JP2021524733A - 修飾ステロールアシルトランスフェラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
(1)配列番号1によるポリペプチドにおける11、281、366、442、551、554、572、624、626、627、636及びその組み合わせからなる群から選択される残基に対応する位置での1つ又は複数のアミノ酸置換を含む、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する、本明細書で定義される修飾酵素。
(2)7−デヒドロコレステロール及びチモステロールを含むステロールのエステル化を触媒し、ステロールエステルにおけるチモステロールに対する7−DHCの比は、それぞれの非修飾酵素を用いた触媒におけるチモステロールに対する7−DHCの比と比較して少なくとも約1.4倍だけ増加される、本明細書で定義され且つ実施形態(1)の修飾酵素。
(3)アミノ酸置換は、F624L、G627D、E11G、H554Q、I442V及びその組み合わせから選択される、本明細書で定義され且つ実施形態(1)又は(2)の修飾酵素。
(4)本明細書で定義され且つ実施形態(1)、(2)、(3)のいずれかによる修飾酵素を含む宿主細胞、好ましくは酵母、より好ましくはステロール産生酵母、更により好ましくはコレステロール産生酵母であって、前記宿主細胞は、任意選択的に、配列番号3によるポリペプチドにおける592及び/又は595から選択される残基に対応する位置での1つ又は複数のアミノ酸置換、好ましくはF592L及び/又はG595Dに対応する置換を更に含む、宿主細胞、好ましくは酵母、より好ましくはステロール産生酵母、更により好ましくはコレステロール産生酵母。
(5)7−DHC及びチモステロールを含むステロールミックスの生成に使用され、チモステロールに対する7−DHCの比は、非修飾酵素を発現する宿主細胞と比較して少なくとも約1.4倍だけ増加される、本明細書で定義され且つ実施形態(4)の宿主細胞。
(6)任意選択的に、
− ERG5及びERG6の不活化、及び/又は
− ステロールΔ24−レダクターゼ活性を有するEC1.3.1.72から選択される異種酵素の発現であって、好ましくは、異種酵素は、植物又は脊椎動物に由来し、より好ましくはヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウマ又はゼブラフィッシュ(Danio rerio)に由来する、発現
を更に含む、本明細書で定義され且つ実施形態(4)又は(5)の宿主細胞。
(7)チモステロール及び7−DHCを含むステロールミックス中のチモステロールのパーセンテージを低減するプロセスであって、適切な条件下において、本明細書で定義され且つ実施形態(4)、(5)若しくは(6)の1つの宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に、ステロールミックスから7−DHCを単離及び/若しくは精製する工程とを含むプロセス又は7−DHC及びチモステロールを含むステロールミックス中の7−DHCのパーセンテージを増加するプロセスであって、適切な条件下において、本明細書で定義され且つ実施形態(4)、(5)若しくは(6)の1つの宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に、ステロールミックスから7−DHCを単離及び/若しくは精製する工程とを含むプロセス。
(8)本明細書で定義され且つ実施形態(4)、(5)又は(6)の1つの宿主を用いる、チモステロール及び7−DHCを含むステロールミックスへのアセチル−CoAの酵素的変換を含む、7−DHCの生成のプロセスであって、ステロールミックス中の7−DHCのパーセンテージは、少なくとも40%であり、任意選択的に、7−DHCは、ビタミンD3及び/又は25−ヒドロキシビタミンD3に更に変換される、プロセス。
(9)7−DHCの生成のプロセスにおける、本明細書で定義され且つ実施形態(1)、(2)、(3)のいずれかの修飾酵素又は本明細書で定義され且つ実施形態(4)、(5)若しくは(6)の1つの宿主細胞の使用であって、7−DHCは、チモステロール及び7−DHCを含むステロールミックスから単離され、チモステロールに対する7−DHCの比は、それぞれの非修飾酵素及び宿主細胞を用いたプロセスと比較してそれぞれ少なくとも約1.4倍だけ増加される、使用。
[実施例1:ARE2変異体の生成及びスクリーニング]
ステロールエステル画分中の7−DHC含有量の向上に関して、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)アシルトランスフェラーゼ2(ScAre2)のバリアントを発現する10,000酵母クローンのエラープローン(error prone)ライブラリを薄層クロマトグラフィー(TLC)によってスクリーニングした(ARE1及びARE2の野生型配列に対して(配列表を参照されたい)。スクリーニング方法は、わずかに細胞壁が消化された細胞からステロールを同時に抽出及び分離することを含む。処理されたバイオマスをTLCプレートに直接適用し、溶媒に浸漬し、1つの工程でステロール含有画分が抽出及び分離された。ステロールエステル画分中の、共役二重結合を有するステロール(例えば、7−DHCとしての)の比は、共役二重結合を有する化合物の様々な分光光度的特性(例えば、蛍光、紫外線検出を消光する能力)を利用することにより、共役二重結合を有さないステロールに対して設定された。
ジェネテシン(100μg/mL)を含む前培養物 − 10ml − YPDに本発明者らの対象の株を接種し(3つの形質転換株/Are2バリアント)、30℃で適切な密度に増殖させた(24〜48時間)。より良好に比較するために、野生型ARE2プラスミドを有する3つの異なる形質転換株も接種し、それをバリアントと同時に形質転換した。バッフルなしで250mL振とうフラスコ内でジェネテシンを含む50mL YPDの本培養物を0.1OD600に接種し、200rpm及び30℃、湿度80%において、3回グルコースを流加して3日間培養した(およそ30、45及び60時間後にグルコースを最終濃度2%まで添加した)。バイオマス200OD単位を15mL Greinerチューブに収集し(1600×gで5分間遠心し、上澄を除去した)、分析まで−20℃で保管した。
溶媒:80%EtOH 20%MeOH 0.1%TFA
カラム:YMC−Pack Pro C18 RS
方法:注入体積:10μL
注入器サーモスタット:40℃
流量:0.6mL/分
カラムサーモスタット:20℃
紫外線検出:210nm、280nm(共役二重結合を有するステロール)
直接、比較をするために、野生型ARE2プラスミドを、Are2バリアントを発現するプラスミド(実施例1を参照されたい)と共に株10Aに再形質転換し、得られた株を同じ試験で分析した(実施例2を参照されたい)。HPLC分析の結果を表1及び図1〜10にまとめる。表の値は、野生型と比較して変異体/バリアントを発現する株間の倍変化を示す。最初の値は、エステル画分と遊離7−DHC画分との比に関する改善を示し、第2の値は、エステル画分中の7−DHCとチモステロールとの比に関する改善を示す。第3の値は、変異体及び野生型のバイオマス中の7−DHC総含有量の比較である。記載のバリアントの一部は、特にエステルレベルの向上を示すのに対して、他は、エステル画分中の7−DHC/チモステロール比の向上を示した。
Claims (14)
- 配列番号1によるポリペプチドにおける11、281、366、442、551、554、572、624、626、627、636及びその組み合わせからなる群から選択される残基に対応する位置での1つ又は複数のアミノ酸置換、好ましくはE11G、及び/若しくはL281I、及び/若しくはD366V、及び/若しくはI442V、及び/若しくはH551Y、及び/若しくはH554Q、及び/若しくはF572L、及び/若しくはF624L、及び/若しくはL626F、及び/若しくはG627D、及び/若しくはC636S並びに/又はその組み合わせに対応する1つ又は複数のアミノ酸置換を含む、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する、ステロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する修飾酵素。
- 7−デヒドロコレステロール(7−DHC)及びチモステロールを含むステロールのエステル化を触媒し、ステロールエステル中のチモステロールに対する7−DHCの比は、それぞれの非修飾酵素を用いた触媒におけるチモステロールに対する7−DHCの比と比較して少なくとも約1.4倍だけ増加される、請求項1に記載の修飾酵素。
- 前記アミノ酸置換は、F624L、G627D、E11G、H554Q、I442V及びその組み合わせから選択される、請求項1又は2に記載の修飾酵素。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の修飾酵素を含む宿主細胞、好ましくは酵母、より好ましくはステロール産生酵母、更により好ましくはコレステロール産生酵母。
- 配列番号3によるポリペプチドにおける592及び/又は595から選択される残基に対応する位置での1つ又は複数のアミノ酸置換、好ましくはF592L及び/又はG595Dに対応する置換を更に含む、請求項4に記載の宿主細胞。
- 7−DHC及びチモステロールを含むステロールミックスの生成に使用され、チモステロールに対する7−DHCの比は、非修飾酵素を発現する宿主細胞と比較して少なくとも約1.4倍だけ増加される、請求項4又は5に記載の宿主細胞。
- ERG5及びERG6は、不活化されている、請求項3〜6のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- ステロールΔ24−レダクターゼ活性を有するEC1.3.1.72から選択される異種酵素を発現し、好ましくは、前記異種酵素は、植物又は脊椎動物に由来し、より好ましくはヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウマ又はゼブラフィッシュ(Danio rerio)に由来する、請求項3〜7のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- チモステロール及び7−DHCを含むステロールミックス中のチモステロールのパーセンテージを低減するプロセスであって、適切な条件下において、請求項4〜8のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、任意選択的に、前記ステロールミックスから前記7−DHCを単離及び/又は精製することとを含むプロセス。
- 7−DHC及びチモステロールを含むステロールミックス中の7−DHCのパーセンテージを増加させるプロセスであって、適切な条件下において、請求項4〜8のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、任意選択的に、前記ステロールミックスから前記7−DHCを単離及び/又は精製することとを含むプロセス。
- 請求項4〜8のいずれか一項に記載の宿主細胞を用いる、チモステロール及び7−DHCを含むステロールミックスへのアセチル−CoAの酵素的変換を含む、7−DHCの生成のプロセスであって、前記ステロールミックス中の7−DHCのパーセンテージは、少なくとも40%である、プロセス。
- 前記7−DHCは、ビタミンD3に更に変換される、請求項11に記載のプロセス。
- 前記7−DHCは、25−ヒドロキシビタミンD3に更に変換される、請求項11又は12に記載のプロセス。
- 7−DHCの生成のプロセスにおける、請求項1〜3のいずれか一項に記載の修飾酵素又は請求項4〜8のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用であって、前記7−DHCは、チモステロール及び7−DHCを含むステロールミックスから単離され、チモステロールに対する7−DHCの比は、それぞれの非修飾酵素及び宿主細胞を用いたプロセスとそれぞれ比較して少なくとも約1.4倍だけ増加される、使用。
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