XM_002264607 (SEQ ID No 50), XM_002324633 (SEQ ID No 51 ), XM_003531801 (SEQ ID No 52), XM_002280933 (SEQ ID No 53) und Nukleinsäuresequenzvarianten mit mindestens 70% Sequenzidentität zu SEQ ID No 30 bis 53,
oder wobei das Gen eine Sequenz umfasst, die für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 83 bis 105, oder für eine Aminosäuresequenzvariante mit mindestens 85% Sequenzidentität zu SEQ ID No 83 bis 105, kodiert.
2. Hefestamm nach Anspruch 1 , wobei der Stamm mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Oxidosqualenzyklase gemäß i. umfasst, und wobei eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450 Reduktase gemäß ii. oder eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Cytochrom P450 IVIonooxygenase gemäß iii. nicht vorhanden sind.
3. Hefestamm nach Anspruch 1 , wobei der Stamm mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Oxidosqualenzyklase gemäß i. und mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Cytochrom P450 IVIonooxygenase gemäß iii. umfasst, und wobei eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450 Reduktase gemäß ii nicht vorhanden ist;
4. Hefestamm nach Anspruch 1 , wobei der Stamm eine Kombination aus mindestens eine
Kopie eines Gens zur Kodierung einer Oxidosqualenzyklase gemäß i., mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer NADPH-Cytochrom P450 Reduktase gemäß ii. und mindestens eine Kopie eines Gens zur Kodierung einer Cytochrom P450 IVIonooxygenase gemäß iii umfasst.
5. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm
mindestens eine intrazelluläre Konzentration eines pentazyklischen Triterpenoids von 1 mg pro Gramm Biotrockensubstanz aufweist.
6. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm
mindestens eine intrazelluläre Konzentration eines pentazyklischen Triterpenoids von 2 mg pro Gramm Biotrockensubstanz aufweist.
7. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm eine intrazelluläre Konzentration an Lupeol von bevorzugt mehr als 5 mg pro Gramm
Biotrockensubstanz aufweist.
8. Hefestamm nach Anspruch 3, wobei der Stamm eine Genkombination gemäß einer der Tabellen 1 1 bis 14 umfasst.
9. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm folgende Kombination umfasst: AB025343 (OEW), XM_003602850 (MTR) und AB619802 (CYP716A15).
10. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm folgende Kombination umfasst: AB025343 (OEW), XM_003602850 (MTR) und AB619803 (CYP716A17).
1 1. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm folgende Kombination umfasst: AB025343 (OEW), XM_003602850 (MTR) und
XM_002331391 (CYP716A9).
12. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm folgende Kombination umfasst: AB025343 (OEW), X69791 (CrCPR) und AB619802 (CYP716A15).
13. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm folgende Kombination umfasst: AB025343 (OEW), X69791 (CrCPR) und XM_003525274 (Cytochrome P450 716B2-like).
14. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm folgende Kombination umfasst: AB025343 (OEW), X69791 (CrCPR) und XM_002331391 (CYP716A9).
15. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm folgende Kombination umfasst: AB025343 (OEW), X69791 (CrCPR) und AB619803 (CYP716A17).
16. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm folgende Kombination umfasst: AB025343 (OEW), AB433810 (LjCPRI ) und AB619802 (CYP716A15).
17. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm folgende Kombination umfasst: AB025343 (OEW), AB433810 (LjCPRI ) und XM_004139039 (cytochrome P450 716B1-like).
18. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm folgende Kombination umfasst: AB025343 (OEW), X66016 (ATR1 ) und JN565975
(CYP716AL1 ).
19. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm eine der folgenden Kombinationen nicht umfasst:
- AB663343 (GuLUPI ), AB433810 (LjCPRI ) und DQ335781 (CYP716A12);
- AB663343 (GuLUPI ), AB433810 (LjCPRI ) und AB619802 (CYP716A15);
- NM_179572 (AtLUPI ), X66016 (ATR1 ) und JN565975 (CYP716AL1 ).
20. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dieser Lupeol produziert.
21. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dieser Betulin produziert.
22. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dieser
Betulinaldehyd produziert.
23. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dieser
Betuli nsäure produziert.
24. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Hefestamm eine tHMG1 Expressionskassette umfasst.
25. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich um Saccharomyces cerevisiae handelt.
26. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm ein Saccharomyces cerevisiae CEN.PK ist.
27. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm ein CEN.PK1 1 1-61A Stamm ist.
28. Hefestamm nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Stamm ein AH22tH3ura8 Stamm ist.
29. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Hefestamms gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung eines Saccharomyces cerevisiae Stamms, b) Transformation mit einem Vektor umfassend ein Gen zur Kodierung einer
Oxidosqualenzyklase, wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number AB05551 1 , AB025343, AB663343, NMJ 79572, AB181245, DQ268869, AB025345, AB1 16228, JQ087376, HM623871 , AB289586, AB055512, c) Transformation eines Vektors umfassend ein Gen zur Kodierung einer NADPH- Cytochrom P450 Reduktase wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number AB433810, X66016, X69791 , XM_003602850, NM_001 179172, X66017, JN594507, DQ984181 , DQ318192, AF302496, AF302497, AF302498, L07843, AF024635, AF024634, FJ719368, FJ719369, und/oder d) Transformation eines Vektors umfassend ein Gen zur Kodierung einer Cytochrom P450 Monooxygenase, wobei das Gen eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren gemäß Accession Number AB619802, AB619803, DQ335781 , JN565975, XM_002331391 , XM_003525274, J F803813, XM_004139039, GU997666, JX036032, XM_002522891 , AM457725, XM_002265988, XM_002527956, BT147421 , XM_003530477, BT096613, XM_002309021 , BT051785, XM_002513137,
XM_002264607. XM_002324633, XM_003531801 , XM_002280933.
30. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, zusätzlich umfassend den Schritt der
Transformation mit einem Vektor umfassend das tHMG1-Gen.
31. Verfahren zur Herstellung von Triterpenen und/oder Triterpenoiden, wobei ein modifizierter Hefestamm gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 28 für die Produktion verwendet werden.
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