JPH05153980A - ラット腎ｐ４５０ｃ２４ 産生菌株 - Google Patents
ラット腎ｐ４５０ｃ２４ 産生菌株Info
- Publication number
- JPH05153980A JPH05153980A JP3320351A JP32035191A JPH05153980A JP H05153980 A JPH05153980 A JP H05153980A JP 3320351 A JP3320351 A JP 3320351A JP 32035191 A JP32035191 A JP 32035191A JP H05153980 A JPH05153980 A JP H05153980A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- escherichia coli
- expression plasmid
- rat kidney
- strain
- rat renal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】ラット腎ミトコンドリアＰ４５０C24 をコード
する遺伝子および該酵素を大量生産するための発現プラ
スミド、該発現プラスミドを保持する大腸菌株、該大腸
菌株を培養することによる該酵素の生産方法に関する。 【構成】ラットＰ４５０C24 を大腸菌内で発現させるプ
ラスミドを構築した。さらに、このＰ４５０C24 と、ウ
シ副腎アドレノドキシンとウシ副腎ＮＡＤＰＨ−アドレ
ノドキシン還元酵素と共役させることにより、２４位が
水酸化されたビタミンＤ3 を生成した。 【効果】本発明による大腸菌株は、ラットＰ４５０C24
を大量生産しているので、該大腸菌により生産した該酵
素とフェレドキシンおよびＮＡＤＰＨ−フェレドキシン
還元酵素とを用い、医薬品として有用なビタミンＤ3 誘
導体を合成できる。
する遺伝子および該酵素を大量生産するための発現プラ
スミド、該発現プラスミドを保持する大腸菌株、該大腸
菌株を培養することによる該酵素の生産方法に関する。 【構成】ラットＰ４５０C24 を大腸菌内で発現させるプ
ラスミドを構築した。さらに、このＰ４５０C24 と、ウ
シ副腎アドレノドキシンとウシ副腎ＮＡＤＰＨ−アドレ
ノドキシン還元酵素と共役させることにより、２４位が
水酸化されたビタミンＤ3 を生成した。 【効果】本発明による大腸菌株は、ラットＰ４５０C24
を大量生産しているので、該大腸菌により生産した該酵
素とフェレドキシンおよびＮＡＤＰＨ−フェレドキシン
還元酵素とを用い、医薬品として有用なビタミンＤ3 誘
導体を合成できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ラット腎ミトコンドリ
アＰ４５０C24 をコードする遺伝子および該酵素を大量
生産するための発現プラスミド、該発現プラスミドを保
持する大腸菌株、該大腸菌株を培養することによる該酵
素の生産方法、および該大腸菌株を用いることによるビ
タミンＤ3 誘導体の製造方法に関する。本発明による大
腸菌株は、ラットＰ４５０C24を大量生産しているの
で、該大腸菌株により生産した該酵素と、フェレドキシ
ンおよびＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素とを用
い、医薬品として有用なビタミンＤ3 誘導体を合成でき
る。
アＰ４５０C24 をコードする遺伝子および該酵素を大量
生産するための発現プラスミド、該発現プラスミドを保
持する大腸菌株、該大腸菌株を培養することによる該酵
素の生産方法、および該大腸菌株を用いることによるビ
タミンＤ3 誘導体の製造方法に関する。本発明による大
腸菌株は、ラットＰ４５０C24を大量生産しているの
で、該大腸菌株により生産した該酵素と、フェレドキシ
ンおよびＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素とを用
い、医薬品として有用なビタミンＤ3 誘導体を合成でき
る。
【０００２】
【従来の技術】Ｐ４５０は微生物から哺乳動物にいたる
まで広く生物界に存在するヘムタンパク質であり、電子
伝達系の末端酵素として種々の脂溶性化合物を基質とし
た１原子酸素添加反応を触媒する。末端酵素であるＰ４
５０は分子種が多様であり、それぞれが異なる基質特異
性を示すので、非常に広範囲の脂溶性化合物を水酸化す
ることができる。哺乳動物のＰ４５０依存性電子伝達系
はその構成酵素から、ミクロソーム型とミトコンドリア
型に分けられる。前者では、フラビンアデニンジヌクレ
オチドとフラビンモノヌクレオチドを分子内に補酵素と
して含有するＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素
（還元酵素）がＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給
し、後者では、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵
素として分子内に含有するＮＡＤＰＨ−フェレドキシン
還元酵素、および非ヘム鉄を補酵素として分子内に含有
するフェレドキシンがＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０
へ供給することにより、種々の脂溶性基質に対して水酸
化反応を触媒する。
まで広く生物界に存在するヘムタンパク質であり、電子
伝達系の末端酵素として種々の脂溶性化合物を基質とし
た１原子酸素添加反応を触媒する。末端酵素であるＰ４
５０は分子種が多様であり、それぞれが異なる基質特異
性を示すので、非常に広範囲の脂溶性化合物を水酸化す
ることができる。哺乳動物のＰ４５０依存性電子伝達系
はその構成酵素から、ミクロソーム型とミトコンドリア
型に分けられる。前者では、フラビンアデニンジヌクレ
オチドとフラビンモノヌクレオチドを分子内に補酵素と
して含有するＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素
（還元酵素）がＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給
し、後者では、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵
素として分子内に含有するＮＡＤＰＨ−フェレドキシン
還元酵素、および非ヘム鉄を補酵素として分子内に含有
するフェレドキシンがＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０
へ供給することにより、種々の脂溶性基質に対して水酸
化反応を触媒する。
【０００３】本発明者らはすでに、数種のミクロソーム
型Ｐ４５０、還元酵素およびミトコンドリア型Ｐ４５０
C25 を酵母内で生産させ、それらの組換え体酵母菌株を
用いることにより工学的に有用な水酸化反応を行うこと
に成功した。すなわち、ラット肝Ｐ４５０ｃ遺伝子、ウ
シ副腎Ｐ４５０17α遺伝子やＰ４５０C21 遺伝子をそれ
ぞれ単離し、これらの遺伝子を含む発現プラスミドを作
製し、これら発現プラスミドで酵母を形質転換すること
により、該酵素を産生する酵母菌株を得た（特開昭６１
−５６０７２、特開平１−４７３８０、特開平２−３１
６８０）。これらの酵母菌株はそれぞれのＰ４５０分子
種に依存した１原子酸素添加活性を示した。また、ラッ
ト肝還元酵素遺伝子や酵母還元酵素遺伝子を単離し、Ｐ
４５０還元能を有する該酵素の酵母内発現に成功した
（特開昭６２−１９０８５、特開平２−５１５２５）。
さらに、発明者らは、Ｐ４５０と還元酵素の両酵素を産
生する酵母菌株（特開昭６２−１０４５８２）や両酵素
の機能を１分子内に併せ持つ新規モノオキシゲナーゼの
作出に成功した（特開昭６３−４４８８８、特開平２−
２３８７０、特願平１−７１２５０）。また、ラット肝
ミトコンドリア型Ｐ４５０C25 遺伝子を含む発現プラス
ミドを作製し、この発現プラスミドで酵母を形質転換す
ることにより、該酵素を産生する酵母菌株を得た（特願
平２−２５８２６２）。この酵母菌株から粗精製したＰ
４５０C25 はウシ副腎ＡＤＸとウシ副腎ＡＤＲとの再構
成系において、Ｐ４５０分子種に依存した１原子酸素添
加活性を示した。以上のような技術により、本発明者ら
はこれらＰ４５０産生酵母菌株を用いて、医薬品として
有用なアセトアミノフェンやステロイドホルモン中間
体、活性型ビタミンＤ3 誘導体の合成を可能にした。ラ
ット腎Ｐ４５０C24 はミトコンドリア型Ｐ４５０分子種
の一つで、５１４アミノ酸からなる前駆体として細胞質
で合成されたのち、そのアミノ末端部分に存在する移行
シグナルが認識され、ミトコンドリア内膜へ取り込ま
れ、４７９アミノ酸からなる成熟型Ｐ４５０C24 （分子
量約５３ｋＤ。本明細書では単にＰ４５０C24 と称す
る）になる。ラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子は、プラスミ
ドpCC24-8 （Ohyama et al.,（1991）FEBS 278, 195-19
8 ）から単離できる。
型Ｐ４５０、還元酵素およびミトコンドリア型Ｐ４５０
C25 を酵母内で生産させ、それらの組換え体酵母菌株を
用いることにより工学的に有用な水酸化反応を行うこと
に成功した。すなわち、ラット肝Ｐ４５０ｃ遺伝子、ウ
シ副腎Ｐ４５０17α遺伝子やＰ４５０C21 遺伝子をそれ
ぞれ単離し、これらの遺伝子を含む発現プラスミドを作
製し、これら発現プラスミドで酵母を形質転換すること
により、該酵素を産生する酵母菌株を得た（特開昭６１
−５６０７２、特開平１−４７３８０、特開平２−３１
６８０）。これらの酵母菌株はそれぞれのＰ４５０分子
種に依存した１原子酸素添加活性を示した。また、ラッ
ト肝還元酵素遺伝子や酵母還元酵素遺伝子を単離し、Ｐ
４５０還元能を有する該酵素の酵母内発現に成功した
（特開昭６２−１９０８５、特開平２−５１５２５）。
さらに、発明者らは、Ｐ４５０と還元酵素の両酵素を産
生する酵母菌株（特開昭６２−１０４５８２）や両酵素
の機能を１分子内に併せ持つ新規モノオキシゲナーゼの
作出に成功した（特開昭６３−４４８８８、特開平２−
２３８７０、特願平１−７１２５０）。また、ラット肝
ミトコンドリア型Ｐ４５０C25 遺伝子を含む発現プラス
ミドを作製し、この発現プラスミドで酵母を形質転換す
ることにより、該酵素を産生する酵母菌株を得た（特願
平２−２５８２６２）。この酵母菌株から粗精製したＰ
４５０C25 はウシ副腎ＡＤＸとウシ副腎ＡＤＲとの再構
成系において、Ｐ４５０分子種に依存した１原子酸素添
加活性を示した。以上のような技術により、本発明者ら
はこれらＰ４５０産生酵母菌株を用いて、医薬品として
有用なアセトアミノフェンやステロイドホルモン中間
体、活性型ビタミンＤ3 誘導体の合成を可能にした。ラ
ット腎Ｐ４５０C24 はミトコンドリア型Ｐ４５０分子種
の一つで、５１４アミノ酸からなる前駆体として細胞質
で合成されたのち、そのアミノ末端部分に存在する移行
シグナルが認識され、ミトコンドリア内膜へ取り込ま
れ、４７９アミノ酸からなる成熟型Ｐ４５０C24 （分子
量約５３ｋＤ。本明細書では単にＰ４５０C24 と称す
る）になる。ラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子は、プラスミ
ドpCC24-8 （Ohyama et al.,（1991）FEBS 278, 195-19
8 ）から単離できる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ミトコンドリア型Ｐ４
５０分子種の関与する生体反応は生理的に重要な化合
物、例えば活性型ビタミンＤ3 などの合成反応が多く、
ミトコンドリア型Ｐ４５０分子種を産生する大腸菌株の
創製は産業面での応用可能性が高い。本発明者らはラッ
ト肝ミトコンドリアＰ４５０C25 を酵母で活性発現させ
ることに成功した（特願平２−２５８２６２）。しか
し、同じミトコンドリア型であるＰ４５０C24 を酵母で
産生させるとその発現量は低く、目的とする水酸化物が
充分量得られなかった。そこで、本発明者らは、ミトコ
ンドリアＰ４５０C24 を大量発現する形質転換微生物を
創製することを目的とした。さらに、ミトコンドリアＰ
４５０C2 4 の２４位水酸化活性発現には、ウシ副腎ＡＤ
Ｘおよびウシ副腎ＡＤＲの２酵素が必要である。そこ
で、本発明者らは、電子伝達系の再構成を試みた。
５０分子種の関与する生体反応は生理的に重要な化合
物、例えば活性型ビタミンＤ3 などの合成反応が多く、
ミトコンドリア型Ｐ４５０分子種を産生する大腸菌株の
創製は産業面での応用可能性が高い。本発明者らはラッ
ト肝ミトコンドリアＰ４５０C25 を酵母で活性発現させ
ることに成功した（特願平２−２５８２６２）。しか
し、同じミトコンドリア型であるＰ４５０C24 を酵母で
産生させるとその発現量は低く、目的とする水酸化物が
充分量得られなかった。そこで、本発明者らは、ミトコ
ンドリアＰ４５０C24 を大量発現する形質転換微生物を
創製することを目的とした。さらに、ミトコンドリアＰ
４５０C2 4 の２４位水酸化活性発現には、ウシ副腎ＡＤ
Ｘおよびウシ副腎ＡＤＲの２酵素が必要である。そこ
で、本発明者らは、電子伝達系の再構成を試みた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、誠意研究
をした結果ミトコンドリア型であるラット腎Ｐ４５０
C24 遺伝子が大腸菌で高い発現量を示すことを見い出し
た。 さらに、この形質転換大腸菌株から部分精製した
Ｐ４５０C24 は、ウシ副腎アドレノドキシン（以下、Ａ
ＤＸと略す）およびウシ副腎ＮＡＤＰＨ−アドレノドキ
シン還元酵素（以下、ＡＤＲと略す）と共役させること
により、25( ＯＨ) Ｄ3 から24,25(ＯＨ)2Ｄ3 を生成す
ることができた。
をした結果ミトコンドリア型であるラット腎Ｐ４５０
C24 遺伝子が大腸菌で高い発現量を示すことを見い出し
た。 さらに、この形質転換大腸菌株から部分精製した
Ｐ４５０C24 は、ウシ副腎アドレノドキシン（以下、Ａ
ＤＸと略す）およびウシ副腎ＮＡＤＰＨ−アドレノドキ
シン還元酵素（以下、ＡＤＲと略す）と共役させること
により、25( ＯＨ) Ｄ3 から24,25(ＯＨ)2Ｄ3 を生成す
ることができた。
【０００６】
【発明の効果】本発明により提供される形質転換大腸菌
によって、初めて分子内にヘムを含有する活性型Ｐ４５
０C24 を大腸菌で産生することが可能になった。さら
に、形質転換株から粗精製したＰ４５０C24 はウシ副腎
ＡＤＸとウシ副腎ＡＤＲとの再構成系において、25( Ｏ
Ｈ) Ｄ3 から24,25(ＯＨ)2Ｄ3 を生成した。本発明者ら
はすでにラット肝ミトコンドリアＰ４５０C25を酵母で
活性発現させることに成功している（特願平２−２５８
２６２）。しかし、同じミトコンドリア型であるＰ４５
０C24 を酵母で産生させるとその発現量は低く、目的と
する水酸化物である24,25(ＯＨ)2Ｄ3 が充分量得られな
かった。今回、本発明者らはビタミンＤ3 生合成系に関
与するミトコンドリア型Ｐ４５０としては初めて大腸菌
における機能発現に成功した。大腸菌内で産生されたＰ
４５０C24 は25( ＯＨ) Ｄ3 の24位水酸化活性を示し
た。Ｐ４５０C24 は1 α,25 −ジヒドロキシビタミンＤ
3 （1 α,25(ＯＨ)2Ｄ3 ）（活性型ビタミンＤ3 ）によ
り誘導合成され、生体内の活性型ビタミンＤ3 濃度の維
持に関与する。すなわち、活性型ビタミンＤ3 により血
清中のカルシウム値が正常になると、25( ＯＨ) Ｄ3 の
代謝は１α位の水酸化から側鎖の酸化へとスイッチされ
る。側鎖の23、24、26位などがまず水酸化され、さらに
側鎖が酸化された化合物へと代謝されていく。多くの側
鎖酸化代謝物がこれまでに単離同定されているが、いず
れもカルシウム代謝調節作用は1 α,25(ＯＨ)2Ｄ3 と比
べかなり弱い。そのため、1 α,25(ＯＨ)2Ｄ3 以外の代
謝物はすべて不活性型と考えられていたが、最近、24,2
5(ＯＨ)2Ｄ3 および1 α,25 −ジヒドロキシビタミンＤ
326,23−ラクトンは重要な代謝物であるとする意見が主
流に成りつつある。24,25(ＯＨ)2Ｄ3 は血中濃度が25(
ＯＨ)Ｄ3 に次いで高く、半減期も長いことから重要な
代謝物と考えられている（表１）。
によって、初めて分子内にヘムを含有する活性型Ｐ４５
０C24 を大腸菌で産生することが可能になった。さら
に、形質転換株から粗精製したＰ４５０C24 はウシ副腎
ＡＤＸとウシ副腎ＡＤＲとの再構成系において、25( Ｏ
Ｈ) Ｄ3 から24,25(ＯＨ)2Ｄ3 を生成した。本発明者ら
はすでにラット肝ミトコンドリアＰ４５０C25を酵母で
活性発現させることに成功している（特願平２−２５８
２６２）。しかし、同じミトコンドリア型であるＰ４５
０C24 を酵母で産生させるとその発現量は低く、目的と
する水酸化物である24,25(ＯＨ)2Ｄ3 が充分量得られな
かった。今回、本発明者らはビタミンＤ3 生合成系に関
与するミトコンドリア型Ｐ４５０としては初めて大腸菌
における機能発現に成功した。大腸菌内で産生されたＰ
４５０C24 は25( ＯＨ) Ｄ3 の24位水酸化活性を示し
た。Ｐ４５０C24 は1 α,25 −ジヒドロキシビタミンＤ
3 （1 α,25(ＯＨ)2Ｄ3 ）（活性型ビタミンＤ3 ）によ
り誘導合成され、生体内の活性型ビタミンＤ3 濃度の維
持に関与する。すなわち、活性型ビタミンＤ3 により血
清中のカルシウム値が正常になると、25( ＯＨ) Ｄ3 の
代謝は１α位の水酸化から側鎖の酸化へとスイッチされ
る。側鎖の23、24、26位などがまず水酸化され、さらに
側鎖が酸化された化合物へと代謝されていく。多くの側
鎖酸化代謝物がこれまでに単離同定されているが、いず
れもカルシウム代謝調節作用は1 α,25(ＯＨ)2Ｄ3 と比
べかなり弱い。そのため、1 α,25(ＯＨ)2Ｄ3 以外の代
謝物はすべて不活性型と考えられていたが、最近、24,2
5(ＯＨ)2Ｄ3 および1 α,25 −ジヒドロキシビタミンＤ
326,23−ラクトンは重要な代謝物であるとする意見が主
流に成りつつある。24,25(ＯＨ)2Ｄ3 は血中濃度が25(
ＯＨ)Ｄ3 に次いで高く、半減期も長いことから重要な
代謝物と考えられている（表１）。
【０００７】
【表１】
【０００８】24,25(ＯＨ)2Ｄ3 の作用としては、1 α,2
5(ＯＨ)2Ｄ3との共同作用による骨の石灰化、副甲状腺
ホルモン（ＰＴＨ）の分泌調節、軟骨の発育などが挙げ
られる。しかも、1 α,25(ＯＨ)2Ｄ3 は大量投与により
副作用（高カルシウム血症）を起こすことが知られてい
るが、大量の24,25(ＯＨ)2Ｄ3 をラットやウサギに対し
て投与すると、副作用無しに骨密度を増加させることが
報告されている。また、卵巣摘出術を行ったイヌに24,2
5(ＯＨ)2Ｄ3 を投与すると、25( ＯＨ) Ｄ3 や1 α,25
(ＯＨ)2Ｄ3 の血中濃度を変化させずに血しょう中のオ
ステオカルシン及び24,25(ＯＨ)2Ｄ3 濃度を上昇させ、
低下した骨密度を増加させるなどの報告がある。他方、
１α−ヒドロキシビタミンＤ3 （１α( ＯＨ) Ｄ3 と略
す）の24位が水酸化された1 α,24(ＯＨ)2Ｄ3 は天然の
代謝物としては同定されていないが、1α,25(ＯＨ)2Ｄ
3 と同様のカルシウム調節作用があることが明らかにさ
れていた。最近、この化合物の外用軟膏が乾せん症（ps
oriasis ）の治療に有効であることが発見された。すで
に二重盲検実験でもその有効性が証明されている。以上
述べたように、24位が水酸化を受けたビタミンＤ3 誘導
体は骨粗そう症などの骨病変の治療に有効である。現
在、これの化合物は複雑な化学合成法に依っている。本
発明により、大腸菌で産生させたＰ４５０C24 をフェレ
ドキシン、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素と組み
合わせることによってビタミンＤ3 24位水酸化体生産の
バイオリアクターとして利用できる可能性があり、現在
行われている複雑な化学合成法を、より単純化すること
ができる。フェレドキシン、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシ
ン還元酵素としては、本発明の実施例で述べたウシ副腎
ＡＤＸ、ＡＤＲのほかホウレンソウ由来フェレドキシン
などＰ４５０C24 に電子を伝達できるものであればよ
い。
5(ＯＨ)2Ｄ3との共同作用による骨の石灰化、副甲状腺
ホルモン（ＰＴＨ）の分泌調節、軟骨の発育などが挙げ
られる。しかも、1 α,25(ＯＨ)2Ｄ3 は大量投与により
副作用（高カルシウム血症）を起こすことが知られてい
るが、大量の24,25(ＯＨ)2Ｄ3 をラットやウサギに対し
て投与すると、副作用無しに骨密度を増加させることが
報告されている。また、卵巣摘出術を行ったイヌに24,2
5(ＯＨ)2Ｄ3 を投与すると、25( ＯＨ) Ｄ3 や1 α,25
(ＯＨ)2Ｄ3 の血中濃度を変化させずに血しょう中のオ
ステオカルシン及び24,25(ＯＨ)2Ｄ3 濃度を上昇させ、
低下した骨密度を増加させるなどの報告がある。他方、
１α−ヒドロキシビタミンＤ3 （１α( ＯＨ) Ｄ3 と略
す）の24位が水酸化された1 α,24(ＯＨ)2Ｄ3 は天然の
代謝物としては同定されていないが、1α,25(ＯＨ)2Ｄ
3 と同様のカルシウム調節作用があることが明らかにさ
れていた。最近、この化合物の外用軟膏が乾せん症（ps
oriasis ）の治療に有効であることが発見された。すで
に二重盲検実験でもその有効性が証明されている。以上
述べたように、24位が水酸化を受けたビタミンＤ3 誘導
体は骨粗そう症などの骨病変の治療に有効である。現
在、これの化合物は複雑な化学合成法に依っている。本
発明により、大腸菌で産生させたＰ４５０C24 をフェレ
ドキシン、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素と組み
合わせることによってビタミンＤ3 24位水酸化体生産の
バイオリアクターとして利用できる可能性があり、現在
行われている複雑な化学合成法を、より単純化すること
ができる。フェレドキシン、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシ
ン還元酵素としては、本発明の実施例で述べたウシ副腎
ＡＤＸ、ＡＤＲのほかホウレンソウ由来フェレドキシン
などＰ４５０C24 に電子を伝達できるものであればよ
い。
【０００９】以下、本発明をさらに詳細に説明する。本
発明に用いるラット腎Ｐ４５０C24 をコードするｃＤＮ
Ａはすでに公知であり、通常の操作法でこれを単離する
ことができる。本発明のＰ４５０C24 を発現する発現プ
ラスミドはラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子を適当な発現ベ
クターに常法により挿入し構築することができる。発現
ベクターとしては、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を
含み、自立的に増殖できるものであって、宿主からの単
離精製が容易であり、検出可能なマーカーを持つものが
好適である。種々のベクターが市販されており、例えば
大腸菌での発現には、lac 、tac 、trp などのプロモー
ターを含む発現ベクター（これらは発現ベクターとし
て、あるいはプロモーターカートリッジとしてファルマ
シアＬＫＢ社などより市販されている）を用いることが
できる。ベクターの切断に用いる制限酵素なども市販さ
れており、これらの使用方法は公知である。また、発現
プラスミドの構造も限定されるものでなく、宿主細胞内
で安定に保持されるものであればよいが、特に好ましい
のは、本発明中のｐＫＣ２４Ｒである。宿主として大腸
菌、例えばエシェリキア・コリＪＭ１０９、ＨＢ１０
１、ＤＨ１、Ｋ１２株などがあげられるが、本発明中の
プラスミドｐＫＣ２４Ｒとの組合せとして最も好ましい
のは本発明中のＪＭ１０９株に代表されるようなlaciq
株（ラクトースリプレッサー高生産株）である。ラット
腎Ｐ４５０C24 遺伝子を含む発現プラスミドによる宿主
大腸菌の形質転換は、公知の方法で行うことができる。
本発明により得られる形質転換大腸菌を通常の方法で培
養することによりラット腎Ｐ４５０C24 を製造すること
ができる。
発明に用いるラット腎Ｐ４５０C24 をコードするｃＤＮ
Ａはすでに公知であり、通常の操作法でこれを単離する
ことができる。本発明のＰ４５０C24 を発現する発現プ
ラスミドはラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子を適当な発現ベ
クターに常法により挿入し構築することができる。発現
ベクターとしては、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を
含み、自立的に増殖できるものであって、宿主からの単
離精製が容易であり、検出可能なマーカーを持つものが
好適である。種々のベクターが市販されており、例えば
大腸菌での発現には、lac 、tac 、trp などのプロモー
ターを含む発現ベクター（これらは発現ベクターとし
て、あるいはプロモーターカートリッジとしてファルマ
シアＬＫＢ社などより市販されている）を用いることが
できる。ベクターの切断に用いる制限酵素なども市販さ
れており、これらの使用方法は公知である。また、発現
プラスミドの構造も限定されるものでなく、宿主細胞内
で安定に保持されるものであればよいが、特に好ましい
のは、本発明中のｐＫＣ２４Ｒである。宿主として大腸
菌、例えばエシェリキア・コリＪＭ１０９、ＨＢ１０
１、ＤＨ１、Ｋ１２株などがあげられるが、本発明中の
プラスミドｐＫＣ２４Ｒとの組合せとして最も好ましい
のは本発明中のＪＭ１０９株に代表されるようなlaciq
株（ラクトースリプレッサー高生産株）である。ラット
腎Ｐ４５０C24 遺伝子を含む発現プラスミドによる宿主
大腸菌の形質転換は、公知の方法で行うことができる。
本発明により得られる形質転換大腸菌を通常の方法で培
養することによりラット腎Ｐ４５０C24 を製造すること
ができる。
【００１０】
【実施例】以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明
する。本発明は実施例のみに限定されるものでなく、本
発明の技術分野における通常の変更をすることができ
る。 実施例１. 発現プラスミドｐＫＣ２４Ｒの構築 以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合などの反応は特に断わらない
限り、通常２０〜２００μｌの反応容積を用いて、これ
らの酵素類を市販するメーカー（例えば、宝酒造( 株))
が製品に添付した反応条件で実施した。ラット腎Ｐ４５
０C24 発現プラスミドｐＫＣ２４Ｒを第１図に示すよう
に構築した。市販のベクタープラスミドpUC19 のHincII
部位に合成リンカーＡＣ３：
する。本発明は実施例のみに限定されるものでなく、本
発明の技術分野における通常の変更をすることができ
る。 実施例１. 発現プラスミドｐＫＣ２４Ｒの構築 以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合などの反応は特に断わらない
限り、通常２０〜２００μｌの反応容積を用いて、これ
らの酵素類を市販するメーカー（例えば、宝酒造( 株))
が製品に添付した反応条件で実施した。ラット腎Ｐ４５
０C24 発現プラスミドｐＫＣ２４Ｒを第１図に示すよう
に構築した。市販のベクタープラスミドpUC19 のHincII
部位に合成リンカーＡＣ３：
【００１１】
【化４】 配列番号１ （内部にAccIII認識部位を持つ）を挿入し、AccIII部位
を持つプラスミドpUC19Ac3を作製した。ラット腎Ｐ４５
０C24 遺伝子を含むプラスミドpCC24-8（Ohyamaet al.,
(1991)FEBS 278, 195-198）を制限酵素AccII とAccIII
で同時消化して得られる、Ｐ４５０C24 アミノ末端側の
領域を含む約１８０ｂｐの断片と合成リンカーＬＫＣ２
４Ｒ：
を持つプラスミドpUC19Ac3を作製した。ラット腎Ｐ４５
０C24 遺伝子を含むプラスミドpCC24-8（Ohyamaet al.,
(1991)FEBS 278, 195-198）を制限酵素AccII とAccIII
で同時消化して得られる、Ｐ４５０C24 アミノ末端側の
領域を含む約１８０ｂｐの断片と合成リンカーＬＫＣ２
４Ｒ：
【００１２】
【化５】 配列番号２ （左右両端にそれぞれHindIII 、AccII 認識部位を持
つ）を前述のpUC19Ac3のHindIII 、AccIII部位に挿入
し、pUKC24RNを得た。このpUKC24RNの部分塩基配列を決
定したところ、合成リンカー部分の配列がデザイン通り
であることを確認した。一方、プラスミドpCC24-8 を制
限酵素NaeIとPstIで同時消化して得られる、Ｐ４５０
C24 のカルボキシ末端領域を含む約３００ｂｐの断片を
市販のpBluescriptKS(+)のNaeI、PstI部位に挿入し、pB
C24CH を得た。ついで、pBC24CHのNaeI-HindIII断片
（約３２０ｂｐ）とpUCC24-8のAccI-NaeI 断片（Ｐ４５
０C24 の中央部分を含む約１２００ｂｐ）とをpUC19 の
AccI、HindIII 部位に挿入し、pUC24ΔN を得た。最後
に、前述のプラスミドpUKC24RNとpUC24 ΔN を制限酵素
AccIIIとHindIII でそれぞれ同時消化し、Ｐ４５０C24
のアミノ末端領域およびカルボキシ末端領域を含む断片
（それぞれ約２１０ｂｐ、１４３０ｂｐ）を得て、これ
らを大腸菌発現ベクターpKK223-4（特願平３−１５３
７）のHindIII部位に挿入した。このようにしてラット
腎Ｐ４５０C24 をコードする約１６４０ｂｐの遺伝子断
片がtac プロモーターとrrnBターミネーターに対して順
方向に挿入されたプラスミドpKC24Rを得た。
つ）を前述のpUC19Ac3のHindIII 、AccIII部位に挿入
し、pUKC24RNを得た。このpUKC24RNの部分塩基配列を決
定したところ、合成リンカー部分の配列がデザイン通り
であることを確認した。一方、プラスミドpCC24-8 を制
限酵素NaeIとPstIで同時消化して得られる、Ｐ４５０
C24 のカルボキシ末端領域を含む約３００ｂｐの断片を
市販のpBluescriptKS(+)のNaeI、PstI部位に挿入し、pB
C24CH を得た。ついで、pBC24CHのNaeI-HindIII断片
（約３２０ｂｐ）とpUCC24-8のAccI-NaeI 断片（Ｐ４５
０C24 の中央部分を含む約１２００ｂｐ）とをpUC19 の
AccI、HindIII 部位に挿入し、pUC24ΔN を得た。最後
に、前述のプラスミドpUKC24RNとpUC24 ΔN を制限酵素
AccIIIとHindIII でそれぞれ同時消化し、Ｐ４５０C24
のアミノ末端領域およびカルボキシ末端領域を含む断片
（それぞれ約２１０ｂｐ、１４３０ｂｐ）を得て、これ
らを大腸菌発現ベクターpKK223-4（特願平３−１５３
７）のHindIII部位に挿入した。このようにしてラット
腎Ｐ４５０C24 をコードする約１６４０ｂｐの遺伝子断
片がtac プロモーターとrrnBターミネーターに対して順
方向に挿入されたプラスミドpKC24Rを得た。
【００１３】実施例２. Ｐ４５０C24 の生産 発現プラスミドpKC24Rを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、
Ｍ９培地（K2HPO4 10.5g、KH2PO4、4.5g、(NH4)2SO4 1.
0g、クエン酸ナトリウム 0.5g 、MgSO4 7H2O0.2g、グル
コース 2.0g 、チアミン塩酸塩 2mg/l）を用いて37℃で
培養し、対数増殖期にIPTG（イソプロピルチオ−β−Ｄ
−ガラクトシド）を終濃度1mM になるように添加して、
Ｐ４５０C24 の発現を誘導した。IPTG添加後経時的に培
養液をサンプリングし、遠心により菌体を回収し、 SDS
（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリアクリルアミドゲル
に供し、Laemmli の方法（(1970)Nature，227 ，680 ）
に従って、電気泳動を行った。電気泳動後のポリアクリ
ルアミドゲルからポリビニリデンジフルオライド（ＰＶ
ＤＦ）フィルターに電気的に蛋白質をトランスファーし
た。トランスファーは50mMトリス，pH8.8 、0.38M グリ
シン、0.1 ％ ＳＤＳのバッファーを用いた。トランス
ファー後、ＰＶＤＦフィルターをＰＢＳＴ（10mMリン酸
カリウム，pH7.5 、0.9 ％塩化ナトリウム、0.05％ Twe
en20）で洗浄し、 3％ゼラチン／ＰＢＳ（10mMリン酸カ
リウム，pH7.5 、0.9 ％塩化ナトリウム）で37℃、３時
間ブロッキングした。その後、PBS で37 ℃において１
０分、２回洗浄した。マウスより得た抗ーラット腎Ｐ４
５０C24 血清をＰＢＳで希釈し、フィルターに結合して
いる蛋白質と室温、１時間反応させ、さらに４℃にて終
夜反応させた。次に、ＰＢＳＴで室温にて５分、５回洗
浄し、ＰＢＳでリンスしたフィルターを［125 Ｉ］抗マ
ウス第二抗体Ｆ( ａｂ')2 フラグメント／ＰＢＳ溶液と
37℃で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで室温にて
２０分、７回洗浄し、オートラジオグラフィーを行っ
た。ＪＭ１０９（ｐＫＣ２４Ｒ）株は抗血清と反応する
蛋白質のバンドを示し、その泳動位置は、ラット腎Ｐ４
５０C24 標品のものとほぼ同じであった。以上のように
して形質転換大腸菌内でＰ４５０C2 4 が発現しているこ
とを確認した。
Ｍ９培地（K2HPO4 10.5g、KH2PO4、4.5g、(NH4)2SO4 1.
0g、クエン酸ナトリウム 0.5g 、MgSO4 7H2O0.2g、グル
コース 2.0g 、チアミン塩酸塩 2mg/l）を用いて37℃で
培養し、対数増殖期にIPTG（イソプロピルチオ−β−Ｄ
−ガラクトシド）を終濃度1mM になるように添加して、
Ｐ４５０C24 の発現を誘導した。IPTG添加後経時的に培
養液をサンプリングし、遠心により菌体を回収し、 SDS
（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリアクリルアミドゲル
に供し、Laemmli の方法（(1970)Nature，227 ，680 ）
に従って、電気泳動を行った。電気泳動後のポリアクリ
ルアミドゲルからポリビニリデンジフルオライド（ＰＶ
ＤＦ）フィルターに電気的に蛋白質をトランスファーし
た。トランスファーは50mMトリス，pH8.8 、0.38M グリ
シン、0.1 ％ ＳＤＳのバッファーを用いた。トランス
ファー後、ＰＶＤＦフィルターをＰＢＳＴ（10mMリン酸
カリウム，pH7.5 、0.9 ％塩化ナトリウム、0.05％ Twe
en20）で洗浄し、 3％ゼラチン／ＰＢＳ（10mMリン酸カ
リウム，pH7.5 、0.9 ％塩化ナトリウム）で37℃、３時
間ブロッキングした。その後、PBS で37 ℃において１
０分、２回洗浄した。マウスより得た抗ーラット腎Ｐ４
５０C24 血清をＰＢＳで希釈し、フィルターに結合して
いる蛋白質と室温、１時間反応させ、さらに４℃にて終
夜反応させた。次に、ＰＢＳＴで室温にて５分、５回洗
浄し、ＰＢＳでリンスしたフィルターを［125 Ｉ］抗マ
ウス第二抗体Ｆ( ａｂ')2 フラグメント／ＰＢＳ溶液と
37℃で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで室温にて
２０分、７回洗浄し、オートラジオグラフィーを行っ
た。ＪＭ１０９（ｐＫＣ２４Ｒ）株は抗血清と反応する
蛋白質のバンドを示し、その泳動位置は、ラット腎Ｐ４
５０C24 標品のものとほぼ同じであった。以上のように
して形質転換大腸菌内でＰ４５０C2 4 が発現しているこ
とを確認した。
【００１４】実施例３. 再構成系におけるＰ４５０C24
依存性水酸化活性の測定 ウシ副腎ＡＤＸおよびウシ副腎ＡＤＲとの再構成系にお
いて、コントロールＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−４）株
およびＰ４５０C24 発現株ＪＭ１０９（ｐＫＣ２４Ｒ）
株から調製した膜画分を用いてＰ４５０C24 に依存した
水酸化活性を測定した。形質転換大腸菌株からの細胞分
画は以下の方法に従った。Ｏ. Ｄ.660が１付近の培養液
を遠心して菌体を回収し、ＭＯＰＳバッファー（50mM M
OPS ，pH7.5 、100mM 塩化カリウム、1mM ＤＴＴ、1mM
ＥＤＴＡ）で洗浄した後、培養液の２０分の１容のＭＯ
ＰＳバッファー（0.2mg/ml リゾチームを含む）に懸濁
した。これを３０分氷冷してスフェロプラストを得、さ
らにＰＭＳＦ、ロイペプチンおよびペプスタチンをそれ
ぞれ終濃度1mM 、0.1 μg/ml、0.1 μg/mlとなるように
加えて、超音波により細胞膜を破砕した。 1,200Xg、１
０分の遠心にて未破砕菌体を除き、得られた遠心上清を
４℃にて 225,000Xg、３０分超遠心分離して可溶性画分
（上清）と膜画分（沈澱）に分けた。膜画分は終濃度6m
M のMgCl2 を含むＭＯＰＳバッファーで洗浄した後、最
終的に 50mM リン酸カリウム(pH7.5) ／ 0.25M シュク
ロースに懸濁した。25( ＯＨ) Ｄ3 24位水酸化活性は、
以下の方法で測定した。100mM トリス−塩酸（pH7.5
）、1mM ＥＤＴＡ、20μM 25( ＯＨ) Ｄ3 、4 μM Ａ
ＤＸ、0.42μMＡＤＲ、1mM ＮＡＤＰＨから成る反応混
液に形質転換大腸菌から調製した膜画分（2.5mg タンパ
ク質を含む）を加え全容を0.5ml とし、一定時間37℃で
インキュベートした。2.5ml ベンゼンを加えて反応を停
止し、ボルテックスミキサーで１分間撹はん後遠心し、
ベンゼン層2 mlを乾固した。これを少量のアセトニトリ
ルに溶解し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣの条件を以
下に示す。
依存性水酸化活性の測定 ウシ副腎ＡＤＸおよびウシ副腎ＡＤＲとの再構成系にお
いて、コントロールＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−４）株
およびＰ４５０C24 発現株ＪＭ１０９（ｐＫＣ２４Ｒ）
株から調製した膜画分を用いてＰ４５０C24 に依存した
水酸化活性を測定した。形質転換大腸菌株からの細胞分
画は以下の方法に従った。Ｏ. Ｄ.660が１付近の培養液
を遠心して菌体を回収し、ＭＯＰＳバッファー（50mM M
OPS ，pH7.5 、100mM 塩化カリウム、1mM ＤＴＴ、1mM
ＥＤＴＡ）で洗浄した後、培養液の２０分の１容のＭＯ
ＰＳバッファー（0.2mg/ml リゾチームを含む）に懸濁
した。これを３０分氷冷してスフェロプラストを得、さ
らにＰＭＳＦ、ロイペプチンおよびペプスタチンをそれ
ぞれ終濃度1mM 、0.1 μg/ml、0.1 μg/mlとなるように
加えて、超音波により細胞膜を破砕した。 1,200Xg、１
０分の遠心にて未破砕菌体を除き、得られた遠心上清を
４℃にて 225,000Xg、３０分超遠心分離して可溶性画分
（上清）と膜画分（沈澱）に分けた。膜画分は終濃度6m
M のMgCl2 を含むＭＯＰＳバッファーで洗浄した後、最
終的に 50mM リン酸カリウム(pH7.5) ／ 0.25M シュク
ロースに懸濁した。25( ＯＨ) Ｄ3 24位水酸化活性は、
以下の方法で測定した。100mM トリス−塩酸（pH7.5
）、1mM ＥＤＴＡ、20μM 25( ＯＨ) Ｄ3 、4 μM Ａ
ＤＸ、0.42μMＡＤＲ、1mM ＮＡＤＰＨから成る反応混
液に形質転換大腸菌から調製した膜画分（2.5mg タンパ
ク質を含む）を加え全容を0.5ml とし、一定時間37℃で
インキュベートした。2.5ml ベンゼンを加えて反応を停
止し、ボルテックスミキサーで１分間撹はん後遠心し、
ベンゼン層2 mlを乾固した。これを少量のアセトニトリ
ルに溶解し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣの条件を以
下に示す。
【００１５】 １．カラム；μBondapakC18（φ4X300mm ） ２．流速；1.0ml/min ３．カラム温度；50℃ ４．検出波長；265nm ５．溶出条件； ０分から２０分： 50 ％から100 ％ア
セトニトリルの直線濃度勾配 ２０分から２５分：100 ％アセトニトリル ２５分から２６分：100 ％から 50 ％アセトニトリルの
直線濃度勾配 ２６分から３４分： 50％アセトニトリル
セトニトリルの直線濃度勾配 ２０分から２５分：100 ％アセトニトリル ２５分から２６分：100 ％から 50 ％アセトニトリルの
直線濃度勾配 ２６分から３４分： 50％アセトニトリル
【００１６】再構成系における25( ＯＨ) Ｄ3 24位水酸
化活性を測定したところコントロールＪＭ１０９（ｐＫ
Ｋ２２３−４）株の膜画分は活性を示さなかったが、Ｐ
４５０C24 発現株ＪＭ１０９（ｐＫＣ２４Ｒ）株の膜画
分ではＨＰＬＣ分析により24,25(ＯＨ)2Ｄ3 の位置にピ
ークが検出できた。ピークの面積から、2.5mg タンパク
質を含むＪＭ１０９（ｐＫＣ２４Ｒ）株の膜画分の24,2
5(ＯＨ)2Ｄ3 への変換率は、反応時間１時間で約３８％
と算出した。以上、Ｐ４５０C24 依存性水酸化活性測定
の結果から、大腸菌膜画分で産生されたＰ４５０C24 は
活性発現に必要なヘムを分子内に含有しており、再構成
系において、ウシ副腎ＡＤＸおよびウシ副腎ＡＤＲと電
子伝達系を構成することによりＰ４５０C24 に依存した
活性を発揮できることがわかった。
化活性を測定したところコントロールＪＭ１０９（ｐＫ
Ｋ２２３−４）株の膜画分は活性を示さなかったが、Ｐ
４５０C24 発現株ＪＭ１０９（ｐＫＣ２４Ｒ）株の膜画
分ではＨＰＬＣ分析により24,25(ＯＨ)2Ｄ3 の位置にピ
ークが検出できた。ピークの面積から、2.5mg タンパク
質を含むＪＭ１０９（ｐＫＣ２４Ｒ）株の膜画分の24,2
5(ＯＨ)2Ｄ3 への変換率は、反応時間１時間で約３８％
と算出した。以上、Ｐ４５０C24 依存性水酸化活性測定
の結果から、大腸菌膜画分で産生されたＰ４５０C24 は
活性発現に必要なヘムを分子内に含有しており、再構成
系において、ウシ副腎ＡＤＸおよびウシ副腎ＡＤＲと電
子伝達系を構成することによりＰ４５０C24 に依存した
活性を発揮できることがわかった。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCCGGAG 7 GAGGCCTC 配列番号：２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGCTTAGGAG GAAAAAATAT GCG 23 ATCCTC CTTTTTTATA CGC
【図１】 本発明の発現プラスミドｐＫＣ２４Ｒの構築
工程を示す。制限酵素部位は、Ec;EcoRI、AcII;AccII、
AcI;AccI、AcIII;AccIII、Na;NaeI 、Ps;PstI、Hd;Hind
IIIを示す。
工程を示す。制限酵素部位は、Ec;EcoRI、AcII;AccII、
AcI;AccI、AcIII;AccIII、Na;NaeI 、Ps;PstI、Hd;Hind
IIIを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (14)
- 【請求項１】大腸菌内でラット腎Ｐ４５０C24 を発現す
る発現プラスミド - 【請求項２】大腸菌trp-lac(tac)プロモーターの下流に
ラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子を結合し、大腸菌内でラッ
ト腎Ｐ４５０C24 を発現する発現プラスミド - 【請求項３】式化１で表される特許請求の範囲第１項の
プラスミドｐＫＣ２４Ｒ 【化１】 - 【請求項４】大腸菌内でラット腎Ｐ４５０C24 を発現す
る発現プラスミドを保持するエシエリキア・コリ - 【請求項５】大腸菌trp-lac(tac)プロモーターの下流に
ラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子を結合し、大腸菌内でラッ
ト腎Ｐ４５０C24 を発現する発現プラスミドを保持する
エシェリキア・コリ - 【請求項６】式化２で表される発現プラスミドを保持す
るエシェリキア・コリ 【化２】 - 【請求項７】エシェリキア・コリがＪＭ１０９株である
ことを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の微生物 - 【請求項８】エシェリキア・コリがＪＭ１０９株である
ことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の微生物 - 【請求項９】エシェリキア・コリがＪＭ１０９株である
ことを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の微生物 - 【請求項１０】大腸菌内でラット腎Ｐ４５０C24 を発現
する発現プラスミドを保持するエシェリキア・コリを培
養することを特徴とするラット腎Ｐ４５０C24 の生産方
法 - 【請求項１１】大腸菌trp-lac(tac)プロモーターの下流
にラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子を結合し、大腸菌内でラ
ット腎Ｐ４５０C24 を発現する発現プラスミドを保持す
るエシェリキア・コリを培養することを特徴とするラッ
ト腎Ｐ４５０C24 の生産方法 - 【請求項１２】式化３で表される発現プラスミドを保持
するエシェリキア・コリを培養することを特徴とするラ
ット腎Ｐ４５０C24 の生産方法 【化３】 - 【請求項１３】特許請求の範囲第４項、第５項、第６
項、第７項、第８項あるいは第９項記載の大腸菌株によ
りビタミンＤ3 の24位水酸化を特徴とするビタミンＤ3
誘導体の製造方法 - 【請求項１４】特許請求の範囲第４項、第５項、第６
項、第７項、第８項あるいは第９項記載の大腸菌株によ
りビタミンＤ3 25水酸化物（25(ＯＨ) Ｄ3 ）の24位水
酸化を特徴とするビタミンＤ3 24,25 二水酸化物（24,2
5(ＯＨ)2Ｄ3 ）の製造方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3320351A JPH05153980A (ja) | 1991-12-04 | 1991-12-04 | ラット腎ｐ４５０ｃ２４ 産生菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3320351A JPH05153980A (ja) | 1991-12-04 | 1991-12-04 | ラット腎ｐ４５０ｃ２４ 産生菌株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05153980A true JPH05153980A (ja) | 1993-06-22 |
Family
ID=18120510
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3320351A Pending JPH05153980A (ja) | 1991-12-04 | 1991-12-04 | ラット腎ｐ４５０ｃ２４ 産生菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05153980A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000061776A1 (fr) * | 1999-04-14 | 2000-10-19 | Mercian Corporation | Derives de vitamine d et procede de production correspondant |
-
1991
- 1991-12-04 JP JP3320351A patent/JPH05153980A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000061776A1 (fr) * | 1999-04-14 | 2000-10-19 | Mercian Corporation | Derives de vitamine d et procede de production correspondant |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sakaki et al. | Bioconversion of vitamin D to its active form by bacterial or mammalian cytochrome P450 | |
| Blake et al. | Coexpression of a human P450 (CYP3A4) and P450 reductase generates a highly functional monooxygenase system in Escherichia coli | |
| Fujii et al. | Purification, characterization, and directed evolution study of a vitamin D3 hydroxylase from Pseudonocardia autotrophica | |
| Guilhot et al. | Evidence that the pathway of disulfide bond formation in Escherichia coli involves interactions between the cysteines of DsbB and DsbA. | |
| Arnér et al. | Preparation and assay of mammalian thioredoxin and thioredoxin reductase | |
| Sakaki | Practical application of cytochrome P450 | |
| US8815583B2 (en) | Cell lines for expressing enzyme useful in the preparation of amidated products | |
| KR20150127034A (ko) | 대사 공학을 통한 에르고티오네인 생성 | |
| Estabrook et al. | The interaction of NADPH-P450 reductase with P450: an electrochemical study of the role of the flavin mononucleotide-binding domain | |
| Yasuda et al. | Protein engineering of CYP105s for their industrial uses | |
| EP0477961B1 (en) | Mitochondrial P450 | |
| Watanabe et al. | Essential 110Cys in active site of membrane-associated prostaglandin E synthase-2 | |
| Straub et al. | Differential effects of mutations in substrate recognition site 1 of cytochrome P450 2C2 on lauric acid and progesterone hydroxylation | |
| Chevallet et al. | The NuoI subunit of the Rhodobacter capsulatus respiratory Complex I (equivalent to the bovine TYKY subunit) is required for proper assembly of the membraneous and peripheral domains of the enzyme | |
| JPH05153980A (ja) | ラット腎ｐ４５０ｃ２４ 産生菌株 | |
| Annalora et al. | Rat cytochrome P450C24 (CYP24A1) and the role of F249 in substrate binding and catalytic activity | |
| Jay et al. | Characterization of a cleavable fusion of human CYP24A1 with adrenodoxin reveals the variable role of hydrophobics in redox partner binding | |
| JP2517894B2 (ja) | フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現させるキメラｐ４５０産生菌株 | |
| JP3178134B2 (ja) | ビタミンｄ３ 誘導体の製造方法 | |
| RU2677997C2 (ru) | Новый полипептид системы цитохрома р450 с повышенной ферментной активностью | |
| JP2500543B2 (ja) | キメラｐ４５０産生菌株 | |
| Jehan et al. | Cloning and expression of the chicken 25-hydroxyvitamin D3 24-hydroxylase cDNA | |
| JP3717958B2 (ja) | 切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ、その製造法およびその使用法 | |
| WO2024038270A1 (en) | Oxidation of steroids | |
| Daiyasu et al. | Recruitment of thioredoxin-like domains into prostaglandin synthases |