JP2005211020A

JP2005211020A - ユビキノン１０の製造方法

Info

Publication number: JP2005211020A
Application number: JP2004024663A
Authority: JP
Inventors: Toshiya Kawaguchi; 俊哉川口
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2004-01-30
Publication date: 2005-08-11

Abstract

【課題】真核細胞におけるユビキノン生合成系に関与する新規遺伝子を用いて、高効率でユビキノンを製造する。
【解決手段】ユビキノン１０産生能を有する細胞に、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子Ａとポリプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子Ｂを共発現する工程と、(a)特定のアミノ酸配列からなるタンパク質(b)前記タンパク質を構成するアミノ酸において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質。得られた細胞を培養してユビキノン１０を産生させ、培地及び培養細胞を含む培養物からユビキノン１０を回収する工程とを含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、医薬用途等において有用な物質として知られるユビキノン１０の製造方法に関する。

ユビキノンは、補酵素（ＣｏＱ）とも称される重要な役割を果たしている生体成分である。ユビキノンは、動植物の組織、微生物の菌体成分として広く生物界に存在し、電子伝達系の必須成分として生理的、生化学的に重要な機能を果たしている。天然には側鎖のイソプレノイド単位の数により主にユビキノン６からユビキノン１０までの同族体が存在している。

ユビキノンは、その薬理、臨床効果についても研究され、うっ血性心不全、筋ジストロフィー、貧血症等に効果があるとされ、医薬品としても価値の高い物質である。ところが、ユビキノンの生合成経路は、大腸菌等の原核生物と酵母やヒト等の真核生物とでは一部異なっていると考えられている。図７に大腸菌におけるユビキノン生合成系と酵母におけるユビキノン生合成系とを示す。図７において、化合物1はisopentenyl diphosphateであり、化合物2はdimethylallyl diphosphateであり、化合物3はpolyprenyl diphosphateであり、化合物4は4-hydroxybenzoateであり、化合物5は3-polyprenyl-4-hydroxybenzoateであり、化合物6は2-polyprenylphenolであり、化合物7は2-polyprenyl-6-hydroxyphenolであり、化合物8は3,4-dihydroxy-5-polyprenylbenzoateであり、化合物9は3-methoxy-4-hydroxy-5-polyprenylbenzoateであり、化合物10は2-polyprenyl-6-methoxyphenolであり、化合物11は2-polyprenyl-6-methoxy-1,4-benzoquinoneであり、化合物12は2-polyprenyl-3-methyl-6-methoxy1,4-benzoquinoneであり、化合物13は2-polyprenyl-3-methyl-5-hydroxy-6-methoxy-1,4-benzoquinoneであり、化合物14はubiquinone-nである。

図７に示すように、大腸菌におけるユビキノン生合成系では化合物5から化合物6、その後化合物7に進むのに対して、酵母におけるユビキノン生合成系では化合物5から化合物8、その後化合物9に進む。このように、大腸菌におけるユビキノン生合成系と酵母におけるユビキノン生合成系とは異なっており、大腸菌のユビキノン生合成系に関する研究で得られた知見を、酵母のユビキノン生合成系に関する研究に適応することはできない。

大腸菌及びサッカロマイセス酵母において、ユビキノン生合成系に関与する遺伝子としては、表１に示す遺伝子および、機能未確定の遺伝子として、Coq4、Coq8が現在知られている。

表１に示すように、サッカロマイセス酵母に代表される酵母においては、ユビキノン生合成系に関与する遺伝子として未解明の遺伝子が少なくない。

ところで、ユビキノン１０はヒトの補酵素Q(CoQ)と側鎖長が同一であることより、例えばパラコッカス・デニトリフィカンスから工業的に抽出され、医薬品として利用されている。ユビキノン１０は以前より慢性心臓疾患に対し有効であることが知られており、抗不整脈剤としても有効であるため、アントラサイクリン抗ガン剤投与による不整脈防止等にも利用されている(非特許文献１)。

ユビキノン１０の生合成について述べた先行文献としては、特許文献１及び２を挙げることができる。しかしながら、これら特許文献１及び２に開示された方法では、真核細胞のユビキノン生合成系に関与する新規遺伝子を提供するものではなく、また、ユビキノン１０生合成の効率を十分に向上させることができなかった。

Fujioka, T. et al., Tohoku J. Exp. Med. (1983) 141 suppl. 453-463 特開平８−１０７７８９号公報ＷＯ０１／０２７２８６

そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、真核細胞におけるユビキノン生合成系に関与する新規遺伝子を用いて、高効率でユビキノン１０を製造することができるユビキノン１０の製造方法を提供することを目的とする。

上述した目的を達成した本発明に係るユビキノン１０の製造方法は以下の工程(1)及び(2)を有するものである。
（1）ユビキノン１０産生能を有する細胞に、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子Ａとポリプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子Ｂを共発現する工程。
(a)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号２で表されるアミノ酸において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質
(2)得られた細胞を培養してユビキノン１０を産生させ、培地及び培養細胞を含む培養物からユビキノン１０を回収する工程。

上記工程(1)では、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂをユビキノン１０産生能を有する細胞に導入することによって、上記遺伝子Ａ及び上記遺伝子Ｂを共発現させることができる。また、遺伝子Ａはとしては、以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含む遺伝子を使用することができる。
(a)配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号１で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号１で表される塩基配列と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNA

さらに、本発明に係るユビキノン１０の製造方法においては、遺伝子Ｂとして、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード遺伝子を使用することができる。
(a)配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号３で表されるアミノ酸において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
特に、ユビキノン１０産生能を有する細胞としてはサッカロマイセス・セルビシエ由来の細胞を使用することが好ましい。さらに、ユビキノン１０産生能を有する細胞としては、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素遺伝子を欠損させたサッカロマイセス・セルビシエにデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子を導入したユビキノン１０産生酵母を使用することができる。

本発明に係るユビキノン１０の製造方法においては、デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子としてパラコッカス・デニトリフィカンス由来の遺伝子を使用することができる。デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子としては以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を使用することができる
(a)配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号４で表されるアミノ酸において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、デカプレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質
特に、パラコッカス・デニトリフィカンス由来のデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子は、ミトコンドリア移行シグナルをコードするポリヌクレオチドを付加した構造であることが好ましい。

本発明により、真核細胞におけるユビキノン生合成経路に関与する新規遺伝子を利用して、ユビキノン１０を優れた効率で製造することができユビキノン１０の製造方法を提供することができる。これにより、医薬品等において有用なユビキノン１０を効率よく得ることが可能となる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るユビキノン１０の製造方法は、ユビキノン１０産生細胞内において、従来機能未知の新規遺伝子（「遺伝子Ａ」）とポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子（「遺伝子Ｂ」）とを共発現させることによって、ユビキノン１０産生細胞におけるユビキノン１０産生能を向上させるものである。

新規遺伝子（「遺伝子Ａ」）
先ず、新規遺伝子について説明する。本発明に係る新規遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である。

ここで、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、従来機能未知であり、本願発明によって初めてユビキノンの生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードする遺伝子として同定されたものである（後述の実施例参照）。例えば、サッカロマイセス・セルビシエから単離された新規遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含んでいる。

本発明に係る新規遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に一致しないアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、相同タンパク質と称する。）であっても、ユビキノン生合成に関与する機能を有するタンパク質をコードするものであればよい。

相同タンパク質としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。複数のアミノ酸とは、２〜３０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸を意味する。特に、欠失、置換若しくは付加するアミノ酸は、本タンパク質におけるユビキノン生合成活性に関与する領域を除く領域のアミノ酸であることが好ましい。

相同タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、サッカロマイセス・セルビシエ以外の真核細胞から単離することができる。サッカロマイセス・セルビシエ以外の真核細胞としては、酵母細胞、例えばキャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)。糸状菌細胞、例えばポドスポラ・アンセリナ(Podospora anserina)。昆虫細胞、例えばドロソフィラ・メラノガスター(Dorosophila melanogaster)。線虫細胞、例えばセノラブディティス・エレガンス(Caenorhabitis elegans)。植物細胞、例えばアラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)。魚細胞、例えばゼブラフィッシュ。両生類細胞、例えばアフリカツメガエル。鳥類細胞、例えばニワトリ。爬虫類細胞、例えばヘビ。哺乳類細胞、例えばヒト、サル、ウサギ、イヌ、ハムスター、マウス、ラット。および、これらの細胞から樹立された細胞株、例えばHeLa細胞、VELO細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、MDCK細胞を挙げることができる。

サッカロマイセス・セルビシエ以外の真核細胞から本発明に係る新規遺伝子を単離するには、例えば、対象の真核細胞に由来するcDNAライブラリーを定法に従って作製し、当該cDNAライブラリーから目的とする新規遺伝子をスクリーニングする方法を挙げることができる。スクリーニングの際には、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計したプローブ或いはプライマーを用いることができる。当該プローブを用いてスクリーニングする際には、ストリンジェントな条件で当該プローブとハイブリダイズするcDNAを選抜する。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。より具体的にストリンジェントな条件は、例えば、ナトリウム濃度が300〜2000mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が40〜75℃、好ましくは55〜65℃での条件をいう。

換言すれば、本発明に係る新規遺伝子は、配列番号１で表す塩基配列からなるDNAを含むものに限定されず、例えば、配列番号１で表される塩基配列と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子（以下、相同型新規遺伝子と称する。）も含まれる。

相同型新規遺伝子としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子を挙げることができる。複数の塩基とは、２〜６０個の塩基、好ましくは２〜４０個の塩基、より好ましくは２〜２０個の塩基を意味する。特に、欠失、置換若しくは付加する塩基は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を改変しないものであっても良いし、改変するものであっても良い。欠失、置換若しくは付加する塩基としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を改変する場合にはユビキノン生合成活性に関与する領域を除く領域のアミノ酸のコード領域であることが好ましい。

さらに、相同型新規遺伝子としては、配列番号１で表される塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子を挙げることができる。ここで相同性とは、例えば、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる値である。

さらにまた、本発明に係る新規遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列を含むDNAに変異を導入することで作製される変異型の遺伝子も含まれる。なお、DNAに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（TaKaRa社製））などを用いて、あるいはTaKaRa社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて変異を導入することができる。

相同タンパク質及び相同型新規遺伝子並びに変異型の遺伝子において、ユビキノン生合成に関与する機能とは、具体的に、イソペンテニル二リン酸を出発物質として最終的にユビキノンを合成する過程に含まれる化学反応に直接的に又は間接的に関与し、当該反応を正に制御する機能を意味する。したがって、ある遺伝子が本発明に係る新規遺伝子に含まれるか否かは、当該検査対象の遺伝子を発現、もしくは機能的に破壊した細胞株を作製し、当該細胞株におけるユビキノン生合成を検討することによって判定することができる。

ところで、本発明に係る新規遺伝子を所望のベクターに挿入してなる組換えベクターも本発明に含まれる。組換えベクターは、宿主中に導入可能なものであれば特に限定されず、また、宿主中で複製不可能なものや複製可能なもののいずれも含まれる。例えば、本発明に係る新規遺伝子を挿入するためのベクターとしては、ベクター自体に宿主中での複製能を持たず、ゲノムDNA挿入目的に用いられるDNA、例えば酵母ゲノム挿入用のpRS404やトランスポゾン配列を含むベクターなどが挙げられる。また、本発明に係るDNAを挿入するためのベクターとしては、宿主中で自律複製可能なベクター、例えばプラスミドベクター、シャトルベクター、ウイルスベクター(ファージベクター)などが挙げられる。

プラスミドベクターとしては、E. coli由来のプラスミド（例えばpET30bなどのpET系、pBR322及びpBR325などのpBR系、pUC118、pUC119、pUC18及びpUC19などのpUC系、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、pYES2などのYEp系、YCp50、pRS414などのYCp系等)などが挙げられる。またファージベクターとしては、λファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、カリフラワーモザイクウイルスなどの植物ウイルス、又はバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。

本発明に係る組換えベクターは、さらに転写プロモーター、リボソーム結合配列、転写ターミネーター及び本発明に係るDNAにより構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。転写プロモーターとしては、例えば恒常発現型プロモーター又は誘導発現型プロモーターが挙げられる。ここで、恒常発現型プロモーターとは、主要代謝経路に関わる遺伝子の転写プロモーターを意味し、どの生育条件でも転写活性を有するプロモーターである。一方、誘導発現型プロモーターとは、特定の生育条件で転写活性があり、その他の生育条件では活性が抑えられるプロモーターを意味する。本発明に係るDNAコンストラクトに含むことができる転写プロモーターは、本発明に係るDNAコンストラクトが導入される宿主細胞中で活性を持つものであればいずれを用いてもよい。例えば、宿主細胞が酵母である場合には、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、TDH3(GAP)プロモーター、ADH1プロモーター、TEF2プロモーター等を用いることができる。また、宿主細胞がE. coliである場合には、trp、lac、trc、tacなどのプロモーターを用いることができる。

また、転写ターミネーターは、本発明に係る新規遺伝子が導入される宿主細胞中で活性を持つものであればいずれの遺伝子に由来する転写ターミネーターを用いてもよい。例えば宿主細胞が酵母である場合には、ADH1ターミネーター、CYC1ターミネーター等を用いることができる。また、宿主細胞がE. coliである場合には、rrnBターミネーターを用いることができる。

さらに、本発明に係る組換えベクターは、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカーなどを含むことができる。なお、選択マーカーとしては、URA3、LEU2、TRP1、HIS3などの栄養非要求性の表現型を指標とするマーカー遺伝子や、Amp^r、Tet^r、Cm^r、Km^r、AUR1-C等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。

また、本発明に係る組換えベクターは、宿主細胞がバクテリアである場合には、遺伝子発現のため、効率的翻訳のためのリボソーム結合部位として開始コドン上流にSD配列 (5'-AGGAGG-3'で代表される)を組み込むこともできる。

ベクターに新規遺伝子を挿入するには、当該新規遺伝子を含むDNA断片を適当な制限酵素で切断し、次いで適当なベクターDNAの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法が用いられる。

本発明に係る組換えベクターを用いて形質転換体を得ることができる。宿主細胞としては、特に限定されるものではなく、酵母などの単細胞真核微生物を含む真菌、原核生物(バクテリアとアーキア)、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。

真菌としては、変形菌類(Myxomycota)、藻菌類(Phycomycetes)、子嚢菌類(Ascomycota)、担子菌類(Basidiomycota)、不完全菌類(Fungi Imperfecti)が挙げられる。なお、真菌として、工業上利用上重要な酵母が良く知られている。そこで、宿主細胞として、例えば、子嚢菌類の子嚢菌酵母、担子菌類の担子菌酵母又は不完全菌類の不完全菌酵母等を用いることができる。より具体的には、子嚢菌酵母、特に、S. cerevisiae、クルヴェロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)又はピキア・パストリス(Pichia pastoris)等の出芽酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)等の分裂酵母が挙げられる。酵母の株は、プレニルアルコールを生産することができる限り特に限定されるものではない。S. cerevisiaeの場合、例えばA451、YPH499、YPH500、W303-1A、W303-1B、ATCC28382などが挙げられる。

バクテリアとしては、大腸菌(Escherichia coli）等のエシェリキア属、バシラス・サティラス(Bacillus subtilis)等のバシラス属、又はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)やアグロバクテリウム・リゾジェネス(Agrobacterium rhizogenes)等のアグロバクテリウム属、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacerium glutamicum)等のコリネバクテリウム属、ラクトバシラス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)等のラクトバシラス属、アクチノマイセス属(Actinomyces)やストレプトマイセス属(Storeptomyces)等の放線菌類(Actinomycetes)が挙げられる。

また、アーキアとしては、メタノバクテリウム属(Metanobacterium)などのメタン生産菌、ハロバクテリウム属(Halobacterium)などの好塩菌、スルフォロバス属(Sulfolobus)等の好熱好酸性菌が挙げられる。

本発明に係る細胞を得るためには、上記宿主細胞のいずれも用いることができるが、特に酵母、その中でも出芽酵母、特にS. cerevisiaeが好ましい。

ポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子（「遺伝子Ｂ」）
次に、ポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子は、サッカロマイセス・セルビシエにおいてCoq2遺伝子と呼称され、サッカロマイセス・セルビシエにおけるユビキノン生合成経路に関与している。Coq2遺伝子は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている。

Coq2遺伝子としては、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものに限定されず、配列番号３で表されるアミノ酸配列における1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であっても良い。

複数のアミノ酸とは、２〜３０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸を意味する。特に、欠失、置換若しくは付加するアミノ酸は、本タンパク質におけるポリプレニルトランスフェラーゼ活性に関与する領域を除く領域のアミノ酸であることが好ましい。

ポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子としては、サッカロマイセス・セルビシエ由来のCoq2遺伝子に限定されず、各種細胞由来のCoq2遺伝子に相当する遺伝子を使用することができる。例えば、アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)のAtPP1遺伝子(AB052553)、バチルス・ファーマス(Bacillus firmus)のUbiA遺伝子(U61168)、ブルセラ・スイス(Brucella suis)のUbiA遺伝子(AE014352)、セノラブディティス・エレガンス(Caenorhabitis elegans)のF57B9.4遺伝子(U13876)、ドロソフィラ・メラノガスター(Dorosophila melanogaster)のCG9613遺伝子(AE003678)、大腸菌(Escherichia coli)のUbiA遺伝子(M96268)、ヒト(Homo sapiens)のUbiA遺伝子(BC008804)、マウス(Mus)のUbiA遺伝子(AK009092)、オリザ・サティバ(Oriza sativa)のPGT-2遺伝子(AP004661)、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)のUbiA遺伝子(AE004947)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)のppt1遺伝子(AB053168)を挙げることができる。なお、括弧内の数字はGenBankへのアクセッション番号を示す。

ユビキノン１０産生細胞
ユビキノン１０産生細胞は、ユビキノン１０産生能を本来的に備える細胞系統を使用してもよいが、ユビキノン１０産生能を本来的に有しない細胞系統にユビキノン１０産生能を付与した細胞系統を使用してもよい。例えば、サッカロマイセス・セルビシエ等の酵母は、ユビキノン６を産生するがユビキノン１０を本来的に産生しない。しかしながら、酵母における、ユビキノンのイソプレン単位が６である側鎖を作る酵素の遺伝子を破壊するとともに、イソプレン単位が１０である側鎖を作る酵素を導入することによって、ユビキノン１０を産生する酵母を作出することができる。

ここで、イソプレン単位が１０である側鎖を作る酵素としては、例えば、パラコッカス・デニトリフィカンス由来のデカプレニル二リン酸合成酵素（特開平１１−１７８５９０号公報参照）を使用することができる。この他にも、イソプレン単位が１０である側鎖を作る酵素をコードする遺伝子としては、アグロバクテリウム(Agrobacterium sp.)のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子(特開2000-228987号公報)、アスペルギルス・クラバタス(Asprergillus clavatus)のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子(特開2002-191367号公報)、ブレオマイセス・アルバス(Bulleomyces albus)のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子(特開2002-345469号公報)、グルコノバクター・サブオキシダンス(Gliconobacter suboxydans)のddsA遺伝子(AB006850)、ヒト(Homo Sapiens)のTrans-prenyltransferase遺伝子(AF118395)、ロイコスポリディウム・スコティ(Leucosporidium scotii)のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子(特開2002-191367号公報)、ロドバクター・カプスラタス(Rhodobacter capsulatus)のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子(特開平11-056372号公報)、サイトエラ・コンプリカータ(Saitoella complicata)のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子(特開2001-061478号公報)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)のdps1遺伝子(D84311)を使用することができる。なお、括弧内の数字はGenBankへのアクセッション番号或いは関連する公報を示す。

これらイソプレン単位が１０である側鎖を作る酵素を酵母内で機能的に発現させるためには、例えば、当該酵素のN末端にミトコンドリア移行シグナルを付加した融合タンパク質として発現させることが好ましい。すなわち、当該酵素をコードする遺伝子の上流にミトコンドリア移行シグナルをコードする配列を付加し、融合タンパク質をコードする遺伝子を構築する。そして、当該融合タンパク質をコードする遺伝子をユビキノン１０産生酵母に導入することによって、イソプレン単位が１０である側鎖を作る酵素を当該酵母内で機能的に発現させることができる。

ミトコンドリア移行シグナルとしては、例えば、特開平９−１７３０７６号公報に開示されている配列を使用することができる。また、ミトコンドリア移行シグナルとしては、これに限定されず、例えば、上述したCoq2遺伝子がコードするポリプレニルトランスフェラーゼにおけるN末端側３５アミノ酸残基からなるポリペプチド（Coq2(N35)）、サッカロマイセス・セルビシエのユビキノン生合成に関与するメチルトランスフェラーゼ遺伝子（Coq3遺伝子）によりコードされるメチルトランスフェラーゼにおけるN末端側３６アミノ酸残基からなるポリペプチド（Coq3(N36)）を使用することができる。

ユビキノン１０産生能を本来的に有しない細胞系統としては、サッカロマイセス・セルビシエ以外に、例えば、細菌細胞、例えばバチルス属(bacillus属)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium属)、エシェリキア属(Escherichia属)、ヘリコバクター属(Helicobacter属)、ミクロコッカス属(Micrococcus属)、サルモネラ属(Salmonella属)、シネコシスティス属(Synechocystis属)を使用することができる。また、好熱性菌、例えばスルホロバス属(Sulfolobus属)を使用することができる。さらに、酵母細胞、例えばハンセヌラ属(Hansenula属)を使用することができる。さらに、線虫細胞、例えばセノラブディティス・エレガンス(Caenorhabitis elegans)を使用することができる。さらに、植物細胞、例えばタバコ(Tabacco)を使用することができる。さらに、動物細胞、例えばマウス(Mus)等を使用することができる。

一方、ユビキノン１０産生能を本来的に備える細胞系統としては、ロドトルラ属(Rhodotorula属)、ロイコスポリディウム属(Leucosporidium属)、キャンディダ属(Candida属)、トルロプシス属(Torulopsis属)、クリプトコッカス属(Cryptococcus属)、ロドスポリディウム属(Rhodosporidium属)、シゾサッカスマイセス属(Shizosaccharomyces属)、ヤフリナ属(Japhrina属)、スポロボロマイセス属(Sporobolomyces属)、ウスティラゴ属(Usitilago属)、ブレオマイセス属(Bulleromyces属)、スポリディオボラス属(Sporidiobolus属)、オオスポリディウム属(Oosporidium属)等の酵母細胞を使用することができる。また、アスペルギルス属(Aspergillus属)、サイトエラ属(Saitoella属)等の子嚢菌細胞を使用することができる。さらに、ロドバクター属(Rhodobacter属)、ロドミクロビウム属(Rhodomicrobium属)、ロドピラ属(Rhodopila属)、ロドスピリラム属(hodospirillum属)、ロドシュードモナス属(Rhodopseudomonas属)等の光合成細菌細胞を使用することができる。さらに、グルコノバクター属(Gluconobacter属)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium属)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium属)、シュードモナス属(Pseudomonas属)等の細菌細胞を使用することができる。さらに、ヒト等の動物細胞を使用することができる。ユビキノン１０産生能を本来的に備える細胞系統の場合には、当該細胞系統に含まれる細胞株を、ユビキノン１０産生細胞としてそのまま使用することができる。

ユビキノン１０の製造
本発明に係るユビキノン１０の製造方法では、上記ユビキノン１０産生細胞内において上記新規遺伝子及び上記ポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を共発現させ、その後、ユビキノン１０産生細胞を培養し、培養物からユビキノン１０を回収する。

本方法において共発現とは、ユビキノン１０産生細胞内における狭い領域で、上記新規遺伝子及び上記ポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子が恒常的に発現することを意味する。例えば、新規遺伝子及びポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子をユビキノン１０産生細胞内で発現しうる状態で有する発現ベクターを構築し、当該ベクターを用いてユビキノン１０産生細胞を形質転換する方法が挙げられる。両遺伝子は、それぞれ異なる発現ベクターに組み込まれ、これら発現ベクターを用いて形質転換を行っても良い。

また、ユビキノン１０産生細胞が本来的にポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を有している場合には、ポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター領域等を改変して、ポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現させ、新規遺伝子と共発現するようにしても良い。

ユビキノン１０産生細胞の培地及び培養条件としては、特に限定されず、ユビキノン１０産生細胞の基となる細胞系統及び栄養要求特性等を考慮して適宜設定することができる。また、ユビキノン１０の産生は、公知の手法によって確認することができる。例えば、Hagermanらの方法(Analytical Biochemistry 296、 141-143 (2001))等を適用してユビキノン１０の産生を確認することができる。

新規遺伝子及びポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を共発現するユビキノン１０産生細胞を培養した後、培養物からユビキノン１０を回収することができる。ここで、培養物とは、培地及び培養されたユビキノン１０産生細胞を意味する。ユビキノン１０を回収する際には、主として培養されたユビキノン１０産生細胞を集菌し、集菌した細胞を粉砕して定法に従って回収することができる。

具体的に、ユビキノン１０の回収方法としては、培養液から、有機溶媒による抽出、各種クロマトグラフィー、結晶化等、通常の有機合成化学で用いられる採取方法、例えば、特開昭56-124390号公報、特開昭56-154994号公報、特開昭56-154995号公報、特開昭56-154996号公報、特開昭57-102192号公報、特開昭58-89193号公報、特開昭58-146285号公報、特開昭61-25490号公報、特開昭61-141891号公報、特開昭63-102691号公報に記載の方法を用いて、ユビキノン１０を採取することができる。

即ち、培養後の菌液にメタノールもしくはエタノール、水酸化ナトリウムおよびピロガロールを添加し、60から90℃で1〜2時間還流過熱後、液相をn-ヘキサン、石油エーテル等の有機溶媒で抽出する。有機溶媒相を水洗し、脱水処理後濃縮する。濃縮物をシリカゲル、アルミナ等を用いる吸着クロマトグラフィーに供し、ベンゼンなどで展開する。ユビキノンを含む画分を濃縮凝固し、エタノール可溶部分を冷却放置すると黄色のユビキノンの粗結晶が得られる。更に再結晶を繰り返すとユビキノンの純粋な結晶が得られる。また、包接化合物による分離、分子蒸留を行うことも効果的である。

本発明に係るユビキノン１０の製造方法によれば、ユビキノン１０を非常に効率よく製造することができる。すなわち、本発明に係るユビキノン１０の製造方法では、ユビキノン１０産生細胞をそのまま使用してユビキノン１０を生産した場合と比較して、ユビキノン１０の生産量を大幅に増加させることができる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において使用した培地等の組成は以下の通りである。

YPD培地
グルコース（和光純薬社製） 20g/L
ポリペプトン（Difco社製） 20g/L
酵母エキス（Difco社製） 10g/L

YPDA培地
グルコース（和光純薬社製） 20g/L
ポリペプトン（Difco社製） 20g/L
酵母エキス（Difco社製） 10g/L
寒天（フナコシ社製） 20g/L

ＹＰＧＡ培地
グリセロール（ナカライテスク社製） 30g/L
ポリペプトン（Difco社製） 20g/L
酵母エキス（Difco社製） 10g/L
寒天（フナコシ社製） 20g/L

SD(-URA)培地
SD Medium-URA(Q-BIOGENE社製) 27.4g/L

SDA(-URA)培地
SD Medium-URA(Q-BIOGENE社製) 27.4g/L
寒天（フナコシ社製） 20g/L

SD(-HIS、-URA)培地
SD Medium-HIS-URA(Q-BIOGENE社製) 27.5g/L

SDA(-HIS、-URA)培地
SD Medium-HIS-URA(Q-BIOGENE社製) 27.5g/L
寒天（フナコシ社製） 20g/L

SD(-URA、-HIS、-TRP)培地
SD Medium-HIS-TRP-URA(Q-BIOGENE社製) 27.4g/L

SDA(-URA、-HIS、-TRP)培地
SD Medium-HIS-TRP-URA(Q-BIOGENE社製) 27.4g/L
寒天（フナコシ社製） 20g/L

SDA(-URA、-HIS、-TRP、-LEU)培地
SD Medium-HIS-LEU-TRP-URA(Q-BIOGENE社製) 27.4g/L
寒天（フナコシ社製） 20g/L

SC-Gal(-URA、-HIS、-TRP)/0.1mMPHB培地
ガラクトース（ナカライテスク社製） 20g/L
イーストナイトロジェンベース（Difco社製） 1.7g/L
硫酸アンモニウム（ナカライテスク社製） 5g/L
CSM-HIS-TRP-URA(Q-BIOGENE社製) 0.7g/L
パラヒドロキシ安息香酸（ナカライテスク社製） 0.0138g/L

SC-Gal(-URA、-HIS、-TRP、 -LEU)/0.1mMPHB培地
ガラクトース（ナカライテスク社製） 20g/L
イーストナイトロジェンベース（Difco社製） 1.7g/L
硫酸アンモニウム（ナカライテスク社製） 5g/L
CSM-HIS-LEU-TRP-URA(Q-BIOGENE社製) 0.6g/L
パラヒドロキシ安息香酸（ナカライテスク社製） 0.0138g/L

702培地
ポリペプトン（Difco社製） 10g/L
酵母エキス（Difco社製） 2g/L
硫酸マグネシウム・７水和物（ナカライテスク社製） 1g/L

本実施例では、実施例１で作製したベクター（pRS433GAP）を用いて、実施例２でユビキノン１０産生酵母を作製した。次に、実施例３では、新規遺伝子（YLR201C）を有するベクター及びポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子（Coq2遺伝子）を有するベクターを作製するとともに、実施例２で作製したユビキノン１０産生酵母にこれらベクターを単独で導入した。次に、実施例４では、実施例３で作製した形質転換体におけるユビキノン１０産生能を検討した。次に、実施例５では、実施例２で作製したユビキノン１０産生酵母に実施例３で作製した２つのベクターを導入した。次に、実施例６では、実施例５で作製した形質転換体におけるユビキノン１０産生能を検討した。

〔実施例１〕ｐＲＳ４３３ＧＡＰベクターの作製
（１）大腸菌−酵母（サッカロマイセス・セレビジエ）・シャトルベクター
ストラタジーン社よりプラスミドｐＲＳ４０３を購入した。インビトロジェン社からプラスミドｐＹＥＳ２を購入した。

（２）染色体ＤＮＡ
酵母の染色体ＤＮＡは、「Genとるくん」（宝酒造社製）を購入し、添付のプロトコルに従って酵母ＹＰＨ４９９（ストラタジーン社から入手）から調製した。大腸菌からのプラスミドＤＮＡは、ＷｉｚａｒｄＰｕｒｅＦｅｃｔｉｏｎＰｌａｓｍｉｄＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて調製した。

（３）ｐＲＳベクターへＣＹＣ１ｔ断片の挿入
ＣＹＣ１転写ターミネーター（ＣＹＣ１ｔ）断片はＰＣＲで調製した。ｐＹＥＳ２を鋳型とし、ＸｈｏＩ−Ｔｃｙｃ１ＦＷ：５‘−ＴＧＣＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＡＴＴＡＧ−３’ （配列番号２１）とＡｐａＩ−Ｔｃｙｃ１ＲＶ：５‘−ＣＡＴＴＡＧＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＴＴＣＧ−３’（配列番号２２）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ(プロメガ社製)を用い、反応液にはＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー(ストラタジーン社製)を加えた。ＰＣＲ条件は９５℃で２分の変性反応後、９５℃で４５秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回実施し、ＣＹＣ１ｔ断片の増幅を行った。増幅した遺伝子断片は制限酵素ＸｈｏＩおよびＡｐａＩ（宝酒造社製）で切断後、ｐＲＳ４０３ベクターのＸｈｏＩ−ＡｐａＩ部位にクローニングした。このようにしてｐＲＳ４０３Ｔｃｙｃベクターを作製した。

（４）転写プロモーターの調製
ＰＣＲにより転写プロモーターを含むＤＮＡ断片を調製した。酵母染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＳａｃＩ−Ｐｔｄｈ３ＦＷ：５‘−ＣＡＣＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＴＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡ−３’ （配列番号２３）とＳａｃＩＩ−Ｐｔｄｈ３ＲＶ：５‘−ＣＴＣＴＣＣＧＣＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣ−３’（配列番号２４）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(宝酒造社製)を用い、反応液にはＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー(ストラタジーン社製)を加えた。ＰＣＲ条件は９５℃ ２分の変性反応後、９５℃ ４５秒、６０℃ １分、７２℃ ２分のサイクルを３０回実施し、増幅を行った。増幅した遺伝子断片を制限酵素ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩ（宝酒造社製）で切断後、アガロースゲル電気泳動でDNA断片を精製しＴＤＨ３ｐとした。

（５）２μ ＤＮＡ複製開始領域の調製
ｐＹＥＳ２をＳｓｐＩとＮｈｅＩ（宝酒造社製）で切断後、２μ ＤＮＡ複製開始点（２μ ｏｒｉ）を含む１．５ｋｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化し、このDNA断片を２μＯｒｉＳＮとした。

（６）ｐＲＳ４３３ＧＡＰベクターの作製
ｐＲＳ４０３ＴｃｙｃをＢＡＰ（ｂａｃｔｅｒｉａｌａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：宝酒造社製）処理したＮａｅＩ部位に２μＯｒｉＳＮを挿入し、大腸菌ＳＵＲＥ２に形質転換した後、プラスミドＤＮＡを調製した。これを、ＤｒａＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ又は、ＰｓｔＩ及びＰｖｕＩＩにより切断後、アガロースゲル電気泳動し、２μ Ｏｒｉの挿入とその向きをチェックした。作製したｐＲＳ４０３ＴｃｙｃにｐＹＥＳ２と同じ向きで２μ Ｏｒｉが挿入されたプラスミドをｐＲＳ４３３Ｔｃｙｃ２μ Ｏｒｉとした。

ｐＲＳ４３３Ｔｃｙｃ２μ ＯｒｉのＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ部位に、転写プロモーターを含む断片ＴＤＨ３ｐ（ＧＡＰｐ）を挿入しＤＮＡをクローン化した。その結果ｐＲＳ４３３ＧＡＰが得られた。作製したｐＲＳ４３３ＧＡＰを図１に示す。

〔実施例２〕ユビキノン１０生産酵母の作製
（１）ヘキサプレニル二リン酸合成酵素遺伝子（ＹＢＲ００３Ｗ）破壊用遺伝子断片の作製
まず、酵母の持つヘキサプレニル二リン酸合成酵素遺伝子Ｃｏｑ１（ＹＢＲ００３Ｗ）を破壊することを目的とした。酵母ＹＰＨ４９９（ストラタジーン社より入手）をＹＰＤ培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から染色体ＤＮＡを単離した。単離には「Ｇｅｎとるくん」（宝酒造社製）を使用した。

このようにして単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＹＢＲ００３Ｗ／Ｆ：５‘−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧ−３’（配列番号２５）とＹＢＲ００３Ｗ／Ｒ：５‘−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＴＡＧＴＡＴ−３’（配列番号２６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用い、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＭＰ（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ条件は９４℃で２分の変性反応後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で５０秒のサイクルを２５回実施し、ＹＢＲ００３Ｗ（配列番号１）の増幅を行った。増幅した遺伝子断片は０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてゲルから精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２Ｔ−ベクター（ノバジェン社製）にクローニングした。

得られたＹＢＲ００３Ｗ／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２を制限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＶ（宝酒造社製）によって切断し、この間に、両端にＸｂａＩおよびＳｍａＩサイトを有するＵＲＡ３遺伝子を挿入した。このようにしてｙｂｒ００３ＷΔＵＲＡ３／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２を作製した（図２）。

次に、ｙｂｒ００３ＷΔＵＲＡ３／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２を鋳型とし、ＹＢＲ００３Ｗ／Ｆ：５‘−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧ−３’（配列番号２５）とＹＢＲ００３Ｗ／Ｒ：５‘−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＴＡＧＴＡＴ−３’（配列番号２６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤｐｌｕｓを用いた。ＰＣＲ条件は９４℃で２分の変性反応後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分のサイクルを２５回実施しｙｂｒ００３ＷΔＵＲＡ３断片の増幅を行った。このようにしてＹＢＲ００３Ｗ破壊用遺伝子断片を作製した。

（２）ＹＢＲ００３Ｗ欠損酵母の作製
ＹＢＲ００３Ｗ遺伝子の破壊は１ステップ遺伝子破壊法(大嶋泰治ら蛋白質核酸酵素Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．１４２５２３−２５４１（１９９０）)によって行った。まず、酵母ＹＰＨ４９９（ストラタジーン社より入手）をＹＰＤ培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体からＦｒｏｚｅｎ−ＥＺＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩキット(ザイモリサーチ社製)を用いてコンピテントセルを作製した。作製したコンピテントセル１０μＬに（１）で作製したＹＢＲ００３Ｗ破壊用遺伝子断片ｙｂｒ００３ＷΔＵＲＡ３１μｇを加えた後、キット付属の手順書に従い調製した菌液をＳＤＡ（−ＵＲＡ）培地に塗布した。菌液を塗布したＳＤＡ（−ＵＲＡ）培地は菌がコロニーを形成するまで４日間３０℃で静置培養した。このようにしてＹＢＲ００３Ｗ欠損株：Ｙ０３Ｗｄ株を作製した。

Ｙ０３Ｗｄ株は、ＹＰＤＡ培地では生育可能であるが、ＹＰＧＡ培地では生育できない呼吸欠損の表現型を示した。

（３）デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子（ＤＰＳ）のサブクローニング
パラコッカス・デニトリフィカンスＩＦＯ１４９０７株（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター生物遺伝資源センターより入手）を７０２培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から染色体ＤＮＡを単離した。単離にはＤＮｅａｓｙキット（キアゲン社製）を使用した。

このようにして単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＤＰＳ／Ｆ：５‘−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＧ−３’（配列番号２７）とＤＰＳ／Ｒ：５‘−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＧＣＧＡＧ−３’（配列番号２８）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液にはＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ２ＰＣＲＫｉｔ（ＢＤバイオサイエンス社製）を用い、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＭＰ（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ条件は９４℃で３分の変性反応後、９４℃で３０秒、６８℃で１分のサイクルを３０回実施し、デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子（ＤＰＳ）（特開平１１−１７８５９０号後方参照）の増幅を行った。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動に供した後、増幅したＤＰＳ遺伝子断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてゲルから精製した。精製したＤＰＳ遺伝子はｐＴ７Ｂｌｕｅ−２Ｔ−ベクターにクローニングした。

このようにして作製したＤＰＳ／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２の塩基配列を決定した。塩基配列決定には、Ｔ７：５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号２９）もしくはＵ１９：５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ−３’（配列番号３０）をプライマーとして、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、ＤＮＡシークエンサー３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定した。決定した塩基配列を配列番号３に、塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。

次にＤＰＳ／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ（宝酒造社製）によって切断した後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、両端にＢａｍＨＩおよびＳａｌＩサイトを有するＤＰＳ遺伝子断片を分離し、当該断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてゲルから精製した。精製した当該断片を発現ベクターｐＲＳ４３３ＧＡＰ（実施例１に記載）のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩサイトに挿入し、ＤＰＳ／ｐＲＳ４３３ＧＡＰベクターを作製した。

（４）ミトコンドリア移行シグナルをコードする遺伝子のサブクローニング
酵母ＹＰＨ４９９（ストラタジーン社製）をＹＰＤ培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から染色体ＤＮＡを単離した。単離には「Ｇｅｎとるくん」（宝酒造社製）を使用した。

このようにして単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｃｏｑ１／Ｆ：５‘−ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧ−３’（配列番号３１）とＣｏｑ１／Ｒ１５９：５‘−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＧＡＧＡＣＴＡＡＴＧＡＴＡＴＧ−３’（配列番号３２）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用い、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＭＰ（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ条件は９４℃で２分の変性反応後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２０秒のサイクルを２５回実施し、Ｃｏｑ１のミトコンドリア移行シグナルをコードする遺伝子断片Ｃｏｑ１（Ｎ５３）の増幅を行った。増幅した遺伝子断片は２％アガロースゲル電気泳動に供した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてゲルから精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２Ｔ−ベクター（ノバジェン社製）にクローニングした。

このようにして作製したＣｏｑ１（Ｎ５３）／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２の塩基配列を決定した。塩基配列決定には、Ｔ７：５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号２９）もしくはＵ１９：５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ−３’（配列番号３０）をプライマーとして、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、ＤＮＡシークエンサー３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定した。決定した塩基配列を配列番号５に、塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号６に示す。

次に、染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｃｏｑ２／Ｆ：ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＴＴＴＡＴＴＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣ−３‘（配列番号３３）とＣｏｑ２／Ｒ１０５：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＡＴＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣ−３‘（配列番号３４）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用い、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＭＰ（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ条件は９４℃で２分の変性反応後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２０秒のサイクルを２５回実施し、Ｃｏｑ２のミトコンドリア移行シグナルをコードする遺伝子断片Ｃｏｑ２（Ｎ３５）の増幅を行った。増幅した遺伝子断片は２％アガロースゲル電気泳動に供した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてゲルから精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２Ｔ−ベクター（ノバジェン社製）にクローニングした。

このようにして作製したＣｏｑ２（Ｎ３５）／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２の塩基配列を決定した。塩基配列決定には、Ｔ７：５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号２９）もしくはＵ１９：５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ−３’（配列番号３０）をプライマーとして、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、ＤＮＡシークエンサー３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定した。決定した塩基配列を配列番号７に、塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号８に示す。

更に、染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｃｏｑ３／Ｆ：５‘−ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＴＡＧ−３’（配列番号３５）とＣｏｑ３／Ｒ１０８：５‘−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＣＡＴＣＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴＧＣＡ−３’（配列番号３６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用い、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＭＰ（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ条件は９４℃ ２分の変性反応後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２０秒のサイクルを２５回実施し、Ｃｏｑ３のミトコンドリア移行シグナルをコードする遺伝子断片Ｃｏｑ３（Ｎ１０８）の増幅を行った。増幅した遺伝子断片は２％アガロースゲル電気泳動に供した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてゲルから精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２Ｔ−ベクター（ノバジェン社製）にクローニングした。

このようにして作製したＣｏｑ３（Ｎ３６）／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２の塩基配列を決定した。塩基配列決定には、Ｔ７：５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号２９）もしくはＵ１９：５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ−３’（配列番号３０）をプライマーとして、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、ＤＮＡシークエンサー３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定した。決定した塩基配列を配列番号９に、塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。

（５）ＤＰＳ発現ベクターの作製
（４）で作製したＣｏｑ１（Ｎ５３）／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ベクター、Ｃｏｑ２（Ｎ３５）／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ベクターおよびＣｏｑ３（Ｎ３６）／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ベクターをそれぞれ制限酵素ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）によって切断した後、２％アガロースゲル電気泳動を行い、両端にＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩサイトを有するＣｏｑ１（Ｎ５３）、Ｃｏｑ２（Ｎ３５）およびＣｏｑ３（Ｎ３６）遺伝子断片を分離し、当該断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてゲルから精製した。精製した当該断片をＤＰＳ／ｐＲＳ４３３ＧＡＰベクターのＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、Ｃｏｑ１（Ｎ５３）−ＤＰＳ／ｐＲＳ４３３ＧＡＰベクター、Ｃｏｑ２（Ｎ３５）―ＤＰＳ／ｐＲＳ４３３ＧＡＰベクターおよびＣｏｑ３（Ｎ３６）―ＤＰＳ／ｐＲＳ４３３ＧＡＰベクターを作製した。その結果を図３Ａ，Ｂ及びＣに示す。また、Ｃｏｑ１（Ｎ５３）−ＤＰＳの塩基配列を配列番号１１に示し、塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号１２に示す。Ｃｏｑ２（Ｎ３５）―ＤＰＳの塩基配列を配列番号１３に示し、塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号１４に示す。Ｃｏｑ３（Ｎ３６）―ＤＰＳの塩基配列を配列番号１５に示し、塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号１６に示す。

（６）ユビキノン１０生産酵母の作製
（２）で作製したＹ０３Ｗｄ株をＳＤ（−ＵＲＡ）培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩキット(ザイモリサーチ社製)を用いてコンピテントセルを作製した。作製したコンピテントセル１０μＬにＣｏｑ１（Ｎ５３）−ＤＰＳ／ｐＲＳ４３３ベクター、Ｃｏｑ２（Ｎ３５）―ＤＰＳ／ｐＲＳ４３３ベクターおよびＣｏｑ３（Ｎ３６）―ＤＰＳ／ｐＲＳ４３３ベクターをそれぞれ１μｇ加え、ＳＤＡ（−ＨＩＳ、 −ＵＲＡ）培地に塗布した。菌液を塗布したＳＤＡ（−ＨＩＳ −ＵＲＡ）培地は菌がコロニーを形成するまで４日間３０℃で静置培養した。このようにしてユビキノン１０生産酵母：Ｙ１Ｎ１４９０７，Ｙ２Ｎ１４９０７およびＹ３Ｎ１４９０７株を作製した。

各ベクターを導入する前のＹ０３Ｗｄ株がＹＰＧＡ培地で生育できない呼吸欠損の表現系を示したのに対し、Ｙ１Ｎ１４９０７，Ｙ２Ｎ１４９０７およびＹ３Ｎ１４９０７株はいずれもＹＰＧＡ培地で生育可能な、呼吸機能の回復した表現型を示した。

〔実施例３〕Ｃｏｑ２、ＹＬＲ２０１Ｃ導入酵母の作製
（１）Ｃｏｑ２発現ベクターの作製
酵母ＹＰＨ４９９をＹＰＤ培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から染色体ＤＮＡを単離した。単離には「Ｇｅｎとるくん」（宝酒造社製）を使用した。

このようにして単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｃｏｑ２／Ｆ／ＳａｃＩＩ：５‘−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＡＴＧＴＴＴＡＴＴＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣ−３’（配列番号３７）とＣｏｑ２／Ｒ／ＸｈｏＩ：５‘−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＡＧＴＣＴＣＡＡＧ−３’（配列番号３８）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用い、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＭＰ（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ条件は９４℃で２分の変性反応後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分３０秒のサイクルを２５回実施し、Ｃｏｑ２遺伝子の増幅を行った。このようにして増幅したＰＣＲ増幅産物を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてＣｏｑ２遺伝子断片をゲルから精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２Ｔ−ベクター（ノバジェン社製）にクローニングした。

このようにして作製したＣｏｑ２／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２の塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１７に、塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号１８に示す。塩基配列決定には、Ｔ７：５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号２９）もしくはＵ１９：５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ−３’（配列番号３０）をプライマーとして、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、ＤＮＡシークエンサー３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定し、ＰＣＲエラーのないことを確認した。

次にＣｏｑ２／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ（宝酒造社製）によって切断した後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、両端にＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩサイトを有するＣｏｑ２遺伝子断片を分離し、当該断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてゲルから精製した。精製した当該断片を発現ベクターｐＲＳ４３４ＧＡＰ（特開２００２−１９９８８３号公報及び特開２００３−０８８３６８号公報参照）のＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入し、Ｃｏｑ２／ｐＲＳ４３４ＧＡＰベクターを作製した（図４−Ａ）。

（２）Ｃｏｑ２発現ベクター導入株の作製
ユビキノン１０生産酵母：Ｙ２Ｎ１４９０７株をＳＤ（−ＵＲＡ、−ＨＩＳ）培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩキット(ザイモリサーチ社製)を用いてコンピテントセルを作製した。作製したコンピテントセル１０μＬにＣｏｑ２／ｐＲＳ４３４ＧＡＰベクター１μｇを加え、ＳＤＡ（−ＵＲＡ、−ＨＩＳ、−ＴＲＰ）培地に塗布した。菌液を塗布したＳＤＡ（−ＵＲＡ、−ＨＩＳ、−ＴＲＰ）培地は菌がコロニーを形成するまで４日間３０℃で静置培養した。このようにしてＣｏｑ２発現ベクター導入株：Ｙ２Ｎ１４９０７／２を作製した。

また、同様の方法にて、Ｃｏｑ２／ｐＲＳ４３４ＧＡＰの代わりにｐＲＳ４３４ＧＡＰを導入したＹ２Ｎ１４９０７／−を作製した。

（３）ＹＬＲ２０１Ｃ発現ベクターの作製
酵母ＹＰＨ４９９（ストラタジーン社より購入）をＹＰＤ培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から染色体ＤＮＡを単離した。単離には「Ｇｅｎとるくん」（宝酒造社製）を使用した。

このようにして単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＹＬＲ２０１Ｃ／Ｆ：５‘−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＴＧＴＣＧＣＡＡＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡ−３’（配列番号３９）とＹＬＲ２０１Ｃ／Ｒ：５‘−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＣＣＣＴＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧＡＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＣ−３’（配列番号４０）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用い、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＭＰ（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ条件は９４℃で２分の変性反応後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で５０秒のサイクルを２５回実施しＹＬＲ２０１Ｃの増幅を行った。増幅した遺伝子断片をＤＮＡ精製キット（ＭｉｎｉＥｌｕｔｅＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ、キアゲン社製）を用いて精製した後、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ベクター（ノバジェン社製）にクローニングした。

このようにして作製したＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＴ７Ｂｌｕｅの塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１９に、塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号２０に示す。塩基配列決定には、Ｔ７：５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号２９）もしくはＵ１９：５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ−３’（配列番号３０）をプライマーとして、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、ＤＮＡシークエンサー３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定し、ＰＣＲエラーのないことを確認した。

次にＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＴ７Ｂｌｕｅを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）によって切断した後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、両端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩサイトを有するＹＬＲ２０１Ｃ遺伝子断片を分離し、当該断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてゲルから精製した。精製した当該断片を発現ベクターｐＲＳ４３４ＧＡＰ（特開２００２−１９９８８３および特開２００３−０８８３６８に記載）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３４ＧＡＰベクターを作製した（図４−Ｂ）。

次にＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＴ７Ｂｌｕｅを制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ（宝酒造社製）によって切断した後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、両端にＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩサイトを有するＹＬＲ２０１Ｃ遺伝子断片を分離し、当該断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてゲルから精製した。精製した当該断片を発現ベクターｐＲＳ４３５ＧＡＰ（特開２００３−０８８３６８号公報参照）ＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入し、ＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３５ＧＡＰベクターを作製した。

（４）ＹＬＲ２０１Ｃ発現ベクター導入株の作製
ユビキノン１０生産酵母：Ｙ２Ｎ１４９０７株をＳＤ（−ＵＲＡ、 −ＨＩＳ）培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩキット(ザイモリサーチ社製)を用いてコンピテントセルを作製した。作製したコンピテントセル１０μＬにＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３４ＧＡＰベクター１μｇを加え、ＳＤ（−ＵＲＡ、−ＨＩＳ、−ＴＲＰ）Ａ培地に塗布した。菌液を塗布したＳＤＡ（−ＵＲＡ、−ＨＩＳ、−ＴＲＰ）培地は菌がコロニーを形成するまで４日間３０℃で静置培養した。このようにしてＹＬＲ２０１Ｃ発現ベクター導入株：Ｙ２Ｎ１４９０７／２０１を作製した。

〔実施例４〕ユビキノン１０の分析
以下のユビキノンの分析値は、分析に供する各株についてそれぞれ４検体ずつ分析を実施し、得られた値を平均して求めた。
（１）ユビキノン１０の抽出
酵母のユビキノンの分析はＨａｇｅｒｍａｎらの方法（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９６、１４１−１４３（２００１））に若干の修飾を加えて実施した。まず、実施例３によって作製したＹ２Ｎ１４９０７／−株、Ｙ２Ｎ１４９０７／２株およびＹ２Ｎ１４９０７／２０１株をそれぞれ５ｍLのＳＤ（ ―ＵＲＡ、−ＨＩＳ、−ＴＲＰ）培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで３０時間振とう培養した。培養後、培養液１ｍＬをＳＣ−Ｇａｌ（−ＵＲＡ、−ＨＩＳ、−ＴＲＰ）／０．１ｍＭＰＨＢ培地１００ｍＬに加え、更に３０℃、１３０ｒｐｍで１００時間振とう培養した。培養終了後、菌体を３５００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収し、菌体の湿重量を測定した。

回収した菌体に、菌体湿重量の１０倍量のガラスビーズ（シグマ社製）および水分含量が１．５ｍＬとなるように無菌水を加えた。更に内部標準物質として１００μＭのコエンザイムＱ９（シグマ社製）を７０μＬ添加し、ボルテックスミキサーで２分間攪拌した。攪拌後、９８％メタノール（ナカライテスク社製）６ｍＬとペンタン（ナカライテスク社製）４ｍＬを加え、更にボルテックスミキサーで３０秒間攪拌した。攪拌後、２０００ｒｐｍ、１０分の遠心操作によって有機相（上相）と水相（下相）に分離し、パスツールピペットを用いて、有機相を定量的に別の試験管に回収した。残った水相にペンタン４ｍＬを加え、同様の抽出操作によって有機相を回収し、これを先に回収した有機相に加えた。次に、スピードバック（サーバント社製）を用いて、回収した有機相を蒸発乾固した。

（２）ユビキノン１０の分析
蒸発乾固させた有機相に含まれている抽出物を、メタノール／エタノール（９／１）（共にナカライテスク社製）０．５ｍＬで再溶解し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。

ＨＰＬＣ分析装置としてはＨＰ１１００（ヒューレットパッカード社製）を使用し、分析用カラムにはデベロシルＯＤＳ−ＵＧ−３（野村化学社製）を用いた。移動相としてエタノールを０．５ｍＬ／分の流速で流通させ、ユビキノンの検出はＵＶ２７５ｎｍの吸収を追跡することによって行った。Ｙ２Ｎ１４９０７／−株、Ｙ２Ｎ１４９０７／２株およびＹ２Ｎ１４９０７／２０１株それぞれのユビキノン１０の生産量はユビキノン１０の溶出ピーク面積から、検量線を用いて求めた。得られた各株の菌体あたりのユビキノン生産量をＹ２Ｎ１４９０７／−株の菌体あたりのユビキノン１０生産量の相対値として表した結果を図５に示す。

図５から分かるように、Ｃｏｑ２もしくはＹＬＲ２０１Ｃ遺伝子をそれぞれ単独で導入したＹ２Ｎ１４９０７／２株およびＹ２Ｎ１４９０７／２０１株のユビキノン１０生産量はこれらの遺伝子を導入していないＹ２Ｎ１４９０７／−株とほとんど変化がなかった。

〔実施例５〕Ｃｏｑ２およびＹＬＲ２０１Ｃ発現ベクター導入株の作製
Ｃｏｑ２発現ベクター導入ユビキノン１０生産酵母：Ｙ２Ｎ１４９０７／２株をＳＤ（−ＵＲＡ、−ＨＩＳ、−ＴＲＰ）培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩキット(ザイモリサーチ社製)を用いてコンピテントセルを作製した。作製したコンピテントセル１０μＬにＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３５ＧＡＰベクター１μｇを加え、ＳＤＡ（−ＵＲＡ、−ＨＩＳ、−ＴＲＰ、−ＬＥＵ）培地に塗布した。菌液を塗布したＳＤＡ（−ＵＲＡ、−ＨＩＳ、−ＴＲＰ、−ＬＥＵ）培地は菌がコロニーを形成するまで４日間３０℃で静置培養した。このようにしてＣｏｑ２およびＹＬＲ２０１Ｃ発現ベクター導入株：Ｙ２Ｎ１４９０７／２，２０１株を作製した。

また、同様の方法にて、Ｙ２Ｎ１４９０７／−株にｐＲＳ４３５ＧＡＰを導入したＹ２Ｎ１４９０７／−，−株を作製した。

〔実施例６〕ユビキノン１０の分析
以下のユビキノンの分析値は、分析に供する各株についてそれぞれ４検体ずつ分析を実施し、得られた値を平均して求めた。

（１）ユビキノン１０の抽出
酵母のユビキノンの分析はＨａｇｅｒｍａｎらの方法（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９６、１４１−１４３（２００１））に若干の修飾を加えて実施した。まず、実施例５によって作製したＹ２Ｎ１４９０７／−，−株およびＹ２Ｎ１４９０７／２，２０１株をそれぞれ５ｍLのＳＤ（ ―ＵＲＡ、−ＨＩＳ、−ＴＲＰ、−ＬＥＵ）培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで３０時間振とう培養した。培養後、培養液１ｍＬをＳＣ−Ｇａｌ（−ＵＲＡ、−ＨＩＳ、−ＴＲＰ、−ＬＥＵ）／０．１ｍＭＰＨＢ培地１００ｍＬに加え、更に３０℃、１３０ｒｐｍで１００時間振とう培養した。培養終了後、菌体を３５００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収し、菌体の湿重量を測定した。

ＨＰＬＣ分析装置としてはＨＰ１１００（ヒューレットパッカード社製）を使用し、分析用カラムにはデベロシルＯＤＳ−ＵＧ−３（野村化学社製）を用いた。移動相としてエタノールを０．５ｍＬ／分の流速で流通させ、ユビキノンの検出はＵＶ２７５ｎｍの吸収を追跡することによって行った。Ｙ２Ｎ１４９０７／−，−株およびＹ２Ｎ１４９０７／２，２０１株それぞれのユビキノン１０の生産量はユビキノン１０の溶出ピーク面積から、検量線を用いて求めた。得られたＹ２Ｎ１４９０７／２，２０１株の菌体あたりのユビキノン生産量をＹ２Ｎ１４９０７／−，−株の菌体あたりのユビキノン１０生産量の相対値として表した結果を図６に示す。

図６から分かるように、Ｃｏｑ２及びＹＬＲ２０１Ｃ遺伝子を同時に導入して共発現させてＹ２Ｎ１４９０７／２，２０１株のユビキノン１０生産量は、これらの遺伝子を導入していないＹ２Ｎ１４９０７／−，−株に比べて１．５倍に向上していた。

図６に示す結果及び図６に示す結果より、ユビキノン１０産生酵母内において新規遺伝子（ＹＬＲ２０１Ｃ遺伝子）及ポリプレニルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｃｏｑ２遺伝子）を共発現させた場合には、これら遺伝子を単独で発現させた時よりもユビキノン１０の再生能を向上できることが明らかとなった。

プラスミドｐＲＳ４３３ＧＡＰの構造を示す模式図である。サッカロマイセス・セレビジエのＹＢＲ００３Ｗ遺伝子の破壊用プラスミド：ＹＢＲ００３ＷΔＵＲＡ３／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２の構築を示す模式図である。ＡはプラスミドＣｏｑ１（Ｎ５３）−ＤＰＳ／ｐＲＳ４３３ＧＡＰの構造、ＢはプラスミドＣｏｑ２（Ｎ３５）−ＤＰＳ／ｐＲＳ４３３ＧＡＰの構造、ＣはプラスミドＣｏｑ３（Ｎ３６）−ＤＰＳ／ｐＲＳ４３３ＧＡＰの構造を示す模式図である。ＡはプラスミドＣｏｑ２／ｐＲＳ４３４ＧＡＰの構造、ＢはプラスミドＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３４ＧＡＰの構造、ＣはプラスミドＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３５ＧＡＰの構造を示す模式図である。酵母組換え株：Ｙ２Ｎ１４９０７／２株およびＹ２Ｎ１４９０７／２０１株の菌体あたりのユビキノン１０生産量をＹ２Ｎ１４９０７／−株の菌体あたりのユビキノン１０生産量の相対値（％）として示す特性図である。酵母組換え株：Ｙ２Ｎ１４９０７／２，２０１株の菌体あたりのユビキノン１０生産量をＹ２Ｎ１４９０７／−，−株の菌体あたりのユビキノン１０生産量の相対値（％）として示す特性図である。大腸菌等の原核生物のユビキノン生合成経路および酵母等の真核生物のユビキノン生合成経路を示す反応経路図である。

Claims

ユビキノン１０産生能を有する細胞に、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子Ａとポリプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子Ｂを共発現する工程と、
(a)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号２で表されるアミノ酸において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質
得られた細胞を培養してユビキノン１０を産生させ、培地及び培養細胞を含む培養物からユビキノン１０を回収する工程と
を含むユビキノン１０の製造方法。
上記遺伝子Ａ及び上記遺伝子Ｂを上記ユビキノン１０産生能を有する細胞に導入することによって、上記遺伝子Ａ及び上記遺伝子Ｂを共発現させることを特徴とする請求項１記載のユビキノン１０の製造方法。
上記遺伝子Ａは、以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含むことを特徴とする請求項１記載のユビキノン１０の製造方法。
(a)配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号１で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号１で表される塩基配列と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNA
上記遺伝子Ｂは、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１記載のユビキノン１０の製造方法。
(a)配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号３で表されるアミノ酸において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
上記ユビキノン１０産生能を有する細胞は、サッカロマイセス・セルビシエ由来であることを特徴とする請求項１記載のユビキノン１０の製造方法。
上記ユビキノン１０産生能を有する細胞は、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素遺伝子を欠損させたサッカロマイセス・セルビシエにデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子を導入したユビキノン１０産生酵母であることを特徴とする請求項１記載のユビキノン１０の製造方法。
上記デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子は、パラコッカス・デニトリフィカンス由来であることを特徴とする請求項６記載のユビキノン１０の製造方法。
上記デカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードすることを特徴とする請求項６記載のユビキノン１０の製造方法。
(a)配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号４で表されるアミノ酸において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、デカプレニル二リン酸合成活性を有するタンパク質
上記パラコッカス・デニトリフィカンス由来のデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子は、ミトコンドリア移行シグナルをコードするポリヌクレオチドを付加した構造であることを特徴とする請求項７記載のユビキノン１０の製造方法。