CN106061996A - 具有增加的酶活性的新型细胞色素p450多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含与SEQ ID NO:1至少80%相同的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的分离的P450酶，其中所述序列包含在对应于位置225的位置处的苏氨酸和/或在对应于位置289的位置处的天冬氨酸突变。本发明还涉及包含编码所述酶的序列的分离的核酸，包含所述核酸的载体，和含有所述核酸或所述载体的宿主细胞。还提供了用于制备所述酶的方法和使用在本发明中表征的酶或宿主细胞产生类固醇激素前体的方法。
Description
本发明涉及具有增加的酶活性的细胞色素P450单加氧酶。
哺乳动物线粒体P450构成细胞色素的一个小家族，其在线粒体内执行特定的反应并在大量疏水化合物的代谢中发挥重要作用。例如，P450c11beta和P450c11AS(由CYP11B1和CYP11B2基因编码)分别执行糖皮质激素和盐皮质激素生物合成的最后一步。P450c11beta是一个经典的类固醇11β羟化酶，其将11脱氧皮质醇转变成氢化可的松，而P450c11AS通过三个连续的步骤催化脱氧皮质酮转变成醛固酮。CYP27A1是线粒体内P450的另一个例子，其是固醇27-羟化酶和维生素D25羟化酶。最后，最具代表性的线粒体P450是P450scc(侧链切割酶)，由CYP11A1基因编码，其切割胆固醇侧链，从而通过两个连续的羟基化和最终的切割将胆固醇转变成孕烯醇酮。P450scc通过将固醇转变成类固醇，执行类固醇生物合成的第一个关键步骤。
P450催化大量底物的区域、化学和立体特异性氧化的能力，反映了它们的生物学作用，使它们成为生物技术应用中的重要候选物。特别地，类固醇激素被广泛用作抗炎、避孕和抗增殖药物。在哺乳动物中，这些类固醇的合成开始于胆固醇向孕烯醇酮转变的侧链切割反应。孕烯醇酮作为基础用于生产进一步的类固醇激素，例如氢化可的松，并且由于它可以从廉价的底物例如胆固醇及其植物来源类似物进行大规模工业转化，因此获得了极大的关注。然而，胆固醇成为孕烯醇酮的侧链切割反应是整个类固醇过程中的限制性步骤。在哺乳动物中，它是由膜结合的CYP11A1酶催化的。
然而，由于多种原因，P450的生物技术和工业使用是难以实现的，并且不令人满意。线粒体P450使用由两种蛋白(即铁氧还蛋白还原酶(FdxR)和铁氧还蛋白(Fdx1)，也称为肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)和肾上腺皮质铁氧还蛋白(Adx))构成的特殊电子传递者链。在体内自然状态下，FdxR从NADPH获得电子，而Fdx1将电子从FdxR运送到线粒体P450。已经开发出了一种体外系统，其中FdxR处于催化浓度(0.5μM)而Fdx1处于饱和浓度(10μM)。为了使这种体外系统有效，电子必须适当地流向(fluxed)P450。
为了尝试克服这些困难，一些作者使用可变的铰链或连接子序列融合了P450scc(或P450c11beta)、Fdx1和FdxR这三个肽。即使这种三重融合产生了有功能的蛋白质，但是其效力与“真实的(bona fide)”多肽相比要低，并且不能够工业规模使用。而且，线粒体环境难以在微生物重组系统中被模拟。例如，P450scc多肽能够被适当地靶定到酵母的线粒体。然而，由于线粒体中不存在底物和/或P450scc的不当折叠或靶定，所靶定的多肽不能够将固醇变成孕烯醇酮。
不同的重组系统被用来从植物固醇产生生物合成的孕烯醇酮。例如，在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中开发了一种生物合成系统。在这个系统中，P450scc与FdxR和Fdx1一起被靶定在线粒体外部的质膜上，并且在该膜上遵循固醇途径来生产固醇。此外，P450c11beta可以和Fdx和FdxR1一起被靶定到线粒体上，在那里它可以将11-脱氧皮质醇转变成皮质醇。在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中开发出了一种生物转化系统。在这个系统中，胆固醇能够被成熟形式的P450scc、Fdx1和FdxR1转变成孕烯醇酮。生物合成仍然是工业规模下最有吸引力的技术，因为底物可以通过宿主作为可溶性分子从简单的碳源制造，从而避免了使用去污剂的负担。
最近，人们已经做出努力以产生新的具有改进特征的P450scc多肽。例如，已经创制了携带K193E突变的重组P450scc突变体。这种突变体比重组的野生型多肽可溶性更好，因此较不容易聚集。因此，使用这种突变体可以获得更高的表达水平，而不会改变其酶特征。然而，仍然需要具有增加的酶活性的改进P450scc多肽，以允许优化类固醇激素的生产，特别是适合于工业化过程。
本发明人开发了一种携带特定突变的新型P450scc多肽。这种突变体在将底物转变成类固醇激素的方面显示了出人意料的改善的酶活性。
因此，本发明涉及一种新的分离的P450酶，其包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列或者由该氨基酸序列构成，其中所述序列包含在对应于位置225的位置处的苏氨酸和/或在对应于位置289的位置处的天冬氨酸。在一些实施方案中，该新型P450酶与SEQID NO:1至少85％、90％、95％、98％或99％相同。
本发明还涉及一种分离的核酸，其包含编码所述酶的核苷酸序列或者由编码所述酶的核苷酸序列构成，并涉及包含与表达调控序列操作连接的所述核酸的载体，和包含所述核酸或所述载体的宿主细胞，所述宿主细胞是例如微生物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种遗传工程化的微生物，其能够将底物转变成类固醇激素前体。该底物可以是，例如具有脂肪族侧链的多环、不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物或胆固醇衍生物。该遗传工程化的微生物包含，例如，编码本发明表征的新型P450酶的核酸，和任选的编码肾上腺皮质铁氧还蛋白(Adx)的核酸序列和/或编码肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)的核酸序列。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于制备本发明表征的P450酶的体外方法，所述方法包括如下步骤：
a)在适合于获得P450酶表达的条件下培养宿主细胞；和
b)回收所表达的酶。
在另一个实施方案中，本发明表征的P450酶用于产生类固醇激素前体。
本发明进一步涉及用于产生类固醇激素前体的方法，包括如下步骤：
a)提供表达本发明所表征的P450酶的微生物，
b)在允许该P450酶表达的条件下培养所述微生物，
c)在允许微生物从所述底物产生类固醇激素前体的条件下，使在步骤b)获得的微生物培养物与选自下组的底物接触：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物和胆固醇衍生物，和
d)回收所产生的类固醇激素前体。
本发明还涉及用于产生类固醇激素前体的方法，例如体外方法，包括如下步骤：
a)在允许所述底物被转变成类固醇激素前体的条件下，使本发明所表征的P450酶与分离的肾上腺皮质铁氧还蛋白(Adx)多肽、分离的肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)多肽和选自下组的底物接触：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物和衍生物，和
b)回收所获得的类固醇激素前体。
类固醇激素被广泛用作抗炎、避孕和抗增殖药物。本发明能够用于生产类固醇激素前体，并帮助合成用于人类的类固醇激素。类固醇激素前体，例如孕烯醇酮，作为基础用于生产进一步的类固醇激素，例如氢化可的松，并且由于它可以进行工业大规模转化，因此获得了极大的关注。
发明详述
酶
“分离的”酶或多肽，其意指所述酶或多肽不再处原始表达它的生物体内的天然环境下。当涉及酶或多肽时，“纯化的”意思是所指分子在基本上不存在相同类型的其它生物大分子的条件下存在。如本文所使用的，术语“纯化的”意思是存在按重量计至少75％的，按重量计至少85％的，按重量计至少95％的，或按重量计至少98％的相同类型的生物大分子。
术语“细胞色素P450酶”或“P450酶”是指能够催化某些反应的单加氧酶，例如在下列文献中综述的那些酶：Van Bogaert et al,2011,FEBS J.278(2):206-221或者Urlacherand Girhard,2011,Trends in Biotechnology 30(1):26-36，或者在网站dmelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html。作为这种野生型P450酶的一个实例，序列SEQ ID NO:4代表了牛(Bos taurus)CYP11A1的成熟形式。包含转运肽(transit peptide)的牛CYP11A1的完整序列在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中被称作P00189(最后序列更新：1986年7月21日)。
本发明中表征的细胞色素P450酶在其各自的原始宿主中可以是膜结合的(不溶的)或细胞质的(可溶的)。作为一个非限制性实例，例如，P450scc(SEQ ID NO:4)催化具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇例如胆固醇、胆固醇类似物及其衍生物的侧链切割反应，使之变成孕烯醇酮或其它类固醇激素前体和衍生物。
本发明人开发了一种具有改善的酶活性的序列SEQ ID NO:1的新型P450酶。与SEQID NO:4(在位置225处具有R并且在位置289处具有N的野生型scc酶)相比，该氨基酸序列SEQ ID NO:1包含两个突变：在对应于序列SEQ ID NO:4的位置225的位置处精氨酸成为苏氨酸的突变，和在对应于序列SEQ ID NO:4的位置289的位置处天冬酰胺成为天冬氨酸的突变。
在具体的实施方案中，本发明表征的新型P450酶显示单加氧酶活性，其催化胆固醇转变成孕烯醇酮。在一个特殊的实施方案中，该新型P450酶显示的单加氧酶活性是序列SEQ ID NO:4的P450酶的至少80％或者更多，特别地，至少85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％，更特别地至少300％或者更多。
本发明表征的分离的P450酶包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列或者由与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列构成，其中所述序列包含在对应于位置225的位置处的苏氨酸和/或在对应于位置289的位置处的天冬氨酸。在一些实施方案中，该新型P450酶与SEQ ID NO:1至少85％、90％、95％、98％或99％相同。
通过向编码该酶的核酸序列中取代、缺失或插入一个或多个密码子导致该酶的氨基酸序列中的改变，由此可以在氨基酸序列中引入变异。氨基酸取代可以是保守的或不保守的。在一些实施方案中，取代是保守取代，其中一个氨基酸被另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸取代。
“保守的氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被另一个具有化学性质(例如电荷或疏水性)相似的侧链R基的氨基酸残基取代的氨基酸取代。大体上，保守氨基酸取代不会实质性改变蛋白质的功能特性。具有化学性质相似的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸，精氨酸，和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
例如，与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列可以是在特定氨基酸残基处具有至少一个取代的多肽。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列与序列SEQ ID NO:1具有至少大约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列同一性。氨基酸序列同一性被定义为，在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且不将任何保守取代考虑作为序列同一性的一部分，在与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列中与参考序列SEQ ID NO:1中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。序列同一性可以在至少80％相同的序列的全长上，在参考序列的全长上，或在两者上进行确定。氨基酸序列同一性的百分比可以如下地进行计算，即根据Needleman-Wunsch比对算法沿着它们的全长进行成对全局比对，以发现两个序列的最佳对齐方式(包括缺口)，例如使用Needle，并使用BLOSUM62矩阵，缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5。
在包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列或者由与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列构成的P450酶中，与SEQ ID NO:1相比的氨基酸修饰通常位于不会显著破坏酶的生物活性的位置。确实，与SEQ ID NO:1至少80％相同的细胞色素P450氨基酸序列展现出与序列SEQ ID NO:1的多肽至少相同的生物活性。
“相同的生物活性”可以指示相同的生物学功能。因此，与序列SEQ ID NO:1的多肽具有相同生物学活性的多肽可以是，例如，具有单加氧酶活性的多肽。确定酶的单加氧酶活性的技术是技术人员众所周知的。作为一个非限制性实例，例如，与序列SEQ ID NO:1的多肽具有相同生物学活性的多肽可以是如下的多肽，其能够催化具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇例如胆固醇、胆固醇类似物和衍生物的侧链切割反应，从而变成孕烯醇酮或其他类固醇激素前体和衍生物。在这种情况下，化合物的催化活性能够在体外(如Woods,S.T.,J.Sadleir,et al.(1998)"Expression of catalytically active humancytochrome p450scc in Escherichia coli and mutagenesis of isoleucine-462.”；Arch Biochem Biophys 353(1):109-15所示)或体内(如Duport,C.,R.Spagnoli,et al.(1998)"Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone inengineered yeast."；Nat Biotechnol 16(2):186-9所示)由本领域的技术人员通过例如实施例1中所述的实验方案容易地进行评估。
通常，催化活性可以在体外转化试验中进行测试，其中150mM HEPES缓冲液被调节到pH 7.4并含有0.05％吐温-20和1mM MgCl2，其被用作反应缓冲液。1单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和5mM作为底物的葡萄糖-6-磷酸，可用作NADPH再生体系。通常，CYP11A1、Adx和AdR的浓度分别可为1μM、20μM和0.5μM，或者0.25μM、5μM和0.125μM。溶解于45％2-羟丙基-β-环糊精中的20μM胆固醇可以用作CYP11A1的底物。通常，将样品预热到37℃，并通过添加NADPH至终浓度为100μM来启始反应。混合物可在37℃伴随搅拌温育30s。通过将样品在水中煮沸30s来终止反应。为了能够在240nm下进行光度检测，可使用来自诺卡氏菌(Nocardia spec)的胆固醇氧化酶将类固醇转变成其3-酮-Δ4衍生物。通常，向样品添加20μl胆固醇氧化酶溶液(5mg胆固醇氧化酶和5mg Na-螯合剂溶解在含有0.05％吐温-20的5ml 50mM HEPES缓冲液中，pH 7)。在37℃温育1h之后，可向反应混合物中添加11-脱氧皮质酮(DOC)，作为内部标准，随后用等体积的乙酸乙酯萃取2次。蒸发后，将萃取物溶解在乙腈/水中。
催化活性还可以在体内转化试验中测定，其中300μM胆固醇向孕烯醇酮的转变通常在24h后通过HPLC进行评估。巨大芽孢杆菌可以被培养在含有10μg/ml四环素的TB培养基中，37℃，180rpm震荡。可通过添加溶于1mL水的0.25g木糖诱导蛋白表达，随后再添加溶于2-羟丙基-β-环糊精中的底物。
可以将序列SEQ ID NO:1与和SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列进行比对。因为这两条序列具有高百分比同一性，所以它们大部分的氨基酸是相同的。因此，可以用如下的方式为两条序列定义氨基酸编号，使位于两条序列中具有相同编号的位置处的氨基酸有至少80％是相同的(如果有必要，引入缺口以实现最大的序列同一性百分比)。在本文的上下文中，序列SEQ ID NO:1的“对应于位置X的位置”是指在与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列中带有所述编号X的位置。因此，序列SEQ ID NO:1可以被当作“参考序列”，用于在同与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列进行的比对中对氨基酸位置进行编号，其方式使得位于两条比对序列“对应位置”处的氨基酸有至少80％是相同的。
在一个实施方案中，本发明表征的分离的P450酶包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列或者由与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列构成，其中所述序列同时包含在对应于位置225的位置处的苏氨酸和/或在对应于位置289的位置处的天冬氨酸。
在另一个实施方案中，本发明表征的P450酶包含选自下组的序列或由选自下组的序列构成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
在另外一个实施方案中，本发明表征的P450酶由序列SEQ ID NO:1构成。
本发明表征的酶可以包含一个或多个标签，其可以方便其纯化。例如，标签可以是聚组氨酸(聚-His)标签。
产生酶的核酸、载体、宿主细胞和方法
在一个实施方案中，本发明表征了一种分离的核酸，其包含编码本发明表征的P450酶的序列或者由编码本发明表征的P450酶的序列构成。
本发明表征的分离的核酸，也称作多核苷酸，可以是DNA或RNA分子，其编码在“酶”部分定义的P450酶，同时考虑到遗传编码的简并性。分离的核酸可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术获得，例如通过体外DNA扩增或聚合，体外基因合成，寡核苷酸连接，或通过这些技术的组合。
本发明表征的核酸有利地处于分离或纯化的形式。术语“纯化的”和“分离的”具有与如上定义相同的含义。
本领域的技术人员会理解，在一些情况下产生具有在天然核苷酸分子中非天然存在的密码子的编码多肽的核苷酸分子可能是有利的。例如，特定原核生物或真核生物宿主偏好的密码子可以被选择用于提高重组多肽表达率。
本发明表征的核酸还可以包含编码标签、载体蛋白、信号肽的序列或非转录或翻译的序列，其提高分子的表达或稳定性。
本发明表征的核酸可用于在合适的表达系统中产生重组P450酶。术语“表达系统”意指在合适的条件下的宿主细胞和相容载体，例如对于表达由该载体携带并且被引入到该宿主细胞内的外来核酸编码的蛋白质是合适的。
通常，核酸可以包含在任何合适的载体内。
因此，在一些实施方案中，本发明表征了一种载体，其包括如上面定义的并且与表达调控元件可操作连接的核酸，和一种含有所述核酸或所述载体的宿主细胞。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意思是如下的携载工具(vehicle)，通过它能够将DNA或RNA序列(例如外来基因)引入到宿主细胞中，从而转化该宿主并促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)。
可以使用任何表达载体，例如质粒、粘粒、附加体(episome)、人工染色体、噬菌体或病毒载体。质粒的实例包括含有复制原点的复制质粒，或整合质粒，例如pUC、pcDNA、pBR等。
载体的其他实例包括用于动物细胞的载体，例如pAGE107(Miyaji H etal.1990)、pAGE103(Mizukami T et al.1987)、pHSG274(Brady G et al.1984)、pKCR(O'Hare K et al.1981)、pSG1beta d2-4-(Miyaji H et al.1990)等。
病毒载体的实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。重组病毒可以通过本领域已知的技术产生，例如通过转染包装细胞或通过用辅助质粒或病毒瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。用于产生这种复制缺陷型重组病毒的详细方案可以在例如WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056和WO 94/19478中发现。
表达载体可以包含一个功能表达盒，例如含有与表达调控序列可操作连接的编码本发明表征多肽的核酸序列的表达盒。
“表达调控序列”是指对多肽表达和任选地对其调节而言必需的元件。表达调控序列可以包括例如启动子序列，用于起始和终止翻译的信号，以及用于调节翻译的合适区域，例如启动子、增强子、终止子等，以导致或指导所述多肽的表达。
在一个实施方案中，本发明表征的载体还包含标记基因，例如使之能够在被转化生物体和不含有所转染的外来DNA的生物体之间进行选择的基因。标记基因可以是赋予对抗生素的抗性的基因。
根据一个具体的实施方案，本发明表征的载体可以进一步包含编码肾上腺皮质铁氧还蛋白(Adx)的核酸序列和/或编码肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)的核酸序列。Adx和AdR是P450酶的氧化-还原配偶体(oxydo-reduction partner)。
“AdR”是指肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(EC:1.18.1.6)或肾上腺皮质-NADP+还原酶，该酶已知是线粒体细胞色素P450电子传递系统的第一个组分，并参与所有类固醇激素的生物合成。
在一个具体的实施方案中，所述AdR酶选自下组：来自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或来自酿酒酵母的AR(由arh1基因编码的NADPH:肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(EC＝1.18.1.6))，和来自大肠杆菌(Escherichia coli)的FNR(由fpr基因编码的铁氧还蛋白-NADP还原酶(EC＝1.18.1.2))。
在一个具体的实施方案中，AdR酶是来自牛的AdR(在UniProtKB/Swiss-Prot中被称作P08165，最后更新：1998年7月15日)。在另一个具体的实施方案中，所述AdR的蛋白序列是SEQ ID NO:7。在另一个具体的实施方案中，所述AdR的蛋白序列是SEQ ID NO:7的变异体，只要保持其生物活性即可。
“Adx”的意思是肾上腺皮质铁氧还蛋白或铁氧还蛋白1，该蛋白凭借其将电子从肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶转移到CYP11A1的活性而为人所知。
在一个具体的实施方案中，所述Adx蛋白选自下组：来自哺乳动物来源的Fdx，来自粟酒裂殖酵母的Etp1fd，和来自酿酒酵母的Yah1。
在一个具体的实施方案中，Adx蛋白是来自牛的Adx(在UniProtKB/Swiss-Prot中被称作P00257，最后更新：1989年7月1日)。在另一个具体的实施方案中，所述Adx的蛋白序列是SEQ ID NO:8。在另一个具体的实施方案中，所述Adx的蛋白序列是SEQ ID NO:8的变体，只要保持其生物活性即可。
本发明表征的载体或核酸能够用于根据本领域技术人员公知的技术转化宿主细胞。所述载体插入到宿主细胞中可以是瞬时的或稳定的。
载体还可以含有编码特定信号的序列，其触发所翻译的蛋白质分泌或者气靶定到细胞室或细胞器。这些不同的控制信号可以根据宿主细胞进行选择，并可以插入到能够在宿主细胞中自我复制的载体中，或者插入到整合在所述宿主基因组中的载体中。
宿主细胞可以是原核生物或真核生物的宿主细胞，包括但不仅限于细菌，酵母，植物细胞，动物细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞，包括可以商业获得的细胞系。在一些实施方案中，表达宿主细胞是大肠杆菌、乳杆菌(Lactobacilli)、芽孢杆菌(Bacillus)，特别是巨大芽孢杆菌，益生菌(probiotic bacteria)，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，酿酒酵母，昆虫细胞，植物细胞，COS细胞和CHO细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，特别是细菌细胞。在另一个特殊的实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如酵母细胞，例如酿酒酵母的细胞。
常用的表达系统包括细菌宿主细胞和质粒载体，昆虫宿主细胞和杆状病毒(Baculovirus)载体，和哺乳动物宿主细胞和载体。具体的实例包括大肠杆菌，巨大芽孢杆菌，克鲁维酵母(Kluyveromyces)或酿酒酵母，哺乳动物细胞系(例如，Vero细胞，CHO细胞，3T3细胞，COS细胞等)，以及原代或已建立的哺乳动物细胞培养物(例如，从淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生的)。实例还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)，小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)，CHO细胞，其中二氢叶酸还原酶基因(也称为“DHFR基因”)是有缺陷的(Urlaub G et al；1980)，大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662，也被称为“YB2/0细胞”)，等等。
在另一个实施方案中，本发明表征的细胞已经被本文提供的核酸和/或载体转染、感染或转化。因此，本发明进一步涉及含有本文所述核酸和/或载体的宿主细胞，以及这些宿主细胞的后代和/或衍生物。在一个实施方案中，宿主细胞是遗传工程化的微生物。
如本文所使用的，“微生物”可以是大肠杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
如Woods,S.T.,J.Sadleir,et al.(1998)(Expression of catalyticallyactive human cytochrome p450scc in Escherichia coli and mutagenesis ofisoleucine-462.Arch Biochem Biophys 353(1):109-15)所示，在大肠杆菌中表达成熟形式的人P450scc，以提供人类酶的更便利来源，并能够用定点诱变进行结构-功能研究。这种表达系统能够产生比先前已经从胎盘线粒体中分离的更大量的活性细胞色素。将所表达的P450scc纯化到接近均质，并显示具有与从人类胎盘纯化的酶相当的催化性质。成熟形式的人类肾上腺皮质铁氧还蛋白也在大肠杆菌中表达，并支持胆固醇侧链切割活性，其Vmax与使用牛肾上腺皮质铁氧还蛋白观察到的相同，但具有更高的Km。人P450scc中，Ile-462突变为Leu导致以胆固醇为底物的催化速率常数(kcat)降低，对22R-羟基胆固醇的Km增加，但不影响20α-羟基胆固醇的动力学常数。
如Duport,C.,R.Spagnoli,et al.(1998)(Self-sufficient biosynthesis ofpregnenolone and progesterone in engineered yeast.Nat Biotechnol 16(2):186-9)所示，在酿酒酵母中复制类固醇合成途径的前两个步骤。固醇生物合成的工程化通过破坏delta 22-去饱和酶基因并引入拟南芥(Arabidopsis thaliana)的delta 7-还原酶活性并且共表达牛侧链切割细胞色素P450、肾上腺皮质铁氧还蛋白和肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶进行，其导致从简单的碳源生物合成孕烯醇酮。在额外共表达人3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶之后，孕烯醇酮被进一步代谢为孕酮。类固醇的形成似乎与酵母的固醇生物合成相偶联。
在Szczebara,F.M.,C.Chandelier,et al.(2003)(Total biosynthesis ofhydrocortisone from a simple carbon source in yeast；Nat Biotechnol 21(2):143-9)中，氢化可的松，哺乳动物的主要肾上腺糖皮质激素和类固醇药物合成的重要中间体，被报道由重组酿酒酵母菌株从简单的碳源产生。人工和完全自给自足的生物合成途径涉及13个工程化基因，其被组装并在单一酵母菌株中表达。内源的固醇生物合成被改道(rerouted)，从而产生相容的固醇以用作该途径异源部分的底物。生物合成涉及8种哺乳动物蛋白(成熟形式的CYP11A1、肾上腺皮质铁氧还蛋白(ADX)和肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(ADR)；线粒体形式的ADX和CYP11B1；3β-HSD、CYP17A1和CYP21A1)。优化涉及调节两个线粒体系统，和破坏与ATF2、GCY1和YPR1基因产物相关的不想要的副反应。氢化可的松是所产生的主要类固醇。此项工作证实了将一个复杂的生物合成途径从高等真核生物转移到微生物中的可行性。
在一个具体的实施方案中，微生物是巨大芽孢杆菌，尤其是被称作巨大芽孢杆菌MS941的菌株。表述“巨大芽孢杆菌MS941菌株”是指在Wittchen and Meinhardt,1995,ApplMicrobiol Biotechnol.42:871-877中指称的菌株，并且其来自于DSM319菌株(DeutscheStammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)。
先前所述的使用大肠杆菌的系统和使用巨大芽孢杆菌的系统是两种能够在体外用大肠杆菌或在细胞内用巨大芽孢杆菌实现固醇和固醇衍生物转变的系统。这些技术能够评估P450scc和底物一起发挥功能的能力。两种技术均需要溶解底物的有效方法，从而使它们能够为酶所及。这种溶解在工业水平上(大体积)会成为挑战，无论是在财政上还是在科学方面。
第三种生物体酿酒酵母在这个方面是特别有利的生物体；它的大量发酵可以在立方米或更高水平下被良好地控制，并且其具有从简单碳源，例如葡萄糖和/或乙醇，生产类固醇如孕烯醇酮的强大能力，从而避免了去污剂或助溶化学剂如β-环糊精的使用(参考上文：Duport,C.,R.Spagnoli,et al.(1998)；Szczebara,F.M.,C.Chandelier,et al.(2003))。为了允许在体内合成类固醇，经由固醇生物合成产生与P450scc相容的固醇。
因为酿酒酵母发酵可以在大规模下被良好控制，向合适的途径定向(routed for)为菜油固醇或其它作为底物描述的固醇的酿酒酵母中引入新近描述的P450scc cDNA，在适当电子载体的存在下，可成为用于产生类固醇的有用工具(asset)。这种重组的生物体可用于评估如本文所述的新型P450scc cDNA。
因此，在另一个具体的实施方案中，微生物是酿酒酵母。
术语“遗传工程化的”微生物是指任何通过本领域技术人员已知的遗传工程化技术进行了修饰的微生物。关于与特定微生物相关的方法，本领域的技术人员可以求助于参考手册，例如用于酵母的“酵母遗传学方法”——实验室手册(“Methods in yeastgenetics”—A laboratory course manual)，M Rose,F Winston和P Hieter.198页.ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York.1990.ISBN 0-87969-354-1。
除非另外指出，否则这些技术是生物信息、细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学领域中的常规技术，它们在本领域的技术范围之内。这些技术在文献中有全面的解释。
如本文所使用的，“遗传工程化技术”是指如下的技术，其允许本领域技术人员表达或过表达本领域已知的基因表达。感兴趣基因的表达或过表达可以通过如下的方法实现：通过本领域技术人员已知的任何转化技术，将包含这种感兴趣基因的外源核酸序列引入到细胞或微生物中。
术语“转化”或“转染”的意思是，将“外来”(即异源)基因、DNA或RNA序列引入到宿主细胞中，从而使宿主细胞会表达所引入的基因或序列，以产生期望的物质，通常是由所引入基因或序列编码的蛋白或酶。宿主细胞的转染可以用任何标准技术执行，例如化学转化、电穿孔、磷酸钙沉淀或脂质体转染。转化技术还包括，例如，PEG介导的原生质体转化技术(Barg et al,2005,Microbial Processes and Products 165-184)。
“外源核酸序列”是指如下的核酸序列，其在所考虑的微生物中不是原始和/或不是天然表达的，或者其表达方式不是该微生物的天然菌株中原始和/或天然表达的(例如，在表达水平方面)，并且使用它转化所述微生物，以便获得如上所述的遗传工程化微生物。在具体的实施方案中，外源核酸序列来自于除所考虑微生物之外的另一物种(例如，微生物或生物体的另一个种)。在另一个具体的实施方案中，外源序列来自于相同的微生物。
所述外源核酸序列可以编码感兴趣的蛋白质，例如细胞色素P450和氧化-还原配偶体AdR和Adx，并且表述“外源DNA”能够指示每个单独的序列，或者包括含有每个单独序列的完整序列。作为一个非限制性实例，通过本领域已知的技术，例如通过同源重组，将所述外源核酸序列整合到所述微生物的基因组中。
在一个方面中，本发明提供了遗传工程化的微生物，其能够将选自下组的底物转变成类固醇激素前体：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物和衍生物，其中所述微生物包含在本发明中表征的核酸，和任选的编码Adx的外源核酸序列和/或编码AdR的外源核酸序列。
在一个具体的实施方案中，遗传工程化的微生物是酿酒酵母。
在另一个具体的实施方案中，遗传工程化的微生物是巨大芽孢杆菌，特别是巨大芽孢杆菌MS941菌株。
本发明还涉及用于制备本发明所表征的P450酶的体外方法，所述方法包括如下步骤：
a)在适合获得P450酶表达的条件下培养宿主细胞；和
b)回收所表达的酶。
“适合获得P450酶表达的条件”是本领域技术人员众所周知的。通常，使用LB-(25g/L)、TB-(24g/L酵母提取物，12g/L胰蛋白胨，0.4％甘油，10mM磷酸钾缓冲液)或EnPressoTM平板培养基(EnPressoTM Tablet medium)培养宿主细胞。可以通过用来自平板或甘油储液的细胞接种50mL含有10μg/mL四环素的培养基进行预培养。然后通过用500μL该预培养的样品接种50mL含有10μg/mL四环素的培养基进行主培养。主培养物通常生长至光密度达到～0.4。在添加溶解于1ml蒸馏水中的0.25g木糖之后，可以诱导蛋白质表达。
然后，可以通过众所周知的纯化程序对P450酶进行纯化：可以通过如下方法，例如HPLC色谱、使用特异抗体的免疫亲和技术等，将它从裂解物或细胞提取物、包涵体，或者从培养物上清中纯化出来。
可选择地，P450酶可以在体外使用无细胞转录和翻译系统在细胞裂解物或重建系统(例如Rapid TranslationRoche Diagnostics或Retic Lysate IVTTM、Ambion)中从含有其表达所需元件的DNA或RNA基质中表达。
产生类固醇激素前体的方法
如实施例2-4所示，本发明人开发了一种携带特定突变的新型P450scc酶，其在将底物转变成类固醇激素前体方面显示改善的酶活性。
因此，在另一个方面中，本发明涉及使用本发明表征的P450酶产生类固醇激素前体的用途。
本发明进一步提供了用于如下所述地生产类固醇激素前体的方法。
用于产生类固醇激素前体的第一种方法包括如下步骤：
a)提供如上所述的微生物，
b)在允许表达本发明表征的P450酶的条件下培养所述微生物，
c)在允许微生物从所述底物产生类固醇激素前体的条件下，使在步骤b)获得的微生物培养物与选自下组的底物接触：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物和胆固醇衍生物，和
d)回收所产生的类固醇激素前体。
根据一个具体的实施方案，步骤b)和c)同时执行。在这种情况下，用于产生类固醇激素前体的方法包括如下步骤：
a)提供如上所述的微生物，
b)在允许表达本发明所表征的P450酶并允许微生物从所述底物产生类固醇激素前体的条件下，在选自下组的底物的存在下培养所述微生物：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物和胆固醇衍生物，和
c)回收所产生的类固醇激素前体。
用于产生类固醇激素前体的第二种方法包括如下步骤：
a)在允许所述底物被转变成类固醇激素前体的条件下，使本发明表征的P450酶与分离的Adx多肽、分离的AdR多肽和选自下组的底物接触：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物和胆固醇衍生物，和
b)回收所获得的类固醇激素前体。
如本文所使用的，术语“底物”包括具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如从环阿屯醇(cycloartenol)和羊毛固醇(lanosterol)衍生的植物固醇。在这些底物中，“胆固醇，胆固醇类似物和它们的衍生物”是指选自下组的一系列底物：胆固醇，菜子固醇(brassicasterol)，菜油固醇(campesterol)，麦角二烯醇(ergostadienol)如麦角甾5,22二烯醇(ergosta 5,22dienol)，麦角甾5,24(28)二烯醇(ergosta 5,24(28)dienol)，麦角甾5,24(28)二烯3β醇(ergosta 5,24(28)diene 3βol)，麦角甾5,24(25)二烯醇(ergosta5,24(25)dienol)，麦角三烯醇(ergostatrienol)如麦角甾5,22,24(25)三烯醇(ergosta5,22,24(25)trienol)，麦角甾5,22,24(28)三烯醇(ergosta 5,22,24(28)trienol)，麦角甾5,7,22三烯醇(ergosta 5,7,22trienol)，麦角四烯醇(ergostatetrenol)如麦角甾5,7,22,24(25)或麦角甾5,7,22,24(28)，链固醇(desmosterol)，β-谷固醇(β-ergostadienol)，generol，氧固醇(oxysterols)的混合物，豆固醇(stigmasterol)，维生素D，7-脱氢胆固醇和麦角固醇。当前在工业过程中使用的固醇混合也包含在底物的这一定义内，例如generol100和ADM90(包括不同比例的菜子固醇(brassicasterol)+菜油固醇+豆固醇+β-谷固醇)。
在一个特定的实施方案中，底物选自下组：胆固醇、菜油固醇、链固醇和麦角甾5,24(28)二烯3β醇。在一个具体的实施方案中，底物是麦角固醇。
在一个具体的实施方案中，“类固醇激素前体”选自下组：孕烯醇酮，7-脱氢孕烯醇酮，羟麦角固醇(hydroxyergosterol)和羟豆固醇(hydroxystigmasterol)。在另一个具体的实施方案中，所述类固醇激素前体选自下组：羟基化胆固醇类似物和开环甾类化合物(secosteroids)(例如维生素D2和D3是胆固醇类似物7-脱氢胆固醇和麦角固醇的衍生物)。在一个特定的实施方案中，类固醇激素前体是孕烯醇酮。
“在底物存在下培养微生物”的意思是使所述微生物与如上定义的底物在物理上相互作用。这种相互作用可以在或者可以不在培养基内实现。在一个具体的实施方案中，所述培养基含有用于使根据本发明的微生物透化和/或使根据本发明的底物溶解的试剂。底物在这些试剂中的溶解可以发生于添加至微生物培养物之前。
“使P450酶与底物接触”的意思是使所述P450酶与如上定义的底物在物理上相互作用。这种相互作用可以在或者可以不在培养基内实现。在一个具体的实施方案中，所述培养基含有用于使根据本发明的底物溶解的试剂。底物在这些试剂中的溶解可以发生于添加至所述培养基之前。
用于溶解底物的试剂可以选自下组：乙醇，吐温-80，tergitol，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，皂苷(例如包含在皂皮树Quillaja saponaria的粗提取物中的皂树皂角苷(Quillaja saponin))，环糊精及其衍生物(如2-羟丙基-β-环糊精)。在另一个具体的实施方案中，可以使用这些试剂的混合物，作为非限制性的实例，例如乙醇和吐温-80的混合物，tergitol和乙醇的混合物，皂苷(例如皂树皂角苷)和环糊精的混合物。可以使用环糊精衍生物，例如2-羟丙基-β-环糊精。在另一个具体的实施方案中，底物与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)共结晶。
在另一个实施方案中，在添加至微生物培养物之前，底物首先溶解于2-羟丙基-β-环糊精中，其中所述培养物含有皂树皂角苷。在另一个实施方案中，底物溶解在溶液中，所述溶液含有范围是10-60％，例如20-50％，例如40-50％的2-羟丙基-β-环糊精和范围是1-10％，例如2-8％，例如3-6％的皂树皂角苷。在另一个实施方案中，底物溶解在含有45％的2-羟丙基-β-环糊精和4％皂树皂角苷的溶液中。
在另一个实施方案中，微生物培养物中2-羟丙基-β-环糊精的终浓度是1-4％，例如2-3％，例如2.25％，如实施例2中举例的。在另一个实施方案中，皂树皂角苷在微生物培养物中的最终浓度是0.05-0.25％，例如0.075-0.225％，例如0.1-0.2％。
“在允许表达所述外源核酸序列的条件下培养所述微生物”可以根据生物技术领域中的任何众所周知的培养和诱导方法执行，例如在Bleif et al.(Appl MicrobiolBiotechnol(2012)93:1135–1146)或者在Korneli et al.(Journal of Biotechnology163(2013)87–96)中所述。
“允许所述底物转化成类固醇激素前体的条件”包括体外条件，例如所用试剂、试剂浓度、温度、搅拌的使用、反应或温育的持续时间等，其有利于所述底物转化成类固醇激素前体。这些条件可以通过本发明技术人员已知的方法加以确定和调整。
作为非限制性实例，反应可以在如下条件下执行：存在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸，通常置于被调节到例如pH 7.4的150mM HEPES缓冲液中，其通常含有0.05％吐温-20和1mM MgCl2。P450酶、Adx和AdR的浓度分别可为例如1μM、20μM和0.5μM，或0.25μM、5μM和0.125μM。具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物或胆固醇衍生物，可以被溶解在45％的2-羟丙基-β-环糊精中。样品可以被预热到37℃，并可以添加NADPH至终浓度为100μM。该混合物可以在37℃下搅拌温育。
在一个具体的实施方案中，在用于产生类固醇激素前体的任何方法中使用的类固醇激素前体是孕烯醇酮。如本文所使用的，“孕烯醇酮”是指一种又被称作3β-羟基孕甾-5-烯-20-酮(3β-hydroxypregn-5-en-20-one)的类固醇激素。
序列简述
SEQ ID NO:1显示了包含在位置225的苏氨酸和在位置289的天冬氨酸的CYP11A1(多肽SA1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2显示了包含在位置225的苏氨酸的CYP11A1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示了包含在位置289的天冬氨酸的CYP11A1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4显示了WT牛(Bos taurus)CYP11A1(多肽SA4；WT P450scc)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5显示了编码SEQ ID NO:1的SA1的质粒pSMF2.1_CYP11A1BYM的序列。
SEQ ID NO:6显示了多肽SA6(P450scc-I1A-K193E)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7显示了AdR的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8显示了Adx的氨基酸序列。
附图简述
图1：HPLC色谱图显示了通过细胞色素P450多肽SA1(SEQ ID NO:1)和SA4(具有序列SEQ ID NO:4的对照)进行的20μM胆固醇的体外转化。图例：S：底物，P：主要产物，DOC：11-脱氧皮质酮。
图2：由HPLC-色谱图得出的孕烯醇酮定量，其显示了通过细胞色素P450多肽SA1(SEQ ID NO:1)将不同底物体内转化成孕烯醇酮。
图3：HPLC色谱图显示了通过细胞色素P450多肽SA1(SEQ ID NO:1)和SA6(具有序列SEQ ID NO:6的对照)体内转化300μM胆固醇24h之后。图例：Chol.：胆固醇，Prog.：孕烯醇酮。
图4：通过细胞色素P450多肽SA1(SEQ ID NO:1)和SA6(具有序列SEQ ID NO:6的对照)体内转化300μM胆固醇的时间过程。
图5：编码SA1(SEQ ID NO:1)的pSMF2.1_CYP11A1BYM的载体图。
实施例
实施例1：材料和方法
蛋白合成
CYP11A1变体通过基因合成并克隆到pTRC99A中，与聚-His融合而得。C43DE3-大肠杆菌细胞用每种载体和编码伴侣蛋白(chaperone)的pGro12共转化。纯化的执行如Janochaet al.(Biochim Biophys Acta.(2011)Jan；1814(1):126-31)所述。纯度通过SDS-PAGE进行评估。纯化蛋白的浓度在用连二亚硫酸钠处理并暴露于CO之后，通过CO-差示光谱确定。
Adx和AdR分别根据Uhlmann et al.(Biochem.Biophys.Res.Commun.,188(1992),pp.1131–1138)和Sagara et al.(Biol.Pharm.Bull.,16(1993),pp.627–630)纯化。
体外转化试验
对于体外酶测定，用含有0.05％吐温-20和1mM MgCl2并调节到pH 7.4的150mMHEPES缓冲液作为反应缓冲液。1单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和5mM作为底物的葡萄糖-6-磷酸作为NADPH再生系统。
对于WT P450scc(记为“SA4”,SEQ ID NO:4)和P450scc-I1A-K193E(记为“SA6”,SEQ ID NO:6)，CYP11A1、Adx和AdR的浓度为1μM、20μM和0.5μM，而对于P450scc-R225T-N289D(记为“SA1”,SEQ ID NO:1)，CYP11A1、Adx和AdR的浓度分别为0.25μM、5μM和0.125μM。
20μM溶解于45％的2-羟丙基-β-环糊精的胆固醇用作CYP11A1的底物。
将样品预热到37℃，并通过添加NADPH至终浓度为100μM开始反应。混合物在37℃伴随搅拌温育30s。通过在水中将样品煮沸30s终止反应。
为了能够在240nm进行光度检测，使用来自诺卡氏菌(Nocardia spec)的胆固醇氧化酶将类固醇转化成其3-酮-Δ4衍生物。
向样品添加20μl胆固醇氧化酶溶液(5mg胆固醇氧化酶和5mg Na-螯合剂，溶解在含有0.05％吐温-20的5ml 50mM HEPES缓冲液中，pH 7)。在37℃温育1h之后，向反应混合物中添加11-脱氧皮质酮(DOC)，作为内部标准，随后用等体积的乙酸乙酯萃取2次。蒸发后，将萃取物溶解在乙腈/水中。
体内转化试验
300μM胆固醇向孕烯醇酮的体内转化在24h后通过HPLC进行评估。将巨大芽孢杆菌培养在含有10μg/ml四环素的TB培养基中，37℃，180rpm震荡。通过添加溶于1mL水的0.25g木糖诱导蛋白表达，随后添加溶于2-羟丙基-β-环糊精中的底物。
实施例2：通过细胞色素P450多肽SA1(SEQ ID NO:1)和SA4(WT对照,SEQ ID NO:4)的胆固醇体外转化
在快速评价(acute evaluation)了每个P450sec制备物的浓度之后，将SA1、SA4和SA6用于下列体外测定。在作为底物的胆固醇(20μM)和饱和量的Adx和AdR的存在下，将这些同工型(isoform)中的每一个重建成1μM的浓度。
尽管SA4和SA6显示相同的活性，但是SA1显示了与SA4和SA6相比呈2-3倍高的活性(图1)。因为底物在温育时间后已经被耗尽，所以难以评估SA1与SA4/SA6多肽在更长温育时间下的差异。
实施例3：通过细胞色素P450多肽SA1(SEQ ID NO:1)和SA6(对照,SEQ ID NO:6)的胆固醇体内转化
因为SA4和SA6之间没有观察到可测量的差异，所以本发明人将兴趣聚焦于比较SA1和SA6多肽。新近开发出了一种新系统，其中在溶解的胆固醇存在下，表达P450scc、Fdx1和FdxR的重组巨大芽孢杆菌将胆固醇代谢成孕烯醇酮。SA1和SA6的相应cDNA被优化用于巨大芽孢杆菌的密码子偏好，并使用合适的限制位点将其转移到质粒pSFM2.1中。使用经典的原生质体转化方案将两种分别携带有密码子优化的SA1和SA6的PSFM2.1质粒转移到巨大芽孢杆菌MS941中。
在24h和48h后，对巨大芽孢杆菌中表达的SA1和SA6多肽的体内胆固醇转化活性进行了评估。
根据体外实验，SA1目前显示了与SA6相比2倍高的活性(图3和4)。
实施例4：通过细胞色素P450多肽SA1(SEQ ID NO:1)将不同底物体内转化成孕烯醇酮
最后，使用改进的系统测试SA1多肽转化如下各种生物技术上感兴趣的底物的能力：菜油固醇、链甾醇、麦角甾-5,24(28)-二烯-3β-醇，和各种20,22-OH氧固醇的混合物。
每种底物被转化成一种与孕烯醇酮具有相同保留时间的主要产物，表明CYP11A1能够切割这些底物中每一个的侧链，产生孕烯醇酮。
对每种底物的孕烯醇酮形成进行定量(图2)。极性氧固醇的转化速度与胆固醇相当(48小时后～35mg/L)。更疏水的固醇菜油固醇、链甾醇和麦角二烯醇在48小时后仅以与胆固醇相比大约19％的速度发生转化。
总之，这些结果显示，所有测试的类固醇能够渗透通过巨大芽孢杆菌的细胞膜，并被CYP11A1SA1突变体转化成孕烯醇酮。
本发明人因此在本文中报告了一种新型P450scc蛋白，命名为SA1，其对包括胆固醇的各种固醇显示增加的转化活性。
Claims (15)
1.一种分离的P450酶，其包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成，其中所述序列包含在对应于位置225的位置处的苏氨酸和/或在对应于位置289的位置处的天冬氨酸。
2.根据权利要求1的酶，其包含选自下组的序列或由选自下组的序列构成：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
3.根据权利要求1或2的酶，由序列SEQ ID NO:1构成。
4.一种分离的核酸，其包含如下的核苷酸序列或者由如下的核苷酸序列构成，所述核苷酸序列编码如权利要求1-3中任一项所限定的酶。
5.一种载体，其包含如权利要求4所限定的核酸，其与表达调控序列可操作地连接。
6.根据权利要求5的载体，进一步包含编码肾上腺皮质铁氧还蛋白(adrenodoxin)(Adx)的核酸序列和/或编码肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(adrenodoxin reductase)(AdR)的核酸序列。
7.一种宿主细胞，其包含如权利要求4所限定的核酸或者如权利要求5或6所限定的载体。
8.根据权利要求7的宿主细胞，其是遗传工程化的微生物。
9.根据权利要求7或8的宿主细胞，其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
10.一种遗传工程化的微生物，其能够将选自下组的底物转变成类固醇激素前体：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物和胆固醇衍生物，其中所述微生物包含如权利要求4所限定的核酸，和任选的编码肾上腺皮质铁氧还蛋白(Adx)的核酸序列和/或编码肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)的核酸序列。
11.一种用于制备如权利要求1-3中任一项所限定的酶的体外方法，所述方法包括如下步骤：
a)在适合于如权利要求1-3中任一项所限定的酶得到表达的条件下培养如权利要求7-9中任一项所限定的宿主细胞；和
b)回收所表达的酶。
12.如权利要求1-3中任一项所限定的酶用于产生类固醇激素前体的用途。
13.一种用于产生类固醇激素前体的方法，包括如下步骤：
a)提供如权利要求8-10中任一项所限定的微生物，
b)在允许如权利要求1-3中任一项所限定的酶表达的条件下培养所述微生物，
c)在允许微生物从底物产生类固醇激素前体的条件下，使在步骤b)获得的微生物培养物与选自下组的底物接触：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物和胆固醇衍生物，和
d)回收所产生的类固醇激素前体。
14.一种用于产生类固醇激素前体的方法，包括如下步骤：
a)在允许底物被转变成类固醇激素前体的条件下，使如权利要求1-3中任一项所限定的酶与分离的肾上腺皮质铁氧还蛋白(Adx)多肽、分离的肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)多肽和选自下组的底物接触：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物和胆固醇衍生物，和
b)回收所获得的类固醇激素前体。
15.根据权利要求13或14的方法，其中该类固醇激素前体是孕烯醇酮。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111019913A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-17 | 苏州汇桢生物技术有限公司 | 一种p450scc突变体及核苷酸、表达载体、宿主细胞 |
| CN112457412A (zh) * | 2020-11-26 | 2021-03-09 | 浙江工业大学 | 一种人工电子传递系统及其在促进p450酶羟基化反应中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1343779A (zh) * | 2000-09-19 | 2002-04-10 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——含有过氧化物酶特征的蛋白12.21和编码这种多肽的多核苷酸 |
| CN1637144A (zh) * | 2004-11-29 | 2005-07-13 | 浙江大学 | 能催化吲哚生成靛蓝的P450BM－3Glu 435Asp变体基因及其用途 |
| CN101333521A (zh) * | 2008-04-25 | 2008-12-31 | 浙江大学 | 细胞色素p450 bm-3 d168s变体酶以及应用其制备靛玉红的方法 |
| WO2012109326A2 (en) * | 2011-02-09 | 2012-08-16 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Determination of oocyte quality |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4861719A (en) | 1986-04-25 | 1989-08-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | DNA constructs for retrovirus packaging cell lines |
| US5278056A (en) | 1988-02-05 | 1994-01-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Retroviral packaging cell lines and process of using same |
| IL90207A (en) * | 1988-05-06 | 1994-07-31 | Roussel Uclaf | Biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor |
| US5670488A (en) | 1992-12-03 | 1997-09-23 | Genzyme Corporation | Adenovirus vector for gene therapy |
| AU6248994A (en) | 1993-02-22 | 1994-09-14 | Rockefeller University, The | Production of high titer helper-free retroviruses by transient transfection |
| FR2712812B1 (fr) | 1993-11-23 | 1996-02-09 | Centre Nat Rech Scient | Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo. |
| IL116816A (en) | 1995-01-20 | 2003-05-29 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof |
| US6013516A (en) | 1995-10-06 | 2000-01-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells |
-
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-
2017
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1343779A (zh) * | 2000-09-19 | 2002-04-10 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——含有过氧化物酶特征的蛋白12.21和编码这种多肽的多核苷酸 |
| CN1637144A (zh) * | 2004-11-29 | 2005-07-13 | 浙江大学 | 能催化吲哚生成靛蓝的P450BM－3Glu 435Asp变体基因及其用途 |
| CN101333521A (zh) * | 2008-04-25 | 2008-12-31 | 浙江大学 | 细胞色素p450 bm-3 d168s变体酶以及应用其制备靛玉红的方法 |
| WO2012109326A2 (en) * | 2011-02-09 | 2012-08-16 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Determination of oocyte quality |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| FAVREAU，F.等: "cholesterol side-chain cleavage enzyme，mitochondrial precursor[Sus scrofa]", 《GENBANK DATABASE》 * |
| N. V. STRUSHKEVICH等: "Role of Positively Charged Residues Lys267, Lys270,and Arg411 of Cytochrome P450scc (Cyp11A1) in Interaction with Adrenodoxin", 《BIOCHEMISTRY (MOSCOW)》 * |
| UNIPROT: "Cytochrome P450，family 11，subfamily A，polypeptide 1", 《UNIPROT DATABASE》 * |
| 王杉: "计算模拟解析P450单加氧酶结构功能和植物细胞壁合成相关基因识别", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111019913A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-17 | 苏州汇桢生物技术有限公司 | 一种p450scc突变体及核苷酸、表达载体、宿主细胞 |
| CN111019913B (zh) * | 2019-12-30 | 2023-07-07 | 苏州汇桢生物技术有限公司 | 一种p450scc突变体及核苷酸、表达载体、宿主细胞 |
| CN112457412A (zh) * | 2020-11-26 | 2021-03-09 | 浙江工业大学 | 一种人工电子传递系统及其在促进p450酶羟基化反应中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112016016586A2 (pt) | 2017-10-03 |
| WO2015107185A1 (en) | 2015-07-23 |
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| WO1993008260A1 (en) | Yeasts containing multiple mammalian cytochromes for degrading complex chemical mixtures | |
| JPH0569511B2 (zh) |
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