CN115232801B - 一种耐高温碱性脂肪酶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种耐高温碱性脂肪酶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种耐高温碱性脂肪酶及其制备方法和应用。本发明耐高温碱性脂肪酶来自蚜虫莫氏黑粉菌。首先将蚜虫莫氏黑粉菌置于活化培养基中进行培养，活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，所得发酵液进行分离或分离纯化，得到耐高温碱性脂肪酶。本发明制备所得耐高温碱性脂肪酶在催化酯水解和在改善馒头品质中均具有较好的催化效果。本发明制备的耐高温碱性脂肪酶可广泛应用于工业生产中，尤其是对补充工业化生产的耐高温碱性脂肪酶种类具有重要意义。
Description
一、技术领域：
本发明属于生物制品以及生物制品制备方法和应用技术领域，具体涉及一种耐高温碱性脂肪酶及其制备方法和应用。
二、背景技术：
脂肪酶可以催化甘油三酯水解为甘油和脂肪酸，具有反应高效、无需辅酶参与、副反应少等优点，广泛应用于食品生产、生物柴油、皮革纺织、香料化合物、日化洗涤和医疗制药等领域。近年来，国际酶市场对脂肪酶的应用需求仅次于蛋白酶和糖酶。预计到2025年，全球的脂肪酶市场产值可达7.977亿美元。相较于国外，我国关于脂肪酶的相关研究时间较短，导致当前实验室研究的脂肪酶种类较多，但工业化生产种类有限。此外，天然脂肪酶的最适温度一般在30～50℃，而在某些应用环境中，环境温度能够达到60℃以上，绝大多数天然脂肪酶难以发挥较好的活性，导致应用效率低下。因此，本领域技术人员致力于开发能够耐受高温环境的脂肪酶。
蚜虫莫氏黑粉菌(Moesziomyces aphidis,M.aphidis)是一种能够在含植物油为碳源的培养基中进行生长繁殖，大量合成甘露糖赤藓糖醇脂的菌株，具有较好的工业化应用前景，但仍缺乏其合成脂肪酶的相关研究。如果能够挖掘其合成脂肪酶的能力，对推动其工业化生产应用具有重要意义。
作为中国的传统主食之一，馒头在工业化生产中常出现表皮皱缩、颜色发暗、结构不均匀等问题。因此，改良馒头品质一直是相关人员重要研究方向。在大健康背景下，使用食品添加剂改良馒头品质的控制越来越严格，国内外关注研究的重点逐渐转向新型酶制剂。有技术人员研究，部分脂肪酶在馒头制作中可以有效改善面团流变学特性、提升成品白度等，但与脂肪酶的种类和添加量密切相关。因此，挖掘新型可用于改良馒头品质的脂肪酶具有实际应用价值。
三、发明内容：
本发明要解决的技术问题是：根据脂肪酶现有技术的发展情况及其存在的技术问题，本发明提供一种耐高温碱性脂肪酶及其制备方法和应用。本发明技术方案，利用蚜虫莫氏黑粉菌发酵合成脂肪酶，进一步利用离心、冻干或利用离心、盐析、透析和冻干制备得到耐高温碱性脂肪酶。
为了解决上述问题，本发明采取的技术方案是：
本发明提供一种耐高温碱性脂肪酶，所述耐高温碱性脂肪酶来自蚜虫莫氏黑粉菌(Moesziomyces aphidis)，菌株保藏编号为DSM 70725。
另外，提供一种上述耐高温碱性脂肪酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌置于活化培养基中进行培养，培养时间为30～48h；
b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养时间为36～60h；
c、将步骤b培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，发酵时间为5～10天；
d、将步骤c所得发酵液进行分离或分离纯化，得到耐高温碱性脂肪酶。
根据上述的耐高温碱性脂肪酶的制备方法，步骤a中所述活化培养基的配制为：酵母浸粉2.5～3.5g、麦芽浸粉2.5～3.5g、葡萄糖8.0～20.0g、蛋白胨4.0～10.0g和去离子水1L；所述活化培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后备用；
步骤b中所述种子培养基的配制为：NaNO3 1.0～4.0g、MgSO4·7H2O 0.2～0.4g、KH2PO4 0.2～0.4g、酵母浸粉1.0～3.0g、葡萄糖30.0～80.0g和去离子水1L；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后备用；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的1～5％；
步骤c中所述发酵培养基的配制为：KH2PO4 0.2～0.4g、NaNO3 1.0～4.0g、酵母浸粉1.0～3.0g、表面活性剂1.0～4.0mL、碳源30.0～80.0g、硫酸盐0.1～0.5g、诱导剂10.0～40.0mL和去离子水1L；所述发酵培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后备用；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的1～5％。
根据上述的耐高温碱性脂肪酶的制备方法，所述表面活性剂为吐温-80、吐温-20、咪唑啉、十二烷基硫酸钠、表面活性剂TX-100和阿拉伯胶中的任一种；
所述碳源为葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉和糊精中的任一种；
所述硫酸盐为CaSO4、MnSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4和MgSO4中的任一种；
所述诱导剂为大豆油、花生油、玉米油、橄榄油、葵花油和芝麻油中的任一种。
根据上述的耐高温碱性脂肪酶的制备方法，步骤a中所述活化培养基的配制为：酵母浸粉3.0g、麦芽浸粉3.0g、葡萄糖10.0g、蛋白胨5g和去离子水1L；
步骤b中所述种子培养基的配制为：NaNO3 3.0g、MgSO4·7H2O 0.3g、KH2PO4 0.3g、酵母浸粉1.0g、葡萄糖40.0g和去离子水1L；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的2％；
步骤c中所述发酵培养基的配制为：MgSO4·7H2O 0.4g、KH2PO4 0.3g、NaNO3 3.1g、酵母浸粉2.24g、吐温-80 3.0mL、葡萄糖50g、花生油20.0mL和去离子水1L；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的2％。
根据上述的耐高温碱性脂肪酶的制备方法，步骤d中所述分离的具体过程为：将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，去除沉淀，所得上清液为耐高温碱性脂肪酶溶液，冷冻干燥后得到耐高温碱性脂肪酶。
根据上述的耐高温碱性脂肪酶的制备方法，步骤d中所述分离纯化的具体过程为：
(1)将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，取出沉淀，获得上清液为粗脂肪酶；
(2)将所得粗脂肪酶中加入硫酸铵，每升粗脂肪酶中加入200g硫酸铵，然后在4℃下盐析8～12h，离心除去沉淀；接着继续加入硫酸铵，每升粗脂肪酶中继续加入300g硫酸铵，在4℃继续盐析12h，离心获得沉淀蛋白；将所得沉淀蛋白采用Tris-HCl缓冲液进行溶解，溶解后转移至透析袋(MW8000-140000Da)中，Tris-HCl缓冲液中4℃透析24h，每6～8h更换缓冲液，最后进行冻干得到耐高温碱性脂肪酶。
本发明制备所得耐高温碱性脂肪酶在催化酯水解中的应用，所述应用中，水解的温度为60～80℃，pH为7.0～10.0，甘油三酯水解位点无特异性。
根据上述的耐高温碱性脂肪酶在催化酯水解中的应用，水解的温度为65～75℃，pH为7.5～8.5。
本发明制备所得耐高温碱性脂肪酶在改善馒头品质中的应用，所述耐高温碱性脂肪酶的加入量为5.0～30.0mg/kg面粉(优选为15.0～20.0mg/kg面粉)。
本发明的积极有益效果：
1、利用本发明技术方案分批发酵生产和制备脂肪酶，最适催化反应温度为70℃，最适反应pH为8.0，-20℃～70℃处理5h或pH5.0～10.0的缓冲液处理1h后，仍保留有80％以上的酶活性，具备良好的热稳定性和pH稳定性。因此，本发明制备的耐高温碱性脂肪酶可广泛应用于工业生产中，尤其是对补充工业化生产的耐高温碱性脂肪酶种类具有重要意义。
2、本发明技术方案中，所用的Moesziomyces aphidis DSMZ 70725菌株具有良好的工业化生产应用前景，其发酵产酶条件温和，培养基来源广泛，发酵生产成本低，具有可持续发展的特点，对实际生产具有很好的推动作用。
3、本发明制备所得耐高温碱性脂肪酶在催化酯水解反应中的应用，具有较高的催化效率，在食品、医药、皮革和洗涤剂等多个领域具有应用价值。
4、本发明制备所得耐高温碱性脂肪酶在改良馒头品质中的应用，具有较高的催化效率，在食品、医药、皮革和洗涤剂等多个领域具有应用价值。
四、附图说明
图1不同初始pH对本发明脂肪酶制备的影响。
图2不同培养温度对本发明脂肪酶制备的影响。
图3本发明实施例1制备所得脂肪酶的最适反应温度及热稳定性。
图4pH对本发明实施例1制备所得脂肪酶的影响及其稳定性。
图5金属离子对本发明实施例1制备所得脂肪酶的影响。
图6表面活性剂及抑制剂对本发明实施例1制备所得脂肪酶活性的影响。
图7本发明实施例1制备所得粗脂肪酶的盐析曲线。
图8本发明实施例2制备所得脂肪酶的最适反应温度。
图9本发明实施例2制备所得脂肪酶的最适反应pH及pH稳定性。
图10金属离子对本发明实施例2制备所得脂肪酶活性的影响。
图11表面活性剂及抑制剂对本发明实施例2制备所得脂肪酶活力的影响。
由图11可知，吐温-20、吐温-80、曲拉通-100、咪唑啉浓度均为0.05％(v/v)，SDS、EDTA、阿拉伯胶浓度均为1mM。
图12本发明实施例2制备所得脂肪酶水解三油酸甘油酯反应产物的薄层色谱图。
图12中，a：三油酸甘油酯标准品；b：1，3-二油酸甘油酯标准品；c：1,2-二油酸甘油酯标注品；d：三油酸甘油酯的水解产物。。
图13本发明实施例2制备所得脂肪酶对馒头比容的影响。
图14本发明实施例2制备所得脂肪酶在馒头中应用效果图(馒头外观和切片图)。
图14中，(a)(c)为空白对照；(b)(d)为添加20mg/kg本发明制备所得脂肪酶制作的馒头。
五、具体实施方式：
以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明技术方案保护的范围。
本发明实施例中，采用的酶活测定方法为：以4-硝基苯磷酸二钠(p-NPP)为底物，在2.00mL离心管中加入600.0μL底物溶液，以及25.0μL稀释后的脂肪酶溶液，对照组加入等量Tris-HCl缓冲液，反应条件为70℃、10min，反应终止剂为500.0μL无水乙醇，离心测定OD410 nm，并计算酶活。其中，绘制的脂肪酶活标准曲线方程为：y＝0.0054x+0.0006，相关系数R2＝0.9992。
实施例1：
本发明耐高温碱性脂肪酶的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌(Moesziomyces aphidis，菌株保藏编号为DSM 70725)置于活化培养基中进行培养，培养时间为36h；
所述活化培养基的配制为：酵母浸粉3.0g、麦芽浸粉3.0g、葡萄糖10.0g、蛋白胨5g和去离子水1L，初始pH未调节；所述活化培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后进行使用；
b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养时间为48h；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的2％；
所述种子培养基的配制为：NaNO3 3.0g、MgSO4·7H2O 0.3g、KH2PO4 0.3g、酵母浸粉1.0g、葡萄糖40.0g和去离子水1L，初始pH未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
c、将步骤b培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，发酵时间为7天，所述培养发酵过程中装液量为30mL，培养温度为25.8℃；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的2％；
所述发酵培养基的配制为：MgSO4·7H2O 0.4g、KH2PO4 0.3g、NaNO3 3.1g、酵母浸粉2.24g、吐温-80 3.0mL、葡萄糖50g、花生油20.0mL和去离子水1L；初始pH未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
d、将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，去除沉淀，所得上清液为耐高温碱性脂肪酶溶液(测定脂肪酶溶液酶活达83.14±1.09U/mL)，冷冻干燥后得到耐高温碱性脂肪酶。
实施例2：
本发明耐高温碱性脂肪酶的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌置于活化培养基中进行培养，培养时间为36h；
所述活化培养基的配制为：酵母浸粉3.0g、麦芽浸粉3.0g、葡萄糖10.0g、蛋白胨5g和去离子水1L，初始pH未调节；所述活化培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后进行使用；
b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养时间为48h；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的2％；
所述种子培养基的配制为：NaNO3 3.0g、MgSO4·7H2O 0.3g、KH2PO4 0.3g、酵母浸粉1.0g、葡萄糖40.0g和去离子水1L，初始pH未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
c、将步骤b培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，发酵时间为7天，所述培养发酵过程中装液量为30mL，培养温度为25.8℃；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的2％；
所述发酵培养基的配制为：MgSO4·7H2O 0.4g、KH2PO4 0.3g、NaNO3 3.1g、酵母浸粉2.24g、吐温-80 3.0mL、葡萄糖50g、花生油20.0mL和去离子水1L；初始pH未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
d、将发酵后的发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，取出沉淀，获得上清液为粗脂肪酶液；
将所得粗脂肪酶液中加入硫酸铵，每升粗脂肪酶液中加入200g硫酸铵，然后在4℃下盐析12h，离心除去沉淀；接着继续加入硫酸铵，每升粗脂肪酶液中继续加入300g硫酸铵，在4℃继续盐析12h，离心获得沉淀蛋白；将所得沉淀蛋白采用Tris-HCl缓冲液进行溶解，溶解后转移至透析袋(MW8000-140000Da)中，Tris-HCl缓冲液中4℃透析24h，每6h更换缓冲液，最后进行冻干得到耐高温碱性脂肪酶。
实施例3：
本发明耐高温碱性脂肪酶的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌(Moesziomyces aphidis，菌株保藏编号为DSM 70725)置于活化培养基中进行培养，培养时间为32h；
所述活化培养基的配制为：酵母浸粉2.8g、麦芽浸粉3.2g、葡萄糖15.0g、蛋白胨6g和去离子水1L，初始pH未调节；所述活化培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后进行使用；
b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养时间为42h；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的2.5％；
所述种子培养基的配制为：NaNO3 2.7g、MgSO4·7H2O 0.28g、KH2PO4 0.28g、酵母浸粉1.2g、葡萄糖38.0g和去离子水1L，初始pH未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
c、将步骤c培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，发酵时间为8天，所述培养发酵过程中装液量为30mL，培养温度为25.0℃；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的2.5％；
所述发酵培养基的配制为：MgSO4·7H2O 0.3g、KH2PO4 0.2g、NaNO3 1.0g、酵母浸粉1.0g、吐温-80 2.0mL、葡萄糖40g、花生油30.0mL和去离子水1L；初始pH未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
d、将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，去除沉淀，所得上清液为耐高温碱性脂肪酶溶液，冷冻干燥后得到耐高温碱性脂肪酶。
实施例4：
本发明耐高温碱性脂肪酶的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌(蚜虫莫氏黑粉菌(Moesziomyces aphidis)，菌株保藏编号为DSM 70725)置于活化培养基中进行培养，培养时间为40h；
所述活化培养基的配制为：酵母浸粉3.2g、麦芽浸粉2.8g、葡萄糖9.0g、蛋白胨4.5g和去离子水1L，初始pH未调节；所述活化培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后进行使用；
b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养时间为50h；所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的2.5％；
所述种子培养基的配制为：NaNO3 3.2g、MgSO4·7H2O 0.32g、KH2PO4 0.32g、酵母浸粉1.5g、葡萄糖45.0g和去离子水1L，初始pH未调节；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
c、将步骤c培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，发酵时间为7天，所述培养发酵过程中装液量为50mL，培养温度为20.0℃、25.0℃、30.0℃、35.0℃、40.0℃或45.0℃；所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的2.0％；
所述发酵培养基的配制为：MgSO4·7H2O 0.3g、KH2PO4 0.3g、NaNO3 3.0g、酵母浸粉1.0g、葡萄糖40g和去离子水1L；初始pH调节为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0；所述种子培养基配制后，在115～121℃下灭菌20min，灭菌后使用；
d、将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，去除沉淀，所得上清液为耐高温碱性脂肪酶溶液，冷冻干燥后得到耐高温碱性脂肪酶。
不同培养温度对本发明脂肪酶制备的影响：
培养温度分别为20.0℃、25.0℃、30.0℃、35.0℃、40.0℃或45.0℃时，摇瓶发酵培养7天，测定脂肪酶活，结果见附图2。由图2可知，在20～45℃温度范围内，发酵液脂肪酶活呈现为先增加后降低的趋势，其中，25℃条件下所得发酵液中的脂肪酶活最高，为49.99±0.05U/mL，40.0℃或45.0℃温度下的脂肪酶活＜5U/mL。
不同初始pH值对本发明脂肪酶制备方法的影响：
初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0时，摇瓶发酵培养7天，测定发酵液脂肪酶见附图1。由图1可知，发酵液初始pH值在4.0～9.0范围内，对脂肪酶活并没有显著性影响。
响应面优化产酶发酵条件：
利用Plackett-Burman试验对葡萄糖添加量(A)、NaNO3添加量(B)、酵母浸粉添加量(D)、MgSO4添加量(E)、花生油添加量(G)、吐温-80添加量(H)、装液量(J)、温度(K)共8个因素，分别设计高、低两个水平，另设3个虚拟空白项考察试验误差，脂肪酶活为响应值，试验设计水平和响应值分别见表1和表2。
表1PB试验设计因素水平
表2PB试验设计方案及实验响应值(N＝12)
对PB试验结果进行处理分析，结果见表3。由此可以看出，葡萄糖添加量、吐温-80添加量、装液量添加量对发酵产脂肪酶具有负效应，NaNO3添加量、酵母浸粉添加量、MgSO4添加量、花生油添加量、温度对发酵产脂肪酶具有正效应。8个因素对脂肪酶活的影响顺序为：NaNO3添加量>温度>酵母浸粉添加量>装液量>葡萄糖添加量>吐温-80添加量>花生油添加量>MgSO4添加量。拟合的模型显著，P＝0.0013<0.05，R2＝0.9869，经方差分析所得的回归方程为：Y＝29.16-4.68A+9.05B+7.73D+2.57G-3.70H-5.75J+8.63K。该模型的F值为42.99，仅有0.13％的概率不能用该模型表示。
表3PB试验设计各因素对脂肪酶活的影响情况
根据PB试验所得的三个最显著因素：NaNO3添加量、温度、酵母浸粉添加量，设计最陡爬坡试验，试验设计及结果见表4。由表4可以看出，脂肪酶活最大响应值在73.86～77.00U/mL之间。以NaNO3 3.0g、温度24.0℃、酵母浸粉2.0g为响应面中心点水平。
表4最陡爬坡试验设计及结果
对NaNO3、温度和酵母浸粉等3个关键因子设置3个水平，编码和对应值见表5，试验设计和各组脂肪酶活测定结果见表6。利用Design Expert 10.0.7软件拟合得到脂肪酶活与三个因素的二次回归模型：
Y＝79.28-3.56A+10.15B+5.71C-1.73AB+6.18AC-3.25BC-17.91A2-12.77B2-4.26C2。R2＝0.9973，R2 Adj＝0.9938。
表5响应面设计因素及水平
表6响应面设计结果
回归模型分析可知，模型的决定系数R2＝0.9973，变异系数C.V.％＝1.91，说明拟合较好，试验结果可信。其中，酵母浸粉添加量和NaNO3添加量、酵母浸粉添加量和温度的交互作用对脂肪酶活有显著影响，而NaNO3添加量和温度对脂肪酶活的交互作用不显著。进一步利用软件计算分析，预测脂肪酶活最高值为81.90U/mL，此时NaNO3添加量为3.1g/L，培养温度为25.8℃，酵母浸粉添加量为2.24g/L。
响应面拟合模型验证脂肪酶制备实验：
根据响应面模型结果对模型进行验证实验，测定脂肪酶活为83.14±1.09U/mL，与模型预测值相差小于1.50％，说明响应面优化法能显著提高M.aphidis合成脂肪酶活，所得模型真实有效。
后续测试中表征耐高温碱性脂肪酶的酶学性质，其中温度和pH对脂肪酶活性的测定分别以最佳酶活为对照(100％)，温度和pH对脂肪酶稳定性以及金属离子、表面活性剂和抑制剂、有机溶剂对脂肪酶的影响，均以未处理的酶液为对照(100％)，计算各处理条件下的相对酶活，公式为：
相对酶活(％)＝各处理条件下的酶活(U/mL)/未处理条件下酶活(U/mL)。
本发明实施例1制备所得脂肪酶的最适反应温度及热稳定性：
测定实施例1所得脂肪酶的最适反应温度结果见附图3(a)。40℃～90℃时，脂肪酶活力呈现先增大后减小的趋势，在70℃时酶活最高，当温度>70℃时粗脂肪酶仍然具有70％以上的活性，表明所得脂肪酶在一定时间内具有耐高温特性。测定所得脂肪酶的热稳定性结果见附图3(b)。所得脂肪酶在-20℃～70℃条件下处理1～5h具有良好的稳定性，相对酶活均高于80％。90℃处理1h后，相对酶活接近0，时间延长后完全失活，表明其不能长时间耐受90℃及以上的高温。
本发明实施例1所得脂肪酶的最适反应pH及pH稳定性：
测定实施例1所得脂肪酶最适pH和pH稳定性测定结果见附图4。脂肪酶在缓冲液pH为8时表现出最大活性，在pH5～6时的脂肪酶活显著降低，在pH>8环境下相对酶活较高，且脂肪酶在pH 5～10范围处理1h后，相对酶活保持在80％以上，表明M.aphidis所产脂肪酶更适合应用于碱性环境中，且具有一定的耐酸碱特性。
金属离子对本发明实施例1所得脂肪酶活性的影响：
测定不同种类和浓度的金属离子对实施例1所得脂肪酶活性的影响，结果见附图5。与对照组相比，0.1mM、0.5mM、10mM的Mn2+、Mg2+以及10mM Ca2+溶液中的脂肪酶相对酶活均在90％以上，具有较好的催化活性。M.aphidis合成脂肪酶的相对酶活随着Ca2+浓度的升高而逐渐增大，随着Fe2+、Fe3+、Zn2+浓度的升高而逐渐降低，其中Zn2+存在条件下脂肪酶活抑制程度最大，加入10mM的Zn2+时，相对酶活仅为3.81±0.33％。不同浓度的Cu2+对脂肪酶的相对酶活具有显著的抑制作用。
表面活性剂及抑制剂对本发明实施例1所得脂肪酶活性的影响
测定不同表面活性剂和抑制剂对实施例1所得脂肪酶活性的影响，结果见附图6。由图6可以看出，吐温-20、吐温-80、曲拉通-100和SDS都能够增大脂肪酶活，其中曲拉通-100的促进作用最显著，相对酶活达152.36±1.66％。吐温-20、吐温-80和SDS条件下的相对酶活并无显著性差异，说明这3种表面活性剂对脂肪酶酶活促进作用效果接近。抑制剂EDTA对酶活无显著的促进或抑制作用。阿拉伯胶和咪唑啉存在条件下，脂肪酶相对酶活受到显著抑制，其中咪唑啉对脂肪酶活抑制作用最强，相对酶活仅为39.15±1.95％。
有机溶剂对本发明实施例1所得脂肪酶活性的影响：
从表7可以看出，甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、DMSO等亲水性有机溶剂对脂肪酶表现出一定的激活作用，其中，30％异丙醇可以将脂肪酶的相对酶活提高约30％。在疏水性有机溶剂中，苯、甲苯、乙醚、正己烷能够显著提高脂肪酶催化活性，而氯仿中孵育1h后的相对酶活下降了约46％，呈现出明显的抑制作用。
表7有机溶剂对实施例1所得脂肪酶活性的影响
本发明实施例1制备所得脂肪酶溶液的盐析曲线：
本发明实施例1制备所得粗脂肪酶经过盐析，测定沉淀物质的蛋白含量、脂肪酶活和上清液的脂肪酶活，结果见附图7。当硫酸铵比例在20～60％时，沉淀的酶活和沉淀蛋白含量随着硫酸铵比例的增加逐渐增大，而上清液的酶活随之逐渐下降。当硫酸铵比例在60～90％时，沉淀和上清酶活以及沉淀蛋白含量基本保持不变。当硫酸铵比例为20％时，上清酶活含量较高，沉淀中含有部分蛋白，但酶活较低。当硫酸铵比例高于60％时，沉淀酶活和蛋白含量基本保持不变。
本发明实施例2耐高温碱性脂肪酶的制备过程中，分别利用酸铵分级盐析、透析袋除盐处理粗脂肪酶制备得到纯化脂肪酶，测定各步骤获得样品的蛋白含量、脂肪酶活，计算出总蛋白、总酶活、回收率等纯化参数，结果见表8。由表8可以看出，随着分离纯化步骤的进行，比酶活和纯化倍数逐渐增加。将纯化脂肪酶冻干得到耐高温碱性脂肪酶。
表8离心所得脂肪酶溶液制备耐高温碱性脂肪酶参数表
以下实验中，表征耐高温碱性脂肪酶的酶学性质，其中，温度和pH对脂肪酶活性的测定分别以最佳酶活为对照(100％)，温度和pH对脂肪酶稳定性以及其它酶学性质评价均以未处理的酶液为对照(100％)，计算各处理条件下的相对酶活，公式为：
相对酶活(％)＝各处理条件下的酶活(U/mL)/未处理条件下酶活(U/mL)。
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶的最适反应温度及热稳定性：
测定脂肪酶的最适反应温度，结果见附图8。当温度在40℃～70℃时，酶活大小与温度高低呈正相关，70℃时纯化脂肪酶表现出最大的催化活性，表明纯化脂肪酶最适反应温度为70℃。80℃、90℃时相对酶活在40％左右。将脂肪酶在不同温度下孵育1、2、3、4、5h后，结果见表9。由表9可以看出，不同温度处理时间对脂肪酶活力大小影响较大。当50℃、70℃孵育时间超过2h，相对酶活损失一半。90℃孵育时间超过2h，脂肪酶完全失活。
表9本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶的热稳定性
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶的最适反应pH及pH稳定性：
将底物与不同pH缓冲液混合，测定脂肪酶活力，计算相对酶活，结果见附图9。缓冲液pH为8.0时纯化脂肪酶活力最大。在pH 5.0～6.0范围内，测定的纯化脂肪酶活力极低。当pH＝9.0时，相对酶活为58.64％。用不同pH(5.0～10.0)缓冲液在4℃下处理粗酶液1h，计算剩余酶活。结果见附图9。纯化脂肪酶在pH 5.0～10.0范围内的稳定性较粗脂肪酶差，酶活明显被抑制，同时在弱碱环境中仍然具有一定的催化活性。
金属离子对本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶活性的影响：
将脂肪酶与不同种类和浓度的金属离子混合，4℃孵育1h，测定酶活，结果见附图10。Cu2+、Mg2+以及0.1mM Ca2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+溶液对纯化脂肪酶活影响较小，相对酶活均在80％以上。脂肪酶在0.5mM、10mM的Mn2+、Fe3+、Zn2+条件下酶活影响较大，相对酶活保持在0.2％～48％。其中Zn2+对脂肪酶的抑制作用最为显著。
表面活性剂及抑制剂对本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶活性的影响：
将脂肪酶与不同表面活性剂及抑制剂混合，4℃条件下孵育1h，测定脂肪酶活，结果见附图11。吐温-20、吐温-80、曲拉通-100或SDS存在下，脂肪酶活均在90％以上。而EDTA、咪唑啉和阿拉伯胶对酶活略有抑制，但相对酶活均在85％以上。
有机溶剂对本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶活性的影响：
将脂肪酶与不同有机溶剂混合，4℃孵育1h，结果见表10。脂肪酶在亲水性有机溶剂中可以保持很好的催化活性(相对酶活>80％)。在疏水性有机溶剂中，苯、甲苯、乙醚以及正己烷对脂肪酶活力影响不大，但在氯仿中孵育1h后，脂肪酶活损失超过50％。
表10有机溶剂对本发明实施例2制备所得纯化脂肪酶活性的影响
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶催化酯水解反应：
薄层色谱分析所述脂肪酶作用三油酸甘油酯的水解产物，结果见附图12，水解反应产物中同时出现了1,3-二油酸甘油酯和1,2-二油酸甘油酯，并且含量相近，说明M.aphidis合成脂肪酶无明显的位置特异性，水解甘油三酯的催化效率较高。
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶改善馒头比容：
脂肪酶MA对馒头比容和高径比的影响见附图13。由图13可以看出，添加脂肪酶可以使馒头比容显著性增大，高径比显著性减小。当添加量为20mg/kg时，馒头比容和高径比数值变化幅度最大。由显著性分析可知，添加量为15mg/kg时的比容和高径比与添加量为20mg/kg的数据并无显著性差异。当脂肪酶MA添加量为15mg/kg时，其中比容从原来的2.11mL/g增加到2.57mL/g；高径比由原来的0.74降低到0.69。
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶改善馒头质构：
脂肪酶MA对馒头质构的影响见表11。可以看出，馒头的硬度、胶着性和咀嚼性随着脂肪酶MA添加量的增多变化趋势表现为先减小后增大。脂肪酶MA可以显著降低馒头硬度，改善馒头口感，并在添加量为20mg/kg时，馒头硬度得到最大程度改善。
表11本发明制备耐高温碱性脂肪酶MA对馒头质构的影响
本发明实施例2制备所得耐高温碱性脂肪酶对馒头色泽的改善：
脂肪酶对馒头皮和馒头芯色泽的影响分别见表12。发现脂肪酶添加量为15mg/kg时，可以使馒头皮亮度值L*由82.38±0.35提升至84.67±0.27，馒头芯的亮度值L*由78.82±0.11提升至80.57±0.19。同时，脂肪酶添加量为20mg/kg时，馒头皮和馒头芯的亮度值与15mg/kg的亮度值并无显著性差异。总的来看，所述脂肪酶可以显著增大馒头成品白度。
表12本发明制备所得脂肪酶对馒头皮和馒头芯色泽的影响
本发明实施例2制备所得脂肪酶对馒头外观和结构的改善：
分别制作未添加脂肪酶和添加量为20mg/kg的馒头，对比馒头外观和结构，结果见附图14。由图14可以看出，添加脂肪酶的馒头表面更加光滑白净，内部结构更加良好。
Claims (1)
1.一种耐高温碱性脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
a、首先将蚜虫莫氏黑粉菌置于活化培养基中进行培养，培养时间为32～48h；
所述活化培养基的配制为：酵母浸粉3.0g、麦芽浸粉3.0g、葡萄糖10.0g、蛋白胨5g和去离子水1L；
b、将步骤a活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接入种子培养基中进行培养，培养时间为42～50h；
所述种子培养基的配制为：NaNO3 3.0g、MgSO4·7H2O 0.3g、KH2PO4 0.3g、酵母浸粉1.0g、葡萄糖40.0g和去离子水1L；
所述活化培养后的蚜虫莫氏黑粉菌占种子培养基体积的2%；
c、将步骤b培养后的蚜虫莫氏黑粉菌接种至发酵培养基中进行培养发酵，发酵时间为7天、培养温度为25.8℃；
所述发酵培养基的配制为：MgSO4·7H2O 0.4g、KH2PO4 0.3 g、NaNO3 3.1g、酵母浸粉2.24g、吐温-80 3.0mL、葡萄糖50g、花生油20.0mL和去离子水1L；
所述种子培养后蚜虫莫氏黑粉菌的加入量占发酵培养基体积的2%；
d、将步骤c所得发酵液进行分离或分离纯化，得到耐高温碱性脂肪酶；
所述分离的具体过程为：将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，去除沉淀，所得上清液为耐高温碱性脂肪酶溶液，冷冻干燥后得到耐高温碱性脂肪酶；
所述分离纯化的具体过程为：
（1）将发酵后所得发酵液，在8000～1000rpm条件下离心5min，取出沉淀，获得上清液为粗脂肪酶；
（2）将所得粗脂肪酶中加入硫酸铵，每升粗脂肪酶中加入200g硫酸铵，然后在4℃下盐析8～12h，离心除去沉淀；接着继续加入硫酸铵，每升粗脂肪酶中继续加入300g硫酸铵，在4℃继续盐析12h，离心获得沉淀蛋白；将所得沉淀蛋白采用Tris-HCl缓冲液进行溶解，溶解后转移至透析袋中，Tris-HCl缓冲液中4℃透析24h，每6～8h更换缓冲液，最后进行冻干得到耐高温碱性脂肪酶；
所述耐高温碱性脂肪酶来自蚜虫莫氏黑粉菌（Moesziomyces aphidis），菌株保藏编号为DSM 70725。
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