CN115873729B - 产mel的蚜虫莫氏黑粉xad01工程菌株及其应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本申请提供了产甘露糖赤藓糖醇脂的蚜虫莫氏黑粉（Moesziomyces aphidis）XAD01工程菌株，所述工程菌株为敲除了涉及胞内油脂合成的关键DGA1基因和ARE1基因的蚜虫莫氏黑粉XM01菌株，命名为XAD01。其中，所述DGA1为胞内油脂合成途径中二酰基甘油转移酶的基因序列SEQ ID NO：1；所述ARE1为胞内油脂合成途径中甾醇脂酰基转移酶的基因序列SEQ ID NO：2。所述蚜虫莫氏黑粉XM01菌株是保藏于中国典型培养物保藏中心的蚜虫拟酵母XM01菌株。所述工程菌株在XM01菌株发酵生产甘露糖赤藓糖醇脂优势的基础上，通过遗传改造实现了甘露糖赤藓糖醇脂产量的大幅度提升，为工业化生产中链脂肪酸和中链α‑烯烃提供了可行性途径，具有重要的产业化应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及一种产MEL的蚜虫莫氏黑粉(Moesziomycesaphidis)XAD01工程菌株。本申请还包括采用所述工程菌株制备中链脂肪酸的方法。
背景技术
中链脂肪酸(medium-chain fatty acids，MCFAs)是由中烷基链构成的，末端带有一个羧酸的脂肪酸链；其主要包括己酸(C6)、辛酸(C8)和癸酸(C10)和月桂酸(C12)。中链脂肪酸在人体中主要在胰腺被脂肪酶分解，再通过血管运输到肝进行β氧化释放能量，其代谢速度是长链脂肪酸的10倍，不易形成肥胖。同时，中链脂肪酸在细胞内通过调节细胞代谢影响细胞信号强度。此外，与普通的动植物油相比较，中链脂肪酸还具有氧化稳定性较高、粘度小、表面张力小和对各种化合物具有极好的溶解能力等优点，医药食品领域中可以作为维生素、抗生素等各种医药品的良好溶剂。在化工领域中，中链脂肪酸不仅常常作为食品机械的润滑油减缓机械摩擦损耗，也能作为化妆品的添加剂成分，促进各类化妆品被皮肤吸收并提高产品质量和贮存时间，还可以作为化工原料的合成前体，例如通过P450脱羧酶制备α-烯烃等。
MCFAs是自然界中含量比较少的脂肪酸，天然的中链脂肪酸一般来自动物奶制品，其余主要来自油棕及椰子的提取，来源比较受限。从天然椰子油、可可油和各种油脂中的甘油酯水解分离得到MCFAs，但提取较复杂，且提取量少。早期大多数采用化学氧化法从石油中提取和制备MCFAs，但是存在副产物多、污染严重，且大多数制备以石化产品作为原料，面临原料枯竭的危机。同时，化学合成的中链脂肪酸杂质提纯困难，往往难以被食品医药行业所接受。近些年，生物合成引起了很多学者的关注与研究，然而生物合成同样有着成本高昂，产率较低，无法商业化的致命缺陷。还有研究人员另辟蹊径，利用基因工程可定向改善植物的含油量，从而提高单位面积的产油量。发明专利申请201910176364.8公开了“一种在植物细胞中生产中链脂肪酸的方法”，该申请采用Cre/LoxP系统构建FatB3-LPAAT、FatB3-KASI及FatB3-LPAAT-KASI三种多基因系统，并转入拟南芥中进行种子特异性共表达，有效提高了植物细胞中合成中链脂肪酸的含量。
甘露糖赤藓糖醇脂(MEL)是最有前途的生物表面活性剂之一，最早由Boothroyd于1956年进行描述。MEL是由苔草裂孢黑粉菌(Schizonella melanogramma)和玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)所分泌的油性化合物。MEL通常在甘露糖部分的C-4和C-6处有一个或两个乙酰基。其中MEL-A是双乙酰化的，而MEL-B和MEL-C分别在C-4和C-6处具有一个乙酰化。MEL不仅具有良好的表面活性，还具有许多特殊的生理活性，如抑制微生物生长、诱导细胞变异、可分化人类骨髓性白血病细胞系和黑素瘤细胞、提高基因转染效率、与糖蛋白有很强的配位能力等，可应用于环保、食品、化妆品、医药等行业。基于MEL的良好的应用前景，发明人前期对MEL的生物转化进行了研究，提供了一株产甘露糖赤藓糖醇脂MEL的蚜虫拟酵母菌株，并以来源广泛的可再生资源植物油为底物，发酵生产MEL，但产量仍然有待提高。
此外，目前还没有关于利用MEL代替石化原料制备中链脂肪酸的报道。
发明内容
针对微生物发酵生产MEL所存在的问题，本发明提供了产甘露糖赤藓糖醇脂的蚜虫莫氏黑粉(Moesziomyces aphidis)XAD01工程菌株，通过减少胞内油脂的合成增加了胞外MEL的分泌，同时结合优化的发酵罐发酵工艺，大大提升了MEL的产量。此外，针对现有技术中中链脂肪酸制备方法所存在的问题，本发明提供了采用MEL制备中链脂肪酸的方法；所述方法简化了化学工艺合成的步骤，不但操作简单、产率高，而且成本低廉、降低了污染和能耗，具有重要的商业化应用前景和巨大的经济价值。
本发明的技术方案：
产甘露糖赤藓糖醇脂的蚜虫莫氏黑粉(Moesziomyces aphidis)XAD01工程菌株，所述工程菌株为敲除了涉及胞内油脂合成的关键DGA1基因和ARE1基因的蚜虫莫氏黑粉XM01菌株，命名为XAD01。其中，所述DGA1为胞内油脂合成途径中二酰基甘油转移酶的基因序列SEQ ID NO：1；所述ARE1为胞内油脂合成途径中甾醇脂酰基转移酶的基因序列SEQ IDNO：2。所述蚜虫莫氏黑粉XM01菌株是保藏于中国典型培养物保藏中心的蚜虫拟酵母XM01菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2021517，保藏日期为2021年5月19日；该菌株在发明专利ZL2021108367574中已经公开。所述工程菌株在XM01菌株发酵生产甘露糖赤藓糖醇脂优势的基础上，通过遗传改造实现了甘露糖赤藓糖醇脂产量的大幅度提升，为工业化生产中链脂肪酸，以及中链α-烯烃提供了可行性途径，从而为甘露糖赤藓糖醇脂下游产业的发展提供了可能性，具有重要的产业化应用前景。
所述的蚜虫莫氏黑粉XAD01工程改造菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)利用同源重组，构建XM01菌株的DGA1基因敲除载体；然后通过电击转化的方法，把构建好的基因敲除载体转入原始的XM01菌株中，构建得到DGA1基因缺陷性的XM01改造菌株。
(2)采用相同的方法，把构建好的ARE1基因敲除载体通过电击转化法转入步骤(1)得到的XM01改造菌株，构建得到ARE1和DGA1双基因敲除的XM01改造菌株，即蚜虫莫氏黑粉XAD01工程改造菌株。
所述的蚜虫莫氏黑粉XAD01工程菌株的活化方法，将改造菌株接种到YPD固体培养基中，在28-30℃的温度条件下培养1-2天。其中，所述YPD固体培养基的配方为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，琼脂20g/L。
一种包含如前所述的蚜虫莫氏黑粉XAD01工程菌株的菌剂。
如前所述的蚜虫莫氏黑粉XAD01工程菌株发酵生产甘露糖赤藓糖醇脂(MEL)的方法，包括以下步骤：将所述的蚜虫莫氏黑粉XAD01工程菌株接入种子培养基中进行种子培养，培养后分离得到菌体细胞；将菌体细胞接入到发酵培养基，在25-30℃的温度条件下发酵，发酵完成后从发酵液中分离得到甘露糖赤藓糖醇脂。本申请所述的工程菌株采用植物油或者烷烃为碳源，发酵制备MEL，与现有技术中的MEL制备方法相比，成本大大降低。
其中，所述的种子培养基为：葡萄糖15-30g/L，硝酸铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，酵母提取物1.0g/L。所述的发酵培养基为：适量碳源，硝酸钠或硝酸钾2.0g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，酵母提取物1.0g/L；其中，所述碳源为植物油80-110g/L或者烷烃30-60g/L。发明人研究发现，不同的微生物合成的MEL的尾部会有不同程度的乙酰化，并且尾部的两个脂肪酸残基的链长也会有很大差异。而本申请所述的工程菌株，利用植物油作为碳源生产的MEL，其脂肪酸组成主要为C(8-12)，其中C10酸总比例高达82.82％，且含有27.94％的不饱和C10酸。
优选的是，当所述碳源为植物油时，采用三段式发酵工艺，具体为：(1)发酵初期，添加20-35g/L的植物油，在300-400rpm的转速和600-800L/h的通气量下维持菌体细胞的高速生长；(2)发酵中期，进入产糖脂阶段，降低转速至180-200rpm、通气量至180-200L/h，补加适量植物油、并在植物油消耗完毕时继续补加(可以每12小时测定植物油的消耗)；补加植物油的总量为75-85g/L；(3)发酵后期，继续降低转速至100-120rpm、通气量降至100-120L/h，防止发酵液乳化，至甘露糖赤藓糖醇脂浓度不再增加时发酵结束。
优选的是，通过利用不同的碳源(例如植物油与烷烃)发酵生产的MEL，根据碳源组分的不同，生成的MEL也会含有不同种类的脂肪酸。其中，植物油可以生成以不饱和脂肪酸为主的MEL，而奇数链烷烃可以生成以奇数链脂肪酸为主的MEL。
如前所述的方法得到的MEL在制备中链脂肪酸中的应用。具体步骤为：取适量MEL加入到碱溶液中，在80℃反应2～3h；所述MEL与碱溶液中氢氧根离子的摩尔比为1:15-1:60。然后向体系中加入酸溶液调节pH＝2-5，萃取、旋蒸，即得到中链脂肪酸。其中，采用植物油为碳源发酵生产的MEL时，得到以不饱和脂肪酸为主的中链脂肪酸；采用奇数链烷烃为碳源发酵生产的MEL时，得到以奇数链脂肪酸为主的中链脂肪酸。
如前所述应用得到的中链脂肪酸在制备中链α-烯烃中的应用。具体为：向所述中链脂肪酸酸中加入适量催化酶，即可得到中链α-烯烃；所用的催化酶为大肠杆菌重组表达的OleTJE P450脂肪酸脱羧酶，所述催化酶的添加量为每1mM的中链脂肪酸添加1.0-5.0μM催化酶。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了蚜虫莫氏黑粉(Moesziomyces aphidis)XAD01工程改造菌株，与原始菌株发酵生产MEL的产量最高为96g/L相比，所述工程改造菌株发酵生产MEL的产量可达140g/L，产量显著增加，实现了不可预料的技术效果。
(2本申请所述的工程菌株发酵生产MEL的方法，采用三段式发酵工艺优化发酵前、中、后期流程中的补料、通气和转速，解决了培养基中过多油脂影响菌体初期的生长和MEL容易导致发酵液乳化，以及由此导致的产量低的问题，为MEL的生产工艺的放大提供了切实可行的技术方案。
(3)采用本申请所述工程菌株发酵生产的MEL代替石化原料进行下游产品的生产，不但简化了化学工艺合成的步骤，而且降低污染和能耗，应用前景广阔。
(4)本申请所述工程菌株采用利用不同的碳源(例如植物油与烷烃)，可以发酵生产不同种类的中链脂肪酸，能够最大程度满足下游产业的需求，具有重要的实际应用价值。
附图说明
附图1为本申请所述的工程菌株的验证试验，其中图1a为DGA1、ARE1双敲除的电泳验证图；图1b为DGA1、ARE1双敲除的荧光表达量图；
附图2为本申请所述的工程菌株与原菌株摇瓶发酵MEL的产量与胞内油含量测定图；
附图3为本申请所述的工程改造菌株的10L发酵罐产量图；
附图4为本申请所述的工程菌株的发酵产物MEL的薄层层析图；
附图5为P450还原酶蛋白纯化的蛋白电泳图；
附图6为P450还原酶转化中链脂肪酸的转化率图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：XM01菌株胞内油合成基因DGA1、ARE1的敲除改造
(1)基因敲除载体的构建
通过降低胞内油脂合成，增加胞外MEL的分泌，提升MEL产量。发明人找到胞内油主要成分三酰基甘油(TAG)合成的关键酶：二酰基甘油转移酶和甾醇脂酰基转移酶，并锁定对应的基因DGA1与ARE1。利用同源重组原理，构建Moesziomyces aphidis XM01菌株的DGA1、ARE1基因敲除载体。首先，根据XM01菌株的DGA1 ARE1基因设计5’同源区与3’同源区扩增的引物并加上对应载体的酶切位点，再以Moesziomyces aphidis XM01菌株基因组模板DNA为模板进行PCR扩增。将纯化回收的两段同源区片段分别连接到PMD19-T载体上，然后通过分步酶切连接的方法将同源区片段依次连接到PMD19T-HPT-loxp或PMD19T-NAT-loxp载体上，最终完成DGA1 ARE1基因敲除载体的构建。Moesziomyces aphidis XM01菌株DGA1 ARE1基因5’同源区与3’同源区扩增的引物如表1所示。
表1.DGA1 PCR引物
(2)酵母电击转化法敲除原始菌株的DGA1 ARE1基因
将XM01菌株在YPD固体培养基上活化48h后，挑取若干菌落接种于50mlYPD液体培养基中，180rpm、28℃震荡培养12-18h，保证细胞生长处于对数早期。
取40ml未染杂菌的菌悬液于50ml无菌高心管中，5000xg下4℃离心5min，弃上清。
将菌体用40ml预处理液重悬，加400ulDTT,室温静置30min；4℃5000xg再次离心，弃上清；加10～15ml 1M山梨醇缓冲液重悬，弃上清，再次加入该溶液，重复三次。
根据菌体量适量加入1～2ml 1M山梨醇缓冲液重悬，即可得到感受态细胞。
准备冰砖和灭菌的1.5mlEP管，分装感受态细胞溶液，一个EP管加80ul，并加入30ul基因敲除载体的线性化片段，混匀转移至电转杯中，冰上静置10～15min；准备电转，电击条件1700～1800v电压，20uF电容，200Ω电阻，2mm直径，时间5s；电转后立即加入1mlYPD/山梨醇溶液(YPD为液体YPD，山梨醇为1mol/l各500ul混合)吹打混匀后，28℃下静置1.5～2h。
将静置后的溶液涂布于加潮霉素(200ug/mg)抗性的YPD固体培养基上，28℃培养箱中静置培养36-72h，在平板上长出重组菌株的菌落。
用无菌竹签将长出的重组菌株的单菌落转接至加潮霉素或诺尔丝菌素(200ug/mg)抗性的YPD固体培养基上进行复筛，28℃培养箱静置培养36h；将复筛后的转化子进行保种，用于后续实验。
实施例2：筛选DGA1和ARE1基因敲除的转化子并进行发酵培养
将实施例1获得的转化子接到5ml液体YPD试管中，28℃180rpm，震荡培养24h，提取基因组，用设计的基因5’同源区与3’同源区扩增的引物，用转化子的基因组作为模板进行PCR验证，电泳图结果如图1A所示。其中，1号为ARE1完全敲除的转化子，2号为DGA1完全敲除的转化子。同时提取敲除转化子和原始菌株的RNA进行荧光定量，测定敲除菌株DGA1和ARE1的基因表达量，结果如图1B所示。用验证过的DGA1、ARE1双基因完全敲除的复筛转化子保种后，取20ul菌液接种到5ml液体培养基(葡萄糖30.0g/L，硝酸铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，酵母提取物1.0g/L)中，培养48h，全部倒入50ml发酵培养基(葡萄糖30g/L，大豆油80g/L，硝酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，酵母提取物1.0g/L)中，在180rprm、28℃培养七天，用原始菌株和敲除菌株分别在同一环境与条件下进行发酵，测定其MEL产量。在不采用分批补料，降低转速通气的大体量罐体发酵的方式下，仅使用250ml摇瓶作为容器并添加8％大豆油的碳源来模拟初步的发酵。结果显示，DGA1、ARE1双敲除的菌株最终产量达到了90.6g/L，而原始菌株只有63g/L；同时对XMAD01菌株的胞内油含量进行了测定，胞内油比例从原本的68％降低到了12％，证明改造菌株产MEL能力有了显著提升，MEL产量和胞内油含量结果如图2所示。摇瓶发酵的模拟，为接下来放大发酵工艺提供了依据。
实施例3：以10升发酵罐进行发酵并采用三段式发酵工艺防止罐体乳化并增加产量
利用XAD01菌株，在10-L发酵罐(GJB-10D，镇江贝利生物工程有限公司)中进行MEL发酵生产。种子培养基为葡萄糖30.0g/L，硝酸铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，酵母提取物1.0g/L，在30℃下培养两天，然后以10％接种量接种到发酵培养基中，发酵配培养基配方为葡萄糖30g/L，大豆油110g/L，硝酸钠3g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，酵母提取物1.0g/L，总体积为7升。由于MELs本身具有较好乳化性的特质，易导致罐体乳化，发酵液油脂过多影响细胞前期生长的缺点，采用三段式发酵工艺，优化了发酵前中后期过程中补料、通气、转速的发酵工艺流程，减少油脂与菌体的直接接触，降低罐体乳化风险。其中，大豆油分批加入，在0h加入35g/L，在36h、60h、72h、84h和96h时，各补加的大豆油15g/L。发酵条件搅拌前36h速度为300rpm，通气速率720L/h的，温度28℃。36h至96h补料期间速度为180rpm，通气速率为150L/h，96h至发酵结束，速度为120rpm，通气速率为100L/h。其中，每隔12小时取样进行细胞内油脂含量、脂肪酶活性、细胞干重、大豆油残留量的测定。结果如图3所示，在72h时，初始添加的葡萄糖基本消耗完，在216h时，MEL产量达到最高值140g/L，生物量为18g/L，胞内油脂含量为15％。相比较利用原始菌株进行10L发酵罐的发酵产量最高值96g/L，生物量24g/L，胞内油脂含量60％，XAD01菌株发酵生产MEL的产量提升了44g/L，胞内油脂含量降低了45％。
10升发酵罐的成功培养，证明了改造菌株产量提升的显著效果，证明了生产MEL的工艺放大并实现工业化，是完全可行的。同时本申请创新性的采用分批补料、转速与通气分时段调整的新型发酵方式，减少油脂接触菌体对细胞生长的影响、降低了MEL分泌导致罐体乳化的风险，相较于原始发酵罐发酵工艺整体提升了产量。
实施例4：MEL的测定与分离纯化
将实施例3得到的发酵液用乙酸乙酯进行萃取，获得的乙酸乙酯相液体悬蒸后得到的MEL。用正己烷-甲醇-水(1:6:3)洗涤，除去剩余的油和脂肪酸。收集甲醇相，再旋转蒸发得到初步纯化的MEL。并利用薄层层析法和气质分析确定产物是否为MEL和其结构的特异性。
(1)薄层层析分析
利用薄层层析(TLC)分析和纯化的MEL，展层剂为氯仿、甲醇和NH4OH(65:15:2)，显色剂为地衣酚试剂(0.1％地衣酚用5％的硫酸溶液溶解)，显色过程为110℃，加热5min。先对发酵粗产物进行鉴定和分析，然后分析MEL经两步纯化后组分的变化。结果如图4所示，纯化去除了残存的油脂和游离脂肪酸组分，未纯化的MEL组分主要有MEL-A、MEL-B、MEL-C等，且MEL-A含量最高。
(2)对MEL的气相色谱/质谱分析
对MEL进行甲酯化，然后对其脂肪酸组成进行气相色谱/质谱(GC/MS)测定。结果显示，MEL的主要脂肪酸链长为C8-C10，其中辛酸为15.33％，癸酸为37％，4-癸烯酸为38.67％。
表2.MEL脂肪酸的组成
(3)MEL的纯化
选用200目的硅胶粉末用氯仿浸润后加入层析柱直至20cm左右，等待自然沉降至无气泡后，缓慢倒入混合氯仿的MEL至硅胶柱完全吸收MEL后加入洗脱剂洗脱，洗脱剂为氯仿丙酮混合物，混合比例为3：7(丙酮：氯仿)，洗脱速率为0.2ml.min-1。洗脱完成后，旋蒸，收集纯品进行MEL分析。结果如图4所示，1号样品为罐体的发酵产物MEL经过乙酸乙酯萃取后得到的，其MEL纯度相当高，几乎不含杂质，只有微量残留的游离脂肪酸和豆油；2号样品为利用正己烷-甲醇-水(1:6:3)洗涤后的结果，去除了豆油、游离脂肪酸等杂质，只有不同乙酰化程度MEL的混合物；3号样品为硅胶柱完全纯化后的结果，只含有MEL-A。综上可知，经过硅胶柱层析后，组分分离，得到纯品的MEL-A，收集后可用作制备中链脂肪酸。
实施例5：中链脂肪酸的制备与分析
(1)中链脂肪酸制备流程
将实施例4制备的MEL 1.0g加入2mol/l KOH50ml中，在80℃烘箱密封静置2～3h，用5mol/l HCl调节PH至3，用适量氯仿萃取两次，收集后旋蒸，最后加入DMSO(二甲基亚砜)溶解，备用。
(2)中链脂肪酸的气相色谱/质谱分析
将步骤(1)制备的中链脂肪酸，进行甲酯化后用气质鉴定分析，以此确定利用豆油所产MEL所制备的中链脂肪酸链长组成范围与比例，结果如表3所示。由表3可知，采用MEL制备的中链脂肪酸中，C10酸比例最高，占到了82.82％其中有接近30％的不饱和中链脂肪酸。
表3.中链脂肪酸的组成比例
实施例6：利用不同碳源制备含有不同长度脂肪酸链的MEL
采用天然植物油(大豆油、花生油、菜籽油、玉米油、葵花油)和不同链长的烷烃作为碳源在摇瓶中发酵生产MEL，产量如表4所示。由表4可知，①植物油碳源中大豆油的生产能力最好；②植物油作为碳源生产MEL的产量要远高于不同链长的烷烃；采用天然植物油发酵生产MEL，产量可达69.56-90.60g/L；采用烷烃发酵生产MEL，产量为4.12-39.45g/L。③烷烃的链长越短，产量越低。
表4.不同碳源(植物油和碳源)发酵生产MEL的产量表
(1)对不同种类的植物油碳源进行气相色谱/质谱分析
通过甲酯化对植物油的脂肪酸组成进行气相色谱/质谱(GC/MS)测定，结果如表5所示。结合表4可知，不同碳源发酵生产MEL产量差异的关键，在于脂肪酸链的组成差异。其中，植物油中长链脂肪酸较多，利于MEL的生产；而烷烃链长固定，且链长越短产量越低。
表5.不同植物油碳源的脂肪酸组分表
(2)对不同植物油所产的MEL进行气相色谱/质谱分析
对于不同碳源所产的MEL进行甲酯化，对其脂肪酸组成进行气相色谱/质谱(GC/MS)测定，结果如表6所示。
表6.天然油脂产MEL的脂肪酸组分分布
通过表6可知，不同碳源中9,12-十八烷酸(C18:2)的比例决定了MEL中4-癸烯酸(C10:1)的占比，而9-十八烷酸(C18:1)的组成决定癸烯酸(C10:0)的组成。例如：葵花油中的不饱和C10酸占比最多，达到了51.81％，而葵花油的9,12-十八烷酸(C18:2)所占比例达到了59.59％，同样是不同碳源里C18:2占比最多的。同样的，菜籽油里的9-十八烷酸(C18:1)占比最高，其MEL的组分中癸烯酸(C10:0)的比例高达63.20％。因此，利用富含不饱和多脂肪酸的天然植物油，能够高产富含不饱和中链脂肪酸的MEL，进而得到富含不饱和中链脂肪酸的中链脂肪酸。
(3)利用不同链长的烷烃作为碳源发酵，并对产物进行气相色谱/质谱分析
采用不同链长的烷烃作为碳源进行发酵，不同链长的烷烃产MEL的脂肪酸组分含量如表7所示。由表7可知，只有奇数链烷烃生产的MEL中才会含有大量的奇数链脂肪酸组份，例如15烷所产MEL组分中的壬酸(C9:0)和十一烷酸(C11:1)，奇数链脂肪酸占比达到77％。因此，利用奇数链烷烃作为碳源，能够生产富含奇数链脂肪酸的MEL，进而得到富含奇数链脂肪酸的中链脂肪酸。
表7.烷烃产MEL的脂肪酸组成表
实施例7：利用MEL制备的中链脂肪酸为底物与P450还原酶结合生成中链α-烯烃
利用大肠杆菌重组表达的来自于Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456的脂肪酸脱羧酶OleTJE P450(图5)，采用实施例5制备的中链脂肪酸作为底物，反应体系包括0.5μM酶，200μM中链脂肪酸，500μM H2O2，反应条件为28℃下反应2h，反应产物经GC-MS进行分析。结果表明，MEL制备的以链长C8、C10和C12为主的中链脂肪酸，可以经脂肪酸脱羧酶转化成末端含有一个双键的七烯、九烯和十一烯，其转化率如图6所示。中链α-烯烃是重要的燃料化合物和工业化学品，同时可作为单体制备高级润滑油聚α-烯烃。该研究结果表明经MEL制备的中链脂肪酸可以作为酶催化制备α-烯烃，具有一定的工业应用前景。
综上可知，本申请所述的蚜虫莫氏黑粉(Moesziomyces aphidis)XAD01工程改造菌株，结合优化的三段式发酵工艺，将发酵罐生产MEL最高产量提升到了140g/L，与原始菌株生产MEL最高产量96g/L相比，不仅产量显著增加，实现了不可预料的技术效果。这是因为，本申请通过菌株改造，实现了胞内油脂含量的大幅度降低；同时采用优化后的发酵工艺解决了培养基中过多油脂影响菌体初期的生长和MEL容易导致发酵液乳化的问题。同时，发明人提供了采用工程菌株发酵生产的MEL代替石化原料生产下游产品的工艺，不但简化了化学工艺合成的步骤，而且降低污染和能耗。此外，采用利用不同的碳源，可以发酵生产不同种类的中链脂肪酸，能够最大程度满足下游产业的需求，具有重要的实际应用价值。
1.DGA1基因敲除序列
ATGTGGCCGCGCCATCCTGCCTCTGAAACCGCCGGCCAGCGTGCCCAGGCTCACGACGTCGACGACCGTCCGCTCAACGCCGACGAAAAGACACCCGCAGACGCTACTGCTACCGACAAGAAGCGCAGCAGCGATGCGATCAACAAGCAGGACGTCATTCGGTAAGTTGAACCACCGTACTTCTTCACAAAAGAGGAGCACGGACTGATTCTCGTTTGGGGGTTATGGCGTGCAGATTCGCGCCGCTCTCGATTCCGCGCAGCCGGCGGCTGCAGACGGCGGGTGTGCTGTTCTGGGCGCTGCTGCTGCCCATCTGCTTGAGCATCTTCTTTCTGCTGCTGTCGATACCCTACGCGTGGCCGATCTTGATACCCTACCTAATCTGGATCAACTTTATCGACGATGCGCCCGAGAACGGCGGGCGTCGCTTCTCATGGGTGCGCAAGCTGCCCGTCTTCCGCTACTTTGCCGAGTACTTTCCCATCTCGATGATCAAGACGACCAACCTGCCCGCGGACCGGCCGTACATCTTTGGCTACCATCCGCACGGCATCCTCGGCGTGGCTGCGGTCGCCAATCTCGGCACGGACGCCACCGAGTTCCCCGAGAGCTTCCCCGGCATCACGCCGCACCTGCTCACGCTCGCGACCAACTTTACCATCCCGCTCTTTCGCGACTGCATCATGGCCATGGGTCTATGCAGCGTGTCCAAGCGCAGCTGCGAGGCCATCTTGCGCAAGGGCAAGGGCAGCGCCATCGCCATCGTCGTCGGCGGCGCCAGCGAGTCGTTGGCCGCCCATCCGGGCACCGCCGATCTCACGCTCCGCAGGCGCCTCGGATTCATCAAGATCGCCATCCGCAACGGCGCCGACCTCGTGCCCGTGTTTTCGTTTGGCGAGAACGACGTGTACGAGCAGCTCTCCAACCAGGAGGGCACCAAGATCTATGCTCTCCAGAAGCGCTTCCAGTCGTTGTTCGGCTTCACCCTCCCCTTCTTCCACGGCAGAGGCCTGTTCAACTACAGCATCGGCTTGATGCCCTACCGCCATCCCATCGTCAGCGTTGGTAAGTCGTCGTCACCCAACCCCTCTTGCCACGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTGACCTTCAGGCATGGCGACTTTCGGAAGTGGGCAAACCGGTGCATGTCAAGCAGAACCCCAACCCGACCAAGGAGGAGATCGAAGAGGTGCAGACGCGCTACATTGAAGAGCTCATGAAGTAAGTAGCCGCCGCGCCGCAGCGCGTTGCCAAACACTGCTCAACACAGCATCACTGACATACGGACGACGTTTGGATCTCTGGCAAACACAGCATCTGGGAGACGTGGAAGGACGCCTACGCGGCCAACCGCACCAAGGAGCTCACCATCGTAGCCTGATGAACCTGCACTCCCGGGCCTCATCTCGCTGTCGCATATGAAATCGAACCTTAACCTTAGCGCTTAGTAGGAGGGGTCTTTAATTTTGCATTTTTAATACAGCGTGTGGGCTTACGTCGCCGCGGGCTGGCGCGCGCGATC
2.ARE1基因敲除序列
ATGGCCACCAACAAGACATCCTCCGGCGCTCGTGCGCTTCCTGTCGAGGAAGACTTTGTCGCCAAACATCCCAAGATCGCCCAACTCATTACAGACACCCCGGAAGACGCAATCTCATCCGCCGTCAGCACGCCCGCATCCGAAATGGTGCCCTCGTCTGAGCTGCCATCGACACCAACCAACGGTGGAGCCACACCGTCCGACTCGGAACCAGAGCCGTCCGTCGCCACCTCGACGCTCACCACCACCATCTCCAACTCGCACGGCACCGGATCCTCCACGTTCGAGTTCAAGCACATCGGCGCCAAGGCGCTCTCGCATCGAGTCGGCAAGGATGGCGCCATTCACCTCAAGCCCGTCGCAGCCTCGACACGCTCACGCAAAAAGATGCGAGCCGTCGTCAGCTTCAAGCCGCGCAACAGCCACTTTGACCGCTTCAACGAGACCTCCTCGCGCGACCAGTTCCGCGGCTTCTTCACCCTCTTCTGGGTCTGCCTCGCGCTCTTCGTGCTCAACACCTCCTACACCTCCTTCGCCTCCACCGGTCAGGTGCTCAGCCTCACCTTCGCCACGCTCTTCAGCAGGGATGCCTGGATCCTCGCCATCTCGGACGGCGTGCTCATCGGCTCGCTCTTCATCTGCGTGCCCTTCGCCAACGTTTGTCGCCGCGGCTGGGTCCGCTACTGGCCCACCGCGGTCACCTTCCAGCACCTGTGGCAGGCGACGCTGCTCGGCCTCGTCATCAAGTGGGCGCGCTATCGCGAGTGGCCGTGGGTGCAGAGCGGATTCTTCGTGCTGCACACGCTCGCCATGATGATGAAGATCCACTCCTACATGAACGTCAACGGCAACATGGCCGACACCTACCACCGCATGCGCCGCATCGAAACCATGCTCGAGGAGCGCGTCGCCGAGGTCGAGGGTGCCGAAGCCGGTCGAGGCGACGAACAACTACACGCCGCCTGGGGTAAAGCCGTCCGTCTCGCTCGCAACGCCGCAGGCTTTGGCGACAAGGATGCCGAGAAAGCCACCGCGCTCTCTCTTGCAGAATGGTCGGCACTCGATAAGCAGCGAGGCAGCAGCTCCAGCCGGCTGCACCTGGGACAAGCACTCAACGCCGCGCCCAAAGCCGAGGAGCCACTTCCCAAACTCACCGTCAAGGACGAATCCAGCCAAGCTCGCAACCAAGCCGACTCCCTGCCAGATCCGCCAGGCCGCAAAGACAAGCAATTAAGCCGGGAAGAGCACATTCAGCTGCACAAGGACATGACCGACAAGACCAACGCCGAGCGCAAGGCTGGCACTGACAAGGACGACGAGGTCAAAGGCGACTCGTCGCTCAACCGACGCCGATCGTCAAGTCGAGCCGCTTCGGGCGCCGAGCCGCATCAGATTCGCGATCCGCATCCGCTCTCTTCGCATCCGGACGTGCTCATCTCGGATCTGGCGCGCGAGATTGAGGTGCTGCGCGAGGATCTGCTGTCGTCTCGGCCGTCGTCCGAGCCGTCGCCCGAGATGATCCGACAAGATCCCGTCATGTGGCCGGCCAACGTGACGTACGCCAACTTCTGGGACTACTTGCTCGTGCCTACGCTCGTCTACGAGCTTTCCTACCCGCGACTCAAGACGATCCGACCGCTGTACGTGCTCGAGAAGACGCTGGCGACGTTTGGCACGTTCCTGGTGATCTACGTCATCACCGAGCACTGGATCATGCCATTCACCCCCACGCCCGAGACGCCGTTCCTGCGCACGTTCCTGCAGCTCGCGGTGCCGATGATGATCAACTACCTGCTCATCTTCTACATCATGTTCGAGTGCATCTGCAACGCGTTTGCCGAGCTCACGCGGTTTGCCGATCGCGAGTTCTACCTGGACTGGTGGAATGCAACGAGCATGGACGTCTTCAGCCGCAAGTGGAACAAGCCCGTGCACAGCTTCCTGCTGCGCCACGTGTATGCCAGCACCATCGCCGCGTGGGGGGTTAGCAAGAGCATGGCCATGTTCTTGACGTTCCTGCTCAGCTCGCTCGTGCACGAGCTCGTCATGGCCATCGTCAGCGGCAAGATCCGATTCTATCTGTTTGCGGCGCAGATGGTGCAGCTGCCGCTCATCATCATCAGCCAGATCCCTTTCATCAAGCGCAACGAAACGCTCGGCAACATGATCTTCTGGATCGGCCTCATGGCGGGCTTCCCGCTCCTCAACATTGGCTACCTCGTCTACTGA
Claims (7)
1.产甘露糖赤藓糖醇脂的蚜虫莫氏黑粉（Moesziomyces aphidis）XAD01工程菌株，其特征在于：所述工程菌株为敲除了DGA1基因和ARE1基因的蚜虫莫氏黑粉XM01菌株；所述DGA1基因序列为SEQ ID NO：1；所述ARE1基因序列为SEQ ID NO：2；所述蚜虫莫氏黑粉XM01菌株是保藏于中国典型培养物保藏中心的蚜虫拟酵母XM01菌株，保藏编号为 CCTCC NO：M2021517，保藏日期为2021年5月19日。
2.如权利要求1所述的蚜虫莫氏黑粉XAD01工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）利用同源重组，构建XM01菌株的DGA1基因敲除载体；然后通过电击转化的方法，把构建好的基因敲除载体转入原始的XM01菌株中，构建得到DGA1基因缺陷性的XM01改造菌株；
（2）采用相同的方法，把构建好的ARE1基因敲除载体通过电击转化法转入步骤（1）得到的XM01改造菌株，构建得到ARE1和DGA1双基因敲除的XM01改造菌株，即蚜虫莫氏黑粉XAD01工程菌株。
3.一种包含权利要求 1 所述的蚜虫莫氏黑粉XAD01工程菌株的菌剂。
4.利用权利要求1所述的蚜虫莫氏黑粉XAD01工程菌株发酵生产甘露糖赤藓糖醇脂的方法，其特征在于：包括以下步骤：将权利要求1所述的工程菌株接入种子培养基中进行种子培养，培养后分离得到菌体细胞；将菌体细胞接入到发酵培养基，在25-30℃的温度条件下发酵，发酵完成后从发酵液中分离得到甘露糖赤藓糖醇脂；所述的种子培养基为葡萄糖30.0 g/L，硝酸铵1.0 g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，酵母提取物1.0 g/L；所述的发酵培养基为葡萄糖30g/L，大豆油80g/L，硝酸钠2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，酵母提取物1.0g/L。
5.采用如权利要求4所述的方法制备中链脂肪酸的方法，其特征在于：具体步骤为：取适量MEL加入至碱溶液中，在80℃反应2~3h；所述MEL与碱溶液中氢氧根离子的摩尔比为1:15-1:60；然后向体系中加入酸溶液调节pH=2-5，萃取、旋蒸，即得到中链脂肪酸。
6.如权利要求5所述方法得到的中链脂肪酸在制备中链α-烯烃中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：具体为：向所述中链脂肪酸酸中加入适量催化酶，即可得到中链α-烯烃；所用的催化酶为大肠杆菌重组表达的OleTJE P450脂肪酸脱羧酶，所述催化酶的添加量为每1 mM的中链脂肪酸添加1.0-5.0 μM催化酶。
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