JPH0361490A

JPH0361490A - Ｐ４５０還元酵素融合酸化酵素

Info

Publication number: JPH0361490A
Application number: JP19729689A
Authority: JP
Inventors: Megumi Shibata; 恵柴田; Yoshiyasu Yabusaki; 義康薮崎; Toshiyuki Sakaki; 利之榊; Hiroko Murakami; 裕子村上; Hideo Okawa; 秀郎大川
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1989-07-28
Filing date: 1989-07-28
Publication date: 1991-03-18
Also published as: JPH0569511B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】り裏り旦二里旦互本発明は、チトクロムＰ４５０　（以下Ｐ４５０と略す
る）の有する１原子酸素添加活性、および、それに必要
なＮＡＤＰＨからの還元力を供給する能力を、同一分子
内にあわせ持つ新規酸化酵素、該酸化酵素をコードする
遺伝子、該遺伝子を含む酵母内発現プラスミド、および
該発現プラスミドにより形質転換された酵母菌株に関す
る。本発明により得られるプラスミドにより形質転換さ
れた酵母菌株は、Ｐ２Ｓ５．７αに由来するｌ原子酸素
添加活性を有する融合酸化酵素を生産し、さらに、菌株
自体がＰ４５０７αに由来する１原子酸素添加活性を有
している。

したがって、この菌株、あるいは菌株から取得した融合
酵素を、医薬品として有用であるステロイド類の合成の
ためのバイオリアクターとして利用することができる。

糖質の代謝を支配し、肝にグリコーゲンを貯蔵させる作
用を有するグルココルチコイドは、ヒトの生命の維持に
必須なホルモンである。さらに、抗炎症、抗アレルギー
作用を有するため、リウマチ、湿疹、ぜんぞくなどの治
療用医薬品として広く用いられている。コルチコイド類
は医薬品として高価なものが多く、現在は全合成法ある
いは発酵法による多段階反応によって製造されている。

例えば、グルココルチコイドの基幹化合物であるハイド
ロコルチゾンは、大豆などから得たスチグマステロール
を原料として、プロゲステロンを経て、８段階はどの化
学合成と１段階の発酵法により合成されている。プロゲ
ステロンからハイドロコルチゾンへの変換反応は、１１
β、１７α、２１位の水酸化工程を含んでおりこれらの
水酸化反応は、生体内ではＰ４５０分子種の関与する反
応である。

逆３ＪυえムＰ２Ｓ５は微生物から哺乳動物に至るまで、広く生物界
に存在するヘム酵素であり、広範囲の脂溶性化合物を基
質として、ｌ原子酸素を添加する反応を触媒する。Ｐ２
Ｓ５の示す広範囲な基質特異性は、Ｐ２Ｓ５の分子多様
性に起因する。すなわち、Ｐ２Ｓ５には多数の分子種が
存在し、各々の分子種は幅の広い基質特異性を示し、し
かも、その基質特異性が重複しているので、広範囲の脂
溶性化合物にｌ原子酸素を添加できる。

一方、各々のＰ４５０分子種に電子を供給する糸路は共
通であり、ミクロソーム膜では、主としてフラビンアデ
ニンジヌクレオチドとフラビンモノクレオチドを分子内
に補酵素として含有するＮＡＤＰＩ（チトクロムＰ４５
０還元酵素（還元酵素と略する）がこの役割をはたして
おり、ＮＡＤＰＨからの電子を、基質を結合したＰ２Ｓ
５へ供給する。したがって、Ｐ２Ｓ５は、還元酵素と共
役することにより、はじめてｌ原子酸素添加活性を発揮
する。

本発明者らは、すでに、ラット肝Ｐ４５０ｃおよび還元
酵素の遺伝子をそれぞれ単離し、これらの遺伝子を酵母
内で発現させ、機能を有する酵素蛋白質を生産すること
に成功した（特開昭６１−５６０７２）特開昭６２−１
９０８５）。酵母内で発現したラット肝Ｐ４５０ｃと還
元酵素は、酵母のミクロソーム膜に局在し、Ｐ４５０ｃ
に依存したｌ原子酸素添加活性を発揮した。さらに、発
明者らは、Ｐ４５０’ｃと還元酵素の両方を生産する酵
母菌株を製造し、こうした菌株が酸化反応プロセスへの
バイオリアクターとして利用できることを示した（特開
昭６２−１０４５８２）。また、発明者らは、遺伝子工
学および蛋白質工学的手法を用いて、各種Ｐ４５０分子
種間でのキメラ体Ｐ４５０、ならびにＰ２Ｓ５と還元酵
素の機能を１分子内にあわせ持つ新規酸化酵素の作出に
成功した（特開昭６２−１０４５８３　、特願昭６１−
７６６３３、特願昭６ｌ−１８７７１３）。

一方、発明者らは、ウシ副腎皮質ミクロソームのＰ４５
０分子種についても遺伝子を単離し、酵母内で発現させ
ることにより、ステロイド化合物を酸化できる酵母菌株
を製造した（特願昭６２−２０４１０１゜特願昭６３−
１８１５７１）。さらに、酵母ミクロソームの還元酵素
遺伝子の取得に成功しく特願昭６２−３２５５２７）、
酵母還元酵素を大量に生産することによって、Ｐ４５０
分子種を発現する酵母菌株の性能を向上させることがで
きた（特願昭６３−２０２７５８）。また、ウシ副腎皮
質ミクロソームのＰ４５０分子種と還元酵素の機能を１
分子内にあわせ持つ新規融合酸化酵素を作出した（特願
昭６３−１７３７６１．特願平１−７１２５０）。

このようにして創製したＰ４５０還元酵素は、いずれも
分子内のＮ末端側にＰ２Ｓ５を、Ｃ末端側に還元酵素を
配した構造をとっており、分子内で効率的に電子伝達を
行なうことにより、１分子で酸化活性を発揮する新規Ｐ
４５０モノオキシゲナーセであった。これらＰ４５０還
元酵素融合酵素の分子構造は、微生物バシラス・メガテ
リウム（ＡＴＣＣ１４５８１株）が産生ずる水濱性Ｐ４
５０モノオキシゲナーゼであるＰ４５０１１Ｍ−３と非
常によく似ていた。すなわち、Ｐ４５０１１Ｍ−１は分
子内に１４５０部分と還元酵素部分をあわせ持ち、ＮＡ
ＤＰＨからの電子を効率的に分子内で伝達することによ
り、１分子で活性を発揮するＰ４５０モノオキシゲナー
セで、分子あたりの代謝回転数は脂肪酸を基質とした場
合４．６００ｎｍｏ　ｌ生成物／ｎｍｏ　ＩＰ４５０Ｉ
ＩＭ、＋／ｍｌにも達する。

そこで、発明者らは、バシラス・メガテリウムからＰ４
５０ＢＭ−３の遺伝子を単離し、これを用いることによ
り、Ｐ２Ｓ５　、　、αとＰ４５０ＧＭ−の還元酵素部
分の融合酵素をコードする融合遺伝子を作製し、これを
酵母内発現ベクターに挿入し、発現プラスミドを溝築し
た。本発明の融合酵素遺伝子は、Ｐ４５０＋ｙαのミク
ロソーム結合に関与する領域、基質およびヘムの結合に
関与する領域を含む部分に相当するＰ４５０＋＋α遺伝
子の下流に、還元酵素のフラビンモノヌクレオチド、フ
ラビンアデニンジヌクレオチド結合に関与する領域とＮ
ＡＤＰＨ結合に関与する領域を含む部分に相当するＰ４
５０ＢＭ−遺伝子を接続することにより作製できる。Ｐ
２Ｓ５　、ｔαのミクロソーム膜への結合、基質および
ヘムの結合に関与する領域は、それぞれ、Ｎ末端部分、
中央部分、およびＣ末端部分であることがすでに推定さ
れている。一方、Ｐ４５０ｎＭ−＋の還元酵素部分のフ
ラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオ
チドおよびＮＡＤＰＨの結合に関与する領域は、他のＮ
ＡＤ　Ｐ　１１−チトクロムＰ４５０還元酵素との１次
構造を比較することにより、容易に推定できる。融合酵
素を単一の分子として発現させるためには、Ｐ２Ｓ５．
、α遺伝子の翻訳停止コドンを含まないようにする必要
がある。また、両遺伝子の接続では、両遺伝子のフレー
ムがずれないように、両遺伝子を直接、または合成リン
カ−を介して接続すればよい。

発現プラスミド構築に用いたＰ４５０１７αおよび１４
５０１１Ｍ−−還元酵素のコーディング領域に相当する
遺伝子は、本発明の技術分野における常とう手段により
製造することができる。例えば、ウシ副腎Ｐ４５０Ｉ、
αについて言えば、これを含むプラスミドｐＡα２（特
願昭６３−１７３７６１）から、また、バシラス・メガ
テリウムＰ４５０８．．遺伝子は、バシラス・メガテリ
ウム（ＡＴＣＣ１４５８１株）からＷｅｎとＦｕｌｃｏ
の方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２，６
６７６（１９８７））により製造することができる。

本発明の融合酵素の酵母内発現プラスミドは、上述のと
おり作製した融合酵素遺伝子を、適当な発現ベクターの
クローニング部位に常法により挿入することにより、構
築できる。例えば、発現ベクターとして、酵母アルコー
ル脱水素酵素遺伝子ＣＡＤ）１１）のプロモーターとタ
ーミネータを保持するベクターｐＡＡ）１５（Ｗａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ
から入手可能、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、　Ｖｏｌ　１０１ｐａｒｔｃ、ｐ１９２−２０
１．　Ａｍｍｅｒｅｒらの方法により製造できる。なお
、酵母ＡＤ旧プロモーターはＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＲｅ
ｓｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄａｔｉｏｎの米国特許出願第２
９９７３３に含まれており、米国において工業的、商業
的目的で使用する場合は、権利者の許諾を必要とする）
をあけることができる。しかしながら、ＰＧＫプロモー
ター、Ｇ３ＰＤＨプロモーター、ＧＡＬＩＯプロモータ
ーを有する発現ベクター′など、宿主酵母内で効率よく
機能するプロモーター、ターミネータ−を保持するもの
であればよく、特に限定されるものでない。また、発現
プラスミドの構造も限定されるものでなく、酵母内で安
定に保持されるものであればよい。

本発明の融合酵素の発現には、酵母、例えばサツカロミ
セス・セレビシェＡＨ２２株、サツカロミセス・セレビ
シェＳＨＹ株、サツカロミセス・セレビシェＮＡ３７−
１１Ａ株などが宿主として好都合に使用できる。発現プ
ラスミドによる宿主の形質転換は、アルカリ金属（Ｌｉ
ＣＩ）を用いる方法、プロトプラスミド法など公知の方
法により行なうことができる。

このようにして得られた形質転換酵母を培養することに
より、本発明の融合酵素を製造することができる。本発
明により得られた形質転換酵母の培養は、通常の培養方
法により行なうことができる。

以下、実施例に基づき、本発明の詳細な説明する。本発
明は実施例に限定されるものではなく、通常、本発明の
技術分野で行なわれている程度の変更を含むものである
。

実施例１　発現プラスミドの　築発現プラスミドｐαＢＭＩの構築方法を第１図に示す。

以下で特に断らない限り、制限酵素によるＤＮＡの切断
、アルカリホスファターセによるＤＮＡの脱リン酸化、
ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ断片の再結合などの反応は
、通常２０〜２００μｌの反応混液中で、これら酵素類
を市販するメーカー（例えば、宝酒造（掬）が製品に添
付した反応条件を用いて実施した。

Ｐ２Ｓ５　、　、α酵母還元酵素融合酵素の発現プラス
ミドを構築する時に使用したプラスミドｐｕα（Ｓ）（
特願昭６３−１７３７６１に記載）を制限酵素５ａｌＩ
で切断し、切断部位をＤＮＡポリメラーゼを用いて修復
し、平滑末端とした。ついで、アルカリホスファターゼ
処理を施したのち、合成リンカ−；（末端は平滑末端、
右端にＰｖｕ　ＩＩ切断部位を有する。ＤＮＡはアプラ
イドバイオシステムズ社製３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を用
いて合成した）を挿入することにより、プラスミドｐＵ
αＬを得た。

一方、Ｐ４５０ＢＭ−１遺伝子クロ一ンｐｕＢＭ３（Ｊ
、　Ｂ　ｉｏ　Ｉ。

Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ　２６２．　ｐ６６７６（１９８
７）記載の方法により製造できる）をＳｍａｒを消化し
、アルカリホスファターゼ処理を施したのち、市販の旧
ｎｄＩＩＩリンカ−（宝酒造四より購入）を挿入した。

こうして、Ｐ４５０ＴＩＭ−３の３°非翻訳領域のＳｍ
ａ　［切断部位を旧ｎｄｌＩｒ部位に変換したプラスミ
ドｐｕＢＭ３Ｈを作製した。

上述したプラスミドｐＵαＬを旧ｎｄｌｌＩとＰｖｕ　
ＩＩで同時ｌ白化して、約４００ｂｐの旧ｎｄ　ＩＩＩ
　−Ｐｖｕ　ＩＩ断片（Ｐ２Ｓ５．７αのＮ末端部分に
相当する）を調製した。また、プラスミド９ＵＢＭ３Ｈ
をＰｖｕ　ＩＩとＥｃｏＲＩを同時ｌ白化して、約１．
９ｋｂのＰｖｕ　ＩＩ　−ＥｃｏＲＩ断片（Ｐ２Ｓ５［
ＩＭ−８の還元酵素部分に相当する）を調製した。これ
ら両断片をＩ）ＵＣｌ３の旧ｎｄＩ［Ｉ、ＥｃｏＲ１部
位に挿入することにより、プラスミドｐＵ△αＢＭを作
製した。ｐｕ△αＢＭはｐＵｃ１９由来のＰｖｕ　ＩＩ
切断部位２ケ所の他に、Ｐ２Ｓ５．？αとＰ４５０ａＭ
−＋還元酵素の接続部分にｌケ所のＰｖｕ　Ｕ部位を有
するので、ｐＵ△αＢＭをＰｖｕ■で部分消化し、ｌケ
所だけ切断をうけたＤＮＡ断片（約５　ｋｂ）を回収し
、アルカリホスファターゼ処理を施したのち、ｐＵαＬ
から調製したＰ２Ｓ５．。

αのＣ末端側に相当する約１．２　ｋｂのＰｖｕ■断片
を挿入し、ｐｖｕｌＩ断片が正しい方向に挿入されたプ
ラスミドｐＵαＢＭＩを得た。ｐＵαＢＭＩを旧ｎｄｌ
ｌｌ消化し、Ｐ２Ｓ５．□α／　Ｐ４５０ａＭ−ｓ還元
酵素部分融合酵素をコードする遺伝子断片を得て、これ
を酵母内発現ベクターＰＡＡＨ５の旧ｎｄＩ［Ｉ部位に
挿入することにより、発現プラスミドｐαＢＭＩを構築
した。

ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％
グルコース）１．０−にサツカロミセス・セレビシェＡ
３２２株（ＡＴＣＣ３８６２６）を接種し、３０°Ｃで
振とう培養し、５ＸｌＯ’菌体になった時点で、菌体を
遠心分離により集めた。この菌体を１．ＯＴＩの０．２
　Ｍ　Ｌｉ（ｉ２熔液で洗浄したのち、２０μｌの１Ｍ
ＬｉＣｆｆ溶液にけんだくした。これに、３０μｌの７
０％ポリエチレングリコール４０００６液、約ｌμｇの
プラスミドｐαＢＭＩを添加して、十分にｌ見合したの
ち、３０℃で１時間インキュベートした。ついで、１４
０μｌの滅菌水を加え、よく撹拌したのち、この溶液を
、ＳＤ合成培地プレート（２％グルコース、０．６７％
窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／−ヒスチジン、２％寒
天）上にまき、３０℃で３日間インキュベートすること
（こより、プラスミドｐαＢＭＩを保持する形質転換酵
母ＡＨ２２（ｐαＢＭＩ）株を得た。

実施例２で得た形質転換酵母ＡＨ２２（ｐαＢＭＩ）株
を、ＳＤ合威培地（２％グルコース、０．６７％酵母窒
素源アミノ酸不含、２０μｇ／−ヒスジン）で、約ｌＸ
ｌ０’細胞／７ｎｌまで培養し、集菌したのち、１００
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄した。

菌体を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）
２−にけんだくし、２本のキュベツトに分注し、サンプ
ル側キュベツトに一酸化炭素ガスを吹きこんだのち、両
キュベツトにジチオナイト５〜１０ｍｇ添加した。よく
かくはんしたのち、４００〜５００ｎｍの差スペクトル
を測定し、４４．７＋１ｍを４９０ｎｍのΔｅ　＝　９
１　ｍＭ−’ａｍ−’をもとにして、ヘム含有融合酵素
量を算出した。その結果、ＡＨ２２（ｐαＢＭ１）株は
細胞あたり約１０５分子のヘム含有融合酵素を産生ずる
ことがわかった。

ＳＤ合成培地で約７Ｘ１０’細胞／−まで培養した形質
転換酵母ＡＨ２２（ｐαＢＭＩ）株の培養液５−中に、
終濃度１０μＭになるように、１ｍＭプロゲステロン（
エタノール溶液）５０μｌを添加した。

３０°Ｃで振とう培養を継続し、０，１，２．６時間後
に０．５１ｎｌずつを分取し、遠心分離により得られる
培養上清をＨＰＬＣにより分析した。１（ＰＬＣは以下
の条件を用いた。

１、　カラム；　ｔｔ　Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃｌ８（φ
４　ｘ　３００ｍｍ、ウォーターズ社）２）　溶出条件；２０〜７０％アセトニトリル／水の直
線濃度勾配７２５分３、流　速、２．Ｏｄ１分・１．温　度；５０°Ｃ５、検　出；２４５ｎｍにおける吸光度６、　定　量；
ピーク面積基質添加６時間後のプロゲステロンから１７α−ヒドロ
キシプロゲステロンへの変換率は約５３％であり、Ｐ２
Ｓ５．、α単独発現酵母ＡＨ２２（ｐＡα２）株の変換
率（約７６％）に比べて、約７０％であった。しかしな
がら、基質添加１時間後の変換率をもとにして、算出し
たヘム酵素あたりの代謝回転速度は、ＡＩ（２２（ｐα
ＢＭＩ）株は２３モル／分１モルヘム含有融合酵素であ
り、ＡＨ２２（ｐＡα２）株の値（９モル／分１モルヘ
ム含有Ｐ４５０．、α）に比べて約２．６倍であった。

したがって、Ｐ２Ｓ５　、　、αとＰ４５０１１．ｌ、
還元酵素部分の融合酵素は、分子あたりの活性の向上し
た新規Ｐ４５０モノオキシゲナーゼであることが明らか
になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｐ２Ｓ５．、αとＰ４５０ＢＭ−１還元酵素
部分の融合酵素発現用プラスミドｐαＢＭＩの構築方法
を示す。図中、Ｃ２ａはＰ４５０□α部分、ｍはＰ２Ｓ
５［ＩＭ−３のＰ４５０部分、［＝＝］はＰ４５０’Ｂ
Ｍ−１の還元酵素部分をそれぞれ示す。また、Ａｖ、　
Ｅｃ、　）ｌｄ、　Ｐｖ、　Ｓｐ、　Ｓｍはそれぞれ、
Ａｖａｌ、　ＥｃｏＲＩ、　Ｈｉｎｄｕｌ　、　Ｐｖｕ
　ＩＩ　、　Ｓｐｈ　Ｉ　。Ｓｍａ　ｒの認識部位を表す。第２図は、Ｐ２Ｓ５．、αとＰ４５０１１Ｍ−還元酵素
の融合酵素遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を示す
。アミノ酸記号は、Ａ：アラニンＮ　アスパラギンＣニジスティンＥ：グルタミン酸Ｈ：ヒスチジンＬ：ロイシンＭ、メチオニンＰニブロリンＴ・スレオニンＹ：チロシンを、表す。Ｒ：アルギニンＤ　アスパラギン酸Ｑ：グルタミンＧニゲリシンｆ：イソロイシンに：リジンＦ：フェニールアラニンＳ：セリンＷ　トリプトファンＶ：バリン

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ウシ副腎チトクロムＰ４５０＿１＿７αの有する
１原子酵素添加活性とバシラス・メガテリウム由来チト
クロムＰ４５０＿Ｂ＿Ｍ＿−＿３の有する還元力供給能
をあわせ持つ融合酸化酵素をコードする遺伝子。
（２）特許請求の範囲第１項に記載の遺伝子を含み、該
融合酸化酵素を発現する酵母内発現プラスミド
（３）特許請求の範囲第２項記載の酵母内発現プラスミ
ドｐαＢＭ１
（４）特許請求の範囲第２項記載の酵母内発現プラスミ
ドを保持する形質転換酵母菌株
（５）サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２株を特許請
求の範囲第３項記載の酵母内発現プラスミドｐαＢＭ１
で形質転換した酵母菌株
（６）ウシ副腎チトクロムＰ４５０＿１＿７αの有する
１原子酸素添加活性とバシラス・メガテイウム由来チト
クロムＰ４５０＿Ｂ＿Ｍ＿−＿３の有する還元力供給能
をあわせ持つ融合酸化酵素。
（７）特許請求の範囲第４項記載の形質転換酵母菌株を
培養することを特徴とする該酸化酵素の製造方法。