JPWO2017208791A1

JPWO2017208791A1 - バイオサーファクタント産生組み換え微生物

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Publication number: JPWO2017208791A1
Application number: JP2018520765A
Authority: JP
Inventors: 友岳森田; あずさ雜賀; 英明小池; 徳馬福岡; 北本　大; 大北本; 周平山本; 岸本　高英; 高英岸本
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Priority date: 2016-06-03
Filing date: 2017-05-15
Publication date: 2019-03-28
Anticipated expiration: 2037-05-15
Also published as: JP6967229B2; WO2017208791A1; KR102300260B1; CN109196091A; KR20190015393A; CN109196091B

Abstract

ＭＥＬの生産効率を高める手段を提供すること。
リパーゼをコードする外因性核酸を有するマンノシルエリスリトールリピッド産生能を有する組み換え微生物。

Description

微生物を用いたバイオサーファクタントの製造に関する技術が開示される。

リパーゼは、植物油脂等の油脂類を構成するトリグリセリドのエステル結合を切断し、脂肪酸とグリセリンに分解する酵素である。リパーゼは多くの生物が保有し、生体内の反応のみならず、多くの工業用途に使用されている。

バイオサーファクタントは微生物が生産する天然の界面活性剤であり、生分解性が高く、環境低負荷であり、種々の有益な生理機能を有する。よって、バイオサーファクタントを食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等で使用すれば、環境調和型の社会を実現する上で有意義である。

バイオサーファクタントは、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系および高分子系の５つに分類される。これらの中でも、糖脂質系の界面活性剤が最もよく研究されている。このような糖脂質系のバイオサーファクタントとしては、マンノースにエリスリトールがグリコシド結合したマンノシルエリスリトール（以下、ＭＥとも称す。）に、更に脂肪酸がエステル結合したマンノシルエリスリトールリピッド（以下、ＭＥＬとも称す。）、並びに、ラムノリピッド、ユスチラジン酸、トレハロースリピッド、及びソホロースリピッド等が知られている。

ＭＥＬについては、植物油脂等の油脂類を原料に製造された例が多く報告されている。例えば、非特許文献１及び２には、カンジダ・エスピー（Candida sp.） B-7株を用いて５質量％の大豆油から５日間で３５ｇ／Ｌ（生産速度：０．３ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：７０質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている。非特許文献３及び４には、カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）T-34株を用いて８質量％の大豆油から８日間で３８ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４８質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている。

非特許文献５には、カンジダ・アンタークティカT-34株を用いて６日間隔で計３回の逐次流加により２４日後に２５質量％のピーナッツ油から１１０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：４４質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている。非特許文献６には、カンジダ・エスピー（Candida sp.）SY-16株を用いて１０質量％の植物油脂から回分培養法により２００時間で５０ｇ／Ｌ（生産速度：０．２５ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬの生産が可能であると共に、流加培養法により２０質量％の植物油から２００時間で１２０ｇ／Ｌ（生産速度：０．６ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：５０質量％）のＭＥＬの生産が可能であることが報告されている。

ＭＥＬには結合する脂肪酸残基並びにアセチル基の位置及び数等が相違する種々の構造が存在する。図１に、水素原子、アセチル基、及び炭素数３〜１８の脂肪酸残基をＲ_１〜Ｒ_５で示したＭＥＬの構造式を示す。Ｒ_１およびＲ_２が脂肪酸残基であり、かつＲ_３およびＲ_４がアセチル基である構造物はＭＥＬ−Ａ、Ｒ_３が水素原子でありＲ_４がアセチル基である構造物はＭＥＬ−Ｂ、Ｒ_３がアセチル基でＲ_４が水素原子である構造物はＭＥＬ−Ｃ、Ｒ_３およびＲ_４が水素原子である構造物はＭＥＬ−Ｄと定義される。マンノースと結合するエリスリトールのヒドロキシメチル基が１位の炭素に由来するか、４位の炭素に由来するかによって、得られるＭＥの構造は図２（ａ）、（ｂ）に示すように相違する。前記カンジダ・アンタークティカ T-34株は図２（ａ）に示される４−Ｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌを糖骨格とする化合物を生成する。得られる４−Ｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌＬｉｐｉｄを４−Ｏ−β−ＭＥＬとも称する。

多くの種類の微生物が上記の４−Ｏ−β−ＭＥＬを生成するのに対して、シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）はオリーブ油を原料に、図２（ｂ）に示される１−Ｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌを糖骨格とする１−Ｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌＬｉｐｉｄ−Ｂ（以下、１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂとも称す。）を生成する。１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂは、４−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂと比べて水和性が向上し、ベシクル形成能も高いという特徴を持ち、スキンケア剤などとして有望なバイオ素材である。シュードザイマ・ツクバエンシス１Ｅ５株は２０質量％のオリーブ油から７日間で７０ｇ／Ｌ（生産速度：０．４ｇ／Ｌ／ｈ、原料収率：３５質量％）の１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂの生産が可能であることが報告されており（非特許文献７参照）、化粧品素材として販売されている。

Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ，Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｓｕｇｉｓａｗａ，Ｙ．ＴａｋａｍｏｒｉａｎｄＴ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６１，１９（１９８３）Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ，Ｍ．ＯｏｇａｋｉａｎｄＴ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６１，１４３（１９８３）．Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｓ．Ａｋｉｂａ，Ｃ．ＨｉｏｋｉａｎｄＴ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，３１（１９９０）．Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｈａｎｅｉｓｈｉ，Ｔ．ＮａｋａｈａｒａａｎｄＴ．Ｔａｂｕｃｈｉ：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，３７（１９９０）．Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｆｉｊｉｓｈｉｒｏ，Ｈ．Ｙａｎａｇｉｓｈｉｔａ，Ｔ．ＮａｋａｎｅａｎｄＴ．Ｎａｋａｈａｒａ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１４，３０５（１９９２）．金，伊炳大，桂樹徹，谷吉樹：平成１０年日本生物工学会大会要旨，ｐ１９５．Ｔ．Ｍｏｒｉｔａ，Ｍ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｆｕｋｕｏｋａ，Ｍ．Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｔ．Ｉｍｕｒａ，Ｄ．Ｋｉｔａｍｏｔｏ：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８８，６７９（２０１０）

ＭＥＬを食品工業、医薬品工業、及び化学工業などで広く普及させるためには、ＭＥＬの生産効率を高め、生産コストの低減を図ることが望ましい。そこで、そのようなＭＥＬの生産効率を高める手段を提供することを１つの課題とする。

斯かる課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、バイオサーファクタントを生産する能力を有する微生物に外因性のリパーゼを発現させることにより、当該微生物によるバイオサーファクタントの生産効率が飛躍的に高まることが見出された。また、バイオサーファクタントを生産する能力を有する微生物を脂肪酸及びグリセリンを含む培地で培養することにより、当該微生物によるバイオサーファクタントの産生効率が飛躍的に高まることが見出された。これらの知見に基づき、更なる研究と検討を重ねた結果、下記に代表される発明が提供される。
項１．
リパーゼをコードする外因性核酸を有するマンノシルエリスリトールリピッド産生能を有する組み換え微生物。
項２．
上記微生物がシュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物である、項１に記載の組み換え微生物。
項３．
上記微生物がシュードザイマ・ツクバエンシスに属する微生物である、項１又は２に記載の組み換え微生物。
項４．
リパーゼが配列番号１〜９、２４、及び２５から成る群より選択されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、項１〜３のいずれかに記載の組み換え微生物。
項５．
項１〜３に記載の組み換え微生物を用いて、マンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法。
項６．
上記微生物を植物油脂を含む培地で培養することを含む、項４に記載のマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法。
項７．
脂肪酸及びグリセリンを添加した培地でマンノシルエリスリトールリピッド産生能を有する微生物を培養することを含む、マンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法。

効率的にバイオサーファクタントを製造することが可能である。

ＭＥＬの構造を示す。４−Ｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ（ａ）及び１−Ｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ（ｂ）の構造を示す。精製リパーゼを培地に添加することによるＭＥＬ生産効率への影響を評価した結果を示す。発現ベクターｐＵＣ＿ｎｅｏ：：ＬＩＰＡ及びｐＵＣ＿ｎｅｏ：：ＬＩＰＢの構造を示す。形質転換株のリパーゼ活性を測定した結果を示す。外因性リパーゼ導入株及びコントロールによるＭＥＬの生産を薄層クロマトグラフィーで測定した結果を示す。外因性リパーゼ導入株及びコントロールによるＭＥＬの生産をＨＰＬＣで測定した結果を示す。外因性リパーゼ導入株及びコントロールの増殖速度を測定した結果を示す。培地にオリーブオイル又はオレイン酸とグリセリンとを添加することによるＭＥＬの生産に対する影響を示す。培地にオリーブオイル又はオレイン酸とグリセリンとを添加することによる菌体増殖への影響を示す。

微生物の組換えに使用するリパーゼは、微生物において発現され、リパーゼ活性を発揮する（即ち、機能する）限り特に制限されず、任意に選択することができる。よって、リパーゼの由来は、微生物、植物及び動物のいずれでもよい。一実施形態において好ましいリパーゼは微生物由来である。一実施形態において、リパーゼの由来として好ましい微生物は、シュードザイマ属、ウスチラゴ属、Sporisorium属、Melanopsichium属、及びクルツマノマイセス属である。好ましいシュードザイマ属微生物は、Pseudozyma antarctica、Pseudozyma aphidis、Pseudozyma hubeiensis、及びPseudozyma tsukubaensisである。好ましいウスチラゴ属微生物は、Ustilago hordei及びUstilago maydisである。好ましいSporisorium属微生物は、Sporisorium reilianum及びSporisorium scitamineumである。好ましいMelanopsichium属微生物は、Melanopsichium pennsylvanicumである。好ましいクルツマノマイセス属微生物は、Kurtzmanomyces sp. I-11である。

好ましい一実施形態において、リパーゼは、配列番号１〜９、２４及び２５のいずれかのアミノ酸配列又はそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。同一性は、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である。このようなリパーゼは、任意の手法で得ることができる。例えば、遺伝子工学的な手法及び化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することが可能である。また、リパーゼをコードする核酸についても任意の手法（例えば、遺伝子工学的手法及び化学方性法）を用いて得ることができる。

配列番号１は、P.antarctica T-34由来のLIP-Aのアミノ酸配列である。配列番号２は、Pseudozyma aphidis DSM70725由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号３は、Pseudozyma hubeiensis SY62由来のリパーゼのアミノ酸配列である。配列番号４は、Ustilago hordei由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号５は、Ustilago maydis 521由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号６は、Sporisorium reilianum SRZ2由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号７は、Sporisorium scitamineum由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号８は、Melanopsichium pennsylvanicum 4由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号９は、Kurtzmanomyces sp. I-11由来のリパーゼが有するアミノ酸配列である。配列番号２４は、Pseudozyma tsukubaensisNBRC1940株由来のリパーゼ（LIPA）が有するアミノ酸配列である。配列番号２５は、Pseudozyma tsukubaensis1E5株由来のリパーゼ（LIPA）が有するアミノ酸配列である。一実施形態において好ましいリパーゼは、P.antarctica T-34由来のLIP-Aである。尚、P.antarctica T-34は、「Moesziomyces antarcticus T-34」とも称される。P. aphidisは、「Moesziomyces aphidis」とも称される。

アミノ酸の同一性は、市販の又はインターネットを通じて利用可能な解析ツール（例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェア）を用いて計算することができる。例えば、BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、及びLambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）にして、他の各種パラメータもデフォルト値に設定して検索を行うことにより、アミノ酸配列の同一性の値（％）を算出することができる。

他の実施形態において、リパーゼは、配列番号１〜９、２４及び２５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位（以下、これらを纏めて「変異」とする場合がある。）したアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。ここで「数個」とは、リパーゼ活性が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、例えば、２〜１００個、好ましくは２〜８０個、より好ましくは２〜６０個、更に好ましくは２〜４０個であり、より更に好ましくは２〜２０個、一層好ましくは２〜１５個、より一層好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。

アミノ酸の置換の種類は、特に制限されないが、リパーゼに顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。

一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ１３，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）など公知の手法を利用して導入することができる。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントを得ることができる。バリアントには、リパーゼを有する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。一実施形態において、変異は、ＦＧＤＨの活性部位又は基質結合部位に影響を与えない部位に存在することが好ましい。

配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１０に示す。配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１１に示す。配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１２に示す。配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１３に示す。配列番号５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１４に示す。配列番号６のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１５に示す。配列番号７のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１６に示す。配列番号８のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１７に示す。配列番号９のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１８に示す。配列番号２４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２６に示す。配列番号２５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２７に示す。

組換え微生物は、例えば、宿主微生物に上記リパーゼをコードする外因性核酸を導入することによって得ることができる。ここで、宿主微生物は、マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物であれば特に制限されず、任意に選択して使用することができる。マンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物として、例えば、シュードザイマ属に属する微生物が挙げられる。一実施形態において、好ましいマンノシルエリスリトールリピッドを生産する能力を有する微生物は、シュードザイマ・ツクバエンシス、シュードザイマ・アンタークティカ、シュードザイマ・ルギュローサ、シュードザイマ・アフィディス、シュードザイマ・パラアンタークティカ、シュードザイマ・ヒュベイエンシスに属する微生物である。ツクバエンシス種に含まれる好ましいＭＥＬ生産株としては、ＮＢＲＣ１９４０株、ＫＭ−１６０株、１Ｄ９株、１Ｄ１０株、１Ｄ１１株、１Ｅ５株、及びＪＣＭ１６９８７株が挙げられる。シュードザイマ・ツクバエンシスの生産する１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂは水和性が４−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂよりも高く、水系用途において有用である。

宿主細胞へのリパーゼをコードする核酸の導入手段は任意であり、特に制限されない。例えば、核酸を宿主に適したベクターに組み込み、それを任意の方法で宿主細胞に導入することができる。ベクターとは、それに組み込まれた核酸分子を細胞内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）である。ベクターの種類は、宿主細胞内で複製及び発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。ベクターの種類は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択できる。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。一実施形態において好ましいベクターは、プラスミドベクターである。

シュードザイマ属を宿主とする場合のベクターとしては、例えば、ｐＵＸＶ１ＡＴＣＣ７７４６３、ｐＵＸＶ２ＡＴＣＣ７７４６４、ｐＵＸＶ５ＡＴＣＣ７７４６８、ｐＵＸＶ６ＡＴＣＣ７７４６９、ｐＵＸＶ７ＡＴＣＣ７７４７０、ｐＵＸＶ８ＡＴＣＣ７７４７１、ｐＵＸＶ３ＡＴＣＣ７７４６５、ｐＵ２Ｘ１ＡＴＣＣ７７４６６、ｐＵ２Ｘ２ＡＴＣＣ７７４６７、pUXV1-neo、pPAX1-neo、pPAA1-neo（Appl Microbiol Biotechnol (2016) 100:3207-3217）及びpUC_neo等を例示することができる。一実施形態において、好ましいベクターは、pUC_neoである。

発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列及び発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，１．８４，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。

宿主細胞へのベクターの導入は任意であり、宿主細胞及びベクターの種類等に応じて適宜選択できる。ベクターの導入は、例えば、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム共沈降法、リポフェクション、マイクロインジェクション、及び酢酸リチウム法等によって実施することができる。

核酸の導入によって組み換え微生物が得られたか否かは、任意の方法で確認することができる。例えば、外因性核酸の導入によって付与したリパーゼ活性の有無を確認することによって所望の組み換え微生物が得られたことを確認できる。リパーゼ活性の確認は任意の方法で実施できる。例えば、上述する実施例で採用した方法（即ち、ラウリン酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解によって生じる、波長４１０ｎｍの吸光度の変化によって測定する方法）によって実施できる。

組み換え微生物は、リパーゼ活性とマンノシルエリスリトールリピッド産生能力を備えることにより、より効率的にマンノシルエリスリトールリピッドを産生することができる。組み換え微生物が産生するマンノシルエリスリトールリピッドの種類は特に制限されず目的に応じて適宜選択できる。一実施形態において、好ましいＭＥＬは、１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂ及び４−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂであり、より好ましくは１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂである。

組み換え微生物を用いたＭＥＬの生産は任意の方法で行うことができる。例えば、ＭＥＬの生産に適した培地で組み換え微生物を培養することによって実施できる。一実施形態において、組み換え微生物を用いたＭＥＬを生産する場合、培地に植物油脂を添加することが好ましい。植物油脂の種類は特に制限されず、目的とするＭＥＬの種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、大豆油、オリーブ油、ナタネ油、紅花油、ゴマ油、パームオイル、ひまわり油、ココナッツ油、カカオバター、及びひまし油等を挙げることができる。一実施形態において好ましい油脂はオリーブ油である。

組み換え微生物の培養条件は特に制限されない。例えば、組み換え微生物が、シュードザイマ属の場合には、ｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ６、温度２０〜３５℃、好ましくは２２〜２８℃の条件で３〜７日間培養することができる。ＭＥＬは、常法にしたがって培養液中から回収することができる。

他の実施形態において、脂肪酸及びグリセリンを添加した培地でマンノシルエリスリトールリピッド産生能を有する微生物を培養することを含む、マンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法が提供される。本実施形態において使用するＭＥＬ産生微生物は、リパーゼ活性を有していても有していなくてもよく、一実施形態においてリパーゼ活性を有していない微生物が好ましい。

脂肪酸は、特に制限されず、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、及びネルボン酸等を挙げることができる。一実施形態において、好ましい脂肪酸は、オレイン酸である。

脂肪酸及びグリセリンの量は、特に制限されないが、例えば、各々培地中の濃度が０．１〜２０容量％となるように添加することができる。

微生物の培養条件は、特に制限されず、上述する組み換え微生物を用いる場合と同様の条件を採用できる。

以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。

１．材料
・使用菌体
シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）1E5株・ゲノムＤＮＡ
シュードザイマ・アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）T-34株・プラスミド
発現ベクターｐＵＣ＿ｎｅｏ
・培地
グリセロール添加ＹＭ培地：脱イオン水１Ｌに、酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、グルコース１０ｇ、グリセロール５０ｇを溶かして調整した。
ＭＥＬ生産培地：脱イオン水１Ｌに、酵母エキス５ｇ、硝酸ナトリウム３ｇ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物０．３ｇ、グリセロール２０ｇを溶かして調整した。培養時には、必要に応じてＧ４１８（抗生物質）を添加した。
・精製リパーゼ：ブタ膵臓由来リパーゼ（東京化成社製）、固定化リパーゼＡ（シグマアルドリッチ社製）、固定化リパーゼＢ（シグマアルドリッチ社製）

２．精製リパーゼ添加培地でのＭＥＬ生産能の評価
シュードザイマ・ツクバエンシス1E5株をグリセロール添加ＹＭ培地２ｍＬで２５℃、３日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液０．１ｍＬをＭＥＬ生産培地に１０％オリーブ油及びブタ膵臓由来リパーゼ、固定化リパーゼＡ、又は固定化リパーゼＢを１ｍｇ添加した培地２ｍＬに接種し、２５℃で４日間振とう培養した。得られた菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加し、十分撹拌した後、酢酸エチル層を分取した。酢酸エチル層に含まれるＭＥＬは薄層クロマトグラフィーにて確認した。結果を図３に示す。図３の結果から、いずれのリパーゼの添加も１Ｅ５株によるＭＥＬ−Ｂの生産性に影響を与えないことが示された。

３．リパーゼ発現組み換え株を用いたＭＥＬ−Ｂの生産
３−１．ゲノムＤＮＡの抽出
上記シュードザイマ・アンタークティカT-34株の菌体培養液に含まれる菌体を液体窒素で凍結し、フェノールおよびクロロホルムで処理しゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡの純度と量は分光光度計で確認した。

３−２．発現ベクター構築
配列番号１０および１９に示す遺伝子を発現する発現ベクターを次の手順で構築した。配列番号１０は、シュードザイマ・アンタークティカT-34株のリパーゼＡをコードする塩基配列であり、配列番号１９は、シュードザイマ・アンタークティカT-34株のリパーゼＢをコードする塩基配列である。まず、配列番号１０を参照して、開始コドンの上流にKpnIサイトを導入したフォワードプライマー（配列番号２０）、および終止コドンの下流にEcoRIサイトを導入したリバースプライマー（配列番号２１）を調製した。これらを用いて、上記３−１．で得られたシュードザイマ・アンタークティカT-34株のゲノムＤＮＡをテンプレートに遺伝子の増幅を行った。同様に、配列番号１９を参照して、開始コドンの上流にKpnIサイトを導入したフォワードプライマー（配列番号２２）、および終止コドンの下流にEcoRIサイトを導入したリバースプライマー（配列番号２３）を調製した。これらを用いて、上記３−１．で得られたシュードザイマ・アンタークティカT-34株のゲノムＤＮＡをテンプレートに遺伝子の増幅を行った。増幅した遺伝子を、糸状菌（Ustilago maydis）由来の複製開始点（UARS）、Ｇ４１８耐性遺伝子、シュードザイマ・アンタークティカT-34株由来のｇａｐプロモーターを含む発現ベクターｐＵＣ＿ｎｅｏに連結し、ｇａｐプロモーターの制御下でこれらの遺伝子が発現される遺伝子発現ベクターｐＵＣ＿ｎｅｏ：：ＬＩＰＡおよびｐＵＣ＿ｎｅｏ：：ＬＩＰＢを構築した。発現ベクターの構造を図４に示す。
Fwd: TTTGGTACCATGCGAGTGTCCTTG（配列番号２０）
Rvs: GCAGAATTCCTAAGGCGGTGTG（配列番号２１）
Fwd: CGAGGTACCATGAAGCTACTCTC（配列番号２２）
Rvs: TGAGAATTCTCAGGGGGTGACG（配列番号２３）

３−３．形質転換体の調製
上記３−２．で得られた発現ベクターｐＵＣ＿ｎｅｏ：：ＬＩＰＡおよびｐＵＣ＿ｎｅｏ：：ＬＩＰＢを制限酵素処理で直線化したものを用いて、エレクトロポレーション法にてシュードザイマ・ツクバエンシス1E5株を形質転換した。また、コントロールとしてインサートを含まないベクターｐＵＣ＿ｎｅｏも同様に、制限酵素処理で直線化した後、エレクトロポレーション法にてシュードザイマ・ツクバエンシス1E5株に導入した。形質転換体の選別には、Ｇ４１８を使用した。

３−４．酵素活性測定
各形質転換体をグリセロール添加ＹＭ培地２ｍＬで２５℃、３日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液１ｍＬをＭＥＬ培地に１２％オリーブ油を添加した培地２０ｍＬに接種し、２５℃で３日間振とう培養した。得られた菌体培養液を遠心し、培養上清を得た。

各形質転換体の培養上清中のリパーゼ活性は、ラウリン酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解によって生じる、波長４１０ｎｍの吸光度の変化によって測定した。１分間に１μｍｏｌの基質を消費するのに必要な酵素量を１Ｕｎｉｔとした。結果を図５に示す。図中、ＮｅｏはｐＵＣ＿ｎｅｏ導入株（コントロール）、ＬＩＰＡはｐＵＣ＿ｎｅｏ：：ＬＩＰＡ導入株、ＬＩＰＢはｐＵＣ＿ｎｅｏ：：ＬＩＰＢ導入株をそれぞれ示す。この結果からＬＩＰＡ導入株及びＬＩＰＢ導入株においてリパーゼ活性が確認された。

３−５．形質転換体のＭＥＬ生産能の評価
各形質転換体をグリセロール添加ＹＭ培地２ｍＬで２５℃、３日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液１ｍＬをＭＥＬ培地に１２％オリーブ油を添加した培地２０ｍＬに接種し、２５℃で１５日間振とう培養した。得られた菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加し、十分撹拌した後、酢酸エチル層を分取した。酢酸エチル層に含まれるＭＥＬは薄層クロマトグラフィーにて確認した（図６）。また、高速液体クロマトグラフィーを用いてＭＥＬの生産量を定量した（図７）。更に、酢酸エチル層を分取した後に残った水層にメタノールを加え、遠心分離することにより菌体を得た。得られた菌体を乾燥させ、秤量し、菌体増殖量を評価した（図８）。

図６及び７に示される通り、いずれの菌株でもＭＥＬ−Ｂの生産が確認され、コントロールと比較してリパーゼＡ導入株では初期のＭＥＬ−Ｂ生産速度が有意に速い（約１．５倍）ことが確認された。図８の結果からリパーゼＡ導入株では、菌体増殖速度もコントロールと比較して早いことが確認された。

４．脂肪酸とグリセリンの添加によるＭＥＬ−Ｂ生産への影響
シュードザイマ・ツクバエンシス1E5株をグリセロール添加ＹＭ培地２ｍＬで２５℃、３日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液１ｍＬを、ＭＥＬ培地にオリーブ油を１２容量％添加した培地２０ｍＬ、又はオリーブオイル１２容量％をオレイン酸１０．８容量％及びグリセリン１．２容量％に替えた培地２０ｍｌに接種し、２５℃で４日間振とう培養した。得られた菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加し、十分撹拌した後、酢酸エチル層を分取した。酢酸エチル層に含まれるＭＥＬの量を高速液体クロマトグラフィーで測定した（図９）。また、酢酸エチル層を分取した後に残った水層にメタノールを加え、遠心分離することにより菌体を得た。得られた菌体は乾燥させた後秤量し、菌体増殖量を評価した（図１０）。図９の結果から、オリーブオイルに替えてオレイン酸及びグリセリンを培地に添加することにより、ＭＥＬ−Ｂの生産量が約１．５倍向上することが確認された。一方、図１０の結果からオリーブオイルをオレイン酸及びグリセリンに替えても菌体の増殖能力に影響しないことが判明した。

Claims

リパーゼをコードする外因性核酸を有するマンノシルエリスリトールリピッド産生能を有する組み換え微生物。
上記微生物がシュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物である、請求項１に記載の組み換え微生物。
上記微生物がシュードザイマ・ツクバエンシスに属する微生物である、請求項１又は２に記載の組み換え微生物。
リパーゼが配列番号１〜９、２４、及び２５から成る群より選択されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組み換え微生物。
請求項１〜３に記載の組み換え微生物を用いて、マンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法。
上記微生物を植物油脂を含む培地で培養することを含む、請求項４に記載のマンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法。
脂肪酸及びグリセリンを添加した培地でマンノシルエリスリトールリピッド産生能を有する微生物を培養することを含む、マンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法。