JP3178134B2 - ビタミンｄ３ 誘導体の製造方法 - Google Patents
ビタミンｄ３ 誘導体の製造方法Info
- Publication number
- JP3178134B2 JP3178134B2 JP00242093A JP242093A JP3178134B2 JP 3178134 B2 JP3178134 B2 JP 3178134B2 JP 00242093 A JP00242093 A JP 00242093A JP 242093 A JP242093 A JP 242093A JP 3178134 B2 JP3178134 B2 JP 3178134B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- producing
- vitamin
- oxo
- nadph
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明により、骨粗鬆症などの骨
病変の治療に有効なビタミンＤ3 誘導体をラット腎Ｐ４
５０C24 産生大腸菌株由来の酵素Ｐ４５０C24 と、フェ
レドキシンおよびＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素
とを用いて、簡便に製造する方法を提供することが可能
となった。
病変の治療に有効なビタミンＤ3 誘導体をラット腎Ｐ４
５０C24 産生大腸菌株由来の酵素Ｐ４５０C24 と、フェ
レドキシンおよびＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素
とを用いて、簡便に製造する方法を提供することが可能
となった。
【０００２】
【従来の技術】ビタミンＤ3 誘導体は老人病として問題
となっている骨粗鬆症などの骨病変の治療に有効である
が、現在これらの化合物は複雑な化学合成法により製造
されており、効率的な製造方法の開発が望まれている。
一方、ビタミンＤ3 誘導体は生理的にはミトコンドリア
型Ｐ４５０分子種により生合成されていることが知られ
ている。
となっている骨粗鬆症などの骨病変の治療に有効である
が、現在これらの化合物は複雑な化学合成法により製造
されており、効率的な製造方法の開発が望まれている。
一方、ビタミンＤ3 誘導体は生理的にはミトコンドリア
型Ｐ４５０分子種により生合成されていることが知られ
ている。
【０００３】活性型ビタミンＤ3 はカルシウム代謝調節
作用を持つホルモンとして知られている。血清中のカル
シウム値が正常になると活性型ビタミンＤ3 はその側鎖
が酸化代謝されることによって生体内の濃度が維持さ
れ、血清中のカルシウム値の調節に寄与する。多くの側
鎖酸化代謝物がこれまでに単離同定されているが、カル
シウム代謝調節作用が知られている１α,25(ＯＨ)2Ｄ3
と比較するといずれもそのカルシウム代謝調節作用はか
なり弱く、１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 以外の代謝物はすべて不
活性型と考えられていた。しかしながら24,25(ＯＨ)2Ｄ
3 は１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 との共同作用によって骨の石灰
化、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の分泌調節、軟骨の発
育などの作用を示すことが明らかとなった。しかも高カ
ルシウム血症などの副作用がなく、血中濃度が25( Ｏ
Ｈ) Ｄ3 に次いで高く、半減期も長いことから重要な代
謝物であることが明らかにされた。同様に、24位がオキ
ソ化されたビタミンＤ3 誘導体である24オキソ25( Ｏ
Ｈ) Ｄ3 もビタミンＤ3 欠乏食を与えたラットに対し
て、先に述べた24,25(ＯＨ)2Ｄ3 と同程度のカルシウム
の腸管吸収や骨形成などの生理活性を示し、骨粗鬆症な
どの骨病変の治療に有効であることが報告されている。
作用を持つホルモンとして知られている。血清中のカル
シウム値が正常になると活性型ビタミンＤ3 はその側鎖
が酸化代謝されることによって生体内の濃度が維持さ
れ、血清中のカルシウム値の調節に寄与する。多くの側
鎖酸化代謝物がこれまでに単離同定されているが、カル
シウム代謝調節作用が知られている１α,25(ＯＨ)2Ｄ3
と比較するといずれもそのカルシウム代謝調節作用はか
なり弱く、１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 以外の代謝物はすべて不
活性型と考えられていた。しかしながら24,25(ＯＨ)2Ｄ
3 は１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 との共同作用によって骨の石灰
化、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の分泌調節、軟骨の発
育などの作用を示すことが明らかとなった。しかも高カ
ルシウム血症などの副作用がなく、血中濃度が25( Ｏ
Ｈ) Ｄ3 に次いで高く、半減期も長いことから重要な代
謝物であることが明らかにされた。同様に、24位がオキ
ソ化されたビタミンＤ3 誘導体である24オキソ25( Ｏ
Ｈ) Ｄ3 もビタミンＤ3 欠乏食を与えたラットに対し
て、先に述べた24,25(ＯＨ)2Ｄ3 と同程度のカルシウム
の腸管吸収や骨形成などの生理活性を示し、骨粗鬆症な
どの骨病変の治療に有効であることが報告されている。
【０００４】Ｐ４５０は微生物から哺乳動物にいたるま
で広く生物界に存在するヘムタンパク質であり、電子伝
達系の末端酵素として種々の脂溶性化合物を基質とした
１原子酸素添加反応を触媒する。末端酵素であるＰ４５
０は分子種が多様であり、それぞれが異なる基質特異性
を示すので、非常に広範囲の脂溶性化合物を水酸化する
ことができる。哺乳動物のＰ４５０依存性電子伝達系は
その構成酵素から、ミクロソーム型とミトコンドリア型
に分けられる。前者では、フラビンアデニンジヌクレオ
チドとフラビンモノヌクレオチドを分子内に補酵素とし
て含有するＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素
（還元酵素）がＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給
し、後者では、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵
素として分子内に含有するＮＡＤＰＨ−フェレドキシン
還元酵素、および非ヘム鉄を補酵素として分子内に含有
するフェレドキシンがＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０
へ供給することにより、種々の脂溶性基質に対して水酸
化反応を触媒する。
で広く生物界に存在するヘムタンパク質であり、電子伝
達系の末端酵素として種々の脂溶性化合物を基質とした
１原子酸素添加反応を触媒する。末端酵素であるＰ４５
０は分子種が多様であり、それぞれが異なる基質特異性
を示すので、非常に広範囲の脂溶性化合物を水酸化する
ことができる。哺乳動物のＰ４５０依存性電子伝達系は
その構成酵素から、ミクロソーム型とミトコンドリア型
に分けられる。前者では、フラビンアデニンジヌクレオ
チドとフラビンモノヌクレオチドを分子内に補酵素とし
て含有するＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素
（還元酵素）がＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０へ供給
し、後者では、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵
素として分子内に含有するＮＡＤＰＨ−フェレドキシン
還元酵素、および非ヘム鉄を補酵素として分子内に含有
するフェレドキシンがＮＡＤＰＨからの電子をＰ４５０
へ供給することにより、種々の脂溶性基質に対して水酸
化反応を触媒する。
【０００５】１α,25 −ジヒドロキシビタミンＤ3 （１
α,25(ＯＨ)2Ｄ3 ）（活性型ビタミンＤ3 ）により誘導
合成されるラット腎Ｐ４５０C24 はビタミンＤ3 誘導体
の24位の側鎖の水酸化を触媒する酵素として知られてい
る。Ｐ４５０C24 はミトコンドリア型Ｐ４５０分子種の
一つで、５１４アミノ酸からなる前駆体として細胞質で
合成されたのち、そのアミノ末端部分に存在する移行シ
グナルが認識され、ミトコンドリア内膜へ取り込まれ、
４７９アミノ酸からなる分子量約５３ｋＤの成熟型Ｐ４
５０C24 になる。ラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子は、プラ
スミドpCC24-8（Ohyama et al., （1991）FEBS 278, 1
95-198 ）から単離できる。
α,25(ＯＨ)2Ｄ3 ）（活性型ビタミンＤ3 ）により誘導
合成されるラット腎Ｐ４５０C24 はビタミンＤ3 誘導体
の24位の側鎖の水酸化を触媒する酵素として知られてい
る。Ｐ４５０C24 はミトコンドリア型Ｐ４５０分子種の
一つで、５１４アミノ酸からなる前駆体として細胞質で
合成されたのち、そのアミノ末端部分に存在する移行シ
グナルが認識され、ミトコンドリア内膜へ取り込まれ、
４７９アミノ酸からなる分子量約５３ｋＤの成熟型Ｐ４
５０C24 になる。ラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子は、プラ
スミドpCC24-8（Ohyama et al., （1991）FEBS 278, 1
95-198 ）から単離できる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はミトコ
ンドリア型Ｐ４５０分子種を産生する大腸菌株を用いる
ことにより、骨粗鬆症などの骨病変の治療に有効なビタ
ミンＤ3 誘導体の簡便な製造方法を提供することであ
る。本発明者らは、ミトコンドリア型Ｐ４５０C24産生
大腸菌株により生産した該酵素と、該酵素の活性発現に
必要なウシ副腎ＡＤＸおよびウシ副腎ＡＤＲの２酵素を
用いて電子伝達系を再構成し、本再構築系をビタミンＤ
3 誘導体の製造に利用することを目的とし、誠意研究を
した結果、本発明を完成するに至った。
ンドリア型Ｐ４５０分子種を産生する大腸菌株を用いる
ことにより、骨粗鬆症などの骨病変の治療に有効なビタ
ミンＤ3 誘導体の簡便な製造方法を提供することであ
る。本発明者らは、ミトコンドリア型Ｐ４５０C24産生
大腸菌株により生産した該酵素と、該酵素の活性発現に
必要なウシ副腎ＡＤＸおよびウシ副腎ＡＤＲの２酵素を
用いて電子伝達系を再構成し、本再構築系をビタミンＤ
3 誘導体の製造に利用することを目的とし、誠意研究を
した結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明はラット腎Ｐ４５
０C24 産生大腸菌株由来の酵素Ｐ４５０C24 を下記一般
式化３
０C24 産生大腸菌株由来の酵素Ｐ４５０C24 を下記一般
式化３
【化３】 （式中、Ｒ4 はＨまたはＯＨを表し、Ｒ5 は、Ｒ4 がＨ
の時はＯＨを表し、Ｒ4がＯＨの時はＲ5 はＨまたはＯ
Ｈを表す。）で表される化合物にフェレドキシンおよび
ＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素の存在下に、作用
させることを特徴とする下記一般式化４
の時はＯＨを表し、Ｒ4がＯＨの時はＲ5 はＨまたはＯ
Ｈを表す。）で表される化合物にフェレドキシンおよび
ＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素の存在下に、作用
させることを特徴とする下記一般式化４
【化４】 （式中、Ｒ1 はＯＨ、Ｒ2 はＨ、またはＲ1 及びＲ2 全
体で＝Ｏを表す。Ｒ3 はＲ1 がＯＨ、Ｒ2 がＨを表す時
はＨを表し、Ｒ1 及びＲ2 全体で＝Ｏを表す時はＲ3 は
ＨまたはＯＨを表す。Ｒ4 はＲ1 がＯＨ、Ｒ2 がＨを表
す時はＯＨを表し、Ｒ1 及びＲ2 全体で＝Ｏを表す時は
ＨまたはＯＨを表す。また、Ｒ4 は一般式化３で表され
る化合物および一般式化４で表される化合物において同
一の原子あるいは原子団を表す。ただし、一般式化３で
表される化合物と一般式化４で表される化合物とは異な
る化合物を表す。）で表されるビタミンＤ3 誘導体の簡
便な製造方法を提供するものである。
体で＝Ｏを表す。Ｒ3 はＲ1 がＯＨ、Ｒ2 がＨを表す時
はＨを表し、Ｒ1 及びＲ2 全体で＝Ｏを表す時はＲ3 は
ＨまたはＯＨを表す。Ｒ4 はＲ1 がＯＨ、Ｒ2 がＨを表
す時はＯＨを表し、Ｒ1 及びＲ2 全体で＝Ｏを表す時は
ＨまたはＯＨを表す。また、Ｒ4 は一般式化３で表され
る化合物および一般式化４で表される化合物において同
一の原子あるいは原子団を表す。ただし、一般式化３で
表される化合物と一般式化４で表される化合物とは異な
る化合物を表す。）で表されるビタミンＤ3 誘導体の簡
便な製造方法を提供するものである。
【０００８】以下、本発明をさらに詳細に説明する。本
発明に用いるラット腎Ｐ４５０C24 をコードするｃＤＮ
Ａはすでに公知であり、通常の操作法でこれを単離する
ことができる。ｃＤＮＡのクローニング法としては例え
ば、特開平４−２０７１９６に記載した方法を用いるこ
とができる。あるいは、全遺伝子を化学合成することも
可能である。本発明のＰ４５０C24 を発現する発現プラ
スミドはラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子を適当な発現ベク
ターに常法により挿入し構築することができる。発現ベ
クターとしては、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含
み、自立的に増殖できるものであって、宿主からの単離
精製が容易であり、薬剤耐性などの検出可能なマーカー
を持つものが好適である。種々のベクターが市販されて
おり、大腸菌での発現には例えば、lac 、tac 、trp な
どのプロモーターを含む発現ベクター（これらは発現ベ
クターとして、あるいはプロモーターカートリッジとし
てファルマシア、ＬＫＢ社などより市販されている）を
用いることができる。ベクターの切断に用いる制限酵素
なども市販されており、これらの使用方法は公知であ
る。また、発現プラスミドの構造も限定されるものでな
く、宿主細胞内で安定に保持されるものであればよい
が、特に好ましいのは、特願平３−３２０３５１に記載
したｐＫＣ２４Ｒである。宿主としては大腸菌、例えば
エシェリキア・コリＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＤＨ１、
Ｋ１２株などがあげられるが、プラスミドｐＫＣ２４Ｒ
との組合せとして最も好ましいのはＪＭ１０９株に代表
されるようなlac Ｉq 株（ラクトースリプレッサー高生
産株）である。
発明に用いるラット腎Ｐ４５０C24 をコードするｃＤＮ
Ａはすでに公知であり、通常の操作法でこれを単離する
ことができる。ｃＤＮＡのクローニング法としては例え
ば、特開平４−２０７１９６に記載した方法を用いるこ
とができる。あるいは、全遺伝子を化学合成することも
可能である。本発明のＰ４５０C24 を発現する発現プラ
スミドはラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子を適当な発現ベク
ターに常法により挿入し構築することができる。発現ベ
クターとしては、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含
み、自立的に増殖できるものであって、宿主からの単離
精製が容易であり、薬剤耐性などの検出可能なマーカー
を持つものが好適である。種々のベクターが市販されて
おり、大腸菌での発現には例えば、lac 、tac 、trp な
どのプロモーターを含む発現ベクター（これらは発現ベ
クターとして、あるいはプロモーターカートリッジとし
てファルマシア、ＬＫＢ社などより市販されている）を
用いることができる。ベクターの切断に用いる制限酵素
なども市販されており、これらの使用方法は公知であ
る。また、発現プラスミドの構造も限定されるものでな
く、宿主細胞内で安定に保持されるものであればよい
が、特に好ましいのは、特願平３−３２０３５１に記載
したｐＫＣ２４Ｒである。宿主としては大腸菌、例えば
エシェリキア・コリＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＤＨ１、
Ｋ１２株などがあげられるが、プラスミドｐＫＣ２４Ｒ
との組合せとして最も好ましいのはＪＭ１０９株に代表
されるようなlac Ｉq 株（ラクトースリプレッサー高生
産株）である。
【０００９】ラット腎Ｐ４５０C24 遺伝子を含む発現プ
ラスミドによる宿主の形質転換は、カルシウム処理によ
り得た大腸菌コンピテント細胞をＤＮＡと混合すること
により、公知の方法で行うことができる。形質転換能を
有する大腸菌コンピテント細胞は市販もされている。市
販の大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセルを用いる場
合、ＪＭ１０９株コンピテントセルに発現プラスミド溶
液を添加して培養し、この培養液をアンピシリン等の抗
生物質を含むプレート上にまくことにより、ベクタ−由
来の当該抗生物質耐性を獲得した発現プラスミドを保持
する形質転換体を選抜することができる。
ラスミドによる宿主の形質転換は、カルシウム処理によ
り得た大腸菌コンピテント細胞をＤＮＡと混合すること
により、公知の方法で行うことができる。形質転換能を
有する大腸菌コンピテント細胞は市販もされている。市
販の大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセルを用いる場
合、ＪＭ１０９株コンピテントセルに発現プラスミド溶
液を添加して培養し、この培養液をアンピシリン等の抗
生物質を含むプレート上にまくことにより、ベクタ−由
来の当該抗生物質耐性を獲得した発現プラスミドを保持
する形質転換体を選抜することができる。
【００１０】得られた形質転換大腸菌を培養し、対数増
殖期後期にIPTG（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクト
シド）を添加して、Ｐ４５０C24 の発現を誘導する。発
現したＰ４５０C24 は大腸菌の膜画分に存在するので、
形質転換体を超音波などにより破砕し、遠心分離により
Ｐ４５０C24 を含む大腸菌膜画分を調製することができ
る。こうして得られた大腸菌膜画分と、Ｐ４５０C24 の
活性発現に必要なフェレドキシン、ＮＡＤＰＨ−フェレ
ドキシン還元酵素を添加した再構成系で、Ｐ４５０C24
活性を測定することができる。再構成系に使用するフェ
レドキシン、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素とし
ては例えば、ウシ副腎ＡＤＸ、ＡＤＲを用いることがで
き、これらはそれぞれOrme-Johnsonらの方法（(1969)
J.Biol.Chem. 244, 6143-6148） およびNonakaらの方
法（(1985) J.Biochem. 98, 257-260 ） に従ってウシ
副腎から精製することができる。また、フェレドキシ
ン、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素としては本発
明の実施例で述べたウシ副腎ＡＤＸ、ＡＤＲの他に、ホ
ウレンソウ由来のものなどＰ４５０C24 に電子を伝達で
きるものであればよい。
殖期後期にIPTG（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクト
シド）を添加して、Ｐ４５０C24 の発現を誘導する。発
現したＰ４５０C24 は大腸菌の膜画分に存在するので、
形質転換体を超音波などにより破砕し、遠心分離により
Ｐ４５０C24 を含む大腸菌膜画分を調製することができ
る。こうして得られた大腸菌膜画分と、Ｐ４５０C24 の
活性発現に必要なフェレドキシン、ＮＡＤＰＨ−フェレ
ドキシン還元酵素を添加した再構成系で、Ｐ４５０C24
活性を測定することができる。再構成系に使用するフェ
レドキシン、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素とし
ては例えば、ウシ副腎ＡＤＸ、ＡＤＲを用いることがで
き、これらはそれぞれOrme-Johnsonらの方法（(1969)
J.Biol.Chem. 244, 6143-6148） およびNonakaらの方
法（(1985) J.Biochem. 98, 257-260 ） に従ってウシ
副腎から精製することができる。また、フェレドキシ
ン、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシン還元酵素としては本発
明の実施例で述べたウシ副腎ＡＤＸ、ＡＤＲの他に、ホ
ウレンソウ由来のものなどＰ４５０C24 に電子を伝達で
きるものであればよい。
【００１１】Ｐ４５０C24 再構成系を利用したビタミン
Ｄ3 誘導体の製造における反応条件は以下に示すとおり
である。酵素Ｐ４５０C24 を反応系へ添加する場合、形
質転換大腸菌から調製した酵素Ｐ４５０C24 を含む膜画
分を反応系での終濃度が１−１０mg/ml となるように用
いるのが好ましい。酵素ＡＤＸおよびＡＤＲはこれらの
酵素による反応が律速とならないように酵素Ｐ４５０
C24 に対して大過剰となるように添加する。ＡＤＸは上
記Ｐ４５０C24 添加量に対して0.15−8 μM 、ＡＤＲは
0.02−0.8 μM の範囲で添加するのが好ましい。補酵素
ＮＡＤＰＨは酵素活性発現を妨げない範囲で用いるのが
好ましい。25( ＯＨ) Ｄ3 又は、１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 を
基質として用いる場合、5 −100 μM の範囲で用いるの
が好ましい。25( ＯＨ) Ｄ3 および１α,25(ＯＨ)2Ｄ3
はそれぞれフナコシ、和光純薬から市販されている。反
応系には酵素活性の金属塩による阻害を防ぐ目的で金属
キレ−ト剤ＥＤＴＡを添加することが好ましい。反応の
ｐＨは 6−8 が好ましい。反応系に用いられる緩衝液は
前記のｐＨを維持できるものであれば特に制限はなく、
トリス−塩酸緩衝液、りん酸緩衝液等の通常の緩衝液を
100mM の濃度で用いることができる。反応温度は10℃−
40℃の範囲が好ましい。反応の停止は生成物を抽出可能
な溶媒を添加することによる。添加溶媒としてはジクロ
ロメタン、ベンゼン、トルエン、酢酸エチル、クロロホ
ルムなどの疎水性有機溶媒を用いることができるが、特
に抽出効率の優れたジクロロメタンが好ましい。生成し
たビタミンＤ3 誘導体は溶媒を留去することにより容易
に反応系より取り出すことができる。
Ｄ3 誘導体の製造における反応条件は以下に示すとおり
である。酵素Ｐ４５０C24 を反応系へ添加する場合、形
質転換大腸菌から調製した酵素Ｐ４５０C24 を含む膜画
分を反応系での終濃度が１−１０mg/ml となるように用
いるのが好ましい。酵素ＡＤＸおよびＡＤＲはこれらの
酵素による反応が律速とならないように酵素Ｐ４５０
C24 に対して大過剰となるように添加する。ＡＤＸは上
記Ｐ４５０C24 添加量に対して0.15−8 μM 、ＡＤＲは
0.02−0.8 μM の範囲で添加するのが好ましい。補酵素
ＮＡＤＰＨは酵素活性発現を妨げない範囲で用いるのが
好ましい。25( ＯＨ) Ｄ3 又は、１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 を
基質として用いる場合、5 −100 μM の範囲で用いるの
が好ましい。25( ＯＨ) Ｄ3 および１α,25(ＯＨ)2Ｄ3
はそれぞれフナコシ、和光純薬から市販されている。反
応系には酵素活性の金属塩による阻害を防ぐ目的で金属
キレ−ト剤ＥＤＴＡを添加することが好ましい。反応の
ｐＨは 6−8 が好ましい。反応系に用いられる緩衝液は
前記のｐＨを維持できるものであれば特に制限はなく、
トリス−塩酸緩衝液、りん酸緩衝液等の通常の緩衝液を
100mM の濃度で用いることができる。反応温度は10℃−
40℃の範囲が好ましい。反応の停止は生成物を抽出可能
な溶媒を添加することによる。添加溶媒としてはジクロ
ロメタン、ベンゼン、トルエン、酢酸エチル、クロロホ
ルムなどの疎水性有機溶媒を用いることができるが、特
に抽出効率の優れたジクロロメタンが好ましい。生成し
たビタミンＤ3 誘導体は溶媒を留去することにより容易
に反応系より取り出すことができる。
【００１２】
【発明の効果】ラット腎Ｐ４５０C24 産生大腸菌株から
粗精製した該酵素はウシ副腎ＡＤＸとウシ副腎ＡＤＲと
の再構成系において、25( ＯＨ) Ｄ3 および１α,25(Ｏ
Ｈ)2Ｄ 3 から24オキソ25( ＯＨ) Ｄ3 や24オキソ23,25
(ＯＨ)2Ｄ3 、24オキソ１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 および24オ
キソ１α,23,25( ＯＨ)3Ｄ3 を製造できることを初めて
見出した。 本発明により、大腸菌で産生させたＰ４５
０C24 をフェレドキシン、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシン
還元酵素と組み合わせることによって骨粗鬆症などの骨
病変の治療に有効であるビタミンＤ3 誘導体の製造を可
能とした。現在行われている複雑な化学合成法と比較す
ると、より簡便に24オキソ25( ＯＨ) Ｄ3 や24オキソ2
3,25(ＯＨ)2Ｄ3 、24オキソ１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 および2
4オキソ１α,23,25( ＯＨ)3Ｄ3 などのビタミンＤ3 誘
導体の製造が可能になった。
粗精製した該酵素はウシ副腎ＡＤＸとウシ副腎ＡＤＲと
の再構成系において、25( ＯＨ) Ｄ3 および１α,25(Ｏ
Ｈ)2Ｄ 3 から24オキソ25( ＯＨ) Ｄ3 や24オキソ23,25
(ＯＨ)2Ｄ3 、24オキソ１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 および24オ
キソ１α,23,25( ＯＨ)3Ｄ3 を製造できることを初めて
見出した。 本発明により、大腸菌で産生させたＰ４５
０C24 をフェレドキシン、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシン
還元酵素と組み合わせることによって骨粗鬆症などの骨
病変の治療に有効であるビタミンＤ3 誘導体の製造を可
能とした。現在行われている複雑な化学合成法と比較す
ると、より簡便に24オキソ25( ＯＨ) Ｄ3 や24オキソ2
3,25(ＯＨ)2Ｄ3 、24オキソ１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 および2
4オキソ１α,23,25( ＯＨ)3Ｄ3 などのビタミンＤ3 誘
導体の製造が可能になった。
【００１３】
【実施例】以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明
する。本発明は実施例のみに限定されるものでなく、本
発明の技術分野における通常の変更をすることができ
る。尚、実施例において生成物であるビタミンＤ3 誘導
体の定量は高速液体クロマトグラフィ−分析によった。
分析条件は以下のとおりである。 １．カラム；μBondapakC18 （φ4X300mm ） ２．流速；1.0ml/min ３．カラム温度；50℃ ４．検出波長；265nm ５．移動相条件； ０分から２０分： 50％から100 ％
アセトニトリルの直線農度勾配 ２０分から２５分：100 ％アセトニトリル ２５分から２６分：100 ％から 50 ％アセトニトリルの
直線濃度勾配 ２６分から３４分：50％アセトニトリル
する。本発明は実施例のみに限定されるものでなく、本
発明の技術分野における通常の変更をすることができ
る。尚、実施例において生成物であるビタミンＤ3 誘導
体の定量は高速液体クロマトグラフィ−分析によった。
分析条件は以下のとおりである。 １．カラム；μBondapakC18 （φ4X300mm ） ２．流速；1.0ml/min ３．カラム温度；50℃ ４．検出波長；265nm ５．移動相条件； ０分から２０分： 50％から100 ％
アセトニトリルの直線農度勾配 ２０分から２５分：100 ％アセトニトリル ２５分から２６分：100 ％から 50 ％アセトニトリルの
直線濃度勾配 ２６分から３４分：50％アセトニトリル
【００１４】 実施例１ １α,24,25( ＯＨ)3Ｄ3 の製造方法 ウシ副腎ＡＤＸおよびウシ副腎ＡＤＲとの再構成系にお
いて、Ｐ４５０C24 発現株から調製した膜画分を用いて
１α,24,25( ＯＨ)3Ｄ3 の製造を以下に示すような方法
で実施した。Ｐ４５０C24 を産生していない株をネガテ
ィブコントロ−ルとした。形質転換大腸菌株からの細胞
分画は以下の方法に従った。O.D.660 が１付近の培養液
を遠心して菌体を回収し、ＭＯＰＳバッファー（50mM M
OPS ，pH7.5 、100mM 塩化カリウム、1mM ＤＴＴ、1mM
ＥＤＴＡ）で洗浄した後、培養液の２０分の１容のＭＯ
ＰＳバッファー（0.2mg/ml リゾチームを含む）に懸濁
した。これを３０分氷冷してスフェロプラストを得、さ
らにＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライ
ド）、ロイペプチンおよびペプスタチンをそれぞれ終濃
度1mM 、0.1 μg/ml、0.1 μg/ml となるように加え
て、超音波により細胞膜を破砕した。1,200 ×g 、１０
分の遠心にて未破砕菌体を除き、得られた遠心上清を４
℃にて 225,000×g 、３０分超遠心分離して可溶性画分
（上清）と膜画分（沈澱）に分けた。膜画分は終濃度 6
mMのMgCl2 を含むＭＯＰＳバッファーで洗浄した後、最
終的に50mMリン酸カリウム(pH7.5) ／0.25M シュクロー
スに懸濁した。１α,24,25( ＯＨ)3Ｄ3 の製造は以下に
示すような条件で実施した。100mM トリス−塩酸（pH7.
5 ）、1mM ＥＤＴＡ、20μM １α,25(ＯＨ)2Ｄ3 、2 μ
M ＡＤＸ、0.2 μM ＡＤＲ、1mM ＮＡＤＰＨから成る反
応混液に形質転換大腸菌から調製した膜画分（1mg タン
パク質を含む）を加え全容を0.5ml とし、37℃で60分反
応した。1.5ml ジクロロメタンを加えて反応を停止し、
ボルテックスミキサーで１分間撹はん後遠心し、ジクロ
ロメタン層 1.3mlを乾固した。これを少量のアセトニト
リルに溶解し、ＨＰＬＣで分析した。その結果、反応時
間60分で１α,24,25( ＯＨ)3Ｄ3 への変換率は15％であ
った。また、コントロ−ル株の膜画分では１α,24,25(
ＯＨ)3Ｄ3 への変換は認められなかった。
いて、Ｐ４５０C24 発現株から調製した膜画分を用いて
１α,24,25( ＯＨ)3Ｄ3 の製造を以下に示すような方法
で実施した。Ｐ４５０C24 を産生していない株をネガテ
ィブコントロ−ルとした。形質転換大腸菌株からの細胞
分画は以下の方法に従った。O.D.660 が１付近の培養液
を遠心して菌体を回収し、ＭＯＰＳバッファー（50mM M
OPS ，pH7.5 、100mM 塩化カリウム、1mM ＤＴＴ、1mM
ＥＤＴＡ）で洗浄した後、培養液の２０分の１容のＭＯ
ＰＳバッファー（0.2mg/ml リゾチームを含む）に懸濁
した。これを３０分氷冷してスフェロプラストを得、さ
らにＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライ
ド）、ロイペプチンおよびペプスタチンをそれぞれ終濃
度1mM 、0.1 μg/ml、0.1 μg/ml となるように加え
て、超音波により細胞膜を破砕した。1,200 ×g 、１０
分の遠心にて未破砕菌体を除き、得られた遠心上清を４
℃にて 225,000×g 、３０分超遠心分離して可溶性画分
（上清）と膜画分（沈澱）に分けた。膜画分は終濃度 6
mMのMgCl2 を含むＭＯＰＳバッファーで洗浄した後、最
終的に50mMリン酸カリウム(pH7.5) ／0.25M シュクロー
スに懸濁した。１α,24,25( ＯＨ)3Ｄ3 の製造は以下に
示すような条件で実施した。100mM トリス−塩酸（pH7.
5 ）、1mM ＥＤＴＡ、20μM １α,25(ＯＨ)2Ｄ3 、2 μ
M ＡＤＸ、0.2 μM ＡＤＲ、1mM ＮＡＤＰＨから成る反
応混液に形質転換大腸菌から調製した膜画分（1mg タン
パク質を含む）を加え全容を0.5ml とし、37℃で60分反
応した。1.5ml ジクロロメタンを加えて反応を停止し、
ボルテックスミキサーで１分間撹はん後遠心し、ジクロ
ロメタン層 1.3mlを乾固した。これを少量のアセトニト
リルに溶解し、ＨＰＬＣで分析した。その結果、反応時
間60分で１α,24,25( ＯＨ)3Ｄ3 への変換率は15％であ
った。また、コントロ−ル株の膜画分では１α,24,25(
ＯＨ)3Ｄ3 への変換は認められなかった。
【００１５】実施例２ 24オキソ25( ＯＨ) Ｄ3 および
24オキソ23,25(ＯＨ)2Ｄ3 の製造法 24,25(ＯＨ) Ｄ3 を基質として図１に示す２種類のビタ
ミンＤ3 誘導体の製造を以下の方法にしたがって実施し
た。実施例１に記載した方法により、形質転換大腸菌株
から膜画分を調製した。20μM 24、25(ＯＨ)2Ｄ3 ，100m
M トリス−塩酸（pH7.5 ）、1mM ＥＤＴＡ、４μM ＡＤ
Ｘ、0.４μM ＡＤＲ、1mM ＮＡＤＰＨから成る反応混液
に形質転換大腸菌から調製した膜画分（2.5mg タンパク
質を含む）を加え全容を0.5ml とし、37℃で60分間反応
した。その結果、24オキソ25( ＯＨ) Ｄ3 および24オキ
ソ23,25(ＯＨ)2Ｄ3 の生成が認められた。これらの化合
物の構造はＥＩ−ＭＳによるフラグメントの開裂パター
ンにより確認した。24オキソ25( ＯＨ) Ｄ3 および24オ
キソ23,25(ＯＨ)2Ｄ3 への変換率はそれぞれ２０％、３
１％であった。また、Ｐ４５０C24 を産生していない株
をネガティブコントロールとして反応させてもオキソ体
の生成は認められなかった。
24オキソ23,25(ＯＨ)2Ｄ3 の製造法 24,25(ＯＨ) Ｄ3 を基質として図１に示す２種類のビタ
ミンＤ3 誘導体の製造を以下の方法にしたがって実施し
た。実施例１に記載した方法により、形質転換大腸菌株
から膜画分を調製した。20μM 24、25(ＯＨ)2Ｄ3 ，100m
M トリス−塩酸（pH7.5 ）、1mM ＥＤＴＡ、４μM ＡＤ
Ｘ、0.４μM ＡＤＲ、1mM ＮＡＤＰＨから成る反応混液
に形質転換大腸菌から調製した膜画分（2.5mg タンパク
質を含む）を加え全容を0.5ml とし、37℃で60分間反応
した。その結果、24オキソ25( ＯＨ) Ｄ3 および24オキ
ソ23,25(ＯＨ)2Ｄ3 の生成が認められた。これらの化合
物の構造はＥＩ−ＭＳによるフラグメントの開裂パター
ンにより確認した。24オキソ25( ＯＨ) Ｄ3 および24オ
キソ23,25(ＯＨ)2Ｄ3 への変換率はそれぞれ２０％、３
１％であった。また、Ｐ４５０C24 を産生していない株
をネガティブコントロールとして反応させてもオキソ体
の生成は認められなかった。
【００１６】実施例３ １α,24,25( ＯＨ)3Ｄ3 、24オ
キソ１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 および24オキソ１α,23,25( Ｏ
Ｈ)3Ｄ3 の製造方法 １α,25(ＯＨ)2Ｄ3 を基質として図２に示す３種類のビ
タミンＤ3 誘導体の製造を以下の方法にしたがって実施
した。100mM トリス−塩酸（pH7.5 ）、1mM ＥＤＴＡ、
20μM １α,25(ＯＨ)2Ｄ3 、2 μM ＡＤＸ、0.2 μM Ａ
ＤＲ、1mM ＮＡＤＰＨから成る反応混液にＰ４５０C24
産生大腸菌から調製した膜画分(22mg タンパク質を含
む）を加え全容を11mlとし、37℃で60分反応した。35ml
ジクロロメタンを加えて反応を停止し、ボルテックスミ
キサーで１分以上撹はん後遠心し、ジクロロメタン層を
分取し、乾固した。これを少量のアセトニトリルに溶解
し、高速液体クロマトグラフィ−で分析した。その結
果、92μｇの１α,25(ＯＨ)2Ｄ 3 から14μｇの１α,24,
25( ＯＨ)3Ｄ3 、６μｇの24オキソ１α,25(ＯＨ)2Ｄ3、
６μｇの24オキソ１α,23,25( ＯＨ)3Ｄ3 が生成し
た。
キソ１α,25(ＯＨ)2Ｄ3 および24オキソ１α,23,25( Ｏ
Ｈ)3Ｄ3 の製造方法 １α,25(ＯＨ)2Ｄ3 を基質として図２に示す３種類のビ
タミンＤ3 誘導体の製造を以下の方法にしたがって実施
した。100mM トリス−塩酸（pH7.5 ）、1mM ＥＤＴＡ、
20μM １α,25(ＯＨ)2Ｄ3 、2 μM ＡＤＸ、0.2 μM Ａ
ＤＲ、1mM ＮＡＤＰＨから成る反応混液にＰ４５０C24
産生大腸菌から調製した膜画分(22mg タンパク質を含
む）を加え全容を11mlとし、37℃で60分反応した。35ml
ジクロロメタンを加えて反応を停止し、ボルテックスミ
キサーで１分以上撹はん後遠心し、ジクロロメタン層を
分取し、乾固した。これを少量のアセトニトリルに溶解
し、高速液体クロマトグラフィ−で分析した。その結
果、92μｇの１α,25(ＯＨ)2Ｄ 3 から14μｇの１α,24,
25( ＯＨ)3Ｄ3 、６μｇの24オキソ１α,25(ＯＨ)2Ｄ3、
６μｇの24オキソ１α,23,25( ＯＨ)3Ｄ3 が生成し
た。
【図１】 Ｐ４５０C24 による24、25(ＯＨ)2Ｄ3 の代謝
経路を示す。
経路を示す。
【図２】 Ｐ４５０C24 による１α、25(ＯＨ)2Ｄ3 の代
謝経路を示す。
謝経路を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 平４−207196（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開497103（ＥＰ，Ａ ２) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．278，Ｎｏ．２（1991）ｐ．195− 198 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．88，Ｎｏ．13 （1991）ｐ．5597−5601 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 7/02 - 7/26 C12N 1/21 C12N 9/02 C12N 15/53 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】ラットＰ４５０C24産生大腸菌株由来の酵
素Ｐ４５０C24を、該酵素の反応系での終濃度１ｍｇ／
ｍｌ以上で、下記一般式 化１ 【化１】 （式中、Ｒ4はＨまたはＯＨを表し、Ｒ5 はＨまたはＯＨ
を表す。） で表される化合物にフェレドキシンおよびＮＡＤＰＨ−
フェレドキシン還元酵素の存在下に、作用させることを
特徴とする下記一般式 化２ 【化２】 （式中、Ｒ 1及びＲ2 は全体で＝Ｏを表す。Ｒ 3 はＨまた
はＯＨを表す。Ｒ 4 はＨまたはＯＨを表す。） で表されるビタミンＤ３誘導体の製造方法。 - 【請求項２】ラットＰ４５０C24産生大腸菌株の膜画分
を使用することを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】ラットＰ４５０ C24 産生大腸菌株由来の酵
素Ｐ４５０ C24 の反応系での終濃度が１〜１０ｍｇ／ｍ
ｌである請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00242093A JP3178134B2 (ja) | 1993-01-11 | 1993-01-11 | ビタミンｄ３ 誘導体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00242093A JP3178134B2 (ja) | 1993-01-11 | 1993-01-11 | ビタミンｄ３ 誘導体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06205685A JPH06205685A (ja) | 1994-07-26 |
| JP3178134B2 true JP3178134B2 (ja) | 2001-06-18 |
Family
ID=11528765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00242093A Expired - Fee Related JP3178134B2 (ja) | 1993-01-11 | 1993-01-11 | ビタミンｄ３ 誘導体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3178134B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5552392A (en) * | 1993-11-03 | 1996-09-03 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of treating hypoparathyroidism with (20S) vitamin D compounds |
| JPH09143154A (ja) * | 1995-11-20 | 1997-06-03 | Kureha Chem Ind Co Ltd | ビタミンｄ３ 誘導体の製造方法 |
| AU3837100A (en) * | 1999-04-14 | 2000-11-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Vitamin d derivatives and process for producing the same |
-
1993
- 1993-01-11 JP JP00242093A patent/JP3178134B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７８，Ｎｏ．２（１９９１）ｐ．１９５−１９８ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８８，Ｎｏ．１３（１９９１）ｐ．５５９７−５６０１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06205685A (ja) | 1994-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jones et al. | The activating enzymes of vitamin D metabolism (25-and 1α-hydroxylases) | |
| Sawada et al. | Metabolism of vitamin D3 by human CYP27A1 | |
| Akiyoshi‐Shibata et al. | Further oxidation of hydroxycalcidiol by calcidiol 24‐hydroxylase: A study with the mature enzyme expressed in Escherichia coli | |
| Sakaki | Practical application of cytochrome P450 | |
| Laden et al. | Cloning, heterologous expression, and enzymological characterization of human squalene monooxygenase | |
| Arnér et al. | Preparation and assay of mammalian thioredoxin and thioredoxin reductase | |
| Miles et al. | Protein engineering of cytochromes P-450 | |
| Sakaki et al. | Bioconversion of vitamin D to its active form by bacterial or mammalian cytochrome P450 | |
| Fujii et al. | Purification, characterization, and directed evolution study of a vitamin D3 hydroxylase from Pseudonocardia autotrophica | |
| Andreesen | Glycine reductase mechanism | |
| Gassner et al. | Structure and mechanism of the iron‐sulfur flavoprotein phthalate dioxygenase reductase | |
| Liu et al. | A bis-cyclodextrin diselenide with glutathione peroxidase-like activity | |
| Inouye et al. | Enzymatic studies on the key enzymes of vitamin D metabolism; 1α-hydroxylase (CYP27B1) and 24-hydroxylase (CYP24) | |
| Estabrook et al. | The interaction of NADPH-P450 reductase with P450: an electrochemical study of the role of the flavin mononucleotide-binding domain | |
| Churchill et al. | Topological studies of the steroid hydroxylase complexes in bovine adrenocortical mitochondria. | |
| Sligar et al. | [3] Mutagenesis of cytochromes P450cam and b5 | |
| EP0477961B1 (en) | Mitochondrial P450 | |
| JP3178134B2 (ja) | ビタミンｄ３ 誘導体の製造方法 | |
| Hernández-Martín et al. | Whole-cell biotransformation with recombinant cytochrome P450 for the selective oxidation of Grundmann’s ketone | |
| JP2003533208A (ja) | Ｎａｄ（ｐ）ｈの間接的な電気化学的再生法 | |
| Leppik et al. | Membrane-associated reactions in ubiquinone biosynthesis: 2-octaprenyl-3-methyl-5-hydroxy-6-methoxy-1, 4-benzoquinone methyltransferase | |
| Bovara et al. | A new enzymatic route to the synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid | |
| JP2517894B2 (ja) | フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現させるキメラｐ４５０産生菌株 | |
| Jay et al. | Characterization of a cleavable fusion of human CYP24A1 with adrenodoxin reveals the variable role of hydrophobics in redox partner binding | |
| JP6742404B2 (ja) | Ｌ−メチオニンの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |