JPH04349887A - キメラｐ４５０産生菌株 - Google Patents
キメラｐ４５０産生菌株Info
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｎ末端のミクロソーム
への局在化シグナル配列と、Ｃ末端の成熟型のミトコン
ドリア型Ｐ４５０からなるキメラＰ４５０に関する。さ
らに具体的には、ミクロソームへの局在化シグナルと考
えられているウシ副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５アミ
ノ酸残基からなるシグナル配列と５０１アミノ酸からな
る成熟型ラット肝ミトコンドリアＰ４５０Ｃ２５ から
なるキメラ体Ｐ４５０をコードする遺伝子および該酵素
を大量生産するための発現プラスミド、該発現プラスミ
ドを保持する酵母菌株、該酵母を用いることによる該酵
素の生産方法、および該酵母を用いることによる５β−
コレスタン−３α，７α，１２α，２７−テトロール（
以下、ＴｅＨＣと略する。）、２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ３ および１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
の製造方法に関する。
への局在化シグナル配列と、Ｃ末端の成熟型のミトコン
ドリア型Ｐ４５０からなるキメラＰ４５０に関する。さ
らに具体的には、ミクロソームへの局在化シグナルと考
えられているウシ副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５アミ
ノ酸残基からなるシグナル配列と５０１アミノ酸からな
る成熟型ラット肝ミトコンドリアＰ４５０Ｃ２５ から
なるキメラ体Ｐ４５０をコードする遺伝子および該酵素
を大量生産するための発現プラスミド、該発現プラスミ
ドを保持する酵母菌株、該酵母を用いることによる該酵
素の生産方法、および該酵母を用いることによる５β−
コレスタン−３α，７α，１２α，２７−テトロール（
以下、ＴｅＨＣと略する。）、２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ３ および１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】以下、本明細書で用いるキメラ体Ｐ４５
０という言葉は、Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグ
ナル配列と、Ｃ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５
０からなるＰ４５０を意味する。Ｐ４５０は微生物から
哺乳動物にいたるまで広く生物界に存在するヘムタンパ
ク質であり、電子伝達系の末端酵素として種々の脂溶性
化合物を基質として１原子酸素添加反応を触媒する。電
子伝達系の末端酵素であるＰ４５０は分子種が多様であ
り、それぞれが異なる基質特異性を示すので、非常に広
範囲の脂溶性化合物を水酸化することができる。哺乳動
物のＰ４５０依存性電子伝達系はその構成酵素から、ミ
クロソーム型とミトコンドリア型に分けられる。前者で
は、フラビンアデニンジヌクレオチドとフラビンモノヌ
クレオチドを分子内に補酵素として含有するＮＡＤＰＨ
−チトクロムＰ４５０還元酵素（還元酵素）がＮＡＤＰ
Ｈからの電子をＰ４５０へ供給し、後者では、フラビン
アデニンジヌクレオチドを補酵素として分子内に含有す
るＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素、および、非ヘ
ム鉄を補酵素として分子内に含有するフェレドキシンが
ＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給することにより
、種々の脂溶性基質に対して水酸化反応を触媒する。
０という言葉は、Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグ
ナル配列と、Ｃ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５
０からなるＰ４５０を意味する。Ｐ４５０は微生物から
哺乳動物にいたるまで広く生物界に存在するヘムタンパ
ク質であり、電子伝達系の末端酵素として種々の脂溶性
化合物を基質として１原子酸素添加反応を触媒する。電
子伝達系の末端酵素であるＰ４５０は分子種が多様であ
り、それぞれが異なる基質特異性を示すので、非常に広
範囲の脂溶性化合物を水酸化することができる。哺乳動
物のＰ４５０依存性電子伝達系はその構成酵素から、ミ
クロソーム型とミトコンドリア型に分けられる。前者で
は、フラビンアデニンジヌクレオチドとフラビンモノヌ
クレオチドを分子内に補酵素として含有するＮＡＤＰＨ
−チトクロムＰ４５０還元酵素（還元酵素）がＮＡＤＰ
Ｈからの電子をＰ４５０へ供給し、後者では、フラビン
アデニンジヌクレオチドを補酵素として分子内に含有す
るＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素、および、非ヘ
ム鉄を補酵素として分子内に含有するフェレドキシンが
ＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給することにより
、種々の脂溶性基質に対して水酸化反応を触媒する。
【０００３】本発明者らはすでに、数種のミクロソーム
型Ｐ４５０及び還元酵素を酵母内で生産させ、それらの
組換え体酵母菌株を用いることにより、工業的に有用な
水酸化反応を行うことに成功した。すなわち、ラット肝
Ｐ４５０ｃ 遺伝子、ウシ副腎Ｐ４５０１７α遺伝子や
Ｐ４５０Ｃ２１ 遺伝子をそれぞれ単離し、これらの遺
伝子を含む発現プラスミドを作製し、これら発現プラス
ミドで酵母を形質転換することにより、該酵素を産生す
る酵母菌株を得た（特開昭６１−５６０７２、特開平１
−４７３８０、特開平２−３１６８０）。これらの酵母
菌株はそれぞれのＰ４５０分子種に依存した１原子酸素
添加活性を示した。また、ラット肝還元酵素遺伝子や酵
母還元酵素遺伝子を単離し、Ｐ４５０還元能を有する該
酵素の酵母内発現に成功した（特開昭６２−１９０８５
、特開平２−５１５２５）。さらに、発明者らは、Ｐ４
５０と還元酵素の両酵素を産生する酵母菌株（特開昭６
２−１０４５８２）や両酵素の機能を１分子内に併せ持
つ新規モノオキシゲナーゼの作出に成功した（特開昭６
３−４４８８８、特開平２−２３８７０、特願平１−７
１２５０）。こうした技術により、本発明者らはこれら
Ｐ４５０産生酵母菌株を用いて、医薬品として有用なア
セトアミノフェンやステロイドホルモン中間体の製造を
可能にした。
型Ｐ４５０及び還元酵素を酵母内で生産させ、それらの
組換え体酵母菌株を用いることにより、工業的に有用な
水酸化反応を行うことに成功した。すなわち、ラット肝
Ｐ４５０ｃ 遺伝子、ウシ副腎Ｐ４５０１７α遺伝子や
Ｐ４５０Ｃ２１ 遺伝子をそれぞれ単離し、これらの遺
伝子を含む発現プラスミドを作製し、これら発現プラス
ミドで酵母を形質転換することにより、該酵素を産生す
る酵母菌株を得た（特開昭６１−５６０７２、特開平１
−４７３８０、特開平２−３１６８０）。これらの酵母
菌株はそれぞれのＰ４５０分子種に依存した１原子酸素
添加活性を示した。また、ラット肝還元酵素遺伝子や酵
母還元酵素遺伝子を単離し、Ｐ４５０還元能を有する該
酵素の酵母内発現に成功した（特開昭６２−１９０８５
、特開平２−５１５２５）。さらに、発明者らは、Ｐ４
５０と還元酵素の両酵素を産生する酵母菌株（特開昭６
２−１０４５８２）や両酵素の機能を１分子内に併せ持
つ新規モノオキシゲナーゼの作出に成功した（特開昭６
３−４４８８８、特開平２−２３８７０、特願平１−７
１２５０）。こうした技術により、本発明者らはこれら
Ｐ４５０産生酵母菌株を用いて、医薬品として有用なア
セトアミノフェンやステロイドホルモン中間体の製造を
可能にした。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一方、ミトコンドリア
型Ｐ４５０に関しては、ミトコンドリア型Ｐ４５０分子
種であるラット肝Ｐ４５０Ｃ２５ 依存性の１原子酸素
添加活性を発揮する酵母菌株を創製した（特願２−２５
８２６２）。 しかし、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５ 依
存性の１原子酸素添加活性を発揮する酵母菌株における
Ｐ４５０Ｃ２５ 産生量は低く、菌体当たりの活性が低
かったため、本発明者らは、さらに大量にＰ４５０Ｃ２
５ を産生する酵母菌株を創製することを目的とした。 さらに、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５ 依存性の１原子酸素
添加活性発現にはＰ４５０Ｃ２５ の他、ウシ副腎アド
レノドキシン（以下、ＡＤＸと略す）およびウシ副腎ア
ドレノドキシン還元酵素（以下、ＡＤＲと略す）の２酵
素が必要である。そこで本発明者らは、１ステップの１
原子酸素添加活性発現のバイオリアクターの作出を試み
た。
型Ｐ４５０に関しては、ミトコンドリア型Ｐ４５０分子
種であるラット肝Ｐ４５０Ｃ２５ 依存性の１原子酸素
添加活性を発揮する酵母菌株を創製した（特願２−２５
８２６２）。 しかし、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５ 依
存性の１原子酸素添加活性を発揮する酵母菌株における
Ｐ４５０Ｃ２５ 産生量は低く、菌体当たりの活性が低
かったため、本発明者らは、さらに大量にＰ４５０Ｃ２
５ を産生する酵母菌株を創製することを目的とした。 さらに、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５ 依存性の１原子酸素
添加活性発現にはＰ４５０Ｃ２５ の他、ウシ副腎アド
レノドキシン（以下、ＡＤＸと略す）およびウシ副腎ア
ドレノドキシン還元酵素（以下、ＡＤＲと略す）の２酵
素が必要である。そこで本発明者らは、１ステップの１
原子酸素添加活性発現のバイオリアクターの作出を試み
た。
【０００５】
【課題解決の手段】ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５ は、５３
３アミノ酸からなる前駆体として細胞質で合成されたの
ち、ミトコンドリアに輸送される。その際、ミトコンド
リアのシグナルとして機能するアミノ末端部分の３２ア
ミノ酸が除去され、５０１アミノ酸からなる成熟型Ｐ４
５０Ｃ２５ （分子量約５７ｋＤ）がミトコンドリア膜
に局在する。一方、Ｐ４５０１７αはウシ副腎ミクロソ
ームの酵素で、Ｎ末端の疎水性アミノ酸配列がミクロソ
ームへの局在化シグナルとして機能する。そこで、本発
明者らは、本来ミトコンドリアに存在する酵素をミクロ
ソームに局在化させることにより酵母内での産生量を上
昇させることを目的として、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５
のミトコンドリア移行シグナル部分をミクロソーム膜へ
の挿入のためのシグナルと考えられるウシ副腎Ｐ４５０
１７αのＮ末端１５アミノ酸に置換したキメラＰ４５０
Ｃ２５ を酵母で発現させるプラスミドを構築した。ま
た、キメラＰ４５０Ｃ２５ 、ＡＤＸおよびＡＤＲがミ
クロソーム膜上で電子伝達系を構築し、モノオキシゲナ
ーゼ活性を発揮することを目的としてキメラＰ４５０Ｃ
２５ 、成熟型ＡＤＸおよび成熟型ＡＤＲの３酵素を同
時に発現するプラスミドを構築した。その際、同一のプ
ロモーター、ターミネーターを用いると酵母の継代培養
中にプラスミド内での組み換えが起こることから、３酵
素を別々のプロモーター、ターミネーターにより発現さ
せた。
３アミノ酸からなる前駆体として細胞質で合成されたの
ち、ミトコンドリアに輸送される。その際、ミトコンド
リアのシグナルとして機能するアミノ末端部分の３２ア
ミノ酸が除去され、５０１アミノ酸からなる成熟型Ｐ４
５０Ｃ２５ （分子量約５７ｋＤ）がミトコンドリア膜
に局在する。一方、Ｐ４５０１７αはウシ副腎ミクロソ
ームの酵素で、Ｎ末端の疎水性アミノ酸配列がミクロソ
ームへの局在化シグナルとして機能する。そこで、本発
明者らは、本来ミトコンドリアに存在する酵素をミクロ
ソームに局在化させることにより酵母内での産生量を上
昇させることを目的として、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５
のミトコンドリア移行シグナル部分をミクロソーム膜へ
の挿入のためのシグナルと考えられるウシ副腎Ｐ４５０
１７αのＮ末端１５アミノ酸に置換したキメラＰ４５０
Ｃ２５ を酵母で発現させるプラスミドを構築した。ま
た、キメラＰ４５０Ｃ２５ 、ＡＤＸおよびＡＤＲがミ
クロソーム膜上で電子伝達系を構築し、モノオキシゲナ
ーゼ活性を発揮することを目的としてキメラＰ４５０Ｃ
２５ 、成熟型ＡＤＸおよび成熟型ＡＤＲの３酵素を同
時に発現するプラスミドを構築した。その際、同一のプ
ロモーター、ターミネーターを用いると酵母の継代培養
中にプラスミド内での組み換えが起こることから、３酵
素を別々のプロモーター、ターミネーターにより発現さ
せた。
【０００６】
【発明の効果】発現された、ほとんどのキメラＰ４５０
Ｃ２５ はミクロソーム画分に存在した。従って、Ｐ４
５０１７α由来のＮ末端１５アミノ酸残基が酵母内でミ
クロソーム膜へのシグナルの役割を果たし、本来はミト
コンドリアの膜蛋白であるＰ４５０Ｃ２５ を酵母ミク
ロソームで発現させることに成功した。また、キメラＰ
４５０Ｃ２５ 産生量は菌体当たり約２×１０５ 分子
であり、シグナルの置換によりＰ４５０Ｃ２５ の産生
量を約１０倍上昇させることができた。さらに、ミクロ
ソーム画分は、ＡＤＸとＡＤＲを添加することにより、
ＴＨＣ、ビタミンＤ３ 、１α−ヒドロキシビタミンＤ
３ に対し、高い水酸化活性を示した。特に、１α−ビ
タミンＤ３ に対する水酸化活性は元の５０１アミノ酸
からなる成熟型Ｐ４５０Ｃ２５ よりもはるかに高く、
１５アミノ酸残基の付加がＰ４５０Ｃ２５ の膜におけ
る存在状態を変化させ、活性を上昇させたと思われる。 また、キメラＰ４５０Ｃ２５ 、ＡＤＸおよびＡＤＲの
同時発現株はモノオキシゲナーゼ活性を発揮しているの
で、本発明者らは、酵母ミクロソーム膜上でＡＤＲから
ＡＤＸを経てキメラＰ４５０Ｃ２５ という電子伝達系
を構築することに成功した。従って、この菌株をステロ
イド化合物や活性型ビタミンＤ３ などの水酸化反応に
１ステップで行うことができる簡便なバイオリアクター
として利用できる。特に、菌体培養液中に基質を添加し
、一定時間後に有機溶媒等で抽出することにより容易に
反応産物を回収することができるため、バイオリアクタ
ーとして有用である。
Ｃ２５ はミクロソーム画分に存在した。従って、Ｐ４
５０１７α由来のＮ末端１５アミノ酸残基が酵母内でミ
クロソーム膜へのシグナルの役割を果たし、本来はミト
コンドリアの膜蛋白であるＰ４５０Ｃ２５ を酵母ミク
ロソームで発現させることに成功した。また、キメラＰ
４５０Ｃ２５ 産生量は菌体当たり約２×１０５ 分子
であり、シグナルの置換によりＰ４５０Ｃ２５ の産生
量を約１０倍上昇させることができた。さらに、ミクロ
ソーム画分は、ＡＤＸとＡＤＲを添加することにより、
ＴＨＣ、ビタミンＤ３ 、１α−ヒドロキシビタミンＤ
３ に対し、高い水酸化活性を示した。特に、１α−ビ
タミンＤ３ に対する水酸化活性は元の５０１アミノ酸
からなる成熟型Ｐ４５０Ｃ２５ よりもはるかに高く、
１５アミノ酸残基の付加がＰ４５０Ｃ２５ の膜におけ
る存在状態を変化させ、活性を上昇させたと思われる。 また、キメラＰ４５０Ｃ２５ 、ＡＤＸおよびＡＤＲの
同時発現株はモノオキシゲナーゼ活性を発揮しているの
で、本発明者らは、酵母ミクロソーム膜上でＡＤＲから
ＡＤＸを経てキメラＰ４５０Ｃ２５ という電子伝達系
を構築することに成功した。従って、この菌株をステロ
イド化合物や活性型ビタミンＤ３ などの水酸化反応に
１ステップで行うことができる簡便なバイオリアクター
として利用できる。特に、菌体培養液中に基質を添加し
、一定時間後に有機溶媒等で抽出することにより容易に
反応産物を回収することができるため、バイオリアクタ
ーとして有用である。
【０００７】以下、本発明をさらに詳細に説明する。本
発明のキメラＰ４５０がＮ末端に有するミクロソームへ
の移行シグナルとしては、ウシ副腎Ｐ４５０１７αに限
らず、他のミクロソーム型Ｐ４５０の移行シグナルを用
いることが可能である。さらに、本発明のキメラＰ４５
０がＣ末端に有する成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０
としては、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５ に限らず、他のミ
トコンドリア型Ｐ４５０を用いることが可能である。ま
た、本発明のウシ副腎Ｐ４５０１７αおよびラット肝Ｐ
４５０Ｃ２５ をコードするｃＤＮＡはすでに公知であ
り、通常の操作法でこれを単離することができる。本発
明のキメラＰ４５０Ｃ２５ を発現する発現プラスミド
はウシ副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端アミノ酸配列に相当
するｃＤＮＡを合成し、成熟型ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５
をコードするｃＤＮＡ領域と連結した後、遺伝子を酵
母アルコール脱水素酵素（以下、ＡＤＨと略す。）遺伝
子のプロモーターおよび同ターミネーターを保持する酵
母発現ベクターｐＡＡＨ５（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １０１， ｐａｒｔＣ， ｐ１
９２−２０１ ）に挿入し構築することができる。また
、この発現プラスミド上に成熟型ＡＤＲおよび成熟型Ａ
ＤＸの発現ユニットを挿入することにより、３酵素を同
時に発現させるためのプラスミドを構築することができ
る。ただし、プロモーターおよびターミネーターはＡＤ
Ｈに限定されず、酵母内で効率的に機能するものであれ
ばよい。また、３酵素を同時に発現させるプラスミドの
プロモーターおよびターミネーターは同一でなく、それ
ぞれ異なっているほうが好ましい。その理由は、継代培
養した場合、プラスミド上での組み換えば起こる可能性
が低いからである。また、３酵素の発現ユニットへの挿
入位置、挿入方向はそれぞれ酵素の発現量にほとんど影
響を与えない。宿主として酵母を用いることが好ましい
が、さらに酵母サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２株
が、望ましい。キメラＰ４５０Ｃ２５ 遺伝子を含む発
現プラスミドあるいは３酵素同時発現プラスミドによる
宿主酵母の形質転換は、アルカリ金属（ＬｉＣｌ）を用
いる方法、プロトプラスト法など公知の方法で行うこと
ができる。本発明により得られる形質転換酵母の培養は
通常のグルコース、窒素源などを含む培地において通常
の培養方法により行うことができる。このようにして得
られた形質転換酵母菌体を培養することによりキメラＰ
４５０Ｃ２５ を製造することができる。
発明のキメラＰ４５０がＮ末端に有するミクロソームへ
の移行シグナルとしては、ウシ副腎Ｐ４５０１７αに限
らず、他のミクロソーム型Ｐ４５０の移行シグナルを用
いることが可能である。さらに、本発明のキメラＰ４５
０がＣ末端に有する成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０
としては、ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５ に限らず、他のミ
トコンドリア型Ｐ４５０を用いることが可能である。ま
た、本発明のウシ副腎Ｐ４５０１７αおよびラット肝Ｐ
４５０Ｃ２５ をコードするｃＤＮＡはすでに公知であ
り、通常の操作法でこれを単離することができる。本発
明のキメラＰ４５０Ｃ２５ を発現する発現プラスミド
はウシ副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端アミノ酸配列に相当
するｃＤＮＡを合成し、成熟型ラット肝Ｐ４５０Ｃ２５
をコードするｃＤＮＡ領域と連結した後、遺伝子を酵
母アルコール脱水素酵素（以下、ＡＤＨと略す。）遺伝
子のプロモーターおよび同ターミネーターを保持する酵
母発現ベクターｐＡＡＨ５（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １０１， ｐａｒｔＣ， ｐ１
９２−２０１ ）に挿入し構築することができる。また
、この発現プラスミド上に成熟型ＡＤＲおよび成熟型Ａ
ＤＸの発現ユニットを挿入することにより、３酵素を同
時に発現させるためのプラスミドを構築することができ
る。ただし、プロモーターおよびターミネーターはＡＤ
Ｈに限定されず、酵母内で効率的に機能するものであれ
ばよい。また、３酵素を同時に発現させるプラスミドの
プロモーターおよびターミネーターは同一でなく、それ
ぞれ異なっているほうが好ましい。その理由は、継代培
養した場合、プラスミド上での組み換えば起こる可能性
が低いからである。また、３酵素の発現ユニットへの挿
入位置、挿入方向はそれぞれ酵素の発現量にほとんど影
響を与えない。宿主として酵母を用いることが好ましい
が、さらに酵母サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２株
が、望ましい。キメラＰ４５０Ｃ２５ 遺伝子を含む発
現プラスミドあるいは３酵素同時発現プラスミドによる
宿主酵母の形質転換は、アルカリ金属（ＬｉＣｌ）を用
いる方法、プロトプラスト法など公知の方法で行うこと
ができる。本発明により得られる形質転換酵母の培養は
通常のグルコース、窒素源などを含む培地において通常
の培養方法により行うことができる。このようにして得
られた形質転換酵母菌体を培養することによりキメラＰ
４５０Ｃ２５ を製造することができる。
【０００８】
【実施例】以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明
する。しかし、本発明は本実施例にのみ限定されないこ
とはいうまでもない。実施例１ 発現プラスミドｐＡ
ＭＳ２５および３酵素同時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２
５の構築 以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合などの反応は、通常２０〜２
００μｌの反応容積を用いて、これらの酵素類を市販す
るメーカー（例えば、宝酒造（株））が製品に添付した
反応条件で実施した。キメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ 発現プ
ラスミドｐＡＭＳ２５を図１に従い構築した。ラット肝
Ｐ４５０Ｃ２５ 発現プラスミドｐＡＣ２５（特願２−
２５８３６２）を構築した際、得られたプラスミドｐＵ
Ｃ２５ＮをＰｓｔＩで部分消化した後ＥｃｏＲＩ消化し
、得られたＤＮＡ断片に合成リンカー：
する。しかし、本発明は本実施例にのみ限定されないこ
とはいうまでもない。実施例１ 発現プラスミドｐＡ
ＭＳ２５および３酵素同時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２
５の構築 以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合などの反応は、通常２０〜２
００μｌの反応容積を用いて、これらの酵素類を市販す
るメーカー（例えば、宝酒造（株））が製品に添付した
反応条件で実施した。キメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ 発現プ
ラスミドｐＡＭＳ２５を図１に従い構築した。ラット肝
Ｐ４５０Ｃ２５ 発現プラスミドｐＡＣ２５（特願２−
２５８３６２）を構築した際、得られたプラスミドｐＵ
Ｃ２５ＮをＰｓｔＩで部分消化した後ＥｃｏＲＩ消化し
、得られたＤＮＡ断片に合成リンカー：
【配列表】を挿入し、得られたプラスミドからＨｉｎｄ
ＩＩＩ −ＳａｃＩ断片を調製した。一方、ｐＵＣ２５
ＣＨ（特願２−２５８２６２）からＳａｃＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ 断片を調製し、これら両断片をｐＵＣ１９のＨ
ｉｎｄＩＩＩ 部位に同時に挿入することによりプラス
ミドｐＵＭＳ２５を得た。次に、ｐＵＭＳ２５から得た
ＨｉｎｄＩＩＩ 断片をベクターｐＡＡＨ５Ｎ（特開平
２−５１５２５）のＨｉｎｄＩＩＩ 部位に挿入するこ
とにより発現プラスミドｐＡＭＳ２５を構築した。
ＩＩＩ −ＳａｃＩ断片を調製した。一方、ｐＵＣ２５
ＣＨ（特願２−２５８２６２）からＳａｃＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ 断片を調製し、これら両断片をｐＵＣ１９のＨ
ｉｎｄＩＩＩ 部位に同時に挿入することによりプラス
ミドｐＵＭＳ２５を得た。次に、ｐＵＭＳ２５から得た
ＨｉｎｄＩＩＩ 断片をベクターｐＡＡＨ５Ｎ（特開平
２−５１５２５）のＨｉｎｄＩＩＩ 部位に挿入するこ
とにより発現プラスミドｐＡＭＳ２５を構築した。
【０００９】成熟型ＡＤＸ（特願平２−１３６４９６に
記載）をコードするＨｉｎｄＩＩＩ 断片をベクターｐ
ＧＡＨＮ（ベクターｐＡＡＨ５ＮのＡＤＨプロモーター
、ターミネーターのかわりにＰＧＫプロモーター、ター
ミネーターを含む）のＰＧＫプロモーター、ターミネー
ター（特願平２−１３６４９６に記載）の間に挿入する
ことにより発現プラスミドｐＧＸを得た。また、成熟型
ＡＤＲ（特開昭６３−１１２９８６に記載）をコードす
るＨｉｎｄＩＩＩ 断片をベクターｐＰＡＨＮ（ベクタ
ーｐＡＡＨ５ＮのＡＤＨプロモーター、ターミネーター
のかわりにＧＡＰプロモーター、ターミネーター（特開
昭６３−１１２９８６に記載）を含む）のＧＡＰプロモ
ーター、ターミネーターの間に挿入することによりｐＰ
Ｒを得た。ｐＰＲをＮｏｔＩで部分消化して得られたＤ
ＮＡ断片とｐＧＸから得られたＮｏｔＩ断片とのリガー
ゼ反応を行うことによりＡＤＲ、ＡＤＸ同時発現プラス
ミドｐＲＸ５を得た。次にｐＲＸ５をＮｏｔＩで部分消
化し、ｐＡＭＳ２５より得たＮｏｔＩ断片（３．７ｋｂ
）を連結することによりキメラＰ４５０Ｃ２５ 、ＡＤ
ＸおよびＡＤＲ同時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５を得
た。
記載）をコードするＨｉｎｄＩＩＩ 断片をベクターｐ
ＧＡＨＮ（ベクターｐＡＡＨ５ＮのＡＤＨプロモーター
、ターミネーターのかわりにＰＧＫプロモーター、ター
ミネーターを含む）のＰＧＫプロモーター、ターミネー
ター（特願平２−１３６４９６に記載）の間に挿入する
ことにより発現プラスミドｐＧＸを得た。また、成熟型
ＡＤＲ（特開昭６３−１１２９８６に記載）をコードす
るＨｉｎｄＩＩＩ 断片をベクターｐＰＡＨＮ（ベクタ
ーｐＡＡＨ５ＮのＡＤＨプロモーター、ターミネーター
のかわりにＧＡＰプロモーター、ターミネーター（特開
昭６３−１１２９８６に記載）を含む）のＧＡＰプロモ
ーター、ターミネーターの間に挿入することによりｐＰ
Ｒを得た。ｐＰＲをＮｏｔＩで部分消化して得られたＤ
ＮＡ断片とｐＧＸから得られたＮｏｔＩ断片とのリガー
ゼ反応を行うことによりＡＤＲ、ＡＤＸ同時発現プラス
ミドｐＲＸ５を得た。次にｐＲＸ５をＮｏｔＩで部分消
化し、ｐＡＭＳ２５より得たＮｏｔＩ断片（３．７ｋｂ
）を連結することによりキメラＰ４５０Ｃ２５ 、ＡＤ
ＸおよびＡＤＲ同時発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５を得
た。
【００１０】実施例２ 発現プラスミドによる酵母の
形質転換 サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２（ＡＴＣＣ ３
８６２６）を、５ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、
２％ポリペプトン、２％グルコース）中で３０℃、１８
時間培養したのち、１ｍｌの酵母培養液を遠心分離し、
集菌した。菌体を、０．２Ｍ ＬｉＣｌ溶液１ｍｌで
洗浄したのち、１Ｍ ＬｉＣｌ溶液２０μｌに懸濁し
た。これに、７０％ポリエチレングリコール４０００溶
液３０μｌ、発現プラスミドｐＡＭＳ２５溶液１０μｌ
（約１μｇＤＮＡ）を添加して、充分に混合したのち、
３０℃で１時間インキュベートした。ついで、１４０μ
ｌの水を加えＳＤ合成培地プレート（２％グルコース、
０．６７％酵母窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／ｍｌヒ
スチジン、２％寒天）上にまき、３０℃で３日間インキ
ュベートすることにより、プラスミドを保持する形質転
換体を得た。
形質転換 サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２（ＡＴＣＣ ３
８６２６）を、５ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、
２％ポリペプトン、２％グルコース）中で３０℃、１８
時間培養したのち、１ｍｌの酵母培養液を遠心分離し、
集菌した。菌体を、０．２Ｍ ＬｉＣｌ溶液１ｍｌで
洗浄したのち、１Ｍ ＬｉＣｌ溶液２０μｌに懸濁し
た。これに、７０％ポリエチレングリコール４０００溶
液３０μｌ、発現プラスミドｐＡＭＳ２５溶液１０μｌ
（約１μｇＤＮＡ）を添加して、充分に混合したのち、
３０℃で１時間インキュベートした。ついで、１４０μ
ｌの水を加えＳＤ合成培地プレート（２％グルコース、
０．６７％酵母窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／ｍｌヒ
スチジン、２％寒天）上にまき、３０℃で３日間インキ
ュベートすることにより、プラスミドを保持する形質転
換体を得た。
【００１１】実施例３ キメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ の
生産実施例３で得たＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株、ＡＨ２
２／ｐＲＸＭＳ２５株およびコントロールＡＨ２２／ｐ
ＡＡＨ５株を合成培地（８％ グルコース、５．４％
酵母窒素源アミノ酸不含、１６０μｇ／ｍｌ ヒスチ
ジン）３００ｍｌでそれぞれ約２×１０７ 細胞／ｍｌ
まで培養し、集菌後１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐ
Ｈ７．０）で洗浄したのち、同緩衝液２ｍｌに懸濁した
。２本のキュベットに菌懸濁液を１ｍｌずつ分注し、サ
ンプル側キュベットに一酸化炭素を吹き込んだのち、両
キュベットにジチオナイト５〜１０ｍｇを添加した。よ
く攪拌したのち４００〜５００ｎｍの差スペクトルを測
定し、Δε（４５０ｎｍ−４９０ｎｍ） ＝９１ｍＭ−
１ｃｍ−１をもとにしてヘム含有Ｐ４５０量を算出した
。その結果、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５および、ＡＨ２２
／ｐＲＸＭＳ２５株は、それぞれ菌体あたり２×１０５
分子および１×１０５ 分子のヘム含有Ｐ４５０を産
生することが判明した。それに対して、コントロールＡ
Ｈ２２／ｐＡＡＨ５株ではヘム含有Ｐ４５０の産生は認
められなかった。
生産実施例３で得たＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株、ＡＨ２
２／ｐＲＸＭＳ２５株およびコントロールＡＨ２２／ｐ
ＡＡＨ５株を合成培地（８％ グルコース、５．４％
酵母窒素源アミノ酸不含、１６０μｇ／ｍｌ ヒスチ
ジン）３００ｍｌでそれぞれ約２×１０７ 細胞／ｍｌ
まで培養し、集菌後１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐ
Ｈ７．０）で洗浄したのち、同緩衝液２ｍｌに懸濁した
。２本のキュベットに菌懸濁液を１ｍｌずつ分注し、サ
ンプル側キュベットに一酸化炭素を吹き込んだのち、両
キュベットにジチオナイト５〜１０ｍｇを添加した。よ
く攪拌したのち４００〜５００ｎｍの差スペクトルを測
定し、Δε（４５０ｎｍ−４９０ｎｍ） ＝９１ｍＭ−
１ｃｍ−１をもとにしてヘム含有Ｐ４５０量を算出した
。その結果、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５および、ＡＨ２２
／ｐＲＸＭＳ２５株は、それぞれ菌体あたり２×１０５
分子および１×１０５ 分子のヘム含有Ｐ４５０を産
生することが判明した。それに対して、コントロールＡ
Ｈ２２／ｐＡＡＨ５株ではヘム含有Ｐ４５０の産生は認
められなかった。
【００１２】実施例４ 酵母のミクロソーム画分にお
けるビタミンＤ３ 、１α−ヒドロキシビタミンＤ３
２５位水酸化活性およびＴＨＣ２７位水酸化活性の測定
ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株菌体から調製したミクロソー
ム画分を用いて、活性を測定した。形質転換酵母菌株か
らの細胞分画は以下の方法に従った。形質転換体の約２
×１０７ 菌体／ｍｌ培養液から約４×１０１０菌体分
を集菌し、ザイモリアーゼ溶液（１０ｍＭ トリス−
塩酸（ｐＨ７．５）、２．０Ｍソルビトール、０．１ｍ
Ｍ ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．３ｍｇ／ｍｌザイモリアーゼ１００Ｔ）に懸濁し、
３０℃で１時間インキュベートしてスフェロプラストを
調製した。これをソニケーションバッファー（１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．６５Ｍ ソル
ビトール、０．１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１
μｇ／ｍｌ ペプスタチン）に懸濁し、テフロンホモ
ジナイザーでホモジナイズすることにより菌体を破砕し
た。
けるビタミンＤ３ 、１α−ヒドロキシビタミンＤ３
２５位水酸化活性およびＴＨＣ２７位水酸化活性の測定
ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株菌体から調製したミクロソー
ム画分を用いて、活性を測定した。形質転換酵母菌株か
らの細胞分画は以下の方法に従った。形質転換体の約２
×１０７ 菌体／ｍｌ培養液から約４×１０１０菌体分
を集菌し、ザイモリアーゼ溶液（１０ｍＭ トリス−
塩酸（ｐＨ７．５）、２．０Ｍソルビトール、０．１ｍ
Ｍ ジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．３ｍｇ／ｍｌザイモリアーゼ１００Ｔ）に懸濁し、
３０℃で１時間インキュベートしてスフェロプラストを
調製した。これをソニケーションバッファー（１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．６５Ｍ ソル
ビトール、０．１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１
μｇ／ｍｌ ペプスタチン）に懸濁し、テフロンホモ
ジナイザーでホモジナイズすることにより菌体を破砕し
た。
【００１３】３０００×ｇ、５分間の遠心分離により、
沈澱１を取り除き、上清１’を得た。沈澱１をソニケー
ションバッファーに懸濁し再度ホモジナイズしたのち、
３０００×ｇ、５分間遠心分離し沈澱１（未破砕菌体・
核画分）および上清１”を得た。上清１’および１”を
併せて上清１とし、１０，０００×ｇ、２０分間遠心分
離し、沈澱２（ミトコンドリア画分）と上清２を得た。 上清２をさらに１２０，０００×ｇ、７０分間遠心分離
し、沈澱３（ミクロソーム画分）と上清３（細胞質画分
）に分けた。各画分の還元型ＣＯ結合差スペクトルを測
定したところ、約８０％のキメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ が
ミクロソーム画分に存在したため、ミクロソーム画分を
用いて活性を測定した。以下に示す反応系（２ｍｌ）の
うちＮＡＤＰＨ以外を混合し、３７℃で５分間インキュ
ベートした後、ＮＡＤＰＨを添加し、反応を開始した。 １０、３０分後、反応液 ０．５ ｍｌ を分取し、５
ｍｌのベンゼンを添加し、遠心分離により得られたベ
ンゼン層を乾固し、以下に示した条件下でＨＰＬＣによ
り分析した。
沈澱１を取り除き、上清１’を得た。沈澱１をソニケー
ションバッファーに懸濁し再度ホモジナイズしたのち、
３０００×ｇ、５分間遠心分離し沈澱１（未破砕菌体・
核画分）および上清１”を得た。上清１’および１”を
併せて上清１とし、１０，０００×ｇ、２０分間遠心分
離し、沈澱２（ミトコンドリア画分）と上清２を得た。 上清２をさらに１２０，０００×ｇ、７０分間遠心分離
し、沈澱３（ミクロソーム画分）と上清３（細胞質画分
）に分けた。各画分の還元型ＣＯ結合差スペクトルを測
定したところ、約８０％のキメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ が
ミクロソーム画分に存在したため、ミクロソーム画分を
用いて活性を測定した。以下に示す反応系（２ｍｌ）の
うちＮＡＤＰＨ以外を混合し、３７℃で５分間インキュ
ベートした後、ＮＡＤＰＨを添加し、反応を開始した。 １０、３０分後、反応液 ０．５ ｍｌ を分取し、５
ｍｌのベンゼンを添加し、遠心分離により得られたベ
ンゼン層を乾固し、以下に示した条件下でＨＰＬＣによ
り分析した。
【００１４】
［反応系］
１．ミクロソーム画分：ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株（０
．８ ｎｍｏｌ キメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ ／５．３
ｍｇ 蛋白質を含む） ＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株
（５．３ ｍｇ 蛋白質を含む）２．ウシ副腎アドレ
ノドキシン還元酵素 ０．８
ｎｍｏｌ３．アドレノドキシン
８．０ ｎｍｏｌ
４．基質
終濃度 ２００ μＭ５．Ｎ
ＡＤＰＨ
終濃度 １．０ 〜２．０ ｍＭ ６．
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．８）
１００
．０ ｍＭ７．ＥＤＴＡ
０．５
〜１．０ ｍＭ［ＨＰＬＣ分析条件］ カラム ：μＢｏｎｄａｐａｋＣ１８（φ ４ ×
３００ ｍｍ）検出 ：Ａ２６５ （ヒ゛タミ
ン Ｄ３， １ α−ヒト゛ロキシヒ゛タミンＤ３），
放射性検出器 （３Ｈ−ＴＨＣ） 流速 ：１．０ ｍｌ／ｍｉｎ 温度 ：５０ ℃ 溶出条件 ０〜 ５分 ８０ ％５〜１５分
８０ ％ 〜 １００ ％の直線濃度勾配１５〜２
５分 １００ ％
．８ ｎｍｏｌ キメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ ／５．３
ｍｇ 蛋白質を含む） ＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株
（５．３ ｍｇ 蛋白質を含む）２．ウシ副腎アドレ
ノドキシン還元酵素 ０．８
ｎｍｏｌ３．アドレノドキシン
８．０ ｎｍｏｌ
４．基質
終濃度 ２００ μＭ５．Ｎ
ＡＤＰＨ
終濃度 １．０ 〜２．０ ｍＭ ６．
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．８）
１００
．０ ｍＭ７．ＥＤＴＡ
０．５
〜１．０ ｍＭ［ＨＰＬＣ分析条件］ カラム ：μＢｏｎｄａｐａｋＣ１８（φ ４ ×
３００ ｍｍ）検出 ：Ａ２６５ （ヒ゛タミ
ン Ｄ３， １ α−ヒト゛ロキシヒ゛タミンＤ３），
放射性検出器 （３Ｈ−ＴＨＣ） 流速 ：１．０ ｍｌ／ｍｉｎ 温度 ：５０ ℃ 溶出条件 ０〜 ５分 ８０ ％５〜１５分
８０ ％ 〜 １００ ％の直線濃度勾配１５〜２
５分 １００ ％
【００１５】ビタミンＤ３ 、および１α−ヒドロキシ
ビタミンＤ３ を基質とした場合、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ
２５株ミクロソーム画分において、２５位水酸化物の産
生が認められた。コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株
では２５位水酸化物への変換は認められず、ＡＨ２２／
ｐＡＭＳ２５株における２５位水酸化活性がキメラ体Ｐ
４５０Ｃ２５ に依存することが示唆された。ＡＤＲ，
ＡＤＸ無添加の場合、活性を示さないことから、ミクロ
ソーム膜に存在するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素から
は電子が伝達されないことがわかった。また、ＮＡＤＰ
Ｈ無添加では活性を示さず、ＮＡＤＰＨ、ＡＤＸ、ＡＤ
Ｒ添加時に形成されるＮＡＤＰＨ→ＡＤＲ→ＡＤＸ→キ
メラ体Ｐ４５０Ｃ２５ という電子伝達系の構築にとも
なって、モノオキシゲナーゼ活性が発揮されたと思われ
る。
ビタミンＤ３ を基質とした場合、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ
２５株ミクロソーム画分において、２５位水酸化物の産
生が認められた。コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株
では２５位水酸化物への変換は認められず、ＡＨ２２／
ｐＡＭＳ２５株における２５位水酸化活性がキメラ体Ｐ
４５０Ｃ２５ に依存することが示唆された。ＡＤＲ，
ＡＤＸ無添加の場合、活性を示さないことから、ミクロ
ソーム膜に存在するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素から
は電子が伝達されないことがわかった。また、ＮＡＤＰ
Ｈ無添加では活性を示さず、ＮＡＤＰＨ、ＡＤＸ、ＡＤ
Ｒ添加時に形成されるＮＡＤＰＨ→ＡＤＲ→ＡＤＸ→キ
メラ体Ｐ４５０Ｃ２５ という電子伝達系の構築にとも
なって、モノオキシゲナーゼ活性が発揮されたと思われ
る。
【００１６】反応時間１０分において算出された代謝回
転速度は ７．４ ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／ｍｉｎで
あり、ＡＨ２２／ｐＡＣ２５株（特願２−２５８２６２
）のミトコンドリア画分において得られた代謝回転速度
０．１４ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／ｍｉｎ に比べて
約５０倍高いことがわかった。また、ビタミンＤ３ に
対する２５位水酸化活性は ０．２８ ｍｏｌ／ｍｏｌ
Ｐ４５０／ｍｉｎ であった。〔 ３Ｈ〕−ＴＨＣを基
質とした場合、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株ミクロソーム
画分は、ＴＨＣ２７位水酸化体（ＴｅＨＣ）への変換が
検出された。コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では
活性が認められず、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株における
活性がキメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ に依存することが示唆
された。反応時間１０分において算出されたＴＨＣに対
する代謝回転速度は ２３ ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／
ｍｉｎ であった。
転速度は ７．４ ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／ｍｉｎで
あり、ＡＨ２２／ｐＡＣ２５株（特願２−２５８２６２
）のミトコンドリア画分において得られた代謝回転速度
０．１４ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／ｍｉｎ に比べて
約５０倍高いことがわかった。また、ビタミンＤ３ に
対する２５位水酸化活性は ０．２８ ｍｏｌ／ｍｏｌ
Ｐ４５０／ｍｉｎ であった。〔 ３Ｈ〕−ＴＨＣを基
質とした場合、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株ミクロソーム
画分は、ＴＨＣ２７位水酸化体（ＴｅＨＣ）への変換が
検出された。コントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株では
活性が認められず、ＡＨ２２／ｐＡＭＳ２５株における
活性がキメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ に依存することが示唆
された。反応時間１０分において算出されたＴＨＣに対
する代謝回転速度は ２３ ｍｏｌ／ｍｏｌＰ４５０／
ｍｉｎ であった。
【００１７】実施例５ ３者同時発現株ＡＨ２２／ｐ
ＲＸＭＳ２５株におけるＴＨＣ２７位水酸化活性の測定
ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株の培養液 （１．６ ×
１０７菌体／ｍｌ）に終濃度１０μＭになるように［
３Ｈ］−ＴＨＣを添加し、１４時間後の培養液１ｍｌを
分取し、ジクロロメタン２ｍｌにより抽出し、ジクロロ
メタン層を乾固した後８０μｌのアセトニトリルに溶解
し、そのうち５０μｌをＨＰＬＣにより実施例４に記述
した条件で分析した。但し、検出は放射活性検出装置（
パッカード社 ＴＲＡＣＥ７１４０）を用いた。その
結果、添加した基質ＴＨＣの１９％がＴｅＨＣに変換し
たことが分かった。 この変換はコントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株には見
られなかったことから、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株に
おいてキメラＰ４５０Ｃ２５、ＡＤＸおよびＡＤＲが酵
母細胞内で電子伝達系を構成し、モノオキシゲナーゼ活
性を発揮したことが分かった。
ＲＸＭＳ２５株におけるＴＨＣ２７位水酸化活性の測定
ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株の培養液 （１．６ ×
１０７菌体／ｍｌ）に終濃度１０μＭになるように［
３Ｈ］−ＴＨＣを添加し、１４時間後の培養液１ｍｌを
分取し、ジクロロメタン２ｍｌにより抽出し、ジクロロ
メタン層を乾固した後８０μｌのアセトニトリルに溶解
し、そのうち５０μｌをＨＰＬＣにより実施例４に記述
した条件で分析した。但し、検出は放射活性検出装置（
パッカード社 ＴＲＡＣＥ７１４０）を用いた。その
結果、添加した基質ＴＨＣの１９％がＴｅＨＣに変換し
たことが分かった。 この変換はコントロールＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株には見
られなかったことから、ＡＨ２２／ｐＲＸＭＳ２５株に
おいてキメラＰ４５０Ｃ２５、ＡＤＸおよびＡＤＲが酵
母細胞内で電子伝達系を構成し、モノオキシゲナーゼ活
性を発揮したことが分かった。
【００１８】本発明により提供される形質転換酵母は分
子内にヘムを含有するキメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ を産生
する。キメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ は酵母のミクロソーム
膜に局在し、ウシ副腎ＡＤＸおよびＡＤＲの添加により
ビタミンＤ３ および１α−ヒドロキシビタミンＤ３
に対して２５位水酸化活性を示し、ＴＨＣに対し２７位
水酸化活性を示した。本来、Ｐ４５０Ｃ２５ はミトコ
ンドリア内膜に存在するタンパク質であるが、ミトコン
ドリアへの輸送シグナルを除去し、ミクロソーム型Ｐ４
５０１７αのＮ末端１５アミノ酸残基（ミクロソーム膜
へのシグナルとして機能する）を付加することにより、
酵母細胞内局在性をミトコンドリアからミクロソームへ
変換することができた。このような膜酵素の局在性の変
換はこれまでに例がない。Ｐ４５０１７αのＮ末端１５
アミノ酸残基は疎水性が高く、ミクロソーム膜へのシグ
ナルの役割を果たしていると考えられるが、シグナルと
しての特殊性はなく、他のミクロソーム膜タンパク質の
シグナルとの代替も可能である。
子内にヘムを含有するキメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ を産生
する。キメラ体Ｐ４５０Ｃ２５ は酵母のミクロソーム
膜に局在し、ウシ副腎ＡＤＸおよびＡＤＲの添加により
ビタミンＤ３ および１α−ヒドロキシビタミンＤ３
に対して２５位水酸化活性を示し、ＴＨＣに対し２７位
水酸化活性を示した。本来、Ｐ４５０Ｃ２５ はミトコ
ンドリア内膜に存在するタンパク質であるが、ミトコン
ドリアへの輸送シグナルを除去し、ミクロソーム型Ｐ４
５０１７αのＮ末端１５アミノ酸残基（ミクロソーム膜
へのシグナルとして機能する）を付加することにより、
酵母細胞内局在性をミトコンドリアからミクロソームへ
変換することができた。このような膜酵素の局在性の変
換はこれまでに例がない。Ｐ４５０１７αのＮ末端１５
アミノ酸残基は疎水性が高く、ミクロソーム膜へのシグ
ナルの役割を果たしていると考えられるが、シグナルと
しての特殊性はなく、他のミクロソーム膜タンパク質の
シグナルとの代替も可能である。
【００１９】シグナルの置換に基づく膜酵素の局在性を
ミトコンドリアからミクロソームへ変化させることによ
り、酵母菌体あたりのＰ４５０Ｃ ２５産生量は約１０
倍に、またＰ４５０分子あたりの１α−ヒドロキシビタ
ミンＤ３ ２５位水酸化活性を約５０倍に上昇させるこ
とができた。したがって、菌体あたりの１α−ヒドロキ
シビタミンＤ３ ２５位水酸化能は約５００倍に上昇し
たことになる。キメラ体Ｐ４５０Ｃ ２５をバイオリア
クターとして用いることにより、カルシウムの代謝調節
、細胞分化促進や細胞性免疫機能を調節に重要な役割を
果たし、骨粗そう症、慢性腎不全、ビタミンＤ抵抗性ク
ル病などの治療に有効である１α，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ３を製造することが可能である。
ミトコンドリアからミクロソームへ変化させることによ
り、酵母菌体あたりのＰ４５０Ｃ ２５産生量は約１０
倍に、またＰ４５０分子あたりの１α−ヒドロキシビタ
ミンＤ３ ２５位水酸化活性を約５０倍に上昇させるこ
とができた。したがって、菌体あたりの１α−ヒドロキ
シビタミンＤ３ ２５位水酸化能は約５００倍に上昇し
たことになる。キメラ体Ｐ４５０Ｃ ２５をバイオリア
クターとして用いることにより、カルシウムの代謝調節
、細胞分化促進や細胞性免疫機能を調節に重要な役割を
果たし、骨粗そう症、慢性腎不全、ビタミンＤ抵抗性ク
ル病などの治療に有効である１α，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ３を製造することが可能である。
【００２０】また、キメラ体Ｐ４５０Ｃ ２５、ＡＤＸ
およびＡＤＲの同時発現株菌体をバイオリアクターとし
て用いることは現在行われている活性型ビタミンＤ３
の複雑な化学合成法を単純化するのに有効な手段である
と考えられる。一方、大量に産生されるキメラＰ４５０
Ｃ２５ は容易に精製することができ、これに対する抗
体を脳腱黄色腫症の診断薬として利用することができる
。
およびＡＤＲの同時発現株菌体をバイオリアクターとし
て用いることは現在行われている活性型ビタミンＤ３
の複雑な化学合成法を単純化するのに有効な手段である
と考えられる。一方、大量に産生されるキメラＰ４５０
Ｃ２５ は容易に精製することができ、これに対する抗
体を脳腱黄色腫症の診断薬として利用することができる
。
【００２１】また、Ｐ４５０Ｃ２５ だけではなく、他
のミトコンドリア型Ｐ４５０をキメラＰ４５０として大
量に生産することも可能である。それにより、前記のＰ
４５０Ｃ ２５が示す２５位水酸化活性だけでなく、他
の部位を水酸化することが可能となるので、そのような
キメラＰ４５０は、バイオリアクターとして有用である
。
のミトコンドリア型Ｐ４５０をキメラＰ４５０として大
量に生産することも可能である。それにより、前記のＰ
４５０Ｃ ２５が示す２５位水酸化活性だけでなく、他
の部位を水酸化することが可能となるので、そのような
キメラＰ４５０は、バイオリアクターとして有用である
。
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成リンカー配列
ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴ ＴＡＡＡＡＡＡＡＴＧ Ｔ
ＧＧＣＴＧＣＴＣＣ ＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴ ＴＣＴＧ
ＣＴＣＡＣＣ ＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴ ６０
ＧＴＴＣＧＡ ＡＴＴＴＴＴＴＴＡＣ ＡＣＣＧ
ＡＣＧＡＧＧ ＡＣＣＧＡＣＡＧＡＡ ＡＧＡＣＧＡＧ
ＴＧＧ ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡ ＴＡＧＣＧＡＴＣ
ＣＣ ＴＧＣＡ
７４ ＡＴＣＧＣＴＡＧＧＧ
ＧＧＣＴＧＣＴＣＣ ＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴ ＴＣＴＧ
ＣＴＣＡＣＣ ＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴ ６０
ＧＴＴＣＧＡ ＡＴＴＴＴＴＴＴＡＣ ＡＣＣＧ
ＡＣＧＡＧＧ ＡＣＣＧＡＣＡＧＡＡ ＡＧＡＣＧＡＧ
ＴＧＧ ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡ ＴＡＧＣＧＡＴＣ
ＣＣ ＴＧＣＡ
７４ ＡＴＣＧＣＴＡＧＧＧ
【図１】本発明の発現プラスミドｐＡＭＳ２５の構築工
程の説明図である。制限酵素切断部位は、Ｅ：ＥｃｏＲ
Ｉ，Ｎｃ：ＮｃｏＩ，Ｓ：ＳａｃＩ，Ｈ：ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ，Ｐ：ＰｓｔＩ，Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
程の説明図である。制限酵素切断部位は、Ｅ：ＥｃｏＲ
Ｉ，Ｎｃ：ＮｃｏＩ，Ｓ：ＳａｃＩ，Ｈ：ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ，Ｐ：ＰｓｔＩ，Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
【図２】発現プラスミドｐＲＸＭＳ２５の構築工程の説
明図である。制限酵素切断部位は、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ
、Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
明図である。制限酵素切断部位は、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ
、Ｎ：ＮｏｔＩを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナル
配列と、Ｃ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０か
らなるキメラＰ４５０を酵母内で大量生産させる発現プ
ラスミド 【請求項２】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナル
配列がウシ副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５アミノ酸で
あることを特徴とする請求項１記載の発現プラスミド【
請求項３】Ｃ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０
がラット肝ミトコンドリアＰ４５０Ｃ２５ であること
を特徴とする請求項１記載の発現プラスミド【請求項４
】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナル配列がウシ
副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５アミノ酸であり、Ｃ末
端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０がラット肝ミト
コンドリアＰ４５０Ｃ２５ であることを特徴とする請
求項１記載の発現プラスミド 【請求項５】酵母アルコール脱水素酵素のプロモーター
を含む請求項１記載の発現プラスミド 【請求項６】酵母アルコール脱水素酵素のプロモーター
を含む請求項２記載の発現プラスミド 【請求項７】酵母アルコール脱水素酵素のプロモーター
を含む請求項３記載の発現プラスミド 【請求項８】酵母アルコール脱水素酵素のプロモーター
を含む請求項４記載の発現プラスミド 【請求項９】下の制限酵素地図で表される発現プラスミ
ドｐＡＭＳ２５ 【請求項１０】請求項１記載の発現プラスミドを保持す
る酵母菌株 【請求項１１】請求項２記載の発現プラスミドを保持す
る酵母菌株 【請求項１２】請求項３記載の発現プラスミドを保持す
る酵母菌株 【請求項１３】請求項４記載の発現プラスミドを保持す
る酵母菌株 【請求項１４】請求項５記載の発現プラスミドを保持す
る酵母菌株 【請求項１５】請求項６記載の発現プラスミドを保持す
る酵母菌株 【請求項１６】請求項７記載の発現プラスミドを保持す
る酵母菌株 【請求項１７】請求項８記載の発現プラスミドを保持す
る酵母菌株 【請求項１８】プラスミドｐＡＭＳ２５を保持する酵母
菌株 【請求項１９】サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２／
ｐＡＭＳ２５ 【請求項２０】請求項１０記載の酵母菌株を培養するこ
とを特徴とするキメラＰ４５０の生産方法【請求項２１
】請求項１１記載の酵母菌株を培養することを特徴とす
るキメラＰ４５０の生産方法【請求項２２】請求項１２
記載の酵母菌株を培養することを特徴とするキメラＰ４
５０Ｃ２５ の生産方法【請求項２３】請求項１３記載
の酵母菌株を培養することを特徴とするキメラＰ４５０
Ｃ２５ の生産方法【請求項２４】請求項１４記載の酵
母菌株を培養することを特徴とするキメラＰ４５０の生
産方法【請求項２５】請求項１５記載の酵母菌株を培養
することを特徴とするキメラＰ４５０の生産方法【請求
項２６】請求項１６記載の酵母菌株を培養することを特
徴とするキメラＰ４５０Ｃ２５ の生産方法【請求項２
７】請求項１７記載の酵母菌株を培養することを特徴と
するキメラＰ４５０Ｃ２５ の生産方法【請求項２８】
請求項１８記載の酵母菌株を培養することを特徴とする
キメラＰ４５０Ｃ２５ の生産方法【請求項２９】請求
項１９記載の酵母菌株を培養することを特徴とするキメ
ラＰ４５０Ｃ２５ の生産方法【請求項３０】請求項１
０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８
あるいは１９記載の酵母菌株により５β−コレスタン−
３α，７α，１２α−トリオールの２７位、ビタミンＤ
３ および１α−ヒドロキシビタミンＤ３ の２５位に
それぞれ水酸化を導入することを特徴とする５β−コレ
スタン−３α，７α，１２α，２７−テトロールおよび
２５−ヒドロキシビタミンＤ３ 、１α，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ３ の製造方法【請求項３１】Ｎ末端
のミクロソームへの局在化シグナル配列とＣ末端の成熟
型のミトコンドリア型Ｐ４５０からなるキメラＰ４５０
、フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に
発現させるプラスミド【請求項３２】ウシ副腎Ｐ４５０
１７αのＮ末端１５アミノ酸残基からなるシグナル配列
とＣ末端の成熟型ミトコンドリア型Ｐ４５０からなるキ
メラＰ４５０、フェレドキシン及びフェレドキシン還元
酵素を同時に発現させるプラスミド 【請求項３３】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナ
ル配列と５０１アミノ酸からなる成熟型のラット肝ミト
コンドリアＰ４５０Ｃ２５ からなるキメラＰ４５０Ｃ
２５ 、フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を
同時に発現させるプラスミド 【請求項３４】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナ
ル配列と５０１アミノ酸からなる成熟型のラット肝ミト
コンドリアＰ４５０Ｃ２５ からなるキメラＰ４５０Ｃ
２５ 、ウシ副腎アドレノドキシン還元酵素およびウシ
副腎アドレノドキシンを同時に発現させるプラスミド【
請求項３５】下の制限酵素地図で表される発現プラスミ
ドｐＲＸＭＳ２５ 【請求項３６】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナ
ル配列とＣ末端の成熟型のミトコンドリア型Ｐ４５０か
らなるキメラＰ４５０、フェレドキシン及びフェレドキ
シン還元酵素を同時に発現する酵母菌株【請求項３７】
ウシ副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５アミノ酸残基から
なるシグナル配列とＣ末端の成熟型のミトコンドリア型
Ｐ４５０からなるキメラＰ４５０、フェレドキシン及び
フェレドキシン還元酵素を同時に発現する酵母菌株 【請求項３８】Ｎ末端のミクロソームへの局在化シグナ
ル配列と５０１アミノ酸からなる成熟型のラット肝ミト
コンドリアＰ４５０Ｃ２５ からなるキメラＰ４５０Ｃ
２５ 、フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を
同時に発現する酵母菌株 【請求項３９】ウシ副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５ア
ミノ酸残基からなるシグナル配列と５０１アミノ酸から
なる成熟型のラット肝ミトコンドリアＰ４５０Ｃ２５
からなるキメラＰ４５０Ｃ２５ 、フェレドキシン及び
フェレドキシン還元酵素を同時に発現する酵母菌株【請
求項４０】ウシ副腎Ｐ４５０１７αのＮ末端１５アミノ
酸残基からなるシグナル配列と５０１アミノ酸からなる
成熟型のラット肝ミトコンドリアＰ４５０Ｃ２５ から
なるキメラＰ４５０Ｃ２５ 、ウシ副腎アドレノドキシ
ン還元酵素、ウシ副腎アドレノドキシンを同時に発現す
る酵母菌株 【請求項４１】プラスミドｐＲＸＭＳ２５を保持する酵
母菌株 【請求項４２】請求項３６、３７、３８、３９、４０あ
るいは４１記載の酵母菌株を用いることを特徴とする請
求項３０の製造方法
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3120123A JP2500543B2 (ja) | 1991-05-24 | 1991-05-24 | キメラｐ４５０産生菌株 |
| EP91116485A EP0477961B1 (en) | 1990-09-26 | 1991-09-26 | Mitochondrial P450 |
| DE69122016T DE69122016T2 (de) | 1990-09-26 | 1991-09-26 | Mitochondriales P450 |
| US08/702,795 US5668000A (en) | 1990-09-26 | 1996-08-26 | Mitochondrial P450 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3120123A JP2500543B2 (ja) | 1991-05-24 | 1991-05-24 | キメラｐ４５０産生菌株 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6190653A Division JP2517894B2 (ja) | 1994-08-12 | 1994-08-12 | フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現させるキメラｐ４５０産生菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04349887A true JPH04349887A (ja) | 1992-12-04 |
| JP2500543B2 JP2500543B2 (ja) | 1996-05-29 |
Family
ID=14778537
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3120123A Expired - Fee Related JP2500543B2 (ja) | 1990-09-26 | 1991-05-24 | キメラｐ４５０産生菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2500543B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013512663A (ja) * | 2009-12-03 | 2013-04-18 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | 酵母による非酵母ステロールの生成 |
| JP2013165659A (ja) * | 2012-02-15 | 2013-08-29 | Toyama Prefecture | ２５−ヒドロキシビタミンｄ２の製造方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6463383A (en) * | 1987-03-14 | 1989-03-09 | Boehringer Ingelheim Int | Human manganese super oxide dismutase |
| JPH04135486A (ja) * | 1990-09-26 | 1992-05-08 | Sumitomo Chem Co Ltd | キメラｐ４５０発現プラスミド及び該プラスミドを保持する酵母菌株 |
-
1991
- 1991-05-24 JP JP3120123A patent/JP2500543B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6463383A (en) * | 1987-03-14 | 1989-03-09 | Boehringer Ingelheim Int | Human manganese super oxide dismutase |
| JPH04135486A (ja) * | 1990-09-26 | 1992-05-08 | Sumitomo Chem Co Ltd | キメラｐ４５０発現プラスミド及び該プラスミドを保持する酵母菌株 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013512663A (ja) * | 2009-12-03 | 2013-04-18 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | 酵母による非酵母ステロールの生成 |
| JP2013165659A (ja) * | 2012-02-15 | 2013-08-29 | Toyama Prefecture | ２５−ヒドロキシビタミンｄ２の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2500543B2 (ja) | 1996-05-29 |
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