BR112020023803A2

BR112020023803A2 - esterol aciltransferases modificadas

Info

Publication number: BR112020023803A2
Application number: BR112020023803-1A
Authority: BR
Inventors: Otto Martin Lehmann; Harald Pichler; Holly Stolterfoht
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2021-02-23
Also published as: JP2021524733A; EP3797158A1; WO2019224188A1; EA202092792A1; US20210095325A1; CN112154205A

Abstract

ESTEROL ACILTRANSFERASES MODIFICADAS. A presente invenção se refere a enzimas esterol aciltransferase modificadas com atividade e/ou especificidade aprimorada em relação à acilação do precursor de vitamina D3 7-desidrocolesterol (7-DHC) a ser usado na produção biotecnológica da vitamina D3. A invenção se refere adicionalmente a uma cepa de hospedeiro que expressa as ditas enzimas modificadas e seu uso em um processo para produção de vitamina D3 ou derivados e/ou metabólitos da mesma.

Description

“ESTEROL ACILTRANSFERASES MODIFICADAS”

[0001] A presente invenção se refere a enzimas esterol aciltransferase modificadas com atividade e/ou especificidade aprimorada em relação à acilação do precursor de vitamina D3 7-desidrocolesterol (7-DHC) a ser usado na produção biotecnológica da vitamina D3. A invenção se refere adicionalmente a uma cepa de hospedeiro que expressa as ditas enzimas modificadas e seu uso em um processo para produção de vitamina D3 ou derivados e/ou metabólitos da mesma.

[0002] A vitamina D3 (também conhecida como colecalciferol ou calciol) pode ser sintetizada na pele de mamíferos a partir da pró-vitamina D3 (também conhecida como 7-desidrocolesterol ou 7-DHC) que é produto da biossíntese de colesterol mediante a exposição à luz UV, através disso, 7-DHC é fotoquimicamente convertido em pró- vitamina D3, que isomeriza à temperatura corporal na forma biologicamente ativa de vitamina D3. No fígado, a vitamina D3 é convertida em 25-hidroxivitamina D3 biologicamente ativa (também conhecida como calcidiol, calcifediol, 25- hidroxicolecalciferol, 25-OH-D3 ou HyD), que é a principal forma circulante da vitamina D3. Hidroxilação adicional ocorre no rim.

[0003] Para produção industrial de vitamina D3, a síntese tanto química quanto biotecnológica está disponível (em princípio). A síntese química começa com o colesterol isolado de, por exemplo, gordura de lã que é desidrogenada em 7-DHC, um intermediário importante tanto na síntese química quanto na síntese biotecnológica. Através da exposição por luz UV e outras etapas de purificação/extração, 7-DHC é convertido em vitamina D3. As cepas de levedura modificadas podem ser usadas para biossíntese de 7-DHC, em que acetil-CoA é convertido em um processo enzimático de múltiplas etapas em 7-DHC. A dita conversão enzimática ocorre no retículo endoplasmático da levedura. Quantidades excessivas de esteróis, incluindo 7- DHC e precursores do mesmo, não necessários nas membranas celulares, são tóxicas à levedura e são, desse modo, armazenadas como ésteres esterílicos em organelas intracelulares (assim chamadas corpos lipídicos) a partir das quais podem ser adicionalmente isoladas. O equilíbrio entre esteróis livres e aqueles armazenados nos corpos lipídicos (principalmente na forma de ésteres esterílicos) é desencadeado pela ação de várias proteínas (enzimas), incluindo a ação de esterol aciltransferases. Em levedura, particularmente Saccharomyces cerevisiae, a formação de éster de esteróis é principalmente realizada pelas duas esterol aciltransferases Are1p e Are2p.

[0004] Devido à ação inespecífica das ditas enzimas esterol aciltransferases, o agrupamento de ésteres esterílicos que é armazenado dentro dos corpos lipídicos é relativamente diverso, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, ésteres de ergosterol, zimosterol, lanosterol, latosterol, colesta-5,7,24(25)-trienol ou 7-DHC. Já que apenas colesta-5,7,24(25)-trienol, um precursor para 7-DHC, e não zimosterol, pode ser usado para síntese de vitamina D3, há uma necessidade de armazenamento seletivo de ésteres específicos, como, por exemplo, ésteres de 7-DHC, nos corpos lipídicos e/ou de aumento do turnover de intermediários de 7-DHC produzidos por tais cepas de levedura que são adicionalmente convertidas em vitamina D3 e/ou derivados ou metabólitos da mesma. Um metabólito particular que também é o foco da presente invenção é 25- hidroxivitamina D3.

[0005] Assim, uma tarefa em andamento consiste em gerar células hospedeiras, como levedura capaz de produzir esteróis, com alta produtividade/especificidade para 7-DHC e/ou acúmulo reduzido de produtos colaterais/intermediários incluindo zimosterol, lanosterol ou latosterol, em particular, ésteres de tais intermediários armazenados nos corpos lipídicos.

[0006] Surpreendentemente, constatou-se agora que a especificidade da atividade de esterol aciltransferase na célula hospedeira pode ser deslocada por meio de introdução de certas substituições de aminoácidos na sequência de ARE2 e/ou ARE1, o que resultará em uma maior produtividade de produto da célula hospedeira em relação à 7-DHC como um intermediário importante na produção de vitamina D3.

[0007] Assim, a presente invenção se refere à enzima modificada com atividade de esterol aciltransferase, isto é, esterol aciltransferases modificadas, particularmente atividade de isoforma de esterol aciltransferase Are1p e/ou Are2p, que compreendem uma ou mais substituições (ou substituição) de aminoácido em (uma) posições (ou posição) correspondentes a resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626, 627, 636 e combinações dos mesmos no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, sendo que a dita enzima modificada aumentou a especificidade para 7-DHC em produtos colaterais/intermediários, incluindo zimosterol e/ou atividade aumentada para formação de éster, incluindo ésteres de 7-DHC.

[0008] O polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, que mostra atividade de ARE2, incluindo polinucleotídeos que codificam o dito polipeptídeo, foi isolado de Saccharomyces cerevisiae. O polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:3, que mostra atividade de ARE1, incluindo polinucleotídeos que codificam o dito polipeptídeo, foi isolado de Saccharomyces cerevisiae.

[0009] Os termos "esterol aciltransferase", "aciltransferase", "ARE", "enzima que tem atividade de aciltransferase" ou apenas "enzima" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a enzimas [EC 2.3.1.26], isto é, aciltransferases que transferem grupos acila graxa de uma molécula para outra. Tal transferência ou atividade enzimática pode ser medida por meios conhecidos pela pessoa versada na técnica. Esterol aciltransferases foram isoladas de diferentes origens, incluindo mamíferos, levedura ou plantas. Tanto ARE1 quanto ARE2 são capazes de acilar esteróis, como, por exemplo, zimosterol e/ou 7-DHC nos respectivos ésteres. Como usado no presente documento, uma enzima "modificada", isto é, aciltransferase modificada, tem uma atividade e/ou especificidade preferencial em relação à esterificação de 7-DHC em comparação com a esterificação de, por exemplo, zimosterol, e/ou formação aprimorada de ésteres de esterol totais, incluindo, por exemplo, 7-DHC ou zimosterol. As isoformas de aciltransferase preferenciais são Are2p ou Are1p. Uma esterol aciltransferase "não modificada",

particularmente ARE1 e ARE2, como usado no presente documento se refere às respectivas enzimas endógenas que não portam uma ou mais substituições de aminoácidos como definido no presente documento.

[0010] Como usado no presente documento, uma célula hospedeira que porta uma atividade de esterol aciltransferase modificada como definido no presente documento, particularmente ARE2 e/ou ARE1 que compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos como definido no presente documento, é denominada célula hospedeira "modificada". A respectiva célula hospedeira que porta uma atividade de esterol aciltransferase não modificada, isto é, que codifica os genes de ARE2 e/ou ARE1 do tipo selvagem, é denominada célula hospedeira "não modificada".

[0011] Como usado no presente documento, os termos "zimosterol", "lanosterol", "latosterol", "colesta- 5,8,24(25)-trienol", "colesta-5,7,24(25)-trienol" ou "7- DHC" que especificam intermediários de vitamina D3 incluem tanto a forma livre quanto a forma de éster dos ditos compostos. Como usado no presente documento, uma mistura de esteróis contém 7-DHC e "produtos colaterais" ou intermediários, incluindo, porém sem limitação, zimosterol, lanosterol, latosterol, colesta-5,8,24(25)-trienol ou colesta-5,7,24(25)-trienol.

[0012] Como usado no presente documento, uma "levedura produtora de colesterol" não pode mais produzir ergosterol, mas os produtos de colesterol, incluindo, porém sem limitação, colesta-5,7,24(25)-trienol, colesta-5,8,24(25)- trienol, colesta-7,24(25)-dienol, 7-DHC ou zimosterol. Particularmente, isso pode ser alcançado através da introdução de inativação dupla de erg5erg6.

[0013] Particularmente, a modificação corresponde a uma atividade modificada de esterol aciltransferase 2 e/ou 1, isto é, atividade de ARE2 e/ou ARE1, compreendendo substituição (ou substituições) de aminoácido, em que, de preferência, pelo menos uma substituição de aminoácido em (uma) posições (ou posição) correspondentes aos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626, 627, 636 e combinações dos mesmos no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:1 corresponde a (um) substituições (ou substituição) de aminoácido de E11 e/ou L281 e/ou D366 e/ou I442 e/ou H551 e/ou H554 e/ou F572 e/ou F624 e/ou L626 e/ou G627 e/ou C636. Com mais preferência, a modificação corresponde a uma atividade de ARE2 modificada, ainda com mais preferência, um peptídeo modificado de acordo com SEQ ID NO:1, em que pelo menos uma substituição de aminoácido em (uma) posições (ou posição) selecionadas a partir do grupo que consiste em 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626, 627, 636, e combinações dos mesmos foi introduzida. Preferencialmente, a enzima que tem atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada é originada de Saccharomyces, como S. cerevisiae.

[0014] Em uma modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 11 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de ácido glutâmico por glicina (E11G). A substituição de aminoácidos descrita em uma posição correspondente ao resíduo E11G na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626, 627 e/ou 636 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 e como descrito no presente documento. De preferência, a substituição de aminoácido em uma posição correspondente ao resíduo E11G na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições (ou substituição) adicionais, como substituição (ou substituições) de aminoácido em posições (ou posição) que corresponde a F624L, G627D, D366V, C636S, e/ou I442V em SEQ ID NO:1, mais preferencialmente, são combinações de substituições que correspondem aos resíduos E11G-F624L, E11G-G627D, E11G-D366V-C636S, E11G-D366V-G627D- C636S, E11G-D366V-F624L-C636S, E11G-D366V-I442V-F624L-C636S ou E11G-D366V-I442V-G627D-C636S na SEQ ID NO:1, com combinações mais preferenciais selecionadas a partir de E11G-D366V-C636S, E11G-D366V-G627D-C636S, E11G-D366V-F624L- C636S, E11G-D366V-I442V-G627D-C636S ou E11G-D366V-I442V- F624L-C636S. Com o uso de uma levedura produtora de colesterol que porta tais enzimas modificadas, em particular, enzimas de acordo com SEQ ID NO:1 compreendendo uma das ditas substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido), especificidade de enzima pode ser aumentada na faixa de pelo menos cerca de 3 a 5 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento.

[0015] Em uma modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 281 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de leucina por isoleucina (L281I). A substituição de aminoácidos descrita em uma posição correspondente ao resíduo L281I na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido 11, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626, 627 e/ou 636 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 e como descrito no presente documento. Com o uso de uma levedura produtora de colesterol que porta tais enzimas modificadas, em particular, enzimas de acordo com SEQ ID NO:1 compreendendo uma das ditas substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido), a formação de éster relativa pode ser aumentada na faixa de pelo menos cerca de 1,5 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento.

[0016] Em uma modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 366 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de ácido aspártico por valina (D366V). A substituição de aminoácidos descrita em uma posição correspondente ao resíduo D366V na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626, 627 e/ou 636 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 e como descrito no presente documento. Com o uso de uma levedura produtora de colesterol que porta tais enzimas modificadas, em particular, enzimas de acordo com SEQ ID NO:1 compreendendo uma das ditas substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido), especificidade de enzima pode ser aumentada na faixa de pelo menos cerca de 3 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento.

[0017] Em uma outra modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 442 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de isoleucina por valina (I442V). A substituição de aminoácidos descrita em uma posição correspondente ao resíduo I442V na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido 11, 281, 366, 551, 554, 572, 624, 626, 627 e/ou 636 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 e como descrito no presente documento. De preferência, a substituição de aminoácido em uma posição correspondente ao resíduo I442V na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais, como substituições de aminoácido em posições (ou posição) que corresponde a F624L, L626F e/ou G627D em SEQ ID NO:1, mais preferencialmente, são combinações de substituições correspondentes aos resíduos I442V-L626F, I442V-G627D, I442V-F624L-L626F ou I442V-L626F-

G627D na SEQ ID NO:1, com combinações mais preferenciais selecionadas a partir de I442V-G627D, I442V-F624L-L626F ou I442V-L626F-G627D. Com o uso de uma levedura produtora de colesterol que porta tais enzimas modificadas, em particular, enzimas de acordo com SEQ ID NO:1 compreendendo uma das ditas substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido), especificidade de enzima pode ser aumentada na faixa de pelo menos cerca de 2,2 a 4,5 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento.

[0018] Em uma modalidade adicional, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 551 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de histidina por tirosina (H551Y). A substituição de aminoácidos descrita em uma posição correspondente ao resíduo H551Y na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido 11, 281, 366, 442, 554, 572, 624, 626, 627 e/ou 636 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 e como descrito no presente documento. Com o uso de uma levedura produtora de colesterol que porta tais enzimas modificadas, em particular, enzimas de acordo com SEQ ID NO:1 compreendendo uma das ditas substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido), especificidade de enzima pode ser aumentada na faixa de pelo menos cerca de 1,7 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento.

[0019] Em uma modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 554 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de histidina por glutamina (H554Q). A substituição de aminoácidos descrita em uma posição correspondente ao resíduo H554Q na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido 11, 281, 366, 442, 551, 572, 624, 626, 627 e/ou 636 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 e como descrito no presente documento. De preferência, a substituição de aminoácido em uma posição correspondente ao resíduo H554Q na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais, como substituições de aminoácido em posições (ou posição) que correspondem a F624L, F572L e/ou G627D na SEQ ID NO:1, mais preferencialmente, são combinações de substituições que correspondem aos resíduos H554Q-F572L-F624L ou H554Q-F572L-G627D na SEQ ID NO:1. Com o uso de uma levedura produtora de colesterol que porta tais enzimas modificadas, em particular, enzimas de acordo com SEQ ID NO:1 compreendendo uma das ditas substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido), especificidade de enzima pode ser aumentada na faixa de pelo menos cerca de 1,4 a mais de 12 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento.

[0020] Em uma outra modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 572 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de fenilalanina por leucina (F572L). A substituição de aminoácidos descrita em uma posição correspondente ao resíduo F572L na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido 11, 281, 366, 442, 551, 554, 624, 626, 627 e/ou 636 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 e como descrito no presente documento. Com o uso de uma levedura produtora de colesterol que porta tais enzimas modificadas, em particular, enzimas de acordo com SEQ ID NO:1 compreendendo uma das ditas substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido) como definido acima, especificidade de enzima pode ser aumentada na faixa de pelo menos cerca de 1,7 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido.

[0021] Em uma modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácidos em uma posição correspondente ao resíduo 624 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de fenilalanina por leucina (F624L), que corresponde à substituição de F592L no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:3. A substituição de aminoácidos descrita em uma posição correspondente ao resíduo F624L na

SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 626, 627 e/ou 636 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 e como descrito no presente documento. Com o uso de uma levedura produtora de colesterol que porta tais enzimas modificadas, em particular, enzimas de acordo com SEQ ID NO:1 compreendendo uma das ditas substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido), especificidade de enzima pode ser aumentada na faixa de pelo menos cerca de 3,1 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento.

[0022] Em uma modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular, atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácido em uma posição correspondente ao resíduo 626 no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de leucina por fenilalanina (L626F). A substituição de aminoácidos descrita em uma posição correspondente ao resíduo L626F na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 627 e/ou 636 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 e como descrito no presente documento. Com o uso de uma levedura produtora de colesterol que porta tais enzimas modificadas, em particular, enzimas de acordo com SEQ ID NO:1 compreendendo uma das ditas substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido) como definido acima, especificidade de enzima pode ser aumentada na faixa de pelo menos cerca de 2,2 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento na faixa de pelo menos cerca de pode ser alcançada.

[0023] Em uma modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular, atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácido em uma posição correspondente ao resíduo 627 no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de glicina por ácido aspártico (G627D), que corresponde à substituição de G595D no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:3. A substituição de aminoácidos descrita em uma posição correspondente ao resíduo G627D na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626 e/ou 636 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 e como descrito no presente documento. Com o uso de uma levedura produtora de colesterol que porta tais enzimas modificadas, em particular, enzimas de acordo com SEQ ID NO:1 compreendendo uma das ditas substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido) como definido acima, especificidade de enzima pode ser aumentada na faixa de pelo menos cerca de 2,2 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento.

[0024] Em uma modalidade, a enzima modificada como definido no presente documento, em particular, atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada, compreende uma substituição de aminoácido em uma posição correspondente ao resíduo 636 no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:1, preferencialmente substituição de cistina por serina (C636S). A substituição de aminoácidos descrita em uma posição correspondente ao resíduo C636S na SEQ ID NO:1 pode ser combinada com substituições adicionais como definido no presente documento, isto é, substituições em uma ou mais posições correspondentes ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626 e/ou 627 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1 e como descrito no presente documento. Com o uso de uma levedura produtora de colesterol que porta tais enzimas modificadas, em particular, enzimas de acordo com SEQ ID NO:1 compreendendo uma das ditas substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido), especificidade de enzima pode ser aumentada na faixa de pelo menos cerca de 3 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento.

[0025] Uma esterol aciltransferase modificada de acordo com a presente invenção, como, por exemplo, ARE2 e/ou ARE1, compreende preferencialmente pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição que corresponde a F624L no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:1, levando a uma especificidade de enzima de cerca de 4. Isso pode ser aumentado pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácido adicionais, por exemplo, substituição de aminoácido em uma posição que corresponde a F572L e/ou H554Q, levando a um aumento de especificidade de enzima na faixa de mais de 12 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento.

[0026] Uma esterol aciltransferase modificada de acordo com uma outra modalidade da presente invenção, como por exemplo, ARE2 e/ou ARE1, compreende preferencialmente pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição que corresponde a G627D no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:1, levando a uma especificidade de enzima de mais de 4. Isso pode ser aumentado pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácido adicionais, por exemplo, substituição de aminoácido em uma posição que corresponde a F572L e/ou H554Q, levando ao aumento de especificidade de enzima de cerca de 5 vezes em comparação com o uso de uma levedura não modificada como definido no presente documento.

[0027] Como usado no presente documento, a atividade de ARE2 e/ou ARE1 é modificada. Isso pode ser alcançado, por exemplo, introduzindo (uma) mutação (ou mutações) no gene (ou genes) endógeno que codifica ARE2 e/ou ARE1, isto é, substituição de aminoácidos (ou substituições de aminoácidos) em uma ou mais posições como descrito no presente documento. A pessoa versada na técnica sabe como manipular geneticamente uma célula de levedura, resultando em modificação de atividade de ARE2 e/ou ARE1. Essas manipulações genéticas incluem, porém sem limitação, por exemplo, substituição de gene, amplificação de gene, rompimento de gene, transfecção, transformação com o uso de plasmídeos, vírus ou outros vetores.

[0028] A geração de uma mutação em ácidos nucleicos ou aminoácidos, isto é, mutagênese, pode ser realizada de formas diferentes, como, por exemplo, por mutagênese aleatória ou lateral, danos físicos provocados por agentes, como, por exemplo, radiação, tratamento químico ou inserção de elemento genético. A pessoa versada sabe como introduzir as mutações.

[0029] A presente invenção é particularmente direcionada ao uso de tais enzimas ARE2 e/ou ARE1 modificadas como definido no presente documento em um processo para produção de 7-DHC, um intermediário para a vitamina D3. Preferencialmente, as enzimas modificadas da presente invenção são introduzidas e/ou expressas em uma célula hospedeira adequada, como levedura, preferencialmente levedura produtora de esterol, em particular célula de levedura produtora de colesterol, como selecionado a partir de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Klyuveromyces spp., Hansenula spp. ou Yarrowia lipolytica, preferencialmente S. cerevisiae. O hospedeiro modificado é usado para produção de 7-DHC, que pode ser adicionalmente convertido em vitamina D3 e/ou 25- hidroxivitamina D3.

[0030] Uma célula hospedeira adequada pode ser adicionalmente modificada para aumentar adicionalmente a produção de 7-DHC, um intermediário importante para a biossíntese de vitamina D3 e/ou reduzir o acúmulo de produtos colaterais.

[0031] Assim, em uma modalidade, a invenção é direcionada a uma cepa de levedura que tem atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificada e, adicionalmente, em que ERG5 e ERG6 são inativadas. A célula de levedura pode ser adicionalmente modificada através da expressão de uma enzima heteróloga que tem atividade de C24-redutase, particularmente selecionada a partir de EC 1.3.1.72, como uma C24-redutase heteróloga que está ativa em colesta-7,24- dienol, zimosterol ou trienol (por exemplo, colesta-5,7,25- trienol), de preferência, uma esterol Δ24-redutase de planta ou vertebrado, com mais preferência, a partir de fonte de vertebrados, ainda com mais preferência, a partir de ser humano, porco, cão, camundongo, rato, cavalo, Danio rerio ou qualquer fonte conhecida, desde que possa ser expressa dentro da dita célula de levedura. Com máxima preferência, a esterol Δ24-redutase é selecionada a partir de Danio rerio, rato ou ser humano. As sequências que expressam as ditas enzimas esterol Δ24-redutase estão publicamente disponíveis, incluindo, porém sem limitação, UniProtKB/Swiss-Prot referência Q15392, Q60HC5, Q8VCH6, Q5BQE6, Q39085 ou P93472 (consulte, por exemplo, o documento WO2003064650).

[0032] Em outra modalidade, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção pode ser adicionalmente modificada por meio de introdução de homólogos de enzimas endógenas envolvidas na biossíntese de 7-DHC, como, por exemplo, C5-esterol desaturase (ERG3) e/ou C8-esterol isomerase (ERG2), resultando em especificidade e/ou produtividade aumentada de 7-DHC com acúmulo reduzido de produtos colaterais ou intermediários de vitamina D3, incluindo, porém sem limitação, zimosterol, lanosterol e/ou latosterol.

[0033] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a um processo para aprimorar uma célula hospedeira em relação à produção de 7-DHC, em que uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento, isto é, modificada por meio de introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos em esterol aciltransferases ARE2 e/ou ARE1 como definido no presente documento, em particular uma célula de levedura produtora de colesterol, preferencialmente uma célula de levedura em que ERG5 e ERG6 são inativadas e em que, opcionalmente, uma enzima heteróloga que tem atividade de C-24-redutase como definido no presente documento é expressa, e/ou em que, opcionalmente, homólogos de ERG2 e/ou ERG3 endógenas são expressos, sendo que a célula hospedeira é aprimorada de tal modo que o percentual de 7-DHC na quantidade total de esterol produzido pela dita célula hospedeira seja aumentado e/ou a atividade da célula hospedeira em relação à produção de esteróis seja aumentada, em comparação com uma célula hospedeira não modificada como definido no presente documento.

[0034] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada às esterol aciltransferases modificadas, particularmente ARE2 e/ou ARE1 modificadas, compreendendo pelo menos uma ou mais substituições de aminoácido como definido no presente documento, em que a especificidade da enzima é aumentada em comparação com a especificidade das enzimas não modificadas, levando à maior razão entre 7-DHC e produtos colaterais incluindo, por exemplo, zimosterol em uma mistura de esterol produzida por uma célula hospedeira adequada que porta tal esterol aciltransferase modificada. A razão pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1,4 vezes, como, por exemplo, através da introdução de substituições de aminoácido correspondentes a H554Q na respectiva sequência de ARE2 e/ou ARE1, como aumentada em pelo menos 3, como, por exemplo, através da introdução de substituições de aminoácido correspondentes a E11G-F624L, I442V-G627D ou I442V-F624L-L626F na respectiva sequência de ARE2 e/ou ARE1, como aumentada em pelo menos 4 vezes, como, por exemplo, através da introdução de substituições de aminoácido correspondentes a F624L ou G627D na respectiva sequência de ARE2 e/ou ARE1, como, pelo menos 5, 10 ou até 12 vezes ou mais, como, por exemplo, através da introdução de substituições de aminoácido correspondentes a H554Q- F572L-G627D ou E11G-D366V-I442V-G627D-C636S na respectiva sequência de ARE2 e/ou ARE1.

[0035] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada às esterol aciltransferases modificadas, particularmente ARE2 e/ou ARE1 modificadas, compreendendo pelo menos uma ou mais substituições de aminoácido como definido no presente documento, em que a atividade da enzima é aumentada em comparação com a atividade das enzimas não modificadas, levando à produção geral maior de esteróis e/ou esteril ésteres, incluindo quantidades maiores de 7-DHC produzida por uma célula hospedeira adequada que porta tal esterol aciltransferase modificada. Assim, a formação de éster relativa, isto é, a razão entre todos os ésteres e 7-DHC livre pode ser aumentada em pelo menos 1,2 vezes, como, por exemplo, através da introdução de substituições de aminoácido correspondentes a H55Q ou H554Q-F572L na respectiva sequência de ARE2 e/ou ARE1, como aumentada em pelo menos 2 ou 3 vezes, como, por exemplo, através da introdução de substituições de aminoácido correspondentes a I442V-G627D ou I442V-L626F-G627D na respectiva sequência de ARE2 e/ou ARE1. A produção de 7-DHC total pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1,2 a 1,4 vezes através da introdução de uma ou mais substituições de aminoácido como descrito no presente documento.

[0036] Com o uso da célula hospedeira modificada, por exemplo, levedura, como uma levedura produtora de esterol, em particular, uma levedura produtora de colesterol, como descrito no presente documento, a porcentagem de 7-DHC na mistura de esterol pode ser aumentada em pelo menos 40 %, como 50, 60, 70, 80, 90 % de 7-DHC com base na quantidade total de esteróis.

[0037] Em um aspecto da presente invenção, uma célula hospedeira que compreende atividade de ARE2 e/ou ARE1 modificadas como definido no presente documento é usada em um processo para produção de precursor de vitamina D3 7- DHC. A célula hospedeira modificada pode ser cultivada em um meio aquoso suplementado com nutrientes apropriados sob condições aeróbicas ou anaeróbicas e como conhecido pela pessoa versada para as respectivas células hospedeiras produtoras de colesterol. Opcionalmente, tal cultivo é na presença de proteínas e/ou cofatores envolvidos na transferência de elétrons, como conhecido na técnica. O cultivo/crescimento da célula hospedeira pode ser conduzido na batelada, batelada alimentada, modo semicontínuo ou contínuo. Dependendo da célula hospedeira, de preferência, a produção de vitamina D3 e precursores da mesma, como 7- DHC, pode variar, como é conhecido pela pessoa versada. O cultivo e o isolamento de 7-DHC e outros intermediários na produção de vitamina D3 são descritos, por exemplo, nos documentos WO2011067144 ou WO2017108799. A 7-DHC pode ser isolada e/ou opcionalmente mais purificada a partir da mistura de esteróis e pode ser adicionalmente convertida em vitamina D3 e/ou 25-hidroxivitamina D3 com o uso de métodos conhecidos na técnica.

[0038] Os termos "ARE1" e "Are1p", "ARE2" e "Are2p", "ERG5" e "Erg5p", "ERG6" e "Erg6p" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a um polipeptídeo codificado pelos respectivos genes are1, are2, erg5 e erg6. Para o propósito da presente invenção, a célula de levedura produtora de colesterol é modificada de tal modo que de fato mostre atividade modificada de ARE2 e/ou ARE1, por exemplo, realize uma modificação em qualquer uma das ARE2, ARE1 endógenas ou ambas, resultando em especificidade modificada de ARE2 e/ou ARE1, em que a dita modificação compreende a por meio da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos (ou substituição de aminoácidos) como definido no presente documento.

[0039] Os genes que codificam ERG5, ERG6, ARE1, ARE2, ERG2, ERG3 ou esterol Δ24-redutase (ERG4), cultivo e engenharia genética da célula de levedura como usado no presente documento são conhecidos e descritos, por exemplo, no documento US 7608421.

[0040] Como usado no presente documento, os termos "C- 24-redutase" ou "Δ24-redutase" são usados intercambiavelmente no presente documento. Em levedura, essa enzima é codificada por erg4 e está ativa no grupo metila do átomo de carbono na posição 24. Trienol, que não exibe tal grupo metila na dita posição, não é, portanto, um substrato aceitável para a levedura ERG4.

[0041] Os termos "C-8 esterol isomerase", "delta 8,7- isomerase" ou "enzima que tem C-8 esterol isomerase" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a enzimas que são capazes de catalisar a conversão de colesta-8-enol em colesta-7-enol e/ou zimosterol em colesta-7,24-dienol. Em levedura, essa enzima é codificada por erg2. Em levedura, essa enzima é codificada por erg2. Um homólogo de ERG2 preferencial a ser usado em uma célula hospedeira modificada de acordo com a presente invenção é um polipeptídeo que tem pelo menos 41 %, como, por exemplo, pelo menos 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:5 que mostra atividade de C-8 esterol isomerase e incluindo polinucleotídeos que codificam tal polipeptídeo, obtenível junto à Ustilago maydis. Particularmente, 1 ou mais cópias, como pelo menos 1, 2, 3, 5, do dito homólogo de ERG2 são expressas em uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento.

[0042] Os termos "C-5 esterol desaturase", "enzima que tem C-5 esterol desaturase", "desaturase" ou "homólogo de ERG3" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a enzimas que têm capacidade de catalisar a conversão de colesta-8-enol em colesta-7,24-dienol e/ou colesta-7-enol em colesta-5,7,24-trienol e/ou 7-DHC. Em levedura, essa enzima é codificada por erg3. Um homólogo de ERG3 preferencial a ser usado em uma célula hospedeira modifica de acordo com a presente invenção é um polipeptídeo que tem pelo menos 45 %, como, por exemplo, pelo menos 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:7 que mostra a atividade de

C-5 esterol desaturase e que inclui polinucleotídeos que codificam tal polinucleotídeo obtenível a partir de Pichia pastoris ou Schizosaccharomyces pombe. Particularmente, 1 ou mais cópias, como pelo menos 1, 2, 3, 5, do dito homólogo de ERG3 são expressas em uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento.

[0043] A "formação de éster relativa" como definido no presente documento é a razão (todos os ésteres/7-DHC livre)mutante/ (todos os ésteres/7-DHC livre)wt. A "especificidade" de enzima como definido no presente documento é a razão (éster de 7-DHC/éster de zimosterol)mutante/ (éster de 7-DHC/ éster de zimosterol)wt. A "produção de 7-DHC total" como definido no presente documento é a razão (7-DHC total)mutante/(7-DHC)wt.

[0044] Como usado no presente documento, o termo "atividade específica" ou "atividade" em relação às enzimas significa sua atividade catalítica, isto é, sua habilidade de catalisar a formação de um produto a partir de um determinado substrato. A atividade específica define a quantidade de substrato consumida e/ou produto produzido em um determinado período de tempo e por quantidade definida de proteína em uma temperatura definida. Tipicamente, a atividade específica é expressa em µmol de substrato consumido ou produto formado por min por mg de proteína. Tipicamente, µmol/min é abreviado por U (= unidade). Portanto, as definições de unidade para atividade específica de µmol/min/(mg de proteína) ou U/(mg de proteína) são usadas de modo intercambiável ao longo desse documento. Uma enzima é ativa, se realizar sua atividade catalítica in vivo, isto é, na célula hospedeira como definido no presente documento ou em um sistema adequado (sem células) na presença de um substrato adequado. A pessoa versada sabe como medir a atividade de enzima, como, por exemplo, por HPLC.

[0045] Em relação à presente invenção, entende-se que os organismos, como, por exemplo, microrganismos, fungos, algas ou plantas, incluem também sinônimos ou basônimos de tais espécies que têm as mesmas propriedades fisiológicas, como definido pelo Código Internacional de Nomenclatura de Procariotas ou pelo Código Internacional de Nomenclatura para algas, fungos e plantas (Código de Melbourne).

[0046] Em particular, a presente invenção apresenta as presentes modalidades:

[0047] (1) Uma enzima modificada como definido no presente documento com atividade de esterol aciltransferase que tem atividade de esterol aciltransferase compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido em (uma) posições (ou posição) correspondentes aos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626, 627, 636 e combinações dos mesmos no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:1, preferencialmente uma ou mais substituições de aminoácido correspondentes a E11G e/ou L281I e/ou D366V e/ou I442V e/ou H551Y e/ou H554Q e/ou F572L e/ou F624L e/ou L626F e/ou G627D e/ou C636S e/ou combinações das mesmas.

[0048] (2) A enzima modificada como definido no presente documento e da modalidade (1) que catalisa a esterificação de esteróis que compreende 7-desidrocolesterol e zimosterol, em que a razão entre 7-DHC e zimosterol nos ésteres de esterol é aumentada em pelo menos cerca de 1,4 vezes em comparação com a razão entre 7-DHC e zimosterol na catálise usando a respectiva enzima não modificada.

[0049] (3) A enzima modificada como definido no presente documento e da modalidade (1) ou (2), em que as substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido) são (ou é) selecionadas (ou selecionada) a partir de F624L, G627D, E11G, H554Q, I442V e combinações das mesmas.

[0050] (4) Uma célula hospedeira, preferencialmente, uma levedura, mais preferencialmente, uma levedura produtora de esterol, ainda com mais preferência, uma levedura produtora de colesterol, que compreende uma enzima modificada como definido no presente documento e de acordo com qualquer uma das modalidades (1), (2), (3), em que a dita célula hospedeira opcionalmente compreende adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácido em (uma) posições (ou posição) correspondentes aos resíduos selecionados a partir de 592 e/ou 595 no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:3, preferencialmente a substituição correspondente a F592L e/ou G595D.

[0051] (5) A célula hospedeira como definido no presente documento e da modalidade (4) usada para produção de uma mistura de esterol que compreende 7-DHC e zimosterol, em que a razão entre 7-DHC e zimosterol é aumentada em pelo menos cerca de 1,4 vezes em comparação com uma célula hospedeira que expressa uma enzima não modificada.

[0052] (6) A célula hospedeira como definido no presente documento e da modalidade (4) ou (5), que opcionalmente compreende adicionalmente: - inativação de ERG5 e ERG6 e/ou - expressão de uma enzima heteróloga selecionada a partir de EC 1.3.1.72 que tem atividade de esterol Δ24- redutase, preferencialmente em que a enzima heteróloga é originada de planta ou vertebrado, mais preferencialmente, originada de ser humano, porco, cachorro, camundongo, rato, cavalo ou Danio rerio.

[0053] (7) Um processo para reduzir a porcentagem de zimosterol em uma mistura de esterol que compreende zimosterol e 7-DHC que compreende cultivar uma célula hospedeira como definido no presente documento e uma das modalidades (4), (5) ou (6) sob condições adequadas e opcionalmente isolar e/ou purificar 7-DHC a partir da mistura de esterol ou um processo para aumentar a porcentagem de 7-DHC em uma mistura de esterol que compreende 7-DHC e zimosterol que compreende cultivar uma célula hospedeira como definido no presente documento e de uma das modalidades (4), (5) ou (6) sob condições adequadas e opcionalmente isolar e/ou purificar 7-DHC da mistura de esterol.

[0054] (8) Um processo para produzir 7-DHC que compreende conversão enzimática de acetil-CoA em uma mistura de esterol que compreende zimosterol e 7-DHC com um hospedeiro como definido no presente documento e de uma das modalidades (4), (5) ou (6), em que a porcentagem de 7-DHC na mistura de esterol é pelo menos 40 %, com opcionalmente conversão adicional de 7-DHC em vitamina D3 e/ou 25- hidroxivitamina D3.

[0055] (9) Uso de uma enzima modificada como definido no presente documento de qualquer uma das modalidades (1), (2), (3) ou uma célula hospedeira como definido no presente documento e de uma das modalidades (4), (5) ou (6) em um processo para produção de 7-DHC, em que 7-DHC é isolado de uma mistura de esterol que compreende zimosterol e 7-DHC, e em que a razão entre 7-DHC e zimosterol é aumentada em pelo menos cerca de 1,4 vezes em comparação com um processo usando a respectiva enzima não modificada e célula hospedeira, respectivamente. Figuras

[0056] Figura 1. Análise de HPLC de extratos de lipídios de cepa tipo selvagem de ARE2 ("WT") e variantes de Are2 nº 2 e nº 1 (consulte a Tabela 1). Em relação aos ésteres de 7-DHC (“éster de 7-DHC") e ésteres de zimosterol ("éster de Zim"), duas formas de éster foram detectadas como indicado por cinza escuro e claro nas respectivas colunas, 7-DHC livre é indicado em preto. (A) razão de formação entre 7- DHC e éster, (B) razão entre 7-DHC total (incluindo formas livres e de éster) e ésteres de zimosterol totais, (C) formação de 7-DHC livre, ésteres de 7-DHC e ésteres de zimosterol mostrados por diferentes colunas. As cepas foram cultivadas por dois dias com duas alimentações de glicose em frascos com defletores. Os dados são valores médios de 3 transformantes independentes, cada um cultivado uma vez.

[0057] Figura 2. Análise de HPLC de extratos de lipídios de cepa tipo selvagem de ARE2 ("WT") e variantes de Are2 nº 2 e nº 1 (consulte a Tabela 1). Para detalhes adicionais, consulte a legenda da Figura 1. As cepas foram cultivadas por quatro dias com uma alimentação de glicose em frascos sem defletores. Os dados são valores médios de 2 transformantes independentes, cada um cultivado uma vez.

[0058] Figura 3. Análise de HPLC de extratos de lipídios de cepa tipo selvagem de ARE2 ("WT") e variantes de Are2 nº

9 e nº 1 (consulte a Tabela 1). Para detalhes adicionais, consulte a legenda da Figura 1. Análise de HPLC de acordo com procedimento padrão. Para detalhes adicionais, consulte o texto.

[0059] Figura 4. Análise de HPLC de extratos de lipídio de cepa tipo selvagem de ARE2 ("WT") e variantes de Are2 n° 24 e n° 20 (consulte a Tabela 1). Para detalhes adicionais, consulte a legenda da Figura 1. Análise de HPLC de acordo com procedimento padrão. Para detalhes adicionais, consulte o texto.

[0060] Figura 5. Análise de HPLC de extratos de lipídio de cepa tipo selvagem de ARE2 ("WT") e variantes de Are2 n° 22 e n° 27 (consulte a Tabela 1). Para detalhes adicionais, consulte a legenda da Figura 1. Análise de HPLC de acordo com procedimento padrão. Para detalhes adicionais, consulte o texto.

[0061] Figura 6. Análise de HPLC de extratos de lipídio de cepa tipo selvagem de ARE2 ("WT") e variantes de Are2 n° 20, n° 22, n° 27 e n° 22 (consulte a Tabela 1). Para detalhes adicionais, consulte a legenda da Figura 1. Análise de HPLC de acordo com procedimento padrão. Para detalhes adicionais, consulte o texto.

[0062] Figura 7. Análise de HPLC de extratos de lipídio de cepa tipo selvagem de ARE2("WT") e variantes de Are2 n° 34, n° 32, n° 43, n° 24, n° 20, n° 22 e n° 27 (consulte a Tabela 1). Para detalhes adicionais, consulte a legenda da Figura 1. Análise de HPLC de acordo com procedimento padrão. Para detalhes adicionais, consulte o texto.

[0063] Figura 8. Análise de HPLC de extratos de lipídio de cepa tipo selvagem de ARE2("WT") e variantes de Are2 n°

9, n° 35, n° 36, n° 39 e n° 40 (consulte a Tabela 1). Para detalhes adicionais, consulte a legenda da Figura 1. Análise de HPLC de acordo com procedimento padrão. Para detalhes adicionais, consulte o texto.

[0064] Figura 9. Análise de HPLC de extratos de lipídio de cepa tipo selvagem de ARE2("WT") e variantes de Are2 n° 27, n° 33, n° 34, n° 37 e n° 38 (consulte a Tabela 1). Para detalhes adicionais, consulte a legenda da Figura 1. Análise de HPLC de acordo com procedimento padrão. Para detalhes adicionais, consulte o texto.

[0065] Figura 10. Análise de HPLC de extratos de lipídio de cepa tipo selvagem de ARE2("WT") e variantes de Are2 n° 41, n° 42, n° 43, n° 24 e n° 20 (consulte a Tabela 1). Para detalhes adicionais, consulte a legenda da Figura 1. Análise de HPLC de acordo com procedimento padrão. Para detalhes adicionais, consulte o texto.

[0066] Os exemplos a seguir são ilustrativos somente e não se destinam a limitar o escopo da invenção de modo algum. Exemplos Exemplo 1: Geração de triagem de mutantes de ARE2

[0067] Uma biblioteca propensa a erros de 10.000 clones de levedura que expressam variantes de Saccharomyces cerevisiae aciltransferase 2 (ScAre2) foi rastreada por cromatografia em camada fina (TLC) para conteúdo aprimorado de 7-DHC na fração de éster de esterol (para sequências de tipo selvagem de ARE1 e ARE2 (consulte a listagem de sequência). O método de triagem compreende a extração e separação simultâneas de esteróis de células com paredes celulares levemente digeridas. A biomassa tratada foi aplicada diretamente na placa de TLC e imersa no solvente, que realizou a extração e separação das frações contendo esterol em uma única etapa. Na fração de éster de esterol, a razão de esteróis com ligações duplas conjugadas (como, por exemplo, 7-DHC) foi definida em relação aos esteróis sem ligações duplas conjugadas, explorando-se as diferentes propriedades espectrofotométricas dos compostos com as ligações duplas conjugadas (por exemplo, capacidade de extinguir a fluorescência, Detecção de UV).

[0068] As melhores variantes foram re-rastreadas em quintuplicatas, sequenciadas, cultivadas em frascos de agitação e analisadas em triplicatas biológicas por HPLC-UV para determinar as composições de esterol e éster de esterol.

[0069] Os plasmídeos contendo as melhores variantes foram isolados e novamente transformados em uma cepa 10A de Saccharomyces cerevisiae produtora de colesta-5,7,24- trienol (are1 are2 erg5 erg6::24R; para elaboração, consultar o Exemplo 1 no documento WO2017108799). Mutações de variantes com múltiplas trocas de aminoácidos foram separadas pela introdução da respectiva mutação em ARE2 por mutagênese direcionada ao sítio (mutações silenciosas não foram levadas em consideração) para descobrir qual mutação causou o efeito desejado. As cepas foram cultivadas e analisadas por HPLC. Exemplo 2: Procedimento padrão de análise de HPLC-UV

[0070] Pré-culturas - 10 ml de YPD com geneticina (100 µg/ml) - foram inoculadas com suas cepas de interesse (3 transformantes por variantes Are2) e cultivadas a 30 °C até a densidade apropriada (24 a 48 h). Para melhor comparação,

três transformantes diferentes com o plasmídeo ARE2 de tipo selvagem também foram inoculados, os quais foram transformados ao mesmo tempo que as variantes. As principais culturas de 50 ml de YPD com geneticina foram inoculadas em OD600 de 0,1 em frascos de agitação de 250 ml sem defletores e foram cultivadas por 3 dias com alimentação de glicose 3 vezes (a glicose foi adicionada a 2 % da concentração final após aproximadamente 30, 45 e 60 h) com 200 rpm e 80 % de umidade a 30 °C. 200 unidades OD de biomassa foram colhidas (centrifugadas por 5 min com 1600 x g e o sobrenadante foi removido) em tubos Greiner de 15 ml e armazenados a -20 °C até a análise.

[0071] Para extração, o pélete de célula 200 OD foi descongelado, ressuspenso em 1 ml de solução de zimoliase (5 mg/ml de zimoliase 20T em 50 mM de KPi, pH 7, com 1 M de D-sorbitol) e incubado por 15 min a 37 °C (750 rpm no termomisturador). A solução de zimoliase foi removida após centrifugação (2500 x g, 5 min) e 3,73 ml de EtOH absoluto foram adicionados ao pélete (ressuspenso com 1 ml por pipetagem para cima e para baixo cuidadosamente, em seguida, adicionando-se 2,73 ml adicionais). Foram adicionados 267 µl de padrão interno (acetato de colesterila, 1 mg/ml em EtOH), a suspensão de células foi agitada em vórtice e aquecida a 70 °C durante 1 h com a mistura (750 rpm no termomisturador). Após alguns minutos após deixar os tubos esfriarem até a temperatura ambiente, os resíduos celulares foram peletizados (2500 x g, 10 min à temperatura ambiente) e 3 ml do sobrenadante foram transferidos para tubos Pyrex que foram levados à secura sob N2. Os lipídios foram absorvidos em 200 µl de acetato de etila (agitados em vórtice e misturados com 750 rpm em um termomisturador a 40 °C por 15 min). A solução foi centrifugada mais uma vez (2500 x g, 5 min) e transferida para um frasco de vidro com incrustação para a análise HPLC-UV subsequente.

[0072] Os extratos lipídicos foram analisados por HPLC com detecção de UV em dois comprimentos de onda (210 nm e 280 nm). Os compostos de zimosterol foram detectados a 210 nm, os compostos de 7-DHC foram quantificados em 280 nm. Solvente: 80 % de EtOH 20 % de MeOH 0,1 % de TFA Coluna: YMC-Pack Pro C18 RS Método: volume de injeção: 10 µl termostato injetor: 40 °C fluxo: 0,6 ml/min termostato de coluna: 20 °C detecção de UV: 210 nm, 280 nm (esteróis com ligações duplas conjugadas)

[0073] As misturas padrão de 7-DHC, zimosterol, acetato de colesterila e esqualeno em 3 diferentes concentrações (0,5, 1,0 e 2,0 mg/ml de cada substância) também foram analisadas e curvas padrão foram geradas para cada substância para calcular a concentração em µg/µl de esterol no extrato ou µg/OD600. Exemplo 3: Avaliação de variantes de ARE2 em relação à atividade e/ou especificidade

[0074] Para comparação direta, o plasmídeo de ARE2 do tipo selvagem foi retransformado juntamente com os plasmídeos que expressam as variantes de Are2 (consulte o Ex. 1) na cepa 10A e as cepas resultantes foram analisadas (consulte o Ex. 2) no mesmo processo. Os resultados das análises de HPLC foram resumidos na Tabela 1 e nas Figuras 1-10. Os valores na tabela geraram a alteração em vezes entre as cepas que expressam o/a mutante/variante em comparação com o tipo selvagem. O primeiro valor indica as melhorias referentes à razão entre a fração de éster e a fração de 7-DHC livre enquanto o segundo valor mostra a melhoria referente à ração entre 7-DHC e zimosterol nas frações de éster. O terceiro valor é uma comparação do teor de 7-DHC total na biomassa de mutantes e do tipo selvagem. Algumas das variantes listadas mostraram especificamente melhorias no nível de éster enquanto outras mostraram melhorias na razão de 7-DHC/zimosterol na fração de éster.

[0075] Tabela 1A: Sumário da formação de éster relativa de variantes de Are2 com base nos vários experimentos independentes. "Formação de éster relativa" significa o aumento em x vezes na porcentagem de 7-DHC com base na quantidade total de esteróis gerados usando a troca de aminoácidos indicados em vez de um ARE2 do tipo selvagem; “7-DHC-éster/zim-éster" significa a razão entre ésteres de 7-DHC e ésteres de zimosterol ("zim"); “7-DHC-total/zim- total" é a razão entre 7-DHC total (livre e ésteres) e zimosterol total (livre e ésteres). Para mais explicações, consulte o texto. n° Troca (ou Formação 7-DHC- 7-DHC- trocas) de de éster éster/zim- total/zim- AA relativa éster total 1 H554Q 1,2 1,0-2,0 3,0-4,2 9 H554Q-F572L 1,2 1,7-3,4 3,9-8,5 15 L281I 1,5 24 I442V-L626F 3,5 1,0-1,3 1,7-2,4 n° Troca (ou Formação 7-DHC- 7-DHC- trocas) de de éster éster/zim- total/zim- AA relativa éster total 27 E11G-D366V- 2,2 1,2-1,5 2,3-3,4 C636S 32 E11G-D366V- 1,3 5,3 12,7 F624L-C636S 33 E11G-D366V- 1,5 6,0 15,4 F624L-C636S 34 E11G-D366V- 1,4 7,1-7,3 16.417.8 G627D-C636S 37 E11G-D366V- 1,6 5,4 13,9 I442V- F624L-C636S 38 E11G-D366V- 1,3 7,1 20,5 I442V- G627D-C636S 41 I442V- 1,9 4,8 10,4 F624L-L626F 42 I442V- 2,5 3,4 6,7 L626F-G627D 43 I442V-G627D 1,9 5,5-5,9 11,76-11,7

[0076] Tabela 1B: Sumário de especificidade de variantes de Are2 com base nos vários experimentos independentes. O número indica o aumento em x vezes na porcentagem de 7-DHC em comparação com a porcentagem de zimosterol na mistura de esterol gerada usando a troca de aminoácidos indicados em vez de um ARE2 do tipo selvagem. Para mais explicações, consulte o texto.

n° Troca (ou trocas) de AA Especificidade 1 H554Q 1,4 2 V286V-H551Y-F572L-S633S 1,7 9 H554Q-F572L 1,8 20 F624L 3,9 22 G627D 4,4 32 E11G-D366V-F624L-C636S 3,1 33 E11G-D366V-F624L-C636S 3,8 34 E11G-D366V-G627D-C636S 4,4 35 E11G-F624L 3,2 36 E11G-G627D 4,2 37 E11G-D366V-I442V-F624L-C636S 3,4 38 E11G-D366V-I442V-G627D-C636S 4,5 39 H554Q-F572L-F624L 12,2 40 H554Q-F572L-G627D 5,0 41 I442V-F624L-L626F 3,1 42 I442V-L626F-G627D 2,2 43 I442V-G627D 3,5

[0077] Tabela 1C: Sumário de produção de 7-DHC total de variantes de Are2 com base nos vários experimentos independentes. O número indica o aumento em x vezes na quantidade total de 7-DHC produzido gerado usando a troca de aminoácidos indicados em vez de um ARE2 do tipo selvagem. Para mais explicações, consulte o texto. n° Troca (ou trocas) de AA Produção de 7-DHC total 1 H554Q 1,0 20 F624L 1,0 22 G627D 1,0 n° Troca (ou trocas) de AA Produção de 7-DHC total 24 I442V-L626F 1,3 27 E11G-D366V-C636S 1,2 32 E11G-D366V-F624L-C636S 1,4 33 E11G-D366V-F624L-C636S 1,4 34 E11G-D366V-G627D-C636S 1,3 35 E11G-F624L 1,1 36 E11G-G627D 1,1 37 E11G-D366V-I442V-F624L- 1,4 C636S 38 E11G-D366V-I442V-G627D- 1,1 C636S 39 H554Q-F572L-F624L 1,0 40 H554Q-F572L-G627D 1,3 41 I442V-F624L-L626F 1,4 42 I442V-L626F-G627D 1,4 43 I442V-G627D 1,4

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Enzima modificada com atividade de esterol aciltransferase que tem atividade de esterol aciltransferase caracterizada por compreender uma ou mais substituições de aminoácido em (uma) posições (ou posição) correspondentes aos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste em 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626, 627, 636 e combinações dos mesmos no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:1, preferencialmente uma ou mais substituições de aminoácido correspondentes a E11G e/ou L281I e/ou D366V e/ou I442V e/ou H551Y e/ou H554Q e/ou F572L e/ou F624L e/ou L626F e/ou G627D e/ou C636S e/ou combinações das mesmas.

2. Enzima modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por catalisar a esterificação de esteróis que compreendem 7-desidrocolesterol (7-DHC) e zimosterol, em que a razão entre 7-DHC e zimosterol nos ésteres de esterol é aumentada em pelo menos cerca de 1,4 vezes em comparação com a razão entre 7-DHC e zimosterol na catálise usando a respectiva enzima não modificada.

3. Enzima modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que as substituições de aminoácido (ou substituição de aminoácido) é/são selecionadas a partir de F624L, G627D, E11G, H554Q I442V e combinações dos mesmos.

4. Célula hospedeira, preferencialmente uma levedura, mais preferencialmente uma levedura produtora de esterol, ainda mais preferencialmente uma levedura produtora de colesterol, caracterizada por compreender uma enzima modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por compreender adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácido em (uma) posições (ou posição) correspondentes aos resíduos selecionados a partir de 592 e/ou 595 no polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:3, preferencialmente substituição correspondente a F592L e/ou G595D.

6. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada por ser usada para produção da mistura de esterol que compreende 7-DHC e zimosterol, em que a razão entre 7-DHC e zimosterol é aumentada em pelo menos cerca de 1,4 vezes em comparação com uma célula hospedeira que expressa uma enzima não modificada.

7. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizada pelo fato de que ERG5 e ERG6 são inativados.

8. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizada pelo fato de que a célula expressa uma enzima heteróloga selecionada a partir de EC 1.3.1.72 que tem atividade de esterol Δ24-redutase, preferencialmente em que a enzima heteróloga é originada de planta ou animal vertebrado, mais preferencialmente originada de ser humano, porco, cão, camundongo, rato, cavalo ou Danio rerio.

9. Processo para reduzir o percentual de zimosterol em uma mistura de esteróis que compreende zimosterol e 7-DHC caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 8, sob condições adequadas, e opcionalmente isolar e/ou purificar a 7-DHC da mistura de esteróis.

10. Processo para aumentar o percentual de 7-DHC em uma mistura de esteróis que compreende 7-DHC e zimosterol caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 8, sob condições adequadas, e opcionalmente isolar e/ou purificar a 7-DHC da mistura de esteróis.

11. Processo para produção de 7-DHC caracterizado por compreender a conversão enzimática de acetil-CoA em uma mistura de esteróis que compreende zimosterol e 7-DHC com uma célula hospedeira conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 8, em que o percentual de 7-DHC na mistura de esteróis é de pelo menos 40 %.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a 7-DHC é adicionalmente convertida em vitamina D3.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a 7-DHC é adicionalmente convertida em 25-hidroxivitamina D3.

14. Uso de uma enzima modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou célula hospedeira conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado por ser em um processo para produção de 7- DHC, em que a 7-DHC é isolada de uma mistura de esteróis que compreende zimosterol e 7-DHC, e em que a razão entre 7-DHC e zimosterol é aumentada em pelo menos cerca de 1,4 vezes em comparação com um processo usando a respectiva enzima não modificada e célula hospedeira, respectivamente.