BR112020023316A2 - otimização de dessaturação de c-5 esterol - Google Patents

Abstract

  OTIMIZAÇÃO DE DESSATURAÇÃO DE C-5 ESTEROL. A presente invenção se refere a um método aprimorado para produção de 7-desidrocolesterol (7-DHC), um intermediário importante para produção biotecnológica de vitamina D3 ou derivados/metabólitos da mesma. A invenção caracteriza cepas hospedeiras modificadas que expressam enzimas que têm atividade de dessaturase C-5 esterol dessaturase aprimorada e seu uso em um processo para produção de vitamina D3 ou derivados e/ou metabólitos da mesma.

Description

“OTIMIZAÇÃO DE DESSATURAÇÃO DE C-5 ESTEROL”

[0001] A presente invenção se refere a um método aprimorado para produção de 7-desidrocolesterol (7-DHC), um intermediário importante para produção biotecnológica de vitamina D3 ou derivados/metabólitos da mesma. A invenção caracteriza cepas hospedeiras modificadas que expressam enzimas que têm atividade de dessaturase C-5 esterol dessaturase aprimorada e seu uso em um processo para produção de vitamina D3 ou derivados e/ou metabólitos da mesma.

[0002] A vitamina D3 (também conhecida como colecalciferol ou calciol) pode ser sintetizada na pele de mamíferos a partir da provitamina D3 (também conhecida como 7-desidrocolesterol ou 7-DHC) que é o produto da biossíntese de colesterol mediante a exposição à luz UV, através disso, 7-DHC é fotoquimicamente convertido em provitamina D3, que isomeriza à temperatura corporal na forma biologicamente ativa de vitamina D3. No fígado, a vitamina D3 é convertida em 25-hidroxivitamina D3 biologicamente ativa (também conhecida como calcidiol, calcifediol, 25- hidroxicolecalciferol, 25-OH-D3 ou HyD), que é a principal forma circulante da vitamina D3. Hidroxilação adicional ocorre no rim.

[0003] Para produção industrial de vitamina D3, a síntese tanto química quanto biotecnológica está disponível (em princípio). A síntese química começa com o colesterol isolado de, por exemplo, gordura de lã que é desidrogenada em 7-DHC, um intermediário importante tanto na síntese química quanto na síntese biotecnológica. Através da exposição por luz UV e outras etapas de purificação/extração, 7-DHC é convertido em vitamina D3. As cepas de levedura modificadas podem ser usadas para biossíntese de 7-DHC, em que acetil-CoA é convertido em um processo enzimático de múltiplas etapas em 7-DHC. A dita conversão enzimática ocorre no retículo endoplasmático da levedura. Quantidades excessivas de esteróis, incluindo 7-DHC e precursores do mesmo, não necessários nas membranas celulares, são tóxicas à levedura e são, desse modo, armazenadas como ésteres esterílicos em organelas intracelulares (assim chamadas corpos lipídicos) a partir das quais podem ser adicionalmente isoladas. O equilíbrio entre esteróis livres e aqueles armazenados nos corpos lipídicos (principalmente na forma de ésteres esterílicos) é desencadeado pela ação de várias proteínas (enzimas), incluindo a ação de esterol aciltransferases.

[0004] Devido à ação inespecífica das ditas enzimas esterol aciltransferases, o agrupamento de ésteres esterílicos que é armazenado dentro dos corpos lipídicos é relativamente diverso, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, ésteres de ergosterol, zimosterol, lanosterol, latosterol, colesta-5,7,24(25)-trienol, colesta-8-enol ou 7- DHC. Apenas 7-DHC pode ser adicionalmente processado em vitamina D3.

[0005] Assim, uma tarefa em andamento consiste em gerar células hospedeiras, como levedura capaz de produzir esteróis, com alta produtividade/especificidade para 7-DHC e/ou acúmulo reduzido de produtos colaterais/intermediários incluindo zimosterol, lanosterol ou latosterol, em particular, ésteres de tais intermediários armazenados nos corpos lipídicos.

[0006] Surpreendentemente, constatou-se agora que a produtividade de 7-DHC em uma célula hospedeira, em particular, a razão entre 7-DHC e colesta-7-enol e/ou latosterol, pode ser deslocada para 7-DHC através da modificação de atividade de C-5 esterol dessaturase dentro da célula hospedeira, isto é, expressão de enzimas heterólogas que têm atividade de C-5 esterol dessaturase, o que leva a maior produtividade da célula hospedeira para 7- DHC como intermediário importante na produção de vitamina D3.

[0007] Então, a presente invenção é direcionada ao uso de uma enzima que tem atividade de C-5 esterol dessaturase em um processo para produção de 7-DHC, em que o dito polipeptídeo tem pelo menos 45 %, como por exemplo, pelo menos 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:2 que é expressa (de maneira heteróloga) em uma célula hospedeira adequada para produção de 7-DHC, em que a razão entre 7-DHC e produtos colaterais incluindo lanosterol e/ou latosterol é aumentada em pelo menos 5 % em comparação com uma célula hospedeira não modificada.

[0008] O polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:2, que mostra atividade de C-5 esterol dessaturase, incluindo polinucleotídeos que codificam o dito polipeptídeo, foram isolados de Pichia pastoris.

[0009] Os termos "C-5 esterol dessaturase", "enzima que tem C-5 esterol dessaturase", "dessaturase" ou "homólogo de ERG3" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a enzimas que têm capacidade de catalisar a conversão de colesta-8-enol em colesta-7,24-dienol e/ou colesta-7-enol em colesta-5,7,24-trienol e/ou 7-DHC. As enzimas definidas no presente documento são homólogas do ERG3 de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO:8), incluindo polipeptídeos que codificam tal polipeptídeo.

[0010] Os termos “conversão”, "conversão enzimática" ou "dessaturação" em combinação com catálise enzimática de, por exemplo, colesta-7-enol para 7-DHC e/ou colesta-7,24-dienol para colesta-5,7,24-trienol são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem à ação de C-5 esterol dessaturase como definido no presente documento e conhecido na técnica.

[0011] A dessaturase pode ser usada em uma forma isolada (por exemplo, em um sistema livre de célula) ou pode ser introduzida e expressa como enzima heteróloga ou extracópias de enzimas endógenas em uma célula hospedeira adequada. Desse modo, uma célula hospedeira adequada, expresse uma, duas ou mais cópias de enzimas dessaturase como definido no presente documento, levando a um aumento em 7-DHC e/ou razão aprimorada entre 7-DHC e colesta-7-enol e/ou lanosterol, em que a dita célula hospedeira é referida no presente documento como célula hospedeira geneticamente modificada. Uma célula hospedeira não modificada ou geneticamente não modificada como referido no presente documento é a respectiva célula hospedeira que porta apenas a atividade C-5 esterol dessaturase expressa pelo gene ERG3 endógeno.

[0012] Como usado no presente documento, os termos "zimosterol", "lanosterol", "latosterol", "colesta- 5,8,24(25)-trienol", "colesta-5,7,24(25)-trienol" ou "7- DHC" que especificam intermediários de vitamina D3 incluem tanto a forma livre quanto a forma de éster dos ditos compostos. Como usado no presente documento, uma mistura de esteróis contém 7-DHC e "produtos colaterais" ou intermediários, incluindo, porém sem limitação, zimosterol, lanosterol, latosterol, colesta-8-enol, colesta-5,8,24(25)- trienol ou colesta-5,7,24(25)-trienol.

[0013] Como usado no presente documento, uma "levedura produtora de colesterol" não pode mais produzir ergosterol, mas os produtos de colesterol, incluindo, porém sem limitação, colesta-5,7,24(25)-trienol, colesta-5,8,24(25)- trienol, colesta-7,24(25)-dienol, colesta-8-enol, 7-DHC ou zimosterol. Particularmente, isso pode ser alcançado através da introdução de inativação dupla de erg5erg6.

[0014] As dessaturases adequadas como definido no presente documento podem ser obteníveis a partir de diferentes fontes, como, por exemplo, plantas, animais, incluindo seres humanos, algas, fungos, incluindo levedura, ou bactérias, de preferência, de fungos, particularmente selecionados a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, Yarrowia, Klyveromyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Candida, Penicillium, Aspergillus, Cryptococcus, Magneporte, Metarhizium e Ustilago, com mais preferência, selecionados a partir de S. cerevisiae, Y. lipolytica, K. lactis, Schizosaccharomyces pombe, P. pastoris, C. albicans, P. roqueforti, A. nidulans, C. neoformans ou U. maydis, com máxima preferência, de Pichia pastoris.

[0015] Em uma modalidade preferencial, a enzima que tem atividade de C-5 esterol dessaturase é obtenível a partir de Pichia, particularmente Pichia pastoris, como, por exemplo, uma proteína codificada por um polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, com mais preferência, a dita proteína é um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:2.

[0016] Em uma modalidade adicional, a enzima que tem atividade de C-5 esterol dessaturase é obtenível a partir de Penicillium, particularmente Penicillium roqueforti, como, por exemplo, uma proteína codificada por um polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO:3, com mais preferência, a dita proteína é um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:4.

[0017] Em uma modalidade, a enzima que tem atividade de C-5 esterol dessaturase é obtenível a partir de Schizosaccharomyces, particularmente Schizosaccharomyces pombe, como, por exemplo, uma proteína codificada por um polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO:5, com mais preferência, a dita proteína é um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:6.

[0018] Em uma outra modalidade, a enzima que tem atividade de C-5 esterol dessaturase é obtenível a partir de Saccharomyces, particularmente, Saccharomyces cerevisiae, como, por exemplo, uma proteína codificada por um polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO:7, com mais preferência, a dita proteína é um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:8 que é derivada de UniProtKB P32352, em que a dita enzima é expressa adicionalmente e/ou como substituição do ERG3 endógeno ao usar S. cerevisiae como hospedeiro.

[0019] Com base nas sequências como revelado no presente documento e no acúmulo aprimorado de 7-DHC e/ou redução de colesta-7-enol e/ou latosterol na mistura de esteróis, isto é, que leva a pelo menos 84 %, como, por exemplo, 85, 90, 92, 95, 97 ou até mesmo 100 % de 7-DHC presente na mistura de esteróis, um indivíduo poderia facilmente deduzir que mais genes adequados que codificam os polipeptídeos têm atividade de C-5 esterol dessaturase como definido no presente documento que poderia ser usado para a dessaturação de C-5 esteróis como definido no presente documento, particularmente colesta-7-enol e colesta-7,24-dienol. Assim, a presente invenção é direcionada a um método para identificação de dessaturases inovadoras, em que um polipeptídeo com pelo menos 44 %, como, por exemplo, pelo menos 48, 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:8, é usado como uma sonda em um processo de triagem para C-5 esterol dessaturases inovadoras, com preferência, para produção de 7-DHC em colesta-7-enol e/ou latosterol, que leva a pelo menos cerca de 84 % de 7-DHC na mistura de esteróis produzida por uma cepa hospedeira adequada. Qualquer polipeptídeo que tem atividade de C-5 esterol dessaturase e revelada no presente documento pode ser usada para produção de 7-DHC, contanto que a ação da dessaturase resulte em pelo menos cerca de 84 % de 7-DHC na mistura de esteróis, com base na quantidade total de esteróis produzidos e/ou razão aumentada de 7-DHC para colesta-7-enol e/ou latosterol.

[0020] A presente invenção se refere particularmente ao uso de tais enzimas dessaturase inovadoras, particularmente enzimas heterólogas, em um processo para produção de 7-DHC, em que a produção de produtos colaterais na mistura de esteróis incluindo colesta-7-enol, zimosterol, colesta-8- enol, ou latosterol é reduzida para cerca de 16 % ou menos, como 15, 12, 10, 8, 5, 3 ou menos com base nas quantidades totais de esteróis, pela ação das ditas dessaturases, como definido no presente documento, particularmente em que a porcentagem de colesta-7-enol e/ou latosterol para a quantidade de 7-DHC é reduzida. O processo pode ser realizado com uma célula de levedura produtora de colesterol adequada que expressa as ditas dessaturases heterólogas, de preferência, em que os genes que codificam as ditas enzimas são expressas de maneira heteróloga, isto é, introduzidas nas ditas células hospedeiras. 7-DHC pode ser adicionalmente convertido em vitamina D3 pela ação de mecanismos químicos ou biotecnológicos (conhecidos) adequados. Aumentando-se o número de cópia dos homólogos de ERG3 para mais de 1 para ser expresso na célula hospedeira, a porcentagem de produtos colaterais pode ser ainda mais reduzida.

[0021] Os termos "identidade de sequência", "% de identidade" são usados de modo intercambiável no presente documento. Para o propósito desta invenção, é definido aqui que, para determinar a percentagem de identidade de sequência de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideal. De modo a otimizar o alinhamento entre as duas sequências, podem ser introduzidas lacunas em qualquer uma das duas sequências que são comparadas. Esse alinhamento pode ser realizado ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas. Alternativamente, o alinhamento pode ser realizado ao longo de um comprimento menor, por exemplo, ao longo de cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucleicos/bases ou aminoácidos. A identidade de sequência é a porcentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências ao longo da região alinhada relatada. A identidade de sequência em porcentagem entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada com o uso do algoritmo

Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Ambas dentre as sequências de aminoácidos e sequências de nucleotídeos podem ser alinhadas pelo algoritmo. O algoritmo de Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para os propósitos da presente invenção, foi usado o programa NEEDLE do pacote EMBOSS (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, Longden and Bleasby, Trends in Genetics 16, (6) páginas 276—277, http://emboss.bioinformatics.nl/). É usado EBLOSUM62 para as sequências de proteínas para a matriz de substituição. Para a sequência de nucleotídeos, é usado EDNAFULL. Os parâmetros opcionais usados têm uma penalidade de abertura de lacunas de 10 e penalidade de extensão de lacuna de 0,5. Um técnico no assunto compreenderá que todos estes parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a porcentagem total de identidade de duas sequências não é significativamente alterada quando são usados diferentes algoritmos.

[0022] Após o alinhamento pelo programa NEEDLE como descrito acima, a porcentagem de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência da invenção é calculada como a seguir: número de posições correspondentes no alinhamento que mostra um aminoácido idêntico ou um nucleotídeo idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após a subtração do número total de vãos no alinhamento. A identidade como definido no presente documento pode ser obtida a partir de NEEDLE através do uso da opção NOBRIEF e é etiquetada na saída do programa como "identidade mais longa". Se ambas as sequências de aminoácidos que são comparadas não diferirem em que qualquer um dos seus aminoácidos, as mesmas são idênticas ou têm 100 % de identidade. Em relação às enzimas originadas a partir de plantas como definido no presente documento, o elemento versado está ciente do fato de que as enzimas derivadas de planta podem conter um sinal de direcionamento de cloroplasto deve ser clivado através de enzimas específicas, como, por exemplo, enzimas de processamento de cloroplasto (CPEs).

[0023] As enzimas/homólogos de ERG3, como definido no presente documento, também abrangem as enzimas que portam a substituição (ou substituições) de aminoácido que não altera a atividade de enzima, isto é, que mostra as mesmas propriedades em relação à enzima do tipo selvagem e catalisam a dessaturação de C-5 esteróis, levando a uma porcentagem de pelo menos cerca de 84 % de 7-DHC (com redução de colesta- 7-enol e/ou latosterol para 7-DHC) na mistura de esteróis. Tais mutações são denominadas também “mutações silenciosas”, que não alteram a atividade (enzimática) das enzimas como descrito no presente documento.

[0024] Dependendo da célula hospedeira os polinucleotídeos como definido no presente documento envolvidos em dessaturação de C-5 esterol podem ser otimizados para a expressão na respectiva célula hospedeira. A pessoa versada sabe como gerar tais polinucleotídeos modificados. Entende-se que os polinucleotídeos como definido no presente documento abrange também tais moléculas de ácido nucleico otimizadas por hospedeiro desde que os mesmos expressem o polipeptídeo com as respectivas atividades como definido no presente documento. Exemplos de tais homólogos de ERG3 otimizados por hospedeiro são mostrados em, por exemplo, SEQ ID NOs:9, 10 e 11.

[0025] Assim, em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a uma célula hospedeira que compreende polinucleotídeos que codificam homólogos de ERG3 (heterólogos) como definido no presente documento que são otimizados para expressão na dita célula hospedeira, sem impacto no crescimento ou padrão de expressão da célula hospedeira ou das enzimas. Particularmente, a levedura, por exemplo, célula de levedura produtora de colesterol, é selecionada dentre Saccharomyces, como, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, em que uma, duas ou mais cópias dos polinucleotídeos que codificam as enzimas ERG3 como definido no presente documento são selecionadas dentre polinucleotídeos com pelo menos 53 %, como, por exemplo, pelo menos 58, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:9, incluindo, por exemplo, polipeptídeos de acordo com a SEQ ID NO:9, 10 ou 11.

[0026] Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção pode compreender apenas uma porção ou um fragmento da sequência de ácidos nucleicos fornecida pela presente invenção, como, por exemplo, as sequências mostradas na SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 10 ou 11, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ou um fragmento que codifica uma porção do homólogo de ERG3 como definido no presente documento. A sonda/iniciador compreende tipicamente oligonucleotídeos substancialmente purificados que compreendem tipicamente uma região de sequência de nucleotídeos que hibridiza, de preferência, sob condições altamente rigorosas a pelo menos cerca de 12 ou 15, de preferência, cerca de 18 ou 20, com mais preferência, cerca de 22 ou 25, ainda com mais preferência, cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ou 75 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 10 ou 11 ou fragmentos ou derivados dos mesmos.

[0027] Um exemplo não limitante preferencial de tais condições de hibridização em 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, seguida por uma ou mais lavagens em 1x SSC, 0,1 % de SDS a 50 °C, de preferência, a 55 °C, com mais preferência, a 60 °C em ainda com mais preferência, a 65 °C.

[0028] Condições altamente rigorosas incluem, por exemplo, 2 h a 4 dias de incubação a 42 °C com o uso de uma sonda de DNA identificada com digoxigenina (DIG) (preparada através do uso de um sistema de identificação de DIG; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemanha) em uma solução como solução de DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) com ou sem 100 µg/ml de DNA de esperma de salmão, ou uma solução que compreende 50 % de formamida, 5x de SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de trissódio), 0,02 % de dodecil sulfato de sódio, 0,1 % de N-lauroilsarcosina e 2 % de reagente de bloqueio (Roche Diagnostics GmbH), seguido de lavagem dos filtros duas vezes por 5 a 15 minutos em 2x SSC e 0,1 % de SDS à temperatura ambiente e, então, lavagem de duas vezes por 15-30 minutos em 0,5x SSC e 0,1 % de SDS ou 0,1x SSC e 0,1 % de SDS a 65-68 °C.

[0029] A presente invenção é particularmente direcionada ao uso de enzimas heterólogas que têm atividade de C-5 esterol dessaturase como definido no presente documento em um processo para produção de 7-DHC, um intermediário para vitamina D3. De preferência, as enzimas modificadas da presente invenção são introduzidas e/ou expressas em uma célula hospedeira adequada, como levedura, em particular, uma célula de levedura produtora de colesterol, como selecionado a partir de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., Pichia spp., Klyuveromyces spp., Hansenula spp. ou Yarrowia lipolytica, de preferência, S. cerevisiae. O hospedeiro modificado é usado para produção de 7-DHC, que pode ser adicionalmente convertido em vitamina D3 e/ou 25-hidroxivitamina D3.

[0030] Uma célula hospedeira adequada pode ser adicionalmente modificada para aumentar adicionalmente a produção de 7-DHC, um intermediário importante para a biossíntese de vitamina D3 e/ou reduzir o acúmulo de produtos colaterais.

[0031] Assim, em uma modalidade, a invenção é direcionada a uma cepa de levedura que tem desaturase atividade de C-5 esterol dessaturase modificada e, adicionalmente, em que ERG5 e ERG6 são inativadas. A célula de levedura pode ser adicionalmente modificada através da expressão de uma enzima heteróloga que tem atividade de C24-redutase, particularmente selecionada a partir de EC 1.3.1.72, como uma C24-redutase heteróloga que está ativa em colesta-7,24- dienol, zimosterol ou trienol (por exemplo, colesta-5,7,25- trienol), de preferência, uma esterol Δ24-redutase de planta ou vertebrado, com mais preferência, a partir de fonte de vertebrados, ainda com mais preferência, a partir de ser humano, porco, cão, camundongo, rato, cavalo, Danio rerio ou qualquer fonte conhecida, desde que possa ser expressa dentro da dita célula de levedura. Com máxima preferência, a esterol Δ24-redutase é selecionada a partir de Danio rerio, rato ou ser humano. As sequências que expressam as ditas enzimas esterol Δ24-redutase estão publicamente disponíveis, incluindo, porém sem limitação, UniProtKB/Swiss-Prot referência Q15392, Q60HC5, Q8VCH6, Q5BQE6, Q39085 ou P93472 (consulte, por exemplo, o documento WO2003064650).

[0032] Em uma outra modalidade, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção pode ser adicionalmente modificada através da introdução de homólogos de enzimas endógenas envolvidas na biossíntese de 7-DHC, como, por exemplo, C8-esterol isomerase (ERG2), resultando em especificidade e/ou produtividade aumentadas de 7-DHC com acúmulo reduzido de produtos colaterais ou intermediários de vitamina D3, incluindo porém sem limitação, zimosterol, lanosterol e/ou latosterol. De preferência, a célula hospedeira modificada como definido no presente documento compreende um ERG2 heterólogo, em que o ERG2 é, de preferência, selecionado dentre Ustilago maydis (como, por exemplo, um polipeptídeo derivado de UniProtKB P32360).

[0033] Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção pode ser adicionalmente modificada na atividade de esterol aciltransferase, particularmente atividade de isoforma de esterol aciltransferase Are1p e/ou Are2p, compreendendo uma ou mais substituições (ou substituição) de aminoácidos em (uma) posição (ou posições) que correspondem aos resíduos selecionados a partir de 592 e/ou 595 no polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:12.

[0034] Assim, a presente invenção se refere, em uma modalidade específica, a uma cepa de levedura modificada a ser usada em um processo para produção de esteróis, particularmente, 7-DHC, em que ERG5 e ERG6 são inativadas, opcionalmente que expressam uma enzima heteróloga que tem atividade de C24-redutase como definido no presente documento, e expressam um homólogo de ERG3 como descrito no presente documento. Com o uso de tal cepa de levedura, a porcentagem de 7-DHC presente na mistura de esteróis está na faixa de cerca de 84 % ou mais, de preferência, como 85, 90, 92, 95, 97 ou até mesmo 100 % com base na quantidade total de esteróis.

[0035] Em uma modalidade específica, a invenção se refere a um processo para aprimorar uma célula de levedura para produção de 7-DHC, em que uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento, isto é, que expressa um homólogo de ERG3 como definido no presente documento, por exemplo, por meio de introdução de uma, duas ou mais cópias de enzimas dessaturase como definido no presente documento, em particular, célula de levedura produtora de colesterol, de preferência, uma célula de levedura em que ERG5 e ERG6 são inativadas e em que, opcionalmente, uma enzima heteróloga que tem atividade de C-24-redutase como definido no presente documento é expressa e/ou em que ARE1 e/ou ARE2 são modificadas como definido no presente documento e/ou em que opcionalmente homólogos de ERG2 são expressos, em que a célula hospedeira é aprimorada de modo que a porcentagem de 7-DHC na quantidade total de esterol produzido pela dita célula hospedeira é aumentada para pelo menos cerca de 84 %, em particular, em que a razão entre 7-DHC e produtos colaterais incluindo colesta-8-enol é aumentada em pelo menos 2 % e em comparação com uma cepa de levedura não modificada como definido no presente documento, isto é, que expressa apenas a atividade de ERG3 (endógena) do tipo selvagem.

[0036] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a um processo para aprimorar uma célula de levedura para produção de 7-DHC, em que, em particular, uma célula de levedura produtora de colesterol, como uma célula de levedura em que ERG5 e ERG6 são inativadas e em que opcionalmente uma enzima heteróloga que tem atividade de C-24-redutase como definido no presente documento é expressa, a dita célula de levedura que expressa um homólogo de ERG3 como definido no presente documento, por exemplo, através de introdução de uma, duas ou mais cópias de enzimas desaturase como definido no presente documento, em que a célula de levedura é aprimorada de modo que a porcentagem de 7-DHC, na quantidade total de esterol produzido pela dita levedura seja aumentada de cerca de 81 % ou menos a pelo menos cerca de 84 %, como, por exemplo, 85, 90, 92, 95, 97 ou até 100 %, e a porcentagem de produtos colaterais na mistura de esteróis incluindo colesta-7-enol, latosterol e/ou colesta-8-enol e/ou zimosterol, seja reduzida para cerca de 16 % ou menos com base nas quantidades totais de esteróis, isto é, uma redução de colesta-7-enol, latosterol e/ou colesta-8-enol e/ou zimosterol na faixa de pelo menos cerca de 16 % com base nas quantidades totais de esteróis e em comparação com uma cepa de levedura não modificada que expressa a atividade de ERG3 (endógena) do tipo selvagem.

[0037] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um processo para produção de uma mistura de esteróis que compreende 7-DHC e uma mistura de colesta-7-enol (latosterol) e/ou lanosterol em uma célula de levedura produtora de colesterol, em que a porcentagem de 7-DHC é aumentada em pelo menos cerca de 2 %, como, por exemplo, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 % em comparação com a porcentagem de lano-/latosterol com base na quantidade total de esteróis, sendo que a dita célula de levedura produtora de colesterol expressa uma dessaturase (heteróloga) como definido no presente documento, isto é, um polipeptídeo com pelo menos 45 %, como, por exemplo, pelo menos 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:2, com mais preferência, expressa pelos respectivos polinucleotídeos otimizados por códon como definido no presente documento, como, de preferência, obtenível a partir de Pichia pastoris, Penicillium roqueforti, ou Schizosaccharomyces pombe, ou Saccharomyces cerevisiae, particularmente, de Pichia pastoris.

[0038] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um processo para produção de uma mistura de esteróis que compreende 7-DHC e colesta-8-enol em uma célula de levedura produtora de colesterol, em que a razão entre 7-DHC e colesta-8-enol com base na quantidade total de esteróis é aumentada em pelo menos cerca de 2 % como, por exemplo, como, por exemplo, 3, 4, 5 ou pelo menos cerca de 10 %, sendo que a dita célula de levedura produtora de colesterol expressa uma dessaturase (heteróloga) como definido no presente documento, isto é, um polipeptídeo com pelo menos cerca de 45 %, como, por exemplo, pelo menos 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:2, com mais preferência, expressa pelos respectivos polinucleotídeos otimizados por códon como definido no presente documento, como, de preferência, obtenível a partir de Pichia pastoris.

[0039] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um processo para a produção de uma mistura de esteróis que compreende 7-DHC e zimosterol em uma célula de levedura produtora de colesterol, em que a porcentagem de 7-DHC é aumentada em pelo menos cerca de 2 % como, por exemplo, 3, 4, 5 ou pelo menos cerca de 10 % em comparação com a porcentagem de zimosterol com base na quantidade total de esteróis, sendo que a dita célula de levedura produtora de colesterol expressa uma dessaturase (heteróloga) como definido no presente documento, isto é, um polipeptídeo com pelo menos 45 %, como, por exemplo, pelo menos 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:2, com mais preferência, expresso pelos respectivos polinucleotídeos otimizados por códon como definido no presente documento, como, de preferência, obtenível a partir de Pichia pastoris.

[0040] Em uma modalidade específica, a presente invenção se refere a um processo para produção de uma mistura de esteróis que compreende 7-DHC, zimosterol, colesta-8-enol, lanosterol e/ou latosterol em uma célula de levedura produtora de colesterol, em que a porcentagem de 7-DHC é aumentada em pelo menos cerca de 2 % como, por exemplo, 4, 5, 7, 10, 15 % ou mais em comparação com a porcentagem dos ditos produtos colaterais na mistura de esteróis, sendo que a dita célula de levedura produtora de colesterol expressa uma dessaturase heteróloga como definido no presente documento, isto é, um polipeptídeo com pelo menos cerca de

45 %, como, por exemplo, pelo menos 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:2, com mais preferência, expresso pelos respectivos polinucleotídeos otimizados por códon como definido no presente documento, como, de preferência, obtenível a partir de Pichia pastoris.

[0041] Conforme usado no presente documento, um aumento na porcentagem de 7-DHC em uma mistura de esteróis é definida como a quantidade de 7-DHC produzida por uma célula hospedeira que expressa um polipeptídeo heterólogo que tem atividade de dessaturase como definido no presente documento em comparação com uma célula hospedeira que expressa apenas a C-5 esterol dessaturase endógena, como, por exemplo, expressa por ERG3. Quando se usa a dita célula hospedeira, por exemplo, levedura, em particular, célula de levedura produtora de colesterol, em um processo de produção de esterol, a porcentagem de 7-DHC pode ser aumentada para pelo menos cerca de 84 % com base na quantidade total de esteróis produzida pela dita célula hospedeira. Conforme usado no presente documento, "expressão de um homólogo de ERG3" inclui a expressão de cópias extras de polipeptídeos de ERG3, isto é, expressão de duas ou mais cópias de ERG3, incluindo cópias extras de ERG3 endógeno.

[0042] Em uma modalidade específica, a invenção se refere a um processo para a produção de uma mistura de esteróis em que uma célula de leveduras como descrito anteriormente é usada e em que uma porcentagem de colesta-8-enol e/ou zimosterol e/ou lanosterol e/ou latosterol presente na dita mistura de esteróis é reduzida, isto é, está na faixa de cerca de 16 % ou menos com base na quantidade total de esteróis, isto é, que leva a uma razão de 7-DHC maior na mistura de esteróis.

[0043] Uma célula hospedeira modificada, que é capaz de expressar os homólogos de ERG3 como definido no presente documento, e genes adicionais necessários para a biossíntese de precursores e/ou intermediários de vitamina D3, é usada em um processo para produção de precursor de vitamina D3 7- DHC. A célula hospedeira modificada pode ser cultivada em um meio aquoso suplementado com nutrientes apropriados sob condições aeróbicas ou anaeróbicas e como conhecido pela pessoa versada para as respectivas células hospedeiras produtoras de colesterol. Opcionalmente, tal cultivo é na presença de proteínas e/ou cofatores envolvidos na transferência de elétrons, como conhecido na técnica. O cultivo/crescimento da célula hospedeira pode ser conduzido na batelada, batelada alimentada, modo semicontínuo ou contínuo. Dependendo da célula hospedeira, de preferência, a produção de vitamina D3 e precursores da mesma, como 7- DHC, pode variar, como é conhecido pela pessoa versada. O cultivo e o isolamento de 7-DHC e outros intermediários na produção de vitamina D3 são descritos, por exemplo, nos documentos WO2011067144 ou WO2017108799.

[0044] Com o uso de uma célula hospedeira como descrito no presente documento, a produtividade/especificidade de atividade de C-5 esterol dessaturase pode ser deslocada para 7-DHC, levando a uma razão de pelo menos cerca de 84 % de 7- DHC nos esteróis totais produzidos pela dita célula hospedeira, com títulos de até cerca de 10 g/l de 7-DHC produzidos após cerca de 110 h de fermentação sob condições de cultura adequadas.

[0045] Os termos "ERG5" e "Erg5p" ou "ERG6" e "Erg6p" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a um polipeptídeo codificado pelos respectivos genes erg3, erg5 e erg6.

[0046] Os genes que codificam ERG5, ERG6, ERG3, ARE1, ARE2 ou esterol Δ24-redutase (ERG4), cultivo e engenharia genética da célula de levedura como usado no presente documento são conhecidos e descritos, por exemplo, no documento US 7608421.

[0047] Como usado no presente documento, os termos "C-24- redutase" ou "Δ24-redutase" são usados intercambiavelmente no presente documento. Em levedura, essa enzima é codificada por erg4 e está ativa no grupo metila do átomo de carbono na posição 24. Trienol, que não exibe tal grupo metila na dita posição, não é, portanto, um substrato aceitável para a levedura ERG4.

[0048] Os termos "esterol C-8 isomerase", "enzima que tem atividade de esterol C-8 isomerase" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a enzimas que têm capacidade de catalisar a conversão de colesta-8-enol em colesta-7-enol e/ou zimosterol em colesta- 7,24-dienol. Em levedura, essa enzima é codificada por erg2. Um homólogo de ERG2 preferencial a ser usado em uma célula hospedeira modificada de acordo com a presente invenção é um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 41 %, como, por exemplo, pelo menos 44, 45, 48, 49, 53, 56, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:14 que mostra atividade de esterol C-8 isomerase e incluindo um polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO:14, que mostra esterol C-8 isomerase, incluindo polinucleotídeos que codificam tal polipeptídeo, obtenível a partir de Ustilago maydis. Particularmente, 1 ou mais cópias, como pelo menos 1, 2, 3, 5, do dito homólogo de ERG2 são expressas em uma célula hospedeira modificada como definido no presente documento.

[0049] Como usado no presente documento, o termo "atividade específica" ou "atividade" em relação às enzimas significa sua atividade catalítica, isto é, sua habilidade de catalisar a formação de um produto a partir de um determinado substrato. A atividade específica define a quantidade de substrato consumida e/ou produto produzido em um determinado período de tempo e por quantidade definida de proteína em uma temperatura definida. Tipicamente, a atividade específica é expressa em µmol de substrato consumido ou produto formado por min por mg de proteína. Tipicamente, µmol/min é abreviado por U (= unidade). Portanto, as definições de unidade para atividade específica de µmol/min/(mg de proteína) ou U/(mg de proteína) são usadas de modo intercambiável ao longo desse documento. Uma enzima está ativa, se realizar sua atividade catalítica in vivo, isto é, dentro da célula hospedeira como definido no presente documento ou dentro de um sistema adequado (livre de célula) na presença de um substrato adequado. A pessoa versada sabe como medir a atividade de enzima, como, por exemplo, por HPLC.

[0050] Em relação à presente invenção, entende-se que os organismos, como, por exemplo, microrganismos, fungos, algas ou plantas, incluem também sinônimos ou basônimos de tais espécies que têm as mesmas propriedades fisiológicas, como definido pelo Código Internacional de Nomenclatura de

Procariotas ou pelo Código Internacional de Nomenclatura para algas, fungos e plantas (Código de Melbourne).

[0051] Em particular, a presente invenção apresenta as presentes modalidades:

[0052] 1. Uma célula de levedura produtora de colesterol que compreende uma enzima que tem C5 esterol dessaturase com pelo menos cerca de 45 %, como, por exemplo, pelo menos 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:2 que é expressa (de maneira heteróloga) em uma célula hospedeira adequada para produção de 7-DHC, em que a razão entre 7-DHC e produtos colaterais que inclui lanosterol e/ou latosterol é aumentada em pelo menos cerca de 5 % em comparação com uma célula hospedeira não modificada.

[0053] 2. Uma célula de levedura produtora de colesterol, como acima, que compreende uma enzima que tem atividade de C5 esterol dessaturase, sendo que a dita célula de levedura produz uma mistura de esteróis que compreende pelo menos cerca de 84 % de 7-desidrocolesterol (7-DHC), de preferência, que compreende pelo menos cerca de 85, 88, 90, 92, 95, 97, 98 ou até 100 % de 7-DHC com base na quantidade total de esteróis.

[0054] 3. Uma célula de levedura produtora de colesterol, como acima, em que a razão entre 7-DHC e colesta-7-enol e/ou lanosterol está na faixa de cerca de 18.

[0055] 4. Uma célula de levedura produtora de colesterol, como acima, em que a razão entre 7-DHC e colesta-7-enol e/ou lanosterol é aumentada em pelo menos cerca de 5 %.

[0056] 5. Uma célula de levedura produtora de colesterol, como acima, que expressa uma enzima heteróloga que tem atividade de C5 esterol dessaturase com pelo menos cerca de 45 %, como, por exemplo, pelo menos 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:2.

[0057] 6. Uma célula de levedura produtora de colesterol, como acima, que expressa uma enzima heteróloga que tem atividade de C5 esterol dessaturase, sendo que a dita enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia, como Y. lipolytica, Klyveromyces, como K. lactis, Schizosaccharomyces, como Schizosaccharomyces pombe, Pichia, como P. pastoris, Candida, como C. albicans, Penicillium, como P. roqueforti, Aspergillus, como A. nidulans, Cryptococcus, como C. neoformans, Magneporte. Metarhizium e Ustilago, como Ustilago maydis.

[0058] 7. Uma célula de levedura produtora de colesterol, como acima, em que ERG5 e ERG6 são inativados.

[0059] 8. Uma célula de levedura produtora de colesterol, como acima, em que a célula de levedura expressa uma enzima heteróloga selecionada dentre EC 1.3.1.72 que tem atividade de esterol Δ24-redutase, de preferência, em que a enzima heteróloga é originada de planta ou vertebrado, com mais preferência, originada de ser humano, porco, cachorro, camundongo, rato, cavalo ou Danio rerio.

[0060] 9. Uma célula de levedura produtora de colesterol, como acima, em que a célula de levedura expressa uma enzima heteróloga que tem atividade de C8-isomerase, de preferência, em que a enzima heteróloga é obtenível a partir de Ustilago maydis, com mais preferência, de um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 42 %, como, por exemplo, pelo menos 43, 44, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 75,

80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:14.

[0061] 10. Uso de uma célula de levedura produtora de colesterol, como acima, para produção de esteróis, de preferência, para a produção de precursores de vitamina D3, com mais preferência, para a produção de 7-DHC.

[0062] 11. Uso de uma célula de levedura produtora de colesterol, como acima, em que o 7-DHC é adicionalmente convertido em vitamina D3.

[0063] 12. Uso, como acima, em que o 7-DHC é adicionalmente convertido em 25-hidroxivitamina D3.

[0064] 13. Um processo para reduzir a quantidade de colesta-7-enol e/ou lanosterol em uma mistura de esteróis produzida por uma célula de levedura, sendo que o dito processo compreende a expressão de uma enzima heteróloga que tem atividade de C5 esterol dessaturase, sendo que a dita enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia, como Y. lipolytica, Klyveromyces, como K. lactis, Schizosaccharomyces, como Schizosaccharomyces pombe, Pichia, como P. pastoris, Candida, como C. albicans, Penicillium, como P. roqueforti, Aspergillus, como A. nidulans, Cryptococcus, como C. neoformans, Magneporte, Metarhizium e Ustilago, como Ustilago maydis, de preferência, selecionada dentre Pichia pastoris, Penicillium roqueforti, Schizosaccharomyces pombe, ou Saccharomyces cerevisiae.

[0065] 14. Um processo para a produção de uma mistura de esteróis, de preferência, um precursor de vitamina D3, com mais preferência, uma mistura de esteróis com pelo menos cerca de 84 % de 7-DHC, em uma célula de levedura que compreende: (a) inativação de ERG5 e ERG6, (b) expressão de uma enzima heteróloga selecionada a partir de EC 1.3.1.72 que tem atividade de esterol Δ24- redutase em colesta-7,24-dienol, zimosterol ou trienol, de preferência, esterol Δ24-redutase de planta ou vertebrado, com mais preferência, esterol Δ24-redutase de vertebrado, (c) expressão de uma enzima heteróloga que tem atividade de C5 esterol dessaturase, sendo que a dita enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia, como Y. lipolytica, Klyveromyces, como K. lactis, Schizosaccharomyces, como Schizosaccharomyces pombe, Pichia, como P. pastoris, Candida, como C. albicans, Penicillium, como P. roqueforti, Aspergillus, como A. nidulans, Cryptococcus, como C. neoformans, Magneporte, Metarhizium e Ustilago, como Ustilago maydis, de preferência, selecionada dentre Pichia pastoris, Penicillium roqueforti, Schizosaccharomyces pombe, ou Saccharomyces cerevisiae, (d) cultivo da dita célula de levedura sob condições adequadas para produção de esterol; em que a razão entre 7-DHC e colesta-7-enol e/ou lanosterol presente na mistura de esteróis é mais que 17,2.

[0066] Os exemplos a seguir são ilustrativos somente e não se destinam a limitar o escopo da invenção de modo algum. Exemplos Exemplo 1: Métodos gerais, cepas e plasmídeos

[0067] Todos os procedimentos de biologia molecular básica e manipulação de DNA descritos no presente documento foram, em geral, realizados de acordo com Sambrook et al.

(1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nova York) ou Ausubel et al. (1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: Nova York). Os genótipos dos plasmídeos e cepas S. cerevisiae usados são listados nas Tabelas 1 e 2. A cepa Y2159 produtora de 7-DHC de Saccharomyces cerevisiae foi construída como descrito no Exemplo 4. Todas as cepas listadas são MATα. Tabela 1: Cepas de Saccharomyces cerevisiae. Y2159 erg5Δ::PGK1p-S24R2-CYC1t-TRP1 Vide Exemplo 4 erg6Δ::TDH3p-S24R1-PGK1t-URA3 erg4Δ::PGK1p-Scer-are1 G595D- CYC1t-LEU2 TDH3p-tHMG1 Y2346 erg5Δ::PGK1p-S24R2-CYC1t-TRP1 Construto de erg6Δ::TDH3p-S24R1-PGK1t-URA3 inserção erg4Δ::PGK1p-Scer-are1 G595D- direcionada no CYC1t-LEU2 TDH3p-tHMG1 INT66 locus INT66 TDH3p-S. cerevisiae-ERG3-PGK1t-

HYGR Y2322 erg5Δ::PGK1p-S24R2-CYC1t-TRP1 Construto de erg6Δ::TDH3p-S24R1-PGK1t-URA3 inserção erg4Δ::PGK1p-Scer-are1 G595D- direcionada no CYC1t-LEU2 TDH3p-tHMG1 INT66 locus INT66 TDH3p-P. pastoris-ERG3-PGK1t-HYGR Y2316 erg5Δ::PGK1p-S24R2-CYC1t-TRP1 Construto de erg6Δ::TDH3p-S24R1-PGK1t-URA3 inserção erg4Δ::PGK1p-Scer-are1 G595D- direcionada no CYC1t-LEU2 TDH3p-tHMG1 INT66 locus INT59 TDH3p-P. roqueforti-ERG3-PGK1t-

HYGR

Y2337 erg5Δ::PGK1p-S24R2-CYC1t-TRP1 Construto de erg6Δ::TDH3p-S24R1-PGK1t-URA3 inserção erg4Δ::PGK1p-Scer-are1 G595D- direcionada no CYC1t-LEU2 TDH3p-tHMG1 INT66 locus INT66 TDH3p-S. pombe-ERG3-PGK1t-HYGR Tabela 2: plasmídeos usados para clonagem de homólogos de ERG3. Plasmídeo Cadeia Inserto Oligos ou principal fonte pMB7722 pMB7622 S. cerevisiae- Fragmento ERG3 sintetizado pMB7700 pMB7622 P. pastoris- Fragmento ERG3 sintetizado pMB7721 pMB7622 P. roqueforti- Fragmento ERG3 sintetizado pMB7701 pMB7622 S. pombe-ERG3 Fragmento sintetizado Exemplo 2: Clonagem de vários homólogos de ERG3 em S. cerevisiae Y2159

[0068] Todos os cassetes de ERG3 foram construídos da seguinte forma. Os quadros de leitura aberta foram otimizados por códon com base na sequência de aminoácidos deduzida e sintetizados com sítios 5’-BamHI (GGATCCatg...) e sítios 3’- EcoRI). Os mesmos foram clonados inserindo-se fragmentos de ERG3 digeridos por BamHI-EcoRI em pMB7621 digeridos por BamHI-EcoRI, o que permite o alvejamento para o locus intergênico INT66 no braço direito do cromossomo XIII entre os genes RKR1 e GAD1 (cerca da posição 769.000).

[0069] Além de S. cerevisiae ERG3 (SEQ ID NO:7; plasmídeo pMB7677), os genes sintetizados compreendem homólogos de ERG3 (otimizados por códon) a partir de Pichia pastoris (SEQ ID NO:9; plasmídeo pMB7732), Penicillium roqueforti (SEQ ID NO:10; plasmídeo pMB7721), e Schizosaccharomyces pombe (SEQ ID NO:11; plasmídeo pMB7681), vide listagem de sequências.

[0070] Para testar o impacto dos genes de ERG3 diferentes na produção de 7-DHC, a cepa Y2159 foi transformada com quatro fragmentos gerados por SfiI diferentes, que representam uma das quatro espécies detalhadas acima, no locus INT66 que usa resistência à higromicina (HygR) como um marcador selecionável, e o promotor de TDH3 constitutivo forte como um elemento de controle.

[0071] Os transformantes foram selecionados em YPD ágar com 200 mg/l de higromicina após 3 dias a 30 °C. As cepas que resultam dessas transformações são listadas na Tabela 1 acima. Essas cepas foram subsequentemente testadas em relação a sua produtividade de 7-DHC e pureza de 7-DHC esterol geral como descrito abaixo. Exemplo 3: Análise de HPLC de esteróis a partir de cepas transformadas

[0072] As cepas foram cultivadas da seguinte forma. As cepas a serem testadas foram inicialmente colocadas em placa em YPD ágar e incubadas por 48 horas a 30 °C. Duas pré- culturas de YPD em milímetros foram inoculadas a partir dessas placas e crescidas em uma roda de rolo por 24 horas a 30 °C. Em uma placa de microtitulação de 24 poços, 0,8 ml de YPD + 10 g/l de etanol foram inoculados a partir da pré- cultura para um OD600 final de 0,5. As placas de microtitulação foram crescidas a 30 °C em um ambiente umidificado e com agitação a 800 rpm em um agitador com uma órbita de 3 mm. Em 24 e 48 horas pós-inoculação, 16 µl de etanol foram adicionados a cada poço como uma alimentação. Em 72 horas pós-inoculação, as células foram amostradas quanto ao teor de esterol.

[0073] Os esteróis das culturas foram extraídos e avaliados da seguinte forma. Oitenta microlitros de caldo integral foram pipetados em um tubo de Precellys de 2 ml com esferas de vidro. Oitocentos microlitros de solução de saponificação (5 % de KOH em etanol) foram adicionados e as amostras foram colocadas em um Homogeneizador Precellys 24 e agitadas a 6500 rpm por 3 ciclos em 15 segundos por ciclo. Sessenta microlitros de ácido acético glacial foram, então, adicionados e os tubos foram centrifugados por 1 minuto na velocidade de topo. O sobrenadante foi avaliado através de HPLC quanto ao teor de esterol. Os resultados são mostrados nas Tabelas 3, 4 e 5. Tabela 3: razões entre 7-DHC e zimosterol no controle e cepas portadoras de homólogos de ERG3. Cepa Razão entre 7-DHC e zimosterol SC2159 - parental 18,1 ERG3 de P. pastoris 18,8 Tabela 3: razões entre 7-DHC e colesta-8-enol no controle e cepas portadoras de homólogos de ERG3. Cepa Razão entre 7-DHC e colesta-8-enol SC2159 - parental 11,7 ERG3 de P. pastoris 12,1 Tabela 4: razões entre 7-DHC e mistura de lanosterol e latosterol no controle e cepas portadoras de homólogos de ERG3. Cepa Razão entre 7-DHC e lanosterol/latosterol SC2159 - parental 17,2 ERG3 de P. pastoris 22,9 ERG3 de P. 19,8 roqueforti ERG3 de S. pombe 18,1 Exemplo 4: Construção de Y2159

[0074] WT S. cerevisiae ARE1 foi sintetizado por DNA2.0, incorporando um sítio XbaI na extremidade 5’ (TCTAGAACAAAatg...) e um sítio PstI na extremidade 3’. Esse foi clonado em um plasmídeo de deleção de erg4∆::HygR com o uso de sítios únicos de XbaI e PstI. LEU2 foi subsequentemente usado para substituir a fração de HygR através de uma clonagem de KpnI-AgeI. O resultado foi o plasmídeo pHyD459.

[0075] A variante de pMB7584 mutante de ARE1 de S. cerevisiae (F592L) foi gerada pela ligação de um produto de PCR clivado por BsrGI-BsaI gerado a partir de ARE1 (oligos de acordo com a SEQ ID NO:16 & 17) com um oligo de fita dupla derivado pelo anelamento de SEQ ID NO:19 e 20 em pHyD459 clivado por BsrGI-PstI. De modo similar, a variante de pMB7585 mutante de ARE1 de S. cerevisiae (G595D) foi gerada pela ligação de um produto de PCR clivado por BsrGI-BsaI gerado a partir de ARE1 (oligos de acordo com a SEQ ID NO:16 & 18) com um oligo de fita dupla derivado pelo anelamento de SEQ ID NO:21 e 22 em pHyD459 clivado por BsrGI-PstI. Os oligos bem como as sequências adicionais usadas no presente documento são listados na Tabela 5. Tabela 5: plasmídeos usados para construção de mutações de ARE. "Scer" significa Saccharomyces cerevisiae.

Plasmídeo Cadeia Inserto Oligos ou fonte SEQ principal ID NO pHyD459 pHyD445 Scer-ARE1 Inserção de LEU2 pMB7584 pHyD459 Scer-are1 MO10013 & 16 & F592L MO10014, MO10016 17 & MO10017 19 & 20 pMB7585 pHyD459 Scer-are1 MO10013 & MO10015 16 & G595D 18

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula de levedura produtora de colesterol caracterizada por compreender uma enzima que tem C5 esterol dessaturase com pelo menos cerca de 45 %, como, por exemplo, pelo menos 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:2 que é expressa (de maneira heteróloga) em uma célula hospedeira adequada para produção de 7-desidrocolesterol (7-DHC), em que a razão entre 7-DHC e produtos colaterais que inclui lanosterol e/ou latosterol é aumentada em pelo menos cerca de 5 % em comparação com uma célula hospedeira não modificada.

2. Célula de levedura produtora de colesterol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma enzima que tem atividade de C5 esterol dessaturase, sendo que a dita célula de levedura produz uma mistura de esteróis que compreende pelo menos cerca de 84 % de 7-DHC, de preferência, que compreende pelo menos cerca de 85, 88, 90, 92, 95, 97, 98 ou até 100 % de 7-DHC com base na quantidade total de esteróis.

3. Célula de levedura produtora de colesterol, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a razão entre 7-DHC e colesta-7-enol e/ou lanosterol está na faixa de cerca de 18.

4. Célula de levedura produtora de colesterol, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a razão entre 7-DHC e colesta-7-enol e/ou lanosterol é aumentada em pelo menos cerca de 5 %.

5. Célula de levedura produtora de colesterol, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por expressar uma enzima heteróloga que tem atividade de C5 esterol dessaturase com pelo menos cerca de 45 %, como, por exemplo, pelo menos 50, 52, 60, 70, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:2.

6. Célula de levedura produtora de colesterol, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por expressar uma enzima heteróloga que tem atividade de C5 esterol dessaturase, sendo que a dita enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia, como Y. lipolytica, Klyveromyces, como K. lactis, Schizosaccharomyces, como Schizosaccharomyces pombe, Pichia, como P. pastoris, Candida, como C. albicans, Penicillium, como P. roqueforti, Aspergillus, como A. nidulans, Cryptococcus, como C. neoformans, como Magneporte oryzae, Metarhizium, como Metarhizium acridum, e Ustilago, como Ustilago maydis.

7. Célula de levedura produtora de colesterol, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que ERG5 e ERG6 são inativados.

8. Célula de levedura produtora de colesterol, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, sendo a célula de levedura caracterizada por expressar uma enzima heteróloga selecionada a partir de EC 1.3.1.72 que tem atividade de esterol Δ24-redutase, de preferência, em que a enzima heteróloga é originada de planta ou vertebrado, com mais preferência, originada de humano, porco, cão, camundongo, rato, cavalo ou Danio rerio.

9. Célula de levedura produtora de colesterol, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, sendo a célula de levedura caracterizada por expressar uma enzima heteróloga que tem atividade de C8-isomerase, de preferência, em que a enzima heteróloga é obtenível a partir de Ustilago maydis, com mais preferência, de um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 42 %, como, por exemplo, pelo menos 43, 44, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 75, 80, 90, 92, 95, 98 ou até 100 % de identidade com o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:14.

10. Uso de uma célula de levedura produtora de colesterol conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 caracterizado por ser para produção de esteróis, de preferência, para a produção de precursores de vitamina D3, com mais preferência, para a produção de 7-DHC.

11. Uso de uma célula de levedura produtora de colesterol, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que 7-DHC é adicionalmente convertido em vitamina D3.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que 7-DHC é adicionalmente convertido em 25-hidroxivitamina D3.

13. Processo para reduzir a quantidade de colesta-7- enol e/ou lanosterol em uma mistura de esteróis produzida por uma célula de levedura, sendo o dito processo caracterizado por compreender a expressão de uma enzima heteróloga que tem atividade de C5 esterol dessaturase, sendo que a dita enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia, como Y. lipolytica, Klyveromyces, como K. lactis, Schizosaccharomyces, como Schizosaccharomyces pombe, Pichia, como P. pastoris, Candida, como C. albicans, Penicillium, como P. roqueforti, Aspergillus, como A. nidulans,

Cryptococcus, como C. neoformans, como Magneporte oryzae, Metarhizium, como Metarhizium acridum, e Ustilago, como Ustilago maydis, de preferência, selecionada dentre Pichia pastoris, Penicillium roqueforti, Schizosaccharomyces pombe, ou Saccharomyces cerevisiae.

14. Processo para a produção de uma mistura de esteróis, de preferência, um precursor de vitamina D3, com mais preferência, uma mistura de esteróis com pelo menos cerca de 84 % de 7-DHC, em uma célula de levedura, caracterizado por compreender: (a) inativação de ERG5 e ERG6, (b) expressão de uma enzima heteróloga selecionada a partir de EC 1.3.1.72 que tem atividade de esterol Δ24- redutase em colesta-7,24-dienol, zimosterol ou trienol, de preferência, esterol Δ24-redutase de planta ou vertebrado, com mais preferência, esterol Δ24-redutase de vertebrado, (c) expressão de uma enzima heteróloga que tem atividade de C5 esterol dessaturase, sendo que a dita enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia, como Y. lipolytica, Klyveromyces, como K. lactis, Schizosaccharomyces, como Schizosaccharomyces pombe, Pichia, como P. pastoris, Candida, como C. albicans, Penicillium, como P. roqueforti, Aspergillus, como A. nidulans, Cryptococcus, como C. neoformans, como Magneporte oryzae, Metarhizium, como Metarhizium acridum, e Ustilago, como Ustilago maydis, de preferência, selecionada dentre Pichia pastoris, Penicillium roqueforti, Schizosaccharomyces pombe, ou Saccharomyces cerevisiae, (d) cultivo da dita célula de levedura sob condições adequadas para produção de esterol; em que a razão entre 7-DHC e colesta-7-enol e/ou lanosterol presente na mistura de esteróis é mais que cerca de 17,2.