KR102300260B1 - 생물 계면활성제 산생 재조합 미생물 - Google Patents

Abstract

MEL의 생산 효율을 높이는 수단을 제공하는 것. 리파아제를 코딩하는 외인성 핵산을 갖는 만노실에리스리톨 리피드 산생능을 갖는 재조합 미생물.

Description

생물 계면활성제 산생 재조합 미생물

미생물을 사용한 생물 계면활성제의 제조에 관한 기술이 개시된다.

리파아제는, 식물 유지 등의 유지류를 구성하는 트리글리세라이드의 에스테르 결합을 절단하여, 지방산과 글리세린으로 분해하는 효소이다. 리파아제는 많은 생물이 보유하고, 생체 내의 반응뿐만 아니라 많은 공업 용도로 사용되고 있다.

생물 계면활성제는 미생물이 생산하는 천연 계면활성제이며, 생분해성이 높고, 환경 저부하이며, 각종 유익한 생리 기능을 갖는다. 따라서, 생물 계면활성제를 식품 공업, 화장품 공업, 의약품 공업, 화학 공업, 환경 분야 등에서 사용하면, 환경 조화형 사회를 실현하는데 있어서 의미가 있다.

생물 계면활성제는 당지질계, 아실펩티드계, 인지질계, 지방산계 및 고분자계의 5가지로 분류된다. 이들 중에서도, 당지질계 계면활성제가 가장 많이 연구되어 있다. 이러한 당지질계 생물 계면활성제로서는, 만노오스에 에리스리톨이 글리코시드 결합한 만노실에리스리톨(이하, ME라고도 함)에, 추가로 지방산이 에스테르 결합한 만노실에리스리톨 리피드(이하, MEL이라고도 함), 그리고 람노리피드, 우스틸라진산, 트레할로스 리피드 및 소포로오스 리피드 등이 알려져 있다.

MEL에 대해서는, 식물 유지 등의 유지류를 원료로 제조된 예가 많이 보고되어 있다. 예를 들어, 비특허문헌 1 및 2에는, 칸디다·에스피(Candida sp.) B-7주를 사용하여 5질량％의 대두유로부터 5일간에 35g/L(생산 속도: 0.3g/L/h, 원료 수율: 70질량％)의 MEL의 생산이 가능한 것이 보고되어 있다. 비특허문헌 3 및 4에는, 칸디다·안타크티카(Candida antarctica) T-34주를 사용하여 8질량％의 대두유로부터 8일간에 38g/L(생산 속도: 0.2g/L/h, 원료 수율: 48질량％)의 MEL의 생산이 가능한 것이 보고되어 있다.

비특허문헌 5에는, 칸디다·안타크티카 T-34주를 사용하여 6일 간격으로 합계 3회의 순차 유가(流加)에 의해 24일 후에 25질량％의 피너츠유로부터 110g/L(생산 속도: 0.2g/L/h, 원료 수율: 44질량％)의 MEL의 생산이 가능한 것이 보고되어 있다. 비특허문헌 6에는, 칸디다·에스피 SY-16주를 사용하여 10질량％의 식물 유지로부터 회분 배양법에 의해 200시간에 50g/L(생산 속도: 0.25g/L/h, 원료 수율: 50질량％)의 MEL의 생산이 가능함과 함께, 유가 배양법에 의해 20질량％의 식물유로부터 200시간에 120g/L(생산 속도: 0.6g/L/h, 원료 수율: 50질량％)의 MEL의 생산이 가능한 것이 보고되어 있다.

MEL에는 결합하는 지방산 잔기 및 아세틸기의 위치 및 수 등이 상이한 각종 구조가 존재한다. 도 1에, 수소 원자, 아세틸기 및 탄소수 3 내지 18의 지방산 잔기를 R₁ 내지 R₅로 나타낸 MEL의 구조식을 나타낸다. R₁ 및 R₂가 지방산 잔기이며, 또한 R₃ 및 R₄가 아세틸기인 구조물은 MEL-A, R₃이 수소 원자이며 R₄가 아세틸기인 구조물은 MEL-B, R₃이 아세틸기이며 R₄가 수소 원자인 구조물은 MEL-C, R₃ 및 R₄가 수소 원자인 구조물은 MEL-D로 정의된다. 만노오스와 결합하는 에리스리톨의 히드록시메틸기가 1위치의 탄소에서 유래하거나, 4위치의 탄소에서 유래하거나 함으로써, 얻어지는 ME의 구조는 도 2의 (a), (b)에 나타내는 바와 같이 상이하다. 상기 칸디다·안타크티카 T-34주는 도 2의 (a)에 나타내는 4-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨을 당 골격으로 하는 화합물을 생성한다. 얻어지는 4-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨 리피드를 4-O-β-MEL이라고도 칭한다.

많은 종류의 미생물이 상기 4-O-β-MEL을 생성하는 것에 비하여, 슈도자이마·츠쿠바엔시스(Pseudozyma tsukubaensis)는 올리브유를 원료로, 도 2의 (b)에 나타내는 1-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨을 당 골격으로 하는 1-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨 리피드-B(이하, 1-O-β-MEL-B라고도 함)를 생성한다. 1-O-β-MEL-B는, 4-O-β-MEL-B와 비교하여 수화성이 향상되고, 베시클 형성능도 높다는 특징을 가지며, 스킨 케어제 등으로서 유망한 바이오 소재이다. 슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주는 20질량％의 올리브유로부터 7일간에 70g/L(생산 속도: 0.4g/L/h, 원료 수율: 35질량％)의 1-O-β-MEL-B의 생산이 가능한 것이 보고되고 있으며(비특허문헌 7 참조), 화장품 소재로서 판매되고 있다.

T. Nakahara, H. Kawasaki, T. Sugisawa, Y. Takamori and T. Tabuchi: J. Ferment. Technol., 61, 19(1983) H. Kawasaki, T. Nakahara, M. Oogaki and T. Tabuchi: J. Ferment. Technol., 61, 143(1983). D. Kitamoto, S. Akiba, C. Hioki and T. Tabuchi: Agric. Biol. Chem., 54, 31(1990). D. Kitamoto, K. Haneishi, T. Nakahara and T. Tabuchi: Agric. Biol. Chem., 54, 37(1990). D. Kitamoto, K. Fijishiro, H. Yanagishita, T. Nakane and T. Nakahara: Biotechnol. Lett., 14, 305(1992). 김, 윤병대, 가쯔라기 도오루, 다니 요시끼: 1998년 일본 생물공학회 대회 요지, p195. T. Morita, M. Takashima, T. Fukuoka, M. Konishi, T. Imura, D. Kitamoto: Appl. Microbiol. Biotechnol., 88, 679(2010)

MEL을 식품 공업, 의약품 공업 및 화학 공업 등에서 널리 보급시키기 위해서는, MEL의 생산 효율을 높이고, 생산 비용의 저감을 도모하는 것이 바람직하다. 그래서, 그러한 MEL의 생산 효율을 높이는 수단을 제공하는 것을 하나의 과제로 한다.

이러한 과제를 해결하도록 예의 연구를 거듭한 결과, 생물 계면활성제를 생산하는 능력을 갖는 미생물에 외인성 리파아제를 발현시킴으로써, 당해 미생물에 의한 생물 계면활성제의 생산 효율이 비약적으로 높아지는 것이 발견되었다. 또한, 생물 계면활성제를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 지방산 및 글리세린을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 당해 미생물에 의한 생물 계면활성제의 산생 효율이 비약적으로 높아지는 것이 발견되었다. 이들의 지견에 기초하여, 더 한층의 연구와 검토를 거듭한 결과, 하기에 대표되는 발명이 제공된다.

항 1.

리파아제를 코딩하는 외인성 핵산을 갖는 만노실에리스리톨 리피드 산생능을 갖는 재조합 미생물.

항 2.

상기 미생물이 슈도자이마(Pseudozyma)속에 속하는 미생물인, 항 1에 기재된 재조합 미생물.

항 3.

상기 미생물이 슈도자이마·츠쿠바엔시스에 속하는 미생물인, 항 1 또는 2에 기재된 재조합 미생물.

항 4.

리파아제가 서열 번호 1 내지 9, 24 및 25로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는, 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 재조합 미생물.

항 5.

항 1 내지 3에 기재된 재조합 미생물을 사용하여, 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법.

항 6.

상기 미생물을 식물 유지를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 항 4에 기재된 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법.

항 7.

지방산 및 글리세린을 첨가한 배지에서 만노실에리스리톨 리피드 산생능을 갖는 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법.

효율적으로 생물 계면활성제를 제조하는 것이 가능하다.

도 1은 MEL의 구조를 나타낸다.
도 2는 4-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨(a) 및 1-O-β-D-만노피라노실-에리스리톨(b)의 구조를 나타낸다.
도 3은 정제 리파아제를 배지에 첨가하는 것에 의한 MEL 생산 효율에 대한 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 4는 발현 벡터 pUC_neo::LIPA 및 pUC_neo::LIPB의 구조를 나타낸다.
도 5는 형질 전환주의 리파아제 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 외인성 리파아제 도입주 및 컨트롤에 의한 MEL의 생산을 박층 크로마토그래피로 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 외인성 리파아제 도입주 및 컨트롤에 의한 MEL의 생산을 HPLC에서 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 외인성 리파아제 도입주 및 컨트롤의 증식 속도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 배지에 올리브유 또는 올레산과 글리세린을 첨가하는 것에 의한 MEL의 생산에 대한 영향을 나타낸다.
도 10은 배지에 올리브유 또는 올레산과 글리세린을 첨가하는 것에 의한 균체 증식에 대한 영향을 나타낸다.

미생물의 재조합에 사용하는 리파아제는, 미생물에 있어서 발현되고, 리파아제 활성을 발휘하는(즉, 기능하는) 한 특별히 제한되지 않고, 임의로 선택할 수 있다. 따라서, 리파아제의 유래는 미생물, 식물 및 동물 중 어느 것이어도 된다. 일 실시 형태에 있어서 바람직한 리파아제는 미생물 유래이다. 일 실시 형태에 있어서, 리파아제의 유래로서 바람직한 미생물은 슈도자이마속, 우스틸라고속, 스포리소리움(Sporisorium)속, 멜라노피치움(Melanopsichium)속 및 쿠르츠마노마이세스속이다. 바람직한 슈도자이마속 미생물은 슈도자이마·안타크티카(Pseudozyma antarctica), 슈도자이마·아피디스(Pseudozyma aphidis), 슈도자이마·휴베이엔시스(Pseudozyma hubeiensis) 및 슈도자이마·츠쿠바엔시스이다. 바람직한 우스틸라고속 미생물은 우스틸라고·호르데이(Ustilago hordei) 및 우스틸라고·마이디스(Ustilago maydis)이다. 바람직한 스포리소리움속 미생물은 스포리소리움·레일리아눔(Sporisorium reilianum) 및 스포리소리움·시타미네움(Sporisorium scitamineum)이다. 바람직한 멜라노피치움속 미생물은 멜라노피치움·펜실바니쿰(Melanopsichium pennsylvanicum)이다. 바람직한 쿠르츠마노마이세스속 미생물은 쿠르츠마노마이세스·에스피(Kurtzmanomyces sp.) I-11이다.

바람직한 일 실시 형태에 있어서, 리파아제는, 서열 번호 1 내지 9, 24 및 25 중 어느 아미노산 서열 또는 그것과 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 동일성은 바람직하게는 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상이다. 이러한 리파아제는 임의의 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 유전자 공학적인 방법 및 화학 합성법(예를 들어, 액상법 및 고상법)을 사용하여 제조하는 것이 가능하다. 또한, 리파아제를 코딩하는 핵산에 대해서도 임의의 방법(예를 들어, 유전자 공학적 방법 및 화학 합성법)을 사용하여 얻을 수 있다.

서열 번호 1은 피. 안타크티카(P. antarctica) T-34 유래의 LIP-A의 아미노산 서열이다. 서열 번호 2는 슈도자이마·아피디스 DSM70725 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 3은 슈도자이마·휴베이엔시스 SY62 유래의 리파아제의 아미노산 서열이다. 서열 번호 4는 우스틸라고·호르데이 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 5는 우스틸라고·마이디스 521 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 6은 스포리소리움·레일리아눔 SRZ2 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 7은 스포리소리움·시타미네움 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 8은 멜라노피치움·펜실바니쿰 4 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 9는 쿠르츠마노마이세스 에스피 I-11 유래의 리파아제가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 24는 슈도자이마·츠쿠바엔시스 NBRC1940주 유래의 리파아제(LIPA)가 갖는 아미노산 서열이다. 서열 번호 25는 슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주 유래의 리파아제(LIPA)가 갖는 아미노산 서열이다. 일 실시 형태에 있어서 바람직한 리파아제는 피. 안타크티카 T-34 유래의 LIP-A이다. 또한, 피. 안타크티카 T-34는 「모에스지오마이세스 안타크티쿠스(Moesziomyces antarcticus) T-34」라고도 칭해진다. 피. 아피디스(P. aphidis)는 「모에스지오마이세스 아피디스(Moesziomyces aphidis)」라고도 칭해진다.

아미노산의 동일성은, 시판되는 또는 인터넷을 통하여 이용 가능한 해석 툴(예를 들어, FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH 등의 소프트웨어)을 사용하여 계산할 수 있다. 예를 들어, BLAST 검색에 일반적으로 사용되는 주된 초기 조건은 이하와 같다. 즉, Advanced BLAST 2.1에 있어서, 프로그램에 blastp를 사용하고, Expect값을 10, Filter는 모두 OFF로 하여, Matrix에 BLOSUM62를 사용하고, Gap existence cost, Per residue gap cost 및 Lambda ratio를 각각 11, 1, 0.85(디폴트값)로 하여, 다른 각종 파라미터도 디폴트값으로 설정하여 검색을 행함으로써, 아미노산 서열의 동일성의 값(％)을 산출할 수 있다.

다른 실시 형태에 있어서, 리파아제는, 서열 번호 1 내지 9, 24 및 25의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산이 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위(이하, 이들을 통합하여 「변이」라고 하는 경우가 있다.)된 아미노산 서열을 포함하고, 리파아제 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다. 여기서 「수개」란, 리파아제 활성이 유지되는 한 제한되지 않지만, 예를 들어 전체 아미노산의 약 20％ 미만에 상당하는 수이고, 바람직하게는 약 15％ 미만에 상당하는 수이고, 더욱 바람직하게는 약 10％ 미만에 상당하는 수이고, 한층 더 바람직하게는 약 5％ 미만에 상당하는 수이고, 가장 바람직하게는 약 1％ 미만에 상당하는 수이다. 보다 구체적으로는, 예를 들어 2 내지 100개, 바람직하게는 2 내지 80개, 보다 바람직하게는 2 내지 60개, 더욱 바람직하게는 2 내지 40개이며, 보다 더욱 바람직하게는 2 내지 20개, 한층 바람직하게는 2 내지 15개, 한층 더 바람직하게는 2 내지 10개, 특히 바람직하게는 2 내지 5개이다.

아미노산의 치환의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 리파아제에 현저한 영향을 주지 않는다는 관점에서 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 「보존적 아미노산 치환」이란, 어느 아미노산 잔기를, 동일한 성질의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 아미노산 잔기는 그의 측쇄에 의해 염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 분지 측쇄(예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 측쇄(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)와 같이, 몇 가지의 패밀리로 분류되어 있다. 보존적 아미노산 치환은 바람직하게는, 동일한 패밀리 내의 아미노산 잔기간의 치환이다.

하나 또는 수개의 변이는, 제한 효소 처리, 엑소뉴클레아제, DNA 리가아제 등에 의한 처리, 위치 지정 돌연 변이 도입법(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) 등 공지된 방법을 이용하여 도입할 수 있다. 또한, 자외선 조사 등 다른 방법에 의해서도 변이체를 얻을 수 있다. 변이체에는, 리파아제를 갖는 미생물의 개체 차, 종이나 속의 상이에 기초하는 경우 등의 천연에 발생하는 변이체(예를 들어, 1 염기 다형)도 포함된다. 일 실시 형태에 있어서, 변이는, FGDH의 활성 부위 또는 기질 결합 부위에 영향을 주지 않는 부위에 존재하는 것이 바람직하다.

서열 번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 10에 나타낸다. 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 11에 나타낸다. 서열 번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 12에 나타낸다. 서열 번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 13에 나타낸다. 서열 번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 14에 나타낸다. 서열 번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 15에 나타낸다. 서열 번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 16에 나타낸다. 서열 번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 17에 나타낸다. 서열 번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 18에 나타낸다. 서열 번호 24의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 26에 나타낸다. 서열 번호 25의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 27에 나타낸다.

재조합 미생물은, 예를 들어 숙주 미생물에 상기 리파아제를 코딩하는 외인성 핵산을 도입함으로써 얻을 수 있다. 여기서, 숙주 미생물은, 만노실에리스리톨 리피드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이면 특별히 제한되지 않고, 임의로 선택하여 사용할 수 있다. 만노실에리스리톨 리피드를 생산하는 능력을 갖는 미생물로서, 예를 들어 슈도자이마속에 속하는 미생물을 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 바람직한 만노실에리스리톨 리피드를 생산하는 능력을 갖는 미생물은, 슈도자이마·츠쿠바엔시스, 슈도자이마·안타크티카, 슈도자이마·루귤로사, 슈도자이마·아피디스, 슈도자이마·파라안타크티카, 슈도자이마·휴베이엔시스에 속하는 미생물이다. 츠쿠바엔시스종에 포함되는 바람직한 MEL 생산주로서는, NBRC1940주, KM-160주, 1D9주, 1D10주, 1D11주, 1E5주 및 JCM16987주를 들 수 있다. 슈도자이마·츠쿠바엔시스가 생산하는 1-O-β-MEL-B는 수화성이 4-O-β-MEL-B보다도 높아, 수계 용도에 있어서 유용하다.

숙주 세포로의 리파아제를 코딩하는 핵산의 도입 수단은 임의이며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 핵산을 숙주에 적합한 벡터에 도입하고, 그것을 임의의 방법으로 숙주 세포에 도입할 수 있다. 벡터란, 거기에 조립된 핵산 분자를 세포 내에 수송할 수 있는 핵산성 분자(캐리어)이다. 벡터의 종류는, 숙주 세포 내에서 복제 및 발현이 가능한 한, 그 종류나 구조는 특별히 한정되지 않는다. 벡터의 종류는 숙주 세포의 종류에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 벡터의 구체예로서는, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 등) 등을 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서 바람직한 벡터는 플라스미드 벡터이다.

슈도자이마속을 숙주로 하는 경우의 벡터로서는, 예를 들어 pUXV1 ATCC 77463, pUXV2 ATCC 77464, pUXV5 ATCC 77468, pUXV6 ATCC 77469, pUXV7 ATCC 77470, pUXV8 ATCC 77471, pUXV3 ATCC 77465, pU2X1 ATCC 77466, pU2X2 ATCC 77467, pUXV1-neo, pPAX1-neo, pPAA1-neo(Appl Microbiol Biotechnol(2016) 100: 3207-3217) 및 pUC_neo 등을 예시할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 바람직한 벡터는 pUC_neo이다.

발현 벡터는 통상, 삽입된 핵산의 발현에 필요한 프로모터 서열 및 발현을 촉진시키는 인핸서 서열 등을 포함한다. 선택 마커를 포함하는 발현 벡터를 사용할 수도 있다. 핵산의 벡터로의 삽입, 선택 마커 유전자의 삽입(필요한 경우), 프로모터의 삽입(필요한 경우) 등은 표준적인 재조합 DNA 기술(예를 들어, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York를 참조할 수 있는, 제한 효소 및 DNA 리가아제를 사용한 주지된 방법)을 사용하여 행할 수 있다.

숙주 세포로의 벡터의 도입은 임의이며, 숙주 세포 및 벡터의 종류 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 벡터의 도입은, 예를 들어 일렉트로포레이션, 인산칼슘 공침강법, 리포펙션, 마이크로인젝션 및 아세트산리튬법 등에 의해 실시할 수 있다.

핵산의 도입에 의해 재조합 미생물이 얻어진 것인지 여부는, 임의의 방법으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산의 도입에 의해 부여한 리파아제 활성의 유무를 확인함으로써 원하는 재조합 미생물이 얻어진 것을 확인할 수 있다. 리파아제 활성의 확인은 임의의 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 상술하는 실시예에서 채용한 방법(즉, 라우르산p-니트로페닐의 가수 분해에 의해 발생하는, 파장 410nm의 흡광도의 변화에 의해 측정하는 방법)에 의해 실시할 수 있다.

재조합 미생물은, 리파아제 활성과 만노실에리스리톨 리피드 산생 능력을 구비함으로써, 보다 효율적으로 만노실에리스리톨 리피드를 산생할 수 있다. 재조합 미생물이 산생하는 만노실에리스리톨 리피드의 종류는 특별히 제한되지 않고 목적에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 바람직한 MEL은 1-O-β-MEL-B 및 4-O-β-MEL-B이며, 보다 바람직하게는 1-O-β-MEL-B이다.

재조합 미생물을 사용한 MEL의 생산은 임의의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, MEL의 생산에 적합한 배지에서 재조합 미생물을 배양함으로써 실시할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 재조합 미생물을 사용한 MEL을 생산하는 경우, 배지에 식물 유지를 첨가하는 것이 바람직하다. 식물 유지의 종류는 특별히 제한되지 않고, 목적으로 하는 MEL의 종류 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 대두유, 올리브유, 유채씨유, 홍화유, 참기름, 팜유, 해바라기유, 코코넛유, 카카오 버터 및 피마자유 등을 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서 바람직한 유지는 올리브유이다.

재조합 미생물의 배양 조건은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 재조합 미생물이, 슈도자이마속인 경우에는, pH 5 내지 8, 바람직하게는 pH 6, 온도 20 내지 35℃, 바람직하게는 22 내지 28℃의 조건에서 3 내지 7일간 배양할 수 있다. MEL은 통상의 방법에 따라서 배양액 중에서 회수할 수 있다.

다른 실시 형태에 있어서, 지방산 및 글리세린을 첨가한 배지에서 만노실에리스리톨 리피드 산생능을 갖는 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법이 제공된다. 본 실시 형태에 있어서 사용하는 MEL 산생 미생물은, 리파아제 활성을 가지고 있어도 가지지 않아도 되고, 일 실시 형태에 있어서 리파아제 활성을 가지지 않은 미생물이 바람직하다.

지방산은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 베헨산 및 네르본산 등을 들 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 바람직한 지방산은 올레산이다.

지방산 및 글리세린의 양은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 각각 배지 중의 농도가 0.1 내지 20용량％가 되도록 첨가할 수 있다.

미생물의 배양 조건은 특별히 제한되지 않고, 상술하는 재조합 미생물을 사용하는 경우와 동일한 조건을 채용할 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들에 제한되는 것은 아니다.

1. 재료

· 사용 균체

슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주·게놈 DNA

슈도자이마·안타크티카 T-34주·플라스미드

발현 벡터 pUC_neo

·배지

글리세롤 첨가 YM 배지: 탈이온수 1L에, 효모 엑기스 3g, 맥아 추출물 3g, 펩톤 5g, 글루코오스 10g, 글리세롤 50g을 녹여서 조정하였다.

MEL 생산 배지: 탈이온수 1L에, 효모 엑기스 5g, 질산나트륨 3g, 인산이수소칼륨 0.3g, 황산마그네슘·7수화물 0.3g, 글리세롤 20g을 녹여서 조정하였다. 배양 시에는, 필요에 따라서 G418(항생 물질)을 첨가하였다.

·정제 리파아제: 돼지 췌장 유래 리파아제(도쿄 카세이사제), 고정화 리파아제 A(시그마 알드리치사제), 고정화 리파아제 B(시그마 알드리치사제)

2. 정제 리파아제 첨가 배지에서의 MEL 생산능의 평가

슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주를 글리세롤 첨가 YM 배지 2mL에서 25℃, 3일간 진탕 배양하고, 전(前)배양액을 얻었다. 이어서, 전배양액 0.1mL를 MEL 생산 배지에 10％ 올리브유 및 돼지 췌장 유래 리파아제, 고정화 리파아제 A, 또는 고정화 리파아제 B를 1mg 첨가한 배지 2mL에 접종하고, 25℃에서 4일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균체 배양액에 등량의 아세트산에틸을 첨가하고, 충분히 교반한 후, 아세트산에틸층을 분취하였다. 아세트산에틸층에 포함되는 MEL은 박층 크로마토그래피로 확인하였다. 결과를 도 3에 도시한다. 도 3의 결과로부터, 어느 리파아제의 첨가도 1E5주에 의한 MEL-B의 생산성에 영향을 주지 않는 것이 나타났다.

3. 리파아제 발현 재조합주를 사용한 MEL-B의 생산

3-1. 게놈 DNA의 추출

상기 슈도자이마·안타크티카 T-34주의 균체 배양액에 포함되는 균체를 액체 질소로 동결시키고, 페놀 및 클로로포름으로 처리하여 게놈 DNA를 추출하였다. 얻어진 게놈 DNA의 순도와 양은 분광 광도계로 확인하였다.

3-2. 발현 벡터 구축

서열 번호 10 및 19에 나타내는 유전자를 발현하는 발현 벡터를 다음 수순으로 구축하였다. 서열 번호 10은 슈도자이마·안타크티카 T-34주의 리파아제 A를 코딩하는 염기 서열이며, 서열 번호 19는 슈도자이마·안타크티카 T-34주의 리파아제 B를 코딩하는 염기 서열이다. 먼저, 서열 번호 10을 참조하여, 개시 코돈의 상류에 KpnI 사이트를 도입한 정방향 프라이머(서열 번호 20), 및 종지 코돈의 하류에 EcoRI 사이트를 도입한 역방향 프라이머(서열 번호 21)를 조제하였다. 이들을 사용하여, 상기 3-1.에서 얻어진 슈도자이마·안타크티카 T-34주의 게놈 DNA를 템플릿에 유전자의 증폭을 행하였다. 동일하게, 서열 번호 19를 참조하여, 개시 코돈의 상류에 KpnI 사이트를 도입한 정방향 프라이머(서열 번호 22), 및 종지 코돈의 하류에 EcoRI 사이트를 도입한 역방향 프라이머(서열 번호 23)를 조제하였다. 이들을 사용하여, 상기 3-1.에서 얻어진 슈도자이마·안타크티카 T-34주의 게놈 DNA를 템플릿에 유전자의 증폭을 행하였다. 증폭시킨 유전자를, 사상균(우스틸라고 마이디스) 유래의 복제 개시점(UARS), G418 내성 유전자, 슈도자이마·안타크티카 T-34주 유래의 gap 프로모터를 포함하는 발현 벡터 pUC_neo에 연결하고, gap 프로모터의 제어 하에서 이들 유전자가 발현되는 유전자 발현 벡터 pUC_neo::LIPA 및 pUC_neo::LIPB를 구축하였다. 발현 벡터의 구조를 도 4에 도시한다.

Fwd: TTTGGTACCATGCGAGTGTCCTTG(서열 번호 20)

Rvs: GCAGAATTCCTAAGGCGGTGTG(서열 번호 21)

Fwd: CGAGGTACCATGAAGCTACTCTC(서열 번호 22)

Rvs: TGAGAATTCTCAGGGGGTGACG(서열 번호 23)

3-3. 형질 전환체의 조제

상기 3-2.에서 얻어진 발현 벡터 pUC_neo::LIPA 및 pUC_neo::LIPB를 제한 효소 처리로 직선화한 것을 사용하여, 일렉트로포레이션법으로 슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주를 형질 전환하였다. 또한, 컨트롤로서 인서트를 포함하지 않는 벡터 pUC_neo도 동일하게, 제한 효소 처리로 직선화한 후, 일렉트로포레이션법으로 슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주에 도입하였다. 형질 전환체의 선별에는, G418을 사용하였다.

3-4. 효소 활성 측정

각 형질 전환체를 글리세롤 첨가 YM 배지 2mL에서 25℃, 3일간 진탕 배양하고, 전배양액을 얻었다. 이어서, 전배양액 1mL를 MEL 배지에 12％ 올리브유를 첨가한 배지 20mL에 접종하고, 25℃에서 3일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균체 배양액을 원심하고, 배양 상청을 얻었다.

각 형질 전환체의 배양 상청 중의 리파아제 활성은, 라우르산p-니트로페닐의 가수 분해에 의해 발생하는, 파장 410nm의 흡광도의 변화에 의해 측정하였다. 1분간에 1㎛ol의 기질을 소비하는 데 필요한 효소량을 1Unit으로 하였다. 결과를 도 5에 도시한다. 도면 중, Neo는 pUC_neo 도입주(컨트롤), LIPA는 pUC_neo::LIPA 도입주, LIPB는 pUC_neo::LIPB 도입주를 각각 나타낸다. 이 결과로 LIPA 도입주 및 LIPB 도입주에 있어서 리파아제 활성이 확인되었다.

3-5. 형질 전환체의 MEL 생산능의 평가

각 형질 전환체를 글리세롤 첨가 YM 배지 2mL에서 25℃, 3일간 진탕 배양하고, 전배양액을 얻었다. 이어서, 전배양액 1mL를 MEL 배지에 12％ 올리브유를 첨가한 배지 20mL에 접종하고, 25℃에서 15일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균체 배양액에 등량의 아세트산에틸을 첨가하고, 충분히 교반한 후, 아세트산에틸층을 분취하였다. 아세트산에틸층에 포함되는 MEL은 박층 크로마토그래피로 확인하였다(도 6). 또한, 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 MEL의 생산량을 정량하였다(도 7). 또한, 아세트산에틸층을 분취한 후에 남은 수층에 메탄올을 첨가하고, 원심 분리함으로써 균체를 얻었다. 얻어진 균체를 건조시켜 칭량하고, 균체 증식량을 평가하였다(도 8).

도 6 및 7에 나타내는 대로, 어느 균주에서도 MEL-B의 생산이 확인되고, 컨트롤과 비교하여 리파아제 A 도입주에서는 초기의 MEL-B 생산 속도가 유의미하게 빠른(약 1.5배) 것이 확인되었다. 도 8의 결과로부터 리파아제 A 도입주에서는, 균체 증식 속도도 컨트롤과 비교하여 빠른 것이 확인되었다.

4. 지방산과 글리세린의 첨가에 의한 MEL-B 생산에 대한 영향

슈도자이마·츠쿠바엔시스 1E5주를 글리세롤 첨가 YM 배지 2mL에서 25℃, 3일간 진탕 배양하고, 전배양액을 얻었다. 이어서, 전배양액 1mL를, MEL 배지에 올리브유를 12용량％ 첨가한 배지 20mL, 또는 올리브유 12용량％를 올레산 10.8용량％ 및 글리세린 1.2용량％로 바꾼 배지 20ml에 접종하고, 25℃에서 4일간 진탕 배양하였다. 얻어진 균체 배양액에 등량의 아세트산에틸을 첨가하고, 충분히 교반한 후, 아세트산에틸층을 분취하였다. 아세트산에틸층에 포함되는 MEL의 양을 고속 액체 크로마토그래피로 측정하였다(도 9). 또한, 아세트산에틸층을 분취한 후에 남은 수층에 메탄올을 첨가하고, 원심 분리함으로써 균체를 얻었다. 얻어진 균체는 건조시킨 후 칭량하고, 균체 증식량을 평가하였다(도 10). 도 9의 결과로부터, 올리브유 대신에 올레산 및 글리세린을 배지에 첨가함으로써, MEL-B의 생산량이 약 1.5배 향상되는 것이 확인되었다. 한편, 도 10의 결과로부터 올리브유를 올레산 및 글리세린으로 바꾸어도 균체의 증식 능력에 영향을 미치지 않는 것이 판명되었다.

SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY TOYOBO CO., LTD. <120> Biosurfactant-producing microorganism <130> P17-007WO <150> JP 2016-112087 <151> 2016-06-03 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 462 <212> PRT <213> Pseudozyma antarctica <400> 1 Met Arg Val Ser Leu Arg Ser Ile Thr Ser Leu Leu Ala Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ala Ala Val Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Thr Leu Asp Arg Arg Ala 20 25 30 Ala Leu Pro Asn Pro Tyr Asp Asp Pro Phe Tyr Thr Thr Pro Ser Asn 35 40 45 Ile Gly Thr Phe Ala Lys Gly Gln Val Ile Gln Ser Arg Lys Val Pro 50 55 60 Thr Asp Ile Gly Asn Ala Asn Asn Ala Ala Ser Phe Gln Leu Gln Tyr 65 70 75 80 Arg Thr Thr Asn Thr Gln Asn Glu Ala Val Ala Asp Val Ala Thr Val 85 90 95 Trp Ile Pro Ala Lys Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser Tyr Gln 100 105 110 Val Tyr Glu Asp Ala Thr Ala Leu Asp Cys Ala Pro Ser Tyr Ser Tyr 115 120 125 Leu Thr Gly Leu Asp Gln Pro Asn Lys Val Thr Ala Val Leu Asp Thr 130 135 140 Pro Ile Ile Ile Gly Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val Val Ser 145 150 155 160 Ser Asp His Glu Gly Phe Lys Ala Ala Phe Ile Ala Gly Tyr Glu Glu 165 170 175 Gly Met Ala Ile Leu Asp Gly Ile Arg Ala Leu Lys Asn Tyr Gln Asn 180 185 190 Leu Pro Ser Asp Ser Lys Val Ala Leu Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Ala 195 200 205 His Ala Thr Val Trp Ala Thr Ser Leu Ala Glu Ser Tyr Ala Pro Glu 210 215 220 Leu Asn Ile Val Gly Ala Ser His Gly Gly Thr Pro Val Ser Ala Lys 225 230 235 240 Asp Thr Phe Thr Phe Leu Asn Gly Gly Pro Phe Ala Gly Phe Ala Leu 245 250 255 Ala Gly Val Ser Gly Leu Ser Leu Ala His Pro Asp Met Glu Ser Phe 260 265 270 Ile Glu Ala Arg Leu Asn Ala Lys Gly Gln Gln Ala Leu Lys Gln Ile 275 280 285 Arg Gly Arg Gly Phe Cys Leu Pro Gly Val Val Leu Thr Tyr Pro Phe 290 295 300 Leu Asn Val Phe Ser Leu Val Asn Asp Thr Asn Leu Leu Asn Glu Ala 305 310 315 320 Pro Ile Val Ser Ile Leu Lys Gln Glu Thr Val Val Gln Ala Glu Ala 325 330 335 Ser Tyr Thr Val Ser Val Pro Lys Phe Pro Arg Phe Ile Trp His Ala 340 345 350 Val Pro Asp Glu Ile Val Pro 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Arg 85 90 95 Arg Ala Ala Leu Pro Asn Pro Tyr Asp Asp Pro Phe Tyr Thr Thr Pro 100 105 110 Ser Asn Ile Gly Thr Phe Ala Lys Gly Gln Val Ile Gln Ser Arg Lys 115 120 125 Val Pro Thr Asp Ile Gly Asn Ala Asn Asn Ala Ala Ser Phe Gln Leu 130 135 140 Gln Tyr Arg Thr Thr Asn Thr Gln Asn Glu Ala Val Ala Asp Val Ala 145 150 155 160 Thr Val Trp Ile Pro Ala Lys Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser 165 170 175 Tyr Gln Val Tyr Glu Asp Ala Thr Ala Leu Asp Cys Ala Pro Ser Tyr 180 185 190 Ser Tyr Leu Thr Gly Leu Asp Gln Pro Asn Lys Val Thr Ala Val Leu 195 200 205 Asp Thr Pro Ile Ile Ile Gly Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val 210 215 220 Val Ser Ser Asp His Glu Gly Phe Lys Ala Ala Phe Ile Ala Gly Tyr 225 230 235 240 Glu Glu Gly Met Ala Ile Leu Asp Gly Ile Arg Ala Leu Lys Asn Tyr 245 250 255 Gln Asn Leu Pro Ser Asp Ser Lys Val Ala Leu Glu Gly Tyr Ser Gly 260 265 270 Gly Ala His Ala Thr Val Trp Ala Thr Ser Leu Ala Asp Ser Tyr Ala 275 280 285 Pro Glu Leu Asn Ile Val Gly Ala Ser His Gly Gly Thr Pro Val Ser 290 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Asp Ile Gly Thr 50 55 60 Ser Asn Asn Ala Ala Ser Phe Gln Leu Leu Tyr Arg Thr Thr Asn Thr 65 70 75 80 Ser Asn Leu Pro Glu Ala Thr Val Ala Thr Val Trp Ile Pro Ala Lys 85 90 95 Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser Tyr Gln Val Tyr Glu Asp Ala 100 105 110 Thr Gln Leu Asn Cys Ala Pro Ser Tyr Ser Tyr Leu Ser Gly Leu Asp 115 120 125 Glu Pro Gly Lys Gly Thr Val Ile Leu Asp Thr Pro Ile Val Ile Ser 130 135 140 Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val Val Ser Ala Asp His Glu Gly 145 150 155 160 Pro Lys Ala Ala Phe Ile Ala Gly Cys Gln Glu Gly Arg Ala Ile Leu 165 170 175 Asp Gly Val Arg Ala Leu Arg Asn Phe Gln Asn Leu Ala Ser Asn Ser 180 185 190 Ala Val Gly Phe Tyr Gly Tyr Ser Gly Gly Gly His Ala Thr Gly Trp 195 200 205 Ala Val Ser Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Pro Asp Val Asn Ile Ile Gly 210 215 220 Ala Ala Tyr Gly Gly Val Pro Thr Ser Thr Arg Asp Ile Phe Asn Phe 225 230 235 240 Leu Asn Gly Gly Ala Phe Ala Gly Phe Ala Val Ala Gly Val Ser Gly 245 250 255 Leu Gly Leu Ala Tyr Pro Glu Leu Glu Ala Tyr Ile Glu Pro 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I-11 <400> 9 Met Arg Phe Phe Leu Arg Ala Val Leu Gly Leu Ala Val Thr Ala Thr 1 5 10 15 Ala Ala Leu Ala Ala Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Pro Asp Pro 20 25 30 Asn Glu Asp Pro Phe Tyr Ser Thr Pro Ser Asn Ile Glu Thr Phe Ala 35 40 45 Asn Gly Gln Ile Ile Gln Ser Arg Lys Val Pro Thr Asp Ile Gly Asn 50 55 60 Ser Asn Asn Ala Ala Ser Tyr Gln Leu Ser Tyr Arg Thr Thr Asn Thr 65 70 75 80 Gln Glu Asp Ala Val Ala Asn Val Ala Thr Ile Trp Ile Pro Ala Lys 85 90 95 Pro Ser Ser Pro Pro Arg Ile Phe Thr Tyr Gln Val Tyr Glu Asp Ser 100 105 110 Thr Gln Leu Asp Cys Ala Pro Ser Tyr Ser Tyr Leu Thr Gly Tyr Asp 115 120 125 Gln Pro Asn Lys Ala Thr Ala Val Leu Asp Thr Pro Ile Val Ile Ser 130 135 140 Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val Val Ser Ala Asp His Glu Gly 145 150 155 160 Ala Arg Ser Ala Phe Ile Ala Gly Tyr Glu Glu Gly Met Ala Ala Leu 165 170 175 Asp Gly Ile Arg Ala Leu Arg Asn Tyr Ala Lys Leu Pro Gln Asp Ser 180 185 190 Ala Val Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Gly Gly Ala His Ala Thr Val Trp 195 200 205 Ala Thr 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accgtgtggg cgacttcgct cgctgaatcg 660 tacgcgcccg agctcaacat tgtcggtgct tcgcacggcg gcacgcccgt gagcgccaag 720 gacaccttca cattcctcaa cggcggaccc ttcgccggct ttgccctggc aggtgtttcg 780 ggtctctcgc tcgctcatcc tgacatggag agcttcattg aggcccgatt gaacgccaag 840 ggtcagcagg cgctcaagca gatccgcggc cgtggcttct gcctgcctgg ggtggtgttg 900 acctacccct tcctcaacgt cttctcgctg gtcaacgaca cgaacctgct gaatgaggcg 960 ccgatcgtta gcatcctcaa gcaggagacg gtggtccagg ccgaagcgag ctacacagtg 1020 tcggtgccca agttcccgcg cttcatctgg catgcggtcc ccgacgagat cgtgccgtac 1080 cagcctgccg ctacctacgt caaggagcaa tgtgccaagg gcgccaacat caacttttcg 1140 ccctacccga tcgccgagca cctcaccgcc gagatctttg gtctggtgcc tagcctgtgg 1200 tttatcaagc aagccttcga cggcaccacg cccaaggtga tctgcggcac tcccatccct 1260 gctatcgctg gcatcaccac gccctcggcg gaccaggtgc tgggttcgga cctggccgac 1320 cagctgcgca gcctcaacgg caagcagagt gcgttcggca agccctttgg ccccatcaca 1380 ccgccttag 1389 <210> 11 <211> 1587 <212> DNA <213> Pseudozyma aphidis <400> 11 atgagacatc gtctcgatgg atcgatcgtt ggatcgattg gggcagccat cgcctataaa 60 ggccagccat ccagcccgca agagtatgct agaagcctca agcgacttca ctccctctct 120 tcccaccctt cctcctcatc ccctcgaccc gagccctacc ctctcgctcc cttgcgtctc 180 cctcccacct ttcgaacgat gcgagtgtcc ttgcgctcca ttacctcgct gctggcggcg 240 gcaacggcgg ctgtgctcgc ggctccggca accgagacgc tggaccgacg ggcggcgctg 300 cccaacccct acgacgatcc cttctacacg acgccatcca acatcggcac gtttgccaag 360 ggccaggtga tccaatctcg caaggtgccc acggacatcg gcaacgccaa caacgctgcg 420 tcgttccagc tgcagtaccg caccaccaat acgcagaacg aggcggtggc cgacgtggcc 480 accgtgtgga tcccggccaa gcccgcttcg ccgcccaaga tcttttcgta ccaggtctac 540 gaggatgcca cggcgctcga ctgtgctccg agctacagct acctcactgg attggaccag 600 ccgaacaagg tgacggcggt gctcgacacg cccatcatca tcggctgggc gctgcagcag 660 ggctactacg tcgtctcgtc cgaccacgaa ggcttcaaag ccgccttcat cgctggctac 720 gaagagggca tggctatcct cgacggcatc cgcgcgctca agaactacca gaacctgcca 780 tccgacagca aggtcgctct tgagggctac agtggcggag ctcacgccac cgtgtgggcg 840 acttcgcttg ctgactcgta cgcgcccgag ctcaacattg tcggtgcttc gcacggcggc 900 acgcccgtga gcgccaagga cacctttaca ttcctcaacg gcggaccctt cgccggcttt 960 gccctggcgg gtgtttcggg tctctcgctc gctcatcctg atatggagag cttcattgag 1020 gcccgattga acgccaaggg tcagcagacg ctcaagcaga tccgcggccg tggcttctgc 1080 ctgccgcagg tggtgttgac ctaccccttc ctcaacgtct tctcgctggt caacgacacg 1140 aacctgctca acgaggcgcc gatcgctggc atcctcaagc aggagacggt ggtccaggcc 1200 gaagcgagct acacggtatc ggtgcccaag ttcccgcgct tcatctggca tgcgatcccc 1260 gacgagatcg tgccgtacca gcctgccgct acctacgtca aggagcaatg tgccaagggc 1320 gccaacatca atttttcgcc ctacccgatc gccgagcacc tcaccgccga gatctttggt 1380 ctggtgccta gcctgtggtt tatcaagcaa gccttcgacg gcaccacacc caaggtgatc 1440 tgcggcactc ccatccctgc tatcgctggc atcaccacgc cctcggcgga ccaggtgctg 1500 ggttcggacc tggccaacca gctgcgcagc ctcaacggca agcagagtgc gttcggcaag 1560 ccctttggcc ccatcacacc accttag 1587 <210> 12 <211> 1293 <212> DNA <213> Pseudozyma hubeiensis <400> 12 atgcatacca gggagacgtt gccggatcca aacgatgatc ctttttacgc ccagccgtcc 60 aacatcgcct cgtacgccaa tggccaagtc attcagtctc gaaaggtaga caccgagatt 120 ggctctatca acaacgtgaa caccttccag gtcaagtacc gtaccacaaa cacgcaaaac 180 caggcgcagt ccaacctcgc gactgtctgg atcccctcca agcctgcatc gccgcccaag 240 atcttcagct accaagtcta catggatgcc acccagatcg actgcgctcc gagctacagc 300 tatgtcaccg gcttggacaa gccaggcaag ggcaccgtca tcttggacac acccatcgtc 360 atcagctggg cgctccagca gggctactac gtcgtttcgt ccgacgatga aggtcccaga 420 gctgccttca tcgccgggta cgaggaaggt aaggccgtcc tcgacggcat tcgcgcgctc 480 cagaactacg ccaacttgcc caaggacagc cccatcggaa tgtatggata cagcggaggt 540 gcccatacca ccggatgggc cgttaacctg gctggctcgt acgcttccga gctcaacatc 600 atcggcgctg cctacggagg acttcctgca agcgccaagg acaccttcac cttcctcaac 660 ggcaagagca tcttctccgg ctttgccctt gcgggcgtct cgggccttgc cctcggtcat 720 ccggacatgg aggctttcat caagccgcgc ctcaatgcca agggcaacca aaccttggcc 780 cagatccgaa gccgtggtga atgtatcggc caagttgctc tgggttatcc tttccttgac 840 gtcttctcgc tcgtcaacga caccaacctg ctcaatgaag agcccattgt cagcatcctc 900 aagaccgaaa cgctggtgca agccgaagcg agctacacag ttcccgtccc caaattcccg 960 cgattcatgt ggcacgcgct accagacgag attgttcctt tccaaccggc acaagattat 1020 gtcactgaac agtgtgccaa gggcgccgac attaactgga acgtctaccc aattgccgag 1080 cacatttctg ccgagctctt ggggttgttg cctggtatcg actggttgag caaggcctat 1140 aagggtcaag caccgaaagt tgcatgcggc ggtggtgtac ctgcaacacc tccgcctgcg 1200 gaagacgtgc tcggaggcga cctggcgagc cagttccgct ccctgaacgg caagcagtct 1260 gcttacggca agcctttcaa cgccggattc tga 1293 <210> 13 <211> 1377 <212> DNA <213> Ustilago hordei <400> 13 atgaggttct tccttggagc tgtgctcgcc ctggccgcag cagccatcgc tgcgctcgct 60 gtacccatgg agaggcgagc tcagttcccg gatcccaacg aggacccctt ctaccagcaa 120 ccgtcgaacg tggccaccta cgccaacggt cagatcatcc gatcacgcaa agctgacacc 180 gacatcggca actcgaacaa ggcccaagcc tttcagctta gctaccgcac caccaacacg 240 cagcagcaag ctcaagccaa cgtcgctacc gtttggatcc ctgctaagcc tgcctctccg 300 cccaagatct tctcctacca ggtctacgag gactcgacgc agctcgactg tgctccaagc 360 tacagctacc tggccggttt tgatcctccc aataaggcta ctaccatcct tgatacttcg 420 ctcatcatcg gctgggcgct tcagcagggt tactacgtcc tctcctccga tcatgagggc 480 cctcgagctg cctttattgc tggttacgaa gagggtatgg ctatccttga cgctattcgt 540 gctttgcaga acttcaggca tctgccaaag gacagccccg ttggcatgta tggttattcg 600 ggaggcgccc atgctactgt ttgggcagag tcgcttgctg gatcctatgc acctgagatc 660 aacatcatcg ctactgccca cggtggcacc cccttcagta caaaggacac tttcaccttt 720 atcaacggcg gtgtctttgc tggtttcgct attgctggtg tctccggttt ggcccttgtt 780 catcctgcta tgcaagctta catcaagcct cggttgaatg ctcaaggcgt caaggtgttt 840 caacagattc gaagtcgtgc attctgcatc gctcaagtcg ttttcaccta ccctttcacc 900 aacgttttca acctggtcaa cggcaccgac ttgctcaatc aagaaccgat ccgttccatc 960 ctcaaacgag agactcttgt tcaatccgaa gcctcttgcg atgttcctgt tgtccgtgca 1020 cctcgtttca tttggcacgc cgcgctcgat gagatcgttc cgtatgcacc tgccgctcag 1080 tatgttaaag agcaatgcga caagggtgca caaatccatt tcgagacata tcctatcgcc 1140 gaacacttca gcgcagagtt ctttggcctt gttcctgctc tctggttcct tagccaagcc 1200 tacgctggga aagctgccaa gacggtctgc ggaactagca ttcctgccat tcctggcttt 1260 accgttccct ctgcagagga ggtcttgggt 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cacattcaac 720 ttcctcaaca aaggcgcgtt tgccggcttc gccattgcgg gtgtctcggg tcttgcgctg 780 gcctacccgg acgtggagac ctacatccag tcgcgcctca acgccaaggg agaaaaggtg 840 tttaaacagg tccgaagtcg cggcttctgc attggccaag tggtcctaac ctacccattc 900 gtcgacgcct attcactcat caacgacaca aaccttctca acgaggaacc ggtcgccagc 960 acgttgaaat ccgagacgtt ggttcaggcc gaggctagct acacggttcc tgttcccaaa 1020 ttcccgcgtt tcatctggca tgcgctcttg gacgagattg ttcccttcca ctcggctgcg 1080 acctatgtca aggagcagtg ttcaaagggc gccgacatca actggaatgt ctactcattt 1140 gccgagcaca tctctgccga gcttttcggc ttgctgcctg gtctcgactg gttaaacaag 1200 gcttacaagg gtcaagcacc caaagtgcct tgtggcggag gggctcaaag cgtgatgggt 1260 gcctcaggcc cgcctgcgca ggacgttctg ggagctgacc tggcaagcca actccgatct 1320 ctccagggta agccttctgc gtttggcaac aaaccttttg gctccatctc cccctga 1377 <210> 15 <211> 1380 <212> DNA <213> Sporisorium reilianum <400> 15 atgagattct ttgcgcagac cctagtcgcg ctggcagccg ccgccacggt ttcgctcgct 60 gcgcccttgg agcgaagggc gcagttccct gaccccaacg acgacccgtt ctactcggcg 120 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cgaacagccc ggcaaggcca ccgtcatcct cgatacgccc 420 attatcatcg gctgggcgct gcagcagggc tactacgttg tctcggccga ccacgagggt 480 cccaaggcgg cgttcatcgc tggataccaa gagggtaggg ccatcctgga cggtattcgt 540 gctctgagga actttaagga cctgccttcg agcagcgccg tcggatttta cggctacagc 600 ggtggtggac acgctactgg ctgggcggtc aacctggccg actcgtacgc tccggacgtc 660 aacattatcg gtgctgccta cggcggattg cctgccagca cgagggacat tttcaacttc 720 ctcaacggag gtgtctttgc tggtttcgcg gtcgctggtg tctctggcct cggacaggcg 780 taccctgagc tggaggcttt tgtcgagcct cgactcaacg ccaagggtca ggaggcgctc 840 aagaagttcc gtagccgtgg cttctgcatt ggacaagtgg tgaccaacga gaactttgtc 900 gacatctaca cgctcgtcaa cgacagcaac atcctcaacc agccgattcc gtctgaggtc 960 ttggcgaaag aaacgctgct ccagtcgcag gcgagctaca cggttccggt tcccaagttc 1020 ccacgattca tctggcatgc gctcgaggac gagatcgttc ccttcattcc tgcgcagaag 1080 tacgtgcagg agcagtgtgc caagggtgcc aacatcaatt ggaacgtctt ccccatcgct 1140 gagcacctta ctgctgaaat ctttggcttg gtgcccggtc tctactggct tagccaagcg 1200 tacgctggta aagcacccaa ggtgacgtgc 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gcccccctgg agcctagagc cgcactcccg gatccaaatg aagatccgtt ttactcgaca 120 ccgtccaata tcgagacgtt cgccaacggt caaatcatcc agtcgcgcaa ggttcccacc 180 gacattggca actcgaacaa tgccgcttcg taccagctgt cgtaccgcac cacaaacaca 240 caagaggatg ctgttgctaa cgttgctacc atctggatcc cggccaagcc atcgtcaccg 300 ccacgtatct tcacttatca ggtttacgag gactcgaccc aactcgattg tgcacctagc 360 tacagctacc ttactggata cgatcagccc aacaaggcaa cggctgttct cgacactccg 420 atcgtcatca gctgggcctt gcaacagggc tattatgtgg tctctgcaga ccatgaagga 480 gcccgctctg ccttcatcgc tggctacgaa gaaggcatgg cggcccttga cggtattcgt 540 gcgctcagaa attacgcaaa actaccacag gacagcgctg tcggagccta cggctattct 600 ggaggagccc atgctaccgt ttgggcaact tccttggctg ctgcctatgc tcctgagatc 660 aacttcatcg gtgctgctca tggtggaaca cccgttagcg cgaaggatac cttcactttc 720 atcaacggcg gtttcttcgc tgggtttgcc attgctggtg tctcaggttt ggccaacgct 780 caccctgata tggaagcctt catccagccc cgtctgaacg ctgagggtgt caaaacactc 840 aaacagatcc gaagccgagg cttctgcctt cccgaggtgg tcactactta tcctttcaag 900 aacgtcttcg 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gcaacagggc tattatgtgg tctctgcaga ccatgaagga 480 gcccgctctg ccttcatcgc tggctacgaa gaaggcatgg cggcccttga cggtattcgt 540 gcgctcagaa attacgcaaa actaccacag gacagcgctg tcggagccta cggctattct 600 ggaggagccc atgctaccgt ttgggcaact tccttggctg ctgcctatgc tcctgagatc 660 aacttcatcg gtgctgctca tggtggaaca cccgttagcg cgaaggatac cttcactttc 720 atcaacggcg gtttcttcgc tgggtttgcc attgctggtg tctcaggttt ggccaacgct 780 caccctgata tggaagcctt catccagcct cgtctgaacg ctgagggtgt caaaacactc 840 aaacagatcc gaagccgagg cttctgcctt cccgaggtgg tcactactta tcctttcaag 900 aacgtcttcg ccctggtcaa tgacacgaac ctgctcaatg agcagcccat ctccggcatc 960 ttgcagcaag agacgcttgt tcaatcggag gcgagctacg ctgtacctgt ccctaagttt 1020 ccccgcttct tgtggcatgc tgctctcgac gagatcgtcc cctacgtacc tgtcaccgag 1080 tatgtcaaag aacagtgtgc caagggcgcc aacatcaact tcaacaccta cccgatcgcc 1140 gagcatctca ctgccgaaat cttcggtctc gttccaggtc tttggttctt gagccaggct 1200 tacgagggca aggcaccggc ggttcagtgc ggaactgcac ttcctgcggc tccttctgct 1260 caacaggtac ttggaaacga cttggccaac caattgagca gcctcaacgg caagcaatct 1320 ccgtttggca agccattcgg ccccataagc ccgacttcgc ttgacaagtt gctgtag 1377

Claims (7)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 리파아제를 코딩하는 외인성 핵산을 갖고,
   만노실에리스리톨 리피드 산생능을 갖는,
   슈도자이마·츠쿠바엔시스(Pseudozyma tsukubaensis)에 속하는 재조합 미생물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 기재된 재조합 미생물을 사용하여, 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 미생물을 식물 유지를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 만노실에리스리톨 리피드를 제조하는 방법.
7. 삭제

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