CN109154015A - 在经修饰的酵母中生产甾醇 - Google Patents

在经修饰的酵母中生产甾醇 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在经修饰的酵母细胞中生产甾醇混合物，其中通过修饰所述酵母中的甾醇酰基转移酶活性，所述混合物中存在的酵母甾醇的量被显著降低或消除。经修饰的酵母细胞可用于生产维生素D3或其衍生物和/或其代谢物。

Description

在经修饰的酵母中生产甾醇
本发明涉及在经修饰的酵母细胞中生产甾醇混合物，其中通过修饰所述酵母中的甾醇酰基转移酶活性，所述混合物中存在的酵母甾醇的量被显著降低或消除。经修饰的酵母细胞可用于生产维生素D3或其衍生物和/或其代谢物。
维生素D3(又名胆钙化醇或calciol)可以在哺乳动物的皮肤中从原维生素D3(又名7-脱氢胆甾醇或7-DHC)合成，原维生素D3是暴露于紫外光时胆甾醇生物合成的产物，其中7-DHC被光化学转变为原维生素D3，原维生素D3在体温下异构化为生物活性形式的维生素D3。在肝脏中，维生素D3被转变为无生物活性的25-羟基维生素D3(又名骨化二醇(calcidiol、calcifediol)、25-羟基胆钙化醇，25-OH-D3或HyD)，其是维生素D3的主要循环形式。进一步的羟基化发生在肾脏中。
对于维生素D3的工业生产，化学合成和生物技术合成(原则上)都是可用的。化学合成始于从例如羊毛脂中分离的胆甾醇，胆甾醇被脱氢成7-DHC，然后进行紫外光照射和进一步的纯化/提取步骤，从而导致维生素D3。或者，经修饰的酵母菌株可被用于产生维生素D3前体，维生素D3前体可被分离并进一步转变为维生素D3。过量的甾醇(例如维生素D3前体，包括7-DHC)储存在细胞内细胞器(所谓的脂滴)中，并可从中被进一步分离。游离甾醇(包括维生素D3前体)与储存在脂滴中的甾醇(呈甾醇或甾醇酯形式)之间的平衡是通过几种蛋白质(特别是酶，包括甾醇酰基转移酶)的作用触发的。
通常，酵母或其它真菌细胞不适合维生素D3生产，原因在于：首先，从乙酰CoA开始，酵母和其它真菌所产生的天然主要甾醇是麦角甾醇而非胆甾醇。通过在编码ERG5和ERG6的基因中引入双重敲除已避开了这一瓶颈，导致胆甾-5，7，24(25)-三烯醇和酵母甾醇以几乎相等的量产生，并且这种erg5erg6双重敲除菌株仅最少量产生麦角甾醇。
然而，这导致了另一瓶颈：仅胆甾-5，7，24(25)-三烯醇能被用作维生素D3前体，而酵母甾醇不能被用作维生素D3前体。三烯醇是7-DHC的直接前体，7-DHC可用于维生素D3生产。其它甾醇通路中间体如酵母甾醇的积累对于这种生产过程没有帮助，并且会在许多方面(产率、下游加工等)对生产过程有负面影响。
因此，持续进行的任务是生成适于生产维生素D3前体的宿主细胞，例如酵母细胞，即产生胆甾-5，7，24(25)-三烯醇的宿主细胞，其中胆甾-5，7，24(25)-三烯醇与酵母甾醇之间的平衡转向胆甾-5，7，24(25)-三烯醇，预计这还会导致由这种酵母菌株产生的维生素D3前体(例如7-DHC)的量增加，维生素D3前体被进一步转变为维生素D3和/或其衍生物或代谢物。特定的代谢物(也是本发明的焦点)是25-羟基维生素D3。
出乎意料地，我们现在发现：通过下述方法，产胆甾醇的酵母细胞内总甾醇的组成可以显著改变，即产物比例可以转向胆甾-5，7，24(25)-三烯醇和/或7-DHC，而非待储存在脂滴中的酵母甾醇：降低或消除此类酵母菌株中存在的某些甾醇酰基转移酶的活性，并任选地向此类酵母细胞中引入异源甾醇-O-酰基转移酶(HAT)。
特别地，已发现：通过减少或消除产胆甾醇的酵母中甾醇酰基转移酶同种型Are2p的活性，酵母甾醇的量可被几乎消除(基于酵母甾醇的总量)，朝向胆甾-5，7，24(25)-三烯醇(作为甾醇化合物存在于脂滴中)强烈增加。在进一步操作之后，此类菌株可被用于生产维生素D3前体，例如7-DHC。
因此，本发明涉及一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，并且其携带ARE2基因的修饰，使得内源性ARE2的活性被降低或消除，优选地被消除，所述酵母细胞能够或用于生产包含胆甾-5，7，24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中基于所述酵母产生的甾醇的总量，与具有ARE2活性的酵母细胞(例如其中内源性ARE2有活性)相比较，所述混合物中酵母甾醇的百分比为约10％或更低。当在甾醇生产方法中使用所述酵母细胞时，基于甾醇的总量，胆甾-5，7，24-三烯醇的百分比可以增加至约75％或更高，优选例如77％、80％、86％、87％、90％、95％。因此，基于甾醇的总量，由所述酵母产生的胆甾-5，7，24-三烯醇与酵母甾醇的比例在约≥7至约≤1的范围内。当使用其中ERG5和ERG6被失活且ARE1活性和ARE2活性(例如内源性ARE1和ARE2的活性)均被降低或消除、优选消除的酵母细胞时，该比例甚至更多地转向胆甾-5，7，24-三烯醇。在此类酵母细胞中，基于甾醇的总量，所述比例可以在约≥8至约≤10的范围内，甚至在约≥8至约2的范围内。当与具有ARE1活性和/或ARE2活性的酵母细胞(例如，其中内源性ARE1和ARE2仍然有活性)相比时，通过使ARE2失活，酵母甾醇的百分比减少约4倍。这在以下菌株中甚至更高，其中ARE2和ARE1都被失活，例如，其中内源性ARE2和ARE1被失活，即与具有ARE1和/或ARE2活性的酵母细胞(例如，其中内源性ARE1和ARE2仍然有活性)相比，百分比减少约20倍。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中所述酵母细胞内的ARE2活性(例如，内源性ARE2的活性)被降低或消除，优选地被消除，所述酵母细胞能够或用于生产包含胆甾-5，7，24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中基于所述酵母细胞内产生的甾醇的总量，所述混合物中胆甾-5，7，24-三烯醇的百分比约为至少75％，优选例如77％、80％、86％、87％、90％、95％。在一个特定的实施方式中，酵母细胞被进一步修饰，使得ARE2和ARE1的活性均被降低或消除，例如，内源性ARE2和ARE1的活性均被降低或消除，优选地被消除，这会导致胆甾-5，7，24-三烯醇的百分比进一步增加，即基于甾醇的总量，在约86％或更高的范围内。因此，与其中ERG5和ERG6被失活但其中ARE1和ARE2仍然有活性的产胆甾醇的酵母细胞相比，胆甾-5，7，24-三烯醇的量可以增加约2倍(在ARE2活性和ARE1活性被降低或消除、优选被消除的酵母细胞中，例如在其中内源性ARE1和ARE2的活性均被降低或消除、优选被消除的酵母细胞中)。
本文所述实施方式的酵母细胞可用于生产维生素D3前体(例如，7-DHC)的方法中。因此，本发明涉及一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中所述酵母表达选自EC1.3.1.72的异源酶，特别是具有甾醇Δ24-还原酶活性的异源酶，优选脊椎动物酶，并且其中ARE2活性被降低或消除，优选地被消除，例如内源性ARE2的活性被降低或消除，优选地被消除，所述酵母能够或用于生产包含7-DHC和酵母甾醇的甾醇混合物，其中所述混合物中酵母甾醇的百分比在约2％或3％或更低的范围内。使用这种酵母菌株时，基于甾醇的总量，所述混合物中存在的7-DHC的百分比为约87％或更高，优选例如88％、90％、95％、98％。在一个特定的实施方式中，酵母细胞被进一步修饰，使得ARE2活性和ARE1活性均被降低或消除，优选地被消除，例如，内源性ARE2和ARE1的活性均被降低或消除，优选地被消除，这会导致7-DHC的百分比进一步增加，即基于甾醇的总量，在约90％或更高的范围内。当与具有ARE2活性和ARE1活性(例如，其中内源性ARE2和ARE1均仍然有活性)的酵母细胞相比时，通过使ARE2失活，酵母甾醇的百分比减少约15倍，与ARE1和ARE2均降低或消除时相比降低甚至更多倍。
在一个具体实施方式中，本发明涉及生产甾醇混合物的方法，其中使用如前所述的酵母细胞之一，并且其中所述甾醇混合物中存在的酵母甾醇的百分比被减少，即基于甾醇的总量，在约10％或更低的范围内。用于这种方法的酵母细胞的特征在于：ERG5和ERG6被失活，并且具有消除或降低的ARE2活性，例如，消除或降低的内源性ARE2的活性，优选消除的活性。在一个具体实施方式中，这种酵母细胞表达选自EC 1.3.1.72的异源酶，例如对烯胆甾烷醇(lathosterol)、酵母甾醇或三烯醇有活性的异源C24还原酶，特别是植物或脊椎动物甾醇Δ24-还原酶，并/或包括进一步修饰，即消除或降低的ARE1活性，例如消除或降低的内源性ARE1的活性，优选消除的活性。
如果本文所述的酵母细胞之一被用于生产包含7-DHC的维生素D3前体，则优选在所述细胞内表达对烯胆甾烷醇、酵母甾醇或三烯醇有活性的异源C24还原酶，特别是植物或脊椎动物甾醇Δ24-还原酶，优选脊椎动物甾醇Δ24-还原酶。因此，本发明涉及用于生产包含7-DHC的维生素D3前体的如前所述的酵母细胞，其中异源C24还原酶被表达，所述异源C24-还原酶对烯胆甾烷醇、酵母甾醇或三烯醇有活性。
在一个具体实施方式中，本发明涉及改善酵母细胞朝向产生胆甾-5，7，24-三烯醇和/或7-DHC的方法，其中通过降低或消除、优选消除ARE2或ARE2和ARE1活性，例如降低或消除内源性ARE2或ARE2和ARE1活性来进一步修饰其中ERG5和ERG6被失活的酵母细胞，其中所述酵母细胞被改善，使得由所述酵母产生的甾醇的总量中胆甾-5，7，24-三烯醇的百分比从约45％提高至约至少75％，优选例如77％、80％、86％、87％、90％、95％。
在朝向7-DHC生产(其在酵母细胞中待被改善)的情况下，通过下述方式进一步修饰其中ERG5和ERG6被失活的酵母细胞：(1)降低或消除、优选地消除ARE2或ARE2和ARE1，和(2)表达对烯胆甾烷醇、酵母甾醇或三烯醇有活性的异源C24-还原酶，特别是植物或脊椎动物甾醇Δ24-还原酶，优选脊椎动物甾醇Δ24-还原酶，其中酵母细胞被改善，使得由所述酵母产生的甾醇的总量中7-DHC的百分比从约45％提高至至少约87％或更高，优选例如88％、90％、95％、98％。
在本文中使用时，产胆甾醇的酵母菌株不能再产生麦角甾醇，而是产生胆甾醇产物，包括但不限于胆甾-5，7，24(25)-三烯醇、胆甾-5，8，24(25)-三烯醇、胆甾-7，24(25)-二烯醇、7-DHC或酵母甾醇。具体地，这是通过引入erg5erg6双重敲除而实现的。通过在这种背景下进一步优选地表达对烯胆甾烷醇、酵母甾醇或三烯醇(例如胆甾-5，7，25-三烯醇)有活性的异源C-24还原酶，特别是植物或脊椎动物甾醇Δ24-还原酶，7-DHC生产得到增强(参见例如WO 2003064650)。
术语“ARE1”和“Are 1p”、“ARE2”和“Are2p”、“ERG5”和“Erg5p”、“ERG6”和“Erg6p”在本文中可互换使用，其是指分别由基因are1、are2、erg5和erg6编码的多肽。为了本发明的目的，对产胆甾醇的酵母细胞进行修饰，使得其显示出ARE2或ARE2和ARE1二者的活性降低或消除，例如，带有内源性ARE2的修饰或者内源性ARE2和ARE1二者的修饰，从而导致ARE2或ARE2和ARE1的活性降低或消除。
术语“ARE活性”或“ARE的活性”，例如，“ARE2和/或ARE1的活性”是指对酰基-CoA和胆甾醇(作为底物)转变为CoA和胆甾醇酯(作为产物)的催化活性。ARE2和ARE1都属于EC2.3.1.26，即将脂肪酰基从一个分子转移到另一个分子的酰基转移酶。这种转移活性或酶活性可以通过技术人员已知的方法测量。已从不同来源(包括哺乳动物、酵母或植物)分离出了酰基转移酶。
在本文中使用时，ARE2或ARE1和ARE2的活性被降低或消除。这可以通过例如在编码ARE1或ARE2的内源基因中引入突变来实现。本领域技术人员知道如何遗传操作酵母细胞，从而导致ARE1和/或ARE2活性被降低或消除。这些遗传操作包括但不限于，例如，使用质粒、病毒或其它载体进行转化，转染，基因破坏，基因扩增，基因替换。
可以以不同方式在核酸或氨基酸内生成突变，即进行诱变，例如通过随机或侧向诱变，由剂(agents)例如辐射引起的物理损伤，化学处理或插入遗传因子。本领域技术人员知道如何引入突变。
为了使酵母细胞产生较少拷贝的ARE1或ARE2基因和/或蛋白质或不产生ARE1或ARE2基因和/或蛋白质，即具有较低的ARE1或ARE2活性或没有ARE1或ARE2活性，修饰可包括弱启动子的使用，或(如本文所述的)ARE2和/或ARE1(的部分)、特别是其调控元件的突变(例如插入缺失或点突变)。这种遗传操作的实例可以例如影响由ARE1或ARE2的N-末端区域介导的与DNA的相互作用，与其它效应分子的相互作用。特别地，导致ARE2或ARE2特异性活性降低或消除的修饰可以在蛋白质的功能部分，例如有催化活性的功能部分上进行。此外，可以通过使ARE1或ARE2与特异性抑制剂或与ARE1或ARE2特异性相互作用的其它物质接触，来降低或消除ARE1或ARE2特异性活性。为了鉴定此类抑制剂，可以在存在疑似抑制ARE1或ARE2蛋白活性的化合物的情况下表达ARE1或ARE2蛋白并检测其活性。
根据本发明，ARE1或ARE2的活性被降低。特别地，本文所述的酵母细胞带有(内源性)ARE1和ARE2，其中ARE2的活性或ARE2和ARE1的活性特别地被降低至少20％，优选地降低至少50％、60％、70％、80％、90％。最优选地，如本文所述，活性被降低100％，即降低至零活性，即活性被消除。这可能仅适用于ARE2的活性，或适用于ARE2和ARE1的活性。可以通过例如敲除/缺失一个或所有两个编码ARE1或ARE2的基因或所述基因的部分来实现活性的消除。
编码ERG5、ERG6、ARE1、ARE2或甾醇Δ24-还原酶(ERG4)的基因、在本文中使用时的酵母细胞的培养和基因工程是已知的，并描述于例如US 7608421中。特别地，将在酵母细胞中表达的甾醇Δ24-还原酶可以源自植物或脊椎动物来源，优选源自脊椎动物来源，更优选源自人、猪、狗、小鼠、大鼠、马、斑马鱼(Danio rerio)或任何其它已知的来源，只要它能够在所述酵母细胞内表达即可。最优选地，甾醇Δ24-还原酶选自斑马鱼、大鼠或人。表达所述甾醇Δ24-还原酶的序列是公众可得的，包括但不限于UniProtKB/Swiss-Prot参考Q15392、Q60HC5、Q8VCH6、Q5BQE6、Q39085或P93472。
在本文中使用时，术语“C-24-还原酶”或“Δ24-还原酶”在本文中可互换使用。在酵母中，该酶由erg4编码，其对24号位上的碳原子的甲基有活性。因此，在所述位置上不显示这种甲基的三烯醇不是酵母ERG4的可接受底物。
可用于实施本发明的合适的酵母细胞可选自例如Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces spp.、Pichia spp.、Klyuveromyces spp.、Hansenula spp.或Yarrowia lipolytica，只要在此类酵母细胞内ERG5和ERG6是失活的即可。
特别地，本发明的重点在于本发明的实施方式：
-一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中ARE2活性(例如内源性ARE2的活性)已被降低或消除，所述酵母细胞被用于生产包含胆甾-5，7，24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中基于所述酵母细胞产生的甾醇的总量，所述甾醇混合物中酵母甾醇的百分比为约10％或更低。
-一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中ARE2活性(例如内源性ARE2的活性)已被降低或消除，所述酵母细胞被用于生产包含胆甾-5，7，24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中基于所述酵母细胞产生的甾醇的总量，胆甾-5，7，24(25)-三烯醇的百分比约为75％或更高。
-一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中ARE2活性(例如内源性ARE2的活性)已被降低或消除，所述酵母细胞被用于生产包含胆甾-5，7，24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中所述甾醇混合物中存在的胆甾-5，7，24(25)-三烯醇与酵母甾醇之间的比例在约7至约1的范围内。
-如上所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞表达选自具有甾醇Δ24-还原酶活性的EC1.3.1.72的异源酶，优选对烯胆甾烷醇、酵母甾醇或三烯醇有活性的异源酶，其中所述异源酶源自植物或脊椎动物，更优选地源自人类、猪、狗、小鼠、大鼠、马或斑马鱼。
-如上所述的酵母细胞，其中所述ARE1活性(例如，内源性ARE1的活性)已被降低或消除。
-如上所述的酵母细胞，其中ARE2活性或ARE2和ARE1活性(例如，内源性ARE2或ARE2和ARE1的活性)已被消除。
-一种使酵母细胞产生的酵母甾醇的量减少至少4倍的方法，所述方法包括：
(a)提供酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，
(b)消除或降低所述酵母细胞内的ARE2活性，
其中所述降低是与其中ARE2有活性(例如其中内源性ARE2有活性)的酵母细胞相比较。
-如上所述的酵母细胞用于生产甾醇，优选用于生产维生素D3前体，更优选用于生产7-DHC的用途。
-一种在酵母细胞中生产甾醇混合物、优选维生素D3前体、更优选7-DHC的方法，所述方法包括：
(a)使ERG5和ERG6失活，
(b)降低或消除ARE2的活性或者降低或消除ARE1和ARE2的活性，
(c)表达选自EC 1.3.1.72的异源酶，所述EC 1.3.1.72具有对烯胆甾烷醇、酵母甾醇或三烯醇的甾醇Δ24-还原酶活性，优选植物或脊椎动物甾醇Δ24-还原酶，更优选脊椎动物甾醇Δ24-还原酶；
(d)在适合甾醇产生的条件下培养所述酵母细胞；
其中基于甾醇的总量，所述甾醇混合物中存在的酵母甾醇的量为约3％或更少。
-如上所述的方法，其中所述甾醇混合物中存在的7-DHC与酵母甾醇之间的比例为至少约87至约2。
附图说明
图1.敲除菌株e5e6(图A)、a2e5e6(图B)和a1a2e5e6(图C)的总甾醇分析(GC/MS)，1：胆甾醇(作为内标添加，10μg/10 OD单位生物质)，2：酵母甾醇，3：胆甾-5，7，24(25)-三烯醇，4：胆甾-7，24-二烯醇。
图2.菌株e5e6：：24R，a2e5e6：：24R(图A)、a1a2e5e6：：24R(图B)和a1a2e5e6：：24R(图C)的总甾醇分析(GC/MS)；1：胆甾醇(作为内标添加，10μg/10 OD单位生物质)，2：胆甾-5，8-二烯醇，3：胆甾-8-烯醇，4：7-脱氢胆甾醇，5：胆甾-7-烯醇，6：酵母甾醇，7：胆甾-5，7，24-三烯醇。
图3.酰基转移酶表达菌株中的游离甾醇和甾醇酯组成，以μg/OD600给出。麦角甾醇(ERG)、7-脱氢胆甾醇(7-DHC)、胆甾醇(CLR)和酵母甾醇(ZYM)的HPLC-MS测量值。从三个生物学重复(biological triplicates)计算出的ERG-菌株和CLR-菌株的平均值和标准偏差；对于7-DHC-菌株，是从平行培养的两个生物学重复(biological duplicates)计算出的(除Pt1*，Tg1*之外：独立培养)。在产麦角甾醇的菌株(ERG-菌株)中表达酰基转移酶48小时后取200 OD600单位的样品，其中针对不同来源的ARE显示游离ERG(第1列)、ERG-酯(第2列)和ZYM-酯(第3列)的测量值(图3A)。在列中，深色显示酯1，而较浅的颜色显示酯2。在产7-DHC的菌株(7-DHC-菌株)中表达酰基转移酶65小时后取200OD600单位的样品，其中针对不同来源的ARE显示游离7-DHC(第1列)、7-DHC-酯(第2列)和ZYM-酯(第3列)的测量值(图3B)。在列中，深色显示酯1，而较浅的颜色显示酯2。在产胆甾醇的菌株(CLR-菌株)中表达酰基转移酶65小时后取200 OD600单位的样品，其中针对不同来源的ARE显示游离CLR(第1列)、CLR-酯(第2列)和ZYM-酯(第3列)的测量值(图3C)。在列中，深色显示酯1，而较浅的颜色显示酯2。
图4.以mg甾醇/ml提取物给出的乙醇脂质提取物的HPLC分析，所述提取物针对CEN.PK2菌株(A)以及不同敲除组合，即erg5/erg6 k.o.(B和E)、are2/erg5/erg6 k.o.(C和G)、are1/are2/erg5/erg6 k.o.(D和H)和are1/erg5/erg6 k.o.(F)。(E)、(F)、(G)和(H)所示的菌株进一步表达24-还原酶基因。将菌株在带有挡板的摇瓶中的含2％葡萄糖的YPD中培养3天，进行3次葡萄糖进料(2％)。来自三个生物学重复的数据按照不同的主要甾醇或甾醇酯类物质给出，例如鲨烯(第1列)、麦角甾醇(第2列)、酵母甾醇酯(第3列和第4列)、麦角甾醇酯(第5列和第6列)、三烯醇(第7列)、三烯醇酯(第8列和第9列)、7-DHC(第10列)、7-DHC酯(第11列和第12列)，其中第3、5、8、11列中所示的甾醇酯用棕榈油酸酯化，而第4、6、9、12列中所示的甾醇酯用油酸酯化(图4A)。图4B中示出了以游离甾醇和酯化甾醇的总和给出的来自三个生物学重复的数据，例如鲨烯(第1列)、麦角甾醇(第2列)、酵母甾醇(第3列)、总量(第4列)、7-DHC(第5列)、三烯醇(第6列)。
图5.CEN.PK2菌株(A)以及不同敲除组合，即erg5/erg6 k.o.(B和E)、are2/erg5/erg6 k.o.(C和G)、are1/are2/erg5/erg6 k.o.(D和H)和are1/erg5/erg6 k.o.(F)的总甾醇的GC/MS分析。(E)、(F)、(G)和(H)所示的菌株进一步表达24-还原酶基因。这些菌株的提取物被使用与HPLC分析相同的生物质。数据来自三个生物学重复，显示了总甾醇，例如鲨烯(第1列)、麦角甾醇(第2列)、酵母甾醇(第3列)、其它甾醇(第4列)、7-DHC(第5列)、三烯醇(第6列)，作为总甾醇的百分比(图5A)以及通过归一化至内标胆甾醇而得到的以μg/10 OD单位计的绝对量(图5B)。
以下实施例仅是说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：构建产胆甾-5，7，24-三烯醇的敲除菌株
通过在二倍体菌株COS24孢子形成之后四分体剖分(tetrad dissection)分离了具有are1和are2敲除(菌株a1a2e5e6，参见表1)的产胆甾-5，7，24-三烯醇的Saccharomycescerevisiae菌株(erg5和erg6敲除，菌株e5e6)以及仅具有are2敲除的菌株(菌株a2e5e6)或仅具有are1敲除的菌株(菌株20B)。通过使COS23(are1 are2敲除；a1a2)和BP5(erg5 erg6敲除；e5e6)这两种菌株杂交获得了二倍体菌株COS24，所述两种菌株是通过用携带营养缺陷型标记的破坏盒(disruption cassette)，或者在Are2的情况下用携带抗生素抗性基因的破坏盒，来敲除特定基因(参见表1)而构建的。通过在标记板上的生长特征鉴定了包含ARE2或ARE1/2 k.o.的有趣菌株。通过cPCR确认了基因组操作。
使用由如下组成的引物通过PCR扩增破坏盒：与旨在被缺失的基因的上游或下游区域同源的位于引物5′-端的约40bp和与旨在被引入的选择标记基因退火的位于引物3′-端的20bp(Longtine，1998；Lorenz，1995)。在are1敲除的情况下，破坏盒侧翼区与ARE1基因的N-末端和C-末端部分是匹配的，并且破坏盒携带TEF启动子和终止子以表达HIS3基因。对于其它三种敲除，被敲除的基因的启动子被用于标记表达。用于产生破坏盒的引物的概述和相应模板载体的列表请参见表7和表2。
利用下述方法将破坏盒转化到Saccharomyces cerevisiae中，并通过原养型标记或抗生素抗性鉴定同源重组体。
在转化之前，将所有菌株在YPD中在30℃下在10mL或50mL预培养物中培养过夜。将主培养物(main culture)接种在50mL中至OD600为0.05，并使其生长过夜，直至OD600达到1.5-2个单位。根据Gietz和Woods(2002)所述的高效LiAc/SS携载体(carrier)DNA/PEG流程进行质粒转化。简而言之，在3000xg下5分钟收获细胞，然后在3000xg下5分钟用25mL无菌水洗涤，并重悬于1mL无菌水中。将细胞转移至1.5mL反应管中，再次在500xg下离心1分钟，移除上清液，并用无菌水填充至终体积为1mL。将100μL(≈108个细胞)的等分试样在500xg下离心1分钟并移除上清液。将含有240μL PEG3500(50％)、36μL 1 MLiAc、50μL煮沸的SS-携载体DNA和34μL 1-2μg质粒DNA或线性破碎盒的转化混合物加入细胞沉淀物中，剧烈混合并在42℃下孵育40分钟。转化事件后，将样品在1mL YPD中再生3.5小时。将悬浮液在500xg下离心5分钟以温和地使细胞旋转下降。将细胞涂布在选择板上。
以几种不同的菌落PCR设置证实了正确的敲除。如Güldener等人(1996)所述，分别用LEU2、TRP1、HIS3和loxP-kanMX-loxP破坏盒替代ERG5、ERG6、ARE1和ARE2基因，以最终产生are1are2erg5erg6四重敲除菌株(菌株a1a2e5e6)。
表1：用于本发明的菌株的基因型和交配型。菌株e5e6携带ERG5和ERG6敲除，菌株a2e5e6携带ERG5、ERG6和ARE2敲除，菌株a1a2e5e6携带ERG5、ERG6、ARE1和ARE2敲除。“n.d.”表示“未确定”(更多解释请参见文本)。
表2：用作破坏盒中标记的模板的质粒(更多解释请参见文本)。
实施例2：其中ARE2或ARE1/2已被敲除的菌株的GC/MS分析
通过GC/MS分析敲除菌株e5e6(对照)、a2e5e6和a1a2e5e6的总甾醇(表3)。
将菌株在摇瓶中在YPD培养基中培养48小时。将10 OD600单位的生物质用KOH/MeOH皂化并用正庚烷提取。从胆甾醇峰的峰面积计算绝对量[μg]。添加10μg胆甾醇至10 OD单位作为内标。酵母甾醇的量从17.2μg(e5e6)到2.5μg(菌株a2e5e6)到0.41μg(菌株a1a2e5e6)不等。胆甾-5，7，24(25)-三烯醇的量从18μg(e5e6)到20μg(a2e5e6)到19μg(a1a2e5e6)不等。
表3：菌株e5e6、a2e5e6和a1a2e5e6的总甾醇分析。更多解释请参见文本。
基于总甾醇，敲除ARE2导致酵母甾醇含量剧烈降低(在4倍的范围内)，额外敲除ARE1使酵母甾醇进一步降低至2％。对于are2敲除，三烯醇含量增加至76％；对于双敲除，三烯醇含量进一步增加至约86％。
实施例3：构建具有ARE1和ARE2的双敲除或单敲除的产7-DHC的菌株
为了构建无酰基转移酶活性的产7-DHC的S.cerevisiae菌株，首先利用实施例1中所述的破坏盒构建CEN.PK2 MATα erg5敲除菌株和CEN.PK2MATα erg6敲除菌株。使这两种菌株杂交以产生二倍体ERG5/erg5：：LEU5ERG6/erg6：：TRP1菌株，然后将用于ARE1和ARE2敲除的破坏盒转化到其中。这些转化产生了二倍体菌株ARE1/are1：：HIS3 ARE2/are2：：kanMXERG5/erg5：：LEU2 ERG6/erg6：：TRP1。向该菌株中转化破坏盒，所述破坏盒含有侧翼为TDH3启动子和PGK1终止子的来自斑马鱼的甾醇24-还原酶的基因与具有TEF1启动子和终止子的潮霉素抗性基因(24DHCR-HPH)的组合。将破坏盒整合到ERG6基因座中，从而获得了CEN.PK2ARE1/are1：：HIS3 ARE2/are2：：kanMX ERG5/erg5：：LEU2 erg6：：24-DHCR-HPH/erg6：：TRP1菌株。在该菌株孢子形成并四分体剖分之后，分离来了erg5：：LEU5 erg6：：24DHCR-HPH敲除菌株。使该菌株与are1：：HIS3are2：：TRP1敲除菌株(利用实施例9中所述的破坏盒构建)交配。使产生的二倍体菌株形成孢子，在四分体剖分之后，最终获得了表达甾醇24-还原酶的CEN.PK2 are1：：SkHis3 are2：：kanMX erg5：：LEU5 erg6：：24DHC-HPH四重敲除菌株，其产生7-DHC作为主要的甾醇。此外，还分离了仅具有ARE1(COS7)或ARE2(COS8)敲除的两种菌株。
实施例4：菌株a2e5e6：：24R和a1a2e5e6：：24R的GC/MS分析
通过GC/MS分析敲除菌株e5e6：：24R(对照)、a2e5e6：：24R和a1a2e5e6：：R24的总甾醇(表4)。
将菌株在摇瓶中在YPD培养基中培养48小时。将10 OD600单位的生物质用KOH/MeOH皂化并用正庚烷提取。从胆甾醇峰的峰面积计算绝对量[μg]。添加10μg胆甾醇至10 OD单位作为内标。酵母甾醇的量从17.2μg(e5e6：：24R)到2.5μg(a2e5e6：：24R)到0.41μg(a1a2e5e6：：24R)不等。
表4：菌株e5e6：：24R、a2e5e6：：24R和a1a2e5e6：：24R的总甾醇分析。术语“n.d.”表示“不可检测”。更多解释请参见文本。
在利用菌株e5e6：：24R获得的总甾醇的量中，约45％的甾醇是7-DHC，34％的甾醇是酵母甾醇。7-DHC的量显著增加至由具有ARE2敲除的菌株产生的总甾醇的87％；在具有ARE1/2双敲除的菌株中，7-DHC的量进一步增加至超过90％。在给定条件下，在菌株a1a2e5e6：：24R中，7-DHC的绝对量从每10 OD单位20μg降低至9μg，但副产物形成进一步减少，因为不再检测到酵母甾醇。
实施例5：构建无酰基转移酶活性的产胆甾醇的S.cerevisiae菌株
为了生成稳定产生胆甾醇而非麦角甾醇的新S.cerevisiae CEN.PK菌株，将源自斑马鱼的脱氢胆甾醇还原酶DHCR7整合到产7-DHC的are1 are2敲除菌株10A(a1a2e5e6：：24R，参见实施例6)中。DHC7使7-DHC的双键位置C-7饱和，从而产生终产物胆甾醇。
使用引物DHCR7-FW和DHCR7-RV(表13)，从载体056662pScript开始，通过PCR扩增具有Bam HI和Eco RI限制性位点以及针对S.cerevisiae的额外5′Kozak共有序列“AAAA”的DHCR7基因。然后将这种PCR产物用作插入物，用于与Bam HI和Eco RI双重消化之后p426GPD_ARE2的载体骨架进行粘端连接。所产生的载体p426GPD_DHCR7现在含有DHCR7基因，其侧翼为强pTDH3和iso-1-细胞色素tCYC1终止子。使用添加5′和3′同源ERG5区域的引物HR-TDH3-FW和CYClt-HR-RV，通过PCR扩增能够引入DHCR7过表达的这种盒。所有引物如表7所示。
将DHC7破坏盒转化到菌株10A(a1a2e5e6：：24R)中。由于仅产胆甾醇的菌株可以耐受纳他霉素，因此将经转化的细胞涂布在40-60μM纳他霉素上，其中仅具有功能性7-DHC还原酶表达的细胞能够存活。菌落PCR结果确认了破坏盒进入ERG5基因座中的正确整合。GC-MS结果显示：在总甾醇中，所产生的酵母菌株BA-C产生＞99％的胆甾醇。
实施例6：转化并分离携带甾醇-O-酰基转移酶(HAT)的合成基因的质粒DNA
在DNA2.0订购编码来自四种生物体的五种不同HAT的合成基因。将所有基因构建体针对在S.cerevisiae中表达进行优化并在pJ201载体中递送(表5)。
表5：HAT的选择，包括载体的名称(基于DNA 2.0载体pJ201)、蛋白质的详细列表、来源生物体和NCBI检索号。
将质粒pHYD-0120-0124和p426GPD载体(Mumberg，1995)转化到电感受态E.coliTOP10F′细胞中，然后在SOC培养基中于37℃下再生1小时，之后涂布在LB-卡那霉素(50μg/mL)琼脂板上用于pHYD转化并涂布在LB-氨苄青霉素(100μg/mL)上用于p426GPD转化。将板在37℃下孵育过夜。表6中给出了培养基组成。
表6：培养基的组成。对于液体培养基，省略了琼脂。
将来自转化板的单菌落划线在LB-卡那霉素(50μg/mL)琼脂板上，并在37℃下生长过夜。利用Gene Jet Plasmid Miniprep试剂盒(Fermentas Thermo Fisher ScientificInc.)，根据手册，从取自琼脂板的细胞材料中分离质粒。
实施例7：从Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2的染色体DNA扩增ARE1和ARE2基因并克隆到载体pJet1.2中
根据“Bust n’Grab”方法(Harju，2004)进行基因组DNA分离。将1.5mL EUROSCARF菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D(MATα，ura3-52，trp1-289，leu2-3_112，his3Δ1，MAL2-8C，SUC2)的过夜培养物(OD600为12)转移到微量离心管中并在13000xg下离心5分钟。将沉淀物重悬于200μL裂解缓冲液(2％Triton X-100，1％SDS，100mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，pH 8.0)中并置于-80℃冰箱中直至完全冻结。将混合物在95℃的热混合器中快速解冻。重复该过程两次，然后将样品涡旋30秒。加入200μL氯仿后，将管涡旋2分钟，并在室温和最大速度下离心3分钟。对于DNA沉淀，将上层水相转移到含有400μL冰冷的100％乙醇的微量离心管中并通过倒置混合。为了提高产率，将样品在-20℃下孵育5-10分钟并在16000xg下离心5分钟。移除上清液，用0.5mL 70％冰冷的乙醇洗涤沉淀物。在16000xg下离心5分钟后，用微量移液管移除上清液，并将沉淀物在30℃的培养箱中干燥，然后将其溶解在20μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8)中。。
为了扩增ARE1和ARE2，在两步PCR中使用CEN.PK2的基因组DNA作为模板。引物提供了具有限制性位点(BamHI和EcoRI)的悬突用于进行克隆(参见表7)。
表7：用于扩增/克隆ARE1和ARE2的引物(更多细节请参见文本)。
在下述条件下进行PCR：50μL总体积，200μM每种dNTP，0.5μM每种引物，约200ng来自S.cerevisiae CEN.PK2-1D的基因组DNA，0.03U/μL在相应缓冲液中的Phusion热启动聚合酶(Finnzymes Thermo Fisher Scientific Inc.)。循环条件如下：在98℃下持续1分钟；5个循环的(在98℃下持续10秒，在67.8℃下持续50秒，在72℃下持续58秒)；30个循环的(在98℃下持续10秒，在78℃下持续50秒，在72℃下持续59秒)；在72℃下持续10分钟，最后保持在4℃。
将扩增的DNA通过制备凝胶(Promega的Wizard SV Gel Slice and PCR ProductPreparation)纯化，然后使用Clone JetTM PCR Cloning试剂盒(Fermentas ThermoFisher Scientific Inc.)根据供应商的手册克隆到pJet1.2载体中，以获得载体pJet1.2_ARE1或pJet1.2_ARE2。将载体pJet1.2_ARE1和pJet1.2_ARE2转化到E.coli TOP10F’中。使用Fermentas GeneJet Plasmid Miniprep试剂盒(Fermentas Thermo Fisher ScientificInc.)根据供应商的手册，将来自过夜培养的单个转化体划线的细胞材料用于质粒分离。通过Sanger测序检查pJET1.2中ARE1或ARE2的正确整合。
实施例8：将ARE1和ARE2基因克隆到载体p426GPD中
来自CEN.PK2的ARE1序列含有BamHI限制性位点，其已通过突变被移除。因此，利用表7中所示的引物在两个片段中扩增ARE1基因。引物are1_c1332a_fw和are1_c1332a_rv含有预期的突变C1332A。为了扩增片段1，使用引物组are1_fw和are1_c1332a_rv；为了扩增片段2，使用引物组are1_c1332a_fw和are1_rv。在50μL总体积中，PCR混合物含有200μM每种dNTP、0.2μM每种引物、13ng pJET1.2_ARE1、0.02U/μL在相应缓冲液中的Phusion聚合酶(Finnzymes Thermo Fisher Scientific Inc.)。所用PCR程序为：在98℃下持续30秒；30个循环的(在98℃下持续10秒，在60℃下持续30秒，在72℃下持续60秒)；在72℃下持续7分钟，最后保持在4℃。将两个片段凝胶纯化并在重叠延伸PCR中合并，从而重构了具有突变的的BamHI限制性位点的整个ARE1基因。在50μL总体积中，用于重叠延伸PCR的反应混合物含有200μM每种dNTP、10ng片段1、7ng片段2、0.02U/μL在相应缓冲液中的Phusion聚合酶(Finnzymes Thermo Fisher Scientific Inc.)。所用PCR程序为：在98℃下持续30秒；15个循环的(在98℃下持续10秒，在60℃下持续20秒，在72℃下持续90秒)；在72℃下持续7分钟，最后保持在4℃。将PCR产物(侧翼为BamHI和EcoRI限制性位点的突变的ARE1基因)凝胶纯化并用作进一步克隆步骤的插入物。
对于用于将突变的ARE1和ARE2克隆到p426GPD中的插入物制备，用BamHI和EcoRI(Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.)限制性消化扩增的ARE1基因(参见上文)或pJet1.2_ARE2和p426GPD。通过制备凝胶纯化ARE2插入物和p426GPD载体骨架，通过GeneJETPCR纯化试剂盒(Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.)纯化ARE1插入物。用T4 DNA连接酶(Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.)连接插入物和骨架。在转化到电感受态E.coli Top10F’细胞中之前，利用MF膜滤器使连接混合物脱盐。将来自转化板的单菌落划线在LB-氨苄青霉素(100μg/mL)琼脂板上，并在37℃下生长过夜。利用Gene JetPlasmid Miniprep试剂盒(FermentasThermo Fisher Scientific Inc.)，根据手册，从取自琼脂板的细胞材料中分离质粒(p426GPD_ARE1和p426GPD_ARE2)。
实施例9：为HAT基因添加FLAG标签并克隆到载体p42GPD中
为了为HAT基因添加N末端FLAG标签，使用表7中列出的引物从pHYD-质粒(异源性酰基转移酶)或p426GPD_ARE1或p426GPD_ARE2扩增基因。
通过制备琼脂糖凝胶纯化PCR产物。用酶BamHI和EcoRI限制性消化之后，将PCR产物与p426GPD的载体骨架连接，并转化到E.coliTOP10F’-细胞中。从单菌落划线中分离质粒，并通过Sanger测序确认Flag标记的酰基转移酶基因的正确插入。
实施例10：将kanMX标记基因克隆到载体p426GPD_ScARE2中代替URA3标记，并将所有带Flag标签的酰基转移酶基因重新克隆到具有Kozak序列的p42kanMXGPD载体中
为了扩增p426GPD_ScARE2的载体骨架(不含URA3标记的载体序列)，使用带有具有NdeI限制性位点的悬突的引物p426GPD_URAfw(表7)和带有具有NotI限制性位点的悬突的引物p426GPD_URArv。为了扩增质粒pFA6a_kanMX6的kanMX标记基因，使用引物NdeI TEFp_fw和引物NotI TEFt_rv。
在下述条件下进行PCR：50μL总体积，200μM每种dNTP，0.5μM每种引物，50ng模板质粒DNA，1单位在相应Phusion HF反应缓冲液中的Phusion聚合酶(Finnzymes，F-530L)。循环条件如下：在98℃下持续30秒；30个循环的(在98℃下持续10秒，在61℃下持续30秒，在72℃下持续2：15分(载体骨架：约7500bp)/45秒(kanMX标记：约1400bp))；在72℃下持续10分钟，最后保持在4℃。
通过制备琼脂糖凝胶(Promega的Wizard SV Gel and PCR Clean-up System)纯化扩增的DNA，并在洗脱后测定浓度。用FastDigest NotI和FastDigest NdeI(FermentasThermo Fisher Scientific Inc.)在各自的缓冲液中消化纯化的DNA溶液(～45μL)。在限制性切割之后，用FastAP热敏碱性磷酸酶将载体骨架(p42GPD_ScARE2)去磷酸化。通过SVMinicolumn(Promega的Wizard SV Gel and PCR Clean-up System)纯化经NdeI和NotI消化的kanMX标记插入物和p426GPD_ScARE2骨架。对于连接，利用1U/μL的T4DNA连接酶(Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.)，使用载体：插入物为1∶3的摩尔比，将100ng载体骨架p426GPD_ScARE2与kanMX插入物在合适缓冲液中在室温下连接1.5小时。
将连接反应物转化到电感受态E.coli Top 10F’细胞中。在SOC培养基中再生之后，将转化混合物涂布在LB-氨苄青霉素(100μg/mL)琼脂板上。将来自转化板的单菌落划线在LB-氨苄青霉素(100μg/mL)琼脂板上，并使其在37℃下生长过夜。利用Gene Jet PlasmidMiniprep试剂盒(Fermentas Thermo Fisher Scientific Inc.)根据手册从取自琼脂板的细胞材料中分离质粒。在用NdeI和NotI进行对照切割后，在琼脂糖凝胶上检查质粒的大小，并将显示正确片段大小的质粒送去测序以确认正确的序列。
对于所产生的p42kanMXGPD_ScARE2载体，确定了kanMX6标记、2μ起点、GAP启动子和ARE2基因的正确序列。
为了向带flag标签的酰基转移酶基因(120-124，ARE2)添加Kozak序列(AAA)，用表7中所示的正向引物Kozak-FLAG和各自的反向引物从p426GPD_FLAG-ACAT质粒扩增编码序列。
用BamHI和EcoRI酶限制性消化之后，将p426kanMXGPD载体骨架与PCR产物连接，并转化到TOP10F’-细胞中。从单菌落划线中分离质粒，并通过Sanger测序确认酰基转移酶基因的正确插入。下文列出了用于S.cerevisiae中酰基转移酶表达的最终构建体，即2μ质粒。
P42kanMX_GPD_Sc1
P42kanMX_GPD_Sc2
P42kanMX_GPD_Ca2
P42kanMX_GPD_Tg1
P42kanMX_GPD_Rn1
P42kanMX_GPD_Rn2
P42kanMX_GPD_Ptl
P42kanMX_GPD
实施例11：将酰基转移酶载体转化到产麦角甾醇、7-DHC或胆甾醇的S.cerevisiaeare1 are2敲除菌株中
用携带同源和异源酰基转移酶基因的p42kanMX-GPD载体集合来转化产麦角甾醇的are1 are2敲除菌株COS5(与表1中的COS4相同的基因型，但COS5的交配型是Matα)。利用实施例9中所述的流程进行转化。还将相同的载体集合转化到产7-DHC的are 1 are2敲除菌株(参见实施例3)、产胆甾醇的are 1 are2敲除菌株(见实施例5)中。表8给出了可用的表达酰基转移酶的酵母菌株的概述。
表8：具有不同甾醇组成的菌株背景中酰基转移酶表达菌株的集合。
实施例12：培养表达酰基转移酶的S.cerevisiae菌株
将产7-DHC和胆甾醇的菌株背景中的酰基转移酶表达菌株(参见表8)在28℃下在250mL带挡板的摇瓶中培养65小时。将50mL含有100μM遗传霉素的YPD培养基从预培养物接种至OD600为0.1。40小时后，向细胞培养物中进料5mL葡萄糖(20％)，并在52小时孵育时间后再次进料5mL葡萄糖。以相同的方式培养麦角甾醇菌株，但仅持续48小时，且在25小时和32小时后进料。对于所有菌株，测量最终OD600/mL，并以含有10、20和200 OD单位细胞的体积获取样品。将悬浮液在1500xg下离心5分钟，并将细胞沉淀物冷冻在-20℃用于进一步分析。
实施例13：具有来自质粒的异源或同源酰基转移酶表达的具有改变的甾醇通路的S.cerevisiae菌株的气相色谱/质谱(GC/MS)分析
GC/MS样品制备和从完整酵母细胞中提取甾醇的程序改编自Quail和Kelly(1996)以及Müllner等(2005)。将来源于酵母培养的10 OD600单位的冷冻样品转移到Pyrex管中，并在2500xg下离心5分钟，随后移除上清液。将由0.6mL甲醇、0.4mL溶解在甲醇中的0.5％连苯三酚和0.4mL60％KOH水溶液组成的溶剂与作为内标的溶解在乙醇中的5μL胆甾醇或麦角甾醇[2mg/mL]一起加入到样品中。将悬浮液通过涡旋混合并在沙浴或水浴中在90℃下孵育2小时。使用Vibrax在1500rpm下振荡3分钟之后，将脂质用1mL正庚烷提取三次，并在1500xg下离心3分钟。将合并的提取物转移到第二Pyrex管中并在氮气流中干燥。(任选的：将脂质储存在-20℃)。将脂质溶解在10μL吡啶中，并在加入10μL N，O-双(三甲基甲硅烷基)-三氟乙酰胺后孵育30分钟以进行衍生化。将样品用200μL乙酸乙酯稀释，并转移至具有微嵌体(micro-inlay)的压盖式钳口小瓶(crimp-top vials)中。
使用Agilent 19091S-433柱HP 5-MS(交联的5％苯基甲基硅氧烷；尺寸为30m×0.25mm×0.25μm膜厚度)进行甲硅烷基化(sialylated)甾醇的GC/MS分析。将1μL(注射器规格＝10μL)的等分试样在270℃注射温度下以无分裂(split-less)模式注射，使用氦气作为载气，流速为0.9mL/min，恒定流动模式，总运行时间为38.67分钟。使用以下温度程序：在100℃下1分钟，10℃/min至250℃，3℃/min至300℃，以及10℃/min至310℃。在扫描模式下获得了质谱。基于甾醇相对于胆甾醇和甾醇标准品的保留时间、甾醇的质谱碎裂模式(massfragmentation pattern)来鉴定甾醇。
通过GC/MS分析如实施例12中所述培养后表达酰基转移酶的S.cerevisiae菌株(参见实施例11)的总甾醇含量，结果在表9中给出，其中在甲硅烷基化脂质提取物之后通过GC-MS检测来确定总细胞甾醇的定量测量。总结的甾醇量(TOTAL)包括前体分子鲨烯(SQL)。
表9：酰基转移酶表达菌株的细胞甾醇组成。相对于作为内标的胆甾醇(ERG-菌株和7DHC-菌株)或麦角甾醇(CLR-菌株)，以μg/OD600计算的值。甾醇的百分比值是相对于TOTAL甾醇。重复测量的平均值(*一次)。更多解释请参见文本。
实施例14：具有来自质粒的异源或同源酰基转移酶表达的具有改变的甾醇通路的S.cerevisiae菌株的HPLC分析
将在15mL Greiner管中的储存在-20℃下的200 OD单位的生物质沉淀物用于提取过程：将样品在室温(RT)下解冻，重悬于1mL裂解酶(zymolyase)溶液(5mg/mL，在50mM KPi中，含有1M D-山梨糖醇)中并在37℃下孵育15分钟。在3000xg下离心5分钟后，弃去上清液，将沉淀物重悬于1mL 100％EtOH中。加入2.8mL 100％EtOH和200μL内标(例如2mg/mL溶解在EtOH中的胆甾醇乙酸酯)并在密闭的管中在70℃下以750rpm混合1小时。冷却至室温，将管在3000xg下离心5分钟，随后将3mL上清液转移至Pyrex玻璃管中。将提取物在N2中干燥并置于200μL乙酸乙酯中。将样品在40℃下振荡15分钟以溶解脂质，然后将未溶解的颗粒在3000xg下离心5分钟，并将上清液转移至具有嵌体(inlay)的GC小瓶中。用含有80％EtOH、20％MeOH和0.1％三氟乙酸的流动相以0.6mL/min的流速进行HPLC测量。在40℃下注入10μL体积的样品。将化合物在YMC-Pack Pro C18RS柱中在20℃下分离，并利用UV检测器在210nm处检测一般甾醇/芳族结构，在280nm处检测具有共轭双键的甾醇例如7-DHC和麦角甾醇；或者，利用MS检测器，在扫描模式和阳性SIM下，用甾醇特异性质量减去OH-基团(-17)。如下分析HPLC数据：对甾醇峰进行积分并相对于内部胆甾醇乙酸酯标准品进行归一化以解释提取过程中的任何损失，并且如果需要的话，将数据再次归一化为外部胆甾醇乙酸酯标准品以调整结果，以比较不同运行的数据。通过使用游离甾醇标准品校准来计算游离甾醇和甾醇酯二者的浓度。
通过HPLC分析如实施例12中所述培养后具有改变的甾醇通路的表达酰基转移酶的S.cerevisiae菌株(参见实施例11)的游离甾醇和酯化甾醇的含量，结果在图3中给出。可以检测到两种主要类型的甾醇酯，其是棕榈油酸的酯化产物(酯1)和油酸的酯化产物(酯2)，它们是Zweytick等人(2000)所报道的酵母中的两种主要脂肪酸。另外，在ERG菌株中，还检测到可能是棕榈酸的酯(酯3)和硬脂酸的酯(酯4)。
实施例15：有或无24-还原酶表达并与ARE1和/或ARE2敲除组合的CEN.PK2 erg5erg6敲除菌株的甾醇谱
将产麦角甾醇的CEN.PK2菌株中的甾醇产生与具有are1和are2敲除的不同组合的产胆甾-5，7，24三烯醇的菌株(参见实施例1和2)或产7-DHC的菌株(参见实施例5)进行比较。将菌株S.cerevisiae CEN.PK2、20B、2B、14C(参见实施例1)、COS7、COS8、COS9(参见实施例5)一式三份地在摇瓶中培养3天，并额外进料葡萄糖。为了通过HPLC分析变体的游离甾醇和甾醇酯组成，如实施例14中所述制备200 OD单位的乙醇提取物。通过HPLC分析提取物，在两个波长(210nm和280nm)处进行UV检测。通过210nm UV光检测酵母甾醇化合物，在280nm处测量7-DHC化合物。通过将峰面积与关于酵母甾醇和7-DHC的0.5-2mg/mL标准溶液检测到的面积相关联来计算浓度。使用胆甾醇乙酸酯作为内标来归一化提取程序中可能的差异。HPLC方法的细节请参见实施例14。图4中显示了通过HPLC分析测量的所分析菌株的甾醇组成。
可以检测到两种主要类型的甾醇酯，其是棕榈油酸的酯化产物(酯1)和油酸的酯化产物(酯2)，它们是Zweytick等人(2000)所报道的酵母中的两种主要脂肪酸。
从与HPLC分析相同的生物质的提取物进行GC分析(参见图5)。GC分析的细节请参见实施例12。对峰面积进行积分并通过内标胆甾醇重新计算为以μg/10 OD单位计的量(参见图5b)。图5A显示了总甾醇的百分比。

Claims (11)

1.一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中甾醇酰基转移酶同种型ARE2活性已被降低或消除，所述酵母细胞被用于生产包含胆甾-5,7,24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中基于所述酵母细胞产生的甾醇的总量，所述甾醇混合物中酵母甾醇的百分比为约10％或更低。
2.一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中内源性ARE2的活性已被降低或消除，所述酵母细胞被用于生产包含胆甾-5,7,24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中基于所述酵母细胞产生的甾醇的总量，胆甾-5,7,24(25)-三烯醇的百分比约为75％或更高。
3.一种酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，其中ARE2活性已被降低或消除，所述酵母细胞被用于生产包含胆甾-5,7,24(25)-三烯醇和酵母甾醇的甾醇混合物，其中所述甾醇混合物中存在的胆甾-5,7,24(25)-三烯醇与酵母甾醇之间的比例在约7至约1的范围内。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞表达选自具有甾醇Δ24-还原酶活性的EC1.3.1.72的异源酶，优选地其中所述异源酶源自植物或脊椎动物，更优选地源自人类、猪、狗、小鼠、大鼠、马或斑马鱼。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的酵母细胞，其中ARE1活性已被降低或消除。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的酵母细胞，其中ARE2或ARE1和ARE2活性已被消除。
7.一种使酵母细胞产生的酵母甾醇的量减少至少4倍的方法，所述方法包括：
(a)提供酵母细胞，其中ERG5和ERG6被失活，
(b)消除或降低所述酵母细胞内的ARE2活性，
其中所述降低是与其中ARE2有活性的酵母细胞相比较。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的酵母细胞用于生产甾醇，优选用于生产维生素D3前体，更优选用于生产7-脱氢胆甾醇(7-DHC)的用途。
9.一种在酵母细胞中生产甾醇混合物、优选维生素D3前体、更优选7-DHC的方法，所述方法包括：
(a)使ERG5和ERG6失活，
(b)降低或消除ARE2的活性或者降低或消除ARE1和ARE2的活性，
(c)表达选自对烯胆甾烷醇、酵母甾醇或三烯醇具有甾醇Δ24-还原酶活性的EC1.3.1.72的异源酶，优选植物或脊椎动物甾醇Δ24-还原酶，更优选脊椎动物甾醇Δ24-还原酶；
(d)在适合甾醇产生的条件下培养所述酵母细胞；
其中基于甾醇的总量，所述甾醇混合物中存在的酵母甾醇的量为约3％或更少。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述甾醇混合物中存在的7-DHC与酵母甾醇之间的比例在至少约87至约2的范围内。
11.根据权利要求1至6所述的酵母细胞或根据权利要求7至10所述的方法，其中ARE1和/或ARE2是内源性甾醇酰基转移酶。
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