KR102300260B1 - 생물 계면활성제 산생 재조합 미생물 - Google Patents
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Abstract
MEL의 생산 효율을 높이는 수단을 제공하는 것. 리파아제를 코딩하는 외인성 핵산을 갖는 만노실에리스리톨 리피드 산생능을 갖는 재조합 미생물.
Description
미생물을 사용한 생물 계면활성제의 제조에 관한 기술이 개시된다.
리파아제는, 식물 유지 등의 유지류를 구성하는 트리글리세라이드의 에스테르 결합을 절단하여, 지방산과 글리세린으로 분해하는 효소이다. 리파아제는 많은 생물이 보유하고, 생체 내의 반응뿐만 아니라 많은 공업 용도로 사용되고 있다.
생물 계면활성제는 미생물이 생산하는 천연 계면활성제이며, 생분해성이 높고, 환경 저부하이며, 각종 유익한 생리 기능을 갖는다. 따라서, 생물 계면활성제를 식품 공업, 화장품 공업, 의약품 공업, 화학 공업, 환경 분야 등에서 사용하면, 환경 조화형 사회를 실현하는데 있어서 의미가 있다.
생물 계면활성제는 당지질계, 아실펩티드계, 인지질계, 지방산계 및 고분자계의 5가지로 분류된다. 이들 중에서도, 당지질계 계면활성제가 가장 많이 연구되어 있다. 이러한 당지질계 생물 계면활성제로서는, 만노오스에 에리스리톨이 글리코시드 결합한 만노실에리스리톨(이하, ME라고도 함)에, 추가로 지방산이 에스테르 결합한 만노실에리스리톨 리피드(이하, MEL이라고도 함), 그리고 람노리피드, 우스틸라진산, 트레할로스 리피드 및 소포로오스 리피드 등이 알려져 있다.
MEL에 대해서는, 식물 유지 등의 유지류를 원료로 제조된 예가 많이 보고되어 있다. 예를 들어, 비특허문헌 1 및 2에는, 칸디다·에스피(Candida sp.) B-7주를 사용하여 5질량%의 대두유로부터 5일간에 35g/L(생산 속도: 0.3g/L/h, 원료 수율: 70질량%)의 MEL의 생산이 가능한 것이 보고되어 있다. 비특허문헌 3 및 4에는, 칸디다·안타크티카(Candida antarctica) T-34주를 사용하여 8질량%의 대두유로부터 8일간에 38g/L(생산 속도: 0.2g/L/h, 원료 수율: 48질량%)의 MEL의 생산이 가능한 것이 보고되어 있다.
비특허문헌 5에는, 칸디다·안타크티카 T-34주를 사용하여 6일 간격으로 합계 3회의 순차 유가(流加)에 의해 24일 후에 25질량%의 피너츠유로부터 110g/L(생산 속도: 0.2g/L/h, 원료 수율: 44질량%)의 MEL의 생산이 가능한 것이 보고되어 있다. 비특허문헌 6에는, 칸디다·에스피 SY-16주를 사용하여 10질량%의 식물 유지로부터 회분 배양법에 의해 200시간에 50g/L(생산 속도: 0.25g/L/h, 원료 수율: 50질량%)의 MEL의 생산이 가능함과 함께, 유가 배양법에 의해 20질량%의 식물유로부터 200시간에 120g/L(생산 속도: 0.6g/L/h, 원료 수율: 50질량%)의 MEL의 생산이 가능한 것이 보고되어 있다.
MEL에는 결합하는 지방산 잔기 및 아세틸기의 위치 및 수 등이 상이한 각종 구조가 존재한다. 도 1에, 수소 원자, 아세틸기 및 탄소수 3 내지 18의 지방산 잔기를 R1 내지 R5로 나타낸 MEL의 구조식을 나타낸다. R1 및 R2가 지방산 잔기이며, 또한 R3 및 R4가 아세틸기인 구조물은 MEL-A, R3이 수소 원자이며 R4가 아세틸기인 구조물은 MEL-B, R3이 아세틸기이며 R4가 수소 원자인 구조물은 MEL-C, R3 및 R4가 수소 원자인 구조물은 MEL-D로 정의된다. 만노오스와 결합하는 에리스리톨의 히드록시메틸기가 1위치의 탄소에서 유래하거나, 4위치의 탄소에서 유래하거나 함으로써, 얻어지는 ME의 구조는 도 2의 (a), (b)에 나타내는 바와 같이 상이하다. 상기 칸디다·안타크티카 T-34주는 도 2의 (a)에 나타내는 4-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨을 당 골격으로 하는 화합물을 생성한다. 얻어지는 4-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨 리피드를 4-O-β-MEL이라고도 칭한다.
많은 종류의 미생물이 상기 4-O-β-MEL을 생성하는 것에 비하여, 슈도자이마·츠쿠바엔시스(Pseudozyma tsukubaensis)는 올리브유를 원료로, 도 2의 (b)에 나타내는 1-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨을 당 골격으로 하는 1-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨 리피드-B(이하, 1-O-β-MEL-B라고도 함)를 생성한다. 1-O-β-MEL-B는, 4-O-β-MEL-B와 비교하여 수화성이 향상되고, 베시클 형성능도 높다는 특징을 가지며, 스킨 케어제 등으로서 유망한 바이오 소재이다. 슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주는 20질량%의 올리브유로부터 7일간에 70g/L(생산 속도: 0.4g/L/h, 원료 수율: 35질량%)의 1-O-β-MEL-B의 생산이 가능한 것이 보고되고 있으며(비특허문헌 7 참조), 화장품 소재로서 판매되고 있다.
T. Nakahara, H. Kawasaki, T. Sugisawa, Y. Takamori and T. Tabuchi: J. Ferment. Technol., 61, 19(1983)
H. Kawasaki, T. Nakahara, M. Oogaki and T. Tabuchi: J. Ferment. Technol., 61, 143(1983).
D. Kitamoto, S. Akiba, C. Hioki and T. Tabuchi: Agric. Biol. Chem., 54, 31(1990).
D. Kitamoto, K. Haneishi, T. Nakahara and T. Tabuchi: Agric. Biol. Chem., 54, 37(1990).
D. Kitamoto, K. Fijishiro, H. Yanagishita, T. Nakane and T. Nakahara: Biotechnol. Lett., 14, 305(1992).
김, 윤병대, 가쯔라기 도오루, 다니 요시끼: 1998년 일본 생물공학회 대회 요지, p195.
T. Morita, M. Takashima, T. Fukuoka, M. Konishi, T. Imura, D. Kitamoto: Appl. Microbiol. Biotechnol., 88, 679(2010)
MEL을 식품 공업, 의약품 공업 및 화학 공업 등에서 널리 보급시키기 위해서는, MEL의 생산 효율을 높이고, 생산 비용의 저감을 도모하는 것이 바람직하다. 그래서, 그러한 MEL의 생산 효율을 높이는 수단을 제공하는 것을 하나의 과제로 한다.
이러한 과제를 해결하도록 예의 연구를 거듭한 결과, 생물 계면활성제를 생산하는 능력을 갖는 미생물에 외인성 리파아제를 발현시킴으로써, 당해 미생물에 의한 생물 계면활성제의 생산 효율이 비약적으로 높아지는 것이 발견되었다. 또한, 생물 계면활성제를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 지방산 및 글리세린을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 당해 미생물에 의한 생물 계면활성제의 산생 효율이 비약적으로 높아지는 것이 발견되었다. 이들의 지견에 기초하여, 더 한층의 연구와 검토를 거듭한 결과, 하기에 대표되는 발명이 제공된다.
항 1.
리파아제를 코딩하는 외인성 핵산을 갖는 만노실에리스리톨 리피드 산생능을 갖는 재조합 미생물.
항 2.
상기 미생물이 슈도자이마(Pseudozyma)속에 속하는 미생물인, 항 1에 기재된 재조합 미생물.
항 3.
상기 미생물이 슈도자이마·츠쿠바엔시스에 속하는 미생물인, 항 1 또는 2에 기재된 재조합 미생물.
항 4.
리파아제가 서열 번호 1 내지 9, 24 및 25로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는, 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 재조합 미생물.
항 5.
항 1 내지 3에 기재된 재조합 미생물을 사용하여, 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법.
항 6.
상기 미생물을 식물 유지를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 항 4에 기재된 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법.
항 7.
지방산 및 글리세린을 첨가한 배지에서 만노실에리스리톨 리피드 산생능을 갖는 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법.
효율적으로 생물 계면활성제를 제조하는 것이 가능하다.
도 1은 MEL의 구조를 나타낸다.
도 2는 4-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨(a) 및 1-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨(b)의 구조를 나타낸다.
도 3은 정제 리파아제를 배지에 첨가하는 것에 의한 MEL 생산 효율에 대한 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 4는 발현 벡터 pUC_neo::LIPA 및 pUC_neo::LIPB의 구조를 나타낸다.
도 5는 형질 전환주의 리파아제 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 외인성 리파아제 도입주 및 컨트롤에 의한 MEL의 생산을 박층 크로마토그래피로 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 외인성 리파아제 도입주 및 컨트롤에 의한 MEL의 생산을 HPLC에서 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 외인성 리파아제 도입주 및 컨트롤의 증식 속도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 배지에 올리브유 또는 올레산과 글리세린을 첨가하는 것에 의한 MEL의 생산에 대한 영향을 나타낸다.
도 10은 배지에 올리브유 또는 올레산과 글리세린을 첨가하는 것에 의한 균체 증식에 대한 영향을 나타낸다.
도 2는 4-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨(a) 및 1-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨(b)의 구조를 나타낸다.
도 3은 정제 리파아제를 배지에 첨가하는 것에 의한 MEL 생산 효율에 대한 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 4는 발현 벡터 pUC_neo::LIPA 및 pUC_neo::LIPB의 구조를 나타낸다.
도 5는 형질 전환주의 리파아제 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 외인성 리파아제 도입주 및 컨트롤에 의한 MEL의 생산을 박층 크로마토그래피로 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 외인성 리파아제 도입주 및 컨트롤에 의한 MEL의 생산을 HPLC에서 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 외인성 리파아제 도입주 및 컨트롤의 증식 속도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 배지에 올리브유 또는 올레산과 글리세린을 첨가하는 것에 의한 MEL의 생산에 대한 영향을 나타낸다.
도 10은 배지에 올리브유 또는 올레산과 글리세린을 첨가하는 것에 의한 균체 증식에 대한 영향을 나타낸다.
미생물의 재조합에 사용하는 리파아제는, 미생물에 있어서 발현되고, 리파아제 활성을 발휘하는(즉, 기능하는) 한 특별히 제한되지 않고, 임의로 선택할 수 있다. 따라서, 리파아제의 유래는 미생물, 식물 및 동물 중 어느 것이어도 된다. 일 실시 형태에 있어서 바람직한 리파아제는 미생물 유래이다. 일 실시 형태에 있어서, 리파아제의 유래로서 바람직한 미생물은 슈도자이마속, 우스틸라고속, 스포리소리움(Sporisorium)속, 멜라노피치움(Melanopsichium)속 및 쿠르츠마노마이세스속이다. 바람직한 슈도자이마속 미생물은 슈도자이마·안타크티카(Pseudozyma antarctica), 슈도자이마·아피디스(Pseudozyma aphidis), 슈도자이마·휴베이엔시스(Pseudozyma hubeiensis) 및 슈도자이마·츠쿠바엔시스이다. 바람직한 우스틸라고속 미생물은 우스틸라고·호르데이(Ustilago hordei) 및 우스틸라고·마이디스(Ustilago maydis)이다. 바람직한 스포리소리움속 미생물은 스포리소리움·레일리아눔(Sporisorium reilianum) 및 스포리소리움·시타미네움(Sporisorium scitamineum)이다. 바람직한 멜라노피치움속 미생물은 멜라노피치움·펜실바니쿰(Melanopsichium pennsylvanicum)이다. 바람직한 쿠르츠마노마이세스속 미생물은 쿠르츠마노마이세스·에스피(Kurtzmanomyces sp.) I-11이다.
바람직한 일 실시 형태에 있어서, 리파아제는, 서열 번호 1 내지 9, 24 및 25 중 어느 아미노산 서열 또는 그것과 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 동일성은 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이다. 이러한 리파아제는 임의의 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 유전자 공학적인 방법 및 화학 합성법(예를 들어, 액상법 및 고상법)을 사용하여 제조하는 것이 가능하다. 또한, 리파아제를 코딩하는 핵산에 대해서도 임의의 방법(예를 들어, 유전자 공학적 방법 및 화학 합성법)을 사용하여 얻을 수 있다.
서열 번호 1은 피. 안타크티카(P. antarctica) T-34 유래의 LIP-A의 아미노산 서열이다. 서열 번호 2는 슈도자이마·아피디스 DSM70725 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 3은 슈도자이마·휴베이엔시스 SY62 유래의 리파아제의 아미노산 서열이다. 서열 번호 4는 우스틸라고·호르데이 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 5는 우스틸라고·마이디스 521 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 6은 스포리소리움·레일리아눔 SRZ2 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 7은 스포리소리움·시타미네움 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 8은 멜라노피치움·펜실바니쿰 4 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 9는 쿠르츠마노마이세스 에스피 I-11 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 24는 슈도자이마·츠쿠바엔시스 NBRC1940주 유래의 리파아제(LIPA)가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 25는 슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주 유래의 리파아제(LIPA)가 갖는 아미노산 서열이다. 일 실시 형태에 있어서 바람직한 리파아제는 피. 안타크티카 T-34 유래의 LIP-A이다. 또한, 피. 안타크티카 T-34는 「모에스지오마이세스 안타크티쿠스(Moesziomyces antarcticus) T-34」라고도 칭해진다. 피. 아피디스(P. aphidis)는 「모에스지오마이세스 아피디스(Moesziomyces aphidis)」라고도 칭해진다.
아미노산의 동일성은, 시판되는 또는 인터넷을 통하여 이용 가능한 해석 툴(예를 들어, FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH 등의 소프트웨어)을 사용하여 계산할 수 있다. 예를 들어, BLAST 검색에 일반적으로 사용되는 주된 초기 조건은 이하와 같다. 즉, Advanced BLAST 2.1에 있어서, 프로그램에 blastp를 사용하고, Expect값을 10, Filter는 모두 OFF로 하여, Matrix에 BLOSUM62를 사용하고, Gap existence cost, Per residue gap cost 및 Lambda ratio를 각각 11, 1, 0.85(디폴트값)로 하여, 다른 각종 파라미터도 디폴트값으로 설정하여 검색을 행함으로써, 아미노산 서열의 동일성의 값(%)을 산출할 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 리파아제는, 서열 번호 1 내지 9, 24 및 25의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위(이하, 이들을 통합하여 「변이」라고 하는 경우가 있다.)된 아미노산 서열을 포함하고, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다. 여기서 「수개」란, 리파아제 활성이 유지되는 한 제한되지 않지만, 예를 들어 전체 아미노산의 약 20% 미만에 상당하는 수이고, 바람직하게는 약 15% 미만에 상당하는 수이고, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만에 상당하는 수이고, 한층 더 바람직하게는 약 5% 미만에 상당하는 수이고, 가장 바람직하게는 약 1% 미만에 상당하는 수이다. 보다 구체적으로는, 예를 들어 2 내지 100개, 바람직하게는 2 내지 80개, 보다 바람직하게는 2 내지 60개, 더욱 바람직하게는 2 내지 40개이며, 보다 더욱 바람직하게는 2 내지 20개, 한층 바람직하게는 2 내지 15개, 한층 더 바람직하게는 2 내지 10개, 특히 바람직하게는 2 내지 5개이다.
아미노산의 치환의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 리파아제에 현저한 영향을 주지 않는다는 관점에서 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 「보존적 아미노산 치환」이란, 어느 아미노산 잔기를, 동일한 성질의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 아미노산 잔기는 그의 측쇄에 의해 염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 분지 측쇄(예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 측쇄(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)와 같이, 몇 가지의 패밀리로 분류되어 있다. 보존적 아미노산 치환은 바람직하게는, 동일한 패밀리 내의 아미노산 잔기간의 치환이다.
하나 또는 수개의 변이는, 제한 효소 처리, 엑소뉴클레아제, DNA 리가아제 등에 의한 처리, 위치 지정 돌연 변이 도입법(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) 등 공지된 방법을 이용하여 도입할 수 있다. 또한, 자외선 조사 등 다른 방법에 의해서도 변이체를 얻을 수 있다. 변이체에는, 리파아제를 갖는 미생물의 개체 차, 종이나 속의 상이에 기초하는 경우 등의 천연에 발생하는 변이체(예를 들어, 1 염기 다형)도 포함된다. 일 실시 형태에 있어서, 변이는, FGDH의 활성 부위 또는 기질 결합 부위에 영향을 주지 않는 부위에 존재하는 것이 바람직하다.
서열 번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 10에 나타낸다. 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 11에 나타낸다. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 12에 나타낸다. 서열 번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 13에 나타낸다. 서열 번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 14에 나타낸다. 서열 번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 15에 나타낸다. 서열 번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 16에 나타낸다. 서열 번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 17에 나타낸다. 서열 번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 18에 나타낸다. 서열 번호 24의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 26에 나타낸다. 서열 번호 25의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 27에 나타낸다.
재조합 미생물은, 예를 들어 숙주 미생물에 상기 리파아제를 코딩하는 외인성 핵산을 도입함으로써 얻을 수 있다. 여기서, 숙주 미생물은, 만노실에리스리톨 리피드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이면 특별히 제한되지 않고, 임의로 선택하여 사용할 수 있다. 만노실에리스리톨 리피드를 생산하는 능력을 갖는 미생물로서, 예를 들어 슈도자이마속에 속하는 미생물을 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 바람직한 만노실에리스리톨 리피드를 생산하는 능력을 갖는 미생물은, 슈도자이마·츠쿠바엔시스, 슈도자이마·안타크티카, 슈도자이마·루귤로사, 슈도자이마·아피디스, 슈도자이마·파라안타크티카, 슈도자이마·휴베이엔시스에 속하는 미생물이다. 츠쿠바엔시스종에 포함되는 바람직한 MEL 생산주로서는, NBRC1940주, KM-160주, 1D9주, 1D10주, 1D11주, 1E5주 및 JCM16987주를 들 수 있다. 슈도자이마·츠쿠바엔시스가 생산하는 1-O-β-MEL-B는 수화성이 4-O-β-MEL-B보다도 높아, 수계 용도에 있어서 유용하다.
숙주 세포로의 리파아제를 코딩하는 핵산의 도입 수단은 임의이며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 핵산을 숙주에 적합한 벡터에 도입하고, 그것을 임의의 방법으로 숙주 세포에 도입할 수 있다. 벡터란, 거기에 조립된 핵산 분자를 세포 내에 수송할 수 있는 핵산성 분자(캐리어)이다. 벡터의 종류는, 숙주 세포 내에서 복제 및 발현이 가능한 한, 그 종류나 구조는 특별히 한정되지 않는다. 벡터의 종류는 숙주 세포의 종류에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 벡터의 구체예로서는, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 등) 등을 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서 바람직한 벡터는 플라스미드 벡터이다.
슈도자이마속을 숙주로 하는 경우의 벡터로서는, 예를 들어 pUXV1 ATCC 77463, pUXV2 ATCC 77464, pUXV5 ATCC 77468, pUXV6 ATCC 77469, pUXV7 ATCC 77470, pUXV8 ATCC 77471, pUXV3 ATCC 77465, pU2X1 ATCC 77466, pU2X2 ATCC 77467, pUXV1-neo, pPAX1-neo, pPAA1-neo(Appl Microbiol Biotechnol(2016) 100: 3207-3217) 및 pUC_neo 등을 예시할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 바람직한 벡터는 pUC_neo이다.
발현 벡터는 통상, 삽입된 핵산의 발현에 필요한 프로모터 서열 및 발현을 촉진시키는 인핸서 서열 등을 포함한다. 선택 마커를 포함하는 발현 벡터를 사용할 수도 있다. 핵산의 벡터로의 삽입, 선택 마커 유전자의 삽입(필요한 경우), 프로모터의 삽입(필요한 경우) 등은 표준적인 재조합 DNA 기술(예를 들어, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York를 참조할 수 있는, 제한 효소 및 DNA 리가아제를 사용한 주지된 방법)을 사용하여 행할 수 있다.
숙주 세포로의 벡터의 도입은 임의이며, 숙주 세포 및 벡터의 종류 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 벡터의 도입은, 예를 들어 일렉트로포레이션, 인산칼슘 공침강법, 리포펙션, 마이크로인젝션 및 아세트산리튬법 등에 의해 실시할 수 있다.
핵산의 도입에 의해 재조합 미생물이 얻어진 것인지 여부는, 임의의 방법으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산의 도입에 의해 부여한 리파아제 활성의 유무를 확인함으로써 원하는 재조합 미생물이 얻어진 것을 확인할 수 있다. 리파아제 활성의 확인은 임의의 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 상술하는 실시예에서 채용한 방법(즉, 라우르산p-니트로페닐의 가수 분해에 의해 발생하는, 파장 410nm의 흡광도의 변화에 의해 측정하는 방법)에 의해 실시할 수 있다.
재조합 미생물은, 리파아제 활성과 만노실에리스리톨 리피드 산생 능력을 구비함으로써, 보다 효율적으로 만노실에리스리톨 리피드를 산생할 수 있다. 재조합 미생물이 산생하는 만노실에리스리톨 리피드의 종류는 특별히 제한되지 않고 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 바람직한 MEL은 1-O-β-MEL-B 및 4-O-β-MEL-B이며, 보다 바람직하게는 1-O-β-MEL-B이다.
재조합 미생물을 사용한 MEL의 생산은 임의의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, MEL의 생산에 적합한 배지에서 재조합 미생물을 배양함으로써 실시할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 재조합 미생물을 사용한 MEL을 생산하는 경우, 배지에 식물 유지를 첨가하는 것이 바람직하다. 식물 유지의 종류는 특별히 제한되지 않고, 목적으로 하는 MEL의 종류 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 대두유, 올리브유, 유채씨유, 홍화유, 참기름, 팜유, 해바라기유, 코코넛유, 카카오 버터 및 피마자유 등을 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서 바람직한 유지는 올리브유이다.
재조합 미생물의 배양 조건은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 재조합 미생물이, 슈도자이마속인 경우에는, pH 5 내지 8, 바람직하게는 pH 6, 온도 20 내지 35℃, 바람직하게는 22 내지 28℃의 조건에서 3 내지 7일간 배양할 수 있다. MEL은 통상의 방법에 따라서 배양액 중에서 회수할 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서, 지방산 및 글리세린을 첨가한 배지에서 만노실에리스리톨 리피드 산생능을 갖는 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법이 제공된다. 본 실시 형태에 있어서 사용하는 MEL 산생 미생물은, 리파아제 활성을 가지고 있어도 가지지 않아도 되고, 일 실시 형태에 있어서 리파아제 활성을 가지지 않은 미생물이 바람직하다.
지방산은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 베헨산 및 네르본산 등을 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 바람직한 지방산은 올레산이다.
지방산 및 글리세린의 양은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 각각 배지 중의 농도가 0.1 내지 20용량%가 되도록 첨가할 수 있다.
미생물의 배양 조건은 특별히 제한되지 않고, 상술하는 재조합 미생물을 사용하는 경우와 동일한 조건을 채용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들에 제한되는 것은 아니다.
1. 재료
· 사용 균체
슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주·게놈 DNA
슈도자이마·안타크티카 T-34주·플라스미드
발현 벡터 pUC_neo
·배지
글리세롤 첨가 YM 배지: 탈이온수 1L에, 효모 엑기스 3g, 맥아 추출물 3g, 펩톤 5g, 글루코오스 10g, 글리세롤 50g을 녹여서 조정하였다.
MEL 생산 배지: 탈이온수 1L에, 효모 엑기스 5g, 질산나트륨 3g, 인산이수소칼륨 0.3g, 황산마그네슘·7수화물 0.3g, 글리세롤 20g을 녹여서 조정하였다. 배양 시에는, 필요에 따라서 G418(항생 물질)을 첨가하였다.
·정제 리파아제: 돼지 췌장 유래 리파아제(도쿄 카세이사제), 고정화 리파아제 A(시그마 알드리치사제), 고정화 리파아제 B(시그마 알드리치사제)
2. 정제 리파아제 첨가 배지에서의 MEL 생산능의 평가
슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주를 글리세롤 첨가 YM 배지 2mL에서 25℃, 3일간 진탕 배양하고, 전(前)배양액을 얻었다. 이어서, 전배양액 0.1mL를 MEL 생산 배지에 10% 올리브유 및 돼지 췌장 유래 리파아제, 고정화 리파아제 A, 또는 고정화 리파아제 B를 1mg 첨가한 배지 2mL에 접종하고, 25℃에서 4일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균체 배양액에 등량의 아세트산에틸을 첨가하고, 충분히 교반한 후, 아세트산에틸층을 분취하였다. 아세트산에틸층에 포함되는 MEL은 박층 크로마토그래피로 확인하였다. 결과를 도 3에 도시한다. 도 3의 결과로부터, 어느 리파아제의 첨가도 1E5주에 의한 MEL-B의 생산성에 영향을 주지 않는 것이 나타났다.
3. 리파아제 발현 재조합주를 사용한 MEL-B의 생산
3-1. 게놈 DNA의 추출
상기 슈도자이마·안타크티카 T-34주의 균체 배양액에 포함되는 균체를 액체 질소로 동결시키고, 페놀 및 클로로포름으로 처리하여 게놈 DNA를 추출하였다. 얻어진 게놈 DNA의 순도와 양은 분광 광도계로 확인하였다.
3-2. 발현 벡터 구축
서열 번호 10 및 19에 나타내는 유전자를 발현하는 발현 벡터를 다음 수순으로 구축하였다. 서열 번호 10은 슈도자이마·안타크티카 T-34주의 리파아제 A를 코딩하는 염기 서열이며, 서열 번호 19는 슈도자이마·안타크티카 T-34주의 리파아제 B를 코딩하는 염기 서열이다. 먼저, 서열 번호 10을 참조하여, 개시 코돈의 상류에 KpnI 사이트를 도입한 정방향 프라이머(서열 번호 20), 및 종지 코돈의 하류에 EcoRI 사이트를 도입한 역방향 프라이머(서열 번호 21)를 조제하였다. 이들을 사용하여, 상기 3-1.에서 얻어진 슈도자이마·안타크티카 T-34주의 게놈 DNA를 템플릿에 유전자의 증폭을 행하였다. 동일하게, 서열 번호 19를 참조하여, 개시 코돈의 상류에 KpnI 사이트를 도입한 정방향 프라이머(서열 번호 22), 및 종지 코돈의 하류에 EcoRI 사이트를 도입한 역방향 프라이머(서열 번호 23)를 조제하였다. 이들을 사용하여, 상기 3-1.에서 얻어진 슈도자이마·안타크티카 T-34주의 게놈 DNA를 템플릿에 유전자의 증폭을 행하였다. 증폭시킨 유전자를, 사상균(우스틸라고 마이디스) 유래의 복제 개시점(UARS), G418 내성 유전자, 슈도자이마·안타크티카 T-34주 유래의 gap 프로모터를 포함하는 발현 벡터 pUC_neo에 연결하고, gap 프로모터의 제어 하에서 이들 유전자가 발현되는 유전자 발현 벡터 pUC_neo::LIPA 및 pUC_neo::LIPB를 구축하였다. 발현 벡터의 구조를 도 4에 도시한다.
Fwd: TTTGGTACCATGCGAGTGTCCTTG(서열 번호 20)
Rvs: GCAGAATTCCTAAGGCGGTGTG(서열 번호 21)
Fwd: CGAGGTACCATGAAGCTACTCTC(서열 번호 22)
Rvs: TGAGAATTCTCAGGGGGTGACG(서열 번호 23)
3-3. 형질 전환체의 조제
상기 3-2.에서 얻어진 발현 벡터 pUC_neo::LIPA 및 pUC_neo::LIPB를 제한 효소 처리로 직선화한 것을 사용하여, 일렉트로포레이션법으로 슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주를 형질 전환하였다. 또한, 컨트롤로서 인서트를 포함하지 않는 벡터 pUC_neo도 동일하게, 제한 효소 처리로 직선화한 후, 일렉트로포레이션법으로 슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주에 도입하였다. 형질 전환체의 선별에는, G418을 사용하였다.
3-4. 효소 활성 측정
각 형질 전환체를 글리세롤 첨가 YM 배지 2mL에서 25℃, 3일간 진탕 배양하고, 전배양액을 얻었다. 이어서, 전배양액 1mL를 MEL 배지에 12% 올리브유를 첨가한 배지 20mL에 접종하고, 25℃에서 3일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균체 배양액을 원심하고, 배양 상청을 얻었다.
각 형질 전환체의 배양 상청 중의 리파아제 활성은, 라우르산p-니트로페닐의 가수 분해에 의해 발생하는, 파장 410nm의 흡광도의 변화에 의해 측정하였다. 1분간에 1㎛ol의 기질을 소비하는 데 필요한 효소량을 1Unit으로 하였다. 결과를 도 5에 도시한다. 도면 중, Neo는 pUC_neo 도입주(컨트롤), LIPA는 pUC_neo::LIPA 도입주, LIPB는 pUC_neo::LIPB 도입주를 각각 나타낸다. 이 결과로 LIPA 도입주 및 LIPB 도입주에 있어서 리파아제 활성이 확인되었다.
3-5. 형질 전환체의 MEL 생산능의 평가
각 형질 전환체를 글리세롤 첨가 YM 배지 2mL에서 25℃, 3일간 진탕 배양하고, 전배양액을 얻었다. 이어서, 전배양액 1mL를 MEL 배지에 12% 올리브유를 첨가한 배지 20mL에 접종하고, 25℃에서 15일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균체 배양액에 등량의 아세트산에틸을 첨가하고, 충분히 교반한 후, 아세트산에틸층을 분취하였다. 아세트산에틸층에 포함되는 MEL은 박층 크로마토그래피로 확인하였다(도 6). 또한, 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 MEL의 생산량을 정량하였다(도 7). 또한, 아세트산에틸층을 분취한 후에 남은 수층에 메탄올을 첨가하고, 원심 분리함으로써 균체를 얻었다. 얻어진 균체를 건조시켜 칭량하고, 균체 증식량을 평가하였다(도 8).
도 6 및 7에 나타내는 대로, 어느 균주에서도 MEL-B의 생산이 확인되고, 컨트롤과 비교하여 리파아제 A 도입주에서는 초기의 MEL-B 생산 속도가 유의미하게 빠른(약 1.5배) 것이 확인되었다. 도 8의 결과로부터 리파아제 A 도입주에서는, 균체 증식 속도도 컨트롤과 비교하여 빠른 것이 확인되었다.
4. 지방산과 글리세린의 첨가에 의한 MEL-B 생산에 대한 영향
슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주를 글리세롤 첨가 YM 배지 2mL에서 25℃, 3일간 진탕 배양하고, 전배양액을 얻었다. 이어서, 전배양액 1mL를, MEL 배지에 올리브유를 12용량% 첨가한 배지 20mL, 또는 올리브유 12용량%를 올레산 10.8용량% 및 글리세린 1.2용량%로 바꾼 배지 20ml에 접종하고, 25℃에서 4일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균체 배양액에 등량의 아세트산에틸을 첨가하고, 충분히 교반한 후, 아세트산에틸층을 분취하였다. 아세트산에틸층에 포함되는 MEL의 양을 고속 액체 크로마토그래피로 측정하였다(도 9). 또한, 아세트산에틸층을 분취한 후에 남은 수층에 메탄올을 첨가하고, 원심 분리함으로써 균체를 얻었다. 얻어진 균체는 건조시킨 후 칭량하고, 균체 증식량을 평가하였다(도 10). 도 9의 결과로부터, 올리브유 대신에 올레산 및 글리세린을 배지에 첨가함으로써, MEL-B의 생산량이 약 1.5배 향상되는 것이 확인되었다. 한편, 도 10의 결과로부터 올리브유를 올레산 및 글리세린으로 바꾸어도 균체의 증식 능력에 영향을 미치지 않는 것이 판명되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY
TOYOBO CO., LTD.
<120> Biosurfactant-producing microorganism
<130> P17-007WO
<150> JP 2016-112087
<151> 2016-06-03
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 462
<212> PRT
<213> Pseudozyma antarctica
<400> 1
Met Arg Val Ser Leu Arg Ser Ile Thr Ser Leu Leu Ala Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Thr Leu Asp Arg Arg Ala
20 25 30
Ala Leu Pro Asn Pro Tyr Asp Asp Pro Phe Tyr Thr Thr Pro Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Thr Phe Ala Lys Gly Gln Val Ile Gln Ser Arg Lys Val Pro
50 55 60
Thr Asp Ile Gly Asn Ala Asn Asn Ala Ala Ser Phe Gln Leu Gln Tyr
65 70 75 80
Arg Thr Thr Asn Thr Gln Asn Glu Ala Val Ala Asp Val Ala Thr Val
85 90 95
Trp Ile Pro Ala Lys Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser Tyr Gln
100 105 110
Val Tyr Glu Asp Ala Thr Ala Leu Asp Cys Ala Pro Ser Tyr Ser Tyr
115 120 125
Leu Thr Gly Leu Asp Gln Pro Asn Lys Val Thr Ala Val Leu Asp Thr
130 135 140
Pro Ile Ile Ile Gly Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val Val Ser
145 150 155 160
Ser Asp His Glu Gly Phe Lys Ala Ala Phe Ile Ala Gly Tyr Glu Glu
165 170 175
Gly Met Ala Ile Leu Asp Gly Ile Arg Ala Leu Lys Asn Tyr Gln Asn
180 185 190
Leu Pro Ser Asp Ser Lys Val Ala Leu Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Ala
195 200 205
His Ala Thr Val Trp Ala Thr Ser Leu Ala Glu Ser Tyr Ala Pro Glu
210 215 220
Leu Asn Ile Val Gly Ala Ser His Gly Gly Thr Pro Val Ser Ala Lys
225 230 235 240
Asp Thr Phe Thr Phe Leu Asn Gly Gly Pro Phe Ala Gly Phe Ala Leu
245 250 255
Ala Gly Val Ser Gly Leu Ser Leu Ala His Pro Asp Met Glu Ser Phe
260 265 270
Ile Glu Ala Arg Leu Asn Ala Lys Gly Gln Gln Ala Leu Lys Gln Ile
275 280 285
Arg Gly Arg Gly Phe Cys Leu Pro Gly Val Val Leu Thr Tyr Pro Phe
290 295 300
Leu Asn Val Phe Ser Leu Val Asn Asp Thr Asn Leu Leu Asn Glu Ala
305 310 315 320
Pro Ile Val Ser Ile Leu Lys Gln Glu Thr Val Val Gln Ala Glu Ala
325 330 335
Ser Tyr Thr Val Ser Val Pro Lys Phe Pro Arg Phe Ile Trp His Ala
340 345 350
Val Pro Asp Glu Ile Val Pro Tyr Gln Pro Ala Ala Thr Tyr Val Lys
355 360 365
Glu Gln Cys Ala Lys Gly Ala Asn Ile Asn Phe Ser Pro Tyr Pro Ile
370 375 380
Ala Glu His Leu Thr Ala Glu Ile Phe Gly Leu Val Pro Ser Leu Trp
385 390 395 400
Phe Ile Lys Gln Ala Phe Asp Gly Thr Thr Pro Lys Val Ile Cys Gly
405 410 415
Thr Pro Ile Pro Ala Ile Ala Gly Ile Thr Thr Pro Ser Ala Asp Gln
420 425 430
Val Leu Gly Ser Asp Leu Ala Asp Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Lys
435 440 445
Gln Ser Ala Phe Gly Lys Pro Phe Gly Pro Ile Thr Pro Pro
450 455 460
<210> 2
<211> 528
<212> PRT
<213> Pseudozyma aphidis DSM70725
<400> 2
Met Arg His Arg Leu Asp Gly Ser Ile Val Gly Ser Ile Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ile Ala Tyr Lys Gly Gln Pro Ser Ser Pro Gln Glu Tyr Ala Arg Ser
20 25 30
Leu Lys Arg Leu His Ser Leu Ser Ser His Pro Ser Ser Ser Ser Pro
35 40 45
Arg Pro Glu Pro Tyr Pro Leu Ala Pro Leu Arg Leu Pro Pro Thr Phe
50 55 60
Arg Thr Met Arg Val Ser Leu Arg Ser Ile Thr Ser Leu Leu Ala Ala
65 70 75 80
Ala Thr Ala Ala Val Leu Ala Ala Pro Ala Thr Glu Thr Leu Asp Arg
85 90 95
Arg Ala Ala Leu Pro Asn Pro Tyr Asp Asp Pro Phe Tyr Thr Thr Pro
100 105 110
Ser Asn Ile Gly Thr Phe Ala Lys Gly Gln Val Ile Gln Ser Arg Lys
115 120 125
Val Pro Thr Asp Ile Gly Asn Ala Asn Asn Ala Ala Ser Phe Gln Leu
130 135 140
Gln Tyr Arg Thr Thr Asn Thr Gln Asn Glu Ala Val Ala Asp Val Ala
145 150 155 160
Thr Val Trp Ile Pro Ala Lys Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser
165 170 175
Tyr Gln Val Tyr Glu Asp Ala Thr Ala Leu Asp Cys Ala Pro Ser Tyr
180 185 190
Ser Tyr Leu Thr Gly Leu Asp Gln Pro Asn Lys Val Thr Ala Val Leu
195 200 205
Asp Thr Pro Ile Ile Ile Gly Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val
210 215 220
Val Ser Ser Asp His Glu Gly Phe Lys Ala Ala Phe Ile Ala Gly Tyr
225 230 235 240
Glu Glu Gly Met Ala Ile Leu Asp Gly Ile Arg Ala Leu Lys Asn Tyr
245 250 255
Gln Asn Leu Pro Ser Asp Ser Lys Val Ala Leu Glu Gly Tyr Ser Gly
260 265 270
Gly Ala His Ala Thr Val Trp Ala Thr Ser Leu Ala Asp Ser Tyr Ala
275 280 285
Pro Glu Leu Asn Ile Val Gly Ala Ser His Gly Gly Thr Pro Val Ser
290 295 300
Ala Lys Asp Thr Phe Thr Phe Leu Asn Gly Gly Pro Phe Ala Gly Phe
305 310 315 320
Ala Leu Ala Gly Val Ser Gly Leu Ser Leu Ala His Pro Asp Met Glu
325 330 335
Ser Phe Ile Glu Ala Arg Leu Asn Ala Lys Gly Gln Gln Thr Leu Lys
340 345 350
Gln Ile Arg Gly Arg Gly Phe Cys Leu Pro Gln Val Val Leu Thr Tyr
355 360 365
Pro Phe Leu Asn Val Phe Ser Leu Val Asn Asp Thr Asn Leu Leu Asn
370 375 380
Glu Ala Pro Ile Ala Gly Ile Leu Lys Gln Glu Thr Val Val Gln Ala
385 390 395 400
Glu Ala Ser Tyr Thr Val Ser Val Pro Lys Phe Pro Arg Phe Ile Trp
405 410 415
His Ala Ile Pro Asp Glu Ile Val Pro Tyr Gln Pro Ala Ala Thr Tyr
420 425 430
Val Lys Glu Gln Cys Ala Lys Gly Ala Asn Ile Asn Phe Ser Pro Tyr
435 440 445
Pro Ile Ala Glu His Leu Thr Ala Glu Ile Phe Gly Leu Val Pro Ser
450 455 460
Leu Trp Phe Ile Lys Gln Ala Phe Asp Gly Thr Thr Pro Lys Val Ile
465 470 475 480
Cys Gly Thr Pro Ile Pro Ala Ile Ala Gly Ile Thr Thr Pro Ser Ala
485 490 495
Asp Gln Val Leu Gly Ser Asp Leu Ala Asn Gln Leu Arg Ser Leu Asn
500 505 510
Gly Lys Gln Ser Ala Phe Gly Lys Pro Phe Gly Pro Ile Thr Pro Pro
515 520 525
<210> 3
<211> 430
<212> PRT
<213> Pseudozyma hubeiensis
<400> 3
Met His Thr Arg Glu Thr Leu Pro Asp Pro Asn Asp Asp Pro Phe Tyr
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ser Asn Ile Ala Ser Tyr Ala Asn Gly Gln Val Ile Gln
20 25 30
Ser Arg Lys Val Asp Thr Glu Ile Gly Ser Ile Asn Asn Val Asn Thr
35 40 45
Phe Gln Val Lys Tyr Arg Thr Thr Asn Thr Gln Asn Gln Ala Gln Ser
50 55 60
Asn Leu Ala Thr Val Trp Ile Pro Ser Lys Pro Ala Ser Pro Pro Lys
65 70 75 80
Ile Phe Ser Tyr Gln Val Tyr Met Asp Ala Thr Gln Ile Asp Cys Ala
85 90 95
Pro Ser Tyr Ser Tyr Val Thr Gly Leu Asp Lys Pro Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Val Ile Leu Asp Thr Pro Ile Val Ile Ser Trp Ala Leu Gln Gln Gly
115 120 125
Tyr Tyr Val Val Ser Ser Asp Asp Glu Gly Pro Arg Ala Ala Phe Ile
130 135 140
Ala Gly Tyr Glu Glu Gly Lys Ala Val Leu Asp Gly Ile Arg Ala Leu
145 150 155 160
Gln Asn Tyr Ala Asn Leu Pro Lys Asp Ser Pro Ile Gly Met Tyr Gly
165 170 175
Tyr Ser Gly Gly Ala His Thr Thr Gly Trp Ala Val Asn Leu Ala Gly
180 185 190
Ser Tyr Ala Ser Glu Leu Asn Ile Ile Gly Ala Ala Tyr Gly Gly Leu
195 200 205
Pro Ala Ser Ala Lys Asp Thr Phe Thr Phe Leu Asn Gly Lys Ser Ile
210 215 220
Phe Ser Gly Phe Ala Leu Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Leu Gly His
225 230 235 240
Pro Asp Met Glu Ala Phe Ile Lys Pro Arg Leu Asn Ala Lys Gly Asn
245 250 255
Gln Thr Leu Ala Gln Ile Arg Ser Arg Gly Glu Cys Ile Gly Gln Val
260 265 270
Ala Leu Gly Tyr Pro Phe Leu Asp Val Phe Ser Leu Val Asn Asp Thr
275 280 285
Asn Leu Leu Asn Glu Glu Pro Ile Val Ser Ile Leu Lys Thr Glu Thr
290 295 300
Leu Val Gln Ala Glu Ala Ser Tyr Thr Val Pro Val Pro Lys Phe Pro
305 310 315 320
Arg Phe Met Trp His Ala Leu Pro Asp Glu Ile Val Pro Phe Gln Pro
325 330 335
Ala Gln Asp Tyr Val Thr Glu Gln Cys Ala Lys Gly Ala Asp Ile Asn
340 345 350
Trp Asn Val Tyr Pro Ile Ala Glu His Ile Ser Ala Glu Leu Leu Gly
355 360 365
Leu Leu Pro Gly Ile Asp Trp Leu Ser Lys Ala Tyr Lys Gly Gln Ala
370 375 380
Pro Lys Val Ala Cys Gly Gly Gly Val Pro Ala Thr Pro Pro Pro Ala
385 390 395 400
Glu Asp Val Leu Gly Gly Asp Leu Ala Ser Gln Phe Arg Ser Leu Asn
405 410 415
Gly Lys Gln Ser Ala Tyr Gly Lys Pro Phe Asn Ala Gly Phe
420 425 430
<210> 4
<211> 458
<212> PRT
<213> Ustilago hordei
<400> 4
Met Arg Phe Phe Leu Gly Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ile
1 5 10 15
Ala Ala Leu Ala Val Pro Met Glu Arg Arg Ala Gln Phe Pro Asp Pro
20 25 30
Asn Glu Asp Pro Phe Tyr Gln Gln Pro Ser Asn Val Ala Thr Tyr Ala
35 40 45
Asn Gly Gln Ile Ile Arg Ser Arg Lys Ala Asp Thr Asp Ile Gly Asn
50 55 60
Ser Asn Lys Ala Gln Ala Phe Gln Leu Ser Tyr Arg Thr Thr Asn Thr
65 70 75 80
Gln Gln Gln Ala Gln Ala Asn Val Ala Thr Val Trp Ile Pro Ala Lys
85 90 95
Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser Tyr Gln Val Tyr Glu Asp Ser
100 105 110
Thr Gln Leu Asp Cys Ala Pro Ser Tyr Ser Tyr Leu Ala Gly Phe Asp
115 120 125
Pro Pro Asn Lys Ala Thr Thr Ile Leu Asp Thr Ser Leu Ile Ile Gly
130 135 140
Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val Leu Ser Ser Asp His Glu Gly
145 150 155 160
Pro Arg Ala Ala Phe Ile Ala Gly Tyr Glu Glu Gly Met Ala Ile Leu
165 170 175
Asp Ala Ile Arg Ala Leu Gln Asn Phe Arg His Leu Pro Lys Asp Ser
180 185 190
Pro Val Gly Met Tyr Gly Tyr Ser Gly Gly Ala His Ala Thr Val Trp
195 200 205
Ala Glu Ser Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Pro Glu Ile Asn Ile Ile Ala
210 215 220
Thr Ala His Gly Gly Thr Pro Phe Ser Thr Lys Asp Thr Phe Thr Phe
225 230 235 240
Ile Asn Gly Gly Val Phe Ala Gly Phe Ala Ile Ala Gly Val Ser Gly
245 250 255
Leu Ala Leu Val His Pro Ala Met Gln Ala Tyr Ile Lys Pro Arg Leu
260 265 270
Asn Ala Gln Gly Val Lys Val Phe Gln Gln Ile Arg Ser Arg Ala Phe
275 280 285
Cys Ile Ala Gln Val Val Phe Thr Tyr Pro Phe Thr Asn Val Phe Asn
290 295 300
Leu Val Asn Gly Thr Asp Leu Leu Asn Gln Glu Pro Ile Arg Ser Ile
305 310 315 320
Leu Lys Arg Glu Thr Leu Val Gln Ser Glu Ala Ser Cys Asp Val Pro
325 330 335
Val Val Arg Ala Pro Arg Phe Ile Trp His Ala Ala Leu Asp Glu Ile
340 345 350
Val Pro Tyr Ala Pro Ala Ala Gln Tyr Val Lys Glu Gln Cys Asp Lys
355 360 365
Gly Ala Gln Ile His Phe Glu Thr Tyr Pro Ile Ala Glu His Phe Ser
370 375 380
Ala Glu Phe Phe Gly Leu Val Pro Ala Leu Trp Phe Leu Ser Gln Ala
385 390 395 400
Tyr Ala Gly Lys Ala Ala Lys Thr Val Cys Gly Thr Ser Ile Pro Ala
405 410 415
Ile Pro Gly Phe Thr Val Pro Ser Ala Glu Glu Val Leu Gly Ala Asp
420 425 430
Leu Ala Lys Gln Leu Lys Gly Leu Ser Ala Lys Asp Leu Ser Ala Lys
435 440 445
Asp Leu Ser Gly Lys His Leu Pro Ala Leu
450 455
<210> 5
<211> 458
<212> PRT
<213> Ustilago maydis
<400> 5
Met Arg Phe Ile Ala Val Arg Ala Ile Val Thr Leu Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Val Ser Leu Ala Val Pro Thr Glu Arg Arg Ala Ala Phe Ala Asp
20 25 30
Pro Asn Asp Asp Leu Phe Tyr Thr Thr Pro Asp Asn Ile Asn Thr Tyr
35 40 45
Ala Asn Gly Gln Val Ile Gln Ser Arg Lys Ala Asp Thr Asp Ile Gly
50 55 60
Asn Ser Asn Lys Val Glu Ala Phe Gln Leu Gln Tyr Arg Thr Thr Asn
65 70 75 80
Thr Gln Lys Glu Ala Gln Ala Asn Val Ala Thr Val Trp Ile Pro Asn
85 90 95
Lys Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser Tyr Gln Val Tyr Gln Asp
100 105 110
Ser Thr Gln Leu Asn Cys Ala Pro Ser Tyr Ser Phe Leu Lys Gly Leu
115 120 125
Asp Lys Pro Asn Lys Ala Thr Thr Ile Leu Glu Ala Pro Ile Ile Ile
130 135 140
Gly Trp Ala Leu Gln Gln Gly Phe Tyr Val Val Ser Ser Asp His Glu
145 150 155 160
Gly Pro Arg Ser Ser Phe Ile Ala Gly Tyr Glu Glu Gly Met Ala Ile
165 170 175
Leu Asp Gly Ile Arg Ala Leu Lys Asn Tyr Ala Lys Leu Pro Thr Asp
180 185 190
Ser Ala Ile Gly Phe Tyr Gly Tyr Ser Gly Gly Ala His Ala Thr Gly
195 200 205
Trp Ala Ala Asn Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Pro Glu His Asn Ile Ile
210 215 220
Gly Ala Ala Tyr Gly Gly Leu Pro Ala Ser Ala Arg Asp Thr Phe Asn
225 230 235 240
Phe Leu Asn Lys Gly Ala Phe Ala Gly Phe Ala Ile Ala Gly Val Ser
245 250 255
Gly Leu Ala Leu Ala Tyr Pro Asp Val Glu Thr Tyr Ile Gln Ser Arg
260 265 270
Leu Asn Ala Lys Gly Glu Lys Val Phe Lys Gln Val Arg Ser Arg Gly
275 280 285
Phe Cys Ile Gly Gln Val Val Leu Thr Tyr Pro Phe Val Asp Ala Tyr
290 295 300
Ser Leu Ile Asn Asp Thr Asn Leu Leu Asn Glu Glu Pro Val Ala Ser
305 310 315 320
Thr Leu Lys Ser Glu Thr Leu Val Gln Ala Glu Ala Ser Tyr Thr Val
325 330 335
Pro Val Pro Lys Phe Pro Arg Phe Ile Trp His Ala Leu Leu Asp Glu
340 345 350
Ile Val Pro Phe His Ser Ala Ala Thr Tyr Val Lys Glu Gln Cys Ser
355 360 365
Lys Gly Ala Asp Ile Asn Trp Asn Val Tyr Ser Phe Ala Glu His Ile
370 375 380
Ser Ala Glu Leu Phe Gly Leu Leu Pro Gly Leu Asp Trp Leu Asn Lys
385 390 395 400
Ala Tyr Lys Gly Gln Ala Pro Lys Val Pro Cys Gly Gly Gly Ala Gln
405 410 415
Ser Val Met Gly Ala Ser Gly Pro Pro Ala Gln Asp Val Leu Gly Ala
420 425 430
Asp Leu Ala Ser Gln Leu Arg Ser Leu Gln Gly Lys Pro Ser Ala Phe
435 440 445
Gly Asn Lys Pro Phe Gly Ser Ile Ser Pro
450 455
<210> 6
<211> 459
<212> PRT
<213> Sporisorium reilianum
<400> 6
Met Arg Phe Phe Ala Gln Thr Leu Val Ala Leu Ala Ala Ala Ala Thr
1 5 10 15
Val Ser Leu Ala Ala Pro Leu Glu Arg Arg Ala Gln Phe Pro Asp Pro
20 25 30
Asn Asp Asp Pro Phe Tyr Ser Ala Pro Ala Asn Ile Gly Ser Tyr Val
35 40 45
Asn Gly Gln Val Ile Gln Ser Arg Ser Ala Thr Thr Asp Ile Gly Thr
50 55 60
Ser Asn Asn Ala Ala Ser Phe Gln Leu Leu Tyr Arg Thr Thr Asn Thr
65 70 75 80
Ser Asn Leu Pro Glu Ala Thr Val Ala Thr Val Trp Ile Pro Ala Lys
85 90 95
Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser Tyr Gln Val Tyr Glu Asp Ala
100 105 110
Thr Gln Leu Asn Cys Ala Pro Ser Tyr Ser Tyr Leu Ser Gly Leu Asp
115 120 125
Glu Pro Gly Lys Gly Thr Val Ile Leu Asp Thr Pro Ile Val Ile Ser
130 135 140
Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val Val Ser Ala Asp His Glu Gly
145 150 155 160
Pro Lys Ala Ala Phe Ile Ala Gly Cys Gln Glu Gly Arg Ala Ile Leu
165 170 175
Asp Gly Val Arg Ala Leu Arg Asn Phe Gln Asn Leu Ala Ser Asn Ser
180 185 190
Ala Val Gly Phe Tyr Gly Tyr Ser Gly Gly Gly His Ala Thr Gly Trp
195 200 205
Ala Val Ser Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Pro Asp Val Asn Ile Ile Gly
210 215 220
Ala Ala Tyr Gly Gly Val Pro Thr Ser Thr Arg Asp Ile Phe Asn Phe
225 230 235 240
Leu Asn Gly Gly Ala Phe Ala Gly Phe Ala Val Ala Gly Val Ser Gly
245 250 255
Leu Gly Leu Ala Tyr Pro Glu Leu Glu Ala Tyr Ile Glu Pro Arg Leu
260 265 270
Asn Ala Lys Gly Gln Asp Ala Leu Lys Arg Phe Arg Ser Arg Gly Tyr
275 280 285
Cys Ile Gly Gln Val Val Thr Ser Glu Asn Phe Val Asp Ile Tyr Thr
290 295 300
Leu Val Asn Asp Ser Asn Ile Leu Asn Glu Pro Ile Pro Ser Gln Val
305 310 315 320
Leu Ala Lys Glu Thr Leu Leu Gln Thr Gln Ala Ser Tyr Thr Val Pro
325 330 335
Val Pro Lys Ser Pro Arg Phe Ile Trp His Ala Leu Glu Asp Glu Ile
340 345 350
Val Pro Phe Lys Pro Ala Gln Gln Tyr Val Thr Glu Gln Cys Ala Lys
355 360 365
Gly Ala Asn Ile Asn Trp Asn Val Phe Pro Ile Ala Glu His Ile Ser
370 375 380
Ala Glu Leu Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Asp Trp Leu Ser Lys Ala
385 390 395 400
Tyr Arg Gly Gln Ala Pro Lys Val Ile Cys Gly Ser Ser Ile Pro Ala
405 410 415
Ile Thr Gly Val Asn Ser Pro Ser Ala Gln Gln Val Leu Gly Ala Asp
420 425 430
Leu Ala Gln Gln Leu Ser Asn Leu Asn Gly Lys Gln Ser Ala Phe Gly
435 440 445
Lys Pro Tyr Gly Pro Ile Thr Pro Pro Thr Ala
450 455
<210> 7
<211> 459
<212> PRT
<213> Sporisorium scitamineum
<400> 7
Met Lys Phe Phe Pro Gln Ala Val Val Ala Leu Ala Ala Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Leu Ala Val Pro Met Gln Lys Arg Ala Gln Tyr Pro Asp Pro
20 25 30
Asn Asp Asp Pro Phe Tyr Ser Val Pro Ala Asn Ile Gly Ser Tyr Ser
35 40 45
Asn Gly Gln Val Ile Gln Ser Arg Ser Ala Thr Thr Asp Ile Gly Asn
50 55 60
Ala Asn Asn Ala Leu Ser Phe Gln Leu Leu Tyr Arg Thr Thr Asn Thr
65 70 75 80
Ser Asn Gln Ala Asp Ala Thr Val Ala Thr Val Trp Ile Pro Ala Lys
85 90 95
Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser Tyr Gln Val Tyr Glu Asp Ala
100 105 110
Thr Gln Leu Asp Cys Ala Pro Ser Tyr Asn Tyr Leu Ser Gly Leu Glu
115 120 125
Gln Pro Gly Lys Ala Thr Val Ile Leu Asp Thr Pro Ile Ile Ile Gly
130 135 140
Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val Val Ser Ala Asp His Glu Gly
145 150 155 160
Pro Lys Ala Ala Phe Ile Ala Gly Tyr Gln Glu Gly Arg Ala Ile Leu
165 170 175
Asp Gly Ile Arg Ala Leu Arg Asn Phe Lys Asp Leu Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Ala Val Gly Phe Tyr Gly Tyr Ser Gly Gly Gly His Ala Thr Gly Trp
195 200 205
Ala Val Asn Leu Ala Asp Ser Tyr Ala Pro Asp Val Asn Ile Ile Gly
210 215 220
Ala Ala Tyr Gly Gly Leu Pro Ala Ser Thr Arg Asp Ile Phe Asn Phe
225 230 235 240
Leu Asn Gly Gly Val Phe Ala Gly Phe Ala Val Ala Gly Val Ser Gly
245 250 255
Leu Gly Gln Ala Tyr Pro Glu Leu Glu Ala Phe Val Glu Pro Arg Leu
260 265 270
Asn Ala Lys Gly Gln Glu Ala Leu Lys Lys Phe Arg Ser Arg Gly Phe
275 280 285
Cys Ile Gly Gln Val Val Thr Asn Glu Asn Phe Val Asp Ile Tyr Thr
290 295 300
Leu Val Asn Asp Ser Asn Ile Leu Asn Gln Pro Ile Pro Ser Glu Val
305 310 315 320
Leu Ala Lys Glu Thr Leu Leu Gln Ser Gln Ala Ser Tyr Thr Val Pro
325 330 335
Val Pro Lys Phe Pro Arg Phe Ile Trp His Ala Leu Glu Asp Glu Ile
340 345 350
Val Pro Phe Ile Pro Ala Gln Lys Tyr Val Gln Glu Gln Cys Ala Lys
355 360 365
Gly Ala Asn Ile Asn Trp Asn Val Phe Pro Ile Ala Glu His Leu Thr
370 375 380
Ala Glu Ile Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Tyr Trp Leu Ser Gln Ala
385 390 395 400
Tyr Ala Gly Lys Ala Pro Lys Val Thr Cys Gly Gly Gly Thr Pro Ala
405 410 415
Ile Thr Gly Val Thr Ser Pro Ser Ala Gln Gln Val Leu Gly Ala Asp
420 425 430
Leu Ala Lys Gln Leu Ser Ser Leu Asn Gly Lys Gln Ser Ala Phe Gly
435 440 445
Lys Pro Phe Gly Ser Ile Thr Pro Pro Thr Ser
450 455
<210> 8
<211> 457
<212> PRT
<213> Melanopsichium pennsylvanicum 4
<400> 8
Met Arg Phe Phe Ser Arg Ala Val Ile Gly Leu Ala Ala Val Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Ile Ala Met Pro Thr His Lys Arg Ala Ala Phe Pro Asp Pro
20 25 30
Asn Asp Asp Ser Phe Tyr Gln Asn Pro Ala Asn Ile Ala Thr Tyr Ala
35 40 45
Asn Gly Gln Ile Ile Gln Ser Arg Asn Val Val Thr Asp Ile Gly Asn
50 55 60
Asn Asn Lys Ala Asp Ser Phe Gln Leu Ser Tyr Arg Thr Thr Asn Thr
65 70 75 80
Gln Lys Asp Ala Val Ala Asn Val Ala Thr Ile Phe Ile Pro Ser Lys
85 90 95
Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser Tyr Gln Val Tyr Glu Asp Ser
100 105 110
Thr Gln Leu Asn Cys Ala Pro Ser Tyr Asn Tyr Leu Thr Gly Phe Asp
115 120 125
Glu Pro Asn Lys Val Thr Thr Ser Leu Asp Thr Pro Ile Ile Ile Ser
130 135 140
Trp Ala Leu Asn Gln Gly Tyr Tyr Val Val Ser Ser Asp Ala Glu Gly
145 150 155 160
Gln Arg Ser Ala Phe Ile Ala Gly Tyr Glu Glu Gly Met Ala Ile Leu
165 170 175
Asp Ala Ile Arg Ala Leu Lys Asn Tyr Lys Ser Leu Pro Lys Asp Thr
180 185 190
Glu Thr Ala Leu Tyr Gly Tyr Ser Gly Gly Ala His Ala Thr Ala Trp
195 200 205
Ala Val Ser Leu Ser Ala Ser Tyr Ala Pro Asp Ile Asn Ile Ile Gly
210 215 220
Ala Ala Tyr Gly Gly Thr Pro Thr Ser Ala Lys Asp Thr Phe Asn Tyr
225 230 235 240
Leu Asn Lys Gly Leu Phe Ala Gly Phe Ala Val Ser Gly Val Ser Gly
245 250 255
Leu Ala Leu Ala His Pro Asp Met Glu Ser Phe Ile Glu Pro Arg Leu
260 265 270
Asn Ala Val Gly Gln Gln Val Phe Gln Lys Val Arg Ser Arg Gly Tyr
275 280 285
Cys Ile Val Gln Val Ser Thr Asn Asn Asn Leu Arg Asp Val Tyr Thr
290 295 300
Leu Val Asn Asp Thr Asn Leu Leu Asn Glu Glu Pro Ile Lys Ser Ile
305 310 315 320
Leu Ala Leu Glu Thr Leu Val Gln Ala Glu Ala Ser Tyr Thr Val Pro
325 330 335
Val Pro Lys Phe Pro Arg Phe Met Trp His Ala Leu Pro Asp Glu Ile
340 345 350
Val Pro Phe Gln Pro Ala Ala Asp Tyr Val Gln Glu Gln Cys Ser Lys
355 360 365
Gly Ala Asn Ile Asn Trp Asn Val Tyr Pro Ile Ala Glu His Val Thr
370 375 380
Ala Glu Ile Phe Gly Ile Ile Pro Ala Leu Asp Trp Leu Gly Lys Val
385 390 395 400
Tyr Ser Gly Asn Ala Pro Lys Val Ala Cys Gly Gly Gly Val Pro Gly
405 410 415
Ile Ala Gly Val Thr Thr Pro Pro Ala Asn Asp Val Leu Gly Ser Ala
420 425 430
Leu Ala Gln Gln Leu Gly Asn Leu Ser Gly Lys Thr Ser Ala Phe Gly
435 440 445
Lys Pro Phe Gly Thr Ile Thr Pro Ser
450 455
<210> 9
<211> 458
<212> PRT
<213> Kurtzmanomyces sp. I-11
<400> 9
Met Arg Phe Phe Leu Arg Ala Val Leu Gly Leu Ala Val Thr Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Leu Ala Ala Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Pro Asp Pro
20 25 30
Asn Glu Asp Pro Phe Tyr Ser Thr Pro Ser Asn Ile Glu Thr Phe Ala
35 40 45
Asn Gly Gln Ile Ile Gln Ser Arg Lys Val Pro Thr Asp Ile Gly Asn
50 55 60
Ser Asn Asn Ala Ala Ser Tyr Gln Leu Ser Tyr Arg Thr Thr Asn Thr
65 70 75 80
Gln Glu Asp Ala Val Ala Asn Val Ala Thr Ile Trp Ile Pro Ala Lys
85 90 95
Pro Ser Ser Pro Pro Arg Ile Phe Thr Tyr Gln Val Tyr Glu Asp Ser
100 105 110
Thr Gln Leu Asp Cys Ala Pro Ser Tyr Ser Tyr Leu Thr Gly Tyr Asp
115 120 125
Gln Pro Asn Lys Ala Thr Ala Val Leu Asp Thr Pro Ile Val Ile Ser
130 135 140
Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val Val Ser Ala Asp His Glu Gly
145 150 155 160
Ala Arg Ser Ala Phe Ile Ala Gly Tyr Glu Glu Gly Met Ala Ala Leu
165 170 175
Asp Gly Ile Arg Ala Leu Arg Asn Tyr Ala Lys Leu Pro Gln Asp Ser
180 185 190
Ala Val Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Gly Gly Ala His Ala Thr Val Trp
195 200 205
Ala Thr Ser Leu Ala Ala Ala Tyr Ala Pro Glu Ile Asn Phe Ile Gly
210 215 220
Ala Ala His Gly Gly Thr Pro Val Ser Ala Lys Asp Thr Phe Thr Phe
225 230 235 240
Ile Asn Gly Gly Phe Phe Ala Gly Phe Ala Ile Ala Gly Val Ser Gly
245 250 255
Leu Ala Asn Ala His Pro Asp Met Glu Ala Phe Ile Gln Pro Arg Leu
260 265 270
Asn Ala Glu Gly Val Lys Thr Leu Lys Gln Ile Arg Ser Arg Gly Phe
275 280 285
Cys Leu Pro Glu Val Val Thr Thr Tyr Pro Phe Lys Asn Val Phe Ala
290 295 300
Leu Val Asn Asp Thr Asn Leu Leu Thr Glu Gln Pro Ile Ser Gly Ile
305 310 315 320
Leu Gln Gln Glu Thr Leu Val Gln Ser Glu Ala Ser Tyr Ala Val Pro
325 330 335
Val Pro Lys Phe Pro Arg Phe Leu Trp His Ala Ala Leu Asp Glu Ile
340 345 350
Val Pro Tyr Val Pro Val Thr Glu Tyr Val Lys Glu Gln Cys Ala Lys
355 360 365
Gly Ala Asn Ile Asn Phe Asn Thr Tyr Pro Ile Ala Glu His Leu Thr
370 375 380
Ala Glu Ile Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Trp Phe Leu Ser Gln Ala
385 390 395 400
Tyr Glu Gly Lys Ala Pro Ala Val Gln Cys Gly Thr Ala Leu Pro Ala
405 410 415
Ala Pro Ser Ala Gln Gln Val Leu Gly Asn Asp Leu Ala Asn Gln Leu
420 425 430
Ser Ser Leu Asn Gly Lys Gln Ser Pro Phe Gly Lys Pro Phe Gly Pro
435 440 445
Ile Ser Pro Thr Ser Leu Asp Lys Leu Leu
450 455
<210> 10
<211> 1389
<212> DNA
<213> Pseudozyma antarctica
<400> 10
atgcgagtgt ccttgcgctc cattacctcg ctgctggcgg cggcaacggc agctgtgctc 60
gcggctccgg cggccgagac gctggaccga cgggcggcgc tgcccaaccc ctacgacgat 120
cccttctaca cgacgccatc caacatcggc acgtttgcca agggccaggt gatccaatct 180
cgcaaggtgc ccacggacat cggcaacgcc aacaacgctg cgtcgttcca gctgcagtac 240
cgcaccacca acacgcagaa cgaggcggtg gccgacgtgg ccaccgtgtg gatcccggcc 300
aagcccgctt cgccgcccaa gatcttttcg taccaggtct acgaggatgc cacggcgctc 360
gactgtgctc cgagctacag ctacctcact ggattggacc agccgaacaa ggtgacggcg 420
gtgctcgaca cgcccatcat catcggctgg gcgctgcagc agggctacta cgtcgtctcg 480
tccgaccacg aaggcttcaa agccgccttc atcgctggct acgaagaggg catggctatc 540
ctcgacggca tccgcgcgct caagaactac cagaacctgc catccgacag caaggtcgct 600
cttgagggct acagtggcgg agctcacgcc accgtgtggg cgacttcgct cgctgaatcg 660
tacgcgcccg agctcaacat tgtcggtgct tcgcacggcg gcacgcccgt gagcgccaag 720
gacaccttca cattcctcaa cggcggaccc ttcgccggct ttgccctggc aggtgtttcg 780
ggtctctcgc tcgctcatcc tgacatggag agcttcattg aggcccgatt gaacgccaag 840
ggtcagcagg cgctcaagca gatccgcggc cgtggcttct gcctgcctgg ggtggtgttg 900
acctacccct tcctcaacgt cttctcgctg gtcaacgaca cgaacctgct gaatgaggcg 960
ccgatcgtta gcatcctcaa gcaggagacg gtggtccagg ccgaagcgag ctacacagtg 1020
tcggtgccca agttcccgcg cttcatctgg catgcggtcc ccgacgagat cgtgccgtac 1080
cagcctgccg ctacctacgt caaggagcaa tgtgccaagg gcgccaacat caacttttcg 1140
ccctacccga tcgccgagca cctcaccgcc gagatctttg gtctggtgcc tagcctgtgg 1200
tttatcaagc aagccttcga cggcaccacg cccaaggtga tctgcggcac tcccatccct 1260
gctatcgctg gcatcaccac gccctcggcg gaccaggtgc tgggttcgga cctggccgac 1320
cagctgcgca gcctcaacgg caagcagagt gcgttcggca agccctttgg ccccatcaca 1380
ccgccttag 1389
<210> 11
<211> 1587
<212> DNA
<213> Pseudozyma aphidis
<400> 11
atgagacatc gtctcgatgg atcgatcgtt ggatcgattg gggcagccat cgcctataaa 60
ggccagccat ccagcccgca agagtatgct agaagcctca agcgacttca ctccctctct 120
tcccaccctt cctcctcatc ccctcgaccc gagccctacc ctctcgctcc cttgcgtctc 180
cctcccacct ttcgaacgat gcgagtgtcc ttgcgctcca ttacctcgct gctggcggcg 240
gcaacggcgg ctgtgctcgc ggctccggca accgagacgc tggaccgacg ggcggcgctg 300
cccaacccct acgacgatcc cttctacacg acgccatcca acatcggcac gtttgccaag 360
ggccaggtga tccaatctcg caaggtgccc acggacatcg gcaacgccaa caacgctgcg 420
tcgttccagc tgcagtaccg caccaccaat acgcagaacg aggcggtggc cgacgtggcc 480
accgtgtgga tcccggccaa gcccgcttcg ccgcccaaga tcttttcgta ccaggtctac 540
gaggatgcca cggcgctcga ctgtgctccg agctacagct acctcactgg attggaccag 600
ccgaacaagg tgacggcggt gctcgacacg cccatcatca tcggctgggc gctgcagcag 660
ggctactacg tcgtctcgtc cgaccacgaa ggcttcaaag ccgccttcat cgctggctac 720
gaagagggca tggctatcct cgacggcatc cgcgcgctca agaactacca gaacctgcca 780
tccgacagca aggtcgctct tgagggctac agtggcggag ctcacgccac cgtgtgggcg 840
acttcgcttg ctgactcgta cgcgcccgag ctcaacattg tcggtgcttc gcacggcggc 900
acgcccgtga gcgccaagga cacctttaca ttcctcaacg gcggaccctt cgccggcttt 960
gccctggcgg gtgtttcggg tctctcgctc gctcatcctg atatggagag cttcattgag 1020
gcccgattga acgccaaggg tcagcagacg ctcaagcaga tccgcggccg tggcttctgc 1080
ctgccgcagg tggtgttgac ctaccccttc ctcaacgtct tctcgctggt caacgacacg 1140
aacctgctca acgaggcgcc gatcgctggc atcctcaagc aggagacggt ggtccaggcc 1200
gaagcgagct acacggtatc ggtgcccaag ttcccgcgct tcatctggca tgcgatcccc 1260
gacgagatcg tgccgtacca gcctgccgct acctacgtca aggagcaatg tgccaagggc 1320
gccaacatca atttttcgcc ctacccgatc gccgagcacc tcaccgccga gatctttggt 1380
ctggtgccta gcctgtggtt tatcaagcaa gccttcgacg gcaccacacc caaggtgatc 1440
tgcggcactc ccatccctgc tatcgctggc atcaccacgc cctcggcgga ccaggtgctg 1500
ggttcggacc tggccaacca gctgcgcagc ctcaacggca agcagagtgc gttcggcaag 1560
ccctttggcc ccatcacacc accttag 1587
<210> 12
<211> 1293
<212> DNA
<213> Pseudozyma hubeiensis
<400> 12
atgcatacca gggagacgtt gccggatcca aacgatgatc ctttttacgc ccagccgtcc 60
aacatcgcct cgtacgccaa tggccaagtc attcagtctc gaaaggtaga caccgagatt 120
ggctctatca acaacgtgaa caccttccag gtcaagtacc gtaccacaaa cacgcaaaac 180
caggcgcagt ccaacctcgc gactgtctgg atcccctcca agcctgcatc gccgcccaag 240
atcttcagct accaagtcta catggatgcc acccagatcg actgcgctcc gagctacagc 300
tatgtcaccg gcttggacaa gccaggcaag ggcaccgtca tcttggacac acccatcgtc 360
atcagctggg cgctccagca gggctactac gtcgtttcgt ccgacgatga aggtcccaga 420
gctgccttca tcgccgggta cgaggaaggt aaggccgtcc tcgacggcat tcgcgcgctc 480
cagaactacg ccaacttgcc caaggacagc cccatcggaa tgtatggata cagcggaggt 540
gcccatacca ccggatgggc cgttaacctg gctggctcgt acgcttccga gctcaacatc 600
atcggcgctg cctacggagg acttcctgca agcgccaagg acaccttcac cttcctcaac 660
ggcaagagca tcttctccgg ctttgccctt gcgggcgtct cgggccttgc cctcggtcat 720
ccggacatgg aggctttcat caagccgcgc ctcaatgcca agggcaacca aaccttggcc 780
cagatccgaa gccgtggtga atgtatcggc caagttgctc tgggttatcc tttccttgac 840
gtcttctcgc tcgtcaacga caccaacctg ctcaatgaag agcccattgt cagcatcctc 900
aagaccgaaa cgctggtgca agccgaagcg agctacacag ttcccgtccc caaattcccg 960
cgattcatgt ggcacgcgct accagacgag attgttcctt tccaaccggc acaagattat 1020
gtcactgaac agtgtgccaa gggcgccgac attaactgga acgtctaccc aattgccgag 1080
cacatttctg ccgagctctt ggggttgttg cctggtatcg actggttgag caaggcctat 1140
aagggtcaag caccgaaagt tgcatgcggc ggtggtgtac ctgcaacacc tccgcctgcg 1200
gaagacgtgc tcggaggcga cctggcgagc cagttccgct ccctgaacgg caagcagtct 1260
gcttacggca agcctttcaa cgccggattc tga 1293
<210> 13
<211> 1377
<212> DNA
<213> Ustilago hordei
<400> 13
atgaggttct tccttggagc tgtgctcgcc ctggccgcag cagccatcgc tgcgctcgct 60
gtacccatgg agaggcgagc tcagttcccg gatcccaacg aggacccctt ctaccagcaa 120
ccgtcgaacg tggccaccta cgccaacggt cagatcatcc gatcacgcaa agctgacacc 180
gacatcggca actcgaacaa ggcccaagcc tttcagctta gctaccgcac caccaacacg 240
cagcagcaag ctcaagccaa cgtcgctacc gtttggatcc ctgctaagcc tgcctctccg 300
cccaagatct tctcctacca ggtctacgag gactcgacgc agctcgactg tgctccaagc 360
tacagctacc tggccggttt tgatcctccc aataaggcta ctaccatcct tgatacttcg 420
ctcatcatcg gctgggcgct tcagcagggt tactacgtcc tctcctccga tcatgagggc 480
cctcgagctg cctttattgc tggttacgaa gagggtatgg ctatccttga cgctattcgt 540
gctttgcaga acttcaggca tctgccaaag gacagccccg ttggcatgta tggttattcg 600
ggaggcgccc atgctactgt ttgggcagag tcgcttgctg gatcctatgc acctgagatc 660
aacatcatcg ctactgccca cggtggcacc cccttcagta caaaggacac tttcaccttt 720
atcaacggcg gtgtctttgc tggtttcgct attgctggtg tctccggttt ggcccttgtt 780
catcctgcta tgcaagctta catcaagcct cggttgaatg ctcaaggcgt caaggtgttt 840
caacagattc gaagtcgtgc attctgcatc gctcaagtcg ttttcaccta ccctttcacc 900
aacgttttca acctggtcaa cggcaccgac ttgctcaatc aagaaccgat ccgttccatc 960
ctcaaacgag agactcttgt tcaatccgaa gcctcttgcg atgttcctgt tgtccgtgca 1020
cctcgtttca tttggcacgc cgcgctcgat gagatcgttc cgtatgcacc tgccgctcag 1080
tatgttaaag agcaatgcga caagggtgca caaatccatt tcgagacata tcctatcgcc 1140
gaacacttca gcgcagagtt ctttggcctt gttcctgctc tctggttcct tagccaagcc 1200
tacgctggga aagctgccaa gacggtctgc ggaactagca ttcctgccat tcctggcttt 1260
accgttccct ctgcagagga ggtcttgggt gccgaccttg ctaagcagct taagggcttg 1320
agcgccaagg atttgagcgc caaggatttg agcggcaagc acttgccggc tttgtga 1377
<210> 14
<211> 1377
<212> DNA
<213> Ustilago maydis
<400> 14
atgaggttca ttgctgttcg ggctatcgtg acgctagcgg ctgcagccgc cgtgtcgctt 60
gcagtgccca cagagcgaag ggcagcgttc gccgatccaa acgacgatct cttctacacc 120
acgccggaca acatcaacac atatgccaat ggtcaggtca tccagtcacg caaggctgat 180
accgatattg ggaacagcaa caaggttgaa gctttccagc ttcaatatcg cactaccaat 240
acgcaaaagg aggcgcaggc caacgttgct accgtatgga tccccaacaa gcccgcttca 300
cctcccaaga tcttctctta tcaggtctat caggactcga cacagctcaa ctgtgctccg 360
agctatagct ttttgaaggg ccttgacaag cctaacaaag ctaccacgat cctcgaagca 420
cccatcatca tcggctgggc gctccaacaa ggtttctacg tcgtctcgtc tgatcacgaa 480
ggcccgcgct catcgttcat tgcgggctac gaggaaggta tggctattct cgacggcata 540
cgtgcgctca agaactacgc caaactgccc acggacagcg cgatcggctt ttacggatac 600
agcggcggtg cccatgcaac cggctgggca gctaatctgg cagggagcta cgctcctgag 660
cacaacatca tcggtgctgc ctacggagga ctgcctgcta gcgccagaga cacattcaac 720
ttcctcaaca aaggcgcgtt tgccggcttc gccattgcgg gtgtctcggg tcttgcgctg 780
gcctacccgg acgtggagac ctacatccag tcgcgcctca acgccaaggg agaaaaggtg 840
tttaaacagg tccgaagtcg cggcttctgc attggccaag tggtcctaac ctacccattc 900
gtcgacgcct attcactcat caacgacaca aaccttctca acgaggaacc ggtcgccagc 960
acgttgaaat ccgagacgtt ggttcaggcc gaggctagct acacggttcc tgttcccaaa 1020
ttcccgcgtt tcatctggca tgcgctcttg gacgagattg ttcccttcca ctcggctgcg 1080
acctatgtca aggagcagtg ttcaaagggc gccgacatca actggaatgt ctactcattt 1140
gccgagcaca tctctgccga gcttttcggc ttgctgcctg gtctcgactg gttaaacaag 1200
gcttacaagg gtcaagcacc caaagtgcct tgtggcggag gggctcaaag cgtgatgggt 1260
gcctcaggcc cgcctgcgca ggacgttctg ggagctgacc tggcaagcca actccgatct 1320
ctccagggta agccttctgc gtttggcaac aaaccttttg gctccatctc cccctga 1377
<210> 15
<211> 1380
<212> DNA
<213> Sporisorium reilianum
<400> 15
atgagattct ttgcgcagac cctagtcgcg ctggcagccg ccgccacggt ttcgctcgct 60
gcgcccttgg agcgaagggc gcagttccct gaccccaacg acgacccgtt ctactcggcg 120
ccggccaaca tcggctcgta cgtcaacggc caggtgatcc agtcgcgctc ggcgaccacg 180
gacatcggca cgtcgaacaa tgcggcgtcg ttccaactgc tgtaccgaac caccaacacg 240
tcgaacctgc ccgaggcgac ggtggcgacc gtgtggatac ctgccaagcc ggcgtcgccg 300
cccaagatct tctcgtacca ggtgtacgag gatgctacgc agctcaactg cgctccgtcg 360
tacagctatc tctcgggctt ggacgagcct ggcaagggca ccgtgatcct ggacacgccc 420
atcgtcatca gctgggcgct gcagcagggc tactacgtcg tgtcggccga ccacgagggg 480
cccaaggcgg cgttcatcgc tggatgccag gagggtcgcg ccatcctcga cggcgtgcgc 540
gcgctgagga acttccagaa cctggcttcg aacagcgcgg tcggattcta cggctacagc 600
ggcggtggac acgcgacggg ctgggcggtg agcctggctg gctcgtatgc tccggacgtc 660
aacatcatcg gtgctgcgta cggtggagtg ccgacgagca cgagggacat cttcaacttc 720
ctcaacggcg gtgcctttgc tggattcgcc gtggcgggtg tctctggcct cggactggcg 780
tatcccgagc tggaggcgta cattgaacct cgactgaacg ccaaggggca ggacgcgctc 840
aagcgcttcc gcagccgcgg atactgtatc ggccaagtgg tgacgagcga aaactttgtc 900
gacatctaca cgctggtcaa cgacagcaac atcctcaacg agcccatccc ttcgcaggtg 960
ctggccaagg agacgctgct gcagacgcag gcgagctaca cggtgcccgt gcccaagtcc 1020
ccgcgattca tctggcatgc gctcgaggac gagattgtgc cgttcaagcc ggcgcagcag 1080
tatgtgacgg agcagtgtgc caaaggcgcc aacatcaact ggaacgtgtt cccgatcgct 1140
gagcacatca gtgctgagct cttcggcttg gtgcccggtc tcgactggct gagcaaggcc 1200
tacaggggac aggcgcccaa ggtgatctgc ggttcgagca ttcccgccat cacaggagtc 1260
aattcgccgt cggcacagca agtgcttgga gctgatctgg cacagcagct gagcaacctc 1320
aacggcaagc agtcggcgtt tggcaagcct tacgggccca tcacacctcc cacggcctga 1380
<210> 16
<211> 1380
<212> DNA
<213> Sporisorium scitamineum
<400> 16
atgaagttct ttccgcaagc cgtcgtcgcg ctagcagccg cagccacggc agcactggct 60
gtgcccatgc agaagagggc gcaataccca gacccgaacg acgatccttt ctactcggtg 120
ccagccaaca ttggctcgta ctccaacggt caggtgatcc agtcgcgttc ggccaccacc 180
gatatcggta acgctaacaa tgcgctctcg tttcagttgc tctaccgaac caccaacacc 240
tcgaaccaag ccgacgcgac tgtagccacc gtgtggatcc ccgccaagcc agcgtcaccg 300
cccaagatct tctcgtacca ggtgtatgaa gacgcaacgc agctcgactg tgctccatcg 360
tacaactacc tgtctggact cgaacagccc ggcaaggcca ccgtcatcct cgatacgccc 420
attatcatcg gctgggcgct gcagcagggc tactacgttg tctcggccga ccacgagggt 480
cccaaggcgg cgttcatcgc tggataccaa gagggtaggg ccatcctgga cggtattcgt 540
gctctgagga actttaagga cctgccttcg agcagcgccg tcggatttta cggctacagc 600
ggtggtggac acgctactgg ctgggcggtc aacctggccg actcgtacgc tccggacgtc 660
aacattatcg gtgctgccta cggcggattg cctgccagca cgagggacat tttcaacttc 720
ctcaacggag gtgtctttgc tggtttcgcg gtcgctggtg tctctggcct cggacaggcg 780
taccctgagc tggaggcttt tgtcgagcct cgactcaacg ccaagggtca ggaggcgctc 840
aagaagttcc gtagccgtgg cttctgcatt ggacaagtgg tgaccaacga gaactttgtc 900
gacatctaca cgctcgtcaa cgacagcaac atcctcaacc agccgattcc gtctgaggtc 960
ttggcgaaag aaacgctgct ccagtcgcag gcgagctaca cggttccggt tcccaagttc 1020
ccacgattca tctggcatgc gctcgaggac gagatcgttc ccttcattcc tgcgcagaag 1080
tacgtgcagg agcagtgtgc caagggtgcc aacatcaatt ggaacgtctt ccccatcgct 1140
gagcacctta ctgctgaaat ctttggcttg gtgcccggtc tctactggct tagccaagcg 1200
tacgctggta aagcacccaa ggtgacgtgc ggtggtggta ctcctgccat cacgggtgtc 1260
acgtcgccgt cggcacagca agtgttggga gccgatctgg cgaagcagct gagcagtctc 1320
aacggcaagc agtccgcttt cggcaagcca tttggttcca tcacgcctcc gacatcgtaa 1380
<210> 17
<211> 1374
<212> DNA
<213> Melanopsichium pennsylvanicum
<400> 17
atgaggttct tctctcgagc agtcattgga ctggctgcag tagccactgc tgcaatcgcc 60
atgcccacgc acaagcgtgc tgctttccct gatcccaatg acgattcctt ctaccagaat 120
cccgccaaca tcgccactta cgcaaacggt caaatcatcc agtcgcgcaa cgtcgttacc 180
gacattggca acaacaataa ggccgactcg ttccaacttt cctaccgcac caccaacacc 240
caaaaagacg ccgttgctaa cgtagccacc attttcatcc ccagcaagcc cgcctctcct 300
cccaagatct tctcgtacca ggtgtacgaa gactcgactc agctgaattg tgcacccagc 360
tacaattacc tcactggctt cgatgagccc aacaaggtta ccacgtctct agacacaccc 420
atcatcatca gttgggccct caatcaaggc tactacgtcg tctcctctga tgccgaggga 480
caacgctccg ctttcattgc tggttacgaa gagggtatgg ccatccttga cgcaattcgt 540
gcacttaaga attacaagtc tttgcccaaa gacaccgaga ccgccttata tggctatagt 600
ggtggagccc acgcaaccgc ctgggctgtt agcctttccg catcgtacgc tcctgacatc 660
aacatcatcg gtgctgccta tggaggtaca cccaccagcg ccaaggacac tttcaattac 720
ctcaacaagg gcctctttgc tggcttcgct gtttctggtg tctcaggtct cgcccttgct 780
cacccggata tggagagttt tatcgagcct cgcctcaatg ccgtgggtca gcaggtcttc 840
cagaaggtcc gaagccgcgg ttactgtatc gttcaggttt cgaccaacaa caatttacgc 900
gacgtctaca cgcttgtcaa cgacaccaat ttgctcaacg aggaacccat caagagcatt 960
cttgcgctcg agacgctggt tcaggctgag gctagctaca cagtgccagt cccaaagttc 1020
ccgaggttca tgtggcacgc tttgcctgac gaaattgtgc cattccagcc tgctgctgac 1080
tacgtccagg aacagtgctc gaaaggagcc aacatcaatt ggaatgtgta tcctattgct 1140
gagcacgtca cagctgagat cttcggtatc atccccgccc tcgactggct cggcaaggtc 1200
tacagcggta atgcgccaaa ggtggcctgc gggggcggtg ttccaggtat tgctggtgtt 1260
acaactcccc ctgccaacga cgtgctcggt tctgcgcttg ctcagcagct tggcaacctt 1320
agcggtaaga cgtcggcatt cgggaagcct ttcggcacca tcacgccttc ttaa 1374
<210> 18
<211> 1377
<212> DNA
<213> Kurtzmanomyces
<400> 18
atgcgcttct tccttcgagc cgtgctcgga ctggcggtca cagcgactgc agcactcgct 60
gcccccctgg agcctagagc cgcactcccg gatccaaatg aagatccgtt ttactcgaca 120
ccgtccaata tcgagacgtt cgccaacggt caaatcatcc agtcgcgcaa ggttcccacc 180
gacattggca actcgaacaa tgccgcttcg taccagctgt cgtaccgcac cacaaacaca 240
caagaggatg ctgttgctaa cgttgctacc atctggatcc cggccaagcc atcgtcaccg 300
ccacgtatct tcacttatca ggtttacgag gactcgaccc aactcgattg tgcacctagc 360
tacagctacc ttactggata cgatcagccc aacaaggcaa cggctgttct cgacactccg 420
atcgtcatca gctgggcctt gcaacagggc tattatgtgg tctctgcaga ccatgaagga 480
gcccgctctg ccttcatcgc tggctacgaa gaaggcatgg cggcccttga cggtattcgt 540
gcgctcagaa attacgcaaa actaccacag gacagcgctg tcggagccta cggctattct 600
ggaggagccc atgctaccgt ttgggcaact tccttggctg ctgcctatgc tcctgagatc 660
aacttcatcg gtgctgctca tggtggaaca cccgttagcg cgaaggatac cttcactttc 720
atcaacggcg gtttcttcgc tgggtttgcc attgctggtg tctcaggttt ggccaacgct 780
caccctgata tggaagcctt catccagccc cgtctgaacg ctgagggtgt caaaacactc 840
aaacagatcc gaagccgagg cttctgcctt cccgaggtgg tcactactta tcctttcaag 900
aacgtcttcg ccctggtcaa tgacacgaac ctgctcactg agcagcccat ctccggcatc 960
ttgcagcaag agacgcttgt tcaatcggag gcgagctacg ctgtacctgt ccctaagttt 1020
ccccgcttct tgtggcatgc tgctctcgac gagatcgtcc cctacgtacc tgtcaccgag 1080
tatgtcaaag aacagtgtgc caagggcgcc aacatcaact tcaacaccta cccgatcgcc 1140
gagcatctca ctgccgaaat cttcggtctc gttccaggtc tttggttctt gagccaggct 1200
tacgagggca aggcaccggc ggttcagtgc ggaactgcac ttcctgcggc tccttctgct 1260
caacaggtac ttggaaacga cttggccaac caattgagca gcctcaacgg caagcaatct 1320
ccgtttggca agccattcgg ccccataagc ccgacttcgc ttgacaagtt gctgtag 1377
<210> 19
<211> 1029
<212> DNA
<213> Pseudozyma antactica
<400> 19
atgaagctac tctctctgac tggtgtggct ggtgtgcttg cgacttgcgt tgcagccact 60
cctttggtga agcgtctacc ttccggttcg gaccctgcct tttcgcagcc caagtcggtg 120
ctcgatgcgg gtctgacctg ccagggtgct tcgccatcct cggtctccaa acccatcctt 180
ctcgtccccg gaaccggcac cacaggtcca cagtcgttcg actcgaactg gatccccctc 240
tcaacgcagc tgggttacac tccctgctgg atctcacccc cgccgttcat gctcaacgac 300
acccaggtca acacggagta catggtgaac gccatcacca cgctctacgc tggttcgggc 360
aacaacaagc ttcccgtgct cacctggtcc cagggtggtc tggttgcaca gtggggtctg 420
accttcttcc ccagtatcag gtccaaggtc gatcgactta tggcctttgc gcccgactac 480
aagggcaccg tcctcgccgg ccctctcgat gcactcgcgg ttagtgcacc ctccgtatgg 540
cagcaaacca ccggttcggc actcaccacc gcactccgaa actcaggtgg tctgacccag 600
atcgtgccca ccaccaacct ctactcggcg accgacgaga tcgttcagcc ccaggtgtcc 660
aactcgccac tcgactcatc ctacctgttc aacggaaaga acgtccaggc acaggccgtg 720
tgtgggccgc tgttcgtcat cgaccatgca ggctcgctca cctcgcagtt ctcttacgtc 780
gtcggtcgat ccgccctgcg ctccaccacg ggccaggctc gtagtgcaga ctatggcatc 840
acggactgca accctcttcc tgcaaatgat ctgactcccg agcaaaaggt cgccgcggct 900
gcgctcctgg cgccggcagc tgcagccatc gtggcgggtc caaagcagaa ctgcgagccc 960
gacctcatgc cctacgcccg cccctttgca gtaggcaaaa ggacctgctc cggcatcgtc 1020
accccctga 1029
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 20
tttggtacca tgcgagtgtc cttg 24
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 21
gcagaattcc taaggcggtg tg 22
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 22
cgaggtacca tgaagctact ctc 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 23
tgagaattct cagggggtga cg 22
<210> 24
<211> 458
<212> PRT
<213> Pseudozyma tsukubaensis
<400> 24
Met Arg Phe Phe Leu Arg Ala Val Leu Gly Leu Ala Val Thr Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Leu Ala Ala Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Pro Asp Pro
20 25 30
Asn Glu Asp Pro Phe Tyr Ser Thr Pro Ser Asn Ile Glu Thr Phe Ala
35 40 45
Asn Gly Gln Ile Ile Gln Ser Arg Lys Val Pro Thr Asp Ile Gly Asn
50 55 60
Ser Asn Asn Ala Ala Ser Tyr Gln Leu Ser Tyr Arg Thr Thr Asn Thr
65 70 75 80
Gln Glu Asp Ala Val Ala Asn Val Ala Thr Ile Trp Ile Pro Ala Lys
85 90 95
Pro Ser Ser Pro Pro Arg Ile Phe Thr Tyr Gln Val Tyr Glu Asp Ser
100 105 110
Thr Gln Leu Asp Cys Ala Pro Ser Tyr Ser Tyr Leu Thr Gly Tyr Asp
115 120 125
Gln Pro Asn Lys Ala Thr Ala Val Leu Asp Thr Pro Ile Val Ile Ser
130 135 140
Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val Val Ser Ala Asp His Glu Gly
145 150 155 160
Ala Arg Ser Ala Phe Ile Ala Gly Tyr Glu Glu Gly Met Ala Ala Leu
165 170 175
Asp Gly Ile Arg Ala Leu Arg Asn Tyr Ala Lys Leu Pro Gln Asp Ser
180 185 190
Ala Val Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Gly Gly Ala His Ala Thr Val Trp
195 200 205
Ala Thr Ser Leu Ala Ala Ala Tyr Ala Pro Glu Ile Asn Phe Ile Gly
210 215 220
Ala Ala His Gly Gly Thr Pro Val Ser Ala Lys Asp Thr Phe Thr Phe
225 230 235 240
Ile Asn Gly Gly Phe Phe Ala Gly Phe Ala Ile Ala Gly Val Ser Gly
245 250 255
Leu Ala Asn Ala His Pro Asp Met Glu Ala Phe Ile Gln Pro Arg Leu
260 265 270
Asn Ala Glu Gly Val Lys Thr Leu Lys Gln Ile Arg Ser Arg Gly Phe
275 280 285
Cys Leu Pro Glu Val Val Thr Thr Tyr Pro Phe Lys Asn Val Phe Ala
290 295 300
Leu Val Asn Asp Thr Asn Leu Leu Thr Glu Gln Pro Ile Ser Gly Ile
305 310 315 320
Leu Gln Gln Glu Thr Leu Val Gln Ser Glu Ala Ser Tyr Ala Val Pro
325 330 335
Val Pro Lys Phe Pro Arg Phe Leu Trp His Ala Ala Leu Asp Glu Ile
340 345 350
Val Pro Tyr Val Pro Val Thr Glu Tyr Val Lys Glu Gln Cys Ala Lys
355 360 365
Gly Ala Asn Ile Asn Phe Asn Thr Tyr Pro Ile Ala Glu His Leu Thr
370 375 380
Ala Glu Ile Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Trp Phe Leu Ser Gln Ala
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Tyr Glu Gly Lys Ala Pro Ala Val Gln Cys Gly Thr Ala Leu Pro Ala
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Ala Pro Ser Ala Gln Gln Val Leu Gly Asn Asp Leu Ala Asn Gln Leu
420 425 430
Ser Ser Leu Asn Gly Lys Gln Ser Pro Phe Gly Lys Pro Phe Gly Pro
435 440 445
Ile Ser Pro Thr Ser Leu Asp Lys Leu Leu
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<210> 25
<211> 458
<212> PRT
<213> Pseudozyma tsukubaensis
<400> 25
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Ala Ala Leu Ala Ala Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Pro Asp Pro
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355 360 365
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370 375 380
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<212> DNA
<213> Pseudozyma tsukubaensis
<400> 26
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atcgtcatca gctgggcctt gcaacagggc tattatgtgg tctctgcaga ccatgaagga 480
gcccgctctg ccttcatcgc tggctacgaa gaaggcatgg cggcccttga cggtattcgt 540
gcgctcagaa attacgcaaa actaccacag gacagcgctg tcggagccta cggctattct 600
ggaggagccc atgctaccgt ttgggcaact tccttggctg ctgcctatgc tcctgagatc 660
aacttcatcg gtgctgctca tggtggaaca cccgttagcg cgaaggatac cttcactttc 720
atcaacggcg gtttcttcgc tgggtttgcc attgctggtg tctcaggttt ggccaacgct 780
caccctgata tggaagcctt catccagcct cgtctgaacg ctgagggtgt caaaacactc 840
aaacagatcc gaagccgagg cttctgcctt cccgaggtgg tcactactta tcctttcaag 900
aacgtcttcg ccctggtcaa tgacacgaac ctgctcactg agcagcccat ctccggcatc 960
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caacaggtac ttggaaacga cttggccaac caattgagca gcctcaacgg caagcaatct 1320
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Claims (7)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 리파아제를 코딩하는 외인성 핵산을 갖고,
만노실에리스리톨 리피드 산생능을 갖는,
슈도자이마·츠쿠바엔시스(Pseudozyma tsukubaensis)에 속하는 재조합 미생물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 기재된 재조합 미생물을 사용하여, 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 미생물을 식물 유지를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법.
- 삭제
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