ES2954210T3

ES2954210T3 - Producción de esteroles en levadura modificada

Info

Publication number: ES2954210T3
Application number: ES16826311T
Authority: ES
Inventors: Hans-Peter Hohmann; Regina Leber; Martin Lehmann; Corinna Odar; Barbara Petschacher; Harald Pichler; Birgit Ploier
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2023-11-20
Anticipated expiration: 2036-12-20
Also published as: EP3394282B1; US11466303B2; EP3394282A1; CN109154015A; US20210180103A1; WO2017108799A1; CN109154015B

Abstract

La presente invención está relacionada con la producción de una mezcla de esteroles en una célula de levadura modificada, en la que la cantidad de zimosterol presente en dicha mezcla se reduce o elimina drásticamente mediante la modificación de la actividad de esterol aciltransferasa dentro de dicha levadura. La célula de levadura modificada se puede utilizar para la producción de vitamina D3 o derivados y/o metabolitos de la misma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de esteróles en levadura modificada

La presente invención está relacionada con la producción de una mezcla de esteroles en una célula de levadura modificada, en donde la cantidad de zimosterol presente en dicha mezcla se reduce o suprime espectacularmente por modificación de la actividad de la esterol aciltransferasa dentro de dicha levadura. La célula de levadura modificada se puede usar para la producción de vitamina D3 o derivados y/o metabolitos de la misma.

La vitamina D3 (también conocida como colecalciferol o calciol) se puede sintetizar en la piel de los mamíferos a partir de la provitamina D3 (también conocida como 7-deshidrocolesterol o 7-DHC) que es un producto de la biosíntesis del colesterol tras la exposición a luz UV, por la cual la 7-DHC se convierte fotoquímicamente en la provitamina D3, que isomeriza a temperatura corporal dando la forma biológicamente activa de la vitamina D3. En el hígado, la vitamina D3 se convierte en la 25-hidroxivitamina D3 biológicamente inactiva (también conocida como calcidiol, calcifediol, 25-hidroxicolecalciferol, 25-OH-D3 o HyD), que es la principal forma circulante de la vitamina D3. La hidroxilación posterior ocurre en el riñón.

Para la producción industrial de vitamina D3, está disponible (en principio) tanto la síntesis química como biotecnológica. La síntesis química empieza con el colesterol aislado de, por ejemplo, grasa de la lana que es deshidrogenada en 7-DHC, seguido por exposición a luz UV y etapas posteriores de purificación/extracción que conducen a la vitamina D3. Alternativamente, se pueden usar cepas de levadura modificada para producir precursores de vitamina D3, que se pueden aislar y convertir posteriormente en la vitamina D3. Cantidades excesivas de esteroles, tales como los precursores de la vitamina D3, que incluyen 7-DHC, se almacenan en orgánulos intracelulares (las denominadas gotitas lipídicas) de los que se pueden aislar posteriormente. El equilibrio entre los esteroles libres, que incluye los precursores de la vitamina D3, y los almacenados en las gotitas lipídicas (en forma de esterol o ésteres esterílicos) es activado por la acción de varias proteínas, en particular enzimas, que incluyen esterol aciltransferasas. No fueron satisfactorios los intentos por construir mutantes desactivados de la isoforma Are2 de esterol aciltransferasa con o sin desactivación de la isoforma Are1 de esterol aciltransferasa para aumentar el nivel de 7-DHC en una mezcla de esteroles (Ploier: Engineering of Sterol Synthesis in Yeast, doctorado, 2010).

Normalmente, la levadura u otras células fúngicas no son adecuadas para la producción de vitamina D3 como tal: en primer lugar, a partir de acetil CoA, el principal esterol natural producido por levaduras y otros hongos es el ergosterol en lugar del colesterol. Este cuello de botella se ha evitado mediante la introducción de una desactivación doble en los genes que codifican ERG5 y ERG6, que conduce hacia la producción de colesta-5,7,24(25)-trienol y zimosterol en una cantidad más o menos equivalente y solo producción mínima de ergosterol por dicha cepa con desactivación doble de erg5erg6.

Se conocen células de levadura productoras de colesterol que producen tanto colesta-5-7-24-trienol como esterol dominante (Cleton M Souza et al., Metabolic Engineering Academic Press, vol.13, no. 5, pp. 555-569, 2011), así como cepas de P. pastoris capaces de 7-DHC, además de zimosterol (Hirz et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Springer, vol 97, no. 21, pp. 9465-9478, 2013).

Esto, sin embargo, conduce a un cuello de botella adicional: solo se puede usar el colesta-5,7,24(25)-trienol y no el zimosterol como precursor de la vitamina D3. El trienol es el precursor directo del 7-DHC, que se puede usar para la producción de vitamina D3. La acumulación de otros productos intermedios de la vía del esterol como el zimosterol no es útil para dicho proceso de producción y tendrá un impacto negativo sobre el proceso de producción de muchas maneras (rendimiento, procesamiento aguas abajo, etc.).

Por lo tanto, es una tarea en curso generar células hospedadoras, tales como células de levadura, adecuadas para la producción de precursores de la vitamina D3, es decir, células hospedadoras productoras de colesta-5,7,24(25)-trienol, en donde el equilibrio entre el colesta-5,7,24(25)-trienol y el zimosterol está desplazado hacia el colesta-5,7,24(25)-trienol, que se espera que también conduzca a un aumento en la cantidad de precursores de la vitamina D3, tales como 7-DHC producido por dichas cepas de levadura que se convierte posteriormente en vitamina D3 y/o derivados o metabolitos de la misma. Un metabolito particular que también es el centro de la presente invención es la 25-hidroxivitamina D3.

Sorprendentemente, los presentes inventores descubrieron ahora que la composición de esteroles totales dentro de una célula de levadura productora de colesterol puede cambiarse espectacularmente, es decir, la relación de producto puede desplazarse hacia el colesta-5,7,24(25)-trienol y/o 7-DHC en lugar del zimosterol a almacenar en las gotitas lipídicas disminuyendo o suprimiendo la actividad de ciertas esterol aciltransferasas presentes en dichas cepas de levadura, y opcionalmente introduciendo esterol-O-aciltransferasas (HAT) heterólogas en dicha célula de levadura.

En particular, se ha descubierto que la disminución o la supresión de la actividad de la isoforma Are2p de esterol aciltransferasa en una levadura productora de colesterol podría casi anular la cantidad de zimosterol (basándose en las cantidades totales de zimosterol) hacia un fuerte aumento de colesta-5,7,24(25)-trienol como compuestos de esterol presentes en las gotitas lipídicas. Tras la manipulación posterior, dichas cepas se podrían usar para la producción de precursores de la vitamina D3, por ejemplo, 7-DHC.

Por lo tanto, la presente invención está relacionada con un proceso para la producción de una mezcla de esteroles que comprende al menos 87 % de 7-deshidrocolesterol (7-DHC) en una célula de levadura en la que ERG5 y ERG6 están inactivados y que lleva una modificación en el gen ARE2 de forma que la actividad de ARE2 endógena se reduzca o suprima, preferentemente suprima, y en donde una enzima EC 1.3.1.72 de planta o vertebrado que tiene actividad de esterol A24-reductasa sobre latosterol, zimosterol o trienol se expresa de forma heteróloga, siendo dicha célula de levadura capaz o usada para la producción de una mezcla de esteroles que comprende colesta-5,7,24(25)-trienol y zimosterol, en donde el porcentaje de zimosterol dentro de dicha mezcla es aproximadamente del 10 % o menos basado en la cantidad total de esteroles producidos por dicha levadura y en comparación con una célula de levadura con actividad de ARE2, por ejemplo, en donde la ARE2 endógena es activa. Cuando se produce una mezcla de esteroles usando dicha célula de levadura, el porcentaje de colesta-5,7,24-trienol se puede aumentar a aproximadamente el 87, 90, 95 % o más basado en la cantidad total de esteroles. Por lo tanto, la relación entre colesta-5,7,24-trienol y zimosterol producida por dicha levadura está en el intervalo de aproximadamente >7 a aproximadamente <1 basado en la cantidad total de esteroles. Esta relación está incluso más desplazada hacia el colesta-5,7,24-trienol cuando se usa una célula de levadura en la que ERG5 y ERG6 están inactivados y tanto la actividad de ARE1 como de ARE2, por ejemplo, la actividad de tanto ARE1 como ARE2 endógenas, se reduce o suprime, preferentemente suprime. En dicha célula de levadura, la relación podría estar en el intervalo de aproximadamente >8 a aproximadamente <10, incluso en el intervalo de aproximadamente >8 a aproximadamente 2 basado en la cantidad total de esteroles. Cuando se compara con una célula de levadura con actividad de ARE1 y/o ARE2, por ejemplo, en donde ARE1 y ARE2 endógenas son todavía activas, el porcentaje de zimosterol disminuye en aproximadamente 4 veces mediante la inactivación de ARE2. Esto es incluso mayor en una cepa en donde tanto ARE2 y ARE1 son inactivas, por ejemplo, en donde ARE2 y ARE1 endógenas son inactivas, es decir, el porcentaje se reduce en aproximadamente 20 veces en comparación con una célula de levadura con actividad de ARE1 y/o ARE2, por ejemplo, en donde ARE1 y ARE2 endógenas son todavía activas.

Por lo tanto, en comparación con una célula de levadura productora de colesterol en donde ERG5 y ERG6 están inactivados, pero en donde ARE1 y ARE2 están todavía activas, la cantidad de colesta-5,7,24-trienol se puede aumentar en aproximadamente 2 veces (en una célula de levadura con actividad de ARE1 y ARE2 reducida o suprimida, preferentemente suprimida, por ejemplo, en una célula de levadura en donde tanto la actividad de ARE1 como de ARE2 endógenas se reducen o suprimen, preferentemente suprimen).

El proceso según la presente invención que comprende el cultivo de células de levadura como se describe en el presente documento se podría usar en un proceso para la producción de precursores de vitamina D3, tales como, por ejemplo, 7-DHC. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un proceso que comprende el cultivo de una célula de levadura, en la que ERG5 y ERG6 están inactivados, en donde la levadura expresa una enzima heteróloga seleccionada de EC 1.3.1.72, en particular una enzima heteróloga que tiene actividad de esterol A24-reductasa, preferentemente una enzima de vertebrado, y en donde la actividad de ARE2 se reduce o suprime, preferentemente suprime, por ejemplo, la actividad de ARE2 endógena se reduce o suprime, preferentemente suprime, siendo dicha levadura capaz de o usada para la producción de una mezcla de esteroles que comprende 7-DHC y zimosterol, en donde el porcentaje de zimosterol dentro de dicha mezcla está en el intervalo de aproximadamente el 2 o 3 % o menos. Usando dicho proceso que incluye dicha cepa de levadura, el porcentaje de 7-DHC presente en dicha mezcla está en el intervalo de aproximadamente el 87 % o más, preferentemente tal como el 88, 90, 95, 98 % basado en la cantidad total de esteroles. En una realización particular, el proceso según la presente invención comprende el cultivo de una célula de levadura que se modifica posteriormente de forma que la actividad de ARE2 y ARE1 sea tanto reducida como suprimida, preferentemente suprimida, por ejemplo, la actividad de ARE2 y ARE1 endógena es tanto reducida como suprimida, preferentemente suprimida, que conducirá a un aumento adicional en el porcentaje de 7-DHC, es decir, en el intervalo de aproximadamente el 90 % o más basado en la cantidad total de esteroles. Cuando se compara con un proceso de cultivo de una célula de levadura que tiene actividad de ARE2 y ARE1, por ejemplo, en donde ARE2 y ARE1 endógenas todavía son ambas activas, el porcentaje de zimosterol se reduce en aproximadamente 15 veces mediante la inactivación de ARE2 e incluso más en comparación con una reducción o supresión de tanto ARE1 como ARE2.

En una realización particular, la invención se refiere a un proceso para la producción de una mezcla de esteroles según la presente invención en donde se usa una de las células de levadura que se ha descrito antes y en donde se reduce el porcentaje de zimosterol presente en dicha mezcla de esteroles, es decir, está en el intervalo de aproximadamente el 10 % o menos basado en la cantidad total de esteroles. Las células de levadura usadas para dicho proceso se caracterizan por la inactivación de ERG5 y ERG6 y con actividad de ARE2 suprimida o reducida, por ejemplo, actividad suprimida o reducida de ARE2 endógena, preferentemente actividad suprimida. En una realización particular, dicha célula de levadura expresa una enzima heteróloga seleccionada de EC 1.3.1.72, tal como una C24-reductasa heteróloga que es activa sobre latosterol, zimosterol o trienol, en particular una esterol A24-reductasa de planta o vertebrado y/o comprende además modificación, es decir, actividad de ARE1 suprimida o reducida, por ejemplo, actividad de ARE1 endógena suprimida o reducida, preferentemente actividad suprimida.

Si una de las células de levadura que se describe en el presente documento se usa para la producción de precursores de la vitamina D3 que comprenden 7-DHC según la presente invención, una C24-reductasa heteróloga que es activa sobre latosterol, zimosterol, o trienol, en particular una esterol A24-reductasa de planta o vertebrado, preferentemente una esterol A24-reductasa de vertebrado, se expresa de forma heteróloga en dicha célula.

En caso de la producción hacia 7-DHC, que se va a mejorar en una célula de levadura, una célula de levadura en la que ERG5 y ERG6 están inactivos se modifica posteriormente mediante (1) reducción o supresión, preferentemente supresión, de ARE2 o ARE2 y ARE1, y (2) expresión de una C24-reductasa heteróloga de planta o vertebrado que es activa sobre latosterol, zimosterol o trienol, en particular una esterol A24-reductasa de planta o vertebrado, preferentemente esterol A24-reductasa de vertebrado, en donde la célula de levadura mejora de forma que el porcentaje de 7-DHC en la cantidad total de esterol producido por dicha levadura aumente desde aproximadamente el 45 % hasta al menos aproximadamente el 87 % o más, preferentemente tal como el 88, 90, 95, 98 %.

Como se usa en el presente documento, una cepa de levadura productora de colesterol ya no puede producir ergosterol, sino productos de colesterol, que incluyen, pero no se limitan a, colesta-5,7,24(25)-trienol, colesta-5,8,24(25)-trienol, colesta-7,24(25)-dienol, 7-DHC o zimosterol. En particular, esto se logra por la introducción de la desactivación doble erg5erg6. Además, preferentemente por la expresión de una C-24 reductasa heteróloga que es activa sobre latosterol, zimosterol o trienol (por ejemplo, colesta-5,7,25-trienol), en particular una esterol A24-reductasa de planta o vertebrado en dicho acervo, se potencia la producción de 7-DHC (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 2003064650).

Los términos "ARE1" y "Are1 p", "ARE2" y "Are2p", "ERG5" y "Erg5p", "ERG6" y "Erg6p" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren al polipéptido codificado por los genes respectivos are1, are2, erg5 y erg6. Con el fin de la presente invención, la célula de levadura productora de colesterol se modifica de forma que muestre actividad reducida o suprimida de ARE2 o tanto ARE2 como ARE1, por ejemplo, o lleve una modificación en cualquier ARE2 endógena o tanto ARE2 como ARE1 endógena, que conduce a actividad reducida o suprimida de ARE2 o ARE2 y ARE1.

El término "actividad de ARE", tal como, por ejemplo, "actividad de ARE2 y/o ARE1" significa actividad catalítica hacia la conversión de acil-CoA y colesterol (como sustratos) en CoA y éster de colesterilo (como productos). Tanto ARE2 como ARE1 pertenecen a EC 2.3.1.26, es decir, aciltransferasas que transfieren grupos acilo grasos de una molécula a otra. Dicha transferencia o actividad enzimática se puede medir por medios conocidos por el experto. Las aciltransferasas han sido aisladas de diferentes orígenes, que incluyen mamíferos, levadura o plantas.

Como se usa en el presente documento, la actividad de ARE2 o ARE1 y ARE2 se reduce o suprime. Esto se podría lograr, por ejemplo, introduciendo una mutación en el gen endógeno que codifica ARE1 o ARE2. El experto sabe cómo manipular genéticamente una célula de levadura dando como resultado la reducción o supresión de la actividad de ARE1 y/o ARE2. Estas manipulaciones genéticas incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, sustitución génica, amplificación génica, alteración génica, transfección, transformación usando plásmidos, virus u otros vectores.

La generación de una mutación en ácidos nucleicos o aminoácidos, es decir, mutagénesis, se puede realizar en diferentes formas, tales como, por ejemplo, por mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio, daño físico causado por agentes, tales como, por ejemplo, radiación, tratamiento químico o inserción de un elemento genético. El experto sabe cómo introducir mutaciones.

Las modificaciones para tener la célula de levadura producen menos copias o ninguna de los genes y/o proteínas ARE1 o ARE2, es decir, para tener menos o ninguna actividad de ARE1 o ARE2, puede incluir el uso de un promotor débil, o la mutación (por ejemplo, inserción, deleción o mutación puntual) de (partes o) las ARE2 y/o ARE1 (como se describe en el presente documento), en particular sus elementos reguladores. Un ejemplo de dicha manipulación genética podría afectar, por ejemplo, a la interacción con ADN que está mediada por la región aminoterminal de ARE1 o ARE2 o interacción con otras moléculas efectoras. En particular, las modificaciones que conducen a actividad específica de ARE2 o ARE2 reducida o suprimida se pueden llevar a cabo en las partes funcionales, tal como en las partes funcionales para la actividad catalítica, de las proteínas. Además, la reducción o supresión de la actividad específica de ARE1 o ARE2 se podría lograr poniendo en contacto ARE1 o ARE2 con inhibidores específicos u otras sustancias que interactúan específicamente con ARE1 o ARE2. Para identificar dichos inhibidores, las proteínas ARE1 o ARE2 se pueden expresar y probar para su actividad en presencia de compuestos que se sospecha que inhiben su actividad.

Según la presente invención, se reduce la actividad de ARE1 o ARE2. En particular, una célula de levadura como se describe en el presente documento lleva una ARE1 y ARE2 (endógena), en donde la actividad de ARE2 o de ARE2 y ARE1 se reducen en particular en al menos el 20 %, preferentemente en al menos el 50, 60, 70, 80, 90 %. Lo más preferentemente, como se describe en el presente documento, la actividad se reduce el 100 %, es decir, se reduce hasta actividad cero, es decir, se suprime. Esto se podría aplicar a la actividad de ARE2 solo o a tanto la actividad de ARE2 como ARE1. La supresión de la actividad se podría lograr, por ejemplo, por desactivación/deleción de uno o ambos de los genes o partes de gen(es) que codifican ARE1 o ARE2.

Se conocen los genes que codifican ERG5, ERG6, ARE1, ARE2 o esterol A24-reductasa (ERG4), el cultivo y la ingeniería genética de la célula de levadura como se usa en el presente documento y se describen en, por ejemplo, el documento de patente US 7608421. En particular, la esterol A24-reductasa a expresar en la célula de levadura se puede originar de una fuente de planta o vertebrado, preferentemente de una fuente de vertebrado, más preferentemente de humano, cerdo, perro, ratón, rata, caballo, Danio rerio o cualquier fuente conocida, en tanto que se puede expresar dentro de dicha célula de levadura. Lo más preferentemente, la esterol A24-reductasa se selecciona de Danio rerio, rata o humano. Las secuencias que expresan dichas enzimas esterol A24-reductasa están disponibles públicamente, que incluyen, pero no se limitan a, la referencia de UniProtκΒ/Swiss-Prot Q15392, Q60HC5, Q8VCH6, Q5BQE6, Q39085 o P93472.

Como se usa en el presente documento, los términos "C-24-reductasa" o "A24-reductasa" se usan indistintamente en el presente documento. En la levadura, esta enzima está codificada por erg4 y es activa en el grupo metilo del átomo de carbono en la posición 24. Por lo tanto, el trienol, que no presenta dicho grupo metilo en dicha posición, no es un sustrato aceptable para la levadura ERG4.

Una célula de levadura adecuada que se puede usar para la realización de la presente invención se podría seleccionar de, por ejemplo, Sacaromyces cerevisiae, Schizosacaromyces spp., Pichia spp., Klyuveromyces spp., Hansenula spp. o Yarrowia lipolytica, en tanto que ERG5 y ERG6 estén inactivados en dicha célula de levadura.

En particular, la presente invención caracteriza las presentes realizaciones:

• Un proceso para la producción de una mezcla de esteroles que comprende al menos 87 % de 7-DHC basado en la cantidad total de esteroles, que comprende el cultivo de una célula de levadura en la que ERG5 y ERG6 están inactivados, en donde la actividad de ARE2, por ejemplo, la actividad de ARE2 endógena, ha sido reducida o suprimida, en donde la enzima EC 1.3.1.72 de planta o vertebrado que tiene actividad de esterol A24-reductasa sobre latosterol, zimosterol o trienol se expresa de forma heteróloga, particularmente, dicha mezcla de esteroles que comprende aproximadamente 3 % o menos de zimosterol basado en la cantidad total de esteroles, particularmente, dicha mezcla de esteroles que comprende colesta-5,7,24(25)-trienol y zimosterol, en donde la relación entre colesta-5,7,24(25)-trienol y zimosterol está en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 1.

• Particularmente, un proceso como antes, en donde la célula de levadura expresa una enzima heteróloga de planta o vertebrado seleccionada de EC 1.3.1.72 que tiene actividad de esterol A24-reductasa que es activa sobre latosterol, zimosterol o trienol, preferentemente procedente de humano, cerdo, perro, ratón, rata, caballo o Danio rerio.

• Proceso como antes, en donde se ha suprimido la actividad de ARE2 o la actividad de ARE2 y ARE1, por ejemplo, la actividad de ARE2 endógena o ARE2 y ARE1.

• Un proceso para disminuir la cantidad de zimosterol en una mezcla de esteroles producida por una célula de levadura en al menos 4 veces basándose en la cantidad total de esteroles que comprende el cultivo de dicha célula de levadura en condiciones adecuadas para la producción de esteroles, comprendiendo dicho proceso:

(a) proporcionar una célula de levadura, en la que ERG5 y ERG6 están inactivados,

(b) suprimir o reducir la actividad de ARE2 dentro de dicha célula de levadura, y

(c) expresar una enzima EC 1.3.1.72 heteróloga de planta o vertebrado que tiene actividad de esterol A24-reductasa sobre latosterol, zimosterol o trienol;

en donde la reducción se compara con una célula de levadura en donde ARE2 es activa, por ejemplo,

en donde la ARE2 endógena es activa.

• Uso de una célula de levadura como antes para la producción de esteroles, preferentemente para la producción de precursores de la vitamina D3, más preferentemente para la producción de 7-DHC. •

• Un proceso como antes, en donde la relación entre 7-DHC y zimosterol presente en la mezcla de esteroles está en el intervalo de al menos aproximadamente 87 a aproximadamente 2.

Figuras

Figura 1. Análisis de esteróles totales (CG/EM) de cepas desactivadas e5e6 (panel A), a2e5e6 (panel B) y a l a2e5e6 (panel C), 1: colesterol (añadido como patrón interno, 10 μg por 10 unidades de DO de biomasa), 2: zimosterol 3: colesta-5,7,24(25)-trienol, 4: colesta-7,24-dienol.

Figura 2. Análisis de esteroles totales (CG/EM) de las cepas e5e6::24R, a2e5e6::24R (panel A), a1a2e5e6::24R (panel B) y a1a2e5e6::24R (panel C); 1: colesterol (añadido como patrón interno, 10 μg por 10 unidades de DO de biomasa), 2: colesta-5,8-dienol 3: colesta-8-enol, 4: 7-deshidrocolesterol, 5: colesta-7-enol , 6: zimosterol, 7: colesta-5,7,24-trienol.

Figura 3. Composiciones de esterol libre y de ásteres de esterol en las cepas de expresión de aciltransferasa dadas en μg/DO⁶⁰⁰. Mediciones de HPLC-EM de ergosterol (ERG), 7-deshidrocolesterol (7-DHC), colesterol (CLR) y zimosterol (ZYM). Valores medios y desviaciones estándar para cepas de ERG y CLR calculados a partir de triplicados biológicos; para la cepa de 7-DHC de duplicados biológicos cultivados en paralelo (excepto para Pt1 *, Tg1*: cultivo independiente). Se tomaron muestras de 200 unidades de DO⁶⁰⁰después de 48 h de expresión de aciltransferasa en cepas productoras de ergosterol (cepas ERG), con medición de ERG libre (columna 1), ásteres de ERG (columna 2) y ásteres de ZYM (columna 3) mostrada para las diferentes fuentes de ARE (Fig.3A). Dentro de una columna, el color oscuro muestra el áster 1, mientras que el color más claro muestra el áster 2. Se tomaron muestras de 200 unidades de DO⁶⁰⁰despuás de 65 h de expresión de aciltransferasa en cepas productoras de 7-DHC (cepas 7-DHC), con medición de 7-DHC libre (columna 1), ásteres de 7-DHC (columna 2) y ásteres de ZYM (columna 3) mostrada para las diferentes fuentes de ARE (Fig. 3B). Dentro de una columna, el color oscuro muestra el áster 1, mientras que el color más claro muestra el áster 2. Se tomaron muestras de 200 unidades de DO⁶⁰⁰despuás de 65 h de expresión de aciltransferasa en cepas productoras de colesterol (cepas CLR), con medición de CLR libre (columna 1), ásteres de CLR (columna 2) y ásteres de ZYM (columna 3) mostrada para las diferentes fuentes de ARE (Fig.

3C). Dentro de una columna, el color oscuro muestra el áster 1, mientras que el color más claro muestra el áster 2.

Figura 4. Análisis de HPLC de extractos etanólicos de lípidos dados en mg de esterol/ml de extracto de cepas CEN.PK₂(A) con diferentes combinaciones de desactivaciones, es decir, desactivación erg5/erg6 (B y E), desactivación are2/erg5/erg6 (C y G), desactivación are1 /are2/erg5/erg6 (D y H) y desactivación are1 /erg5/erg6 (F). Las cepas mostradas en (E), (F), (G) y (H) expresan además el gen 24-reductasa. Las cepas se cultivaron en YPD con 2 % de glucosa durante tres días con alimentación triple de glucosa (2 %) en matraces con agitación con deflectores. Los datos son de triplicados biológicos, se facilitan como diferentes especies principales de ásteres de esterol o esterilo, tales como escualeno (columna 1), ergosterol (columna 2), áster de zimosterol (columna 3 y 4), áster de ergosterol (columna 5 y 6), trienol (columna 7), áster de trienol (columna 8 y 9), 7-DHC (columna 10), áster de 7-DHC (columna 11 y 12), en donde los ásteres de esterol mostrados en la columna 3, 5, 8, 11 están esterificados con ácido palmitoleico y los ásteres de esterol mostrados en la columna 4, 6, 9, 12 están esterificados con ácido oleico (Fig. 4A). Datos de triplicados biológicos facilitados como la suma de esteroles libres y esterificados, tales como escualeno (columna 1), ergosterol (columna 2), zimosterol (columna 3), total (columna 4), 7-DHC (columna 5), trienol (columna 6) se muestran en la Fig. 4B .

Figura 5. Análisis de CG/EM de esteroles totales de cepas CEN.PK₂(A) con diferentes combinaciones de desactivaciones, es decir, desactivación erg5/erg6 (B y E), desactivación are2/erg5/erg6 (C y G), desactivación are1/are2/erg5/erg6 (D y H) y desactivación are1/erg5/erg6 (F). Las cepas mostradas en (E), (F), (G) y (H) expresan además el gen 24-reductasa. Se usaron extractos de estas cepas de la misma biomasa que para el análisis de HPLC. Los datos son de triplicados biológicos que muestran esteroles totales, tales como escualeno (columna 1), ergosterol (columna 2), zimosterol (columna 3), otros esteroles (columna 4), 7-DHC (columna 5), trienol (columna 6) tanto en porcentaje de esteroles totales (Fig. 5A) como en cantidades absolutas en μg por 10 unidades de DO por normalización al patrón interno colesterol (Fig. 5B).

Los siguientes ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención en modo alguno.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción de cepas desactivadas que producen colesta-5,7,24-trienol

Se aislaron una cepa de Sacaromyces cerevisiae productora de colesta-5,7,24-trienol (erg5 y erg6 desactivados, cepa e5e6) con are1 y are2 desactivados (cepa a1a2e5e6, váase la Tabla 1) y una cepa con solo are2 desactivado (cepa a2e5e6) o are1 desactivado (cepa 20B) por disección de tátradas despuás de la esporulación de la cepa diploide COS24. La cepa diploide COS24 se obtuvo cruzando las dos cepas COS23 (are1 are2 desactivado; a1 a2) y BP5 (erg5 erg6 desactivado; e5e6), que se construyeron por desactivación de los genes especificados (váase la Tabla 1) con casetes de interrupción que llevaban un marcador de auxotrofía, o en caso de Are2 con un casete de interrupción que llevaba un gen de resistencia a antibióticos. Se identificaron cepas interesantes que comprenden ARE2 o ARE1/2 desactivadas por características de crecimiento en placas de marcador. Las manipulaciones genómicas se confirmaron por cPCR.

Se amplificaron por PCR casetes de interrupción usando cebadores compuestos de aproximadamente 40 pb en el extremo 5' del cebador que son homólogos a la región del extremo 3' del gen que se indica que está delecionado y 20 pb en el extremo 3' del cebador que se hibrida con el gen marcador de selección que se pretende introducir (Longtine, 1998; Lorenz, 1995). En caso de are1 desactivado, las regiones flanqueantes de interrupción coincidieron con la parte amino- y carboxiterminal del gen ARE1 y el casete de interrupción llevó un promotor y terminador de TEF para la expresión del gen HIS3. Para las otras tres desactivaciones, los promotores de los genes desactivados se usaron para la expresión de marcadores. Para un resumen de los cebadores para la generación de los casetes de interrupción y una lista de los vectores molde correspondientes, véanse la Tabla 7 y Tabla 2.

Se transformaron los casetes de interrupción en Sacaromyces cerevisiae con el método descrito a continuación y se identificaron recombinantes homólogos por prototrofia de marcador o resistencia a antibiótico.

Antes de la transformación, todas las cepas se cultivaron en YPD a 30 °C en 10 o 50 ml de precultivo durante la noche. El cultivo principal se inoculó hasta una DO⁶⁰⁰de 0,05 en 50 ml cultivados durante la noche hasta que se alcanzó una DO⁶⁰⁰de 1,5 - 2 unidades. Se realizó transformación de plásmidos según el protocolo de LiAc/ADNmc transportador/PEG de alta eficiencia descrito por Gietz y Woods (2002). Brevemente, las células se recogieron a 3000 x g durante 5 min, se lavaron con 25 ml de agua estéril a 3000 x g, 5 min, y se resuspendieron en 1 ml de agua estéril. Las células se transfirieron a un tubo de reacción de 1,5 ml, se centrifugó nuevamente a 500 x g, 1 min, se retiró el sobrenadante y se llenó hasta un volumen final de 1 ml con agua estéril. Se centrifugaron alícuotas de 100 μl (= 108 células) a 500 x g, 1 min, y se retiró el sobrenadante. La mezcla de transformación que contenía 240 μl de PEG 3500 (50 %), 36 μl de 1 MLiAc, 50 μl de ADNmc transportador hervido y 34 μl de 1 - 2 μg de ADN de plásmido o casetes de interrupción lineal se añadió a los sedimentos de células, se mezclaron vigorosamente y se incubaron a 42 °C durante 40 min. Después del evento de transformación, las muestras se regeneraron en 1 ml de YPD durante 3,5 h. La suspensión se centrifugó durante 5 min a 500 x g para centrifugar suavemente las células. Las células se sembraron en placas de selección.

Las desactivaciones correctas se verificaron en varias configuraciones de PCR de colonias diferentes. Los genes ERG5, ERG6, ARE1 y ARE2 se sustituyeron por LEU2, TRP1, HIS3 y los casetes de interrupción loxP-kanMX-loxP, respectivamente, como se describe por Güldener et al. (1996) para dar finalmente la cepa de desactivación cuádruple are1are2erg5erg6 (cepa a1a2e5e6).

esac vac n e y , a cepa a e e eva a esac vac n e , y , a cepa a a e e lleva una desactivación de ERG5, ERG6, ARE1 y ARE2. "N.d." significa "no determinado" (para más explicación véase el texto).

Tabla 2 : Plásmidos usados como moldes para marcadores en casetes de interrupción (para más explicación véase el texto).

Ejemplo 2: Análisis de CG/EM de cepas en donde ARE2 o ARE1/2 se han desactivado

Se analizaron esteroles totales de cepas desactivadas e5e6 (control), a2e5e6 y a1a2e5e6 por CG/EM (Tabla 3).

Las cepas se cultivaron en matraces con agitación en medio YPD durante 48 h. Se saponificaron 10 unidades de DO⁶⁰⁰de biomasa con KOH/MeOH y se extrajeron con n-heptano. Se calcularon cantidades absolutas [μg] a partir del área de los picos del pico de colesterol. Como patrón interno, se añadieron 10 μg de colesterol a 10 unidades de DO. Con respecto al zimosterol, la cantidad varió de 17,2 μg (e5e6) a 2,5 μg (cepa a2e5e6) a 0,41 μg (cepa a1a2e5e6). Para colesta-5,7,24(25)-trienol, la cantidad varió de 18 μg (e5e6) a 20 μg (a2e5e6) a 19 μg (a1a2e5e6).

Tabla 3 : Análisis de esteroles totales de cepas e5e6, a2e5e6 y a1a2e5e6. Para más explicación véase el texto.

La desactivación de ARE2 conduce a una drástica reducción del contenido de zimosterol (en el intervalo de 4 veces) basado en esteroles totales, una desactivación adicional de ARE1 redujo más el zimosterol hasta el 2 %. El contenido de trienol aumentó hasta el 76 % para la desactivación de are2 y además hasta aproximadamente el 86 % para la desactivación doble.

Ejemplo 3: Construcción de cepas productoras de 7-DHC con desactivación simple o doble de ARE1 y ARE2

Para la construcción de una cepa de S. cerevisiae productora de 7-DHC sin actividad de aciltransferasa, en primer lugar, se construyó una cepa de erg5 desactivado CEN.PK₂MATa y una de erg6 desactivado CEN.PK₂MATa con los casetes de interrupción descritos en el Ejemplo 1. Estas dos cepas se cruzaron dando una cepa diploide ERG5/erg5::LEU5 ERG6/erg6::TRP1, en la que se transformaron los casetes de interrupción para la desactivación de ARE1 y ARE2. Estas transformaciones dieron la cepa diploide ARE1/are1 ::HIS3 ARE2/are2::kanMX ERG5/erg5::LEU2 ERG6/erg6::TRP1. En esta cepa se transformó un casete de interrupción que contenía el gen para una esterol 24-reductasa de Danio rerio flanqueado por un promotor de TDH3 y un terminador de PGK1 en combinación con un gen para resistencia a higromicina con el promotor y terminador TEF1 (24DHCR-HPH). El casete de interrupción se integró en el sitio ERG6, así se obtuvo una cepa CEN.PK₂ARE1/are1 ::HIS3 ARE2/are2::kanMX ERG5/erg5::LEU2 erg6::24-DHCR-HPH/erg6::TRP1. Después de la esporulación de esta cepa y una disección de tétradas, se aisló una cepa desactivada erg5::LEU5 erg6::24DHCR-HPH. Esta cepa se apareó con una cepa desactivada are1 ::HIS3 are2::TRP1 (construida con los casetes de interrupción descritos en el Ejemplo 9). La cepa diploide resultante se esporuló y después de una disección de tétradas finalmente se obtuvo una cepa de desactivación cuádruple CEN.PK₂are1::SkHis3 are2::kanMX erg5::LEU5 erg6 ::24DHC-HPH que expresaba una esterol 24-reductasa, que produjo 7-DHC como esterol principal. Además, se aislaron dos cepas con solo desactivación de ARE1 (COS7) o ARE2 (COS8).

Ejemplo 4: Análisis de CG/EM de cepas a2e5e6::24R y a1a2e5e6::24R

Se analizaron esteroles totales de cepas desactivadas e5e6::24R (control), a2e5e6::24R y a1a2e5e6::R24 por CG/EM (Tabla 4).

Las cepas se cultivaron en matraces con agitación en medio YPD durante 48 h. Se saponificaron 10 unidades de DO⁶⁰⁰de biomasa con KOH/MeOH y se extrajeron con n-heptano. Se calcularon cantidades absolutas [μg] a partir del área de los picos del pico de colesterol. Como patrón interno, se añadieron 10 μg de colesterol a 10 unidades de DO. Con respecto a zimosterol, la cantidad varió de 17,2 μg (e5e6::24R) a 2,5 μg (a2e5e6::24R) a 0,41 μg (a1a2e5e6::24R).

Tabla 4 : Análisis de esteroles totales de las cepas e5e6::24R, a2e5e6::24R y a1 a2e5e6::24R. El término "n.d." significa "no detectable". Para más explicación véase el texto.

De la cantidad de esteroles totales obtenidos con la cepa e5e6::24R, aproximadamente el 45 % es 7-DHC y el 34 % de los esteroles es zimosterol. La cantidad de 7-DHC aumentó espectacularmente hasta el 87 % de los esteroles totales producidos por una cepa que poseyó una desactivación en ARE2; aumentó además a más del 90 % en cepas que poseyeron una desactivación doble de ARE1/2. Las cantidades absolutas de 7-DHC disminuyeron de 20 μg por cada 10 unidades de DO a 9 μg en la cepa a1a2e5e6::24R en las condiciones dadas, pero la formación de subproducto disminuyó más ya que ya ni se detectó más zimosterol.

Ejemplo 5: Construcción de una cepa de S. cerevisiae productora de colesterol sin actividad de aciltransferasa

Para generar una nueva cepa CEN.PK de S. cerevisiae que produce establemente colesterol en lugar de ergosterol, se integró la deshidrocolesterol reductasa DHCR7 que se originó de Danio rerio (pez cebra) en la cepa de desactivación de are1 are2 productora de 7-DHC 10A (a1a2e5e6::24R, véase el Ejemplo 6). DHC7 satura 7-DHC en su posición de doble enlace C-7 dando como resultado el producto final colesterol.

Se amplificó el gen DHCR7 por PCR a partir del vector 056662pScript junto con sitios de restricción Bam HI y Eco RI y una secuencia consenso de Kozak en 5' adicional "AAAA" para S. cerevisiae usando los cebadores DHCR7-FW y DHCR7-RV (Tabla 13). Este producto de PCR se usó entonces como un inserto para la ligación de extremos cohesivos con el esqueleto de vector de p426GPD_ARE2 después de la digestión doble con Bam HI y Eco RI. El vector creado p426GPD_DHCR7 contuvo ahora el gen DHCR7 flanqueado por el fuerte pTDH3 y el terminador de iso-1-citocromo tCYC1. Este casete capaz de introducir la expresión en exceso de DHCR7 se amplificó por PCR, usando los cebadores HR-TDH3-FW y CYCIt-HR-RV añadiendo las regiones de ERG5 homologas en 5' y 3'. Todos los cebadores se muestran en la Tabla 7.

El casete de interrupción de DHC7 se transformó en la cepa 10A (a1a2e5e6::24R). Como solo las cepas productoras de colesterol pueden resistir a la natamicina, las células transformadas se sembraron en natamicina 40 - 60 μM, donde solo podrían sobrevivir células con expresión de 7-DHC reductasa funcional. Los resultados de PCR de las colonias confirmaron la correcta integración del casete de interrupción en el sitio ERG5. Los resultados de CG-EM mostraron que la cepa de levadura BA-C resultante produjo >99 % de colesterol en esteroles totales.

Ejemplo 6: Transformación y aislamiento de ADN de plásmido que lleva genes sintéticos para esterol-O-aciltransferasas (HAT)

Se ordenaron genes sintéticos que codificaban cinco HAT diferentes de cuatro organismos en DNA2.0. Todas las construcciones génicas se optimizaron para la expresión en S. cerevisiae y se suministraron en un vector pJ201 (Tabla 5).

Tabla 5 : Selección de HAT que incluyen la designación de los vectores (basada en el vector pJ201 de DNA2.0), lista detallada de proteínas, organismo fuente y números de acceso de NCBI.

Los plásmidos pHYD-0120-0124 y el vector p426GPD (Mumberg, 1995) se transformaron en células TOP10F' de E. coli electrocompetentes generadas en medio SOC durante 1 h a 37 °C y se sembraron en placas de agar con LB-kanamicina (50 μg/ml) para las transformaciones de pHYD y en LB-ampicilina (100 μg/ml) para la transformación de p426GPD. Las placas se incubaron a 37 °C durante la noche. La composición de los medios se facilita en la Tabla 6.

Tabla 6: Composición de medios. Para medios líquidos, se omite el agar.

Se cultivaron en línea colonias individuales de las placas de transformación en placas de agar con LB-kanamicina (50 μg/ml) y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Los plásmidos se aislaron de material celular tomado de las placas de agar con Gene Jet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.) según el manual.

Ejemplo 7: Amplificación del gen ARE1 y ARE2 de ADN cromosómico de CEN.PK₂de Saoaromyoes cerevisiae y clonación en el vector pJetl .2

El aislamiento de ADN genómico se hizo según el método "Bust n' Grab" (Harju, 2004). Se transfirieron 1,5 ml de un cultivo durante la noche (DO⁶⁰⁰12) de la cepa de Sacaromyces cerevisiae CEN.PK₂-1D de EUROSCARF (MATa, ura3-52, trp1 -289, leu2-3_112, his3A1, MAL2-8C, SUC2) a un tubo de Microfuge y sedimentó a 13.000 x g durante 5 min. El sedimento se resuspendió en 200 μl de tampón de lisis (2 % de Triton X-10ü,1 % de SDS, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0) y se dispuso en un congelador a -80 °C hasta que se congeló completamente. La mezcla se descongeló rápidamente en una termomezcladora a 95 °C. Este procedimiento se repitió dos veces antes de mezclar en vórtex la muestra durante 30 s. Después de añadir 200 μl de cloroformo, los tubos se mezclaron en vórtex durante 2 min y se centrifugaron durante 3 min a temperatura ambiente y velocidad máxima. Para la precipitación de ADN, la fase acuosa superior se transfirió a un tubo de microcentrifugadora que contenía 400 μl de etanol al 100 % frío en hielo y se mezclaron por inversión. Para aumentar el rendimiento, las muestras se incubaron a -20 °C durante 5-10 min y se centrifugaron durante 5 min a 16.100 x g. El sobrenadante se retiró y el sedimento se lavó con 0,5 ml de etanol al 70 % frío en hielo. Después de la centrifugación a 16.000 x g durante 5 min, el sobrenadante se retiró con una micropipeta y el sedimento se secó en una estufa de incubación a 30 °C antes de disolverlo en 20 μl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8).

Para amplificar ARE1 y ARE2, se usó ADN genómico de CEN.PK₂como molde en una PCR de dos etapas. Los cebadores proporcionaron nucleótidos protuberantes con sitios de restricción (BamHI y EcoRI) para la clonación (véase la Tabla 7).

Tabla 7: Cebadores para la amplificación/clonación de ARE1 y ARE2 (para más detalles véase el texto).

Se llevó a cabo la PCR en las siguientes condiciones: 50 gl de volumen total, 200 gM de cada dNTP, 0,5 gM de cada cebador, aproximadamente 200 ng de ADN genómico de CEN.PK₂-1D de S. cerevisiae, 0,03 U/gl de polimerasa Phusion Hot Start en tampón apropiado (Finnzymes Thermo Fisher Scientific Inc.). Las condiciones de los ciclos fueron del siguiente modo: 98 °C durante 1 min; 5 ciclos de 98 °C durante 10 s, 67,8 °C durante 50 s, 72 °C durante 58 s; 30 ciclos de 98 °C durante 10 s, 78 °C durante 50 s, 72 °C durante 59 s; 72 °C durante 10 min, finalmente se mantuvo a 4 °C.

Se purificó el ADN amplificado por un gel preparativo (Wizard SV Gel Slice y PCR Product Preparation por Promega) y se clonó en el vector pJet1.2 con Clone JetTM PCR Cloning Kit (Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.) según el manual del proveedor para conseguir el vector pJet1.2_ARE1 o pJet1.2_ARE2. Los vectores pJet1.2_ARE1 y pJet1.2_ARE2 se transformaron en TOP10F' de E. coli. Se usó el material celular de un cultivo en línea cultivado durante la noche de un único transformante para el aislamiento de plásmidos con Fermentas GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.) según el manual del proveedor.

La correcta integración de ARE1 o ARE2 en pJet1.2 se comprobó por secuenciación de Sanger.

Ejemplo 8: Clonación del gen ARE1 y ARE2 en el vector p426GPD

La secuencia de ARE1 de CEN.PK₂contiene un sitio de restricción BamHI, que se retiró por mutación. Por lo tanto, el gen ARE1 se amplificó en dos fragmentos con los cebadores indicados en la Tabla 7. El cebador are1_ c1332a_fw y are1_ c1332a_rv contuvo la mutación prevista C1332A. Para la amplificación del fragmento 1 se usó el conjunto de cebadores are1_fw y are1_c1332a_rv, para la amplificación de fragmento 2 se usó el conjunto de cebadores are1_c1332a_fw y are1_rv. La mezcla de PCR contuvo en 50 gl de volumen total 200 gM de cada dNTP, 0,2 gM de cada cebador, 13 ng de pJet1.2_ARE1,0,02 U/gl de la polimerasa Phusion en tampón apropiado (Finnzymes Thermo Fisher Scientific Inc.). El programa de PCR usado fue: 98 °C durante 30 s; 30 ciclos de 98 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 60 s; 72 °C durante 7 min, finalmente se mantuvo 4 °C. Los dos fragmentos se purificaron en gel y se fusionaron en una PCR de extensión por superposición reconstituyendo el gen ARE1 completo con sitio de restricción BamHI mutado. La mezcla de reacción para la PCR de extensión por superposición contuvo en 50 μl de volumen total 200 μM de cada dNTP, 10 ng de fragmento 1,7 ng de fragmento 2, 0,02 U/μl de polimerasa Phusion en tampón apropiado (Finnzymes Thermo Fisher Scientific Inc.). El programa de PCR usado fue: 98 °C durante 30 s; 15 ciclos de 98 °C durante 10 s, 60 °C durante 20 s, 72 °C durante 90 s; 72 °C durante 7 min, finalmente se mantuvo a 4 °C. El producto de PCR (gen ARE1 mutado flanqueado por sitios de restricción BamHI y EcoRI) se purificó en gel y se usó como inserto para etapas clonación adicionales.

Para la preparación del inserto para la clonación de ARE1 y ARE2 mutados en p426GPD, el gen ARE1 amplificado (véase anteriormente) o pJet1.2_ARE2 y p426GPD se restringieron con BamHI y EcoRI (Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.). El inserto de ARE2 y el esqueleto de vector p426GPD se purificaron por un gel preparativo, el inserto de ARE1 se purificó por el kit de purificación de PCR GeneJET (Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.). El inserto y el esqueleto se ligaron con ADN ligasa T4 (Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.). Antes de la transformación en células Top10F' de E. co lielectrocompetentes, las mezclas de ligación se desalaron con filtros de membrana MF. Se cultivaron en línea colonias individuales de las placas de transformación en placas de agar con LB-ampicilina (100 μg/ml) y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Los plásmidos (p426GPD_ARE1 y p426GPD_ARE2) se aislaron de material celular tomado de las placas de agar con el Gene Jet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.) según el manual.

Ejemplo 9: Adición de una marca FLAG a los genes HAT y clonación en el vector p42GPD

Para añadir una marca FLAG aminoterminal a los genes HAT, los genes se amplificaron de los plásmidos pHYD (aciltransferasas heterólogas) o p426GPD_ARE1 o p426GPD_ARE2 con los cebadores enumerados en la Tabla 7.

Se purificaron productos de PCR por un gel de agarosa preparativo. Después de la restricción con enzimas BamHI y EcoRI, los productos de PCR se ligaron con el esqueleto de vector de p426GPD y se transformaron en células TOP10F' de E. coli. Los plásmidos se aislaron de cultivos en línea de colonias individuales y se confirmó la inserción correcta de los genes de aciltransferasa marcados con Flag por secuenciación de Sanger.

Ejemplo 10: Clonación del marcador génico kanMX en el vector p426GPD_ScARE2 en lugar del marcador URA3 y reclonación de todos los genes de aciltransferasa marcados con Flag en el vector p42kanMXGPD con una secuencia de Kozak

Para amplificar el esqueleto de vector de p426GPD_ScARE2 (secuencia de vector sin marcador URA3), se usaron el cebador p426GPD_URAfw (Tabla 7) que lleva un nucleótido protuberante con un sitio de restricción para Ndel y el cebador p426GPD_URArv que lleva un nucleótido protuberante con un sitio de restricción para NotI. Para amplificar el marcador génico kanMX de plásmido pFA6a_kanMX6, se usaron el cebador Ndel TEFp_fw y el cebador NotI TEFt_rv.

Se llevó a cabo la PCR en las siguientes condiciones: 50 μl de volumen total, 200 μM de cada dNTP, 0,5 μM de cada cebador, 50 ng de ADN molde de plásmido, 1 unidad de polimerasa Phusion (Finnzymes, F-530L) en tampón de reacción Phusion HF apropiado. Las condiciones de los ciclos fueron del siguiente modo: 98 °C durante 30 s; 30 ciclos de 98 °C durante 10 s, 61 °C durante 30 s, 72 °C durante 2:15 min (esqueleto de vector: aprox. 7500 pb)/ 45 s (marcador kanMX: aprox. 1400 pb); 72 °C durante 10 min, finalmente se mantuvo a 4 °C.

Los ADN amplificados se purificaron por un gel de agarosa preparativo (Wizard SV Gel y PCR Clean-up System por Promega) y las concentraciones se determinaron después de la elución. Las disoluciones de ADN purificado (~45 μl) se digirieron con FastDigest NotI y FastDigest Ndel (Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.) en tampón respectivo. Después del corte con restricción, el esqueleto de vector (p42GPD_ScARE2) se desfosforiló con fosfatasa alcalina termosensible FastAP. Se purificaron el inserto de marcador kanMX digerido con Ndel y NotI y el esqueleto p426GPD_ScARE2 por SV Minicolumn (Wizard SV Gel y PCR Clean-up System por Promega). Para la ligación, se ligaron 100 ng de esqueleto de vector p426GPD_ScARE2 con el inserto de kanMX usando una relación molar de 1:3 de vector con respecto al inserto con 1 U/μl de ADN ligasa T4 (Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.) en tampón apropiado durante 1,5 h a temperatura ambiente.

La reacción de ligación se transformó en células Top 10 F' de E. coli electrocompetentes. Después de la regeneración en medio SOC, la mezcla de transformación se sembró en placas de agar con LB-ampicilina (100 μg/ml). Se cultivaron en línea colonias individuales de las placas de transformación en placas de agar con LB-ampicilina (100 μg/ml) y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Se aislaron plásmidos del material celular tomado de las placas de agar con el Gene Jet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.) según el manual. Los tamaños de los plásmidos se comprobaron después de un corte de control con Ndel y Notl en un gel de agarosa y los plásmidos que muestran tamaños de fragmento correcto se enviaron para secuenciación para confirmar la secuencia correcta.

Para el vector p42kanMXGPD_ScARE2 resultante, se determinó la secuencia correcta del marcador kanMX6, el origen 2p, el promotor GAP y el gen ARE2.

Para añadir una secuencia de Kozak (AAA) a los genes de aciltransferasa marcados con Flag (120-124, ARE2), se amplificaron las secuencias codificantes de los plásmidos p426GPD_FLAG-ACAT con el cebador directo Kozak-FLAG y los cebadores inversos respectivos como se muestra en la Tabla 7.

Los productos de PCR se ligaron con el esqueleto de vector de p426kanMXGPD después de la restricción con enzimas BamHI y EcoRI y se transformaron en células TOP10F'. Los plásmidos se aislaron de cultivos en línea de colonias individuales y se confirmó la inserción correcta de los genes de aciltransferasa por secuenciación de Sanger. Las construcciones finales, es decir, plásmidos 2p, para la de aciltransferasa en S. cerevisiae se enumeran a continuación:

P42kanMX_GPD_Sc1

P42kanMX_GPD_Sc2

P42kanMX_GPD_Ca2

P42kanMX_GPD_Tg1

P42kanMX_GPD_Rn1

P42kanMX_GPD_Rn2

P42kanMX_GPD_Pt1

P42kanMX_GPD

Ejemplo 11: Transformación de vectores de aciltransferasa en cepas desactivadas en arel are2 de S. cerevisiae productoras de ergosterol, 7-DHC o colesterol

Se transformó la cepa desactivada en are1 are2 productora de ergosterol COS5 (mismo genotipo que COS4 en la Tabla 1, excepto el tipo de apareamiento, COS5 es Mata) con el conjunto de vectores p42kanMX-GPD que llevan los genes homólogos y heterólogos de aciltransferasa. La transformación se hizo con el protocolo descrito en el Ejemplo 9. También se transformó el mismo conjunto de vectores en la cepa desactivada en are1 are2 productora de 7-DHC (véase el Ejemplo 3) y la cepa desactivada en are1 are2 productora de colesterol (véase el Ejemplo 5). La Tabla 8 da una visión general de las cepas de levadura que expresan aciltransferasa disponibles.

Tabla 8 : Conjunto de cepas de expresión de aciltransferasa en acervos de cepas con composiciones de esterol variables.

Ejemplo 12: Cultivo de cepas de S. oerevisiae que expresan aciltransferasa

Cepas de expresión de aciltransferasa en acervos de cepas productoras de 7-DHC y colesterol (véase la Tabla 8) se cultivaron a 28 °C en un matraz con agitación con deflectores de 250 ml durante 65 h. Se inocularon 50 ml de medio YPD que contenía geneticina 100 μM de un precultivo hasta una DO ⁶⁰⁰ de 0,1. Los cultivos celulares se alimentaron con 5 ml de glucosa (20 %) después de 40 h y otra vez 5 ml después de 52 h de tiempo de incubación. Las cepas de ergosterol se cultivaron de la misma forma, pero solo durante 48 h con alimentación después de 25 y 32 h. Para todas las cepas, se midió la DO ⁶⁰⁰ /ml final y se tomaron muestras en volúmenes que contenían 10, 20 y 200 unidades de DO de células. Las suspensiones se centrifugaron a 1500 x g durante 5 min y los sedimentos de las células se congelaron a -20 °C para análisis posteriores.

Ejemplo 13: Análisis de cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG/EM) de cepas de S. oerevisiae con vía del esterol alterada con expresión homóloga o heteróloga de aciltransferasa de plásmido

El procedimiento para la preparación de muestras para CG/EM y la extracción de esteroles de células completas de levadura se adaptó de Quail y Kelly (1996) y Müllner et al. (2005). Se transfirieron muestras congeladas de 10 unidades de DO ⁶⁰⁰ derivadas de cultivo de levadura a tubos de Pyrex y se centrifugaron durante 5 min a 2500 x g retirando posteriormente el sobrenadante. El disolvente que consistía en 0,6 ml de metanol, 0,4 ml de 0,5 % de pirogalol disuelto en metanol y 0,4 ml de KOH acuosa al 60 % se añadió a las muestras junto con 5 μl de colesterol o ergosterol [2 mg/ml] disuelto en etanol como patrón interno. La suspensión se mezcló en vórtex y se incubó durante 2 h a 90 °C en un baño de arena o un baño de agua. Los lípidos se extrajeron tres veces con 1 ml de n-heptano tras la agitación durante 3 min usando un Vibrax a 1500 rpm y se centrifugaron 3 min a 1500 g. Los extractos combinados se transfirieron a un segundo tubo de Pyrex y se llevaron a sequedad bajo una corriente de nitrógeno (opcional: los lípidos se almacenaron a -20 °C). Los lípidos se disolvieron en 10 μl de piridina y se incubaron 30 min para la derivatización después de añadir 10 μl de N,O-bis(trimetilsilil)-trifluoroacetamida. Las muestras se diluyeron con 200 μl de acetato de etilo y se transfirieron a viales de tapa plegada con microincrustación.

El análisis de CG/EM de esteroles sililados se realizó con una columna Agilent 19091S-433 HP 5-EM (5 % de fenil metil siloxano reticulado; dimensiones 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm de espesor de película). Se inyectaron alícuotas de 1 μl (tamaño de jeringa = 10 μl) en modo sin división a 270 °C de temperatura de inyección con helio como gas portador a un caudal de 0,9 ml/min en modo de flujo constante durante un tiempo de ejecución total de 38,67 min. Se usó el siguiente programa de temperatura: 1 min a 100 °C, 10 °C/min a 250 °C, 3 °C/min a 300 °C y 10 °C/min a 310 °C. Se adquirieron los espectros de masas en modo de barrido. Los esteroles se identificaron basándose en su patrón de fragmentación de masa, su tiempo de retención con respecto al colesterol y los patrones de esterol.

Se analizaron por CG/EM los contenidos de esteroles totales de cepas de S. cerevisiae que expresaban aciltransferasa (véase el Ejemplo 11) después del cultivo como se describe en el Ejemplo 12, los resultados se facilitan en la Tabla 9, en donde una medición cuantitativa de los esteroles celulares totales identificados por detección por CG-EM tras la sililación de extractos de lípidos. Cantidades de esterol resumidas (TOTAL) incluyen la molécula precursora escualeno (SQL).

Tabla 9: Composición de esterol celular de cepas de expresión de aciltransferasa. Los valores se calculan en μg/DO600 con respecto al colesterol (cepas de ERG y 7DHC) o ergosterol (cepa de CLR) como un patrón interno. Los valores en porcentaje de esteroles son con respecto a esteroles TOTALES. Valores medios de medición duplicada (‘ individual). Para más explicación, véase el texto.

Ejemplo 14: Análisis de HPLC de cepas de S. oerevisiae con vía de esterol alterada con expresión homologa o heteróloga de aciltransferasa de plásmido

Se usaron sedimentos de biomasa de 200 unidades de DO almacenados a -20 °C en tubos Greiner de 15 ml para un proceso de extracción: se descongelaron las muestras a temperatura ambiente (TA), se resuspendieron en 1 ml de disolución de zimoliasa (5 mg/ml en KP 50 mM, con D-sorbitol 1 M) y se incubaron durante 15 min a 37 °C. Después de la centrifugación a 3000 x g durante 5 min, el sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 1 ml de EtOH al 100 %. Se añadieron 2,8 ml de EtOH al 100 % y 200 μl de patrón interno (por ejemplo, 2 mg/ml de acetato de colesterilo disuelto en EtOH) y se mezclaron en tubos cerrados herméticamente a 70 °C con 750 rpm durante 1 h. Los tubos enfriados hasta TA se centrifugaron a 3000 x g durante 5 min y posteriormente se transfirieron 3 ml de sobrenadante a tubos de vidrio Pyrex. Los extractos se llevaron a sequedad bajo N₂y se recogieron en 200 μl de acetato de etilo. Se agitaron las muestras a 40 °C durante 15 min para resolver los lípidos, entonces, las partículas sin disolver se centrifugaron a 3000 x g durante 5 min y el sobrenadante se transfirió a viales de CG con incrustación. La medición de HPLC se realizó con una fase móvil que contenía 80 % de EtOH - 20 % de MeOH y 0,1 % de ácido trifluoroacético a un flujo de 0,6 ml/min. Se inyectó un volumen de 10 μl de muestra a 40 °C. Los compuestos se separaron en una columna YMC-Pack Pro C18 RS a 20 °C y se detectaron con un detector de UV a 210 nm para estructuras/esteroles aromáticos en general, 280 nm para esteroles con dobles enlaces conjugados tales como 7-DHC y ergosterol; alternativamente con un detector de EM en modo de barrido y SIM positivo a masas específicas de esterol menos el grupo OH (-17). Los datos del análisis de HPLC se hicieron integrando los picos de esterol y normalizando frente a un patrón interno de acetato de colesterilo para explicar cualquier pérdida durante la extracción y, si fuera necesario, los datos se normalizaron nuevamente a un patrón externo de acetato de colesterilo para ajustar los resultados para comparar datos de diferentes series. Se calcularon tanto concentraciones de esterol libre como de éster de esterol usando calibración con patrones de esterol libre.

Se analizó por HPLC el contenido de esterol libre y esterificado de cepas de S. cerevisiae que expresan aciltransferasa con vía de esterol alterada (véase el Ejemplo 11) después del cultivo como se describe en el Ejemplo 12, los resultados se facilitan en la Figura 3. Se pueden detectar dos tipos principales de ésteres de esterol que serán productos de esterificación de ácido palmitoleico (éster 1) y ácido oleico (éster 2), los dos ácidos grasos principales en levaduras como se informa por Zweytick et al. (2000). Además, en la cepa de ERG, también se detectaron ésteres con probablemente ácido palmítico (éster 3) y ácido esteárico (éster 4).

Ejemplo 15: Patrón de esterol de la cepa CEN.PK₂desactivada en erg5 erg6 con o sin expresión de 24-reductasa en combinación con desactivaciones de ARE1 y/o ARE2

Se comparó la producción de esterol en una cepa CEN.PK₂productora de ergosterol con respecto a las cepas productoras de colesta-5,7,24-trienol (véase el Ejemplo 1 y 2) o 7-DHC (véase el Ejemplo 5) con diferentes combinaciones de desactivaciones are1 y are2. Se cultivaron por triplicado cepas de S. cerevisiae CEN.PK₂, 20B, 2B, 14C (véase el Ejemplo 1), COS7, COS8, COS9 (véase el Ejemplo 5) en matraces con agitación durante tres días con alimentación de glucosa adicional. Para analizar esteroles libres y la composición de ésteres de esterol de las variantes por extractos etanólicos de HPLC de 200 unidades de DO, se prepararon como se describe en el Ejemplo 14. Los extractos se analizaron por HPLC con detección UV a dos longitudes de onda (210 y 280 nm). Se detectaron compuestos de zimosterol por luz UV a 210 nm, los compuestos de 7-DHC se midieron a 280 nm. Las concentraciones se calcularon relacionando áreas de los picos con áreas detectadas para 0,5-2 mg/ml de disoluciones patrón de zimosterol y 7-DHC. Se usó acetato de colesterilo como patrón interno para normalizar posibles diferencias dentro del procedimiento de extracción. Para detalles del método de HPLC véase el Ejemplo 14. La composición de esterol de las cepas analizadas como se mide por análisis de HPLC se muestra en la Figura 4.

Se pueden detectar dos tipos principales de ésteres de esterol que serán productos de esterificación de ácido palmitoleico (éster 1) y ácido oleico (éster 2), los dos ácidos grasos principales en levaduras como se informa por Zweytick et al. (2000).

El análisis de CG se hizo a partir de extractos de la misma biomasa que para el análisis de HPLC (véase la Figura 5). Para detalles del análisis de CG véase el Ejemplo 12. Se integraron las áreas de los picos y se recalcularon para cantidades en gg por 10 unidades de DO por el patrón interno de colesterol (véase la Figura 5b). La Figura 5A muestra el porcentaje de esteroles totales.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la producción de una mezcla de esteróles que comprende al menos 87 % de 7-deshidrocolesterol (7-DHC) basado en la cantidad total de esteroles, que comprende el cultivo de una célula de levadura en condiciones adecuadas para la producción de esteroles, en donde:

(a) ERG5 y ERG6 están inactivados,

(b) se reduce o suprime la actividad de ARE2, y

(c) se expresa de forma heteróloga la enzima EC 1.3.1.72 de planta o vertebrado que tiene actividad de esterol A24-reductasa sobre latosterol, zimosterol o trienol.

2. Un proceso según la reivindicación 1 para la producción de una mezcla de esteroles que comprende aproximadamente 3 % o menos de zimosterol basado en la cantidad total de esteroles.

3. Un proceso según la reivindicación 1 o 2 para la producción de una mezcla de esteroles que comprende colesta-5,7,24(25)-trienol y zimosterol, en donde la relación entre colesta-5,7,24(25)-trienol y zimosterol está en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 1.

4. Un proceso para disminuir la cantidad de zimosterol en una mezcla de esteroles en al menos 4 veces basado en la cantidad total de esteroles, comprendiendo dicho proceso:

(a) inactivación de ERG5 y ERG6,

(b) reducción o supresión de la actividad de ARE2, y

(c) expresión de una enzima EC 1.3.1.72 heteróloga de planta o vertebrado que tiene actividad de esterol A24-reductasa sobre latosterol, zimosterol o trienol;

comprendiendo dicho proceso además el cultivo de una célula de levadura en condiciones adecuadas para la producción de esteroles y en donde la cantidad de zimosterol se compara con el cultivo de una célula de levadura en donde ARE2 es activo.

5. Un proceso según la reivindicación 3, en donde la enzima EC 1.3.1.72 que tiene actividad de esterol A24-reductasa procede de un humano, cerdo, perro, ratón, rata, caballo, Danio rerio.

6. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además la reducción o supresión de la actividad de ARE1.

7. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde se suprimen los genes endógenos que codifican las esterol aciltransferasas ARE1 y/o ARE2.

8. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el 7-DHC se convierte además en vitamina D3.