JP6920684B2

JP6920684B2 - Ｍｅｌ−ｄの製造方法

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Publication number: JP6920684B2
Application number: JP2017008703A
Authority: JP
Inventors: 周平山本; 岸本　高英; 高英岸本; 友岳森田; あずさ雜賀; 徳馬福岡; 英明小池; 北本　大; 大北本
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Toyobo Co Ltd
Priority date: 2017-01-20
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2021-08-18
Anticipated expiration: 2037-01-20
Also published as: JP2018113946A

Description

バイオサーファクタント（より具体的には、ＭＥＬ−Ｄ）の製造方法に関する技術が開示される。

バイオサーファクタントは微生物が生産する天然の界面活性剤であり、生分解性が高く、環境低負荷であり、種々の有益な生理機能を有する。よって、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等で使用すれば、環境調和型の社会を実現する上で有意義である。

バイオサーファクタントは、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系および高分子系の５つに分類される。糖脂質系のバイオサーファクタントとしては、マンノースにエリスリトールがグリコシド結合したマンノシルエリスリトール（以下、ＭＥとも称す。）に、更に脂肪酸がエステル結合したマンノシルエリスリトールリピッド（以下、ＭＥＬとも称す。）、並びに、ラムノリピッド、ユスチラジン酸、トレハロースリピッド、及びソホロースリピッド等が知られている。

ＭＥＬには結合する脂肪酸残基並びにアセチル基の位置及び数等が相違する種々の構造が存在する。ＭＥＬの一般的な構造式を図１に示す。ＭＥＬ−Ａは、図１の構造式においてＲ_１およびＲ_２が脂肪族アシル基であり、かつＲ_３およびＲ_４がアセチル基である。ＭＥＬ−Ｂは、Ｒ_１およびＲ_２が脂肪族アシル基であり、Ｒ_３が水素原子であり、Ｒ_４がアセチル基である。ＭＥＬ−Ｃは、Ｒ_１およびＲ_２が脂肪族アシル基であり、Ｒ_３がアセチル基であり、Ｒ_４が水素原子である。ＭＥＬ−Ｄは、Ｒ_１およびＲ_２が脂肪族アシル基であり、Ｒ_３およびＲ_４が水素原子である。マンノースと結合するエリスリトールのヒドロキシメチル基が１位の炭素に由来するか、４位の炭素に由来するかによって、ＭＥＬには図２（ａ）及び（ｂ）に示す光学異性体が存在する。図２（ａ）の構造を有するＭＥＬを４−Ｏ−β−ＭＥＬと称し、図２（ｂ）の構造を有するＭＥＬを１−Ｏ−β−ＭＥＬと称する。シュードザイマ・ツクバエンシスは、１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂを生産することが知られ、１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂは４−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂと比べて水和性が高く、ベシクル形成能も高いという特徴を有する。

ＭＥＬ−Ｄは、図１の構造式におけるＲ_３およびＲ_４がいずれも水素原子であるため、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−ＢおよびＭＥＬ−Ｃと比較して水への親和性が高い。それ故、ＭＥＬ−Ｄは、水溶性を必要とする用途に有用であり、その大量生産技術が切望されている。

ＭＥＬ−Ｄの製造方法として、特許文献１には、ＭＥＬ−Ｂ等のアセチル基をリパーゼで脱アシル化してＭＥＬ−Ｄを製造する技術が開示されている。

特許第５００７３９６

上記のような現状の下、ＭＥＬ−Ｄを効率的に製造する手段を提供することが１つの課題である。

斯かる課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、バイオサーファクタントを生産する能力を有する微生物のアセチル基転移酵素の遺伝子を欠失させることにより、当該微生物は、図１の構造式においてＲ_３およびＲ_４のいずれもが水素原子であるＭＥＬ−Ｄを生産するようになることを見出した。これらの知見に基づき、更なる研究と検討を重ねた結果、下記に代表される発明が提供される。
項１．
下記式（１）の構造を有するＭＥＬ−Ｄを産生する微生物。

（式中、Ｒ_１は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。Ｒ_２は水素原子、アセチル基又は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。Ｒ_３及びＲ_４は水素原子を表す。）
項２．
Ｒ_２が水素原子又はアセチル基である、項１に記載の微生物。
項３．
Ｒ_２が炭素数２〜２４の脂肪族アシル基である、項１に記載の微生物。
項４．
マンノースアセチル転移酵素をコードする遺伝子が欠損している、項１〜３のいずれかに記載の微生物。
項５．
微生物がシュードザイマ属に属する、項１〜４のいずれかに記載の微生物。
項６．
微生物がシュードザイマ・ツクバエンシスに属する、項１〜５のいずれかに記載の微生物。
項７．
項１〜６のいずれかに記載の微生物を用いてＭＥＬ−Ｄを製造する方法。
項８．
ＭＥＬ−ＤにおけるＲ_２が水素原子又はアセチル基である、項７に記載の方法。
項９．
微生物を植物油脂を含む培地で培養する工程を含む、項７又は８に記載の方法。
項１０．
ＭＥＬ生産能を有する微生物のマンノースアセチル転移酵素をコードする遺伝子を破壊する工程を含む、上記式（１）の構造を有するＭＥＬ−Ｄ生産微生物を製造する方法。
項１１．
ＭＥＬ生産能を有する微生物がシュードザイマ属微生物である、項１０に記載の方法。
項１２．
ＭＥＬ生産能を有する微生物がシュードザイマ・ツクバエンシスに属する微生物である、項１０又は１１に記載の方法。
項１３．
ＭＥＬ−ＤにおけるＲ_２が水素原子又はアセチル基である、項１０〜１２のいずれかに記載の方法。

一実施形態において、ＭＥＬ−Ｄを効率的に生産する手段が提供される。

ＭＥＬの構造を示す。４−Ｏ−β−Ｄ−ＭＥＬ（ａ）及び１−Ｏ−β−Ｄ−ＭＥＬ（ｂ）の構造を示す。ＭＡＴ遺伝子破壊ベクターの構造を示す。ＭＡＴ遺伝子遺伝子破壊株が生産するＭＥＬのパターンを確認した薄層クロマトグラフィーの結果を示す。ＭＡＴ遺伝子破壊株が生産するＭＥＬの構造解析を行った結果を示す。ＭＡＴ遺伝子破壊株が生産するＭＥＬ−Ｄの構造を示す。Ｒ_１は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。

下記式（１）の構造を有するＭＥＬ−Ｄを生産する手段が提供される。

式中、Ｒ_１は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。Ｒ_２は水素原子、アセチル基又は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。Ｒ_３及びＲ_４は水素原子を表す。）

一実施形態において、ＭＥＬ−Ｄは、式１において、Ｒ_２が水素原子又はアセチル基である構造を有するモノアシルＭＥＬ−Ｄであることが好ましい。モノアシルＭＥＬ−Ｄは、Ｒ_２が炭素数２〜２４の脂肪族アシル基であるジアシルＭＥＬ−Ｄと比較してより親水性であるため、そのような特性が求められる用途に適している。一実施形態において、ＭＥＬ−Ｄは、式１においてＲ_２が炭素数２〜２４の脂肪族アシル基であるジアシルＭＥＬ−Ｄであることが好ましい。一実施形態において、ＭＥＬ−Ｄは、モノアシルＭＥＬ−Ｄ及びジアシルＭＥＬ−Ｄの混合物であることが好ましい。

一実施形態において、ＭＥＬ−Ｄは、１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｄであることが好ましい。好適な一実施形態において、ＭＥＬ−Ｄは、下記式（２）の構造を有することが好ましい。

式（２）のＭＥＬ−Ｄにおいて、Ｒ_１及びＲ_２の定義は、式（１）と同じである。一実施形態において、Ｒ_１及びＲ_２は、各々独立して炭素数４〜２４の脂肪族アシル基であることが好ましく、炭素数８〜１４の脂肪族アシル基であることが好ましい。

ＭＥＬ−Ｄ産生微生物及びその製造
上記記載のＭＥＬ−Ｄを生産する微生物が提供される。ＭＥＬ―Ｄを生産する微生物の種類は特に制限されない。一実施形態においてＭＥＬ−Ｄ生産微生物は、シュードザイマ属、モイジオマイセス属、ウスチラゴ属、スポリソリウムに属、Melanopsichium属、又はクルツマノマイセス属に属することが好ましい。好ましいシュードザイマ属微生物は、Pseudozyma antarctica、Pseudozyma parantarctica、Pseudozyma rugulosa、 Pseudozyma siamensis、Pseudozyma shanxiensis、Pseudozyma crassa、 Pseudozyma churashimaensis、Pseudozyma aphidis、Pseudozyma hubeiensis、及びPseudozyma tsukubaensisである。好ましいモイジオマイセス属微生物はMoesziomyces antarcticus、 Moesziomyces aphidisである。好ましいウスチラゴ属微生物は、Ustilago hordei及びUstilago maydisである。好ましいSporisorium属微生物は、Sporisorium reilianum及びSporisorium scitamineumである。好ましいMelanopsichium属微生物は、Melanopsichium pennsylvanicumである。好ましいクルツマノマイセス属微生物は、Kurtzmanomyces sp. I-11である。好適な一実施形態において、ＭＥＬ産生微生物は、シュードザイマ属微生物であり、より好ましくはPseudozyma tsukubaensisに属する微生物であり、更に具体的には、Pseudozyma tsukubaensis 1E5（JCM16987株）、NBRC1940（ATCC24555、CBS422.96、CBS6389、DBVPG6988、PYCC4855、JCM10324、MUCL29894、NCYC1510、NRRLY-7792）である。Pseudozyma tsukubaensisに属する微生物は、１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｂを選択的に生産することが知られている。

一実施形態において、ＭＥＬ−Ｄ生産微生物は、ＭＥＬを生産する微生物（例えば、ジアシル型ＭＥＬ（例えば、ＭＥＬ−Ａ，ＭＥＬ−Ｂ，ＭＥＬ−Ｃ）又はモノアシル型ＭＥＬ（例えば、ＭＥＬ−Ａ，ＭＥＬ−Ｂ，ＭＥＬ−Ｃ））に変異を加えることによって得ることができる。変異の種類は特に制限されないが、好ましくはＭＥＬ生産微生物が有するアセチル基転移酵素をコードする遺伝子を破壊する変異であることが好ましい。遺伝子の破壊とは、遺伝子がコードするタンパク質（例えば、アセチル基転移酵素）が機能しなくなることを意味し、その態様は特に制限されない。一実施形態において、ＭＥＬ産生微生物が有するアセチル基転移酵素をコードする遺伝子を破壊することによって、ＭＥＬ−Ｄを生産する微生物を得ることができる。ＭＥＬ生産微生物は、一般的に、マンノースアセチル転移酵素（ＭＡＴ）を有する。ＭＡＴは、マンノースの4位と6位の水酸基にアセチル基を結合する反応を触媒するアセチル基転移酵素である。ＭＥＬ−Ｄ産生微生物を製造するためには、ＭＡＴをコードする遺伝子を破壊することが好ましい。

遺伝子の破壊は任意の手法で行うことができる。例えば、遺伝子の破壊は、当該遺伝子の塩基配列に変異を導入する方法、当該遺伝子の発現制御領域（プロモーター等）を破壊又は欠失させる方法、又は当該遺伝子の転写産物の翻訳を阻害する方法によって実施することができる。これらは、例えば、相同組み換え法、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を用いて行うことができる。

一実施形態において、遺伝子の破壊は、相同組み換え法を用いて行うことが好ましい。相同組み換え法による遺伝子を破壊する手法は公知である。例えば、相同組み換え法による標的遺伝子の破壊は、標的遺伝子のＯＲＦ中に、薬剤耐性又は栄養要求性を相補する遺伝子等の選択マーカー遺伝子を挿入した遺伝子カセットを作成し、それを適当なベクター（例えば、プラスミド）に組み込んで、宿主微生物（例えば、従来型ＭＥＬ生産微生物）に導入し、相同組み換えによって標的遺伝子中にマーカー遺伝子を挿入する方法である。標的遺伝子が破壊された微生物は、上記マーカー遺伝子の発現により選択することができる。

相同組み換え法で使用するマーカー遺伝子は、遺伝子工学において、通常使用される形質転換体の選択マーカー遺伝子を用いることができる。例えば、ハイグロマイシン、ゼオシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、及びＧ４１８等の薬剤に耐性を付与する遺伝子、ウラシル合成酵素、ロイシン合成酵素、アデニン合成酵素、及びリシン合成酵素等の栄養要求性を相補する遺伝子が挙げられる。

一実施形態において、遺伝子破壊の標的遺伝子は、ＭＡＴ遺伝子であることが好ましい。代表的なＭＡＴ遺伝子の例は次のとおりである。配列番号１は、Pseudozyma antaractica T34株由来のアセチル基転移酵素（ＰaＭＡＴ）をコードする塩基配列である。配列番号２は、Pseudozyma antaractica JCM10317株由来のアセチル基転移酵素（ＰaＭＡＴ）をコードする塩基配列である。配列番号３は、Pseudozyma tsukubaensis1E5株由来のアセチル基転移酵素（ＰｔＭＡＴ）をコードする塩基配列である。これらの配列情報に基づいてアシル転移酵素の遺伝子を破壊するためのベクターを構築することができる。尚、P.antarctica T-34は、「Moesziomyces antarcticus T-34」とも称される。P. aphidisは、「Moesziomyces aphidis」とも称される。

シュードザイマ属を宿主とする場合のベクターとしては、例えば、pUXV1 ATCC 77463、 pUXV2 ATCC 77464、 pUXV5 ATCC 77468、 pUXV6 ATCC 77469、 pUXV7 ATCC 77470、 pUXV8 ATCC 77471、 pUXV3 ATCC 77465、 pU2X1 ATCC 77466、 pU2X2 ATCC 77467、 pTA2、pUXV1-neo、 pPAX1-neo、pPAA1-neo（Appl Microbiol Biotechnol (2016) 100:3207-3217）及びpUC_neo等を例示することができる。

宿主細胞へのベクターの導入は任意の手法で行うことができ、宿主細胞及びベクターの種類等に応じて適宜選択できる。ベクターの導入は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈降法、リポフェクション、マイクロインジェクション、及び酢酸リチウム法等によって実施することができる。

遺伝子を破壊した微生物を用いたＭＥＬ−Ｄの生産は任意の方法で行うことができる。例えば、遺伝子破壊する前のＭＥＬ生産微生物の培養に適した培地で遺伝子を破壊した微生物を培養することによってＭＥＬ−Ｄを生産することができる。そのような培地としては、特に制限されないが、例えば、炭素原料にグルコース、ショ糖、廃糖蜜などの糖質を用いることが望ましい。糖質に加えて、もしくは置き換えて、油脂類などを炭素源として用いることもできる。油脂類の種類は特に制限されず、例えば、植物油脂、或いは、脂肪酸又はそのエステル類を添加することが好ましい。一実施形態において、培地に植物油脂を添加することが好ましい。植物油脂の種類は特に制限されず、目的とするＭＥＬの種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、大豆油、オリーブ油、ナタネ油、紅花油、ゴマ油、パームオイル、ひまわり油、ココナッツ油、カカオバター、及びひまし油等を挙げることができる。脂肪酸としては、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、及びネルボン酸等を挙げることができる。一実施形態において、好ましい脂肪酸は、オレイン酸である。一実施形態において、炭素源としてグルコースのみを含む培地でＭＥＬ−Ｄを生産する微生物を培養することができる。窒素源としては、有機窒素源と無機窒素源を組み合わせて用いることができる。例えば、有機窒素源として、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カザミノ酸、及び尿素から成る群より選択される一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。無機窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、及びアンモニアから成る群より選択される一種類もしくは二種類以上を組み合わせて用いることができる。別の実施形態において、脂肪酸及びグリセリンを添加した培地でマンノシルエリスリトールリピッド産生能を有する微生物を培養することを含む、マンノシルエリスリトールリピッドを製造する方法が提供される。

脂肪酸及び油脂類の量は、特に制限されないが、例えば、各々培地中の濃度が０．１〜２０容量％となるように添加することができる。

微生物の培養条件は特に制限されない。例えば、微生物が、シュードザイマ属の場合には、ｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ６、温度２０〜３５℃、好ましくは２２〜２８℃の条件で３〜７日間培養することができる。ＭＥＬ−Ｄは、常法にしたがって培養液中から回収することができる。

ＭＥＬ−Ｄ含有製品
ＭＥＬ−Ｄは、従来型のＭＥＬ−Ａ、Ｂ、Ｃと比較して水への高い親和性を有すると考えられる。よって、従来型のＭＥＬが使用される分野（例えば、化粧品及び医薬品）において使用でき、特に親水性が求められる分野での利用に適している。一実施形態において、ＭＥＬ−Ｄを含有する皮膚外用剤が提供される。皮膚外用剤の用途は特に制限されないが、例えば、化粧品、医薬部外品、及び／又は医薬品とすることができる。ＭＥＬ−Ｄを配合した化粧品としては、例えば、シャンプー、コンディショナー、トリートメントなどの毛髪化粧料、洗顔料、クレンジング化粧料、日焼け止め化粧料、パック、マッサージ化粧料、化粧水、乳液、クリームなどの皮膚化粧料、アイライナー、マスカラ、口紅、ファンデーションなどのメイクアップ化粧料、並びに浴用化粧料等を挙げることができる。

ＭＥＬ−Ｄ含有皮膚外用剤には、目的に応じて任意のＭＥＬ−Ｄ以外の任意の成分を配合することができる。そのような成分としては、例えば、次を挙げることができる：水；エタノール等のアルコール類、タール系色素、酸化鉄などの着色顔料；パラベン、フェノキシエタノールなどの防腐剤；オリーブスクワラン、米スクワラン、サメスクワランなどのスクワラン；ジメチルポリシロキサン、環状シリコーン等のシリコーン油；パラフィン、流動パラフィン、ワセリン、オレフィンオリゴマー、スクワラン等の炭化水素類；ホホバ油、オリーブ油、マカデミアナッツ油、ヒマシ油、紅花油、ヒマワリ油、アボカド油、キャノーラ油、キョウニン油、米胚芽油、米糠油などの植物油；トリアセチルヒドロキシステアリン酸グリセリル、トリアセチルリシノール酸グリセリル、トリイソパルミチン酸グリセリド、トリイソステアリン酸グリセリル、トリウンデカン酸グリセリル、トリヒドロキシステアリン酸グリセリル、トリオレイン酸グリセリル、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル、トリ（カプリル・カプリン・ミリスチン・ステアリン酸）グリセリル、トリ（カプリル・カプリン・ラウリン酸）グリセリル、トリ（カプリル・カプリン・リノール酸）グリセリル、トリカプリン酸グリセリル、トリ牛脂脂肪酸グリセリル、トリミリスチン酸グリセリド、トリステアリン酸グリセリル、トリパルミチン酸グリセリル、トリ２−ヘプチルウンデカン酸グリセリル、トリベヘン酸グリセリル、トリミリスチン酸グリセリル、トリヤシ油脂肪酸グリセリル、トリラウリン酸グリセリル、トリラノリン脂肪酸グリセリル、２−エチルヘキサン酸グリセリル、トリリノール酸グリセリル等の合成グリセリドなどのトリグリセリド；ミツロウ、モクロウ、カルナバロウ等のロウ類；ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸セチル、イソステアリン酸イソステアリル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；セタノール、ベヘニルアルコール、イソステアリルアルコール、ホホバアルコール、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、長鎖分岐脂肪族アルコール等の高級アルコール類；コレステロール、フィトステロール、分岐脂肪酸コレステロールエステル、マカデミアナッツ脂肪酸フィトステリルエステル等のステロール類及びその誘導体；硬化油等の加工油類；ステアリン酸、ミリスチン酸、イソ型長鎖脂肪酸、アンテイソ型長鎖脂肪酸などの高級脂肪酸；ジカプリルエーテル等のエーテル；リモネン、水素添加ビサボロール等のテルペン類等、セチル硫酸ナトリウム、Ｎ−ステアロイル−Ｌ−グルタミン酸塩などの陰イオン界面活性剤；多価アルコール脂肪酸エステル（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油は除く）、変性シリコーン、蔗糖エステルなどの非イオン界面活性剤；テトラアルキルアンモニウム塩などの陽イオン界面活性剤；ベタイン型、スルホベタイン型、スルホアミノ酸型などの両性界面活性剤；レシチン、リゾフォスファチジルコリン、セラミド、セレブロシドなどの天然系界面活性剤；酸化チタン、酸化亜鉛などの顔料；ジブチルヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤；塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機塩類；クエン酸ナトリウム、酢酸カリウム、琥珀酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ガンマアミノ酪酸、リポ酸等の有機酸塩類；塩酸エタノールアミン、硝酸アンモニウム、塩酸アルギニン等の塩類、エデト酸等のキレート剤；水酸化カリウム、ジイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン等の中和剤；ヒアルロン酸、コラーゲン等の生体高分子；胎盤抽出物；ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルフォン酸塩等の紫外線吸収剤；レチノール、レチノールアセテート、レチノールパルミテートなどのビタミンＡ及びその誘導体；αトコフェロール、γトコフェロール、δトコフェロール、ニコチン酸トコフェロール、酢酸トコフェロールなどのビタミンＥ及びその誘導体；パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、テトライソステアリン酸アスコルビルなどの油溶性ビタミンＣ誘導体；キサンタンガム、ベータグルカン、オーツ麦、白きくらげ等から抽出される多糖類、カラギーナンやアルギン酸、寒天などのような海藻抽出物、カルボキシビニルポリマー、ペクチン、アルキル変性カルボキシビニルポリマーなどの水溶性高分子；ジプロピレングリコール、１，３ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、マルビトール、ジグリセリン、ラフィノース、ヘキシレングリコールなどの多価アルコール等が挙げられるがこれに限定されるものではない。

以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。

１．ウラシル要求性変異株の取得
Pseudozyma tsukubaensis 1E5株を1白金耳分ＹＭ培地(Yeast extract 0.3%、Malt extract 0.3%、Peptone 0.5%、Glucose 1%) 3mlに植菌し、10ml容量の試験管内で25℃、 180rpmの条件で24時間振とう培養した。培養液をシャーレに広げ、UV灯(Panasonic社製GL15殺菌灯)から45cmの位置にプレートを配置した。UVを照射し、培養液を0.2ml回収した。回収した培養液を25℃で3時間インキュベートし、5FOA plate(Yeast nitrogen base w/o AA 0.67%、-Ura DO supplement 0.078%、Uracil 0.05%、5-FOA 0.2%、Glucose 2%、Agar 1.5%)に塗布植菌した。植菌したプレートを25℃で6日間インキュベートし、コロニーを生育させた。5FOAプレートに生育したコロニーをYNB+5FOA+uracil培地につまようじで植え継ぎ、菌体の一部をcolony PCR及びシーケンス解析に供した。PCRのプライマーには下記の塩基配列を有するものを用いた。
PtURA3coloP_F：AATTAAGCTTCTGTGCGGGGCTCTCCTTCCTCCTT（配列番号４）
PtURA3coloP_R：CCATTGCTTACTTCAGTCTTGTCTGTGAGTGTGC（配列番号５）
PtURA5coloP_F： ACGTCAATTCTCGTCTCAGCCAAGCAAGAAGGCG（配列番号６）
PtURA5coloP_R： ATCATGACTCTTTCTCCCACTTGGCTCTTCTCAAG（配列番号７）
シーケンス解析の結果、URA3遺伝子に変異が挿入されていることを確認した。尚、得られたウラシル要求性変異体の栄養要求性試験を行い、ウラシル要求性、5FOA耐性を有していることを確認した。また、ＭＥＬ生産能を維持していることも確認した。

２．ＭＡＴ遺伝子の破壊株の取得
２−１．ＭＡＴベクターの構築
Pseudozyma tsukubaensis 1E5株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲにてＭＡＴ１遺伝子領域の増幅を行った。PCRのプライマーには下記の塩基配列を有するものを用いた。
PtMAT1_U2.0K_F：tgtctactcgctcgactttgcccgtacgcgtctag（配列番号８）
PtMAT1_D2.0K_R：caagcactcctgcaagcatcaacactcctgagcat（配列番号９）
増幅したDNA断片をTArget Clone-Plus-(東洋紡製)を用いてTA cloningし、pTA-MAT1ベクターを作製した。

２−２．ＭＡＴ１破壊ベクターの構築
Pseudozyma tsukubaensis 1E5株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲにてURA5遺伝子領域の増幅を行い、URA5遺伝子断片を取得した。PCRのプライマーには下記の塩基配列を有するものを用いた。
PtURA5U1K_F：CCGAAGGTCATGGTGTTCCCGGTGGCTTGCCATAC（配列番号１０）
PtURA5D05K_R：ACAAGCCAGATCAAGTTCGTCATGTCGGCGGTGAA（配列番号１１）
ついで、pTA-MAT1ベクターをテンプレートとしたＰＣＲにて線状化pTA-MAT1ベクターの増幅を行い、遺伝子断片を取得した。PCRのプライマーには下記の塩基配列を有するものを用いた。
PtMAT1_D2KU5_fF ACGAACTTGATCTGGCTTGTtattactttagctacccatcttcttgcatt（配列番号１２）
PtMAT1_U2KU5_fR GGGAACACCATGACCTTCGGaatactcacttgaaagtgcacgcatcaaac（配列番号１３）
上記で得られた線状化pTA-MAT1ベクターおよびURA5遺伝子断片をFusion(R) HD Cloning Kit(TAKARA製)に供した後、JM109株(東洋紡製)に形質転換し、pTA-MAT1破壊ベクター(pTA-MAT1del-ura5)を作製した。pTA-MAT1破壊ベクターをシーケンス解析することにより目的断片が挿入されていることを確認した。pTA-MAT1破壊ベクターの構造を図３に示す。

２−３．形質転換体の調製
上記２−２．で得られたpTA-MAT1破壊ベクターをPCRで増幅したものを用いて、エレクトロポレーション法にて上記１．で得たウラシル要求性変異株に形質転換した。形質転換体の選別には、ウラシル要求性消失を使用した。目的のDNA断片が相同組み換えによって目的のゲノム位置挿入されたことは、コロニーPCRおよびシーケンス解析にて確認し、ＭＡＴ１遺伝子が破壊された変異体を３株取得した。

２−４．ＭＡＴ１遺伝子破壊形質転換体のＭＥＬ生産能の評価
ＭＡＴ１遺伝子破壊形質転換体２株をそれぞれ３％のグリセロールを含むＹＭ培地６０ｍＬ(５００ｍＬ容量坂口フラスコ)で２５℃、1日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液０．２ｍＬをＭＥＬ培地に１０％オリーブ油を添加した培地２０ｍＬ(５００ｍＬ容量坂口フラスコ)に接種し、２５℃で７日間振とう培養した。得られた菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加し、十分撹拌した後、酢酸エチル層を分取した。酢酸エチル層に含まれるＭＥＬは薄層クロマトグラフィーにて確認した。その結果、図４に示される通り、いずれの変異株（＃１および＃１５）についてもＭＥＬ−Ｂの生産は消失し、ＭＥＬ−ＢよりもＲｆ値の低い２種類の未知の糖脂質の生産が確認された。

３．糖脂質の構造解析
薄層クロマトグラフィーで検出された２種類の未知の糖脂質画分をそれぞれ酢酸エチルにより抽出し、加温減圧により取得した。得られた未知の糖脂質を下記の装置及び条件を用いて構造解析した。
（解析１）
装置：フーリエ変換核磁気共鳴装置（ブルカー・バイオスピン製ＡＶＡＮＣＥ５００）
測定溶液：試料１０〜１００ｍｇを０．６ｍｌの重水素化ジメチルスルホキシドに溶解した。
1Ｈ共鳴周波数：５００．１３ＭＨｚ
検出パルスのフリップ角：４５°
データ取り込み時間：４．０秒
遅延時間：１．０秒
積算回数：４３回
測定温度：３５℃。
（解析２）
装置：フーリエ変換核磁気共鳴装置（ブルカー・バイオスピン製ＡＶＡＮＣＥ５００）
測定溶液：試料１０〜１００ｍｇを０．６ｍｌの重水素化ジメチルスルホキシドに溶解した。
１３Ｃ共鳴周波数：１２５．７６ＭＨｚ
検出パルスのフリップ角：４５°
データ取り込み時間：２．０秒
遅延時間：０．５秒
プロトンデカップリング：フルデカップル。
測定温度：室温
積算回数：４０９６回

構造解析の結果を５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示す。図５Ａの１Ｈ−ＮＭＲの結果は、図４においてジアシル型ＭＥＬ−Ｄと表示したバンドから抽出した糖脂質に関するものであり、２ｐｐｍ付近にアセチル基のピークがなく、脂肪酸がマンノース骨格に２個あることからいずれのＭＡＴ１遺伝子欠損株によって生産された物質も図６ａに示す構造を有するジアシル型ＭＥＬ−Ｄであることが判明した。また、図５Ｂの１Ｈ−ＮＭＲの結果は、図４においてモノアシル型ＭＥＬ−Ｄと表示したバンドから抽出した糖脂質に関するものであり、マンノース３位の水酸基がフリーになっており、プロトンのピークが３．５ｐｐｍ付近に見られるのに対して、２位では水酸基に脂肪酸がエステル結合していることにより、プロトンのピークが５．２ｐｐｍ付近に低磁場シフトしていることから、いずれのＭＡＴ１遺伝子欠損株によって生産された物質も図６ｂに示す構造を有するモノアシル型ＭＥＬ−Ｄであることが判明した。同様に図５Ｃの１３Ｃ−ＮＭＲの結果からも、上記に伴うマンノース２位、３位のカーボンのピークのシフトが確認された。上述の解析結果からいずれのＭＡＴ１遺伝子欠損株によって生産された物質も図６ｂに示す構造を有するモノアシル型ＭＥＬ−Ｄであることが判明した。これらの知見は、ＭＡＴ１がジアシル型ＭＥＬ−Ｄからジアシル型ＭＥＬ−Ａ、−Ｂ，又は−Ｃの合成に関与するアシル基転移酵素であることを踏まえると興味深いものである。以上のとおり、本来ＭＥＬ−Ｂを選択的に生産するPseudozyma tsukubaensis 1E5株のＭＡＴ１遺伝子を破壊することにより、ジアシル型およびモノアシル型のＭＥＬ−Ｄが生産されることが確認された。

Claims

下記式（１）の構造を有するＭＥＬ−Ｄを産生する、ＭＡＴ１遺伝子が破壊されたシュードザイマ・ツクバエンシスに属する微生物。

（式中、Ｒ_１は炭素数２〜２４の脂肪族アシル基を表す。Ｒ_２は水素原子又はアセチル基を表す。Ｒ_３及びＲ_４は水素原子を表す。）
請求項１に記載の微生物を用いて、ＭＥＬ−Ｄを製造する方法。