JP7455755B2 - オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの生成量を増大させる方法、並びにそのための宿主細胞 - Google Patents
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの生成量を増大させる方法、並びにそのための宿主細胞 Download PDFInfo
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Description
配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有するタンパク質であってメバロン酸を生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、
及び、
配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、アセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させることを含む。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させることを含む。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
少なくとも1つのオキシドスクアレン、好ましくは2,3-オキシドスクアレンを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
少なくとも1つのオキシドスクアレン、好ましくは2,3-オキシドスクアレンを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、少なくとも1つのオキシドスクアレン、好ましくは2,3-オキシドスクアレンを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、少なくとも1つのオキシドスクアレン、好ましくは2,3-オキシドスクアレンの生成量を増大させることを含むということを意味する。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
2,3-オキシドスクアレンを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
2,3-オキシドスクアレンを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、2,3-オキシドスクアレンを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、2,3-オキシドスクアレンの生成量を増大させることを含むということを意味する。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
ルペオールを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
ルペオールを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、ルペオールを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、ルペオールの生成量を増大させることを含む。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
スクアレン、ラノステロール、及び/又はエルゴステロールの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
スクアレン、ラノステロール、及び/又はエルゴステロールの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、スクアレン、ラノステロール、及び/又はエルゴステロールの少なくとも1つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、スクアレン、ラノステロール、及び/又はエルゴステロールの少なくとも1つの生成量を増大させることを含むことを意味する。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させることを含み、
該オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つは、グリチルレチン酸(glycyrrhetinic acid)ではない。グリチルレチン酸は、グリチルレチン酸(glycyrrhetic acid)及びエノキソロンとしても知られ、グリチルリチン酸の加水分解から得られるβ-アミリンタイプの5員環トリテルペノイド誘導体である。
配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させることを含む。
MVLTNKTVISGSKVKSLSSAQSSSSGPSSSSEEDDSRDIESLDKKIRPLEELEALLSSGNTKQLKNKEVAALVIHGKLPLYALEKKLGDTTRAVAVRRKALSILAEAPVLASDRLPYKNYDYDRVFGACCENVIGYMPLPVGVIGPLVIDGTSYHIPMATTEGCLVASAMRGCKAINAGGGATTVLTKDGMTRGPVVRFPTLKRSGACKIWLDSEEGQNAIKKAFNSTSRFARLQHIQTCLAGDLLFMRFRTTTGDAMGMNMISKGVEYSLKQMVEEYGWEDMEVVSVSGNYCTDKKPAAINWIEGRGKSVVAEATIPGDVVRKVLKSDVSALVELNIAKNLVGSAMAGSVGGFNAHAANLVTAVFLALGQDPAQNVESSNCITLMKEVDGDLRISVSMPSIEVGTIGGGTVLEPQGAMLDLLGVRGPHATAPGTNARQLARIVACAVLAGELSLCAALAAGHLVQSHMTHNRKPAEPTKPNNLDATDINRLKDGSVTCIKS
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はさらに100%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させることを含む。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はさらに100%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させることを含むことを意味する。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示される3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素のアミノ酸配列と少なくとも44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はさらに100%の配列同一性を有するタンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はさらに100%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させることを含む。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
ROX1(配列番号25)座位をノックアウトするように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させることを含む。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
ROX1(配列番号25)座位をノックアウトするように、宿主細胞を改変すること、
スクアレン、ラノステロール、及び/又はエルゴステロールの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
スクアレン、ラノステロール、及び/又はエルゴステロールの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、スクアレン、ラノステロール、及び/又はエルゴステロールの少なくとも1つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、スクアレン、ラノステロール、又はエルゴステロールの少なくとも1つの生成量を増大させることを含む。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
ROX1(配列番号25)座位をノックアウトするように、宿主細胞を改変すること、
及び、
タンパク質がラノステロールを生成可能であるという条件で、配列番号9に示すアミノ酸配列を有する、又は配列番号9と少なくとも34%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させることを含む。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
ROX1(配列番号25)座位をノックアウトするように、宿主細胞を改変すること、
及び、
タンパク質がラノステロールを生成可能であるという条件で、配列番号9に示すアミノ酸配列を有する、又は配列番号9と少なくとも34%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制するように、宿主細胞を改変すること、
2,3-オキシドスクアレンを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
2,3-オキシドスクアレンを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、2,3-オキシドスクアレンを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、2,3-オキシドスクアレンの生成量を増大させることを含むということを意味する。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、植物を改変すること、
並びに、適切な条件下でそれぞれの植物抽出からオキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを精製することで、
改変前の植物と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させることを含む。
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号1に示すアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル-CoA、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA、メバロナート-5-ホスフェート、メバロナート-5-ピロホスフェート、イソペンテニル-5-ピロホスフェート、ファルネシル-ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル-ピロホスフェートの少なくとも1つを生成可能であるという条件で、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号2、3、4、5、6、7、及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも44%の配列同一性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
ROX1(配列番号25)座位をノックアウトするように、宿主細胞を改変すること、
及び、
タンパク質がラノステロールを生成可能であるという条件で、配列番号9に示すアミノ酸配列を有する、又は配列番号9と少なくとも34%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
T.koksaghyzルペオール合成酵素TkLUP(配列番号12)を発現するように、宿主細胞を改変すること、
ルペオールを生成する少なくとも1つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
ルペオールを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、ルペオールを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、ルペオールの生成量を増大させることを含むことを意味する。
実施例1:コンストラクトのクローニング
pAG424Gal-TkLUPを生成するため、TkLUP(配列番号12)(GenBank MG646375)のコード配列を、fw-プライマー5´-AAA (GTC GAC) TAA AAA AAT GTG GAA GCT GAA AAT AGC-3´(配列番号23)及びbw-プライマー5´-AAA (CTC GAG) ATA TAT TTT GAA CAA TAC GA-3´(配列番号24)とともにT. koksaghyzcDNAでPCR増幅し、精製、消化、並びにpENTR3c(Invitrogen, カールスバッド、米国)にライゲーションした。その後、TkLUPコード配列(配列番号12)を組み換えによってpAG424Gal1-ccdB(Alberti et al. 2007; Addgene,ケンブリッジ、米国)に導入した。
S. cerevisiae株CEN-PK2-1Cを、選択マーカーとしてウラシル(pCFB255_rox1_KlUra3_tHMGR/ERG13, 配列番号11)、ロイシン(pCFB255_ERG7-P_KlLeu2_CTR3-P_ERG7, 配列番号10)、及びトリプトファン(pAG424Gal-TkLup)を用いて酢酸リチウム法(Gietz 2007)によって形質転換した。安定して酵母ゲノムに組み込むため、pCFB255_rox1_KlUra3_tHMGR/ERG13(配列番号11)及びpCFB255_ERG7-P_KlLeu2_CTR3-P_ERG7(配列番号10)をNotI消化してプラスミドのバックボーンを除去した。細胞を最小合成培地(SD培地, Clontech, マウンテンビュー、米国)にプレーティングし、30℃で増殖させた。必要な場合組込みコンストラクトの両側のプライマーを用いてコロニーPCRによって、クローンを健常性について確認した。
酵母代謝物の抽出は、Rodriguez等(2014)のプロトコルに従って行った。手短に説明すると、凍結乾燥酵母細胞は、メタノール中の1mLの6%[w/v]KOH(Roth,カールスルーエ、独国)及び100μgのコレステロール(内部標準物質として、Sigma, セントルイス、米国)を各サンプルに添加後、80℃の温浴で5分間インキュベートした。メタノール混合物から代謝物を抽出するため、2mlのn-ヘキサン(Roth, カールスルーエ、独国)を3段階で、ボルテックス後に添加した。上部相を新しいバイアルに移し、n-ヘキサンを蒸発させて除去した。その後、サンプルを1mLのアセトン(Roth, カールスルーエ、独国)に再溶解し、GC-MSを行った。GC-MS分析を、30m Rtx-5MSカラムを備えたGC-MS-QP 2010 Ultra(Shimadzu, デュースブルク、独国)で行い、温度グラジエント(120-330°C; 21°C per min; 圧力: 58,8 kPa)を、120℃で1分の保持時間、その後330℃で10分間の保持時間後に用いた。イオン質量43m/z、55m/z、69m/z、95m/z、109m/z及び189m/z、204m/z、207m/z、218m/z、271m/z、285m/z、411m/zによって分子を検出した。それぞれLabSolutionソフトウエア(Shimadzu, デュースブルク、独国)及びNISTライブラリによって、ピーク積分及び同定を行った。検出した物質のトータルイオンカレント(TIC)を、内部標準物質に由来するコレステロール及び使用したサンプルの乾燥重量に対してノーマライズした。2つのサンプルのt検定をp<0.05で用いて、結果の統計的有意性を確認した。
提示した酵母システムのモデル酵素として、ゴム産生タンポポTaraxacum koksaghyz由来のルペオール合成酵素を選んだ(図6参照)。T. officinaleのルペオール合成酵素であるTRXの増幅に用いるプライマーにより(Shibuya et al., 1999)、759アミノ酸をコードする(配列番号12)T. koksaghyz(GenBank受託番号MG646375)のcDNAの2277bpのORFを増幅することができた。この配列は、記載のルペオール合成酵素と99.3%のアミノ酸配列類似性を有するので、SalI/XhoI制限部位を介してpENTR3cにクローニングした。CEN.PK2-1C酵母株(WT)にて発現させるため、アドバンスドゲートウェイデスティネーションベクターシステム(pAG-ベクターシステム)を用い、得られた配列を、GAL1プロモーターの制御下での発現を可能にするpAG424GAL1-ccdBに組み換えた。コンストラクトの概略図を図6aに示す。空のべクターpAG424GAL1-ccdBは、発現実験においてベクターコントロールとした。培養及びトリテルペン抽出後、2つのさらなるm/z218フラグメントが、推定ルペオール合成酵素配列(配列番号12)を有する3つの個別の形質転換体からの抽出物のGC-MS測定において同定できた(図6b参照)。これらのピークは、WTでもベクターコントロールサンプルでも同定できなかった。検出フラグメントの保持時間がβ-アミリン及びルペオール標準物質において測定される保持時間に適合するので(Extrasynthese, ジュネ,仏国;図1b)、得られたフラグメントは、微量の定量不可能な量のβ-アミリンの蓄積、及び0.16mg/gCDWのルペオールの蓄積を示すと推測した(図6c)。配列相同性と、おそらくルペオールを示す主要な同定ピークとにより、得らえた配列は、TkLUPという名称のT. koksaghyzからのルペオール合成酵素(配列番号12)をコードすると結論付けた。
酵母における推定ルペオールの生成をさらに高めるため、以前に異種酵母システムにおいてイソプレノイド生成量を高めることを示した酵母メバロナート経路遺伝子を過剰発現させることにした(Kirby et al., 2008; Asadollahi et al., 2010; Paddon et al., 2013)。HMG1は経路の重要な酵素であり、フィードバック機構による厳密な制御の基盤となるので、ユビキチン化信号欠如のためフィードバック機構の基盤とならないトランケート形態(tHMGRと呼ぶ)(配列番号32)を過剰発現させた(DeBose-Boyd, 2008)。一方で、イソプレノイド生合成に正の効果を有することも示されているERG13(配列番号14)を過剰発現させることを選択した(Yuan et al.,2014)。さらに経路をディレギュレート/アップレギュレートするため、発明者らは、メバロナート経路及び後期ステロール生合成の負の調節因子として記載されるROX1(配列番号25)をノックアウトすることを考え(Henry et al., 2002; Montanes et al., 2011; Ozaydin et al., 2013; Jakociunas et al., 2015)、後期ステロール生合成を高めることによるスクアレンのダウングレード向上に関して、メバロナート経路自体をディレギュレートすることによってメバロナート経路における流れを高めることを狙いとした。これらの段階を組み合わせるため、双方向性GAL1/GAL10プロモーターの制御下でtHMGR(配列番号32)及びERG13(配列番号14)を発現させることを選択し、過剰発現カセットをrox1(配列番号25)座位に組み込んで、ノックアウトさせた。したがって、NotI消化pCFB255_rox1_KlUra3_tHMGR/ERG13(配列番号11)からもたらされるフラグメントで、CEN.PK2-1C酵母細胞を形質転換した(図7a)。予期されるように、組込み遺伝子の発現及びrox1(配列番号25)のノックアウト後、TkLUP配列(配列番号12)のみを有する細胞と比較して、コンストラクト及びTkLUP配列(配列番号12)を有する酵母において、スクアレンの有意な8.2倍の蓄積向上を検出できた(図7b)。さらに、指定したルペオールの蓄積において、16.5倍の増加が見受けられ(図7b)、ラノステロール含有量の3.6倍の増加を観察できた(以下の表1参照)。
必須の後期ステロール生合成におけるノックアウトは、致死性酵母株をもたらし、ERG1の過剰発現は、5員環トリテルペン生成において2,3-オキシドスクアレン蓄積を高めるのに十分ではないので、発明者らは、2,3-オキシドスクアレン合成のボトルネックを克服するためERG7(配列番号20)を抑制して、後期ステロール生合成からルペオール生成への代謝の流れを変更した。ゆえに、内在性ERG7コード配列(配列番号20)の前に銅輸送体の735bpプロモーターフラグメント(CTR3)(配列番号42)を挿入し、同段階において、内在性コアプロモーターの196bpフラグメントを欠失させることを選択した(図8a)。挿入したCTR3プロモーターフラグメント(配列番号42)では、2つのシスエレメント(TTTGCTC, 銅応答エレメント、略語はCuRE)がCuSO4の存在下において遺伝子発現低下の原因となることが示された(Labbe et al., 1997)。さらに、CTR3プロモーターフラグメント(配列番号42)は、アルテミシニン生成を高めるためERG9(配列番号49)を抑制するように適切に使用して、この工業プロセスにおいてコストを下げ、著述者らの以前の研究に使用されたMET3プロモーター(配列番号50)との同等性を示した(Paddon et al., 2013)。
UV検出器(SPD-M20A)及びフラクションコレクター(FRC-10A)に接続されたShimadzu LC20A HPLCシステム(Shimadzu, デュースブルク、独国)を用いてセミ分取HPLCを行った。UltraC18カラム(250 x 21.2 mm, 粒径: 5 μm, Restek GmbH, バート・ホムブルク、独国)及び10ml/minの流量で溶媒としてメタノールを使用して、トリテルペンを分離した。カラムオーブン温度を40℃に設定した。205nmで検出を行い、トリテルペンフラクションを収集し、Rocketエバポレーターシステム(Thermo Fisher Scientific)を使用して乾燥させ、アセトンに溶解して、GC-MSによって分析した。第2の固定相として、Ultraビフェニルカラムを使用した(250 x 21.2 mm, 粒径:5 μm, Restek GmbH, バート・ホムブルク、独国)。カラムオーブン温度を40℃に設定し、トリテルペンを、以下の溶出プロファイルを用いて、8ml/minの流量でメタノール(A)及び水(B)のグラジエントにおいて分離した:0~25分、アイソクラティック90% A;25~71分、リニア90%~100% A;71~75分、アイソクラティック100% A;その後カラム再平衡化:75~76分、リニア100%~90% A;76~85分、アイソクラティック90% A。
トリテルペンを、上述のようにCG-MSによって定量及び同定した(Putter et al., 2017)。
主要な成分ポリ(cis-1,4-イソプレン)を除いて、天然ゴムは、ポリマーの物性に影響を与えるタンパク質、脂肪酸、及びトリテルペンといったさらなる物質を含む(Xu et al., 2017)。NR特性に関与する単一のトリテルペンの詳しい全体像を得るため、溶媒としてアセトンを用いてT. koksaghyz NRから脂質フラクションを抽出した。アセトン抽出物をHPLCによってC18カラムで分離し、205nmでUV検出を使用して7つの主要なフラクションを観察することができた(図12a)。これらを収集して、その後GC-MSによって分析した。7つのフラクションのうち3つにおいて、フラクションF1のルペオール(lup-20(29)-en-3-ol)、F4のタラキサステロール及びβ-アミリン、並びにF6のα-アミリンを含む、Taraxacum種の根に非常に豊富であると記載される(Post et al. 2012)種々の5員環トリテルペンを検出できた。アルコールに加え、これらの4つの5員環トリテルペンのケトン誘導体、すなわちF2のルペノン(lup-20(29)-en-3-one)、F5のタラキサステロン及びβ-アミロン、並びにF7のα-アミロンも3つのフラクションで同定された。さらに、2つのフラクション(F3及びF5)において、Taraxacum種の根材に存在するとして以前に記載されている2つのステロール化合物、スチグマステロール及びシトステロールを検出した(Post et al. 2012)。
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Claims (11)
- 宿主酵母細胞においてオキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させる方法であって、前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つは、2,3-オキシドスクアレン又はルペオールであり、
‐配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現するように、
及び、
配列番号3のアミノ酸配列を含むタンパク質を過剰発現するように、前記宿主酵母細胞を改変し、さらにROX1(配列番号25)の座位をノックアウトするように前記宿主酵母細胞を改変し、さらに配列番号9に示すアミノ酸配列を含むラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制するように、前記宿主酵母細胞を改変すること、
‐前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを生成する少なくとも1つの異種タンパク質であるルペオール合成酵素又はオキシドスクアレン環化酵素(OSC)を発現するように、前記宿主酵母細胞を改変すること、
‐前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを発現するように、適切な条件下で前記宿主酵母細胞を培養すること、
‐並びに、前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを精製することで、
改変前の前記宿主酵母細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの生成量を増大させることを含む、方法。 - 前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの前記精製は、少なくとも2つのクロマトグラフィーステップによって行われる、請求項1に記載の方法。
- 2つ以上のオキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの前記生成量を増大する、請求項1又は2に記載の方法。
- オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを製造するための組換え宿主酵母細胞であって、前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つは、2,3-オキシドスクアレン又はルペオールであり、
前記宿主酵母細胞は、配列番号1に示すアミノ酸配列を含む3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素を過剰発現するように、並びに、配列番号3のアミノ酸配列を含むタンパク質を過剰発現するように改変され、さらに配列番号9に示すアミノ酸配列を有するラノステロール合成酵素を抑制するように改変され、さらにROX1(配列番号25)の座位をノックアウトするように改変された、宿主酵母細胞。 - 前記宿主酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Nicotiana benthamiana、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Pichia stipitis、Candida albicans、Candida utilis、及びBY2細胞からなる群より選択される、請求項4に記載の宿主酵母細胞。
- オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つを製造するための、請求項4又は5に記載の宿主酵母細胞の使用。
- CTR3-プロモーターの挿入及び/又は硫酸銅CuSO4の添加によって、配列番号9に示すアミノ酸配列を含むラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制するように、前記宿主酵母細胞をさらに改変することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記硫酸銅の添加量は、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、又は375mMのCuSO4である、請求項7に記載の方法。
- 前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つの前記精製は、第1のクロマトグラフィーステップにC18カラムを使用し、第2のクロマトグラフィーステップにビフェニルカラムを使用することによる、少なくとも2つのクロマトグラフィーステップによって行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記宿主酵母細胞は、CTR3-プロモーターの挿入及び/又は硫酸銅CuSO4の添加によって、配列番号9に示すアミノ酸配列を有するラノステロール合成酵素を抑制するように、さらに改変された、請求項4に記載の宿主酵母細胞。
- 前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び/又はトリテルペノイドの少なくとも1つは、ルペオールである、請求項4に記載の宿主酵母細胞。
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