WO2021039686A1 - モノアシル型ｍｅｌの製造 - Google Patents

モノアシル型ｍｅｌの製造 Download PDF

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WO2021039686A1
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monoacyl
type
type mel
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友岳 森田
あずさ 雜賀
徳馬 福岡
北本　大
知宏 菅原
周平 山本
曽我部　敦
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
東洋紡株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use

Definitions

  • Biosurfactant is a natural surfactant produced by microorganisms, has high biodegradability, low environmental load, and has various beneficial physiological functions. Therefore, when used in the food industry, cosmetics industry, pharmaceutical industry, chemical industry, environmental industry, etc., it is meaningful in realizing an environment-friendly society.
  • Biosurfactants are classified into five types: glycolipid type, acylpeptide type, phospholipid type, fatty acid type and polymer type. Of these, glycolipid-based surfactants have been the most studied. Examples of such glycolipid-based biosurfactants include mannoseyl erythritol (hereinafter, also referred to as ME) in which erythritol is glycosidic bonded to mannose, and mannosyl erythritol lipid (hereinafter, also referred to as MEL) in which fatty acid is ester-bonded. , Ramnolipid, ustyrazine acid, trehalose lipid, sophorose lipid and the like are known.
  • ME mannoseyl erythritol
  • MEL mannosyl erythritol lipid
  • Ramnolipid, ustyrazine acid, trehalose lipid, sophorose lipid and the like are known.
  • FIG. 1 shows the structural formulas of MEL in which hydrogen atoms, acetyl groups, and fatty acid residues having 3 to 18 carbon atoms are represented by R 1 to R 5.
  • R 1 and R 2 are fatty acid residues and R 3 and R 4 are acetyl groups
  • R 3 is a hydrogen atom and R 4 is an acetyl group
  • a structure in which R 3 is an acetyl group and R 4 is a hydrogen atom is defined as MEL-C
  • a structure in which R 3 and R 4 are hydrogen atoms is defined as MEL-D.
  • the structure of the obtained ME differs as shown in FIGS. 2 (a) and 2 (b) depending on whether the hydroxymethyl group of erythritol bonded to mannose is derived from the carbon at the 1-position or the carbon at the 4-position. ..
  • the MEL having 4-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol as the sugar skeleton shown in FIG. 2 (a) is referred to as 4-O- ⁇ -D-MEL.
  • Pseudozyma tsukubaensis is capable of producing 1-O- ⁇ -D-MEL-B having 1-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol as the sugar skeleton shown in FIG. 2 (b).
  • 1-O- ⁇ -MEL-B has the characteristics of improved hydration and high vesicle-forming ability as compared with 4-O- ⁇ -MEL-B, and is a promising biomaterial as a skin care agent. ..
  • R 1 , R 3 and R 4 are monoacyl-type MELs (single strands) that are hydrogen atoms. It has been reported that type MEL) is produced (Non-Patent Document 1). This monoacyl type MEL has improved hydrophilicity as compared with the conventional diacyl type MEL (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 The MEL biosynthetic pathway has already been reported, and MEL is synthesized intracellularly by the reaction of glycosyltransferase that binds mannose and erythritol, acyltransferase that binds fatty acids, and acetyltransferase that binds acetyl groups.
  • Patent Document 1 By deleting the gene for the acyltransferase of a microorganism capable of producing biosurfactants, the present inventors have created a monoacyl-type MEL in which an aliphatic acyl group is bound only to R 1 in the structural formula of FIG. It was found that it can be obtained (Patent Document 1).
  • Item 1 A method for producing a monoacyl type MEL, which comprises culturing a microorganism capable of producing a monoacyl type MEL in the presence of a surfactant.
  • Item 2 Item 2. The method according to Item 1, wherein the surfactant is a nonionic surfactant.
  • Item 3 Item 2. The method according to Item 1 or 2, wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Pseudozaima.
  • Item 4 Item 6. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the microorganism lacks a gene encoding a mannose acyltransferase.
  • Item 5 Item 6.
  • Items 6 A monoacyl-type MEL production-enhancing agent for a microorganism having a monoacyl-type MEL-producing ability, which contains a surfactant.
  • Item 7 Use of surfactants to improve the monoacyl-type MEL-producing ability of microorganisms having monoacyl-type MEL-producing ability.
  • the manufacturing efficiency of monoacyl type MEL can be improved.
  • the structure of MEL is shown.
  • the structures of 4-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol (a) and 1-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol (b) are shown.
  • the results of thin-layer chromatography evaluation of monoacyl-type MEL extracted with ethyl acetate and methanol are shown.
  • the results of evaluation of monoacyl type MEL extracted with methanol, ethanol and acetone by thin layer chromatography are shown.
  • the results of thin-layer chromatography evaluation of the amount of monoacyl-type MEL produced when monoacyl-type MEL-producing bacteria were cultured in a surfactant-free medium are shown.
  • the results of thin-layer chromatography evaluation of the cell growth amount (a) and the monoacyl-type MEL production amount (b) when the monoacyl-type MEL-producing bacteria were cultured in the MEL-B-added medium are shown.
  • the results of thin-layer chromatography evaluation of the cell growth amount (a) and the monoacyl-type MEL production amount (b) when the monoacyl-type MEL-producing bacteria were cultured in the Tween20-added medium are shown.
  • the results of thin-layer chromatography evaluation of the amount of monoacyl-type MEL produced when monoacyl-type MEL-producing bacteria were cultured in the Triton X-100-added medium are shown.
  • the results of thin-layer chromatography evaluation of the amount of monoacyl-type MEL produced when monoacyl-type MEL-producing bacteria were cultured in BRIJ35-added medium are shown.
  • the surfactant When culturing a microorganism that produces monoacyl-type MEL, it is preferable to culture in the presence of a surfactant.
  • the type of surfactant is not particularly limited and is arbitrary.
  • the surfactant can be a nonionic surfactant, an anionic surfactant, a cationic surfactant, or an amphoteric surfactant.
  • the surfactant is preferably nonionic.
  • the nonionic surfactant include ether type, ester type, ester ether type and the like.
  • the nonionic surfactant is preferably of the ether type.
  • ether-type nonionic surfactants examples include polyoxyethylene surfactants (for example, polyoxyethylene octylphenyl ether (TritonX-100), polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween20), and polyoxyethylene lauryl). Ether (BRIJ35)), block polymer surfactants (eg, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether), MEL, sophorolipid, ramnolipid, trehalose lipid.
  • the surfactant is preferably an anionic surfactant.
  • anionic surfactant examples include carboxylic acid type surfactants (for example, sodium octanate, sodium decanoate, sodium laurate, sodium myristate, sodium palmitate, sodium stearate, etc.) and sulfonic acid type surfactants.
  • carboxylic acid type surfactants for example, sodium octanate, sodium decanoate, sodium laurate, sodium myristate, sodium palmitate, sodium stearate, etc.
  • sulfonic acid type surfactants for example, sodium octanate, sodium decanoate, sodium laurate, sodium myristate, sodium palmitate, sodium stearate, etc.
  • Agents eg, sodium 1-hexanesulfonate, sodium 1-octanesulfonate, sodium 1-decanesulfonate, sodium 1-dodecanesulfonate, perfluorobutanesulfonic acid, sodium toluenesulfonate, etc.
  • phosphate ester surfactants Activators eg, lauryl phosphate, sodium lauryl phosphate, potassium lauryl phosphate, etc.
  • these surfactants can be used in any combination.
  • the mode of culturing the monoacyl-type MEL-producing microorganism in the presence of a surfactant is not particularly limited.
  • a surfactant can be added to a liquid medium and the monoacyl-type MEL-producing microorganism can be cultured in the medium.
  • the amount of surface activity added to the medium is not particularly limited, and can be appropriately set in consideration of the type of surfactant, the type of microorganism, the type of medium, and the like.
  • the concentration of the surfactant in the medium is 0.0001% by mass or more and 1% by mass or less, 0.001% by mass or more and 1% by mass or less, 0.0001% by mass or more and 0.1% by mass or less, 0.001.
  • Mass% or more and 0.1% by mass or less 0.01% by mass or more and 0.1% by mass or less, 0.0001% by mass or more and 0.05% by mass or less, 0.001% by mass or more and 0.05% by mass or less, 0 It can be set to be .0001% by mass or more and 0.01% by mass or less, or 0.001% by mass or more and 0.01% by mass or less.
  • the monoacyl type MEL can be extracted by using any of methanol, ethanol, and acetone after lyophilizing the culture solution.
  • the type of microorganism that produces monoacyl-type MEL is not particularly limited.
  • a microorganism that produces the monoacyl-type MEL described in Patent Document 1 can be used.
  • the entire patent document is incorporated herein by reference.
  • the monoacyl-type MEL-producing microorganism preferably belongs to the genus Pseudozyma, the genus Moijiomyces, the genus Ustilago, the genus Spolisolium, the genus Melanopsichium, or the genus Kurtumanomyces.
  • Pseudozyma genus microorganisms are Pseudozyma antarctica (Moesziomyces antarcticus), Pseudozyma parantarctica, Pseudozyma rugulosa, Pseudozyma siamensis, Pseudozyma shanxiensis, Pseudozyma crassa, Pseudozyma churassa, Pseudozyma chura.
  • Pseudozyma antarctica Moesziomyces antarcticus
  • Pseudozyma parantarctica Pseudozyma rugulosa
  • Pseudozyma siamensis Pseudozyma shanxiensis
  • Pseudozyma crassa P
  • Preferred microorganisms of the genus Moesziomyces are Moesziomyces antarcticus and Moesziomyces aphidis.
  • Preferred Ustilago microorganisms are Ustilago hordei and Ustilago maydis.
  • Preferred Sporisorium genus microorganisms are Sporisorium reilianum and Sporisorium scitamineum.
  • a preferred microorganism of the genus Melanopsichium is Melanopsichium pennsylvanicum.
  • a preferred microorganism of the genus Kurtzmanomyces is Kurtzmanomyces sp. I-11.
  • the MEL-producing microorganism is a Pseudozyma genus microorganism, more preferably a microorganism belonging to Pseudozyma tsukubaensis, more specifically Pseudozyma tsukubaensis 1E5 (JCM16987 strain), NBRC1940 (ATCC24555, CBS422.96). , CBS6389, DBVPG6988, PYCC4855, JCM10324, MUCL29894, NCYC1510, NRRLY-7792).
  • Microorganisms belonging to Pseudozyma tsukubaensis are known to selectively produce 1-O- ⁇ -MEL-B.
  • the monoacyl-type MEL-producing microorganism can be obtained by mutating the conventional MEL-producing microorganism.
  • the conventional MEL is a diacyl type MEL.
  • the type of mutation is not particularly limited, but it is preferably a mutation that disrupts the gene encoding the acyltransferase of the MEL-producing microorganism.
  • Gene disruption means that the protein encoded by the gene (for example, acyltransferase) does not function, and the mode thereof is not particularly limited.
  • a microorganism producing monoacyl-type MEL can be obtained by disrupting a gene encoding an acyltransferase possessed by a MEL-producing microorganism.
  • MEL-producing microorganisms generally have two types of mannose acyltransferases (MAC1 and MAC2).
  • MAC1 and MAC2 are acyltransferases that catalyze the reaction of binding fatty acids to the hydroxyl groups at the 2- and 3-positions of mannose.
  • either the gene encoding MAC1 or MAC2 may be disrupted, or both may be disrupted. In one preferred embodiment, it is preferred to disrupt the gene encoding MAC2.
  • Gene destruction can be done by any method.
  • gene disruption can be achieved by introducing a mutation into the base sequence of the gene, disrupting or deleting an expression control region (promoter, etc.) of the gene, or inhibiting translation of a transcript of the gene.
  • These include, for example, homologous recombination method, transposon method, transgene method, posttranscription gene silencing method, RNAi method, nonsense-mediated decay (NMD) method, ribozyme method, antisense method, and miRNA (micro-). It can be carried out by using the RNA) method, the siRNA (small interfering RNA) method, or the like.
  • gene disruption is preferably carried out using a homologous recombination method.
  • Techniques for disrupting genes by homologous recombination are known.
  • a gene cassette in which a selectable marker gene such as a gene that complements drug resistance or nutritional requirement is inserted in the ORF of the target gene is prepared, and an appropriate vector (
  • it is a method of incorporating it into a plasmid), introducing it into a host microorganism (for example, a conventional MEL-producing microorganism), and inserting a marker gene into a target gene by homologous recombination.
  • Microorganisms in which the target gene is disrupted can be selected by expressing the above marker gene.
  • a selectable marker gene of a transformant usually used in genetic engineering can be used. For example, it complements the nutritional requirements of genes that confer resistance to drugs such as hygromycin, zeosin, canamycin, chloramphenicol, and G418, uracil synthase, leucine synthase, adenine synthase, and lysine synthase. Genes can be mentioned.
  • the target gene is preferably the MAC2 gene.
  • Examples of typical MAC2 genes are as follows.
  • SEQ ID NO: 1 is a nucleotide sequence encoding an acyltransferase (PaMAC2) derived from the Pseudozyma antaractica T34 strain.
  • SEQ ID NO: 2 is a nucleotide sequence encoding an acyltransferase (PaMAC2) derived from the Pseudozyma antaractica JCM10317 strain.
  • SEQ ID NO: 3 is a nucleotide sequence encoding an acyltransferase (PhMAC2) derived from the Pseudozyma hubeiensis SY62 strain.
  • SEQ ID NO: 4 is a nucleotide sequence encoding an acyltransferase (PtMAC2) derived from the Pseudozyma tsukubaensis NBRC1940 strain.
  • SEQ ID NO: 5 is a nucleotide sequence encoding an acyltransferase (PtMAC2) derived from the Pseudozyma tsukubaensis1E5 strain.
  • SEQ ID NO: 6 is a nucleotide sequence encoding an acyltransferase (MAC2) derived from the Pseudozyma aphidis DSM70725 strain.
  • a vector for disrupting the gene for acyltransferase can be constructed.
  • the P. antarctica T-34 is also referred to as the "Moesziomyces antarcticus T-34".
  • P. aphidis is also called “Moesziomyces aphidis”.
  • Vectors for the host of the genus Pseudozaima include, for example, pUXV1 ATCC 77463, pUXV2 ATCC 77464, pUXV5 ATCC 77468, pUXV6 ATCC 77469, pUXV7 ATCC 77470, pUXV8 ATCC 77471, pUXV3 ATCC 77465, pU2X1 ATCC 77466, pU2X Examples thereof include pTA2, pUXV1-neo, pPAX1-neo, pPAA1-neo (Appl Microbiol Biotechnol (2016) 100: 3207-3217, pUC_neo and pUC T _neo.
  • the vector can be introduced into the host cell by any method, and can be appropriately selected according to the type of the host cell and the vector.
  • the introduction of the vector can be carried out by, for example, electroporation, calcium phosphate co-precipitation method, lipofection, microinjection, lithium acetate method and the like.
  • monoacyl-type MEL can be produced by culturing in a medium suitable for culturing MEL-producing microorganisms.
  • the medium is not particularly limited, but for example, it is desirable to use sugars such as glucose, sucrose, and molasses as the carbon raw material.
  • sugars such as glucose, sucrose, and molasses
  • fats and oils can be used as a carbon source.
  • the type of fats and oils is not particularly limited, and for example, it is preferable to add vegetable fats and oils, fatty acids or esters thereof.
  • vegetable oil it is preferable to add vegetable oil to the medium.
  • the type of vegetable oil is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the type of target MEL and the like.
  • soybean oil, olive oil, rapeseed oil, safflower oil, sesame oil, palm oil, sunflower oil, coconut oil, cocoa butter, castor oil and the like can be mentioned.
  • fatty acids include caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, bechenic acid, and nervonic acid.
  • the preferred fatty acid is oleic acid.
  • a microorganism that produces monoacyl-type MEL can be cultured in a medium containing only glucose as a carbon source.
  • a nitrogen source an organic nitrogen source and an inorganic nitrogen source can be used in combination.
  • the organic nitrogen source one or a combination of two or more selected from the group consisting of yeast extract, malt extract, peptone, polypeptone, corn steep liquor, casamino acid, and urea can be used.
  • the inorganic nitrogen source one type or a combination of two or more types selected from the group consisting of sodium nitrate, potassium nitrate, ammonium nitrate, ammonium sulfate, and ammonia can be used.
  • a method for producing a monoacyl type MEL comprises culturing a microorganism capable of producing a monoacyl type MEL in a medium supplemented with fatty acid and glycerin.
  • the amounts of fatty acids and fats and oils are not particularly limited, but for example, they can be added so that the concentration in each medium is 0.1 to 40% by volume.
  • the culture conditions for microorganisms are not particularly limited. For example, it can be cultured for 3 to 7 days under the conditions of pH 5 to 8, preferably pH 6, temperature 20 to 35 ° C., preferably 22 to 28 ° C.
  • Extraction of monoacyl-type MEL produced by a microorganism capable of producing monoacyl-type MEL can be performed by any method.
  • the culture solution or cell disruption solution is centrifuged, the supernatant is collected, an appropriate extraction solvent is added to the supernatant, the extraction solvent layer is collected, and further purification is performed if necessary to perform monoacyl.
  • Type MEL can be obtained.
  • the extraction solvent used for the extraction of the monoacyl type MEL is preferably one or more selected from the group consisting of methanol, ethanol, acetone and a mixture thereof from the viewpoint of extraction efficiency. Acetone is preferable from the viewpoint that hydrophilic impurities and monoacyl type MEL can be efficiently separated to obtain monoacyl type MEL.
  • the surfactant can be used as a monoacyl-type MEL production promoter by a monoacyl-type MEL-producing microorganism.
  • surfactants can be used to stimulate the production of monoacyl-type MEL by monoacyl-type MEL-producing microorganisms and to stabilize monoacyl-type MEL production.
  • MEL production medium Prepared by dissolving 5 g of yeast extract, 3 g of sodium nitrate, 0.3 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.3 g of magnesium sulfate / heptahydrate, 20 g of glycerol, and a surfactant described below in 1 L of deionized water.
  • Methanol was added to the dried supernatant, and the mixture was stirred with a vortex and allowed to stand overnight at room temperature. After standing, the methanol layer was recovered and filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a methanol extract. Extraction using ethanol or acetone was also carried out in the same manner as in the case of methanol.
  • Fig. 4 shows the results of extraction with ethanol and acetone. It was confirmed that ethanol and acetone can extract monoacyl type MEL more efficiently than ethyl acetate as well as methanol. In particular, in acetone extraction, almost no highly hydrophilic impurities detected at the origin were detected in methanol or ethanol extraction, and it was confirmed that only monoacyl-type MEL can be extracted with higher purity. It was also confirmed that, unlike methanol and ethanol, monoacyl-type MEL spots were detected in a single spot.
  • the TLC plates on the left, middle, and right in FIG. 5 represent the results of the first, second, and third cultures, respectively. As shown in FIG. 5, it was confirmed that the monoacyl-type MEL was not produced (third time) or was produced in a very small amount (first time) under the condition of no addition of a surfactant.
  • FIG. 6 shows the results of culturing the monoacyl-type MEL-producing strain in the MEL production medium to which MEL-B was added.
  • (a) shows the amount of bacterial cell growth
  • (b) shows the result of TLC analysis.
  • the production amount of monoacyl type MEL was significantly improved as compared with the non-addition condition, and monoacyl type MEL was stably produced in all cultures. It was confirmed that it would be done.
  • the amount of bacterial cell growth also exceeded that in the case of no addition.
  • FIG. 7 shows the results of culturing the monoacyl-type MEL-producing strain in the MEL production medium to which Tween20 was added.
  • (a) shows the amount of bacterial cell growth
  • (b) shows the result of TLC analysis.
  • the addition of Tween 20 improved the production amount of the monoacyl type MEL as compared with the non-addition condition, and that the monoacyl type MEL was stably produced in all the cultures.
  • the amount of bacterial cell growth also exceeded that in the case of no addition.
  • FIG. 9 shows the results of culturing the monoacyl-type MEL-producing strain in the MEL production medium to which BRIJ35 was added. As shown in FIG. 9, it was confirmed that the addition of 0.01% BRIJ35 improved the production amount of monoacyl type MEL as compared with the non-addition condition, and stable production of monoacyl type MEL in all cultures. .. The amount of bacterial cell growth was 20.6 ⁇ 0.4 g / L.

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Abstract

モノアシル型MELを効率的に生産する手段を提供すること。 モノアシル型MEL生産菌を界面活性剤の存在下で培養すること。

Description

モノアシル型ＭＥＬの製造
　微生物を用いたモノアシル型MELの製造に関する技術が開示される。
　バイオサーファクタントは微生物が生産する天然の界面活性剤であり、生分解性が高く、環境低負荷であり、種々の有益な生理機能を有する。よって、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境工業分野等で使用すれば、環境調和型の社会を実現する上で有意義である。
　バイオサーファクタントは、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子系の5つに分類される。これらの中でも、糖脂質系の界面活性剤が最もよく研究されている。このような糖脂質系のバイオサーファクタントとしては、マンノースにエリスリトールがグリコシド結合したマンノシルエリスリトール（以下、MEとも称す。）に、更に脂肪酸がエステル結合したマンノシルエリスリトールリピッド（以下、MELとも称す。）、並びに、ラムノリピッド、ユスチラジン酸、トレハロースリピッド、及びソホロースリピッド等が知られている。
　MELには結合する脂肪酸残基並びにアセチル基の位置及び数等が相違する種々の構造が存在する。図１に、水素原子、アセチル基、及び炭素数3～18の脂肪酸残基をR1～R5で示したMELの構造式を示す。R1及びR2が脂肪酸残基であり、かつR3及びR4がアセチル基である構造物はMEL－A、R3が水素原子でありR4がアセチル基である構造物はMEL－B、R3がアセチル基でR4が水素原子である構造物はMEL－C、R3及びR4が水素原子である構造物はMEL－Dと定義される。マンノースと結合するエリスリトールのヒドロキシメチル基が1位の炭素に由来するか、4位の炭素に由来するかによって、得られるMEの構造は図２（ａ）、（ｂ）に示すように相違する。図２（ａ）に示される4－O－β－D－mannopyranosyl－erythritolを糖骨格とするMELを4－O－β－D－MELと称する。シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）は、図２（ｂ）に示される1－O－β－D－mannopyranosyl－erythritolを糖骨格とする1－O－β－D－MEL－Bを生産することが知られている。1－O－β－MEL－Bは、4－O－β－MEL－Bと比べて水和性が向上し、ベシクル形成能も高いという特徴を持ち、スキンケア剤などとして有望なバイオ素材である。
　炭素源をグルコースのみとして、MEL生産菌を培養することで、図1のMELにおいてR2のみに脂肪酸が結合し、R1、R3及びR4は水素原子であるモノアシル型MEL（1本鎖型MEL）が生産されることが報告されている（非特許文献1）。このモノアシル型MELは、従来のジアシル型MELと比較して、親水性が向上している（非特許文献1）。
　MEL生合成経路は既に報告されており、マンノースとエリスリトールを結合する糖転移酵素、脂肪酸を結合するアシル基転移酵素、アセチル基を結合するアセチル基転移酵素の反応によって、MELが細胞内で合成される（非特許文献2）。
　本発明者らは、バイオサーファクタントを生産する能力を有する微生物のアシル基転移酵素の遺伝子を欠失させることにより、図1の構造式においてR1だけに脂肪族アシル基が結合したモノアシル型MELが得られることを見出した（特許文献1）。
特願2016-191438
Fukuoka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 76: 801-810. Hewald et al., Appl. Environ. Microbiol. (2006) 72: 5469-5477
　モノアシル型MELの効率的な生産が1つの課題である。
　斯かる課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、モノアシル型MEL生産菌の培養時に、培地に界面活性剤を添加することで、モノアシル型MELの生産効率が向上することが見出された。これらの知見に基づき、更なる研究と検討を重ねた結果、下記に代表される発明が提供される。
項１
モノアシル型MEL生産能を有する微生物を界面活性剤の存在下で培養することを含む、モノアシル型MELを製造する方法。
項２
界面活性剤がノニオン系界面活性剤である、項１に記載の方法。
項３
微生物がシュードザイマ属に属する微生物である、項１又は２に記載の方法。
項４
微生物がマンノースアシル基転移酵素をコードする遺伝子が欠損している、項１～３のいずれかに記載の方法。
項５
メタノール、エタノール及びアセトン及びこれらの混合物からなる群より選択される一種以上を用いてモノアシル型MELを抽出する工程を更に含む、項１～４のいずれかに記載の方法。
項６
界面活性剤を含む、モノアシル型MEL生産能を有する微生物のモノアシル型MEL生産能向上剤。
項７
モノアシル型MEL生産能を有する微生物のモノアシル型MEL生産能を向上させるための界面活性剤の使用。
　モノアシル型MELの製造効率を向上させることができる。
MELの構造を示す。 4－O－β－D－mannopyranosyl－erythritol（ａ）及び1－O－β－D－mannopyranosyl－erythritol（ｂ）の構造を示す。 酢酸エチル及びメタノール抽出したモノアシル型MELを薄層クロマトグラフィで評価した結果を示す。 メタノール、エタノール及びアセトン抽出したモノアシル型MELを薄層クロマトグラフィで評価した結果を示す。 界面活性剤非添加培地でモノアシル型MEL生産菌を培養した際のモノアシル型MEL生産量を薄層クロマトグラフィで評価した結果を示す。 MEL-B添加培地でモノアシル型MEL生産菌を培養した際の菌体増殖量（ａ）及びモノアシル型MEL生産量（ｂ）を薄層クロマトグラフィで評価した結果を示す。 Tween20添加培地でモノアシル型MEL生産菌を培養した際の菌体増殖量（ａ）及びモノアシル型MEL生産量（ｂ）を薄層クロマトグラフィで評価した結果を示す。 TritonX-100添加培地でモノアシル型MEL生産菌を培養した際のモノアシル型MEL生産量を薄層クロマトグラフィで評価した結果を示す。 BRIJ35添加培地でモノアシル型MEL生産菌を培養した際のモノアシル型MEL生産量を薄層クロマトグラフィで評価した結果を示す
　モノアシル型MELを生産する微生物を培養する際には、界面活性剤の存在下で培養することが好ましい。界面活性剤の種類は特に制限されず任意である。例えば、界面活性剤は、ノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、又は両性界面活性剤であり得る。一実施形態において、界面活性剤はノニオン系であることが好ましい。ノニオン系界面活性剤としては、例えば、エーテル型、エステル型、エステル・エーテル型等を挙げることができる。一実施形態において、ノニオン系界面活性剤はエーテル型であることが好ましい。エーテル型のノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン系界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（TritonX-100）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Tween20）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（BRIJ35））、ブロックポリマー系界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル）、MEL、ソホロリピッド、ラムノリピッド、トレハロースリピッドを挙げることができる。これらの界面活性剤の１種または２種以上を任意に組み合わせて使用することができる。一実施形態において、界面活性剤はアニオン系界面活性剤であることが好ましい。アニオン系界面活性剤としては、例えば、カルボン酸型界面活性剤（例えば、オクタン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム等）、スルホン酸型界面活性剤（例えば、１－ヘキサンスルホン酸ナトリウム、１－オクタンスルホン酸ナトリウム、１－デカンスルホン酸ナトリウム、１－ドデカンスルホン酸ナトリウム、ペルフルオロブタンスルホン酸、トルエンスルホン酸ナトリウム等）、並びにリン酸エステル型界面活性剤（例えば、ラウリルリン酸、ラウリルリン酸ナトリウム、ラウリルリン酸カリウム等）等を挙げることができる。これらの界面活性剤の１種または２種以上を任意に組み合わせて使用することができる。
　界面活性剤の存在下でモノアシル型MEL生産微生物を培養する様式は特に制限されない。例えば、界面活性剤を液体培地に添加し、その培地中でモノアシル型MEL生産微生物を培養することができる。培地に添加する界面活性量は特に制限されず、界面活性剤の種類、微生物の種類、培地の種類などを考慮して適宜設定することができる。例えば、界面活性剤は、培地中の濃度が０．０００１質量％以上１質量％以下、０．００１質量％以上１質量％以下、０．０００１質量％以上０．１質量％以下、０．００１質量％以上０．１質量％以下、０．０１質量％以上０．１質量％以下、０．０００１質量％以上０．０５質量％以下、０．００１質量％以上０．０５質量％以下、０．０００１質量％以上０．０１質量％以下、又は０．００１質量％以上０．０１質量％以下となるように設定することができる。
　培養液からモノアシル型MELを抽出する溶媒として、従来の酢酸エチルは適していない。一実施形態において、モノアシル型MELは、培養液を凍結乾燥後にメタノール、エタノール、アセトンのいずれかを用いて抽出することが出来る。
　モノアシル型MELを生産する微生物の種類は特に制限されない。例えば、特許文献１に記載されるモノアシル型MELを生産する微生物を使用することができる。特許文献は、参照によってその全体が本書に取り込まれる。一実施形態においてモノアシル型MEL生産微生物は、シュードザイマ属、モイジオマイセス属、ウスチラゴ属、スポリソリウムに属、Melanopsichium属、又はクルツマノマイセス属に属することが好ましい。好ましいシュードザイマ属微生物は、Pseudozyma antarctica（Moesziomyces antarcticus）、Pseudozyma parantarctica、Pseudozyma rugulosa、 Pseudozyma siamensis、Pseudozyma shanxiensis、Pseudozyma crassa、 Pseudozyma churashimaensis、Pseudozyma aphidis（Moesziomyces aphidis）、Pseudozyma hubeiensis、及びPseudozyma tsukubaensisである。好ましいモイジオマイセス属微生物はMoesziomyces antarcticus、 Moesziomyces aphidisである。好ましいウスチラゴ属微生物は、Ustilago hordei及びUstilago maydisである。好ましいSporisorium属微生物は、Sporisorium reilianum及びSporisorium scitamineumである。好ましいMelanopsichium属微生物は、Melanopsichium pennsylvanicumである。好ましいクルツマノマイセス属微生物は、Kurtzmanomyces sp. I-11である。好適な一実施形態において、MEL産生微生物は、シュードザイマ属微生物であり、より好ましくはPseudozyma tsukubaensisに属する微生物であり、更に具体的には、Pseudozyma tsukubaensis 1E5（JCM16987株）、NBRC1940（ATCC24555、CBS422.96、CBS6389、DBVPG6988、PYCC4855、JCM10324、MUCL29894、NCYC1510、NRRLY-7792）である。Pseudozyma tsukubaensisに属する微生物は、１-Ｏ-β-MEL-Bを選択的に生産することが知られている。
　一実施形態において、モノアシル型MEL生産微生物は、従来型のMELを生産する微生物に変異を加えることによって得ることができる。ここで従来型のMELとはジアシル型MELである。変異の種類は特に制限されないが、好ましくはMEL生産微生物が有するアシル基転移酵素をコードする遺伝子を破壊する変異であることが好ましい。遺伝子の破壊とは、遺伝子がコードするタンパク質（例えば、アシル基転移酵素）が機能しなくなることを意味し、その態様は特に制限されない。一実施形態において、MEL産生微生物が有するアシル基転移酵素をコードする遺伝子を破壊することによって、モノアシル型MELを生産する微生物を得ることができる。MEL生産微生物は、一般的に、2種類のマンノースアシル転移酵素（MAC1及びMAC2）を有する。MAC1及びMAC2は、マンノースの2位と3位の水酸基に脂肪酸を結合する反応を触媒するアシル基転移酵素である。モノアシル型MEL産生微生物を製造するためには、MAC1及びMAC2のいずれをコードする遺伝子を破壊してもよく、両方を破壊してもよい。好適な一実施形態において、MAC2をコードする遺伝子を破壊することが好ましい。
　遺伝子の破壊は任意の手法で行うことができる。例えば、遺伝子の破壊は、当該遺伝子の塩基配列に変異を導入する方法、当該遺伝子の発現制御領域（プロモーター等）を破壊又は欠失させる方法、又は当該遺伝子の転写産物の翻訳を阻害する方法によって実施することができる。これらは、例えば、相同組換え法、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を用いて行うことができる。
　一実施形態において、遺伝子の破壊は、相同組換え法を用いて行うことが好ましい。相同組換え法による遺伝子を破壊する手法は公知である。例えば、相同組換え法による標的遺伝子の破壊は、標的遺伝子のORF中に、薬剤耐性又は栄養要求性を相補する遺伝子等の選択マーカー遺伝子を挿入した遺伝子カセットを作成し、それを適当なベクター（例えば、プラスミド）に組み込んで、宿主微生物（例えば、従来型MEL生産微生物）に導入し、相同組換えによって標的遺伝子中にマーカー遺伝子を挿入する方法である。標的遺伝子が破壊された微生物は、上記マーカー遺伝子の発現により選択することができる。
　相同組換え法で使用するマーカー遺伝子は、遺伝子工学において、通常使用される形質転換体の選択マーカー遺伝子を用いることができる。例えば、ハイグロマイシン、ゼオシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、及びG418等の薬剤に耐性を付与する遺伝子、ウラシル合成酵素、ロイシン合成酵素、アデニン合成酵素、及びリシン合成酵素等の栄養要求性を相補する遺伝子が挙げられる。
　一実施形態において、標的遺伝子は、MAC2遺伝子であることが好ましい。代表的なMAC2遺伝子の例は次のとおりである。配列番号１は、Pseudozyma antaractica T34株由来のアシル転移酵素（PaMAC2）をコードする塩基配列である。配列番号２は、Pseudozyma antaractica JCM10317株由来のアシル転移酵素（PaMAC2）をコードする塩基配列である。配列番号３は、Pseudozyma hubeiensis SY62株由来のアシル転移酵素（PhMAC2）をコードする塩基配列である。配列番号４は、Pseudozyma tsukubaensis NBRC1940株由来のアシル転移酵素（PtMAC2）をコードする塩基配列である。配列番号５は、Pseudozyma tsukubaensis1E5株由来のアシル基転移酵素（PtMAC2）をコードする塩基配列である。配列番号６は、Pseudozyma aphidis DSM70725株由来のアシル基転移酵素（MAC2）をコードする塩基配列である。これらの配列情報に基づいてアシル転移酵素の遺伝子を破壊するためのベクターを構築することができる。尚、P.antarctica T-34は、「Moesziomyces antarcticus T-34」とも称される。P. aphidisは、「Moesziomyces aphidis」とも称される。
　シュードザイマ属を宿主とする場合のベクターとしては、例えば、pUXV1 ATCC 77463、pUXV2 ATCC 77464、pUXV5 ATCC 77468、pUXV6 ATCC 77469、pUXV7 ATCC 77470、pUXV8 ATCC 77471、pUXV3 ATCC 77465、pU2X1 ATCC 77466、pU2X2 ATCC 77467、pTA2、pUXV1-neo、pPAX1-neo、pPAA1-neo（Appl Microbiol Biotechnol (2016) 100:3207-3217、pUC_neo及び pUCT_neo等を例示することができる。
　宿主細胞へのベクターの導入は任意の手法で行うことができ、宿主細胞及びベクターの種類等に応じて適宜選択できる。ベクターの導入は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈降法、リポフェクション、マイクロインジェクション、及び酢酸リチウム法等によって実施することができる。
　モノアシル型MELを産生する微生物を用いたモノアシル型MELの生産は任意の方法で行うことができる。例えば、MEL生産微生物の培養に適した培地で培養することによってモノアシル型MELを生産することができる。そのような培地としては、特に制限されないが、例えば、炭素原料にグルコース、ショ糖、廃糖蜜などの糖質を用いることが望ましい。糖質に加えて、もしくは置き換えて、油脂類などを炭素源として用いることもできる。油脂類の種類は特に制限されず、例えば、植物油脂、或いは、脂肪酸又はそのエステル類を添加することが好ましい。
　一実施形態において、培地に植物油脂を添加することが好ましい。植物油脂の種類は特に制限されず、目的とするMELの種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、大豆油、オリーブ油、ナタネ油、紅花油、ゴマ油、パームオイル、ひまわり油、ココナッツ油、カカオバター、及びひまし油等を挙げることができる。脂肪酸としては、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、及びネルボン酸等を挙げることができる。一実施形態において、好ましい脂肪酸は、オレイン酸である。
　一実施形態において、炭素源としてグルコースのみを含む培地でモノアシル型MELを生産する微生物を培養することができる。窒素源としては、有機窒素源と無機窒素源を組み合わせて用いることができる。例えば、有機窒素源として、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カザミノ酸、及び尿素から成る群より選択される一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。
　無機窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、及びアンモニアから成る群より選択される一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。別の実施形態において、脂肪酸及びグリセリンを添加した培地でモノアシル型MEL産生能を有する微生物を培養することを含む、モノアシル型MELを製造する方法が提供される。
　脂肪酸及び油脂類の量は、特に制限されないが、例えば、各々培地中の濃度が0.1～40容量％となるように添加することができる。
　微生物の培養条件は特に制限されない。例えば、pH5～8、好ましくはpH6、温度20～35℃、好ましくは22～28℃の条件で3～7日間培養することができる。
　モノアシル型MEL産生能を有する微生物が産生したモノアシル型MELの抽出は、任意の手法で行うことができる。例えば、培養液又は菌体破砕液を遠心分離し、上清を回収し、上清に適当な抽出溶媒を添加し、抽出溶媒層を回収し、必要に応じて更なる精製を行って、モノアシル型MELを得ることができる。一実施形態において、モノアシル型MELの抽出に用いる抽出溶媒は、メタノール、エタノール及び、アセトン及びこれらの混合物からなる群より選択される一種以上であることが抽出効率の観点で好ましい。アセトンは、親水性の不純物とモノアシル型MELを効率的に分離してモノアシル型MELを得ることができるという観点で好ましい。
　上述のように、界面活性剤を用いることにより、微生物によるモノアシル型MELの産生効率（能力）を向上させることができ、またより安定的にモノアシル型MELを得ることができる。よって、一実施形態において、界面活性剤をモノアシル型MEL産生微生物によるモノアシル型MEL産生促進剤として利用することができる。他の実施形態において、モノアシル型MEL産生微生物によるモノアシル型MELの産生を促進させるため、モノアシル型MEL産生を安定化させるために、界面活性剤を使用することができる。
　以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
１．材料
・使用菌体
モノアシル型MEL生産株：シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）1E5株（JCM16987）アシル基転移酵素（PtMAC2）破壊株
・界面活性剤
MEL-B（シュードザイマ・ツクバエンシス培養物の精製品）
Tween20（SIGMA社製）
TritonX-100（MP Biomedicals社製）
BRIJ35（MP Biomedicals社製）
ラウリン酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製）
・培地　
グリセロール添加YM培地：脱イオン水1Lに、酵母エキス3g、麦芽エキス3g、ペプトン5g、グルコース10g、グリセロール50gを溶かして調製した。
MEL生産培地：脱イオン水1Lに、酵母エキス5g、硝酸ナトリウム3g、リン酸二水素カリウム0.3g、硫酸マグネシウム・七水和物0.3g、グリセロール20g、後述の界面活性剤を溶かして調製した。
２．モノアシル型MELの抽出溶媒の検討
２－１．モノアシル型MEL生産株の培養
　モノアシル型MEL生産株をグリセロール添加YM培地2mLで25℃、2日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液1mLをMEL生産培地（0.005% TritonX-100を含む）に3%オリーブ油を添加した培地20mLに接種し、25℃で7日間振とう培養した。培養3日目に2%オリーブ油を追加した（添加油脂量合計5%）。
２－２．モノアシル型MELの抽出
　培養液からのモノアシル型MELの抽出を種々の溶媒（酢酸エチル、メタノール、エタノール、アセトン）を用いて試験した。上記２－１で得た培養液を3,000rpmで遠心し、培養上清を回収した。回収した上清に直接酢酸エチルを添加し、モノアシル型MELを含む酢酸エチル層を回収したものを酢酸エチル抽出物とした。メタノールによる抽出では、初めに回収した上清は-20℃で凍結した後、凍結乾燥を行った。乾燥後の上清にメタノールを添加し、ボルテックスで攪拌した後一晩室温で静置した。静置後、メタノール層を回収し、0.45μmのフィルターでろ過したものをメタノール抽出物とした。エタノール、又はアセトンを用いた抽出もメタノールの場合と同様に行った。
２－３．抽出物中のモノアシル型MEL量の評価
　各溶媒抽出物に含まれるモノアシル型MELの量は、薄層クロマトグラフィ（TLC）で分析した。展開相の組成は、クロロホルム：メタノール：12%アンモニア水＝55：25：2で行った。展開後のTLCプレートに2%アンスロン硫酸試薬を噴霧し、95℃、5分間加熱してモノアシル型MELのスポットを検出した。
　図３に示される通り、メタノール抽出と比較して、酢酸エチル抽出のモノアシル型MEL抽出量は少ないことが確認された。メタノール抽出物中のモノアシル型MELのスポットが2つに分かれているのは、溶媒中の水分の影響であると考えられる。
　同様に、エタノールとアセトンで抽出を行った結果を図４に示す。メタノールと同様に、エタノール及びアセトンでも酢酸エチルよりも効率的にモノアシル型MELを抽出できることが確認された。特にアセトン抽出では、メタノールやエタノール抽出では原点に検出される高親水性の不純物がほとんど検出されず、より高純度にモノアシル型MELのみを抽出可能なことが確認された。また、メタノール、エタノールとは異なり、モノアシル型MELのスポットが単一に検出されることも確認された。
３．モノアシル型MEL生産量の評価
３－１．モノアシル型MEL生産株の培養
　モノアシル型MEL生産株をグリセロール添加YM培地2mLで25℃、2日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液1mLをMEL生産培地に3%オリーブ油を添加した培地20mLに接種し、25℃で7日間振とう培養した。培養3日目に2%オリーブ油を追加した（添加油脂量合計5%）。MEL生産培地は、界面活性剤を含まないもの、及び界面活性剤（MEL-B、Tween20、TritonX-100又はBRIJ35）を0.01％又は0.1％の濃度で含むものを用いた。
３－２．モノアシル型MELの抽出
　上記３－１で得た培養液を3,000rpmで遠心し、培養上清を回収した。回収した上清は-20℃で凍結した後、凍結乾燥を行った。乾燥後の上清にアセトンを添加し、ボルテックスで攪拌した後一晩室温で静置した。静置後、アセトン層を回収し、0.45μmのフィルターでろ過したものをアセトン抽出物とした。
３－３．抽出物中のモノアシル型MEL量の評価
　各アセトン抽出物に含まれるモノアシル型MELの量は、薄層クロマトグラフィ（TLC）で分析した。展開相の組成は、クロロホルム：メタノール：12%アンモニア水＝55：25：2で行った。展開後のTLCプレートに2%アンスロン硫酸試薬を噴霧し、95℃、5分間加熱してモノアシル型MELのスポットを検出した。
３－４．界面活性剤非添加条件でのモノアシル型MEL生産
　界面活性剤非添加のMEL生産培地でモノアシル型MEL生産株を計3回培養した結果を図５に示す（1回に付きn=3で実施）。図５中、左、中、右のTLCプレートはそれぞれ1回目、2回目、3回目の培養結果を表す。図５に示される通り、界面活性剤非添加条件下では、モノアシル型MELは生産されないか（3回目）、生産されてもごく少量である（1回目）ことが確認された。また、n=3で培養を実施しても、1検体からのみしかモノアシル型MELが検出されない（2回目）場合もあり、生産が不安定であることも確認された。菌体増殖量は、計3回の平均で21.9±2.8g/Lであった。
３－５．MEL-B添加条件でのモノアシル型MEL生産
　MEL-Bを添加したMEL生産培地でモノアシル型MEL生産株を培養した結果を図６に示す。図６中（ａ）は菌体増殖量、（ｂ）はTLC分析の結果を表す。図６に示される通り、0.01％及び0.1％MEL-Bの添加により、モノアシル型MELの生産量が非添加条件と比較して大幅に向上し、全ての培養で安定してモノアシル型MELが生産されることが確認された。また、菌体増殖量も非添加条件の場合を上回っていた。
３－６．Tween20添加条件でのモノアシル型MEL生産
　Tween20を添加したMEL生産培地でモノアシル型MEL生産株を培養した結果を図７に示す。図７中（ａ）は菌体増殖量、（ｂ）はTLC分析の結果を表す。図７に示される通り、Tween20の添加により、モノアシル型MELの生産量が非添加条件と比較して向上し、全ての培養で安定してモノアシル型MELが生産されることが確認された。また、菌体増殖量も非添加条件の場合を上回っていた。
３－７．TritonX-100添加条件でのモノアシル型MEL生産
　TritonX-100を添加したMEL生産培地でモノアシル型MEL生産株を培養した結果を図８に示す。図８に示される通り、0.01％TritonX-100の添加により、モノアシル型MELの生産量が非添加条件と比較して大幅に向上し、全ての培養で安定してモノアシル型MELが生産されることが確認された。また、菌体増殖量も25.0±0.4g/Lと非添加条件の場合を上回っていた。
３－８．BRIJ35添加条件でのモノアシル型MEL生産
　BRIJ35を添加したMEL生産培地でモノアシル型MEL生産株を培養した結果を図９に示す。図９に示される通り、0.01％BRIJ35の添加により、モノアシル型MELの生産量が非添加条件と比較して向上し、全ての培養で安定してモノアシル型MELが生産されることが確認された。菌体増殖量は20.6±0.4g/Lであった。
３－９．ラウリン酸ナトリウム添加条件でのモノアシル型MEL生産
　アニオン系界面活性剤であるラウリン酸ナトリウムを0.01％添加したMEL生産培地で上記試験と同様にモノアシル型MEL生産株を培養したところ、界面活性剤非添加の場合と比較して、モノアシル型MELの生産量は上昇し、またモノアシル型MELの生産が安定化することが確認された。
　MEL-Bの培地への添加により、原料油脂の乳化、分散が促進された結果、モノアシル型MELの生産が促進されたと推測される。

Claims (7)

  1. モノアシル型MEL生産能を有する微生物を界面活性剤の存在下で培養することを含む、モノアシル型MELを製造する方法。
  2. 界面活性剤がノニオン系界面活性剤である、請求項１に記載の方法。
  3. 微生物がシュードザイマ属に属する微生物である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 微生物がマンノースアシル転移酵素をコードする遺伝子が欠損している、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. メタノール、エタノール及びアセトン及びこれらの混合物からなる群より選択される一種以上を用いてモノアシル型MELを抽出する工程を更に含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 界面活性剤を含む、モノアシル型MEL生産能を有する微生物のモノアシル型MEL生産能向上剤。
  7. モノアシル型MEL生産能を有する微生物のモノアシル型MEL生産能を向上させるための界面活性剤の使用。
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