JPS6170990A - 正のレトロレギユレーシヨン因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は組換ＤＮＡの分野に関する。さらに詳しくは
、この発明は、遺伝子産物をコードする選択されたＤＮ
Ａ配列に連結された場合に該遺伝子産物の発現を増強す
る正のレトロレギュレーション因子（ｐｏｓｉｔｉｖｖ
　ｒｅｔｒｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔ）
に関する。選択されたＤＮＡ配列に連結された正のレト
ロレギュレーション因子を担持するプラスミド及びこの
プラスミドによ〕形質転換された細胞が提供される。さ
らに、この発明は、所望の遺伝子産物を発現することが
できる選択されたＤＮＡ配列に正のレトロレギュレーシ
ョン因子を連結することにより遺伝子産物の発現を増強
する方法に関する。

（従来の技術） 組換ＤＮＡ技法の商業的利用の基礎を成す基本的な方策
の１つは、非常に低い濃度又は容量で天然に通常存在す
るポリペプチド又は蛋白質の形で遺伝子産物を比較的高
容量で製造することである。

比較的短い世代時間又は倍化時間を有する細胞を一般に
プラスミドの形である組換本分子で形質転換することに
より、有意量の所望の遺伝子産物を得ることができる。

組換体ＤＮＡを有する各細胞は実際に非常に少量のみの
所望の遺伝子産物を産生ずるが、細胞の急速な増加が所
望の遺伝子産物の有意量の製造を可能にする。

一般に、選択された遺伝子産物を多量に製造するという
目標は、所望の遺伝子産物を産生ずる形質転換された細
胞の増殖のために必要とされる培地容積の程度により限
定される。目的とする遺伝子産物の収量を増加すること
は、目的とする遺伝　　　　　　こ子産物の商業的製造
において、明らかに大きな関　　　　　　、５形質転換
された細胞Ｋｌ産生される生成物の量　　　　　　　゛
−心事である。収量を増加するための１つの方法は、を
変光ないで、該細胞又は培地からの目的遺伝子産物の回
収率を改良することである。この方法は、所与の発酵か
らの目的遺伝子産物の回収を増加するための加工（ｐｒ
ｏｃｅｓｓｉｎｇ　）段階の追加ｔ−課する。このよう
な追加の加工段階は、加えられる装置及び職員のために
大きなコストを必要とする場合がある。

目的の遺伝子産物の収量を増加するための他の方法は、
形質転換された細胞による目的遺伝子産物の発現を増加
することでちる。各細胞による目的遺伝子産物の産生に
おけるこのような増加は、特定の発酵についての収率の
増加と共に製造された生成物の純度の改良を導き、そし
て追加の加工が必要でないため単位生成物当たりのコス
トの低下を導く。

細胞当たりの目的遺伝子産物の収量を改良するための重
要な一般的方法の１つは、細胞に最適培養条件を与える
ことである。例えば、培地の栄養素含量を富化し、発酵
のための最適温度を与え、微量因子の最適量を与え、そ
して培地に要求されるアミノ酸を補充することにより、
収量を有意に改良することができる。

細胞ｉｂ目的遺伝子産物の収量を増加する問題に対する
第２の一般的方法は、細胞による遺伝子産物の発現を調
節する制御因子を操作することである。目的遺伝子産物
の発現を調節する制御因子を操作する１つの方法は、強
力なプロモーターの選択による方法である。プロモータ
ーは一般に、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列からの
メツセフツヤ−ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ　）の転写を開始す
るためにＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ分子の領
域として定義される。強力なプロモーターは、弱いプロ
モーターよりも一層高頻度で゛ＲＮＡポリメラーゼによ
るＲＮＡ転写を開始し、その結果、そのプロモーターと
関連するＤＮＡ配列が転写されて目的遺伝子産物をコー
ドする一層多くのｍＲＮＡ転写物が形成される。

組換ＤＮＡの分野においては、強力なプロモーターを、
該強力なプロモーターから開始されるｍＲＮＡ転写物が
産生されるように適切なリーディングフレーム内に、目
的Ｒ嵌子産物をコードする選択されたＤＮＡ配列に連結
することは常法となっている。

多数のプロモーターを選択されたＤＮＡ配列に連結し、
それによってＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ配列に結合す
る機会を増加し、そしてＤＮＡ配列から一層多くのｍＲ
ＮＡ転写物を産生せしめることができる。

この最後の方法の例は、目的遺伝子産物をコードするＤ
ＮＡ配列の始めにタンデムｌａｊオペロングロモーター
を使用することである。

一層高レベルのｍＲＮＡの転写をもたらすためにＲＮＡ
ポリメラーゼの結合を増加するための他の方法は、目的
遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列からｍＲＮＡ　ｔ−
転写するＲＮＡポリメラーゼの能力を低下せしめる傾向
を有する制御因子（ｒ＠ｇｕｌａｔｏｒ）’ｆａｃｔｏ
ｒｓ）　ｔ−除去することである。幾つかの強力なプロ
モーターはそれと関連するアテヌエーター領域を有し、
この領域はある条件下で、結合したＲＮＡポリメラーゼ
をして該アテヌエーター領域と関連するＤＮＡ配列の転
写を停止せしめる。１つのこのようなアテヌエーター領
域は、強力なプロモーターとして知られているプロモー
ターの１つでちるトリプトファンオペロンのプロモータ
ーと関連している。トリブトファン牙゛イロンのプロモ
ーターのアテヌエーター領域を除去することにより。

トリプトファンプロモーターは害されていない強力なプ
ロモーターとして機能することができる。

目的の遺伝子産物の収量を増加するための他の方法は、
選択されたＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡ転写物に
１７　Ｍシームが高い効率で結合するように、選択され
たＤＮＡ配列内に強力なりボゾーム結合部位を連結する
ことである。このような強力なりがシーム結合部位を介
してリボゾームに対するｍＲＮＡ転写物の親和性を増加
することにより、ｍｌ囚人転写物の翻訳が一層高頻度で
生じ、従って目的遺伝子産物の産生が増加すると信じら
れる。

目的遺伝子産物の発現を増加するための上記の技法のす
べては、目的遺伝子産物をコ〜！−するＤＮＡ配列の５
′一端に存在する！ＩＩＩ１ｇＩ配列の操作に関する。

すべての場合において、これらの制御配列は目的遺伝子
産物をコードするＤＮＡ配列の転写の開始、又は目的遺
伝子産物をコードするＤＮＡ配列に対応するｍｌσ人転
写物の翻訳の開始のいずれかに関する。

遺伝子の発現の他の形は種々のウィルス系におｈて観察
されている。ルトロレギーレーショ／′（ヒａｔｈｏｒ
ｅｇｕｌａｔｉｏｎ　）”なる語はこの形の発現調節の
友めに造られた造語である。Ｃｏｕｆｔ等、後記（１９
８３）を参照のこと。先行技術に記載式れているように
、レトロレギュレーションの既知の形は、レトロレギュ
レーションがその効果を及ぼす遺伝子産物の発現を減少
せしめることが常に見出される。従って、既知の形のレ
トロレギュレーションハ負の（２２、ｇａｔｉマ・）　
Ｌ／　トｃｒレイニレ−ジョンである。

バクテリオファーノλにおいて、ｓｉｂと称する３′−
末端配列によるイ／テグ２−ゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）
遺伝子（ｉ　ｎ　ｔ　）　ｍＲＮＡ配列の発現の制御が
５ｏｈｉｎｄｌ＠ｒ及びＥｃｈｏｌｓ″′バクテリオフ
ァージλの士止遺伝子の制８＝翻訳完了の調節”、プロ
シーデインダス・オツ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オプ拳サイエンシス・オブΦデ嗜ユナイテッドψステイ
ッ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃｄ、ｏｆＳｃｉ、（ＵＳＡ）、　７８　：　４４７
５−４４７９（１９８１）に記載されている。５ａｈｉ
ｎｄｌｓｒ及びＥａｈｏｌｇは、Ｊ上領域が発現の翻訳
レベルにおいて幻匹ｍｌざＡからの蛋白質の合成の正常
な完了を阻害することにより作用すると仮定している。

さらに、小制御領域がステムアンドルーズ（ｓｔｅｍ　
ａｎｄ　１ｏｏｐ　）二次構造７′ニゲレツクスを形成
することができるｒｎＲＮＡ領域に対応することが仮定
されている。１Ｉｔｂ領域はさらに、それが制御する遺
伝子の末端に近い、ＲＮアーゼ瓜のための開裂部位を与
える領域を含むと信じられている。

駅アーゼ■のためのこの開裂部位は種々のエキソヌクレ
アーゼによる分解に対してｍＲＮＡ　を感受性にする。

著者は、ｍＲＮＡ転写物の分解によりｉｎｔ遺伝子産物
の蛋白質合成が早すぎる時期に停止されると仮定してい
る。すなわち、参照文献は、」８遺転子によりコードざ
ルるポリペプチドの産生が減少する、−〇上制御配列の
負の゛ｉｉ制御の役割を開示しているｏＧｕａｒｎｅｒ
ｏｓ　等、１遺伝子に遠位の部位からのバクテリオファ
ーソλｉｎｔ遺伝子発現の転写後調節”、！ロシーデイ
ンダス・オブ・ザ赤ナショナル−アカデミ−・オブ・サ
イエンシス・オブ・デ・ユナイテッド・スティソ・オプ
・アメリカ［：　（Ｐｒｏａ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｄ、
　ｏｆ　Ｓｃ　ｉ、　（ＵＳＡ））、７９　：２３８−
２４２（１９８，２）は、機能的ＲＮアーゼ■を欠く細
菌宿主においてｌｌ１ｂ制御は不完全であることを開示
している。参照文献はさらに、ｓｉｂレトロレギュレー
シ、／因子は転写後に機能して１ｎｔ　ｍＲＮＡの分解
を増加せしめることによりｍＲＮＡの翻訳を阻害すると
する５ｃｈｉｎｄｌｅｒ及びＥｃ　ｈａ　ｌ　７ｊ　％
前掲、に同意している。Ｃｏｕｒｔ等、１λｉｎｋ遺伝
子についてのレトロレギュレーション部部位の検出分析
”ツヤ−ナル・オグ・モレΦ２３３−２４０（１９８３
）は％　Ｇｕａｒｎｅｒｏｓ　等、前掲、′の一般的教
示に同意し、そしてさらに。

ｓｉｂ部（Ｓｋｔ’コードするレトロレギュレーション
因−３４）ＲＮアーゼ■感受性構造は、ニジユリシャ・
−コリ（Ｅａｃｈｅｒｉｃｈａ工虹二）及びファーノ中
に見出される他のＲＮアーゼ■感受性部位に類似してい
ることを示唆している。

Ｅ．コリ　（Ｅ、　ｃｏｉｌ　）における転写停止につ
いての一般的検討において、Ｈｏｌｍｅｓ等、＠Ｅ、コ
リにおける転写の停止”、セル（Ｑｅｌｌ　）、３２．
１０２９−１０３２（１９８３）は、転写ターミネータ
−をコードするＤＮＡの一次構造は、対称的グアニン−
シトシン高含有配列のいずれかの側にアデニン及びチミ
ン塩基対の列を含有することを開示している。これらの
配列からのｍ１ＷＡ転写物は、いずれかの側にウリソン
残基の列が続くステムアンドループ二次構造又はヘアピ
ンループ二次構造を形成する。このようなターミネータ
−はいずｎかの方向においてターミネータ−として機能
する。しかしながら、文献はこの２方向ターミネータ−
活性の意義は明らかでないことを強調している。文献は
さらに、ステムアンドルーグ構造を欠く転写ターミネー
タ−をコードするＤＮＡ　配列ノＲＮＡ転写物はそのよ
うな構造を有するターミネータ−よシ急速に分解される
という事実を検討している＠Ｐｌａｔｔ及びＢｅａｒ　
、　’転写停止におけるＲＮＡポリメラーゼ、ρファク
ター及びリボゾームノ役割”、ノー／・ファンクション
・イン・グロカリオツ（Ｇｏｎｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　
ｉｎ　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｓ　）、Ｂｅｃｋｗｉ　ｔｈ
　％ｆ４．　ｓ−ルドスグリングハーパーラゴラトリー
ズ、ニューヨーク（１９８３）は、転写停止、及び転写
停止の制御におけるＲＮＡ転写物の末端の二次構造の役
割について総説している。

著者はｒｎＲＮＡ中の二次構造の幾つかの機能の可能性
を推論しており、その１つは完成式れたｍＲＮＡ転写物
のある点から後の３′エキソヌクレアーゼによる分解に
対する安定化を含む。しかしながら、ｍＲＮＡ転写物が
コードする遺伝子産物の発現の増強が得られるとする水
製は存在しな＾。

Ｇａｎｔｚ、　Ｒ，”　ＲＮＡ停止シグナルの下流の置
き換えにより強力なプロモーターのクローニング及び分
析が可能となる“、！ロシーデインダス・オシ・デ・ナ
ショナル・アカデミ−・オシ・サイエンシス・オシ・デ
・ユナイテッド・スティソ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　ｏｆ　Ｓｅｔ　（ＵＳＡ））、
７８　４９３６−４９４０（１９８１）は、シラスミド
ｐＬＢＵ３において、バクテリオファージｔｄ　由来の
強力な転写ターミネータ−の、ｌａｃプロモーター領域
を欠くβ−がラクトシダーゼ遺伝子のα−断片への付加
かファーゾＴ５のための強力なグロそ一ターのクローニ
ングｔ−可能にしたことを示している。強力なプロモー
ターが、Ｍ２Ｓ（上駐α析片欠損株）補完検定（ｃｏｍ
ｐｌｅｍｅｎｔａＬｉｏｎ　ａｓｓａｙ　）における増
加したβ−ガラクトシダーゼ活性により単離された。ｄ
ｙａｄ対称の領域を有するｆｄターミネータ−により強
力な転写停止活性が示でれたが、この強力な転写停止活
性はＧｌ！　ｎ　ｔ　ｚ等により記載された系において
、ｆｄ）ｌａツム中の本来の方向とは反対の方向におい
てのみ報捨された。ｐＬＵＢ　３中のｆｄ断片は、ｆｔ
ｌ”ツム中でのその活性と異シ、ρファクターと共働し
て転写を効率的に停止せしめる。しかしながら、ｆｄ転
写ターミネータ−それ自＃、がβ−がラクトシダーゼ遺
転子の発現に対して増強効果を有することは、Ｇｅｎｔ
ｚ等によって教示されておらず、又なんらの証明も示さ
れていない。

Ｇｅｎｔｚ等は、測定可能なβ−ガラクトシダーゼ活性
を、β−が２クトシダーゼ遺伝子のα−断片をコードす
るＤＮＡ配列の５′末端に連結さルたファーノＴ５由来
の強力なプロモーターに帰している。

Ｆ’Ｌｏｃｋ等、１合成りボゾーム結合部位を用いるヒ
トーウロがストロンの遺伝子パシルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌｓ　）における発現１
、モレキュラー・アンド・ゼネラル・ゼネティクス（Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇ＠ｎａｒａｌ　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ　）１且Ａ１２４６−２５１（１９８４）は、
１（ｆ之スミド）ｐＦＦ８１０中でバクテリオファージ
からの転写ターミネータ−ｆｄ’４ウロｆステロ／遺伝
子のすぐ後に置くことが、′Ｅ、コリにおいて全体的な
発現を約５〜１０倍改良する”と述べている。ｆｄ転写
ターミネータ−シグナル、その配列、ウロがステロン遺
伝子の直接末端に対する方向及び配置の詳細は記載され
ていない。Ｆｌ　ｏ　ａｈ等のｆｄ転写ターミネータ−
は、Ｂ、ズブチリスにシいて非常に活性が高いと予想さ
れる推定上強力なプロモーターと共に使用されるＯ 幾つかの細菌において、多量に存在する細菌性蛋白質又
はリポプロティンと関連すると思われる比較的安定な高
コピー数ｍＲＮＡが観察されている。

例エバ、ハシシス・チュリンノエ／シス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　Ｌｈｕｒｉｎｇｉａｎａｉｓ　）のｃｒｙ遺伝子
からのｍＲＮＡが胞子形成中に発現される遺伝子の他の
ｍＲＮＡよりも長い半減期を有することが報告されてい
る。Ｐｅｔｉｔ　−Ｇａ１ｔｒｏｎ　、　Ｍ、　Ｆ、及
びＲａｐｐｏｒｔ　＋　Ｇ、　、’　Ｅ、コリからの無
細胞系におけるＢ、チュリンノエンシスの蔵子形成細胞
からの安定なｍＲＮＡの翻訳”、ビオケミ−（Ｂｌｏｃ
ｈｍｌｅ　）　。

５８．１１９−１２９（１９７６）。この増加したｍＲ
ＮＡ安定性は胞子形成中における結晶蛋白質の多量合成
に寄与する因子として長い間仮定されていた。

さらに、主要外層膜蛋白質の合成を指令するＥ。

コリのリポグロテイｙ　（ｔｐｐ　）遺伝子からのｍＲ
ＮＡは相対的に安定であることが知られており、そして
約−０，４〜約−２１，１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ　の範囲
のΔＧｏを有するステムアンドループ構造の形で広範な
二次構造を形成することができる配列を有することが示
されている。ナカムラ等、′Ｅ、コリ外層膜■のり／ｆ
ｃｘティンのメツセンシャーリボ核岐。

児全ヌクレオチド配列”、ツヤ−ナル・オシ・パイオロ
ゾカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｒｎ、　
）２５５：２１０−２１６（１９８０）。ナカムラ等及
びＰｅｔｉｔ−Ｇａｌｔｒｏｎ　等のいずれも、これら
の構造が目的遺伝子産物の発現を増強するために使用す
ることができることを示唆していない。さらに、クロー
ン化されたｅｒ７遺伝子のヌクレオチド配列は、後に記
載するように、ｚｐｐ遺伝子のｍＲＮＡと関連する広範
な二次構造を欠いている。

要約すると、一般にレトロレギュレートョ／に関する従
来技術は、既知のレトロレギュレーション配列は、それ
らがレトロレギュレートする遣云子の発現に対して負の
効果を有することを示している。ターミネータ−に関し
て、Ｇｅ　ｎ　Ｌｘ及びＦｌｏｃｋ等は、強力なブロモ
−ターの調節のもとにあるＤＮＡ配列については該ＤＮ
Ａ配列がコードする遺伝子の効果的な発現か得られるが
、そのような強力なターミネータ−の非存在下でに仮定
の強力なｆＩ：Ｉモーターの活性は明確に示され得ない
こと全示唆している。

（本発明の記載） 本発明者等は、選択された遺伝子産物をコードするＤＮ
Ａ配列に連結された場合に該選択された遺伝子産物の産
生上増加せしめる正のレトロレギュレーション因子を発
見した◎ この明細書において、「選択された」又に「目的の遺伝
子産物」なる語は、ポＩＪ、！７’チド又は蛋白賃金コ
ードするＤＮＡ配列を含んで成る組換ＤＮＡ分子による
原核生物宿主又は真核生物宿主の形質＠喚によ）それら
の宿主により産生されるポリペプチド又は蛋白質を意味
する。このような選択された又は目的の遺伝子産物は、
宿主により通常に。

宿主以外の原核生物により、又はイ８主以外の真核生物
により産生されるものである。この明、ＩＢ書において
「遺伝子」なる語は、ポリペプチド又は蛋白質全コード
するＤＮＡ配列を意味する。「発現」なる語は、ＤＮＡ
配列又は遺伝子によりコードされているポリペプチド又
は蛋白質の産生について用いる。一般に、正のレトロレ
ギュレーション因子は選択でれた遺伝子産物をコードす
るＤＮＡ配列の下流に連結される。この明細書において
、「下流」なる語はＤＮＡ配列が対応するメツセンツヤ
−Ｐ、ＮＡの転写の方向に関して使用され、転写は上流
から下流に進行する。

正のレトロレギュレーション因子の位置は一般に、選択
された遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列のコード鎖の
３′末端例である。遺伝子が発現されるために、選択て
れた遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列の３′末端に翻
訳終止コドンが一般に存在することがよく知られている
。典型的には、正の・レトロレギーレーシ、ン因子は、
選択された遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に、該選
択された遺伝子のための該ＤＮＡ配列と関連する翻訳終
止配列への３′側に連結される。既知の翻訳終止配列は
一般にヌクレオチドのトリブレ２トである。このような
翻訳終止コドンは配列ＴＡＧ％ＴＡＡ、及びＴＧＡを用
するコドンを包含し、ここで文字はＤＮＡ分子の溝成成
分であるチミン残基、アデニン残基及びグアニン残基に
相当する。翻訳終止コド／は単独で、連胱して対を成し
て、又は間に多数のヌクレオチドを有する対として存在
することができる。

例えば、Ｗａｔｓｏｎ　Ｊ、　Ｄ、　、モレキュラー　
・パイオロノー〇オブ・デ・ノーン（Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｂｉｏｌｏｇ７ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｏｎｅ　）　、　
’＞Ｖ、　Ａｓ　Ｂｅｎｊａｎｌｎ社、メンロノ等−り
、カリホルニア（第３版、１９７７）＆：参照のこと。

翻訳終止シグナルは選択された遺伝子産物をコードする
ＤＮＡ配列に本来的なものであってもよく、あるいは、
所望の位置に翻訳終止シグナルを設けるために、選択さ
れた遺伝子産物をコードするり、ＮＡ配列の３′末端に
そのシグナル自体が連結てれてもよい。

正のレトロレギュレーション因子が連結される遺伝子０
３′末端から該因子までの距離は、該遺伝の発現に対す
る正の効果又は増強効果を及ぼす限シにおいて変化する
ことができる。後で非常に詳細に説明するように、Ｂ、
チュリンノエノシス稍晶蛋白質をコードする遺伝子の３
７フ２／キング領域から単離された正のレトロレギーレ
ーシ、ン因子の、選択された遺伝のｍ１ＬＮＡ　１ｍ写
物の末端において「ステムアンドループ構造を形成する
と信じられる特定の領域が、選択された遺伝子の３′末
端から約３０〜約３００ヌクレオチドの位置に連結され
た。両構成物において、前記上のしｌ・ロレギュレーシ
ョン因子が連結された遺伝子の発現に対する正のレトロ
レギュレー７．ン効果が示てれる。

後で例において詳細に示すように、正のレトロレギュレ
ーション因子は、該正のレトロレギュレーション因子の
方向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏ−ｎ　）とは無関係に、そ
れらが連結された遺伝子の発現を増強することが示され
た。正のレトロレギュレータ１ノ因子が選択された遺伝
子０３′末端に連結される限Ｄ、核上のレトロレギュレ
ーション因子ハ３’−５’方向又’Ｕ５’−３’方向を
有することができ、そしてなお選択された遺伝子の発現
に対する増強効果を発揮することが示された。

この発明の正のレトロレギュレーション因子は、Ｔｉｎ
ｏｃｏ　、　Ｉ、等、ネイチ、アー・ニュー・バイオロ
ノ−（Ｎａｔｕｅｒ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　ｅ　
２４６　＊　　４０−．４１（１９７３）の方法によ）
決定された場合に約−３０，、４ｋｃａｌのＧｉｂｂ〒
の自由エネルギー含量（ΔＧ’）を有するステムアンド
ループ構造そ形成することができる対、応するＲｉ”４
Ａ転写物を転写するＤＮＡ配列、として構造的に＋９１
ａ付けることができる。１つの効果的な態様において、
この発明の正のレトロレギュレーション因子は、約４３
％のグアニン−シトシン残基＠　ｆｔ　ｋ　Ｍするステ
ムアンドルーフａ構造を形成することができる対応する
助仏転写物を転写するＤＮＡ配列である。約４０チ〜約
４５％のグアニン−シトシン宮ｆｅ有するそのようなス
テムアンドループ構造もまた効果的な正のレトロレギュ
レーション因子であると予想される。このような正のレ
トロレギュレーション因子はこの発明の範囲内のものと
意図される。

この発明の好ましい態様において、正のレトロレギュレ
ーション因子は、デオキシリボヌクレオ部分は逆方向反
復塩基配列を構成する）ｔ−含む逆方向反復塩基配列を
有するＤＮＡ配列として特徴付けられる。上記の逆方向
反復塩基配列に対応するｍＲＮＡ転写物はりメヌクレオ
チド配列：　ＡＡＡＡＣＧＧＡＡＵＣＡＣＣＵＣＣＡＵ
ＵＧＡＡＡＣＧＧＡＧＵＧＡＵＧＵＣＣＧＵＵＵＵ（こ
の配列中、下線を付したＩＪ　ｇヌクレオチド配列部分
は逆方向反復塩基配列である）を有する。

上記のデオキシヌクレオチド配列及び対応するＲＮＡ転
写物の、う／ダム変異、点変異、付加変異、欠失変異、
合成オリゴヌクレオチド指令変異又は合成オリゴヌクレ
オチドの造成によ）生ずる変形物が、正のレトロレギ、
レージ、／因子の正のレトロレギュレーション効果を維
持するであろう逆方向反復塩基配列を有することが予想
される。正のレトロレギュレーション因子の正のレトロ
レギュレーション因子を維持するそのような変形物は明
らかにこの発明の範囲内にるる。

後で非常に詳細に記載するように、この発明の正のレト
ロレギュレーション因子ハ、Ｂ、チュリンノエンシス結
晶蛋白質をコードする遺伝子（ｃｒｙ遺伝子）の３′フ
ランキング領域の部分から単離することができる・この
３′フランキング領域は、常用のダル電気泳動法によ＃
）精製し、そして増幅のために適当な宿主にクローン化
することかでさる。

この発明の１つの態様においては、後で例においてさら
に記載するように、その転写停止シグナルを含むｃｒｙ
遺伝子の３′フランキング配列の部分が単離され、精製
され、そしてクローン化された。

ｃｒｙ遺伝子のこの部分は、約３８２ヌクレオチドの長
さを有し、すでに前記した正のレトロレギュレーション
因子及びｃｒｙ遺伝子の３′フランキング領域の部分を
含み、そして正のレトロレギュレーション因子を有する
。

正のレトロレギュレーション因子が選択された遺伝子産
物を発現することができるＤＮＡ配列に前記のように適
切な関係に連結でれた場合、選択された遺伝子産物の発
現が増強される。従って、この発明は、選択された遺伝
子産物の発現を増強する方法を包含する。この明ａ書に
おいて、「選択された遺伝子産物を発現することができ
るＤＮＡ配列」とは、選択された遺伝子、例えばβ−ラ
クタマーゼ又はインターロイΦンー２の遺伝子であって
、それと関連するプロモーター、転写開始シグナル、リ
ボゾーム結合部位、翻訳開始シグナル及び翻訳終止シグ
ナルを有し１、これらのすべてが、ＤＮＡ配列がコード
する生成物が発現され得るように逍切な関連及びリーデ
ィングフレームにあるものを意味すると意図される。多
くの適切なプロモーターが当業者により知られており、
これにはＥ。

コリ由来のプロモーター（トリプトファンプロモーター
、ｌａＣグロモーター／オペレーター及ヒ当業者により
知られているその他の多くのプロモーターを包ｔする）
：パシシスのプロモーター（ｐｅｎＰｆロモーターを包
含する）：並びに種々のウィルスプロモーター、例えば
ファーゾλの５ｐ８２ｆロモーター及びＰＬｆロモータ
ーが含まれる。ウィルスプロモーターは、該ウィルスが
一般に感染する特定の細胞に依存して種々の細胞により
認識され得る。選択きれたＤＮＡ配列はさらに、発現さ
ｎた遺伝子産物が分泌されるようにシグナル配列、例え
ば−ｐｓｎＰシグナル配列を含有することができる。シ
グナル配列を含有する選択されたＤＮＡがＥ、コリにお
いて発現される場合、発現生成物は一般にそのｕＩｉ胞
の６　リｆｙズム空間に分泌され、そして超音波処理に
より、９　ＩＪグラズム空間か−ら放出され得るであろ
う。シグナル配列を含有する選択されたＤＮＡが例えば
Ｂ、ズブチリスにより発現される場合、選択された遺伝
子産物は一般に培地に分泌され、該培地から回収され得
るであろう。

「選択された遺伝子産物を発現することができるＤＮＡ
配列」なる語はさらに、ＤＮＡ配列がコードする遺伝子
産物の発現のために必要な因子、例えば酵素類（機能的
ＲＮＡポリメラーゼを包含する）、トランスファーＲＮ
Ａ　、アミノ酸、りが！−ム、並びに選択されたＤＮＡ
配列の転写及び翻訳のために必要な他の因子を含むこと
が意回される。

前記のことから、「選択された遺伝子産物を発現するこ
とができるＤＮＡ配列」はベクター、例えばプラスミド
、及びこれによ］形質伝侯ちれた宿主細胞であって、遺
伝子を発現しそして該遺伝子によりコードされた遺伝子
産物と生成することができるものを包含することが理解
されよう。このようなプラスミド及び宿主の例は当業者
によりよく知られておシ、そして後記の列において詳細
に例示される。選択された遺伝子産物を発現することが
できるＤＮＡ配列を担持するプラスミドのだめの適当な
宿主は原核細胞及び真核細胞□である。原核生物は、真
核（ｔｒｕｅ　ｎｕｃｌ員Ｓ　）を欠く生物と定義する
ことができ、被膜が存在せず、そして核構造が核領域又
はヌクレオイド（ｎｕｃｌｅｏｉｄ　）　ニ集められて
いる。原核生物の染色体に一般に蛋白質と会合していな
い。

グラ哀ミドのための適当な原核ｔｍＪＪｌは、ダラム陰
性細菌及びグラム陽性細菌の両者である。グラム陽性又
はダラム陰性なる語は、それぞれダラム染料を取シ込み
そして維持することができる細胞及びダラム染料を維持
することができない細胞を意味する。適当なグラム陽性
細菌はパクシス“（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　）属に属するも
の、そして特にＢ、ズブチリスである。Ｂ、ズブチリス
ＰＳＬＩ株（ＢＧＳＣＮｏ　ｌＡ３１０　）が特に好ま
しい。　　　　　□適当なダラム陰性細菌はニジエリシ
ャ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）属に属するものでアシ、
そして特にＥ、コリＭＭ２９４株及びＣ３４１２株であ
る。

真核細胞は、被膜により結合されており、そして中に一
般に蛋白質に結合している染色体が存在す゛る真核を有
する細胞と定義することができる。

真核細胞には植物細胞、動物細胞及び菌類細胞が包含さ
れる。菌類細胞の内、酵母、そして特にすｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　）がこの発明の実施において有用である。

選択された遺伝子産物を発現することができる６ＮＡ配
列を担持するための適当なプラスミドは、ＤＮＡ配列が
それによって発現されるように宿主細胞を形質転換する
ことができるプラスミドである。

一般に、正のレトロレギュレーション因子に連結された
選択された遺伝子産物を発現することができるＤＮＡ配
列を、適当な形質転換された宿主中で発現することがで
きる任意のプラスミド中に配置することができる。従っ
て、この発明は、正のレトロレギュレーション因子に連
結された、選択された遺伝子産物を発現することができ
るＤＮＡ配列を担持するプラスミド、及び該プラスミド
により形質転換され九宿主細胞を包含する。

Ｅ、コリを形質転換することができるプラスミドには、
例えばＣｏ１Ｅｌ　　タイプのプラスミドが一般に含ま
れる。Ｅ、コリを形質転換することができる他の適当な
プラスミドには、ｐｓｃｌｏｌｓ　ｐｓＦ２１２４、ｐ
ＭＢ８、ｐＭＢ９、ｐＡｃＹｃ１８４、ｐＡＣＹＣ１７
７、ｐ　ＣＫＩ、Ｒ６に、　ｐＢＲ３１２、ｐＢＲ３１
３、ｐＢＲ３１７、ｐＢＲ３１８、ｐＢＲ３２０，ｐＢ
Ｒ３２１，ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３３３、ｐＢＲ３４１
゜ｐＢＲ３４５、ｐＢＲ３５０，ｐＢＲ３５１、ｐ　Ｍ
Ｌ２、ｐＭＬ２１、Ｃｏ１ＥＩＡＰ、　Ｒ８ＦＩＯＩＯ
１ｐＶ）ｉ５１−　ｐＶＨ１５１ｘ及びｐＶＨ１５３が
含まれる。リコンビナント・モレキュラス・インパクト
・オン・サイエンス・アンド・Ｒ，Ｆ、及びＢａ５ｓｅ
ｔｔ　、　Ｅ、Ｇ、　＠、ラペンプレス、二。

−ヨーク（１９７７）ｔ−参照のこと。ｐＢＲタイプの
プラスミドにはｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、及びｐＢ
Ｒ３２８が含まれる。５ｏｂｅｒｏｎ？、ゾーン（Ｇｅ
ｎｅ　）　＋９　：２８７−３０５（１９８０）を参照
のこと。他の適当なプラスミドが、ＤＮＡイノサージ、
ン・エレメンッ、ｆラスミズ・アンド・エピゾームス（
ＤＮＡ　Ｉｎａｅｒｔｉｏｎ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｈ　
Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ａｎｄＥｐｉｓｏｍｅｓ　）　、　
Ｂｕｋｈａｒ１等編、コールドスプリングバーパーラゲ
ラトリ−（１９７６）ｆｔ参照のことＯ Ｂ、ズブチリスを形質転換することができるプラスミド
には、ｐｃ１９４、ｐｃ２２１、ｐＣ２２３、ｐＵＢ１
１２、ｐＴ１２７、ｐＥ１９４、ｐＵＢｌｌｏ、ｐｓＡ
０５０１％ｐｓＡ２１００、ｐＴＰ４、ｐＴＰ５　（Ｇ
ｒｙｃｚａｎ　、　Ｔ、Ｊ、　、　’″Ｂ、Ｂ、ズブチ
リス中子クローニング、デ・モレキュラス・バアカデミ
ックプレス、ニーーヨーク、１９８２゜３１０頁〕、及
びこれらのｄ４木が會ｌれる。

この発明の実施において使用することができる・Ｂ、ズ
ブチリス及びＥ、コリの両者を形質転換することができ
るプラスミドにはｐ　ＤＨ５０６０、ｐＬＰ１２０１（
０ｓｔｒｏｆｆ等、後記）、ｐ０６２１６５　（Ｇｒａ
ｙ　、　０．及びＣｈａｎｇ　、　Ｓ、　、　’　Ｌコ
リ及びＢ、ズブチリスにおけるＢ、リケニホルミス（Ｂ
、１ｌｃｈ＠ｎｉｆｏｒｍｉａ　）β−ラクタマーゼ遺
伝子の分子クロー二／グ及び発現″。

ツヤ−ナル・オツ・バクテリオロン−（Ｊ、Ｂａ１！ｔ
ｅ−ｒｉｏｌ、）、１４５．４２２−４２８（１９８２
））、ｐＨＶｌｌ、ｐＨ”／１２、ｐｆ（Ｖ１４、ｐＨ
Ｖ１６（Ｉｈｒｌｉｃｈ、Ｓ。

Ｄ、　、　＠Ｂ、ズブチリスにおけるＤＮＡクローニン
グ。

グロシーデインダス・オブ・デ・ナシ、ナル・アカデミ
−・オブ・デ・サイエフシス・オブ・デ・ユナイテッド
・スティソ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　）　、工５：１４３３−１４３６（
１９７Ｂ）玉及びｐｓＹｃ１３０−２　（ＭｃＬａｕｇ
ｈｌｔｎ　ｈＪ、後記；さらにＯｌｄ、Ｒ，Ｗ、及びＰ
ｒｉｍｒｏｓｅ　、　Ｓ、　Ｂ、　、　＠Ｅ、コリ以外
の微生物中でクローニングするためのプラスミドベクタ
ー”、ｆリンシグシス・オプ・ノーイ・ｈａｍ　、Ｌ−
Ｌ−＊及びＲｉ　ｔｔｅｎｂ＊ｒｇ　、　Ｓ、Ｃ，、ｉ
ｉ　、カリホルニア大学出版、パークレイ、１９８１．
４８頁を参照のこと〕が含まれる。

Ｓ、−ｈＶビシニーを形質転換することができるプラス
ミドには、ＰＭＰ７８、ＹＥｐ１３、ｐＢＴＩ　１　、
ｐＬＣ５４４、ＹＥｐ２、ＹＲｐ　１７、ｐＲＢ８（Ｙ
Ｉｐ３０）、ｐＢＴＩ７、ｐＢＴＩ９、ｐＢＴｌｌｏ、
ｐＡＣｌ、ｐｓＬｅｌ、ｐＪＤＢ２１９、ｐＤＢ２４８
、及びＹＲｐ７が含まれる。

正のレトロレギュレーション因子に連結された、発現可
能な遺転子産物金コードするＤＮＡ配列は、シストロン
的、すなわち単一のポリペプチドをコードするものであ
ってもよく、又はポリシストロン的、すなわち多数のポ
リペプチドをコードするものであってもよい。ポリシス
トロン的ＤＮＡに対するｍＲＮＡは単一のプロモーター
の調節のもとにある。このようなポリシストロン的ＤＮ
Ａ配列は当業者によく知られておシ、そしてこれには例
えば、Ｅ、コ、りにおいてトリプトファンオペロンの調
節のもとにあるトリブトファン生合成用遺伝子が含まれ
る。ポリシストロン的遺伝子はまた、一連の複数の目的
遺伝子を単一のプロモーターの調節のもとに連結するこ
とにより人工的に形成することもできる。例えば、Ｆ　
１　ｏ　ｃｋ　ｒ　Ｊ−等、前掲（１９８４）を参照の
とと◎ 正のレトロレギュレーション因子に連結された、目的遺
伝子産物を発現することができる選択されたＤＮＡ配列
は、宿主のＤＮＡに対して同種性　・（ｈｏｍｏｌｏｇ
ｏｕｓ　）であってもよく、又はこれとは異り、宿主の
ＤＮＡに対して異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）で
ありてもよい。すなわち、例えば、選択されたＤＮＡ配
列が遺伝子産物を発現するために形質転換された宿主細
胞と同一の種であることができ、この場合、ここで使用
される選択されたＤＮＡ配列は同種性であると称する。

例えば、この発明の選択された遺伝子産物を発現するこ
とができる同種性遺転子配列は、Ｅ、コリにとりて本来
的な遺伝子を担持するプラスミドにより形質転換された
Ｅ、コリ上宿中で増強された発現を示す。１つの例はＥ
、コリβ−ガラクトシダーゼの産生であシ、ここでは、
増強された発現がβ−がラクトシダーゼ遺伝子の３′末
端における正のレトロレギュレーション因子の連結によ
り介在される。

前記のように、正のレトロレギュレーション因子に連結
された、目的４す（グチドを発現することができる選択
されたＤＮＡ配列は宿主にとって異種性であってもよい
。このような異種性の増強された発現の多くの例が後に
詳細に記載されており、そしてこれには、Ｂ、ズブチリ
スにおけるＢ、リケニホルミスのペニシリナーゼ遺伝、
子の、正のレトロレギュレーション因子に介在された増
強された発現：Ｂ、Ｘ”ブチリス及びＥ、コリのごとき
原核性微生物における嶋乳動物インターロイキン−２及
び変異したインターロイ中７−２遺伝子のごとき真核性
遺伝子の同様な発現、が含まれる。

この発明の他の観点においては、正のレトロレギュレー
ション因子が、選択さｎ−ｆｃ　ＤＮＡ配列によりコー
ドされるｍＲＮＡ転写物の半減期全延長する方法におい
て使用される。例に詳細に示すように、正のレトロレギ
ュレーション因子が選択されたＤＮＡ配列の３′末端に
連結される場合、該選択されたＤＮＡ配列によりコード
嘔れるｍＲＮＡ転写物の半減期が延長される。正のレト
ロレギュレーション因子がこのｍＲＮＡ半減期延長を行
う機作は完全に理解されていない。観察されるｍＲＮＡ
半減期延長についての可能性ある説明は、正のレトロレ
ギーレ−７、ン因子のＲＮＡ転写物が転写物の３′末端
において開始されるｍＲＮＡ転写物の酵素的加水分解全
防止する二次構造を担当するということである。

ｍ＆ＮＡ転写物の半減期を延長する方法は、正のレトロ
レギュレーション因子をその３′−５’方向及び５／−
３１方向の両方において使用して証明石れた。

正のレトロレギュレーション因子は、選択でれたＤＮＡ
配列が宿主生物にとって異種性でるる場合に、該ＤＮＡ
配列に□よりコードされるｍＲＮＡ　＠生物の半減期ｔ
−延長するために使用することができる。

さらに、正のレトロレギュレーション因子のＩＥ用によ
って供されるｍＲＮＡ転写物の半減期の延長は、ブロモ
−ター、選択されたＤＮＡ配列及び正のレトロレキュレ
ーターがすべて宿主生物にとって異種性である場合にも
生ずる。ブロモ−ター、選択さＡ　７’ＣＤＮＡ　、又
は正のレトロレギュレーション因子がそれぞれ１つだけ
、又は−緒に、宿主生物にとって異種性でない場合のｍ
ＲＮＡの半減期延長法もこの発明の範囲に入ると意図さ
れる。

その３′末端に正のレトロレギュレーション因子を有す
る選択されたＤＮＡ配列によりコード妊れたｍＲＮＡ転
写物はそれらが転写さｎ７’Ｃ政生物内で延長きれた半
減期を有することが証明された。従って、このような微
生物は選択−ｇｊ’したＤＮＡをＲＮＡに転写するため
の手段を提供する。選択されたＤＮＡ１　ＲＮＡに転写
するための他の手段はこの発明の範囲内で有用であると
考えられる。すなわち、真核細胞、例えばサク力ロミセ
ス又はキセノゲス（Ｘｅｎｏｐｕｉ　）卯母＃ｊＡ胞が
ＤＮＡ　ｔ　ｉ写するためのそのような手段と考えられ
る。さらに、ＲＮＡ転写に必要な成分、例えば緩衝剤、
ＤＮＡ依存依存性ＲＮＡ／ラメラーゼオン及びリボヌク
レオチドトリホスフェートをその中にＭする無細胞系が
その３′末端に連結でれた正のレトロレギュレーション
因子を有する選択さｎ　ｆｃＤＮＡ配列を転写して延長
された半減期ｔＶするＲＮＡを生成せしめるために有用
であると考えられる。

その３′末端に正のレトロレギュレーションＬｌを有す
る選択されたＤＮＡ配列から転写さｎたｍＲＮＡの半減
期の延長は、リフアンビシ／のごとき転写阻害剤により
処理された細胞のｍＲＮＡに放射性ラベルされたＤＮＡ
グローブをハイブリダイズせしめることにより直接測定
することができる。

正のレトロレギュレーション因子の使用により得られる
選択されたＤＮＡの増強された発現が該選択されたＤＮ
Ａ配列によりコードされｆＣｍＲＮＡの半減期の延長と
実質的に相互関連することが示された。

この発明の以上の要約から、正のレトロレギュレーショ
ン因子、選択された遺伝子産物の発現が増強されるよう
に選択された遺伝子産物を発現することができるＤＮＡ
配列に連結された正のレトロレギ、レーア目ン因子金担
持するプラスミド、増強されたレベルに２いて選択され
たｄ成子産物を発現するそのようなプラスミドにより形
質転換された細胞、及びこうして発現された選択てれた
遺伝子産物を本発明者等が提供したことが、当業者にと
って明らかで６ろう。

妊らに１選択された遺伝子産物を発現することができる
ＤＮＡ配列を用意し、そして正のレトロレギュレーショ
７因子を該ＤＮＡ配列に、前記選択された遺伝子産物の
発現が増強されるような関連に連結すること金含んで成
る、選択１ｎた遺伝子産物の発現を増強するための一般
的方法を提供した−ことが、当業者にとって明らかであ
ろう。上記の、そして後で列において一層詳細に記載す
る一般的方法は、目的とする遺伝子産物をコードするＤ
ＮＡ配列の原核性宿主又は真核性宿主における発現する
友めに効果的であり、そして発現されるべきＤＮＡ配列
がそれを発現する宿主細胞にとって同種性であっても又
は異種性であっても効果的であるように思われる。

次に、例によυこの発明を具体的に説明するが、これに
よりこの発明の範囲を限定するものではない。前記のご
とく、この明細書に記載さｎる発明は、種々のタイグの
＃ｉ胞による棟々の遺伝子産物の発現の増強のために広
く適用することができ、この仁とは当業者にとって容易
に明らかであろう。

下記の例は単に、以下にクリ示される細胞又はプラスミ
ド適用する場合のこの発明の詳細且つ実際的な記載を提
供することき意図するものである。

次に、後記の列において便用シれた制限エンドヌクレア
ーゼのりストｔ−記載する。このリストの三個は特定の
エンドヌクレアーゼの一般に使用さルている名称であり
、そして右欄にそれらが由来する生物である。挙げられ
た制限エンドヌクレアーぜは供給者により推奨される緩
衝液条件及び温度条件下で便用した。制限エンドヌクレ
アーゼは、ニューイングランドビオラプス、ペドリー、
マサチューセッツ、米国；及びペセスダリサーチラはラ
ドリース、ｆイデースペルグ、メリーランド。

米国を含む多くの商業的供給者から入手することができ
る。特定の制限エンドヌクレアーゼが切断するヌクレオ
配列の特定は酵素供給者の製造カタログ、及び標準的参
考書中に見出すことができる。

以下；ＪＸ白 この明細書において幾つかの慣用語及び略号を使用する
。特にことわらない限シ、これらは次の意味を有する。

’ｐｅｎＰ”なる語は、Ｂ、リケニホルミス（土１ｉａ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）　７４９　／　０株のグレペ
ニシリナーゼ遺伝子、又は文脈から明らかな場合はその
関連部分を意味する。ｐ＊ｎＰのヌクレオチド配列はＫ
ｒｏｙｅｒ　、　Ｊ、及びＣｈａｎｇ　＊　８４　ｍノ
ー７　（Ｇｅｎｅ）。

１５．３４３−３４７（１９８１）：及びＮｅｕｇｅ−
ｂａｕｅｒ＋に、、５ｐｒｅｎＨｅｌ、Ｒ，、及び５ｃ
ｈａｌｌｅｒ、）Ｌ。

ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃｉｄ
ａＲａｇ、）、９．２５７７−２５８９（１９８１）に
より公表されている。

１コドン”は、相互交換可能に、（１）ポリペプチド中
のアミノ酸に翻訳されるｍｌ硝Ａ中のり？ヌクレオチド
のトリブレット、又は翻訳の開始又は終止のためのコー
ド、あるいは（１１）遺伝子中のデオキシリフヌクレオ
チドのトリジレット（この対応するトリブレットがｍＲ
ＮＡ中のり＆ヌクレアーゼのトリブレットに転写され、
今度はこれがポリペプチド中のアミノ酸に翻訳される）
、あ、るいは翻訳の開始又は終止のためのコードを意味
する。従って、例えば、この明細書において１コドン”
なる語を使用する場合、５’−ＴＣＣ−３’及び５’−
ＵＣＣ−３’はやずれもセリンの１コドノ”でちる。

１ヌクレオチド”、４デオキシヌクレオチド１、及び″
ｒオキシｊＪ＆ヌクレオチド”なる語はいずれもデオキ
シリ？ヌクレオチド′ｔ−意味する。

″ｄＮＴＰ’又は＠ＮＴＰ”は、デオキシリ？ヌクレオ
チドトリホスフェートのいずれか、すなわちＡＴＰ。

ＧＴＰ、　ＣＴＰ又はＴＴＰを意味する。

“ｂｐ”は塩基対を意味し、そして＠ｋｂ’はキロ塩基
対を意味する。

“ポリペプチド”は２個又はそれより多くのアミノ酸か
ら成る任意の一！−グチドヲ；す味し、これには蛋白質
が包含される。

犠コード配列”又は’　ＤＮＡコード−配列”は、ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列配列来意味・−ＡＴＣ
Ｃ”は、アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクシ
ョン、ロックビル、メリーランド。

米国を意味する０番号と共に、例えば“ＡＴＣＣ３７０
１７”として使用される場合、ＡＴＣＣ１はＡＴＣＣに
寄託された生物のためのアメリカン・タイ！・カルチュ
アー・コレクシ、ンの受託番号を意味する。

“作動可能に連続された（　ｏｐ＠ｒａｂｌｙ　１ｉｎ
ｋ＠ｄ）”なる語は、ＤＮＡ配列に関して使用てれる場
合、それらが通常の機能を発揮することを許容するよう
に該配列が並置された状態を意味する。例えば、コード
配列に作動可能に連結されたプロモーターは、該プロモ
ーターが該配列の発現を調節することができる場合のそ
れらの連結に関する。す？シーム結合コード配列に作動
可能に連結さルたプロモーターは同じ意味をする。すな
わち、それは、９？シ一ム結合部位（ＲＢＳ　）がＲＮ
Ａ転写物の翻訳の開始に寄与するように転写物中に位置
することを許容する。開始コドンに作動可能に連結され
たＲＢＳはこのコドンにおける翻訳の開始を許容するよ
うに位置する。

この発明の方法は、遺伝子工学及び分子クローニングの
技法を用いる。遺伝子工学及び分子クローニングの一般
的技法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、
Ｅ、Ｆ、、及びＳａｍｂｒｏｏｋ　、　Ｊ、　、モレキ
ュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル
（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ　：　Ａ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　）　、コールドスソリ
ングハーパーラ＆ラトリ−１１９８２：及びメンズ・イ
ン・工ンチそロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　）−１０１６８ｓ　リコンビナン）　Ｄ
ＮＡ　、（Ｗｕ　、　Ｒ，編）、アカデミツクプレス、
ニューヨーク、１９７９に記載されている。

オリがヌクレオチドの合成は、米国特許第４．４１５，
７３４号、並びにＭａ　Ｌ　ｔ　＊　ｕ　ａ　ｉ等、ツ
ヤ−ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソシエテイ−
（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏａ、　）１０３　（１１）
：３１８５−３１９１　（１９８１）　：　Ａｄａｍｓ
等、ツヤ−ナル・オツ・アメリカン・ケミカル・ソシエ
テイー（△Ａｍ、　Ｃｈｉｍ、　Ｓｏａ、　）ｌ　Ｏ５
、（３）　：　６６１−６６３（１９８３）：及びＢａ
ｍｃａｇ＊等、テトラヘドロン・Ｖｌ−２”（Ｔｅｔｒ
ａｈ＠ｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　）　、　２２（２０
°）１８５９−１８６７（１９８１）に記載さルている
方法を含む多くの方法により実施することができる。

例１．３′−発現増強断片の調製 人、　　ｐＥｓｌ プラスミドｐＥｓ１は、ヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ　
８２３０２１３７．３　（これを引用によりこの明細書
に組み入れる）に記載されている方法と同様にして、！
ラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）と、Ｂ。

チーリッツエンシス・バラエティ−・クリスタキＨＤ−
１（Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　Ｋ
ｕｒｓｔａｋｉＨＤ−１の大プラスミド断片消化物とか
ら調製された。ｐＥｓｌはまた、Ｈ，５ｃｈｎｅｐｆ及
びＬＷｈｉ　ｔｅｌｅｙ。

グロシーデインダス・オプ・デ・ナシ、ナル・アカデミ
−・オツ・サイエンシス・オブ・デ・ユナイテッド・ス
ティソ・オプ・アメリカ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　８ｃｉ、　（ＵＳＡ））、　７
８：　　２８９３−２８９７（１９８１）、及び米国特
許第４．４４８３８５号（引用によりこの明細書に組み
入れる）にも記載されている。Ｅ、コリに−１２／ＨＢ
ＩＯＩ中のｐＥｓｌは、上記ヨーロッ・９特許出願の出
願人により、ブタペスト条約に基いて、アメリカン・タ
イプ・カルテ、アー・コレクシ、ン、ロックビル、メリ
ーランドに寄託されている。その寄託番号はＡＴＣＣ３
１９９５である。Ｂ、チ、りンノエンシス・バラエティ
−・クルスタキＨＤ−１−Ｄｉｐｅ１株は、ノーサン・
レノ璽ナル・リサーチ・２デラトリー・カルテ。

ア・コレクシ、　ン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎ
ａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｕ１
ｔｕｒ＠Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

ペオリア、イリノイから、ＮｏＢ５７９２として入手す
ることができる。Ｂ、チェリンツエンシス・バラエティ
−・クルスタキＨＤ−１は、アメリカン・タイプ・カル
チュア・コレクションからＮｏ１６１５として入手する
ことができる。

５ａｈｎｅｐｆ　及びＷｈｌｔｅｌ＠Ｆ　ｌ前掲、及び
Ｈ，Ｗｏｎｇ等、ツヤ−ナル・オツ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊｏｕｒ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、）ｅ２
５８．　１９６０（１９８３）に記載されているよう〜
に、　ｐＥ８１は、そのｐＢＲ３２２親のＢａｍＨ１部
位に挿入された、Ｂ、チーリッツエンシスからの３０メ
ｆダルドアプラスミド、４７メガダルトンデラスミド、
又はこれらのプラスミドの両方からのＳａｕ　３Ａ１断
片を有する。

コノ旦駐３Ａｌ断片は、Ｂ、チェリンジエンシスのδ−
エンドトキシン結晶蛋白質をコードする遺伝子（ｃｒｙ
遺伝子）を含有する。この遺伝子は発現されて、プラス
ミドｐＥｓ１により形質転換されたＥ。

コリ中で、生物学的に活性な結晶蛋白質を生成する。

Ｂ、　　Ｍ１３ｍｐ８ＥＰ１−ｃｒｙ遺伝子の３′末端
のクローングラス叱ドｐｇｓ１　ｆ　Ｐｖｕ　ｆｆ及び
Ｉｃｏ　Ｒ１により消化し、そして生じた２ｋｂ断片を
アガロースダル電気泳動によ）単離した。この方法は１
．Ｍａｎｌａｔｉａ等、前掲、１９８２．１６４頁に従
って行ったが、緩衝液として１／ｌ０ＸＴＥＡ（４ｍＭ
　Ｔｒｉｍ　、　Ｏ，１ｍＭＮａＥＤＴＡ　・２Ｈ２０
、０，５ｍＭ酢酸ナトリウム）ｔ−使用した。この断片
は、結晶蛋白質遺伝子の３味端から始鷹）、そして結晶
蛋白質遺伝子の転写停止シグナルを含む。

制限地図配置、及び転写停止シグナルがすぐ後に続く翻
訳終止コドンを含む断片の配列部分を第１因に示す。

次に、常用の連結法を用いて、２ｋｂ断片を７丁−ノＭ
１３ｍｐ８　（ペセスダリサーチラゴラトリーオ社、が
イデーペルグ、メリーラ／ド、米国から入手することが
できる）の？！Ｉ！ＩＩｌ！型（ＲＦ）ＤＮＡ　ｔ−あ
らかじめｆＪｍａ　ｌ及びＥａｏＲＩで消化したものに
クローン化した。得られた！ラスミドｆ　Ｍｌ　３ｍｐ
　８　ＥＰ　１と称する。Ｅ、コリＪＭＩ　ＯＢ株ｔ−
Ｍ１３ｍｐ８　ＥＰＩ　プラスミドで形質転換した。

クローニング Ｍ１３ｒｎｐ９　Ｎｅ３を次のようにして調製した。

Ｍ１３ｍｐ８　ＥＰＩ　ＲＦ　ＤＮＡ　ＪｋＮｄ＠Ｉに
より消化した。このＮｄｅｌ末端を、Ｅ、コリＤＮＡ　
ｙＪ？リメラーゼｌクレノウ断片及びｄＮＴＰにより平
滑末端化した。この平滑末端化されたＤＮＡ分子ｔ−Ｂ
ａｔｎＨ（によりさらに消化した。次に、Ｃ’４Ｆ遺伝
子の転写停止シグナルを担持する、Ｎｅ３と称する３　
８５　ｂｐの断片を、Ｍａｘｌｒｎ等、７ｓロシーデイ
ンダス・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サ
イエｚグ・オツ・デ・ユナイテッド・スティソ・オプ・
アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ）　、　７４　：５６０−５６４（１９７９）に記
載されている方法を用いてアクリルアミドダル電気泳動
により単離した。

Ｎｅ３　ｔ−ＥａｏＲＩ　−Ｓｍａ　ｌ消化したＭｌ　
３ｍｐ　９　ＲＦ　　ＤＮＡにサラクローニングし、Ｍ
１３ｍｐ９　Ｎｅ３を形成した。

Ｅ、コリＪＭＩ　０３を、Ｍ１３ｍｐ９　Ｎｅ３により
形質転換した。

Ｍ１３ｍｐ９　ＮＦ３中にクローン化されているＮｅ３
と称する断片を第１図に示す。この図かられかるように
、Ｍ１３ｍｐ９　ＮＰａ中にクローン化された断片は、
Ｍ１３ｍｐ８　ＥＰＩ中の転写停止シグナルの下流のＮ
ｄｅ１部位とＥｃｏＲ１部位の間に存在する約１．６ｋ
ｂのＤＮＡを欠いている。

リス中で複製することができる（第３図を参照のこと）
。このプラスミドは、Ｅ、リケニホルミス７４９／Ｃ由
来ルペニシリナーゼ（ｐｅｎＰ）の遺缶−？−ｆｌ−含
右し、とのン、′を転子は、とのプラスミド９により形
質転換されたＥ、コリ及びＢ、ズブチリス中で、１駐Ｐ
のために特に変異されたシグナル配列の影響のもとで発
現される。ｐＳＹＣ６６７により形質転換されたＢ、ズ
ブチリスにより、成熟ペニシリナーゼは細胞外に培地中
に分泌される。成熟ペニシリナーゼはｐｓＹｃ６６７に
より形質梃換されたＥ、コリの−ｅ　′リグラズム空間
に分泌され、そしてＮｏ５ｅｌ及び■５ｐｐｅｌ　、シ
ャ゛−ナル・オツ・パイオロノカル・ケミストリー（Ｊ
−Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｒｎ、　）　＃　２４１　ｓ　３Ｑ
５５−３０６２（１９６６）、又はＬｕｎｎ及びＰｉｇ
ｉｅｔ　。

シャーナル・オプ・パイオロノカル・ケミストリー（Ｊ
、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、　）、２５７　、１１４２４−
１１４３０（１９６２）の方法による超音波処理によっ
てベリ！ラズムから放出される。

ｐｓｙｃ　６６７’を次のようにして造成した。

Ｂ、！Ｊケニホルミスのペニシリナーゼ遺伝子は配　　
　　゛列決定されている。Ｋｒｏｙ自ｒ　、　Ｊ、、及
びＣｈａｕｇ　。

Ｓ、ジーン（Ｇｏｎｅ）、１５．３４３−３４７（１９
８１）、並びにＮｅｕｇｅｂａｕｅｒ　、　Ｋ、等１．
スクレイツクー７７ズ・リサーチ（Ｎｕａｌ、　Ａｃ１
ｄ＋ｓ　Ｒａｇ、　）　、　９　：　２５７７−２５８
８（１９８１）を参照のこと。本来のシグナル配列は、
アミノ酸位！ｉ２７にシスティンをコードするコドンＴ
ＧＣ−を含有する。位置２７のシスティン残基は、ペニ
シリナーゼの膜結合リポプロティン形の形成を導く事象
の配列部分として修飾される。Ｎ１ｅｌ＋ｓｅｎ　、　
Ｊ、　Ｂ、　Ｋ、　＊、Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ　ｒＭ、Ｐ
、、及びＬａｍｐｅｎ　、　Ｊ、　Ｏ＊　、！ロシーデ
インダス番オブ拳デ・ナショナル会アカデミ−・オツ・
デ・サイエンシス・オノ・デ・ユニイテッド・ス：３５
１１−３５１５（１９８１）；並びにＬａｉ。

Ｊ、　Ｓ、　ｈ　５ａｒｖａａ　、　ＭＬ　％Ｂｒａｍ
ｍａｒ　、　Ｍ、　Ｊ、　、Ｎｅｕｇｅ−ｂａｕｅｒ　
ｅ　Ｋ％及びＷｕ　＃　Ｈ−Ｃ１ｒプロシーデインダス
・オツ・デ・ナショナル・アカデミ−・オノ・デ・サイ
エンシス・オプ・デ・ユナイテッド・スティソ・オツ・
アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ、Ｓａｉ。

（ＵＳＡ）　〕、　７８　：　３５０６−３５１０　（
１９８１）。この生合成経ｉｔ−特異的に変化せしめる
ため、及び。

よシ多くの蛋白質を細胞から分泌される（グラム陽性細
菌、例えばＢ、ズブチリスの場合）又はペリプラズム空
間に分泌される（グラム陽性細菌、例えばＥ、コリの場
合）細胞外形に変えるため、ぺ二シリナーゼシグナル配
列遺転子中のこの位置にシスティンをコードする配列を
変異せしめることが必要である。

その簡単さと効率の高嘔の故に、システィンからセリン
への変異の造成のためにブライマー指令変異誘発法１：
　Ｚｏｌ　ｌｅｒ　、　Ｍ、　Ｊ、、及び５ｒｎｉｔｈ
、Ｍ、、ヌクレイツク０アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、
　Ａｃ１ｄｓ。

Ｒｅｓ、、）、１０．６４８７−６５００（１９８）を
参照のこと〕を使用した。野性截ペニシリナーゼ（ｐｅ
ｎＰ）遺伝子配列を含有するＤＮＡ断片を単離した。具
体的には１．巨す聾■部位及びとｆ（１部位間に位置す
るＤＮＡ断片ｔ−プラスミドｐｓｙｃ　３１０−２から
切り出した。ＭｃＬａｕｇｈ１１町等、ヌクレイツク・
７　Ｖ　Ｘ’−リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａａｉｃｊａ　
Ｒｅｓ、　）　ｗ　３９０５−３９１９（１９８２）を
参照のこと。プラスミドｐｓｙｃ　３１０−２はＢヂプ
チリス及びＥ、コリのいずれ、においても複製すること
ができる。このプラスミドは、旦Ωｔｄｌｌ［−Ｂａｍ
Ｈｌ断片上に３３．ＩＪケニホルミス７４９７Ｃからの
野性ｑ　とＰ遺伝子を担持する。当業者は、野性型ｐｅ
ｎＰ遺伝子を、それを担持する他の操作されたｍ楔体プ
ラスミドから切り出すこともできること全認識するであ
ろう。このようなプラスミドの１つがＢ、ズブチリスの
プラスミドＰＯＧ２１６５　　である。ｐＳＹＣ３１０
７２から切ｐ出されたＨｌ　ｎｄ　ｍ−ＢａｍＨＩ　Ｄ
ＮＡ断片を、アクリルアミドデル溶出により精製し、そ
して次にコリイアーノＭ１３ｎｘｐ９のＲＦ　ＤＮＡに
連結した。Ｖｉｅｒａ＋Ｊ、、及びＭ＊ｓｓｔｈｎｇａ
Ｊ、ｒ　ノーン（Ｇｏｎｏ）　、　１９　：２５９−２
６８（１９８２）；及びＭａｓｓｉｎｇ、Ｊ、、及びＶ
ｌａｒａ　、　Ｊ、、ゾーン（Ｇｏｎｏ）、１９：　２
６９−２７６（１９８２）を参照のこと。

詳しくは、ｐｓＹｃ３１０−２からの精製１れたＨｌｎ
ｄｌｌｌ−シロＨ１断片を、ペセスダ、リサーチラボラ
トリーズ社＊　Ｐ−０，Ｂｏｘ　５７７　ｒがイデーブ
ルグ。

ＭＤから得らｎたＭ１３ｍｐ９をあらかじめ制限エンド
ヌクレアーゼＨＬｕｄｌｆ［及びＢａｍＨＩで消化した
ものに連結した。この２重鎖ファー）ＤＮＡ　’ｉ　Ｅ
、コリＪＭ１０３に形質転換し、そして細胞全培養した
◎ｐｅｎＰ遺伝子を担持する組侠体ファージ、すなわち
岨換本ファー２Ｍ、１３−ＣＭＩを同定し、そしてこの
クローンから単鎖、　ＤＮＡを調製した。使用した方法
は、Ｚｏ、１１ｅｒ　、　ｊｉＬ　、Ｊ、及びＳｍｉ　
ｔｈ　、　Ｍ、　、；＜クレイツク・アンズ・リサーチ
（Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）　。

１０：６４８７−６５００（１９８２）に記載さルてい
る。

Ｎａｒ　ａｎｇ　、　Ｓ、　Ａｓ　、　Ｈａ　ｉ　ｕｎ
ｇ　、　Ｈ，Ｍ、、及びＢｒｏｕｓｓｅａｕ　。

Ｒｏ、メンズ・イン・エンチモロノー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
力デミックプレス（１９７９）に記載さｎているホスホ
トリエステル法により調製された１５−ヌクレオチド合
成断片５’−ＧＴＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣ−３’を
、−ｉずＡＴＰＡびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ金用
いて５′−末端においてリン酸化し、そして次に５′−
リン酸化されたブライマーを鋳型Ｍ１３−ＣＭＩＤＮＡ
に７ニールさせた後、これをブライマーとして用いて相
補鎖のインービトロ合成ケ開始した。

ＤＮＡ　ｙｊ！リメラーゼエクレノウ断片を用いて、Ｔ
４りが−ゼの存在下４種類すべてのｄＮＴＰと共にプラ
イマーｔ−延長した。このノライマーは、２５位〜２９
位の５個のアミノ酸のコドンに対応するｐｅｎＰシグナ
ル配列セグメントのアンチ−センス鎖に相補的であるが
、但し、合成ヌクレオチド中の中央のヌクレオチドがミ
スマツチヌクレオチドであ）、このものは野性ｆｉｐｓ
ｎＰ遺伝子鋳型中転子応ヌクレオチドＧと相補的でない
ｏｐｅｎＰ遺伝子へのミスマツチ配列の導入が２７位に
おけるシスティ／（ＴＧＣコド／）からセリン（ＴＣＣ
コドン）への転換を生じさせる。

コードされたペグチド上での変化は、本質上、システィ
ン２７の一８Ｈ基からセリン２７の−ＯＨＨへの転換で
ある。ヌクレオチドのレベルにおいては、変異体は変異
座においてＢａｍＨ１部位（ＧＧＡＴＣＣ）を得、そし
てＨｈａ１部位（ＧＣＧＣ）を失う。新たなりａｍＨ１
部位は＠ＧからＣへ”のヌクレオチド変異を有する変異
体を同定するために使用される表現型でおる。

システィンからセリンへの変異の造成において、相補鎖
（マイナス鎖）はＥ、コリＤＮＡポリメラーゼ■のフレ
ノウ断片を用いるＭｌ３−　ＣＭＩ　ファージＤＮＡ鋳
型上での７０ライマ一延長反応により合成された。Ｚｏ
ｌｌｅｒ　、　ｍ　Ｊ、及び５ｒｎｉｔｈ　、　Ｍ、、
　ヌクレイック−アシズ、・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａ
ｃ１ｄｓ　ＲＢ、）　。

１０：６４８７−［５５００（１９８２）を参照のこと
。この反応中Ｔ４−ＤＮＡＩＪ、ｆ−ゼの存在下で、Ｄ
ＮＡ分子のフラクションは２本鎖の共有結合的に閉じら
れたりラックスサークルに転換した。これらの分子を、
ポリメラーゼによりネ完全に延長されたか又はｆ２イマ
ーの不完全なキナーゼ反応のために連結されなかった他
の分子から分慝した。

この分離はアがロース）ｆＡ／奄気泳動により行った。

こノミ気泳動は、２μｇ、４ｎｌのエテノウムブロミド
の存在下０．８％アｆロースｒル上に反応混合物を適用
することにより行った。共有Ｍ金的に閉じられた環状Ｄ
ＮＡｔ−官有するバンドを切り出し、そしてＤＮＡを回
収した。

プラスミドｐｓＹｃ　６６７は次の点を除きｐ　ＳＹＣ
。

６６０と同じである。すなわち、ｐｓＹｃ６６０中の約
１３２０　ｂｐ匹りｄｌｌｌ−シミ旧　前片の末端にお
けるＢａｍＨＩ　認識配列（５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’
　）の代シに、ｐＳＹ、Ｃ６６７は配列５’−ＧＧＡＴ
ＣＣＡＴＣＣ−３’　を有する。

プラスミドｐｓＹｃ６６７はプラスミドｐｓＹｃ６６０
　のＰｓｔｌ及びＢｇｌｌ［認識部位を保持している。

同様に、ｐｅｎＰ　８２７Ｐ　２Ｂ遺伝子を含有するＭ
ｌ３　ｐｅ　ｆｌＰｓ２７Ｐ２８のＨＬｎｄｉｌｌ−加
Ｈ１析片は、ｐｓＹｃ６６ス中の旦堕ｄ　１［−Ｂ　ａ
ｍ　ＨＩ　−ｐ　ｅ　ｎ　Ｐ　Ｓ　２７言有断片中のヱ
ｓ”ｂ　１部位及びＢｇ１１部位と同じ位置に、それぞ
れＰｓ’ｔ　１部位及びＢｇ１１部位を有する。

ｐｓＹｃ６６７はＡＴＣＣＮｏ３９７５８として、ブタ
ペスト条件に基きＡＴＣＣに寄託される。

Ｂ、　　ＰＨＣＷ３−　Ａ　３ プラスミドｐＳＹＣ６６７ｔ−μ已Ｉで消化した。Ｂａ
１ｌはＢ、リケニホルミスのベニ、シリナーゼ遺転子中
の翻訳終止コドンと転写停止シグナルとの間を切断する
。Ｂａ１ｌ末端を、ＤＮＡポリメラーゼエクレノウ断片
及び４種類のｄＮＴＰ　ｆ：用いてフィル−インした。

この方法は当業者によく知られている（　Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ等、前掲（１９８２１参照のこと）。

酵素をフェノール抽出により不活性化し、そしてＤＮＡ
をエタノール沈澱により回収した。、次に、％ＤＮＡ劣
１らにＮｒｕｌにより消化し、そしてフェノールで２回
抽出し、そして次にエーテルで２回抽出した。凶＝■は
、ｐ８Ｙｃ６６７中のＢ、リケニホルミスのベリシリナ
ーゼ遺伝子の転写停止シ、グナルの下流を切断する。従
って、ｐｓＹｃ６６７の大Ｎｒｕ　ｌ　−Ｂｃｌ　ｌ切
断断片は翻訳終止コドンまでの完全なペニシリナーゼ遺
伝子を含有するぞ、転写停止シグナルを含有しない（第
３図を参照のこと）。

Ｍｌ　３ｍｐ９　・ＮＦ２　ｔ−Ｅａ　ｏＲｌ及びＢａ
ｍＨＩで切断し、そして４００　ｂｐ　断片’ｅｌ　ｑ
ＩＩ７ガｏ　−スｙ　、＋Ｉ／　’６用いて標準的方法
により単離し、そしてＤＩ−５２クロマドグ２フイーに
より！＃製した。このような方法はＭａｎｉａｔｌａ等
、前掲、１０４（１９８２）に記載されている。

次に、Ｍ１３ｍｐ９　ＮＦ２からのＥ、ｃｏＲｌ−Ｂａ
ｍＨＩ　４００ｂｐ　断片を、標準的方法を用いてｐｓ
Ｙｃ６６７の大Ｎｒｕｌ−Ｂｃｌｌ断片に連結した。得
らｎたプラスミドを、　Ｃｏｈｅｎ等の方法〔ノロシー
ディ／ゲス・オブ・デ・ナショナル・アカデミ−・オプ
・サイエンシス・オプ・デ・ユナイテッド・スティソ・
オ６９二２１１０（１９７３））（場らに、Ｍａｎｉａ
ｔｉａ＠、前掲、１９８２．２５０頁を参照のこと）の
方法によりＥ、コリに一１２／Ｃ８４１２に形質転換し
た。５０μｌ／１ｔｔｔのアノビ７りンを含有するＬＢ
培地グレート上で、形質転換体を耐性について選択した
。Ｍａｎｉａｔｌａ等、前掲、４４０（１９８２）。選
択された形質転換体から、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌ
ｙ　（ヌクレイツク囃アシズ・リサーチ（Ｎｃｕｌ、　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）　、　１　：　　１５１３（
１９７９）］のミニーグレグ法によりｆラスミドＤＮＡ
　ｔ−調製し、そして予想される１、　６　ｋｂＥａｏ
Ｒ１断片、すなわちＭ１３ｍｐ９　ＮＰ３由来の約０．
４ｋｂの断片及びｐ　ＳＹＣ６６７からの約１．２　ｋ
ｂの断片、き有するプラスミドについてスクリーニング
した。１つの形質転換体がｐ）ＩＣＷ−Ａ３と称するプ
ラスミドを有していた。

Ｂ、１．　　ｐＨｃＷ−Ａ３によるＢ、ズブチリスの形
質転換ｐＨｃＷ−Ａ３　ｔ−さら４ｃ、Ｂ、、ｒフチリ
スＰＳＬｌ　　、パクシス・ゼネティック・ストック・
センターＮ。

ｌＡ３１０（オヒオ州立大学微生物学部パシシス・ゼネ
ティック・ストック・センター、コロンビア・オヒオ・
米国）に形質転換した。Ｂ、ズブチリスＰＳＬＩはＬｅ
ｕ″″、　Ａｒｇ−、Ｔｈｒ−、及びｒｅｃＥ４である
。

Ｂ、ズブチリスＰＳＬＩ細胞の培養ｗｉｔ、Ａｎａｇｎ
ｏ−ｓｔｏｐｏｕｌｏｓ　及び５ｐｉｚｌｚｅｎ　、ゾ
ヤーナ／ｌｚ　・オプ・バクテリオロノ−（Ｊ、　Ｂａ
ｅｔ＊ｒｉｏ１．　）　、　７４１−７４６（１９６１
）により記載されている技法に関連する技法を用いて形
質転換のためにコンピテントにした０ ２０１１の（Ｎｌ（４）２Ｓｏ４．　ｌ　４０　ｆ９の
に２ＨＰＯ４＄６０１１のＫＨ２ＰＯ４及び１０．９の
クエン酸ナトリウムに蒸留水を加えて全容ｌｌにして混
合することにより、１ＯＸｓｐｉｚｉｚｅｎｉ最少溶液
を調製した。

５ｐｉｚｉｚｅｎＩ　培地は、２．０５１１！ｌのｔＭ
Ｍｇｓ０４：６ｄの５　Ｑ　ｖ／ｖ％グルコース：　５
１１１Ｑ）　１０　Ｗ／ｖ％酵母エキス；５ゴの２　ｖ
ｒ／ｖ％カゼイン加水分解物：形質転換されるべき菌株
により要求される各アミノ酸のために、アミノ酸の１　
ｗ／ｗ％溶液２．５１ｆｆ１７；５０１１７の１０ＸＳ
ｐｉｚｉｚｅｎｌ最少溶液；及ヒ溶液ノ容積１５００１
１Ｌｌにするのに十分な蒸留水を混合することにより開
展した。Ｂ、ズブチリスＰＳＬＩのために必要なアミノ
酸はスレオニン、アルギニン及びロイシンである。

５ｐｉｚｉｚ＠ｎｌｌ培地を、５ＱＯａｊの５ｐｉｚｉ
ｚｅｎｌ培地に０．２５１！Ｌｌのｌ　Ｍ　Ｃａ　Ｃｔ
２及び１ｄの１ＭＭ２を添加することにより調製した。

３９ｍｊの８ｐｉｚｉｚｅｎｌ培地に形質転換てれるべ
きＢ、、Ｉ＃ブチリスの株の胞子懸濁液を接種し、そし
て３７℃にて一夜（１６〜２０時間）増殖せしめた。

次に、１５ｍの一夜培養物を、２８００ｍ７のフラスコ
中１３５ゴの５ｐｉｚｉｚｅｎｌ　培地に接種し、そし
て３７℃にて増殖せしめた。この培養物の６００　ｎｍ
　（０，Ｄ、）における光学濃度を１．５〜２時間後に
測定し、そしてさらに、１５分間の０．Ｄ、の読み値の
増加が５チ未満となることを基礎にして培養物が後期対
数増殖期にあることが見出されるまで、１５分ごとに測
定した。

次に、５０ＩＩＬｌの後期対数増殖期培養物１２８００
−のフラスコ中４５０１１１７の５ｐｉｚｉｚｅｎｉ［
培地に接種し、そして３７℃にて１．５時間増殖せしめ
た。

１．５時間の増殖の後：４℃にて１０分間５０００ｒｐ
ｍで遠心分離することにより細胞を回転沈澱せしめた。

次に遠心分離からの（レットを４５ｍの上滑液に再懸濁
し、次にこの懸濁液に６ｄの８０ｖ／マチ無菌グリセリ
ンを加え、その直後にドライアイス−エタノール浴（−
７０℃）中で培養物を凍結した。

凍結した培養物甲の細胞はコンピテント細胞であり、次
のようにして所望のプラスミドにより形質転換するため
に適当でらった。

０．５ｄ〜０．６　＃！ｊの凍結ぢれたコンピテント細
胞含有培養物を・氷上で解凍し、そして該細胞に形質転
換されるべきプラスミドを含有する溶液５μｅ５０μｌ
を、上記の解凍した培養物と一緒にした。

得られた混合ｖＩＪｔ３７℃にて２時間振とうし、この
間にプラスミドの形質転換及び遺伝子の発現が生じた。

最後に、選択のため、小アリコート、例えば約５〜約２
００μｊの形質転換された細胞の培養物を、選択のため
に望ましい抗性物質（１種類又は複数種類）を含有する
プレートに移した。

プラスミドにより形質転換されたＥ、コＩＪＫ−１２／
Ｃ８４−１２から前記のようにしてプラスミドｐＨｃＷ
−Ａ３　　のミニ−プレｆｔ−調製した。コ／ピテント
Ｂ、ズブチリスＰＳＬＩの培養物ＩＷＬｌに５μノのミ
ニ−プレグ−プラスミドＤＮＡ溶液を加えた。この混合
換金３７℃にて２時間インキュベートした。

次に、混合物のアリコートｔ−プレートし、そして５μ
ｂ個のクロラムフェニコールを加えた富栄養寒天グレー
ト（牛肉エキス１．５１／ｌ　　；酵母エキス３．０１
／１３　　；ペグトン６．０１／ｌ　　；寒天１５，０
１／ｌ）上で３７℃にて一夜イ／キ、ベートした。

クロ２ムフエニコール耐性コロニーを拾い上ケ、そして
５μｍ１ＡＩＬｌのクロラムフェニコールを含有する５
Ｍの２ＸＬＢ培地に接種し、そしてこの培養物を振とう
しながら３７℃にて一夜インキ、ベートした。

上記のようにして調製された。　ｐｉ（ＣＷ−Ａ３によ
り形質転換されたＢ、ズブチリスＰＳＬＩの培養物のサ
ブカルチュアーはＮｏ　２１２０としてＣＭＣＣに寄託
されている。

Ｃ，ｐＬＷｌ プラスミドｐＬＷｌはＥ、コリ中で複製することができ
るｐＢＲ３２２誘導本であり、テトラティクリン耐性遺
伝子、Ｅ、コリｔｒｐプロモーター、１７　ｄｌ”シー
ム結合部位（ＲＢＳ）断片、及びヒト−インターロイキ
ン−２（ＩＬ−２）の遺伝子を含有する７　０６ｂｐ旦
１ｎｄｌｌ−Ｐｓｔｌ　ＤＮＡ断片を含有する９ｏｓｅ
ｎｂ＊ｒｇ。

Ｓ、　Ａ、等、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　ｅ　
２２３：１４１２−１４１５　（１９８４）　：ｌ　ｏ
　ＰＬＷ’はブタペスト条約に基き、ＡＴＣＣＮｏ　３
９４０５　としてＡＴＣＣに寄託されている。− Ｄ、　　ｐＬＷ４５ プラスミドｐＬＷ４５はＥ、コリ中で複製することがで
きるｐＢＲ３２２の誘導体でらフ、テトラサイクリン耐
性遺伝子及びＥ、コＩ）　ｔｒｐグロモーターを含有す
る。このプラスミドは７０６ｂｐ−患ユｄトシ＋ｔｌ断
片上に変形されたＬＩ−２蛋白質の遺伝子を含有する。

ｐＬ潤５はツタペスト条約に基きＡＴＣＣＮｏ３９６２
９としてＡＴＣＣに寄託されている。

ｐＬＷ４５によりコードされた変形されたＩＬ−２、及
び免疫系の抑制を含むヒトの疾患の治療におけるこのよ
うな変形されたＩＬ−２蛋白質の使用は１９８３年１１
月１４日に発行されたベルギー特許Ｎｏ８．９８，０１
６に記載されている。この記載を引用によりこの明細書
に組み入ｎる。

Ｅ、　　ｐＨｃＷ７０１及びｐ　ＨＣＷ７０２供給者に
より示唆された緩衝液条件下でＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ
１制限エンドヌクレアーゼで消化することにより、Ｍ１
３ｍｐ９０　ＮＰ３からｃｒｙ遺伝子の転写停止シグナ
ルを担持する４００ｂｐ’Ｅｃびｌ　−Ｂ　ａｍＨＩ制
限断片を切９出した。この断片のＩｃｏＲｌ　−Ｂａｍ
Ｈｌ末端をフレノウＰｏ１ｌ断片及びｄＮＴＰにより干
滑末端化した。ａｒｐ遺伝子の転写停止シグナルを含有
する平滑末端化された断片をアクリルアミドダル電気泳
動により単離した。この単離された平滑末端化断片を電
気溶出し、そしてＴ４りが一ゼ及ヒＡＴＰ　ｔ−用いて
、５ｔｕｌ制限エンドヌクレアーゼであらかじめ消化さ
れたプラスミドｐＬＷ１に連結した。

転写停止シグナルを担持する平滑末端化断片がｐＬＷｌ
の旦す」　　末端に組み換えられる方向付けには無関係
に、もとのＥｃｏＲ１部位及びＢ　ａ　ｍｆ（１部位の
両者が再形成されるであろう、１つの方向付けが、Ｂａ
ｍＨ１部位がＩＬ−２の３′末端に近い方に位置する結
果をもたらし、そしてこのように特徴付けられたプラス
ミドｔ−ｐｆ（ＣＷ７０１と称する。（この方向付けは
、ｃｒｙ遺伝子自体の中に見出されるそれに類似する。

）他の方向付けは、ＥｃｏＲ１部位がＩＬ−２遺伝子の
３′末端に近い方に位置する結果をもたらし、そしてこ
の組換プラスミドをｐＨｃＷ７０２　　と称する（第３
図）。第１図に示すようにＥａｏＲｌ　−ＢａｍＨＩ［
ｉ片中の逆方向反復塩基配列の非対称的配置のため、　
ｐｆ（ＣＷ７０１　　においては正のレトロレギ為レー
ン、ン因子のステムアンドルーグ構造ハＩＬ−２遺伝子
の３′末端のＢａｍ部位の約３１０　ｂｐ下流に位置す
る。ｐＨｃｗ７０２　　においては、正のレトロレギュ
レーション因子のステムアンドルーフ構造はＩＬ−２遺
伝子の３′末端のユリ１部位の約３０ｂｐ下流にある。

ｐ）ＩＣＷ７０１　　及びｐＨｃＷ７０２　Ｕ、プラス
ミドＤＮＡを制限酵素１ｃｏ’ＲＩで消化しそしてアク
リルアミド又はアがロースグル電気泳動を用いて制限断
片のサイズを決定することにより容易に区別することが
できる。ＥｃｏＲｌで消化されたｐｌ（ＣＷ７０１は、
鬼プロモーター−ＲＢＳカセット（１０８ｂｐ）、ＩＬ
−２遺伝子（４５０ｂｐ　）及びターミネータ−（４０
０ｂｐ）を含有する９　６０　ｂｐ制限断片を放出する
。しかしながら、ｌ１２ａｏＲ１で消化てれたｐ　ｆ（
Ｃｆ７０２は、Ｌｒｐプロモーター−ＲＢＳカセット（
１０８ｂｐ）−及びＩＬ−２遺伝子（４ｓＯｂｐ）のみ
を含有する５６０ｂｐ　制限断片を放出する。

Ｐ、　　ｐＨｃＷ８０１’の造成　　　　　　　　−プ
ラスミドｐ　ＬＷ４５による変形さＡ７’ｃＩＬ−２の
製造に対する正のレトロレギュレーション因子の効果を
評価するためにｐＨｃＷ８０１−　ｔ−造成した。プラ
スミドｐＨｃＷ７０１’ｉ■胛Ｉで消化し、そして前記
のようにしてフレノウＰｏ１Ｉ断片及びｄＮＴＰにより
末端を平滑末端化した。平滑床ＡＡ化ＢａｍＨＩ斯片全
Ａｖａｌにより消化した。得られる最大断片は２．７ｋ
ｂでラシ、そして１つの平滑ＢａｍＨ１末端及び１つの
Ａｖａｌ末端を有していた。この断片を０．８慢アがロ
ースグル電気泳動により精製した。このものは３′発現
増強配列を含有する。

プラスミドｐＬＷ４５　ｔ−８ｔｕ　Ｉ制限工／ドヌク
レアーゼにより、そして仄にＡｖａｌ制限工／ドヌクレ
アーゼにより消化した。約２．３ｋｂの断片を、アガロ
ースゲル電気泳動により消化物から精製し、ａ気醇出し
、そしてＴ４　リガーゼ及びＡＴＰ’ｉ用いて、プラス
ミドｐ　ＨＣＷ７０１由来のＢａｎ平滑末端とＡｖａｌ
末端とを有する断片（正のレトロレギュレーション因子
を含有する）に連結した。テトラサイクリン耐性形質転
漠体をプラスミドＤＮＡのミニーグレグ単離により分析
し、そして、変形されたＩＬ−２遺伝子及びレトロレギ
ュレーション因子の両者を含有する。ＥａｏＲＩ断片の
存在についてスクリーニングした。　Ｂｉｒｎｂａｍ　
及びＤｏｌｙ、　　前掲（１９７９）。

Ｇ、　　ｐＨｃＷ３０１　　　　’ １、ｆコモ−ター１５６： バクテリオフアーノ５Ｐ８２の２４０ｂｐＨｈａｌ制限
断片上に位置する、Ｂ、ズブチリス栄養細胞ＲＮＡポリ
メラーゼにより認識されるブロモ−ターは最近：　ＤＮ
Ａ制限断片プローブ分析及びＢ、ズブチリスＲＮＡポリ
メラーゼ結合及び開始アッセイにより発見された。Ｊｏ
ｎｅｓ　、　Ｂ、Ｂ、、Ｃｈａｎ、Ｈ，、Ｒｏｔｈｓｔ
ｅｉｎ。

Ｓｌ、Ｗｅ　１１　ｓ　、　Ｒ，Ｄ、　　及びＲｅｚｎ
ｉｋｏｆｆ　、ｗ、ｓ＊　、　７”　。

シーデインダス・オプ・デ・ナシ、ナル・アカデミ−・
オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・スティ
ソ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓａｌ、　（ＵＳＡ）　）　、工４，４９
１４−４９１８（１９７９）。２４０ｂｐＨｈａｌ断片
（囲２Ｉにより消化された５Ｐ８２からｒルミ気泳動に
より単離し、そして３００　ｍＭ　ＮａＣＡ　、　６０
　ｍＭ　ＳＯ２及び５０ｍＭ酢酸゛す）　ＩＪウムを含
有する緩衝液（ＰＨ１，６）中２２００／ｄの８１　　
ヌクレアーゼを用いて不対合ヌクレオチドを除去するこ
とにより末端を平滑化した。Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　
ｓ等、前掲、１４０貞。次に、この平滑末端断片を、ら
らかじめＨｉｎｃｆｆ　により消化されたＭ１３ｍｐ７
　ＲＦ　ＤＮＡ　（ペセスダリサーチラプスから得られ
る）の世、ｎａｌ［部位にクローン化した◎ＤＮＡ配列
分析は、ＲＢＣ配列が、ブロモ−ター配列を担持するシ
Ｉ制限断片の３′末端に位置することを示した。ＲＢＳ
配列を取り出すため、２４０　ｂｐ旦Ｍｌｌｒｒ片をＡ
ｌｕｌ制限エンドヌクレアーゼで消化した。１５０　ｂ
ｐ　Ｈｈａｌ−Δ堕Ｉ制限断片をアクリルアミドダル電
気泳動により単離した。

ブロモ−ターがこの１５０ｂｐ制限断片上に存在するこ
とがＤＮＡ配列分析により知られた６次にこの１５−Ｏ
ｂｐ制限断片を、あらかじめｆ（ｉｎａｎ制限工／ドヌ
クレアーゼで消化式れたＭ１３ｍｐ７　ＲＦ　ＤＮＡの
［１ｎａ　［部位にサブクローン化することによυＭ１
３ｍｐ７−　ｐ　１５６と称するファーゾを形成したａ
・２、　リゾシーム結合部位： 次の配列：　（１）　５’　−ＣＧＡＴＡＡＧＡＧＧＡ
ＧＧＴＡ　−３ζ及び（２）　５’−ＡＧＣＴＴＡＣＣ
ＴＣＣＴＣＴＴＡＴ　−３’　　を有する２つノ合成オ
リコ９ヌクレオチドを調製した。

５００　ｐ＋ｎｏｌｅずつの各オリゴヌクレオチドを混
合し、そしてポリヌクＶオキナーゼ及びＡＴＰによりリ
ン酸化した。次に、リン酸化されたオリゴ９ヌクレオチ
ドｔ−６８℃にて１時間、そして次に３７℃にて３時間
アニールした。次に、次の配列：５’　ＡＧＣＴＴＡＣ
ＣＴＣＣＴＣＴＡＡＴ−３’３’　ＡＴＧＧＡＧＧＡＧ
ＡＴＴＡＧＣ−５’を有するアニールしたオリゴマー’
ｋＰＵｃ８−４１　０Ｃ１ｍ　ｌ　−Ｈ１ｎｄｌ１１部
位に、Ｔ４りが−ゼを用いて、オリゴマーとベクターの
比が約１０：１の連結染沖下でクローン化した。ｐＵＣ
８は商業的に入手可能であＩ）（ペセスダリーナーチラ
ｙＮ：ｙ　ト！Ｊ−ズ、ガイデーペルグ、メリーランド
、米国）、これ’ｌのようにして変形してｐＵＣ８−４
１ｋ得た。ｐＵｃ８をＢａｍＨＩで消化し、そして末端
をフレノウＰｏ１ｌＵｒ片により平滑化した。再環化さ
れた、Ｂ　ａ　ｍＨｌが修復されたｐ［Ｊｃ８　ｉ含有
するＥ、コ！ｊ　ＪＭ１０３の白色コｏニーを選択した
。こｎらの形質転換体からのプラスミドＤＮＡをＰｓｔ
Ｉにより線状化し、そして末端をフレノウＰａ１ｌ＃ｒ
片によ′シ切シ取りた。この方法によりｌａｅ　Ｚにつ
いての正しいリーディングフレームが回復し、そして連
結の後ＪＭＩＯ３の青色形質転換体が選択された。Ｂａ
ｍＨ１部位のイφ復により、ＤＮＡメチラーせ欠損（Ｄ
ａｍ−）　Ｅ、コリ宿主から調製されたＤＮＡ中にＣ１
ａ　１部位が生ずるので、ｐＵＣ８−４１は、Ｃ１ａｌ
による線状化により確認された。制限酵素分析及びヌク
レオチド配列決定を用いて、ｐＵＣ８−４１−ＲＢＳＩ
と称する造成された組換プラスミドが合成り？シーム結
合部位の１つのコピーを確かに担持している仁とが決定
さルた。

３、　　ｐＬＰ１２０１−ｐ１５６−ＲＢＳＩの造成ｐ
Ｕ０８−４１−　ＲＢＳＩ　　中の合成リゲゾーム結合
部位を、このプラスミドのＥｃ　ｏＲＩ〜Ｈｉｎｄｆｆ
［２重消化によ）回収し、そしてアクリルアミドデル電
気泳動により単離した。ＥｃｏＲｌ−Ｈｉｎｄ［［断片
を、ＥｃｏＲｌ及び旦堕ｄｆｆ［制限シ′ドヌクレアー
ゼであらかじめ消化した！ラスミドｐＬＰ１２０１　　
にサブクローン化しｐＬＰ１２０１−　ＲＢＳＩ　？形
成した。０ａｔｒｏｆｆ　、Ｇ。

Ｒ，及ヒＰｅｎ５　、　Ｊ、　Ｍ、　ｓモレキュラー・
アンド・ゼネラ３１１１ゼネティクス（Ｍ６１ｔ　Ｇｅ
ｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　）　。

１旦３：３０６−３１１（１９８４）。Ｅ、コリＣ３４
１２株を常法によりブラスミドｐＬＰ１２０１　”ＲＢ
ＳＩで形質転換した。Ｃｏｈｅｎ等、前掲（１９７３）
。

プラスミドｐＬＰ１２０１−　ＲＢＳＩを担持す不Ｅ、
コリ形質転換本はテンピシリン耐性であ−９そしてテト
ラティクリン感受性でちった。

次に、ｆｃ２モーターｐ１５６　ｉＭ１３ｍｐ７−ｐ１
５６ＲＦ　ＤＮＡから堕旧　　制限工／ドヌクレアーゼ
を用いて切り出し、そして、ＥｃｏＲｌ　　制限工ンド
ヌクンアーゼによりあらかじめ消化されたｐＬＰ１２０
１−　ＲＢＳＩのｇｃｏＲ１部位にサグクローン化した
。望ましい組換プラスミドｐＬＰ１２０１−ｐ１５６−
　ＲＢＳＩ　は、このシラスミドにょシ形質転換された
Ｅ、コリ宿主にアンピシリン及びテトラサイクリン耐性
を付与する。

の造成 ｐａｃｗ３ｏｏ　ｅｐＬＷ２１及びｐＬＰ１２０１−Ｒ
ＢＣＩ−ｐ１５６から造成した。ｐＬＷ２１　ｒｔｐＢ
Ｒ３２２に由来し、そしてＩＬ−２をコードする領域を
含む５７０　ｂｐ旦ぜＲ１−シラ■配列を含有する。ｐ
ＬＷｌをＥｃｏＲＩ及びＢａｎ１ｌエンドヌクレアーゼ
で消化することにより得られた５、７０　ｂｐ　ｇａｏ
Ｒｌ　−ＢａｍＨ配列金ｐＢＲ３２２に連結するごとに
よりｐ　ＬＶ／２　！　ｉ：、＞？ｉ成した。

この旦ヨＲ１−Ｂａ五ｎ斯片がテトラティクリーンは性
遺転子の部分を含むｐＢ１３２２中の４８５　ｂｐ　Ｅ
ｃｏＲｌ。

−１１ａｎｌ＃ｆｒ片と置き換わることにより、テトラ
サイクリン感受性のｐ　ＬＷ２１が生ず／）　、ＰＬＷ
２１　’（ｆ（ｉ　ｎｄｌ［制限工／ドヌクレアーゼで
消化し、次にＮｒｕｌ制限エンドヌクレアーゼで消化し
た。２つの断片が生じ、そして約４０　（Ｊ　ｂｐの長
さのＨｌｎｄｉｎ−Ｎｒｕｌｌｊｒ片をアクリルアミド
デル電気泳動により単離した。プラスミドｐＬＰ１２０
１−　ＲＢＣＩ　−ｐ１５６をＨｌ　ｎｄ　ＩＩＩ　及
びＮｒｕｌ制限エ制限エンドアクンアーゼし、除去てれ
たナト２サイクリ遺転子遣云子を含有する領域ｔ−有す
る線状化されたグ２スミド金形成した。この線状化され
たプラスミドとｐ　ＬＷ２１からの４００　ｂｐ　Ｈｉ
ｎｄｌ−Ｎｒｕ　ｌ　断片と混合し、そしてＴ４１Ｊが
−ゼを用いて連結して、そして、ｐ１５６７”ａモー１
、前記ノＲＢＳ及びＩＬ−２ｔ−コードするＤＮＡ配列
を有する４　００　ｂｐ配列を有する４　００　ｂｐ配
列を有するｐＨＣＷ３００と称するプラスミド２生成せ
しめた。アンピシリン耐性形質転換体のレプリカプレー
トによりＥ、コリのテトラサイクリン感受性形質転換体
を得、そしてＨｌｎｄｌｌｉ及びＡｖａ　ｌ制限エンド
ヌクレアーゼを用いて約７ｋｂ及び０．８５ｋｂの２個
の断片を生成するプラスミドｐ　ＨＣＷ３００の存在に
つｂてスクリーニングした。

プラスミドｐＨｃＷ７０１　ＩｔｇｃｏＲｌ　制限エン
ドヌクレアーゼで消化し、そして末端をフレノウＰｏ１
ｌ断片及びｄＮＴＰで平滑化した。Ｈｉｎｄｌｌ　制限
エンドヌクレアーゼで消化した後、ＩＬ−２遺伝子及び
正のレトロレギュレーション因子を含有する約０．８５
ｋｂ′ｔｒ片をアブロースグル電気泳動により単離した
。プラスミドｐＬＰ１２０１−ＲＢＳＩ　−ｐ１５６　
　をＨｉｎｄｌｌ［及びＮｒｕ　ｌ制限エンドヌクレア
ーゼで消−−――――■■−噛−自一一一一一一一化し
て、ナト２サイクリン耐性遺伝子を含有する領域を切除
した。ＩＬ−２遺伝子及び正のレトロレギュレーション
因子を含有する０、８５　ｋｂ　　ＥａｏＲｌ（平滑）
　−Ｈｌｎｄｉｌ［断片を、連結条件下Ｔ４１Ｊが一ゼ
を用いて、Ｈｌｎｄｌｌ−Ｎｒｕ　ｌで消化されたｐＬ
Ｐ１２０１−ＲＢＳＩ　−ｐ１５６ベクターに連結した
。アンピシリン耐性形質転換体をレプリカグレートする
ことによりＥ、コリのテトラサイクリン感受性形質転換
体を得、そしてＩｃｏＲＩ　　制限エンドヌクレアーゼ
を用いてシラスミドｐＨｃＷ３０１についてスクリーニ
ングした。ｐＬＰ１２０１−ＲＢＳＩ断片、ＩＬ−２遺
伝子−正のレトロレギーレーシ、ン因子断片、及びプロ
モーター断片の予想されるサイズにそれぞれ対応する約
７　ｋｂ、　０．８８ｋｂ、及び１５６　ｂｐの３つの
断片が生じた。

アクセイ法 １、Ｅ、コリにおいて ５０μＩＩ／ＩＬｌのアンピシリンを含有する５ｄのＹ
ＴプロスＣＨＩ／Ｉトリプトン、５１／ｌ酵母エキス。

５１／ｌ　ＮａＣｔ）に、ｐｓＹｃ６６７又４ｄ　ｐＨ
（Ｗ−Ａ　３　　ｔ−担持するＥ、コリに−１２／Ｃ８
４１２の個々のコロニーを接種し、そしてニューブラノ
スウィックロータリーインキーペーター中で振とうしな
がら３７℃にて一夜増殖せしめた。次に、ペックマンモ
デルＪ−２ＩＣ遠心機のＪＡ−２０ローター中で５．０
００ｒｐｍにて１０分間、細胞をペレツト化した。細胞
ペレットを５−の氷冷した５０ｍＭ　リン酸緩衝液ｐＨ
７，０により洗浄した。洗浄された細胞ペレットｔ−０
，５ｍｊの５０ｍＭリンＵリン酸緩衝液ｍ濁し、そして
プランノン３５０ソニ７アーを用いて、最高出力にて３
分間Ｏｃにて０，５秒バーストで超音波処理した。超音
波処理物をエツインドルフミクロフユーノ中で２分間回
転せしめた。得られた上清を酵素活性の測定のために使
用した。

Ｂ、リケニホルミスのベニシリナーゼの産生ｗ。

５ｃｈｉｎｄｌ＠ｒ及び）Ｌｕ　ｂ　ｅ　ｒの方法によ
り色原体β−ラクタマーゼ基質ＰＡＤＡＣ（カル・ビオ
ケムから商業的に入手できる）を用いて測定した。５ｃ
ｈｉｎｄｌｅｒ。

Ｐ、及びｌ１ｕｂｅｒ　ｅ　Ｇ、　ｔ　″β　−ラクタ
マーゼ生産生物の検出及びβ−ラクタマーゼ阻害剤／不
活性化剤の測定のためのＰＡＤＡＣ、新規な色原体β−
２クタマーゼ基質、の使／ｌｆＩ′、エンデイム・イン
ヒビター２”　（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｎｈｉｂｔｔｏｒｓ
　）　、　Ｂｒｏｄｂｅｅｋ。

１９８０．１６９−１．７６頁。す／酸緩衝液（ｐＨ□
Ｕ、　ｆ！ＩＡ、ウアイノハイム：フェルラークケミー
。

７．０沖０Ｄｓｙｓ＝１（約２７．４μＭ）ｔ−有する
溶液を作ることによりＰＡＤＡＣｇｆｉ　（Ｍｖｖ５６
１７　）　ｔ−Ｍ　　　　　　′５製した。細胞抽出物
ｔ−添加した後、５７３ｎｒ＋ｄ（おける吸収の減少を
室温にてＣａｒｙ　２１９　　分光光度計を用いて測定
した。結果を第１表に示す。

２、Ｂ、ズブチリスにおいて Ｂ、ズブチリスを、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｌｕｓ　　
及び　　　　　　　　□５ｐｌｚｉｚｅｎ　、前掲（１
９６１）に関連する方法に従ってｐｓＹｃ６Ｇ７又はｐ
ＨｃＷ−Ａ３にヨシ形質＝ｉし、そして前記の富栄養培
地寒天上にグレートし、そして３７℃にて一夜増障せし
めた。５μｇ〜のクロラムフェニコールを含有する２ｘ
ＬＢ培地５Ｆｎｌに個々の形質転換体を接種し、そして
二＆−プランスクィックロータリーインキ、ベーター上
テ振とうしながら３７℃にて一夜増殖せしめた。次に、
上記のようにして、　ＪＡ−２０ローター中で１０分間
５０００　ｒｐｍにて細胞をペレット化した。この上清
液を用いて、Ｅ、コリについて上記したのと同じ方法に
より、ベニシリナーゼのｆｉｌ定を行った。結果ｔ−第
１表に示す。

以下余白 第１表 正のレトロレギュレーシ、／囚子を有するか又は有しな
いｐｅｎＰ組換シラスミドを担持するＥ。

コリ又はＢ、ズブチリス中でのベリシナ−ぜポリペプチ
ドの産生 Ｅ、コリＣ８４１２−Ｑ ＰＳＹＣ６６７１０５５ ｐＨｃＷ−Ａ３　　　２７６２ ｐ８Ｙｃ６６７　　　　３２８０ ｐＨｃＷ−Ａ３　　　１７５１０ （０２５℃において蛋白質Ｊｒ−ｇ当シ１分間当シ加水
分解されるＰＡｏＡＣのｎｍｏｌａ　　数トシて定義さ
れる比活性。

Ｂ、　　ＩＬ−２の発現の測定法 ｐＨｃＷ７０１％ｐＨｃｗ７０２、又はｐｉ、Ｗｌによ
り形質転換されたＥ、コリに１２／ＭＭ２９４の振とウ
テラスコ培養物ヲトリグトファン（ｔｒｐ　）含有Ｎ培
地（０，７％　Ｎ＆２ＰＯ４，０，３％に町ＰＯａ　−
０，５％　ＮａＣＺ　−０，１チ洲、ｃｔ　、　０．２
チグルコース、０．５チカデミノ酸＋　４０　μｉ／＋
ｎｌ　ｔｒｌｙ、及ヒ１０　ｆｉｇ／ＩＲＩ　７　ドア
　？イクリン）１０ｄ中で、二、−プランスウィックロ
ータリーインキュペーター中で振とうしながら３７℃に
て一夜増殖せしめた。５ゴの一夜培養物からの細胞１Ｊ
Ａ−２０ローター１中で１０分間５０００　ｒｐｍにて
遠心することによりペレット化した。この細胞ペレット
ヲ、２μＩ／Ｉｎ９のチアミンを含有しｔｒｐ　ｆｔ含
有しないＮ培地５ｄ中に懸濁した。分光光度計中での６
００　ｎｒｎにおける吸収（ＯＤ６゜。）により光学濃
度を決定した。ｔｒｐ　ｔ−含まないＮ培地中で０．０
５の０Ｄ６ｏｏ？ｉ−有するサブカルチーアー２５ゴを
調製し、そして３７℃にて振とうしながら約０．３の最
終０Ｄ６ｏｏまで増殖せしめた。

対照を調製し、そしてＮ培地がトリプトファン金欠くほ
か同じ条件下で増殖せしめた。次に細胞をペレット化し
、そしてＩＬ−２Ｍｉ音波処理鏝衝液（５０ｍＭＴｒｉ
ｓ　、ｐＨ７，５，５０ｍＭＥＤＴＡ、　１５％７、−
クロース、１４ＳＤＳ）中に再懸濁して最終０ｂ６０Ｇ
がｌＯとなるようにした。細胞を前記のようにして超音
波処理した。Ｇ１１ｌｉｓ　、　Ｓ、→、ツヤ−ナル・
オブ・イムノロノー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　。

１２０．２０２７−２０３２（１９７８）に記載されて
いる方法により上清液１ＩＮ−２活性の存在について測
定した。結果を第２表に示す。

２、　発酵培養 ｐＨｃＷ８０１又はｐＬＷ４５で形質転換されたＥ、コ
リに一１２／ＭＭ２９４−１　’ｔ”、１０１の発酵（
曹中で、３７Ｃ，３５０〜１２００ｒｐｒｎ、０〜２１
／ｍ（ｌｐｍ）の空気及びＯ〜５１ｐｍの酸素（溶存酸
素約４０チ）にて発酵させた。培地は７２ｍＭ（ＮＨａ
　）　２８０４−２１−６　ｒｎ＋Ｍ　ＫＨ２ｐｏ　４
　ｔ　１．５　ｍＭクエン酸ナトリウム＋　１．５　ｌ
ｌＮ９／１ＴＫ−９畝瀘元累、及び次の無直添加物：　
３　ｍＭ　Ｏ−，５％　ＭｇＳＯ４，２ｏ−＊／Ｊ　　
１％　ｆ　７　ミｙ−ＨＣ２−７２ｍＭ　Ｏ，２Ｍ　　
Ｆ’ｅＳＯ４−５１／１５０Ｌｓグルコース、　７０−
＋９／ｌ　０．５％Ｌ−）す７’）７アン、５ｍ９７ｇ
　　１％テトラサイクリン、及び１００ｍ１／１２０％
　カデミ／ｆｉ（０Ｄ６８．〜１５〜２０にオ＾て添加
）から成る。接種物は２０　’１９／ｌであシ、そして
ＰＨは５ＮＫＯＨによりロ、８に制御した。グルコース
濃度を５〜１０１１／ｌ　に維持するためにグルコース
のフィードを行った。

全細胞蛋白質のＳＤＳポリアクリルアミドｒル電気電気
用動用養サンプルを、１３．７〜１９．７時間の間で１
時間ごとに採取した。グルの蛋白質バンドのデンシトメ
ーター測定は、　　ＩＬ知の最大産生が１７．７時間目
において全細胞蛋白質の１７．１％であることを示した
。これらのサンプルからのＩＬ−２の生物学的活性を、
Ｅ、コリにおけるＩＬ−２発明についてすでに記載した
方法にょシ決定した。

結果を第２表に示す。

３、Ｂ、ズブチリスにおいて ５μＩ／ｆｌＬｌのクロラムフェニコールを含Ｖｆる２
ＸＬＢ　培地５−に単一コロニーを接種した後、ｐＨｃ
Ｗ３０１又はｐ　ＨＣＷ３００により上記のようにシテ
形質転換されたＢ、ズブチリスｌＡ３１０の培養物を、
３７℃にて振とうしなからＯＤ　６ｏｏ＝　１．０　　
まで増殖せしめた。細胞をペレット化し、ＩＬ−２逆音
波処理緩衝蚊に再懸濁し、超音波処理し、そしてＥ、コ
リについて記載したようにして、ＩＬ−２活性？測定し
た。結果を第２表に示す。

以下余白 ８２表 正のレトロレギュレー７Ｍノ因子の存在下又は非存在下
でのＩも−２及び変形されたＨ、−２の産生１、Ｅ、コ
リ（５ｍ培養） ｐＬＷｌ　　　　　　　　　　　（７ＸＩＯ３＋　　　
　　　２　　Ｘｌ０５ ｐＨｃＷ７０１　　　　　　　　　２．８　Ｘ　ｌ　Ｏ
＋　　　　　　　　　１．４Ｘ１０ ｐＨｃＷ７０２　　　　　　　　　、　１．５Ｘ１０５
＋　　　　　　９．２８１０ ２、Ｅ、コリ（１０１発酵槽） ｐＨｃＷ８０１　　　　　　　　　　１．６　　Ｘ　１
０３、Ｂ、ズブチリス（５ｍｌ培養）　　・形質転侯用
ノラスミド　　　　産生されたＩＬ−２の比活性（Ｕ／
１５０μｇ全細肥蛋白質） ｐＨｃＷ３００　　　　　　　　　　　　１　　Ｘ　１
０’ｐＨｃＷ３０１　　　　　　　　　’　　２．５　
Ｘ　１０’例４．正のレトロレギュレーション因子の欠
失地図上のレトロレギュレーション効果を担当するとエ
タニミネーター領域内のｍ１列を一層正確に定義するた
めに欠挺研艷誉行りた二Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ、及ｄＳｍ　
ｉ　ｔ　ｈ　Ｌ　Ｍ、’　ｅ　　”Ｍ１３斗クターにク
ローン化されたＤＮＡ断片のオリゴ９ヌクレオチド指令
変異誘発”。

メソズ・イン・工／チモロノー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
′の方法に従うオリコ９７″オキシリメヌクレオチド指
令部位特異的変異誘発を用いて、第１図においてそれぞ
れＢ１及びＢ２として示した。　　ｃｒｙターミネータ
−断片内の逆方向反復塩基配列からｓ　ｏ　ｂｐ及び２
０　ｂｐ上流の位置に別々に２個のＢｇｌｌ［制限部位
を導入した。これらの短縮されたターミネータ−含有断
片ｆ、Ｂｇｌ　■−ＥａｏＲ■消化により対応する変形
されたＭ１３ｍｐ９　ＮＰ３ファーノｒツムから切９出
すことができる。これらを、ｐＨｃＷ−Ａｙ）造成のた
めに用いたのと同様の方法によりｐｓＹｃ６６７にＢｃ
ｌ　ｌ　−Ｎｒｕ　１部位にクローン化し、そしてプラ
スミドｐＥｌｃＷ−Ａ４及びｐＨＣＷ−Ａ５　ｉ形成し
た。こＡらのプラスミドを有するＢ、ズブチリス及びＥ
、コリの、クローン化ｐｅｎＰ遺転子七元現せしめ６能
力についての分析のデータを第３表に示す。短縮された
断片がなお、もとの断片中に観察された正のレトロレギ
ュレーション因子を含有していることが明らかである。

２個の新たに形成されたＢｇｌ１１部位はｃｒｙコード
配列の外側にあるから′、このデーターは、増強された
活性を付与する座はｃｒｙ遺伝子の非コード領域に位置
すること、及びおそらくｃｒｙ遺伝子のターミネータ−
とオーバーラツプすることを示している。

Ｂ、ズブチリスＰＳＣＩ株及びＥ、コリＳＣ４１２味を
、シラスミドｐＨＣＷ−Ａ　３、ｐａｃｗ−Ａ４、又は
ｐａｃｙｉ−Ａｓにより上記のようにして形質転換した
。前記のようにして測定されたベニシリナーゼ活性を第
３表に示す°　　　　　　　　　　　　　　　以下余白
プラスミドｐＦＣ５４はバクテリオファーノλＰグロモ
ーター及び遺伝子Ｎ　１７♂シ一ム結合部位゛（ＰＬ　
ＮＲｕｓ　）の調節のもどにｄ’ｅｓ−Ａｌａｎｙｌ　
。

５ｅｒｉｎｅ、２５　インターロイキン−２をコーＰす
る。

Ｃｏ１Ｅ１シラスミドベクターは、温度感受性コピー数
現象をシラスミドに付与する２つの変異を含有する。こ
のプラスミドを有するＥ、コリ細胞は熱的に３導されて
全蛋白質の２０％を新規なＩＬ二二人ムティンして蓄、
債する。

シラスミドｐＦｃ５４ｉ　ｓｐｈ　Ｉで完全消化し、そ
して２５μＭ　ｄＧＴＰの存在下でＤＮＡ／リメラーせ
■（フレノウ断片）で処理することにより３′突出単鎖
テイルを除去する。次に、平滑末端ＤＮＡをＸｂａ　１
により消化する。

！ラスミドｐＨｃＷ８０　ｉｔ−ｇｃ　ｏ　Ｒｌ　によ
り完全消化し、ｄＮＴＰの存在下でＤＮＡ　ｄｅリメラ
ーゼＩ（フレノウ断片）で処理し、そして次にＸｂａｌ
で消化する゛。ｓｅ　ｔ　”５１Ｌ’−’２の６−末ｒ
Ｊ２２５ｂｐ、３６ｂｐの３’非ｆｉ訳ＩＬ−’！ｃＤ
ＮＡ　、及び正のレトロレギュレーション因子を担持讐
る３　９４　ｂｐの断片からなる６　５５　ｈｐ　Ｄ’
ＮＡ断片をｒルミ気泳動によりて精製する。ｐＦＣ５４
ベクターＤＮＡ断片及び精製されたｐ　Ｉ（ＣＷ８０１
断片ｋ、１　：　３（７）モル比テ、３０ｔｔｌＤＮＡ
膚のＤＮＡ濃度においてＴ４　ＤＮＡ　ＩＪ　ｉ−ゼを
用いて接着末端の連結に好都合な条件下で連結し、２．
５倍に稀釈し、そして次にＴ４　ＤＮＡ　Ｕが−ゼを用
いて分子内環形成に好都合な平滑末端条件下で連結する
。連結されたＤＮＡ　’ｉ−、シ、ｎ［で消化すること
により、ｐＦＣ５４の小及び犬Ｘｂａｌ−１辿Ｉ所片を
含んで成る不所望の連結生成物を不活性化薔る。

この連結されそして消化処理されたＤＮＡ６０ｎ、９を
用いてＥ、コリに１２抹ＤＧ９５（λＮ、Ｎ、ｃＩ８５
７ｓｕｓｆ’８０）をＡｍｐＲに形質転換する。この味
は、低温（３０℃〜３２℃）において活性な温度感受性
λｃ’Ｉレゾレッサーをコードするλプロファーノを含
有する。

しかしながら、高温（３６℃〜４２℃）においてはこの
レグレッサーが不活性でありＰＬプロモーターかゆの転
写が進行し得る。この株の他のコードして、上昇した温
度に２いてグロファーノは誘導しない。形質転侯体ｆ　
Ａｍｐ　Ｒについて選択し、そしてＭｌ　コロニーを所
望の５．６ｋｂ７’ラスミドについて選択した。峡補！
ラスミド１ｌ１８２ｂｐＥａｏＲＩ　断片の放出（正の
レトロレギュレーシ。

ン因子を担持する断片中の修復されたＥｃｏＲｌ　ｇ位
とベクター断片中の修復でれたｓｐｈ　１部位との連結
がＥａｏＲｌ　部位を再形成すると予想された）、ルー
２コード配列中のＸｂａｌ　部位の保持、１二−りＢａ
ｍＨｌ　部位の獲得（ターミネータ−断片中）、及びｐ
ＦＣ５４中のユニークＢａｎ　ｌ［部位の喪失について
スクリーニングした＠望ましい組戻プラスミドを単離し
、そしてｐＦ５４．　ｔ　と命名した。

後に示すように、プラスミドｐＦＣ５４，ｔを有するＥ
、コリに１２株ＤＧ９５（λＮ７Ｎ５３ｃＩ８５７ｓｕ
ｓＰ８０）が温度誘導される場合、全細砲蛋白質の３４
ｇ６がｄｅｓ−Ａｌａ＋ｘｙｌ　、　Ｓｅｒ　　　ＩＬ
−２である。

！ラスミドｐＦＣ５４，ｔは、ブタ（スト条約に基ぎＡ
ＴＣＣＮｏ　３９７８９　　として寄託されている。

プラスミドｐＦＣ５４，Ｌを第６図に示す。５．６１１
０で示すｇｃｏＲｌ　　制限エンドヌクレアーゼ部位か
ら出発しそして時計方向に移動しながら、！ラスミドｐ
ＦＣ５４，ｔは下記に示す成分を含んで成る＠座標Ｑ−
０，３５ｋｂはバクテリオファーゾλＰＬプロモーター
の温度制御ブロモ−ター／オペレーター及び隣接する遺
伝子Ｎ　１７　＆シーム結合部位を含んで成る。λ座標
３５７１５のＢｇｌｌ［認識部位ＣＳａｎｇｅｒ　ｊ　
ｒ、　等＃ツヤーナル・オツ・モレキュラー・バイオロ
ノ−（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）　、　１６２ニ
ア２９−７７３（１９８２））はＥｃｏＲＩ　認識部位
に転換てれており、そしてλ座標３５３６６のＨｌｎｆ
　Ｉ　　認識部位はプラスミドｐＦＣ５４，ｔＫ挿入す
るためにＨ１ｎｄｉｌｌ認識部位に転換されている。

座標０．３５−０．７９４ｋｂは成熟ヒトｄｏｓＡｌａ
ｎｙｌ　、　Ｓｅｒ１２’　ＩＬ−２ムテインをコード
するプラスミドｐＬＷ４６の４４４　ｂｐ堡ｄｌｌ−柑
１断片を含んで成る。ｆａｎｇ　ｌん等、サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ）。

２２４．１４３１−１４３３（１９８４）。

５′匹ｔｎｄ１１　　部位が変形ちれたムティンのＡＴ
Ｇ開始コドンにすぐ先行しく　Ｒｏａｅｎｂｅｒｇ　、
　３．Ａ、等１サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２３
．１４１２−１４１６（１９８４））そして５ｔｕｌ認
識部位（ヒトＩＬ−２中のｏｐａｌルミｌ終止コドン６
　ｂｐ遠位）はｐＦＣ５４、ｔにおいてはＢａｍＨＩ　
認識部位に転換されている。

座標０．７９４−１．１８８ｋｂは、プラスミドｐｆ（
ＣＷ８０謔らの３９４　ｂｐシ凹旧−とすＩ　ＤＮＡ断
片を含んで成り、そしてＢ、チュリンゾエンシスδエン
ドトキシン遺伝子からの正のレトロレギ。

レーション因子金含有する。

座標１．１８８−２．０５ｋｂは８６３　ｂｐの５ｐｈ
ｌ（修復）／Ａｖａｌ（修復）　ＰＢＲ３２２ＤＮＡ断
片（それぞｆｉｐＢＲ３２２座標５６７−１４２９）’
ｉ含んでなる。

座標２．０５−３．４８　ｋｂは、細菌トランスポゾン
Ｔｎ３のβ−ラクタマーゼ遺伝、子をコードする、プラ
スミドｐＯＰ６　（Ｇｅ１ｆａｎｄ　、　Ｄ、　Ｈ，等
、プロシーディ／ゲス・オツ・デｅナショナル・アカデ
ミ−・オツ・サイエフシス・オプ・デ・ユナイテッド・
スデイツーオプ・アメリカ（Ｐｒｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　）　、ヱ互、５８６９−５８７３．
１９７８；Ｍｕｅｓｉｎｇ　、　Ｍ、等、セル（Ｃｅ１
ｌ　）　ｅ　２４−２３５−２４２．１９８１）からの
１．４３　ｋｂ坦ｎ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を含んで成
る。Ｈ＠ｆｆｒｏｎ　、　Ｆ、等、セル（旦り上）、１
８：　１１５３−１１６３　（１９７９）。

座標３．４８−３．９５　ｋｂはｐＯＰ６　（Ｇｅ１ｆ
ａｎｄ　、前掲、１９７８）の０．４７　ｋｂ　Ｓａｔ
　Ｉ−Ｐｖｕｎ　ＤＮＡ断片を含んで成る。このＤＮＡ
断片は細菌トランスポゾンＴｎ３の左境界（座標１−２
７０　、）（ｅｆｆｒｏｍ。

Ｆｌ等、前掲、１９７９）及び隣Ｑ　Ｃｏ　Ｉ　ＥＩ　
Ｈａ＠■Ｃ断片の部分を含有する◎ 座標３．９５−５．６１　ｋｂはプラスミドｐ　ＥＩＷ
２７（Ｗｏｎｇ　、　Ｅ、　Ｍ、等、ｆロシーデインダ
ス・オプ・デ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエ
フシス・オツ・デ・ユナイテッド・スティソ・オブ・ア
メリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓａ　
１．　ＵＳＡ　）　ｓ７９：３５７０−３５７４（１９
８２））からの１．６６ｋｂヱｖｕｌ［−担ＲＩ　ＤＮ
Ａ断片を含んで成る。この断片はプラスミドＣｏ１Ｅ１
のコリシンＥ１免疫領域及びゾライマーグロモーター領
域、ＲＮＡ１領域、及び複製開始点ヲコードする。ｐＢ
ＧＰ１２０　（Ｐｏ１ｉａｋ）ｒ　。

Ｂｏ等、グロシーデインダス・オブーデ・ナシュナル・
アカデミ−・オツ・サイエンシス・オグ・デ・ユナイテ
ッド・スティソ・オブアメリカ（Ｐｒｅ。

ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓａｉ、ＵＳＡ）　、７３：３９
００−３９０４（１９７６）及びＧｅ１ｆａｎｄ　、　
Ｄ、　Ｈ，等、前掲。

１９７８］の野性型Ｃｏｌ　ＥＩ　ＤＮＡ配列が２ケ所
（ｆライマーＲＮＡ伝写物のヌクレオチド１２５及び１
３５に対応するＤＮＡ鎖中のＧ−＋Ａ　）ランノション
）で変えられており、プラスミドｐＦＣ５４，ｔに温度
感受性Ｃｏｐ−表現狐を付与する。

Ｂ、形質転換でれた株により産生されたＩＬ−２ムテイ
ン 上記の方法を用いてｐＦＣ５４又はｐＦＣ５４，ｔによ
り形質転換石れたＥ、コリに１２株ＤＧ９５（射、Ｎ、
０Ｉ８５７ａｕａＰ８０）ｔｌＯＪ発酵槽中で、上記と
同じ条件下で、１８．５時間、０Ｄ６８ｏがそれぞれ２
８．７又は２８．１になるまで増殖せしめた。１８．５
時間口に測定した後、形質転換された微生（リフを含有
する培地の温度全４２℃に上昇せしめてＴ；Ａ反感受性
コピー数プラスミド及び！ロモーターを誘導した。誘導
後４時間にわたり、０．５時間又は１時間の間隔でテン
プルを採取した。各サンダル倉遠心分離によりペレット
化し、そしてリン酸緩衝化塩（ＰＢＳ　）中に１０ダ乾
燥重址／Ｍの濃度に再懸濁した。次に、各テンプルを１
％ドデシル４ａ酸ナトリウム／ＰＢＳ　中に１０倍稀釈
し、ヒートシステムスモデルＷ−３７５ソ二ケーター中
で細胞を完全に破砕するのに十分な時間超音波処理し、
そして測定した。

ＩＬ−２ムテインのユニット／ｍｊｊｊ−前記のように
して決定した。蛋白質４旬をＬｏｖｒ７法により決定し
た。ユニツ）　ＩＬ−２ムテイン／ＩＱ蛋白質を決定し
た。第４表にこれを示す。

ＩＬ−２の産生ｔ、各？／グルについて産生された全細
胞蛋白質の係として、　ＳＤＳアクリルアミドｒル電気
泳動により決定した。Ｌｏｖｒｙアッセイ−により決定
されたのと同じ量の蛋白質６ｒルに負荷した◎バンドを
クマーシープルー染剤により染色し、そしてヒラレット
パラカード３３９０Ａ　　インチグレーターを付加した
ツァイネースキ、ン二ングデンシトメーターを用いて読
み取った。ＩＬ−２ムテインのチを積分プログラムによ
り決定した。

全細胞蛋白質に対するチとしてＩＬ−２ムテイン生産金
下の第５表に示す。ＩＬ−２の増加慢は、正のレトロレ
ギ、レーショノ因子を担持する株により産生されるＩＬ
−２ムテインの正味増加を決定し、そしてその増加を、
正のレトロレギュレーシ、／因子を有しない株により産
生されたＩＬ−２ムテインに対するチとして示すことに
より見出された。

ｐＦＣ５４，ｔにより形質転換されたＥ、コリ株Ｋ１２
ＤＧ９５（λＮｖＮ５ｓ　ｃ　Ｉ　８５７　ｓ　ｕ　ｓ
　Ｐ　８０　）ｅ前記と同じ条件下で増殖せしめた。但
し、培養物を、先行する例におけるように０Ｄ６８゜＝
２８．１　　においてではなく１４．０において温度誘
導した。全細胞蛋白質に対するチとしてのＩＬ−２ムテ
イ／の生産が、全細胞蛋白質の３４％であると決定さｎ
た。正のレトロレギーレーシ、／因子を担持するプラス
ミドで形質転換式れ几倣生物によるＩＬ−２の増加した
産生は、高い細胞濃度０Ｄ６８Ｇ　（２ｓ、　１　）よ
υも低い細胞濃度０ＤＡ１５０　（１４）において温度
ｇ４した場合に最もよく達成された。

第　４　表 ユニットＩＬ−２／ｎ９蛋白質 ０　　　　７１５Ｘ１０　　８．６０Ｘ１０　　１０．
３１　　　　１．４４Ｘ１０　　１．６２Ｘ１０　　１
２１．５　　　１．９９Ｘ１０５　２．２６Ｘ１０　　
１３．５２　　　　２．５４Ｘ１０　　２．６８Ｘ１０
５　５．５３　　　　２．２３Ｘ１０　　３．０２Ｘ１
０　　２６．１４　　　　２．８５Ｘ１０　　２．５２
Ｘ１０５　−以下余白 第５表 ０　　　　　　　　　３．３　　　　　　２．６　　　
　−０．５　　　　　　　１２．３　　　　　１２．７
　　　　２１　　　　　−　　　１４．７　　　　　１
７．９　　　２１２　　　　　　　　２４．３　　　　
　２１．５　　　　−３　　　　　　　　２１．６　　
　　　２０．６　　　　−４２“３．８　　　　２２．
４　　　−正のレトロレギュレーション因子に連結され
た選択されたＤＮＡ配列の発現の増強が該選択されたＤ
ＮＡ配列によりコードされたｍＲＮＡ転写物の増加した
安定性及び延長さｎた半減期の結果であるか否かを決定
するため、Ｅ、コリ及びＢ、ズブチリスの両者において
プラスミドｐＨＣＷ−Ａ３　　及びその親プラスミドｐ
ＳＹＣ６６７により産生されたｐ＊ｎＰ転写物の崩壊速
度全測定した。Ｅ、コリ株Ｃ８４１２及びＢ、ズブチリ
ス沫ｌＡ３１０はそれぞれシラスミドｐＦＩｃＷ−Ａ３
　　又はその親プラスミドｐｓｓＹｃＧ６７を含有する
。これらをＬ−培地中３７０にて振とうしながら増殖せ
しめた。培養物が対象増殖甲期（Ａ６ｏｑ　＝　０．７
　）に達したとき、ｌ・〃蕾のリファンピシンを加えて
七はポリメラーゼによるその後の転写の開始をブロック
した。次に、７Ｍのす／グルを１分間の間隔で培養物か
ら採取し、そしてこのサンプルを収容したチューブを氷
水上で急速に冷却した。細胞を遠心分離により集め、ぞ
して１ｍＭＥＤＴＡ及び１０　Ｓ　（ｗ／ｖ）ＳＤＳを
含有する酢酸カリウム緩衝液（ｐ）１５．５　）　５０
０μσ中に再懸濁した。Ｑａｂａｉｎ等、プロシーディ
／ゲス・オブ・デ・す／ヨナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシス・オプ・デ・ユナイテッド・スティソ・オプ
・アメリカ（Ｐｒｅ、　Ｎａｋ、　Ａａ＆ｄ、　５ｃＬ
ＪＳＡ）、８０：６５３−６５７（１９８３）に記滅さ
れている方法に従ってＥ、コリから全細胞ＲＮＡ　ｉ抽
出し、そして精製した。□ Ｂ、ズブチリスからのＲＮＡ調製物は次のようにして抽
出した。凍結した細胞ペレッ）　（ＩＮ　）ｔ−１０，
０５〃旬のベントナイトを含有する０、０５Ｍ酢酸カリ
ウム（ｐＨ５，０）４ｄ中に懸濁し、そして２−の！ｆ
ｒたに蒸留したフェノール（同じ酢酸カリウム緩衝液で
飽和したもの）を加えた。この懸濁液を、ミクロチップ
を備えたプランソンソニフィア−（ヒートシステムスー
ウルトラソニ／ス社。

プレインビー−９口／グアイラント、ニューヨーク）を
用いて３分間超音波処理し、そして６０℃にて１０分間
抽出し、そしてエタノールで一夜沈澱せしめた。沈澱し
た物質？遠心分離により集め、−２０℃のエタノールで
洗浄し、そして４Ｍの０、１０４　Ｍ　Ｔｒｌｓ　、ｐ
［（７，０，０，０１Ｍ　ＭｇＣ２２に溶解した。ＤＮ
Ａアーゼ（３０μの准１　ウオー７７トン。

ＲＮＡアーゼ不含）を加えた。この調製物を、３７℃に
て４時間、４００容量の０．０４　Ｍ　Ｔｒｉａ　、　
ｐＨ７、０ＩＯ，ＯＩ　Ｍ　ｍｇｃｚ２　に対して透析
した。次にＲＮＡをフェノールにより２回室温にて４分
間抽出し、エタノールによりー夜沈澱せしめ、エタノー
ルで洗浄し、そして水に溶解した。

ネ青製されたｍＲＮＡ　ｆ　８２　ｒｒｘのニトロセル
ロースフィルター（銘柄ＢＡ８５＊シュライケル・アン
ド・シュニル社）上に固定化した。メンズ・イン・エン
チモロノ−（Ｍ＠ｔｈｏｄａ　ｉｎ　Ｉｉ：ｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ　）　。

６８．３８９（１９７９）にｄ己載されているようにし
てＷｏ　ｏ等の方法を用いて、前記フィルターの前ハイ
ブリダイゼーションを行った。

次に、処理されたフィルター６、ｘ□ｍのノ・イブリダ
イゼー７ヨン緩衝液（５Ｘデンノ・−ト溶液。

５０　ｍＭりンｇす１リウム、ＰＨ７，０，１００μｇ
ＡＬｌの剪埠ｒ　Ｇ　ｎｆｃ単鎖Ｅ、コリＤＮＡ　、　
１　％　ＳＤＳ　）中６８℃にて一夜、ｐｅｎＰ−特異
的グローブ（２０μｍ／フィルター）とハイブリダイズ
せしめた。

このハイブリダイゼーションに使用したグローブに、プ
ラスミドｐＳＹＣ７９５ｆ　Ｃ１ａ　ｌにより完全消化
し、そして末端ｆ！：ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼ
大断片により修復して線状化プラスミドを形成すること
によって作った。プラスミドｐｓＹｃ７９５ｒｒ。

プラスミドｐｓＹｃ４２３　　の誘導体であり、こｎは
Ｈｙａｓｈｉ等、ツヤ−ナル・オプ・ノ々イオロノカル
・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）　＊　２５９　：１０４４８−１０４５４（１９８
４）に記載されてオリ、ｐｅｎＰ遺伝子のコード領域の
ヌクレオチド８０にＧ−＋Ｃ変異を金屑する。次に、線
状化されたシラスミド１ＥｃｏＲＩによりさらに消化し
た。プラスミド消化物を５％ポリアクリルアミドｒル上
で泳動せしめ、そしてｐｅｎＰ遺伝子の５′部分を含む
７２７　ｂｐ旦廿−Ｒ１−Ｃ１ａｌ断片を回収した。こ
の断片をＭｌ　３ｍｐ　１１のＳｍａ　ｌ−ジ」Ｒ■部
位にサグクローニングした。これらのｍ換ファーノから
の単鎖ＤＮＡｉＭｉｇｓｉｎｇ　＊メソズ・イン・エン
チモロノ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ　）　Ｍｏｌ　１０１　：　２０−７８（１９８
３）の方法に従って単離し、そして環状ＤＮＡ　ｆ、Ｄ
ＮＡアーゼｌ（０，０５μｇ／μ、９ＤＮＡ）により３
７℃にて２０分間消化した。単鎖ＤＮＡ断片をフェノー
ル／エーテル抽出し、エタノール沈澱せしめ、５０　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　　、菱両液（ｕ（８）に再懸濁し、細菌
アルカリ・比ホスファターゼにより脱りン藏化し、そし
て〔γ　Ｐ）−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼに
よりラペルして比活性３ＸＩＯ６Ｏｐｍ／μ：ＪＤＮＡ
　　とした。ハイブリダイゼーションノ仮、２ｘＳＳＣ
，１，０％ＳＤＳ　　ｔ−含有するｌ　Ｘ　ＳＳＣによ
りそれぞれ６８℃にて１５分間ずつ、次々と洗浄し、ホ
ットラングの下で乾に■し、そして液［ドシ／チレーシ
ョン液中で計数した。ハイブリダイゼーションｎ液中に
過剰のＤＮＡグローブが存在することｔ医証するため、
異る量の固定化ｍＲＮＡサングルを含有する複数のフィ
ルター金調製した。

こルらのハイブリダイゼーション実験の結果を第７Ａ図
及び第７Ｂ図に要約する。Ｅ、コリ又はＢ、ズブチリス
中でプラスミドｐＳＹＣ６６７から産生されたｐｅｎＰ
　ｍＲＮＡの半減期は約２分であり、ｐ　ＨＣＷ−Ａ３
からのそれは約６分であると算定された。この分析はさ
らに、！ラスミドルｌ（ＣＷ−Ａ３を担持する細胞は、
プラスミドｐＳＹＣ６６７を有する細胞に比べてｐｅｎ
Ｐ　＋ｎＲＮＡの高い定常状態レベルを有することを示
した。この結果は、正のレトロレギュレーシ、、／因子
が同時に転写された遺伝子を安定化する場合に予想され
るものである。ｍ１ＩＡのレベルの上昇が、前記の例３
に示ぢれるようにこｎらの細菌宿主の両者におけるペニ
シリナーゼ酵素の増加の程度と一致するから、正のレト
ロレギュレー７目〕因子はｍＲＮＡの安定性に対するそ
の影響を通して遺伝子発現を増強する。

次の第６我に挙げる菌株の寄託物が、この出題の出願人
であるシタス・コーポレーシ、ン、エメリービル、カリ
ホルニア、米国、のマスター・カルチュアー・コレクシ
ョンに医存されており番号が付嘔ルている。これらの菌
株はま几シタス・コーポレーションにより、アメリカン
・タイグ・カルチーアー・コレクション（ＡＴＣＣ）、
ロックビル。

メリーランド、米国に寄託てれ、表に示す番号が与えら
れている。ＡＴＣＣへの寄託は、特許手続上の微生物の
寄託の国際的承認に関するブタベスト条約及びその規則
のに基いてなでれており、そして該条約及びその規則に
従って公衆に対して手入９”Ｂ　Ｋ　８　ｎ、　６　ｆ
　’；ｂ　６５−　　　　　　　　１ユ、余白第６表 Ｅ、コリに一１２／ｊ：５４１２　　　　＝−ｐ８Ｙ０
６６７　　　　３９７５８Ｂ、チーリンジ′エンシスｆ
（Ｄ−１”　　　１６１５Ｅ、コリに一４２／ＭＭ２９
４　　　　　　ｐＨＣＶ／７０１　　　　　３９７５７
Ｅ、コリＤＧ９５（λ）　　　　　　　　ｐＦｃ５４．
Ｌ　　　　　　３９７８９Ｅ、コリＭＭ２９４　　　　
　　　　　　　ｐＬＷｌ　　　　　　　　　３９４０５
Ｅ、コリＭＭ２９４−１　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　３９６２　にの明細書において記載し又
は例示したよう（′こ、この発明の（東々の変法が当業
者にとって明らかでろろう。このよう、な変法はすべて
この発明の範囲に属する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｂ．チュリンジェンシスからのクローン化ｃ
ｒｙ遺転子を担持する組換プラスミドｐＥｓ１の制限地
区の概略と示す。ｃｒｙ逍云子の転写は第４０目のＥｃ
ｏＲ１部位の３５０　ｂｐ上流の部位から始まり第３番
目のＰｖｕｌの約３６０　ｂｐ　Ｔ流で終る。 第１図にはさらにＯＦ２の転写ターミネ〒ターを担持す
るＰｖｕ　ｌ　−Ｎｄａ　Ｉ制限断片のヌクレオチド配
列も示されている。Ｎｄａ１部位の約４０　ｂｐ上流に
逆方向反復塩基配列が存在する。この領域から作らｎ　
ｆｃ　ｍＲＮＡ転写物はステムアンドルーゾ構造を形成
することが潜在的に可能である。 Ｎ２図は、第１図に示した逆方向反復塩基配列によりコ
ードさｎた就法の予想ぢれるステムアンドルーグ構造を
示す。このステムアンドルーグ構造は比較的Ｇ／Ｃに富
み、約４４チのＧ／Ｃを含有し、そしてＴｉｎｏｃｏ等
、前掲、のルールにより計算し７’Ｃ場合約−３０．４
ｋｃａｌの予想ΔＧ０を有する。 第３図は、プラスミドｐｓＹｃ６６７の概略図である。 第４図は、グｙｘミドｐＨＹｃ７０及びｐＨｃＷ７０　
ノ概略図である。 第５図は、ゲラスミｌ’　ｐｆ（ＣＷ３００及びｐＨｃ
Ｗ３０１、並びにこれらのプラスミドの造成に使用でれ
たプラスミドの概略図である。 第６図は、プラスミドｐＦＣ５４，１の概略図である。 図面に示されたｆ−）スミドの大きさは同一の比率では
ない。エンドヌクレアーゼ部位の相対位置及びプラスミ
ドの該当コード領域が示されている。 第７Ａ図及び第７Ｂ図は、プラスミドｐＳＹＣ６６７及
びｐＨＣＷ−Ａ３　ｆ有するＥ、コリ及びＢ、ズブチリ
スにより腫生されるｐｅｎＰ　ｍＲＮＡの崩壊のグラフ
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、選択された遺伝子産物の発現を増強する方法であっ
   て、 ａ）正のレトロレギュレーション因子を用意し、 ｂ）選択された遺伝子産物を発現することができるＤＮ
   Ａ配列を用意し、 ｃ）前記正のレトロレギュレーション因子を前記ＤＮＡ
   配列に、前記選択された遺伝子産物の発現が増強される
   ような関係に連結し、そして ｄ）前記選択された遺伝子産物を細胞中で発現せしめる
   、 ことを含んで成る方法。 ２、前記選択されたＤＮＡ配列が非−異種性ＤＮＡであ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記選択されたＤＮＡ配列が異種性ＤＮＡである特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、前記異種性ＤＮＡが原核生物遺伝子産物をコードす
   る特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、前記原核生物遺伝子産物がペニシリナーゼである特
   許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、前記異種性ＤＮＡが真核生物遺伝子産物をコードす
   る特許請求の範囲第３項記載の方法。 ７、前記異種性ＤＮＡがＩＬ−２である哺乳類動物遺伝
   子産物をコードする特許請求の範囲第３項記載の方法。 ８、前記正のレトロレギュレーション因子が選択された
   遺伝子産物を発現することができる前記ＤＮＡ配列の下
   流に連結される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、翻訳終止シグナルが前記正のレトロレギュレーショ
   ン因子と前記選択された遺伝子産物をコードする前記Ｄ
   ＮＡ配列との間に存在する特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 １０、前記正のレトロレギュレーション因子がＢ．チュ
   リンジェンシス結晶性蛋白質の３′フランキング配列の
   一部分を含んで成り、該フランキング配列が逆方向反復
   塩基配列を含有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、前記正のレトロレギュレーション因子が次のＤＮ
   Ａ配列ＡＧＡＴＣＴＡＡＧＴＡＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡ
   ＴＧＡ￥ＡＡＡＡＣＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣ￥ＡＴ
   ＴＧＡＡＡＣ￥ＧＧＡＧＴＧＡＴＧＴＣＣＧＴＴＴＴ￥
   ＡＣＴＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＡＴＡＣＡＴ
   ＡＴＧＴＡＴＡＧＡＧＡの一部分を含んで成る特許請求
   の範囲第１０項記載の方法。 １２、前記逆方向反復塩基配列が次の配列５′−￥ＡＡ
   ＡＡＣＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣ￥ＡＴＴＧＡＡＡＣ
   ￥ＧＧＡＧＴＧＡＴＧＴＣＣＧＴＴＴＴ￥−３′を有す
   る特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １３、選択された遺伝子産物を発現することができるＤ
   ＮＡ配列の下流に連結された場合に該選択された遺伝子
   産物の発現を増強する正のレトロレギュレーション因子
   。 １４、選択された遺伝子産物を発現することができるＤ
   ＮＡ配列の３′末端に連結された場合に該選択された遺
   伝子産物の発現を増強する特許請求の範囲第１３項記載
   の正のレトロレギュレーション因子。 １５、Ｂ．チュリンジェンシス結晶性蛋白質遺伝子の３
   ′−フランキング配列の部分を含んで成り、該フランキ
   ング配列が逆方向反復塩基配列を含有する特許請求の範
   囲第１３項記載の正のレトロレギュレーション因子。 １６、次のＤＮＡ配列ＡＧＡＴＣＴＡＡＧＴＡＡＴＴＴ
   ＧＴＴＧＴＡＡＴＧＡ￥ＡＡＡＡＣＧＧＡＣＡＴＣＡＣ
   ＣＴＣＣ￥ＡＴＴＧＡＡＡＣ￥ＧＧＡＧＴＧＡＴＧＴＣ
   ＣＧＴＴＴＴ￥ＡＣＴＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＧＴ
   ＡＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＧＡＧＡの部分を含んで
   成る特許請求の範囲第１３項記載の正のレトロレギュレ
   ーション因子。 １７、前記逆方向反復塩基配列が次の配列５′−￥ＡＡ
   ＡＡＣＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣ￥ＡＴＴＧＡＡＡＣ
   ￥ＧＧＡＧＴＧＡＴＧＴＣＣＧＴＴＴＴ￥−３′を含ん
   で成る特許請求の範囲第１５項記載の正のレトロレギュ
   レーション因子。 １８、前記逆方向反復塩基配列のＲＮＡ転写物がステム
   ・アンド・ループ構造を形成することができる特許請求
   の範囲第１５項記載の正のレトロレギュレーション因子
   。 １９、ＲＮＡ転写物に対応し、該ＲＮＡ転写物がステム
   ・アンド・ループ構造を形成し、該ステム・アンド・ル
   ープ構造が約−３０．４Ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧ°を有
   する特許請求の範囲第１３項記載のレトロレギュレーシ
   ョン因子。 ２０、前記ステム・アンド・ループ構造が４０〜４５％
   のグアノシン及びシトシンを含んで成る特許請求の範囲
   第１９項記載の正のレトロレギュレーション因子。 ２１、前記ステム・アンド・ループ構造が約４３％のグ
   アノシン及びシトシンを含んで成る特許請求の範囲第１
   ９項記載の正のレトロレギュレーション因子。 ２２、選択された遺伝子産物を発現することができるＤ
   ＮＡ配列、及び該選択された遺伝子産物の発現が増強さ
   れるような関係に該ＤＮＡ配列に連結された正のレトロ
   レギュレーション因子を含んで成るプラスミド。 ２３、前記正のレトロレギュレーション因子が選択され
   た遺伝子産物を発現することができる前記ＤＮＡ配列の
   下流に連結されている特許請求の範囲第２２項記載のプ
   ラスミド。 ２４、正のレトロレギュレーション因子が選択された遺
   伝子産物を発現することができる前記ＤＮＡ配列の下流
   に連結されており、そして翻訳終止シグナルが該正のレ
   トロレギュレーション因子と前記選択された遺伝子産物
   を発現することができる前記ＤＮＡ配列との間に位置す
   る特許請求の範囲第２２項記載のプラスミド。 ２５、正のレトロレギュレーション因子がＢ．チュリン
   ジェンシス結晶性蛋白質遺伝子の３′−フランキング配
   列の部分を含んでなり、そして該フランキング配列が逆
   方向反復塩基配列を含有する特許請求の範囲第２３項記
   載のプラスミド。 ２６、前記逆方向反復塩基配列が次の配列５′−￥ＡＡ
   ＡＡＣＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣ￥ＡＴＴＧＡＡＡＣ
   ￥ＧＧＡＧＴＧＡＴＧＴＣＣＧＴＴＴＴ￥−３′を有す
   る特許請求の範囲第２５項記載のプラスミド。 ２７、選択された遺伝子産物を発現することができるＤ
   ＮＡ配列及び該選択された遺伝子産物の発現が増強され
   る様な関係に該ＤＮＡ配列に連結された正のレトロレギ
   ュレーション因子を含んで成るプラスミドにより形質転
   換された細胞。 ２８、前記細胞が真核生物細胞である特許請求の範囲第
   ２７項記載の細胞。 ２９、前記細胞が原核生物細胞である特許請求の範囲第
   ２７項記載の細胞。 ３０、前記細胞がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞であ
   る特許請求の範囲第２９項記載の細胞。 ３１、前記細胞がＢ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｉｌｉｓ
   ）の細胞である特許請求の範囲第２９項記載の細胞。 ３２、ＲＮＡ配列の半減期を延長する方法であって、 （ａ）３′−末端に正のレトロレギュレーション因子を
   有する選択されたＤＮＡ配列を用意し； （ｂ）前記選択されたＤＮＡ配列を該ＤＮＡ配列がコー
   ドするＲＮＡに転写するための手段を用意し；そして、 （ｃ）前記選択されたＤＮＡ配列を前記正のレトロレギ
   ュレーション因子と共に転写する； ことを含んで成る方法。 ３３、選択されたＤＮＡ配列を転写する前記手段が宿主
   細胞である特許請求の範囲第３２項記載の方法。 ３４、前記正のレトロレギュレーション配列が前記宿主
   細胞に対して異種性である特許請求の範囲第３３項記載
   の方法。 ３５、同時転写された正のレトロレギュレーション因子
   により与えられた延長された半減期を有するＲＮＡ配列
   。