JPS6283891A - ハイブリッドｄｎａ配列の製造方法及び該方法に使用するベクター - Google Patents
ハイブリッドｄｎａ配列の製造方法及び該方法に使用するベクターInfo
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- JPS6283891A JPS6283891A JP61157163A JP15716386A JPS6283891A JP S6283891 A JPS6283891 A JP S6283891A JP 61157163 A JP61157163 A JP 61157163A JP 15716386 A JP15716386 A JP 15716386A JP S6283891 A JPS6283891 A JP S6283891A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はハイブリッドポリペプチドとその合成プロセス
について示したものである。特に、本発明は、新しいポ
リペプチド配列と新しい物理的性質を有するハイブリッ
ドポリペプチドを発現することができるハイブリッドＤ
ＮＡ配列を製造する方法を提供する。
について示したものである。特に、本発明は、新しいポ
リペプチド配列と新しい物理的性質を有するハイブリッ
ドポリペプチドを発現することができるハイブリッドＤ
ＮＡ配列を製造する方法を提供する。
組み換えＤＮＡ技術の分野における進歩は種々の天然Ｄ
ＮＡ配列のクローニングとその基礎となる組み換えＤＮ
Ａの発現によって生物学的に活性のある組み換えポリペ
プチドを生成させてきている。例えば、ヒトの成長ホル
モンは大腸菌（Ｅ。
ＮＡ配列のクローニングとその基礎となる組み換えＤＮ
Ａの発現によって生物学的に活性のある組み換えポリペ
プチドを生成させてきている。例えば、ヒトの成長ホル
モンは大腸菌（Ｅ。
ｃｏｌｉ）中で、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のプロモータ
ーに、このタンパク質のコード配列を融合することによ
り生成されている（１）。第２の例としては、組織プラ
スミノーゲン活性因子、その他の微量ヒトタンパク質も
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で作られている（２）。
ーに、このタンパク質のコード配列を融合することによ
り生成されている（１）。第２の例としては、組織プラ
スミノーゲン活性因子、その他の微量ヒトタンパク質も
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で作られている（２）。
ある組み換えポリペプチドの修正は、その修正ポリペプ
チドの性質を研究する目的で作られている。このため、
天然ＤＮＡ配列がクローニングされ、例えば米国特許ｍ
４，５１８，５８４に公開されているような部位特異的
突然変異によって、天然のポリペプチドのアミノ酸残基
の欠失、置換を起こすべく修正されて、天然の組み換え
ポリペプチドの物理的性質を変化させている。
チドの性質を研究する目的で作られている。このため、
天然ＤＮＡ配列がクローニングされ、例えば米国特許ｍ
４，５１８，５８４に公開されているような部位特異的
突然変異によって、天然のポリペプチドのアミノ酸残基
の欠失、置換を起こすべく修正されて、天然の組み換え
ポリペプチドの物理的性質を変化させている。
また、組み換えポリペプチドは組み換えＤＮＡ配列を融
合させることにより修正されている。例えば、プラスミ
ド誘導のベータ・ラクタマーゼのシグナル配列は、プロ
インシュリンの分泌をうながすために、共通の制限部位
を通じて、プロインシュリンのアミノ末端に付けられた
。（３）ワイズマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ）により述べら
れているように、２つの異なるヒトのアルファ・インタ
ーフェロンＤＮＡ配列が共通の制限部位によって結合さ
れ、アルファー１インターフエロンとアルファー２イン
ターフエロンからの配列を含むＤＮＡ配列がつくられて
いる（４）。しかし、このような融合アルファ・インタ
ーフェロンＤＮＡ配列によって発現したアルファ・イン
ターフェロンは限られた生物学的活性しか示さなかった
。
合させることにより修正されている。例えば、プラスミ
ド誘導のベータ・ラクタマーゼのシグナル配列は、プロ
インシュリンの分泌をうながすために、共通の制限部位
を通じて、プロインシュリンのアミノ末端に付けられた
。（３）ワイズマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ）により述べら
れているように、２つの異なるヒトのアルファ・インタ
ーフェロンＤＮＡ配列が共通の制限部位によって結合さ
れ、アルファー１インターフエロンとアルファー２イン
ターフエロンからの配列を含むＤＮＡ配列がつくられて
いる（４）。しかし、このような融合アルファ・インタ
ーフェロンＤＮＡ配列によって発現したアルファ・イン
ターフェロンは限られた生物学的活性しか示さなかった
。
１ケ所の制限部位か、橋かけ合成オリゴヌクレオチドに
よって１ケ所以上の制限部位でその基礎となるＤＮＡを
結合するか、全部修正したＤＮＡ配列を作るために合成
オリゴヌクレオチドを結合することによって修正ポリペ
プチドを生成させることへの最大の制限は、特別の修正
組み換えポリペプチドを生成するためには、莫大な動力
が必要となることである。たとえば、そのような修正に
はＤＮＡやポリペプチドの配列を知る必要があり、もし
そのデータが入手できない場合は、それを決定しなけれ
ばならない。さらに、そのような配列がたとえわってい
ても、修正ポリペプチドの生成の仕事は複雑で、生物学
的に不活性な分子を生じてしまうかもしれない。
よって１ケ所以上の制限部位でその基礎となるＤＮＡを
結合するか、全部修正したＤＮＡ配列を作るために合成
オリゴヌクレオチドを結合することによって修正ポリペ
プチドを生成させることへの最大の制限は、特別の修正
組み換えポリペプチドを生成するためには、莫大な動力
が必要となることである。たとえば、そのような修正に
はＤＮＡやポリペプチドの配列を知る必要があり、もし
そのデータが入手できない場合は、それを決定しなけれ
ばならない。さらに、そのような配列がたとえわってい
ても、修正ポリペプチドの生成の仕事は複雑で、生物学
的に不活性な分子を生じてしまうかもしれない。
ウェハー（Ｗｅｂｅｒ ）等（５）は、アルファー１と
アルファー２のヒト・インターフェロン配列をコードす
るＤＮＡ間での生体内組み換えによって、修正遺伝子を
作る方法を公開した。５′側にアルファー２インターフ
エロン遺伝子、３′側にアルファー１インターフエロン
遺伝子の一部をもつプラスミドベクターを含む線状ＤＮ
Ａ配列を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のレックーＡプラス（
ｒｅｃ Ａ” ）株にトランスフェクトした。
アルファー２のヒト・インターフェロン配列をコードす
るＤＮＡ間での生体内組み換えによって、修正遺伝子を
作る方法を公開した。５′側にアルファー２インターフ
エロン遺伝子、３′側にアルファー１インターフエロン
遺伝子の一部をもつプラスミドベクターを含む線状ＤＮ
Ａ配列を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のレックーＡプラス（
ｒｅｃ Ａ” ）株にトランスフェクトした。
部分的に相同的なインターフェロン遺伝子配列の間での
生体内組み換えによる、その綿状プラスミドの環状化は
、アルファー１とアルファー２のインターフェロン遺伝
子配列の種々の部分を含む、いくつかの修正インターフ
ェロン遺伝子を生成した。それらの修正アルファインタ
ーフェロン遺伝子のいくつかは未修正アルファー２イン
ターフエロンと同様な生物学的活性を有する修正アルフ
ァ・インターフェロンを発現したとウニバー（Ｗｅｂｅ
ｒ）は報告している。
生体内組み換えによる、その綿状プラスミドの環状化は
、アルファー１とアルファー２のインターフェロン遺伝
子配列の種々の部分を含む、いくつかの修正インターフ
ェロン遺伝子を生成した。それらの修正アルファインタ
ーフェロン遺伝子のいくつかは未修正アルファー２イン
ターフエロンと同様な生物学的活性を有する修正アルフ
ァ・インターフェロンを発現したとウニバー（Ｗｅｂｅ
ｒ）は報告している。
ウェハー （Ｗｅｂｅｒ） （５）が公開しているよう
に、線状プラスミドの生体内環状化（組み換え）による
修正遺伝子及びポリペプチドの生成効率は、環状プラス
ミドに比べ、綿状プラスミドは微生物へのトランスフェ
クトの効率が低いことにより制限されている。さらに、
２つの異なるが関連している遺伝子は、そのような線状
プラスミド配列上で複製可能なプラスミド配列によって
常に分離されている。環状化は、その２つの遺伝子を含
むベクターの端が、２つの遺伝子が互いに近く接するよ
うにオーバラップすることを要求する。それゆえ、組み
換えの効率はそのようなプラスミド構造の線型によって
制限されることになる。
に、線状プラスミドの生体内環状化（組み換え）による
修正遺伝子及びポリペプチドの生成効率は、環状プラス
ミドに比べ、綿状プラスミドは微生物へのトランスフェ
クトの効率が低いことにより制限されている。さらに、
２つの異なるが関連している遺伝子は、そのような線状
プラスミド配列上で複製可能なプラスミド配列によって
常に分離されている。環状化は、その２つの遺伝子を含
むベクターの端が、２つの遺伝子が互いに近く接するよ
うにオーバラップすることを要求する。それゆえ、組み
換えの効率はそのようなプラスミド構造の線型によって
制限されることになる。
従って、ここでは、複製可能なＤＮＡ配列と少なくとも
２つの異なる親ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
含む環状ベクター、そして上記の複製可能なＤＮＡ配列
と各親ポリペプチドの１部分に対応するハイブリッドポ
リペプチドをコードするハイブリッドＤＮＡ配列を含ん
でいる組み換え環状ベクターを提供することを目的とし
ている。
２つの異なる親ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
含む環状ベクター、そして上記の複製可能なＤＮＡ配列
と各親ポリペプチドの１部分に対応するハイブリッドポ
リペプチドをコードするハイブリッドＤＮＡ配列を含ん
でいる組み換え環状ベクターを提供することを目的とし
ている。
また、本発明の目的は、そのような組み換え環状ベクタ
ーやハイブリッドポリペプチドを作るための効率的方法
を提供することである。
ーやハイブリッドポリペプチドを作るための効率的方法
を提供することである。
さらに、本発明の目的は、そのような組み換え環状ベク
ターを単離するための付加的方法を提供することである
。
ターを単離するための付加的方法を提供することである
。
さらに本発明の目的は、少なくとも２つの親ポリペプチ
ドからのポリペプチド配列のセグメントを含む生物学的
に活性ハイブリッドポリペプチドを提供することである
。
ドからのポリペプチド配列のセグメントを含む生物学的
に活性ハイブリッドポリペプチドを提供することである
。
さらに、本発明の目的はハイブリッドアミラーゼやハイ
ブリッドプロテアーゼのような生物学的に活性なハイブ
リッド酵素を提供することである。
ブリッドプロテアーゼのような生物学的に活性なハイブ
リッド酵素を提供することである。
複製可能なＤＮＡ配列と少なくとも２つの別々な親ポリ
ペプチドの全部か又は一部をコードした親ＤＮＡ配列を
含む新しい環状ベクターを公開する。そのようなベクタ
ーを上記の複製可能なＤＮＡ配列と（１）第１親ポリペ
プチド配列の第１部分に対応するハイブリッドポリペプ
チドのアミノ末端部分をコードする第１ＤＮＡ配列は、
（２）第２親ポリペプチド配列の第１部分に対応する上
記ハイブリッドポリペプチドのカルボキシル末端部分を
コードする第２ＤＮＡ配列、を含むハイブリッドＤＮＡ
配列を含有する組み換え環状ベクターを作るために新し
い方法中で使用する。
ペプチドの全部か又は一部をコードした親ＤＮＡ配列を
含む新しい環状ベクターを公開する。そのようなベクタ
ーを上記の複製可能なＤＮＡ配列と（１）第１親ポリペ
プチド配列の第１部分に対応するハイブリッドポリペプ
チドのアミノ末端部分をコードする第１ＤＮＡ配列は、
（２）第２親ポリペプチド配列の第１部分に対応する上
記ハイブリッドポリペプチドのカルボキシル末端部分を
コードする第２ＤＮＡ配列、を含むハイブリッドＤＮＡ
配列を含有する組み換え環状ベクターを作るために新し
い方法中で使用する。
第１及び第２の親ポリペプチド配列の全て又は一部をコ
ードする第１及び第２の親ＤＮＡ配列は複製可能なＤＮ
Ａ配列と結合され、上記の親ＤＮＡ配列が互いに隣接す
るように環状ベクターを形成する。レック・プラス（ｒ
ｅｃ”″）微生物をそのように形成されたベクターで形
質転換し、そこでレック・プラス微生物の自然組み換え
メカニズムによって、上記の環状ベクターの少なくとも
１つが交叉組み換えをおこすような、多数の上記環状ベ
クターを含む細胞集団を形成する。そのようなベクター
の交叉組み換えは上記の第１及び第２の親ポリペプチド
配列の各第２部分をコードする第３ＤＮＡ配列を切り出
し、上記複製可能ＤＮＡ配列及び、第１と第２の親ポリ
ペプチド配列の各第１部分をコードする上記のハイブリ
ッドＤＮＡ配列を含有する組み換え環状ベクターを形成
する。
ードする第１及び第２の親ＤＮＡ配列は複製可能なＤＮ
Ａ配列と結合され、上記の親ＤＮＡ配列が互いに隣接す
るように環状ベクターを形成する。レック・プラス（ｒ
ｅｃ”″）微生物をそのように形成されたベクターで形
質転換し、そこでレック・プラス微生物の自然組み換え
メカニズムによって、上記の環状ベクターの少なくとも
１つが交叉組み換えをおこすような、多数の上記環状ベ
クターを含む細胞集団を形成する。そのようなベクター
の交叉組み換えは上記の第１及び第２の親ポリペプチド
配列の各第２部分をコードする第３ＤＮＡ配列を切り出
し、上記複製可能ＤＮＡ配列及び、第１と第２の親ポリ
ペプチド配列の各第１部分をコードする上記のハイブリ
ッドＤＮＡ配列を含有する組み換え環状ベクターを形成
する。
そのような組み換えベクターは新しいハイブリッドポリ
ペプチドを発現することができるし、またそのような発
現をさせる為にさらに修正される。
ペプチドを発現することができるし、またそのような発
現をさせる為にさらに修正される。
種々の上記方法では上記の第３ＤＮＡ配列中に含まれる
１ケ所切断制限部位を利用する。第３ＤＮＡ配列の切り
出しはもはや１ケ所切断制限部位を含まない組み換え環
状ベクターを作る。単離した環状ベクターと組み換え環
状ベクターを、上記の１ケ所切断制限部位に対するエン
ドヌクレアーゼで処理すると線状ベクターと環状組み換
えベクターが生成する。その環状組み換えベクターは、
それらベクターを微生物にさらし、組み換え環状ベクタ
ーをその微生物に形質転換することによって線状ベクタ
ーから単離される。
１ケ所切断制限部位を利用する。第３ＤＮＡ配列の切り
出しはもはや１ケ所切断制限部位を含まない組み換え環
状ベクターを作る。単離した環状ベクターと組み換え環
状ベクターを、上記の１ケ所切断制限部位に対するエン
ドヌクレアーゼで処理すると線状ベクターと環状組み換
えベクターが生成する。その環状組み換えベクターは、
それらベクターを微生物にさらし、組み換え環状ベクタ
ーをその微生物に形質転換することによって線状ベクタ
ーから単離される。
また、第２ＤＮＡ配列の発現を阻止するＤＮＡ配列を第
３ＤＮＡ配列が含むようなプロセスも公開している。そ
のような配列は典型的には転写終止配列である。機能性
プロモーター配列は上記の第１ ＤＮＡ配列と実施可能
な形で結合している。
３ＤＮＡ配列が含むようなプロセスも公開している。そ
のような配列は典型的には転写終止配列である。機能性
プロモーター配列は上記の第１ ＤＮＡ配列と実施可能
な形で結合している。
第３ＤＮＡ配列がレック・プラス微生物によって切り出
されたとき、ハイブリッドポリペプチドは発現する。そ
のような発現は組み換えベクターを含む形質転換体を同
定するのに使われる。
されたとき、ハイブリッドポリペプチドは発現する。そ
のような発現は組み換えベクターを含む形質転換体を同
定するのに使われる。
この後者の方法はさらに、上記の第２ＤＮＡ配列の３′
側に第４のＤＮＡ配列を位置させることにより修正する
ことができる。この第４ＤＮＡ配列は、テトラサイタリ
ン耐性のような特定の選択特性をコードしており、上記
の第３ＤＮＡ配列の切り出しの結果のような特定の選択
特性を発現する組み換えベクターを含む形質転換体を単
離するのに使われる。
側に第４のＤＮＡ配列を位置させることにより修正する
ことができる。この第４ＤＮＡ配列は、テトラサイタリ
ン耐性のような特定の選択特性をコードしており、上記
の第３ＤＮＡ配列の切り出しの結果のような特定の選択
特性を発現する組み換えベクターを含む形質転換体を単
離するのに使われる。
特定の生物学的活性を有する新しいハイブリッドポリペ
プチドを環状ベクター中に含まれるＤＮＡ配列の相同的
交叉組み換えによって作ることができることを発明者は
示している。少なくとも２の異なるポリペプチドの全部
又は一部をコードする親ＤＮＡ配列を複製可能なＤＮＡ
配列と結合して環状ベクターを形成する。親ＤＮＡ配列
は、上記の配列が非常に近接するように並んで結合させ
てもよいし、文種々の近接度をもつように環状ベクター
内の種々の位置に挿入させてもよい。そのような近接度
の変化は組み換えの効率を制御するのに有用であるし、
組み換えが起こるそのようなｆｉＤＮＡ配列中の領域に
制限を与える物理的抑制う負わせている。このように結
合した環状ベクターで形質転換したレック・プラス微生
物はその親ＤＮＡ配列間の配列相同的領域で交叉組み換
えを起こすと信じられている。組み換え環状ベクターは
各親ＤＮＡ配列の種々の部分を含むハイブリッドＤＮＡ
配列を含むように形成された。相同性は交叉組み換えを
起こすのに必要であるだけで、実際の交叉点が相同的な
親ＤＮＡ配列のそれらの領域に必ずしも対応しているわ
けではない。これらのハイブリッドＤＮＡ配列は、各親
ポリペプチドからの種々のアミノ末端とカルボキシル末
端を含む生物学的に活性なポリペプチドをコードしてい
た。
プチドを環状ベクター中に含まれるＤＮＡ配列の相同的
交叉組み換えによって作ることができることを発明者は
示している。少なくとも２の異なるポリペプチドの全部
又は一部をコードする親ＤＮＡ配列を複製可能なＤＮＡ
配列と結合して環状ベクターを形成する。親ＤＮＡ配列
は、上記の配列が非常に近接するように並んで結合させ
てもよいし、文種々の近接度をもつように環状ベクター
内の種々の位置に挿入させてもよい。そのような近接度
の変化は組み換えの効率を制御するのに有用であるし、
組み換えが起こるそのようなｆｉＤＮＡ配列中の領域に
制限を与える物理的抑制う負わせている。このように結
合した環状ベクターで形質転換したレック・プラス微生
物はその親ＤＮＡ配列間の配列相同的領域で交叉組み換
えを起こすと信じられている。組み換え環状ベクターは
各親ＤＮＡ配列の種々の部分を含むハイブリッドＤＮＡ
配列を含むように形成された。相同性は交叉組み換えを
起こすのに必要であるだけで、実際の交叉点が相同的な
親ＤＮＡ配列のそれらの領域に必ずしも対応しているわ
けではない。これらのハイブリッドＤＮＡ配列は、各親
ポリペプチドからの種々のアミノ末端とカルボキシル末
端を含む生物学的に活性なポリペプチドをコードしてい
た。
ここで用いられているように、“ハイブリッドポリペプ
チド”とは少なくとも２つの親アミノ酸配列から引き出
された部分配列の組み合せであるアミノ酸配列を有する
組み換えポリペプチドのことである。ここで公開されて
いる種々の好ましい具体例のいくつかでは、ハイブリッ
ドポリペプチドは特にＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、Ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉ ｌ ｕｓ ）
のアルファ・アミラーゼからの種々の量のアミノ末端ペ
プチド配列と特にＢ、リチェニホルミス（Ｂ、Ｉｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアルファ・アミラーゼからの
カルボキシル末端を含んでいる。
チド”とは少なくとも２つの親アミノ酸配列から引き出
された部分配列の組み合せであるアミノ酸配列を有する
組み換えポリペプチドのことである。ここで公開されて
いる種々の好ましい具体例のいくつかでは、ハイブリッ
ドポリペプチドは特にＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、Ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉ ｌ ｕｓ ）
のアルファ・アミラーゼからの種々の量のアミノ末端ペ
プチド配列と特にＢ、リチェニホルミス（Ｂ、Ｉｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアルファ・アミラーゼからの
カルボキシル末端を含んでいる。
また他の具体例は特に枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
）のアルカリ・プロテアーゼからの種々の量のアミノ末
端配列と、特にＢ．アミロリクエファシエンス（Ｂ、ａ
ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のアルカリ・プロ
テアーゼからのカルボキシル末端アミノ酸配列を含むハ
イブリッドポリペプチドを公開している。
）のアルカリ・プロテアーゼからの種々の量のアミノ末
端配列と、特にＢ．アミロリクエファシエンス（Ｂ、ａ
ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のアルカリ・プロ
テアーゼからのカルボキシル末端アミノ酸配列を含むハ
イブリッドポリペプチドを公開している。
これら特別な具体例は例として示されているもので、本
発明の範囲を制限するものでない。特に、ここで特別に
公開したちの以外のものからのアルファ・アミラーゼ又
はアルカリ・プロテアーゼは、本発明を実施するのに用
いることができる。そのような親ポリペプチドには、た
とえば、Ｂ、コアグランス（Ｂ、ｃｏａｇｕｌａｎｓ
） （たとえばＡＴＣＣ７０５０）、Ｂ．アミロリクエ
ファシエンス（Ｂ。
発明の範囲を制限するものでない。特に、ここで特別に
公開したちの以外のものからのアルファ・アミラーゼ又
はアルカリ・プロテアーゼは、本発明を実施するのに用
いることができる。そのような親ポリペプチドには、た
とえば、Ｂ、コアグランス（Ｂ、ｃｏａｇｕｌａｎｓ
） （たとえばＡＴＣＣ７０５０）、Ｂ．アミロリクエ
ファシエンス（Ｂ。
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ） （たとえ
ば、ＡＴＣＣ２３８４２）、Ｂ、メガテリウム（Ｂｌｍ
ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（たとえば、ＡＴＣＣ６４５Ｂ）
、Ｂ、アルカロフィラム（Ｂ、ａｌｃａｌｏｐｈｉｌ
ｕｓ） （たとえば、ＡＴＣＣ２１５９１）、そして
Ｂ、セレアル（Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ）（たとえば、ＡＴＣ
Ｃ２１７６８）から誘導されるアルファ・アミラーゼを
含んでいる。他のアルカリ・プロテアーゼの例には、Ｂ
、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
） （たとえば、ＡＴＣＣ２１４１５）、Ｂ、アル
カロフィラス（Ｂ、ａｌｃａｌｏ−ｐｈｉｌｕｓ）
（たとえば、ＡＴＣＣ２１５２２）及びＢ、セレアス（
Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ） （たとえば、ＡＴＣＣ２１７６
８）から誘導されるものを含む。
ば、ＡＴＣＣ２３８４２）、Ｂ、メガテリウム（Ｂｌｍ
ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（たとえば、ＡＴＣＣ６４５Ｂ）
、Ｂ、アルカロフィラム（Ｂ、ａｌｃａｌｏｐｈｉｌ
ｕｓ） （たとえば、ＡＴＣＣ２１５９１）、そして
Ｂ、セレアル（Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ）（たとえば、ＡＴＣ
Ｃ２１７６８）から誘導されるアルファ・アミラーゼを
含んでいる。他のアルカリ・プロテアーゼの例には、Ｂ
、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
） （たとえば、ＡＴＣＣ２１４１５）、Ｂ、アル
カロフィラス（Ｂ、ａｌｃａｌｏ−ｐｈｉｌｕｓ）
（たとえば、ＡＴＣＣ２１５２２）及びＢ、セレアス（
Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ） （たとえば、ＡＴＣＣ２１７６
８）から誘導されるものを含む。
一般に、本発明はまた関連もしくは非関連のポリペプチ
ドからのアミノ酸配列を結合することによってハイブリ
ッドポリペプチドを生成するのにも使うことができる。
ドからのアミノ酸配列を結合することによってハイブリ
ッドポリペプチドを生成するのにも使うことができる。
関連するアミノ酸配列を含むハイブリッドポリペプチド
は独特な物理的性質を示し、一方、非関連ポリペプチド
のハイブリッドは二つの機能性を備えたハイブリッドポ
リペプチドを作ることができる。親ポリペプチドを選択
する上での制限は機能だけである。各親ポリペプチドを
コードする、その基礎となるＤＮＡ配列は、生体内での
組み換えを許すに十分な配列相同性を有さなくてはなら
ない。
は独特な物理的性質を示し、一方、非関連ポリペプチド
のハイブリッドは二つの機能性を備えたハイブリッドポ
リペプチドを作ることができる。親ポリペプチドを選択
する上での制限は機能だけである。各親ポリペプチドを
コードする、その基礎となるＤＮＡ配列は、生体内での
組み換えを許すに十分な配列相同性を有さなくてはなら
ない。
本発明に従って結合することができる種々の親ポリペプ
チドの例には、プラスミノーゲン活性化因子、成長ホル
モン、インターフェロン、リンフォトキシン、アスパチ
ル・プロテアーゼ、Ｂ、サリンジエンシス（Ｂ、ｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ）のトキシン、セルロース及び
タルコアミラーゼ等が含まれる。
チドの例には、プラスミノーゲン活性化因子、成長ホル
モン、インターフェロン、リンフォトキシン、アスパチ
ル・プロテアーゼ、Ｂ、サリンジエンシス（Ｂ、ｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ）のトキシン、セルロース及び
タルコアミラーゼ等が含まれる。
１ハイブリッドＤＮＡ配列”とは上記のハイブリッドポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列である。いくつかの
公開した具体例の中では、そのようなハイブリッドＤＮ
Ａ配列はさらに、その基礎となるハイブリッドＤＮＡに
よってコードされるハイブリッドポリペプチドが発現で
きるように、上記ハイブリッドＤＮＡに実施可能な状態
で結合した機能性プロモーターを含んでいる。そのよう
なプロモーターは親ＤＮＡ配列の元のプロモーターでも
よいし、その分野に熟練した人に知られている源からＨ
ｆＨＨされるか、ハイプリ１．ドポリペプチドがうまく
発現できるよう、よく知られている方法により機能的に
挿入されてもよい。いくつかの具体例の中では、プロモ
ーターはハイブリッドＤ Ｎ Ａ配列を作るのに必要と
しない。プロモーター配列は組み換えの後に、そのハイ
ブリッドＤＮＡ配列が発現できるようそのような組み換
えベクター内に導入することができる。
リペプチドをコードするＤＮＡ配列である。いくつかの
公開した具体例の中では、そのようなハイブリッドＤＮ
Ａ配列はさらに、その基礎となるハイブリッドＤＮＡに
よってコードされるハイブリッドポリペプチドが発現で
きるように、上記ハイブリッドＤＮＡに実施可能な状態
で結合した機能性プロモーターを含んでいる。そのよう
なプロモーターは親ＤＮＡ配列の元のプロモーターでも
よいし、その分野に熟練した人に知られている源からＨ
ｆＨＨされるか、ハイプリ１．ドポリペプチドがうまく
発現できるよう、よく知られている方法により機能的に
挿入されてもよい。いくつかの具体例の中では、プロモ
ーターはハイブリッドＤ Ｎ Ａ配列を作るのに必要と
しない。プロモーター配列は組み換えの後に、そのハイ
ブリッドＤＮＡ配列が発現できるようそのような組み換
えベクター内に導入することができる。
“親ＤＮＡ配列”とは特別なポリペプチド配列の全部又
は一部をコードするＤＮＡ配列のことである。ここで公
開されているように、少なくとも２つの親ＤＮＡ配列か
らの第１部分がハイブリッドポリペプチドをコードする
ハイブリッドＤＮＡを形成するように生体内で組み換え
られる。特別な具体例によっては、各親ＤＮＡ配列の第
２部分は上記ハイブリッドＤＮＡ配列の形成の間に切り
出される。
は一部をコードするＤＮＡ配列のことである。ここで公
開されているように、少なくとも２つの親ＤＮＡ配列か
らの第１部分がハイブリッドポリペプチドをコードする
ハイブリッドＤＮＡを形成するように生体内で組み換え
られる。特別な具体例によっては、各親ＤＮＡ配列の第
２部分は上記ハイブリッドＤＮＡ配列の形成の間に切り
出される。
“シック・プラス微生物”とは、組み換え可能で、特に
本発明の環状ベクターの組み換えを媒介することができ
る原核及び真核微生物の遺伝子型である。一般にそのよ
うな微生物には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） 、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）やエンテロバクテリアシアエ（Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｉａｅ）細菌のその他の
種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ） 、
コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）
、ラクトバシリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ） 、スト
レプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ−ｔｏｍｙｃｅｓ ） 、
アグロバクテリウム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の
ような原核生物と、サツカロマイセス・セレビシアエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
や他のイースト、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ）や他の繊維状カビ、そして鳥類又はホ乳類由来
の組織培養細胞の真核生物が含まれている。
本発明の環状ベクターの組み換えを媒介することができ
る原核及び真核微生物の遺伝子型である。一般にそのよ
うな微生物には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） 、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）やエンテロバクテリアシアエ（Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｉａｅ）細菌のその他の
種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ） 、
コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）
、ラクトバシリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ） 、スト
レプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ−ｔｏｍｙｃｅｓ ） 、
アグロバクテリウム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の
ような原核生物と、サツカロマイセス・セレビシアエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
や他のイースト、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ）や他の繊維状カビ、そして鳥類又はホ乳類由来
の組織培養細胞の真核生物が含まれている。
本発明の環状ベクター及び組み換えベクターの一部を形
成する“複製可能なＤＮＡ配列”とは、生体内組み換え
を媒介するのに用いられる特別なシック・プラス微生物
に適合するベクタ一種から誘導された複製及び制御配列
のことである。通常そのような複製可能ＤＮＡ配列配列
は形質転換した細胞中で発現型の選択を与えることが可
能なプロティンをコードする配列と同様な複製部位を有
している。例えば、シック・プラス大腸菌（Ｅ。
成する“複製可能なＤＮＡ配列”とは、生体内組み換え
を媒介するのに用いられる特別なシック・プラス微生物
に適合するベクタ一種から誘導された複製及び制御配列
のことである。通常そのような複製可能ＤＮＡ配列配列
は形質転換した細胞中で発現型の選択を与えることが可
能なプロティンをコードする配列と同様な複製部位を有
している。例えば、シック・プラス大腸菌（Ｅ。
ｃｏｌｉ）が生体内組み換えのために選択されたときに
は、ｐＢＳ４２ （１７）（ＡＴＣＣ＃３７２７９）
ｐＢＲ３２２（２５）（ＡＴＣＣ＃３７０１７）、ｐＵ
ｃシリーズプラスミド（２６）、及びＲ３Ｆ１０１０（
４４）から引き出されるＤＮＡ配列が使用される・サツ
カロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスバ
ルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）又はホ乳類の組
織培養細胞のようなシック・プラス真核生物が使われる
ときには、複製可能ＤＮＡ配列には、それぞれ、イース
ト２−μベクター（３５）、アスパルギラス（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ）組込みベクターｐ３ＳＲ２（３６）
及びＳＶ４０ （３７）から引き出される。
は、ｐＢＳ４２ （１７）（ＡＴＣＣ＃３７２７９）
ｐＢＲ３２２（２５）（ＡＴＣＣ＃３７０１７）、ｐＵ
ｃシリーズプラスミド（２６）、及びＲ３Ｆ１０１０（
４４）から引き出されるＤＮＡ配列が使用される・サツ
カロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスバ
ルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）又はホ乳類の組
織培養細胞のようなシック・プラス真核生物が使われる
ときには、複製可能ＤＮＡ配列には、それぞれ、イース
ト２−μベクター（３５）、アスパルギラス（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ）組込みベクターｐ３ＳＲ２（３６）
及びＳＶ４０ （３７）から引き出される。
ここで用いられているように、コード化したＤＮＡ配列
と実施可能な形で結合している機能性プロモーターとは
、コード化した配列の転写及び翻訳を制御するプロモー
ターのことである。そのプロモーター配列は、発現のた
めに選ばれた微生物中で機能的であるように選ばれる。
と実施可能な形で結合している機能性プロモーターとは
、コード化した配列の転写及び翻訳を制御するプロモー
ターのことである。そのプロモーター配列は、発現のた
めに選ばれた微生物中で機能的であるように選ばれる。
たとえば、ラムダＰＬ （３８）から導入されたプロ
モーター配列は、ｔｒｐ（３９）やｔａｃ（４０）プロ
モーターと同様に、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中でポリペ
プチドを発現すべく、コード化配列と実施可能な形で結
合している。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）が発現
宿主である場合には、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｔｌｉｓ
）のアルカリ、プロテアーゼプロモーター（３２）又は
Ｂ．アミロリクエファシエンスＣＢ、ａｔｍｙｌｏｌｒ
ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）（４１）のアルファ・アミラ
ーゼ・プロモーターが使われる。イースト中での発現は
Ｓ、セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）のＧＡ
ＰＤＭに対するプロモーターの制御下にあり、一方、繊
維状カビ中での発現は、アスベルギラス・ニガー（Ａｓ
ｐｅｒｇｆｌｌｕｓｎ５ｇｅｒ ） （４３）からの
Ｂ−グルコシダーゼに対するプロモーターにより媒介さ
れる。５Ｖ４０（３７）の初期のプロモーターがホ乳類
細胞中での発現にとって好ましい。
モーター配列は、ｔｒｐ（３９）やｔａｃ（４０）プロ
モーターと同様に、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中でポリペ
プチドを発現すべく、コード化配列と実施可能な形で結
合している。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）が発現
宿主である場合には、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｔｌｉｓ
）のアルカリ、プロテアーゼプロモーター（３２）又は
Ｂ．アミロリクエファシエンスＣＢ、ａｔｍｙｌｏｌｒ
ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）（４１）のアルファ・アミラ
ーゼ・プロモーターが使われる。イースト中での発現は
Ｓ、セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）のＧＡ
ＰＤＭに対するプロモーターの制御下にあり、一方、繊
維状カビ中での発現は、アスベルギラス・ニガー（Ａｓ
ｐｅｒｇｆｌｌｕｓｎ５ｇｅｒ ） （４３）からの
Ｂ−グルコシダーゼに対するプロモーターにより媒介さ
れる。５Ｖ４０（３７）の初期のプロモーターがホ乳類
細胞中での発現にとって好ましい。
ＤＮＡの“消化”とはＤＮＡ中のある位置にのみ働く酵
素で、ＤＮＡを触媒的な切断のことである。そのような
酵素は制限酵素と呼ばれ、各々の特異的部位を制限部位
と呼ぶ。“部分”消化とは制限酵素による不完全消化の
ことで、すなわち、ＤＮＡ基質中の、ある与えられた制
限エンドヌクレアーゼに対する部位が完全には切断され
ないような条件が選択される。ここで使用れている種々
の制限酵素は市販されており、それらの反応状性、補因
子、酵素提供者により設定されている他の必要物が用い
られる。一般に、プラスミドもしくはＤＮＡフラグメン
ト約１マイクログラムが約１ユニツトの酵素と約２０マ
イクロリツトルの緩衝溶液とともに用いられる。特定の
制限酵素に対する適切な緩衝液と基質量は製造業者によ
って指定されている。通常、３７℃で約１時間のインキ
ュベーション時間かつかわれているが供給者の指定に従
って変化することもある。インキュベーション後、タン
パク質をフェノールとクロロホルムで抽出することによ
り除き、消化した核酸をエタノール沈殿によって水層か
ら回収する。制限酵素による消化の後に、ＤＮＡフラグ
メントの二つの制限切断末端が閉環ループを作って、制
限部位への他のＤＮＡフラグメントの挿入を阻止するこ
とがないように、末端５′リン酸をバクチリアル・アル
カリ・ホスファターゼによって加水分解する。
素で、ＤＮＡを触媒的な切断のことである。そのような
酵素は制限酵素と呼ばれ、各々の特異的部位を制限部位
と呼ぶ。“部分”消化とは制限酵素による不完全消化の
ことで、すなわち、ＤＮＡ基質中の、ある与えられた制
限エンドヌクレアーゼに対する部位が完全には切断され
ないような条件が選択される。ここで使用れている種々
の制限酵素は市販されており、それらの反応状性、補因
子、酵素提供者により設定されている他の必要物が用い
られる。一般に、プラスミドもしくはＤＮＡフラグメン
ト約１マイクログラムが約１ユニツトの酵素と約２０マ
イクロリツトルの緩衝溶液とともに用いられる。特定の
制限酵素に対する適切な緩衝液と基質量は製造業者によ
って指定されている。通常、３７℃で約１時間のインキ
ュベーション時間かつかわれているが供給者の指定に従
って変化することもある。インキュベーション後、タン
パク質をフェノールとクロロホルムで抽出することによ
り除き、消化した核酸をエタノール沈殿によって水層か
ら回収する。制限酵素による消化の後に、ＤＮＡフラグ
メントの二つの制限切断末端が閉環ループを作って、制
限部位への他のＤＮＡフラグメントの挿入を阻止するこ
とがないように、末端５′リン酸をバクチリアル・アル
カリ・ホスファターゼによって加水分解する。
制限消化物からＤＮＡの所定のフラグメントの“回収”
又は“単離”は、その消化物のポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分離、分子量既知のマーカーＤＮＡフラ
グメントに対する泳動度の比較による目的フラグメント
の同定、望ましいフラグメントを含むゲル区分の切り出
し及び一般的には電気流出によるＤＮＡのゲルからの分
離を意味する。（６，７） “連結”とは２つの二本鎖核酸フラグメント間でホスホ
ジエステル結合を形成する過程をいう（８）。特に記述
がない場合は、連結は既知緩衝液をつかって、連結する
ＤＮＡフラグメントとほぼ等モル量の、Ｄ Ｎ Ａ ０
．５マイクログラム当り、１０ユニツトの７４ＤＮＡリ
ガーゼ（″リガーゼ”）という条件を行なう。
又は“単離”は、その消化物のポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分離、分子量既知のマーカーＤＮＡフラ
グメントに対する泳動度の比較による目的フラグメント
の同定、望ましいフラグメントを含むゲル区分の切り出
し及び一般的には電気流出によるＤＮＡのゲルからの分
離を意味する。（６，７） “連結”とは２つの二本鎖核酸フラグメント間でホスホ
ジエステル結合を形成する過程をいう（８）。特に記述
がない場合は、連結は既知緩衝液をつかって、連結する
ＤＮＡフラグメントとほぼ等モル量の、Ｄ Ｎ Ａ ０
．５マイクログラム当り、１０ユニツトの７４ＤＮＡリ
ガーゼ（″リガーゼ”）という条件を行なう。
“形質転換”とは生体内にＤＮＡを導入し、染色体外要
素として、もしくは染色体組み込み物として、そのＤＮ
Ａが複製可能となることである。
素として、もしくは染色体組み込み物として、そのＤＮ
Ａが複製可能となることである。
特に記述がない場合は大腸菌（ｔ！、ｃｏｌｉ）の形質
転換に対し、ここで使う方法はマンデル（Ｍａｎｄｅｌ
）（９）の塩化カルシウム法であり、バチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）に対してはアナグツストポラス（Ａｎａｇ
ｎｏｓｔｏｐｏｌｏｕｓ ）の方法である。
転換に対し、ここで使う方法はマンデル（Ｍａｎｄｅｌ
）（９）の塩化カルシウム法であり、バチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）に対してはアナグツストポラス（Ａｎａｇ
ｎｏｓｔｏｐｏｌｏｕｓ ）の方法である。
“オリゴヌクレオチド”とは短かい一本鎖又は二本鎖ポ
リヌクレオチドのことでフレア（Ｃｒｅａ）等の方法に
よって化学的に合成しく１１） 、さらにポリアクリル
アミドゲルにより精製する。
リヌクレオチドのことでフレア（Ｃｒｅａ）等の方法に
よって化学的に合成しく１１） 、さらにポリアクリル
アミドゲルにより精製する。
形質転換体からのＤＮＡの“調製“とは微生物培養物か
らプラスミドＤＮＡを単離することである。特に記述が
ない場合は、アルカリ／ＳＤＳ法が用いられる。 （１
２） 次に掲げる特別な例は、本発明の範囲を制限するもので
はなく、本発明の性格を十分に説明するためのものであ
る。
らプラスミドＤＮＡを単離することである。特に記述が
ない場合は、アルカリ／ＳＤＳ法が用いられる。 （１
２） 次に掲げる特別な例は、本発明の範囲を制限するもので
はなく、本発明の性格を十分に説明するためのものであ
る。
好ましい具体例の１つの中で、Ｂ、ステアロサーモフィ
ラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の
アルファ・アミラーゼをコードする全ＤＮＡ配列に実施
可能な形で結合した、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のアルファ
・アミラーゼに対する本来のプロモーターを含むＢ、ス
テアロサーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）のアルファ・アミラーゼのＤＮＡ配列を
クローニングし、単離した。Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ
。
ラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の
アルファ・アミラーゼをコードする全ＤＮＡ配列に実施
可能な形で結合した、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のアルファ
・アミラーゼに対する本来のプロモーターを含むＢ、ス
テアロサーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）のアルファ・アミラーゼのＤＮＡ配列を
クローニングし、単離した。Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ
。
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアルファ・アミラー
ゼをコードするＤＮＡ配列も同様にクローン化した。
ゼをコードするＤＮＡ配列も同様にクローン化した。
Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ ）のアルファ・アミラーゼをコードする構造ＤＮＡ
配列の５′近傍のＰｓｔ［制限部位と、Ｂ、ステアロサ
ーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ）のアルファ・アミラーゼをコードする構造ＤＮＡ
配列の３′近傍のＰｓｔＩ制限部位は、環状ベクター上
において各親アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を並ん
で連結させるのに用いた。
ｓ ）のアルファ・アミラーゼをコードする構造ＤＮＡ
配列の５′近傍のＰｓｔ［制限部位と、Ｂ、ステアロサ
ーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ）のアルファ・アミラーゼをコードする構造ＤＮＡ
配列の３′近傍のＰｓｔＩ制限部位は、環状ベクター上
において各親アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を並ん
で連結させるのに用いた。
アルファ・アミラーゼＤＮＡ配列間での相同交叉組み換
えはレック・プラス微生物により媒介され、Ｂ、リチェ
ニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）とＢ
、ステアロサーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）から誘導されるいくつかのハイブ
リッドアミラーゼをコードするハイブリッドＤＮＡ配列
を形成した。
えはレック・プラス微生物により媒介され、Ｂ、リチェ
ニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）とＢ
、ステアロサーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）から誘導されるいくつかのハイブ
リッドアミラーゼをコードするハイブリッドＤＮＡ配列
を形成した。
他の具体例においては、相同交叉組み換えを行なわない
ベクターはＰｓｔｌの消化により線状化した。ハイブリ
ッド・アルファ・アミラーゼをコードしているハイブリ
ッドＤＮＡ配列を形成する組み換えられたベクターは、
２つのアルファ・アミラーゼＤＮＡ配列を結合するのに
使われるＰｓｔ１部位をもはや持たない。そのようなＰ
ｓｔ１部位は構築されたベクター内には１カ所しかない
ので、組み換えベクターは線状化に対して耐性がある。
ベクターはＰｓｔｌの消化により線状化した。ハイブリ
ッド・アルファ・アミラーゼをコードしているハイブリ
ッドＤＮＡ配列を形成する組み換えられたベクターは、
２つのアルファ・アミラーゼＤＮＡ配列を結合するのに
使われるＰｓｔ１部位をもはや持たない。そのようなＰ
ｓｔ１部位は構築されたベクター内には１カ所しかない
ので、組み換えベクターは線状化に対して耐性がある。
そのような非線状組み換えベクターを第２の微生物への
形質転換により、線状ベクターから分離する。
形質転換により、線状ベクターから分離する。
両具体例においては、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）とＢ、リチ
ェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）の
アルファ・アミラーゼをコードするＤＮＡ配列の相同的
配列で開始する交叉組み換えは、Ｂ、ステアロサーモフ
ィラスＣＢ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｒｌｕｓ）
のアルファ・アミラーゼのプロモーター、Ｂ、ステアロ
サーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）のアルファ・アミラーゼのアミノ末端配列の種
々の部分、Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｓ ）のアルファ・アミラーゼのカルボキシ
ル末端の種々の部分をコードするハイブリッドＤＮＡ配
列を含む突然変異ベクターを形成する。そのようなハイ
ブリッドＤＮＡ配列により発現する種々のハイブリッド
アルファ・アミラーゼはＢ、ステアロサーモフィラス（
Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）とＢ、リ
チェニホルミス（Ｂ、１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｎ＋ｉｓ
）の親アルファ・アミラーゼと比較して独自の性質を示
した。その他の好ましい具体例も合せて公開する。
、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）とＢ、リチ
ェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）の
アルファ・アミラーゼをコードするＤＮＡ配列の相同的
配列で開始する交叉組み換えは、Ｂ、ステアロサーモフ
ィラスＣＢ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｒｌｕｓ）
のアルファ・アミラーゼのプロモーター、Ｂ、ステアロ
サーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）のアルファ・アミラーゼのアミノ末端配列の種
々の部分、Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｓ ）のアルファ・アミラーゼのカルボキシ
ル末端の種々の部分をコードするハイブリッドＤＮＡ配
列を含む突然変異ベクターを形成する。そのようなハイ
ブリッドＤＮＡ配列により発現する種々のハイブリッド
アルファ・アミラーゼはＢ、ステアロサーモフィラス（
Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）とＢ、リ
チェニホルミス（Ｂ、１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｎ＋ｉｓ
）の親アルファ・アミラーゼと比較して独自の性質を示
した。その他の好ましい具体例も合せて公開する。
実施例
Ａ、バチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌ
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）とバチルス・ステアロサ
ーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）のアルファ・アミラーゼ遺伝子
のクローニングＢ、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ ）又はＢ、ステアロサーモフィラス
（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−Ｐｈｉｌｕｓ）のＤ
ＮＡを５ａｕ３Ａで部分分解し、６ｋｂ（キロベース）
以上のＤＮＡフラグメントをショ糖勾配中で分画する。
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）とバチルス・ステアロサ
ーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）のアルファ・アミラーゼ遺伝子
のクローニングＢ、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ ）又はＢ、ステアロサーモフィラス
（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−Ｐｈｉｌｕｓ）のＤ
ＮＡを５ａｕ３Ａで部分分解し、６ｋｂ（キロベース）
以上のＤＮＡフラグメントをショ糖勾配中で分画する。
遺伝子ＤＮＡ源として用いるＢ、リチェニホルミス（Ｂ
、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）株は、スコツトラン
ド、アバディーン（＾ｂｅｒｄｅｅｎ）のトリー（Ｔｏ
ｒｒｅｙ）研究所、国立産業細菌コレクション（Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌＢａｃｔｅｒｉａ）から入手した菌株ＭＣＩ
Ｂ８０６１である。遺伝子ＤＮＡ源として用いたＢ、ス
テアロサーモフィラス（Ｂ 、 Ｓ ｔｅａｒｏ ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈ ｉ ｌ ｕｓ ）株は受理番号３９５３
６で米国培養コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にアシグ
ニ−（八ｓｓｉｇｎｅｅ）によって保存された菌株ＮＺ
−３である。バクテリオファージ・ラムダ・ベクターλ
１０５９（１３）をＢａｍＨｌで完全分解し、自己連結
を少なくするために、仔牛の腸ホスファターゼで処理し
た。５００ｎＨのベクターと５００ｎＨの細菌ＤＮＡフ
ラグメントを２０μ１反応体積中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で連結した。その反応中に含まれるＤＮＡを市Ｕｉ（プ
ロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｂｉｏｔｅｃ）
（マジソン市（Ｍａｄｉｓｏｎ ）Ｗｌ）のバッキ
ング・イクストラクトを用いて試験管内でバッキングし
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ） Ｑ３５８（１５）、（６）
とＱ３５９（Ｑ３５９のＰ２溶原体）（１５）に感染さ
せた。典型的には、組み換え体プラークの数は約２．５
Ｘ１０”個であった。
、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）株は、スコツトラン
ド、アバディーン（＾ｂｅｒｄｅｅｎ）のトリー（Ｔｏ
ｒｒｅｙ）研究所、国立産業細菌コレクション（Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌＢａｃｔｅｒｉａ）から入手した菌株ＭＣＩ
Ｂ８０６１である。遺伝子ＤＮＡ源として用いたＢ、ス
テアロサーモフィラス（Ｂ 、 Ｓ ｔｅａｒｏ ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈ ｉ ｌ ｕｓ ）株は受理番号３９５３
６で米国培養コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にアシグ
ニ−（八ｓｓｉｇｎｅｅ）によって保存された菌株ＮＺ
−３である。バクテリオファージ・ラムダ・ベクターλ
１０５９（１３）をＢａｍＨｌで完全分解し、自己連結
を少なくするために、仔牛の腸ホスファターゼで処理し
た。５００ｎＨのベクターと５００ｎＨの細菌ＤＮＡフ
ラグメントを２０μ１反応体積中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で連結した。その反応中に含まれるＤＮＡを市Ｕｉ（プ
ロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｂｉｏｔｅｃ）
（マジソン市（Ｍａｄｉｓｏｎ ）Ｗｌ）のバッキ
ング・イクストラクトを用いて試験管内でバッキングし
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ） Ｑ３５８（１５）、（６）
とＱ３５９（Ｑ３５９のＰ２溶原体）（１５）に感染さ
せた。典型的には、組み換え体プラークの数は約２．５
Ｘ１０”個であった。
アルファ・アミラーゼ活性によるスクリーニングのため
、約５Ｘ１０３ケのプラークを０．５％でんぷんを含む
ＬＢプレートの大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｑ３５９上に
まいた。これらのプレートをでんぷんを染めるヨウ素蒸
気にさらした（１６）。透明なハローに囲まれた５ケの
プラークがＢ、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｓ ）ライブラリー中に発見された。同様に
３ケのプラークがＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、５
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｎ＋ｏｐｈｉ １ｕｓ）ライブラリ
ー中に発見された。ＤＮＡはアミラーゼ・ポジテイブな
り、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉＣｈｅｎｉ−ｆｏｒｍ
ｉｓ）ファージ（λ−ａｍｙ −ＢＬと名付ける）とＢ
、ステアロサーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）ファージ（λ−ａｍｙ −ｆ３Ｓ
と名付ける）の各１ケから調製した。
、約５Ｘ１０３ケのプラークを０．５％でんぷんを含む
ＬＢプレートの大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｑ３５９上に
まいた。これらのプレートをでんぷんを染めるヨウ素蒸
気にさらした（１６）。透明なハローに囲まれた５ケの
プラークがＢ、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｉｓ ）ライブラリー中に発見された。同様に
３ケのプラークがＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、５
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｎ＋ｏｐｈｉ １ｕｓ）ライブラリ
ー中に発見された。ＤＮＡはアミラーゼ・ポジテイブな
り、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉＣｈｅｎｉ−ｆｏｒｍ
ｉｓ）ファージ（λ−ａｍｙ −ＢＬと名付ける）とＢ
、ステアロサーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）ファージ（λ−ａｍｙ −ｆ３Ｓ
と名付ける）の各１ケから調製した。
さて、図３Ｂに参照されるように、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）−枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）のシャトルベ
クターｐＢＳ４２ （１７） 、ＡＴＣＣ３７２７２
をＢａｍＨｌ又はＥｃｏＲｌで切断し、自己連結を防ぐ
ために仔牛の腸アルカリホスファターゼで処理する。こ
の切断したシャトルベクターを各々ＢａＩＩＩＨ１又は
ＥｃｏＲｌで消化したλ−ａａ＋ｙ −ＢＬ由来のＤＮ
Ａと連結する。
ｉ）−枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）のシャトルベ
クターｐＢＳ４２ （１７） 、ＡＴＣＣ３７２７２
をＢａｍＨｌ又はＥｃｏＲｌで切断し、自己連結を防ぐ
ために仔牛の腸アルカリホスファターゼで処理する。こ
の切断したシャトルベクターを各々ＢａＩＩＩＨ１又は
ＥｃｏＲｌで消化したλ−ａａ＋ｙ −ＢＬ由来のＤＮ
Ａと連結する。
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ２９４、（１８） 、ＡＴＣ
ＣＮ１３１４４６の形質転換は多くのクロラムフェニコ
ール耐性形質転換体を生じ、その多くはヨウ素蒸気で染
めると透明なハローを示す。アミラーゼポジティブ（ａ
ｎｙ” ）なりａｍＨｌ及びＥｃｏＲ１サブクローンの
各々の消化はそれぞれ９．４ｋｂ及び３．２ｋｂのフラ
グメントが挿入したことを明らかにした。これらの結果
はＢ、リチェニホルミス（Ｂ。
ＣＮ１３１４４６の形質転換は多くのクロラムフェニコ
ール耐性形質転換体を生じ、その多くはヨウ素蒸気で染
めると透明なハローを示す。アミラーゼポジティブ（ａ
ｎｙ” ）なりａｍＨｌ及びＥｃｏＲ１サブクローンの
各々の消化はそれぞれ９．４ｋｂ及び３．２ｋｂのフラ
グメントが挿入したことを明らかにした。これらの結果
はＢ、リチェニホルミス（Ｂ。
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアルファ・アミラー
ゼ遺伝子がこれらのフラグメントの各々に全体として含
まれていることを示している。このＥｃｏＲ１サブクロ
ーンをｐＢＳ４２−ＢＬと命名し、図３Ｂに示した。
ゼ遺伝子がこれらのフラグメントの各々に全体として含
まれていることを示している。このＥｃｏＲ１サブクロ
ーンをｐＢＳ４２−ＢＬと命名し、図３Ｂに示した。
さらに、プラスミドｐＢＳ４２−ＢＬを、図１に描いた
制限地図を作るため、種々の制限酵素による消化に課し
た。グイデオキシ・チェーン・クーミネーション法（２
１）により予備的にＤＮＡ配列情報を決定するために挿
入したＤＮＡの種々のサブフラグメントをＭ１３シーケ
ンシング・ベクター中にサブクローンした。その１力所
切断Ｋｐｎ１部位付近の配列がＢ．アミロリクエファシ
エンス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｔｅｎｓ ）
のアルファ・アミラーゼ遺伝子のそれと非常に相同性が
高いことが分った。Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアミラーゼ遺伝子がＢ．ア
ミロリクエファシエンス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆ
ａｃｉｅｎｓ ）遺伝子と構造的に同じであると仮定す
ることによって詳細に配列が適切なフラグメントを節単
に選ぶことができる。
制限地図を作るため、種々の制限酵素による消化に課し
た。グイデオキシ・チェーン・クーミネーション法（２
１）により予備的にＤＮＡ配列情報を決定するために挿
入したＤＮＡの種々のサブフラグメントをＭ１３シーケ
ンシング・ベクター中にサブクローンした。その１力所
切断Ｋｐｎ１部位付近の配列がＢ．アミロリクエファシ
エンス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｔｅｎｓ ）
のアルファ・アミラーゼ遺伝子のそれと非常に相同性が
高いことが分った。Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアミラーゼ遺伝子がＢ．ア
ミロリクエファシエンス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆ
ａｃｉｅｎｓ ）遺伝子と構造的に同じであると仮定す
ることによって詳細に配列が適切なフラグメントを節単
に選ぶことができる。
図１は完全に配列決定した領域を示しである。
１５３６ｂｐのオーブン・リーディング・フレームがＢ
．アミロリクエファシエンス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅ−ｆａｃｉｅｎｓ ）の全アルファ・アミラーゼ遺伝
子と高い相同性をもつことが分った。Ｂ、リチェニホル
ミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアルファ
・アミラーゼのＤＮＡ配列を図２Ａと２Ｂに示した。
．アミロリクエファシエンス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅ−ｆａｃｉｅｎｓ ）の全アルファ・アミラーゼ遺伝
子と高い相同性をもつことが分った。Ｂ、リチェニホル
ミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアルファ
・アミラーゼのＤＮＡ配列を図２Ａと２Ｂに示した。
λ−ａｍｙ −ＢＳのＤＮＡを種々の制限酵素で消化し
、１％アガロースゲルで分画し、ニトロセルロース・フ
ィルター（２１）に移し、Ｄ’Ｎ Ａ −ＤＮＡハイブ
リダイゼーションに課した。用いたプローブはＢ、リチ
ェニホルミス（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ア
ミラーゼ遺伝子（図１）の大部分のコード化配列を含む
Ｐｓｔ １− Ｐｓｔ １フラグメントである。このフ
ラグメントをニック・トランスレーション法（２３）に
よりγ−３２ｐで放射能ラベルした。標準的な高ストリ
ンジェント条件下で（２４）、ハイブリダイゼーション
させた。１．８ｋｂのＢａｍＨ１フラグメントと１．８
ｋｂのＳａｆ Ｉフラグメントはハイブリダイズする
フラグメントであった。これら両方のフラグメントをｐ
ＢＲ３２２中にサブクローンし、ＢａｍＨｌ又は５ａｌ
ｔ ｌで切断、ＢａｍＨｌ又はＳａｌ ｌで切断したｐ
ＢＲ３２２と連結して図３Ａに示したプラスミドｐＢＲ
３２２ＢＳ−ＢとｐＢＲ３２２ＢＳ−５を生成した。挿
入したフラグメントの詳細な制限地図を図１に示す。こ
の情報は予備的ＤＮＡ配列解析のための、Ｍ１３配列決
定ベクターへのクローニングに対する種々のサブフラグ
メントの単離に使用した。１カ所切断のＫｐｎ１部位付
近の配列はＢ．アミロリクエファシエンス（Ｂ、ａｍｙ
ｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）と Ｂ、リチェニホ
ルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアルフ
ァ・アミラーゼ遺伝子のそれと高い相同性をもつことが
分った。Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ。
、１％アガロースゲルで分画し、ニトロセルロース・フ
ィルター（２１）に移し、Ｄ’Ｎ Ａ −ＤＮＡハイブ
リダイゼーションに課した。用いたプローブはＢ、リチ
ェニホルミス（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ア
ミラーゼ遺伝子（図１）の大部分のコード化配列を含む
Ｐｓｔ １− Ｐｓｔ １フラグメントである。このフ
ラグメントをニック・トランスレーション法（２３）に
よりγ−３２ｐで放射能ラベルした。標準的な高ストリ
ンジェント条件下で（２４）、ハイブリダイゼーション
させた。１．８ｋｂのＢａｍＨ１フラグメントと１．８
ｋｂのＳａｆ Ｉフラグメントはハイブリダイズする
フラグメントであった。これら両方のフラグメントをｐ
ＢＲ３２２中にサブクローンし、ＢａｍＨｌ又は５ａｌ
ｔ ｌで切断、ＢａｍＨｌ又はＳａｌ ｌで切断したｐ
ＢＲ３２２と連結して図３Ａに示したプラスミドｐＢＲ
３２２ＢＳ−ＢとｐＢＲ３２２ＢＳ−５を生成した。挿
入したフラグメントの詳細な制限地図を図１に示す。こ
の情報は予備的ＤＮＡ配列解析のための、Ｍ１３配列決
定ベクターへのクローニングに対する種々のサブフラグ
メントの単離に使用した。１カ所切断のＫｐｎ１部位付
近の配列はＢ．アミロリクエファシエンス（Ｂ、ａｍｙ
ｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）と Ｂ、リチェニホ
ルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアルフ
ァ・アミラーゼ遺伝子のそれと高い相同性をもつことが
分った。Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ。
５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋ｎｏｐｈｉｌｕｓ）のアルファ
・アミラーゼ遺伝子の構造が他の２つのものと類似して
いると仮定すると、ｐＢＲ３２２ＢＳ−ＢとｐＢＲ３２
２ＢＳ−３中の挿入し九ソラグメントの他のサブフラグ
メントを完全に配列決定するのに選び出すことが可能で
あった。Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の全配列を図２Ａと２Ｂ
に示した。これらの研究で他のアルファ・アミラーゼ遺
伝子のものと高い相同性を示す１５８１ｂｐのオープン
・リーディング・フレームが明らかになった。
・アミラーゼ遺伝子の構造が他の２つのものと類似して
いると仮定すると、ｐＢＲ３２２ＢＳ−ＢとｐＢＲ３２
２ＢＳ−３中の挿入し九ソラグメントの他のサブフラグ
メントを完全に配列決定するのに選び出すことが可能で
あった。Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の全配列を図２Ａと２Ｂ
に示した。これらの研究で他のアルファ・アミラーゼ遺
伝子のものと高い相同性を示す１５８１ｂｐのオープン
・リーディング・フレームが明らかになった。
Ｂ、 Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒ
ｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉ ｌｕｓ ）のアルファ・ア
ミラーゼ・プラスミドベクターｐＵｃ１３Ｂｓ及びＢ、
ステアロサーモフィラス（Ｂ、５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋
ｗｏｐｈｉｌｕｓ） −Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、１
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒ＋＋＋ｉｓ ）のアルファ・アミラ
ーゼ前駆体プラスミドｐＵＣ１３ＢＳＢＬとｐＢＳ４２
ＢＳＢＬの構築図３Ａに示したように、１）ＢＲ３２２
ＢＳ−ＢからのＤＮＡをＢａｍＨｌで消化し、１．８
ｋｂのフラグメント（フラグメントＡ）を単離した。プ
ラス ′ミドｐＢＲ３２２ＢＳ−３をＢａｍＨｌと５ａ
１１で二重消化し、１．８ ｋｂのフラグメント（フラ
グメントＢ）を単離した。プラスミドｐＢＲ３２２をＢ
ａｍＨｌとＳａｌ １で二重消化し、より大きいベクタ
ーフラグメント（フラグメントＣ）を単離した。フラグ
メントＡ、Ｂ、Ｃを連結した。その反応物を大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ） ２９４に形質転換した。
ｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉ ｌｕｓ ）のアルファ・ア
ミラーゼ・プラスミドベクターｐＵｃ１３Ｂｓ及びＢ、
ステアロサーモフィラス（Ｂ、５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋
ｗｏｐｈｉｌｕｓ） −Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、１
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒ＋＋＋ｉｓ ）のアルファ・アミラ
ーゼ前駆体プラスミドｐＵＣ１３ＢＳＢＬとｐＢＳ４２
ＢＳＢＬの構築図３Ａに示したように、１）ＢＲ３２２
ＢＳ−ＢからのＤＮＡをＢａｍＨｌで消化し、１．８
ｋｂのフラグメント（フラグメントＡ）を単離した。プ
ラス ′ミドｐＢＲ３２２ＢＳ−３をＢａｍＨｌと５ａ
１１で二重消化し、１．８ ｋｂのフラグメント（フラ
グメントＢ）を単離した。プラスミドｐＢＲ３２２をＢ
ａｍＨｌとＳａｌ １で二重消化し、より大きいベクタ
ーフラグメント（フラグメントＣ）を単離した。フラグ
メントＡ、Ｂ、Ｃを連結した。その反応物を大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ） ２９４に形質転換した。
プラスミドｐＢＲ３２２ＢＳを含む１つのアンピリジン
耐性コロニーを単離した。このプラスミドをＨｉｎｄｌ
ｌで完全消化し、５ａ１１で部分消化し、４．２ｋｂの
フラグメント（フラグメントＤ）を単離した。ベクター
ｐＵｃ１３ （２６）をＨｉｎｄＩ［［と５ａ１１で消
化し、より大きいベクターフラグメント（フラグメント
Ｅ）を単離した。フラグメントＤ、！：Ｅを連結し、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ２９４に形質転換した。プラス
ミドｐＵｃ１３Ｂｓを含むアンピリジン耐性コロニーを
単離した。このコロニーは、ＬＢデンプン寒天プレート
上に透明なゾーンを作ることが分った。それゆえ、これ
はＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉ １ｕｓ）のアルファ・アミラーゼの全
遺伝子をそのプラスミド上に含むと仮定した。
耐性コロニーを単離した。このプラスミドをＨｉｎｄｌ
ｌで完全消化し、５ａ１１で部分消化し、４．２ｋｂの
フラグメント（フラグメントＤ）を単離した。ベクター
ｐＵｃ１３ （２６）をＨｉｎｄＩ［［と５ａ１１で消
化し、より大きいベクターフラグメント（フラグメント
Ｅ）を単離した。フラグメントＤ、！：Ｅを連結し、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ２９４に形質転換した。プラス
ミドｐＵｃ１３Ｂｓを含むアンピリジン耐性コロニーを
単離した。このコロニーは、ＬＢデンプン寒天プレート
上に透明なゾーンを作ることが分った。それゆえ、これ
はＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、Ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉ １ｕｓ）のアルファ・アミラーゼの全
遺伝子をそのプラスミド上に含むと仮定した。
図３Ｂに参照されるように、Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ
．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアルファ・アミラ
ーゼプラスミドｐＢＳ４２ＢＬを５ｓｔｌとＰｓｔＩで
切断し、そのより小さいフラグメント（フラグメントＦ
）を単離した。また、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のプラスミ
ドｐＵｃ１３Ｂｓを５ｓｔｌとＰｓｔｌで消化し、より
大きいベクターフラグメント（フラグメントＧ）を単離
した。フラグメントＦとＧを連結し、さらに大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｔ） ２９４に形質転換した。プラスミドｐ
Ｕｃ１３ＢｓＢＬを含む１つのアンピリジン耐性コロニ
ーを選択した。このコロニーは、ＬＢデンプン寒天プレ
ート上に透明なハローをつくれないことから活性のある
アルファ・アミラーゼを生産していない。この結果はｐ
ＵＣ１３ＢＳＢＬがＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、
Ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍαｐｈｉｌｕｓ）のアルファ
・アミラーゼ遺伝子のカルボキシル末端コドンとＢ、リ
チェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）
のアルファ・アミラーゼ遺伝子のアミノ末端コドンを欠
失していることから□ 予想される。さらに、後者の遺
伝子コドンは、前者遺伝子コドンと同じ読み枠ではない
。プラスミドｐＵｃ１３ＢｓＢＬをＢａｍＨｌで完全消
化し、ＥｃｏＲｌで部分消化し、フラグメントＨを単離
した。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）−枯草菌（１３，５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ ）シャトルベクターｐＢＳ４２をＢａｍＨ
ｌとＥｃｏＲｌで消化し、より大きいベクターフラグメ
ント（フラグメントＩ）を単離した。フラグメントＨと
Ｉを連結し、大腸菌（Ｅ、ｃｏ目）２９４に形質転換し
た。１つのクロラムフェニコール耐性形賃転換ｐＢＳ４
２ＢＳＢＬを得た。このコロニーは、ＬＢデンプン、寒
天プレート上でデンプンを透明化するハローをつくれな
いことから判るようにアルファ・アミラーゼを生成しな
い。このことは、このプラスミドがｐＵｃ１３ＢｓＢＬ
と同じアルファ・アミラーゼ配列をもつことから予想さ
れる。
．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアルファ・アミラ
ーゼプラスミドｐＢＳ４２ＢＬを５ｓｔｌとＰｓｔＩで
切断し、そのより小さいフラグメント（フラグメントＦ
）を単離した。また、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のプラスミ
ドｐＵｃ１３Ｂｓを５ｓｔｌとＰｓｔｌで消化し、より
大きいベクターフラグメント（フラグメントＧ）を単離
した。フラグメントＦとＧを連結し、さらに大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｔ） ２９４に形質転換した。プラスミドｐ
Ｕｃ１３ＢｓＢＬを含む１つのアンピリジン耐性コロニ
ーを選択した。このコロニーは、ＬＢデンプン寒天プレ
ート上に透明なハローをつくれないことから活性のある
アルファ・アミラーゼを生産していない。この結果はｐ
ＵＣ１３ＢＳＢＬがＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、
Ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍαｐｈｉｌｕｓ）のアルファ
・アミラーゼ遺伝子のカルボキシル末端コドンとＢ、リ
チェニホルミス（Ｂ、ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）
のアルファ・アミラーゼ遺伝子のアミノ末端コドンを欠
失していることから□ 予想される。さらに、後者の遺
伝子コドンは、前者遺伝子コドンと同じ読み枠ではない
。プラスミドｐＵｃ１３ＢｓＢＬをＢａｍＨｌで完全消
化し、ＥｃｏＲｌで部分消化し、フラグメントＨを単離
した。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）−枯草菌（１３，５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ ）シャトルベクターｐＢＳ４２をＢａｍＨ
ｌとＥｃｏＲｌで消化し、より大きいベクターフラグメ
ント（フラグメントＩ）を単離した。フラグメントＨと
Ｉを連結し、大腸菌（Ｅ、ｃｏ目）２９４に形質転換し
た。１つのクロラムフェニコール耐性形賃転換ｐＢＳ４
２ＢＳＢＬを得た。このコロニーは、ＬＢデンプン、寒
天プレート上でデンプンを透明化するハローをつくれな
いことから判るようにアルファ・アミラーゼを生成しな
い。このことは、このプラスミドがｐＵｃ１３ＢｓＢＬ
と同じアルファ・アミラーゼ配列をもつことから予想さ
れる。
Ｃ，ハイブリッド、アルファ・アミラーゼＤＮＡ配列の
生成と、それにコード化されたハイブリッド・タンパク
質の発現 １０ｎｇのプラスミドｐＢ３４２ＢＳＢＬを大腸菌（Ｅ
、 ｃｏｌｉ） ２９４ （シックＡプラス）に形質転
換するのに用いた。その反応物を１２．５μｇ／ｍｌの
クロラムフェニコールを補ったＬＢ−デンプンプレート
上にまいた。約３Ｘ１０’ケのコロニーが得られた。こ
れらのうちの６ケがデンプン加水分解によるハローを形
成した。これらのコロニーは、プラスミド中のＢ、ステ
アロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ ）とＢ、リチェーホルミス（Ｂ、 ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラーゼＤＮ
Ａ配列が活性のあるハイブリッド・ア −ルファ・アミ
ラーゼをコードするハイブリッドＤＮＡ配列が生ずるよ
うに相同的組み換えによって組み換えられているような
プラスミドを含むと考えられる。２つのアルファ・アミ
ラーゼ遺伝子フラグメント間の相同領域（組み換えが起
こると予想される）は約１．０ ｋｂである。これらの
データはそのような組み換えが起こる穎度が６／３×１
０４又は２１０−’であることを示している。
生成と、それにコード化されたハイブリッド・タンパク
質の発現 １０ｎｇのプラスミドｐＢ３４２ＢＳＢＬを大腸菌（Ｅ
、 ｃｏｌｉ） ２９４ （シックＡプラス）に形質転
換するのに用いた。その反応物を１２．５μｇ／ｍｌの
クロラムフェニコールを補ったＬＢ−デンプンプレート
上にまいた。約３Ｘ１０’ケのコロニーが得られた。こ
れらのうちの６ケがデンプン加水分解によるハローを形
成した。これらのコロニーは、プラスミド中のＢ、ステ
アロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ ）とＢ、リチェーホルミス（Ｂ、 ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラーゼＤＮ
Ａ配列が活性のあるハイブリッド・ア −ルファ・アミ
ラーゼをコードするハイブリッドＤＮＡ配列が生ずるよ
うに相同的組み換えによって組み換えられているような
プラスミドを含むと考えられる。２つのアルファ・アミ
ラーゼ遺伝子フラグメント間の相同領域（組み換えが起
こると予想される）は約１．０ ｋｂである。これらの
データはそのような組み換えが起こる穎度が６／３×１
０４又は２１０−’であることを示している。
実施例２
ｐＢ３４２ＢｓＢＬを含むコロニーのパンククランドを
減するために、ｐＢＳ４２ＢＳＢＬを形質転換した大腸
菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ２９４からのプラスミド調製
物を第２の形質転換前にＰｓｔｌで消化した。Ｂ、ステ
アロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ）とＢ、リチェニホルミス（Ｂ。
減するために、ｐＢＳ４２ＢＳＢＬを形質転換した大腸
菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ２９４からのプラスミド調製
物を第２の形質転換前にＰｓｔｌで消化した。Ｂ、ステ
アロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ）とＢ、リチェニホルミス（Ｂ。
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｎ＋ｉｓ）遺伝子フラグメント間
の組み換えが起こる全ての場合に、Ｐｓｔ１部位（プラ
スミド中の１ケ所切断）が欠失していることが証明され
る。このように、そのようなハイブリッド組み換えプラ
スミドはＰｓｔｌ消化に対し耐性であるが、一方、組み
換えられていないプラスミドはＰｓｔｌ消化により線状
化されよう。環状プラスミドの形質転換効率はそのよう
な線状型のものよりも１００から１０００倍大きい。そ
れゆえ、形質転換前にＰｓＬｌでｐＢＳ４２ＢＳＢＬを
消化すると、組み換えしていないプラスミドを含むコロ
ニーに対し、組み換えをおこしてるものを含むものの比
率を増加することが予定される。このように、ｐＢ３４
２ＢＳＢＬで形質転換した大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ）
２９４からのＰｓｔｌ処理したプラスミド調製物１１０
００ｎが二度目の大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ２９４へ
の形質転換に用いられた。２０３２ケのコロニーが得ら
れた。そのうちの５１７ケ（約２５％）は、活性ハイブ
リッドアルファ・アミラーゼの合成を示す、ＬＢデンプ
ン寒天プレート上でのデンプン加水分解によるハローを
つくった。
の組み換えが起こる全ての場合に、Ｐｓｔ１部位（プラ
スミド中の１ケ所切断）が欠失していることが証明され
る。このように、そのようなハイブリッド組み換えプラ
スミドはＰｓｔｌ消化に対し耐性であるが、一方、組み
換えられていないプラスミドはＰｓｔｌ消化により線状
化されよう。環状プラスミドの形質転換効率はそのよう
な線状型のものよりも１００から１０００倍大きい。そ
れゆえ、形質転換前にＰｓＬｌでｐＢＳ４２ＢＳＢＬを
消化すると、組み換えしていないプラスミドを含むコロ
ニーに対し、組み換えをおこしてるものを含むものの比
率を増加することが予定される。このように、ｐＢ３４
２ＢＳＢＬで形質転換した大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ）
２９４からのＰｓｔｌ処理したプラスミド調製物１１０
００ｎが二度目の大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ２９４へ
の形質転換に用いられた。２０３２ケのコロニーが得ら
れた。そのうちの５１７ケ（約２５％）は、活性ハイブ
リッドアルファ・アミラーゼの合成を示す、ＬＢデンプ
ン寒天プレート上でのデンプン加水分解によるハローを
つくった。
実施例３
Ａ、アルファ・アミラーゼを生成する大腸菌（Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ） ２９４のｐＢｓ４２ＢｓＢＬ形質転換体中に
含まれるハイブリッドＤＮＡ配列の特性化 ａｎｙ ”コロニーは、その配列が相同的な領域での、
Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ５ｔｅａｒｏ −
ｔｈｅｒ＋ｗｏｐｈｉｌｕｓ）とＢ、リチェニホルミス
（Ｂ。
ｏｌｉ） ２９４のｐＢｓ４２ＢｓＢＬ形質転換体中に
含まれるハイブリッドＤＮＡ配列の特性化 ａｎｙ ”コロニーは、その配列が相同的な領域での、
Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ５ｔｅａｒｏ −
ｔｈｅｒ＋ｗｏｐｈｉｌｕｓ）とＢ、リチェニホルミス
（Ｂ。
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子フラグメント間で
の単一交叉現象がｐＢＳ４２ＢＳＢＬプラスミド内で起
こった結果生じたものであると仮定した。そのような組
み換え遺伝子はＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）の遺伝子由来の
５′配列とＢ、リチェニホルミス（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子由来の３′配列を含んでいるこ
とが理解されよう。この記述が正しいことを示すために
、次のような実験を行った。約１５０ｂｐの間隔をもっ
た１６〜１８ヌクレオチドの相同性の低い領域を選び出
す。それらの領域中のＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、 ５ｔｅａｒｏｔｈｅｒｓ＋ｏｐｈｉｌｕｓ ）の意
味をもつ鎖に対応する、図２Ａ及び２Ｂ中のプローブ１
〜９として示したオリゴヌクレオチドを合成した（１１
）。これらのオリゴヌクレオチドをＴ３２ｐ−ＡＴＰと
Ｔ４オリゴヌクレオチド・キナーゼでラベルし、Ｂ、ス
テアロサーモフィラス（Ｂ。
の単一交叉現象がｐＢＳ４２ＢＳＢＬプラスミド内で起
こった結果生じたものであると仮定した。そのような組
み換え遺伝子はＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）の遺伝子由来の
５′配列とＢ、リチェニホルミス（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ）遺伝子由来の３′配列を含んでいるこ
とが理解されよう。この記述が正しいことを示すために
、次のような実験を行った。約１５０ｂｐの間隔をもっ
た１６〜１８ヌクレオチドの相同性の低い領域を選び出
す。それらの領域中のＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、 ５ｔｅａｒｏｔｈｅｒｓ＋ｏｐｈｉｌｕｓ ）の意
味をもつ鎖に対応する、図２Ａ及び２Ｂ中のプローブ１
〜９として示したオリゴヌクレオチドを合成した（１１
）。これらのオリゴヌクレオチドをＴ３２ｐ−ＡＴＰと
Ｔ４オリゴヌクレオチド・キナーゼでラベルし、Ｂ、ス
テアロサーモフィラス（Ｂ。
５ｔｅａｒｏｔｈｅｒｎ＋ｏｐｈｉｌｕｓ ）の配列を
検出するハイブリダイゼーションプローブを作った。交
叉部位の５′側の全ての配列がＢ、ステアロサーモフィ
ラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
）由来のものであり、それゆえ、対応する（完全に相同
的）オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイスする
ことが理解できよう。交叉部位の３′側の配列はＢ、リ
チェニホルミス（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）
の遺伝子由来のものであり、それゆえ、つかわれた条件
下では、対応する（相同性が低い）オリゴヌクレオチド
プローブにハイブリダイズすることはできない。
検出するハイブリダイゼーションプローブを作った。交
叉部位の５′側の全ての配列がＢ、ステアロサーモフィ
ラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
）由来のものであり、それゆえ、対応する（完全に相同
的）オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイスする
ことが理解できよう。交叉部位の３′側の配列はＢ、リ
チェニホルミス（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）
の遺伝子由来のものであり、それゆえ、つかわれた条件
下では、対応する（相同性が低い）オリゴヌクレオチド
プローブにハイブリダイズすることはできない。
ｐＵｃ１３Ｂｓ、ｐＢｓ４２ＢＬ、及びｐＢ３４２ＢＳ
ＢＬを含むコロニーと同様に、組み換えハイブリッドア
ルファ・アミラーゼＤＮＡ配列を含むと仮定される１２
ケのａｍｙ ”コロニーを各々のオリゴヌクレオチドプ
ローブとのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによ
り選択した。これらのコロニーの全てヲ各々、９ケのニ
トロセルロース濾紙小片上でインキュベートした。これ
らの小片をＬＢ寒天プレート上に置き、そのプレートを
コロニー生長のため３７℃で一晩インキユベートした。
ＢＬを含むコロニーと同様に、組み換えハイブリッドア
ルファ・アミラーゼＤＮＡ配列を含むと仮定される１２
ケのａｍｙ ”コロニーを各々のオリゴヌクレオチドプ
ローブとのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによ
り選択した。これらのコロニーの全てヲ各々、９ケのニ
トロセルロース濾紙小片上でインキュベートした。これ
らの小片をＬＢ寒天プレート上に置き、そのプレートを
コロニー生長のため３７℃で一晩インキユベートした。
さらにその濾紙を標準法による（２７）ハイブリダイゼ
ーションに供した。各々の容器中、９ケの小片を低スト
リンジェント・ハイブリダイゼーションのための標準法
を使って各オリゴヌクレオチドプローブとインキュベー
トした。（２）その濾紙を３７℃で２ ｘＳＳＣと０．
１％ＳＤＳで洗浄し、さらに空気乾燥してオートラジオ
グラフをとった。その結果を表１に示した。
ーションに供した。各々の容器中、９ケの小片を低スト
リンジェント・ハイブリダイゼーションのための標準法
を使って各オリゴヌクレオチドプローブとインキュベー
トした。（２）その濾紙を３７℃で２ ｘＳＳＣと０．
１％ＳＤＳで洗浄し、さらに空気乾燥してオートラジオ
グラフをとった。その結果を表１に示した。
オリゴヌクレオチ
ハイブリッド １２３４５
１ ↓ −−−一
２ 十−−−−３＋−−−
− ４＋−−−− ５士 ＋ ＋＋＋ ６ ＋＋＋−− ７＋＋＋−− ３＋＋＋−− ９＋＋＋＋− Ｄ ＋＋＋＋＋ Ｅ ＋＋＋＋＋ １１ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
Ｆ ＋＋＋＋＋ Ｇ ＋＋＋＋＋ ｐＢｓ４２ＢＬ −−−−− ｐＨＣ１３ＢＳ ＋ ＋ ＋ ＋ 十ｐＢｓ４２Ｂｓ
ＢＬ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ドブロ
ーブに対する応答 Ｂ、ステアロサーモフィラス のアルファ・アミラーゼ ６ ７ ８ ９ 遺伝子中の交叉品位−−−−３２〜
１５４ − − − − ３２ 〜１５４−
− − − ３２ 〜１５４−−−−．３
２ 〜１５４ − − − − ６１２ 〜７４６−
− − − ３１’Ｅ 〜 ４５０−
− − − ３１８ 〜４５０− − −
− ３１８ 〜４５０− − − −
４６７ 〜５９５＋ −−−７６７〜 ９
１２ ＋ −−−７６７〜 ９１２ − − − − ６１２ 〜７４６＋
＋ ＋ −１０６７〜１１９７＋ ＋
＋ −１０６７〜１１９７＋＋＋＋ ＋＋＋− 予想されるように、全てのプローブはＢ、ステア ０ザ
ーモフイラス（３，ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ ）の配列にはハイブリダイズするが、Ｂ、ｌＪチ
ェニホルミス（Ｂ、 ］１ｃｈｅｎｉｆｏｒ＋ｎｉｓ
ンの配列にはハイブリダイズしない。このことはＢ、ス
テアロサーモフィラス（Ｂ、５ｔｅａｒｏｔ、ｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ）のアルファ・アミラーゼの全遺伝子
を含むｐＵｃ１３Ｂｓを有する細胞からのＤＮＡに対し
、全プローブが正のハイブリダイゼーションの信号を与
えるが、Ｂ。
− ４＋−−−− ５士 ＋ ＋＋＋ ６ ＋＋＋−− ７＋＋＋−− ３＋＋＋−− ９＋＋＋＋− Ｄ ＋＋＋＋＋ Ｅ ＋＋＋＋＋ １１ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
Ｆ ＋＋＋＋＋ Ｇ ＋＋＋＋＋ ｐＢｓ４２ＢＬ −−−−− ｐＨＣ１３ＢＳ ＋ ＋ ＋ ＋ 十ｐＢｓ４２Ｂｓ
ＢＬ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ドブロ
ーブに対する応答 Ｂ、ステアロサーモフィラス のアルファ・アミラーゼ ６ ７ ８ ９ 遺伝子中の交叉品位−−−−３２〜
１５４ − − − − ３２ 〜１５４−
− − − ３２ 〜１５４−−−−．３
２ 〜１５４ − − − − ６１２ 〜７４６−
− − − ３１’Ｅ 〜 ４５０−
− − − ３１８ 〜４５０− − −
− ３１８ 〜４５０− − − −
４６７ 〜５９５＋ −−−７６７〜 ９
１２ ＋ −−−７６７〜 ９１２ − − − − ６１２ 〜７４６＋
＋ ＋ −１０６７〜１１９７＋ ＋
＋ −１０６７〜１１９７＋＋＋＋ ＋＋＋− 予想されるように、全てのプローブはＢ、ステア ０ザ
ーモフイラス（３，ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ ）の配列にはハイブリダイズするが、Ｂ、ｌＪチ
ェニホルミス（Ｂ、 ］１ｃｈｅｎｉｆｏｒ＋ｎｉｓ
ンの配列にはハイブリダイズしない。このことはＢ、ス
テアロサーモフィラス（Ｂ、５ｔｅａｒｏｔ、ｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ）のアルファ・アミラーゼの全遺伝子
を含むｐＵｃ１３Ｂｓを有する細胞からのＤＮＡに対し
、全プローブが正のハイブリダイゼーションの信号を与
えるが、Ｂ。
ステアロサーモフィラス（Ｅｌ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の遺伝子からの配列は含まないが
Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ）の全アルファ・アミラーゼの全遺伝子を含むｐ
ＢＳ４２ＢＬを有する細胞からのＤＮＡに対しては負の
ハイブリダイゼーションの信号を与えることから示され
る。
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の遺伝子からの配列は含まないが
Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ）の全アルファ・アミラーゼの全遺伝子を含むｐ
ＢＳ４２ＢＬを有する細胞からのＤＮＡに対しては負の
ハイブリダイゼーションの信号を与えることから示され
る。
ｐＢＳ４２ＢＬを含む細胞からのＤＮＡはプローブ９以
外の全てについて正の信号を与えるが、これはプローブ
９がこのプラスミド中に存在するＢ。
外の全てについて正の信号を与えるが、これはプローブ
９がこのプラスミド中に存在するＢ。
ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）の３′側の領域に対応しているため
である。
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）の３′側の領域に対応しているため
である。
１４ケの推定されるハイブリッドは種々のハイブリダイ
ゼーションの型を示している。たとえば、ハイブリッド
１．２．３及び４はプローブ１にハイブリダイズするが
他のプローブ（より３′側の）にはハイブリダイズしな
い。これはプローブ１と２に対応する配列の間での交叉
を示している。他の側では、ハイブリッド９はプローブ
１〜４にはハイブリダイズするが、より３′側のプロー
ブ５〜９にはハイブリダイズしない。これはプローブ４
と５に対応する配列の間での交叉を示している。
ゼーションの型を示している。たとえば、ハイブリッド
１．２．３及び４はプローブ１にハイブリダイズするが
他のプローブ（より３′側の）にはハイブリダイズしな
い。これはプローブ１と２に対応する配列の間での交叉
を示している。他の側では、ハイブリッド９はプローブ
１〜４にはハイブリダイズするが、より３′側のプロー
ブ５〜９にはハイブリダイズしない。これはプローブ４
と５に対応する配列の間での交叉を示している。
表１に示されているように、その他の交叉領域も同様に
残りのハイブリッドの中で同定されている。
残りのハイブリッドの中で同定されている。
他の実験において（示されていないが）、効率には非常
にバラツキがあるがいかなるプローブ領域の間にも交叉
をもつハイブリッドがみつかっている。例えばプローブ
１と２の間での交叉は非常に一般的（約２０％）ではあ
るが、一方プローブ領域２と３の間での交叉は全（稀で
ある（約１％）。
にバラツキがあるがいかなるプローブ領域の間にも交叉
をもつハイブリッドがみつかっている。例えばプローブ
１と２の間での交叉は非常に一般的（約２０％）ではあ
るが、一方プローブ領域２と３の間での交叉は全（稀で
ある（約１％）。
上の結果は、アルファ・アミラーゼ遺伝子フラグメント
の間での交叉は２つの遺伝子間のおよそ１．０ｋｂの相
同的領域に渡って広く分散していることを示している。
の間での交叉は２つの遺伝子間のおよそ１．０ｋｂの相
同的領域に渡って広く分散していることを示している。
しかし、より詳細にこの分布を研究することは興味深い
。このように、我々は、グイデオキシ・チェーン・ター
ミネーション法（２８）を用いて、水酸化ナトリウムで
破壊したプラスミドを直接配列決定により、それらの交
叉領域中のハイブリッド遺伝子のＤＮＡ配列を決定した
。所定のハイブリッドに対して、そのハイブリ・７ドに
ハイブリダイズする３′側の合成オリゴヌクレオチドを
用いて合成を開始した。１２のハイブリッドに対する交
叉部位を図２Ａと２Ｂの点描したボックス中に示した。
。このように、我々は、グイデオキシ・チェーン・ター
ミネーション法（２８）を用いて、水酸化ナトリウムで
破壊したプラスミドを直接配列決定により、それらの交
叉領域中のハイブリッド遺伝子のＤＮＡ配列を決定した
。所定のハイブリッドに対して、そのハイブリ・７ドに
ハイブリダイズする３′側の合成オリゴヌクレオチドを
用いて合成を開始した。１２のハイブリッドに対する交
叉部位を図２Ａと２Ｂの点描したボックス中に示した。
たとえば、ハイブリッド９ （図２Ａ）においては、こ
の領域のＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）の５′側由来の配列
と、この領域のＢ、リチェニホルミス（Ｂ、 Ｉｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の３′側の配列の存在により示さ
れるように、交叉はｂｐ５８５とｂｐ６００の間で走っ
ている。
の領域のＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）の５′側由来の配列
と、この領域のＢ、リチェニホルミス（Ｂ、 Ｉｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の３′側の配列の存在により示さ
れるように、交叉はｂｐ５８５とｂｐ６００の間で走っ
ている。
Ｂ、プラスミドハイブリッド４．６及びＤにより生成す
るハイブリッド・アルファ・アミラーゼ酵素の解析 ｐＢＳ４２ＢＬもしくはプラスミドハイブリッド４．６
又はＤを含む大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ２９４ｍ胞
ヲ１２．５μｇ ／ ｍ Ｅのクロラムフェニコールを
補ったＬＢ培地を含む振とうフラスコ（１２゜ｒｐｍ
）中で１晩培養した。プラスミドｐＵｃ１３ＢＳを含む
大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ２９４を、クロラムフェ
ニコールではなく５０μｇ ／ ｍ １のカルベニシリ
ンをＬＢ培地に添加する以外は同様に培養した。遠心に
より集菌し、浸透圧ショック法（２９）により、細胞質
及びペリブラスマ成分に分画した。
るハイブリッド・アルファ・アミラーゼ酵素の解析 ｐＢＳ４２ＢＬもしくはプラスミドハイブリッド４．６
又はＤを含む大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ２９４ｍ胞
ヲ１２．５μｇ ／ ｍ Ｅのクロラムフェニコールを
補ったＬＢ培地を含む振とうフラスコ（１２゜ｒｐｍ
）中で１晩培養した。プラスミドｐＵｃ１３ＢＳを含む
大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ２９４を、クロラムフェ
ニコールではなく５０μｇ ／ ｍ １のカルベニシリ
ンをＬＢ培地に添加する以外は同様に培養した。遠心に
より集菌し、浸透圧ショック法（２９）により、細胞質
及びペリブラスマ成分に分画した。
これらのフラクションをデンプン加水分解を測定するミ
クローフェダパス（ｍｉｃｒｏ−Ｐｈａｅｄａｂａｓ
）検定法（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） 、
ビスカタウエイ （Ｐｉｓｃａｔａｔｍａｙ） Ｎ Ｊ
）により、アルファ・アミラーゼを検定した。全ての
場合において、活性の大部分く８０〜８５％）はべりプ
ラズマ画分中にみられる。このようにこの両分は５ケの
培養中で生成したアルファ・アミラーゼの精製に使用し
た。
クローフェダパス（ｍｉｃｒｏ−Ｐｈａｅｄａｂａｓ
）検定法（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ） 、
ビスカタウエイ （Ｐｉｓｃａｔａｔｍａｙ） Ｎ Ｊ
）により、アルファ・アミラーゼを検定した。全ての
場合において、活性の大部分く８０〜８５％）はべりプ
ラズマ画分中にみられる。このようにこの両分は５ケの
培養中で生成したアルファ・アミラーゼの精製に使用し
た。
この酵素を精製するために、アルファ・アミラーゼをデ
ンプンに結合させるために、４℃で、不溶性デンプンを
含むカラムに、ペリプラズマ画分を注いだ。そして、温
度を５０℃まで上昇させなからカラムから酵素を流出し
た。デンプンをＰ−２カラム（バイオ・ラッド・ラボラ
トリ−（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｖａｔｏｒｉｅｓ）
、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ）、ＣＡ）での
ゲル浸透クロマトグラフィーと次のＤＥＡＥクロマトグ
ラフィーにより、酵素から除いた。（３０）各精製アル
ファ・アミラーゼはＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの
その均一性によって純粋であると判断した。各精製タン
パク質のタンパク濃度はブラッドフォードの色素結合法
により決定した。（３１） その精製アルファ・アミラーゼの熱安定性は次のように
測定した。等濃度の酵素を９０℃でインキニベートした
。種々の時間にその一部をとり、ミクローフエダバス（
ｍｉｃｒｏ−Ｐｈａｅｄａｂａｓ ）法により、７０℃
でのアルファ・アミラーゼ活性を検定した。その結果を
図５に示した。ｐＢＳ４２ＢＬプラスミドから生成した
親Ｂ、リチヱニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ）酵素は、９０°Ｃで延長したインキュベーショ
ン（１２０分）時間ののちも、その全活性を基本的に保
持しているが、一方、プラスミドｐＵｃ１３Ｂｓから生
成した親日。ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）酵素はその条件下で
約５０％の活性を失なう。ハイブリッド４．６及びＤの
ハイブリッドＤＮＡ配列によりコードされている。ハイ
ブリッド酵素は種々の熱安定性を示す。ハイブリッド４
は９０℃で１２０分後でも基本的にその全活性を保持し
ている。図６に示したように、このタンパク質は最初の
１５ケのアミノ酸がＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）の遺伝子
によりコードされているアミノ末端部分以外、Ｂ、リチ
ェニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の
酵素と構造的に一敗している。そのハイブリッド４タン
パク質と、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅ
ａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）タンパク質とのこ
の強い類似性が熱失活に対する同様な耐性を説明づける
。これに対し、ハイブリッド４タンパク質は、９０℃、
１２０分のインキュベーション後には僅か１０％の活性
しか保持していない。このポリペプチドは、その全アミ
ノ末端半分がほぼＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）遺伝子によ
りコードされ、一方、カルボキシル末端半分はＢ。
ンプンに結合させるために、４℃で、不溶性デンプンを
含むカラムに、ペリプラズマ画分を注いだ。そして、温
度を５０℃まで上昇させなからカラムから酵素を流出し
た。デンプンをＰ−２カラム（バイオ・ラッド・ラボラ
トリ−（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｖａｔｏｒｉｅｓ）
、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ）、ＣＡ）での
ゲル浸透クロマトグラフィーと次のＤＥＡＥクロマトグ
ラフィーにより、酵素から除いた。（３０）各精製アル
ファ・アミラーゼはＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの
その均一性によって純粋であると判断した。各精製タン
パク質のタンパク濃度はブラッドフォードの色素結合法
により決定した。（３１） その精製アルファ・アミラーゼの熱安定性は次のように
測定した。等濃度の酵素を９０℃でインキニベートした
。種々の時間にその一部をとり、ミクローフエダバス（
ｍｉｃｒｏ−Ｐｈａｅｄａｂａｓ ）法により、７０℃
でのアルファ・アミラーゼ活性を検定した。その結果を
図５に示した。ｐＢＳ４２ＢＬプラスミドから生成した
親Ｂ、リチヱニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ）酵素は、９０°Ｃで延長したインキュベーショ
ン（１２０分）時間ののちも、その全活性を基本的に保
持しているが、一方、プラスミドｐＵｃ１３Ｂｓから生
成した親日。ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）酵素はその条件下で
約５０％の活性を失なう。ハイブリッド４．６及びＤの
ハイブリッドＤＮＡ配列によりコードされている。ハイ
ブリッド酵素は種々の熱安定性を示す。ハイブリッド４
は９０℃で１２０分後でも基本的にその全活性を保持し
ている。図６に示したように、このタンパク質は最初の
１５ケのアミノ酸がＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）の遺伝子
によりコードされているアミノ末端部分以外、Ｂ、リチ
ェニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の
酵素と構造的に一敗している。そのハイブリッド４タン
パク質と、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅ
ａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）タンパク質とのこ
の強い類似性が熱失活に対する同様な耐性を説明づける
。これに対し、ハイブリッド４タンパク質は、９０℃、
１２０分のインキュベーション後には僅か１０％の活性
しか保持していない。このポリペプチドは、その全アミ
ノ末端半分がほぼＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）遺伝子によ
りコードされ、一方、カルボキシル末端半分はＢ。
リチェニホルミス（Ｂ、 ｌｔｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
）の遺伝子由来のＤＮＡによりコードされていること（
図６を参照）において非常にキメラ的である。ハイブリ
ッド４タンパク質の熱安定性は各組タンパクのそれより
も劣ることから、アルファ・アミラーゼのアミノ末端及
びカルボキシル末端半分の間の相互作用が熱安定性に対
し要求され、ハイブリッドタンパク質の中ではこの相互
作用が修正されるらしい。ハイブリッド６由来のタンパ
ク質は９０℃で１２０分のインキュベーション後、その
約半分の活性を保持しており、それゆえ、親のＢ、ステ
アロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ ）の酵素と同様の熱安定性を有している
。ハイブリッド６タンパク質は、主としてＢ、リチェニ
ホルミス（８，ｌ１ｃｈｅｎｉｆｏｒ＋ｎ１ｓ）遺伝子
によりコードされる残基を含んでいるが、アミノ末端・
７３残基はＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）由来のものである（
図６参照）。この異質アミノ末端は、親のＢ、リチェニ
ホルミス（Ｂ。
）の遺伝子由来のＤＮＡによりコードされていること（
図６を参照）において非常にキメラ的である。ハイブリ
ッド４タンパク質の熱安定性は各組タンパクのそれより
も劣ることから、アルファ・アミラーゼのアミノ末端及
びカルボキシル末端半分の間の相互作用が熱安定性に対
し要求され、ハイブリッドタンパク質の中ではこの相互
作用が修正されるらしい。ハイブリッド６由来のタンパ
ク質は９０℃で１２０分のインキュベーション後、その
約半分の活性を保持しており、それゆえ、親のＢ、ステ
アロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ ）の酵素と同様の熱安定性を有している
。ハイブリッド６タンパク質は、主としてＢ、リチェニ
ホルミス（８，ｌ１ｃｈｅｎｉｆｏｒ＋ｎ１ｓ）遺伝子
によりコードされる残基を含んでいるが、アミノ末端・
７３残基はＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）由来のものである（
図６参照）。この異質アミノ末端は、親のＢ、リチェニ
ホルミス（Ｂ。
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）の酵素と比較して、そ
の減する安定性に寄与しそうなタンパク質構造への僅か
な不安定化効果を有しているらしい。この結果は、ハイ
ブリッドアルファ・アミラーゼが、その親酵素の熱安定
性と同じか又は異なるかという熱安定性の範囲を示すと
考えることができることを示している。
の減する安定性に寄与しそうなタンパク質構造への僅か
な不安定化効果を有しているらしい。この結果は、ハイ
ブリッドアルファ・アミラーゼが、その親酵素の熱安定
性と同じか又は異なるかという熱安定性の範囲を示すと
考えることができることを示している。
親アルファ・アミラーゼと上記の精製ハイブリッドアル
ファ・アミラーゼの比活性も４つの異なる温度で測定し
た。これらのデータを図７に示した。親日。ステアロサ
ーモフィラス（Ｂ、ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ）酵素は全ての温度で高い比活性を有している
、一方、親Ｂ、ｌＪチェニホルミス（Ｂ。
ファ・アミラーゼの比活性も４つの異なる温度で測定し
た。これらのデータを図７に示した。親日。ステアロサ
ーモフィラス（Ｂ、ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ）酵素は全ての温度で高い比活性を有している
、一方、親Ｂ、ｌＪチェニホルミス（Ｂ。
１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）酵素は全ての温度にお
いて非常に活性が低い。上記のように、ハイブリッド４
と６は、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａ
ｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の遺伝子由来の短か
い範囲のアミノ酸残基のみを含んでおり、その比活性プ
ロフィールはＢ、リチェニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ）酵素と非常に類似している。しかし
、ハイブリッドアルカリ・アミラーゼはその親酵素の中
間の比活性を有している。７０℃に比して、９０℃での
この酵素の活性の明確な減少は、主に上記のような９０
℃での著しい不安定性によるらしい。これらのデータは
ハイブリッド・アルファ・アミラーゼが種々の比活性を
有することを示している。
いて非常に活性が低い。上記のように、ハイブリッド４
と６は、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａ
ｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の遺伝子由来の短か
い範囲のアミノ酸残基のみを含んでおり、その比活性プ
ロフィールはＢ、リチェニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ）酵素と非常に類似している。しかし
、ハイブリッドアルカリ・アミラーゼはその親酵素の中
間の比活性を有している。７０℃に比して、９０℃での
この酵素の活性の明確な減少は、主に上記のような９０
℃での著しい不安定性によるらしい。これらのデータは
ハイブリッド・アルファ・アミラーゼが種々の比活性を
有することを示している。
実施例４
もう１つの好ましい具体例においては、枯草菌（Ｂ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ ）とＢ．アミロリクエファシエンス
（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の
ハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼを生成した。１
つ以上の１力所切断制限部位を含む合成オリゴヌクレオ
チド配列を枯草菌（Ｉｌ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）とＢ
．アミロリクエファシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のアルカリ・プロテアーゼをコー
ドするＤＮＡ配列を連結するのに用いた。レソク・プラ
ス微生物中での組み換えの後、各々の１力所切断制限部
位に特異的なエンドヌクレアーゼでベクターを処理する
ことにより、非組み換えベクターによるバンクグランド
形質転換を減させた。
５ｕｂｔｉｌｉｓ ）とＢ．アミロリクエファシエンス
（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の
ハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼを生成した。１
つ以上の１力所切断制限部位を含む合成オリゴヌクレオ
チド配列を枯草菌（Ｉｌ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）とＢ
．アミロリクエファシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のアルカリ・プロテアーゼをコー
ドするＤＮＡ配列を連結するのに用いた。レソク・プラ
ス微生物中での組み換えの後、各々の１力所切断制限部
位に特異的なエンドヌクレアーゼでベクターを処理する
ことにより、非組み換えベクターによるバンクグランド
形質転換を減させた。
Ａ、枯草菌（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）−Ｂ．アミロ
リクエファシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）アルカリ・プロテアーゼ前駆体プラスミド
ｐＢ３４２ＢＳＢＡの構築 図４に記しであるように、枯草菌（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ）アルカリ・プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミド
ｐ３１６８．１（４４，３２）をＥｃｏＲｌとＮｃｏｌ
で消化した。より小さいフラグメント（フラグメントＡ
）を単離した。全てのＢ．アミロリクエファシエンス（
Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） ・ア
ルカリ・プロテアーゼ遺伝子を含んでいるプラスミドｐ
Ｓ４−５ （４４，３３）をＥｃｏＲｌとＡｖａｌで消
化した。より大きいベクターフラグメント（フラグメン
トＢ）を単離した。ＮｃｏｌとＡｖａｌの粘着末端と、
それら末端間にＰｓｔｌ、５ａｉｌ及びＫｐｎ１部位を
含む２つの相補的な合成オリゴヌクレオチドを、９５℃
に加熱したのち２３℃に冷却することによってアニール
しフラグメントＣを形成した。フラグメンｌ−Ａ、Ｂ及
びＣを連結し、この連結したベクターを大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ） ２９４を形質転換するのに用いた。プラ
スミドｐＢ３４２ＢＳＢＡを含むクロラムフェニコール
耐性コロニーを確保した。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ ）株ＢＧ２０３６ （４４）は染色体アルカリプロ
テアーゼと中性プロテアーゼ遺伝子を欠失している。０
．１％のスキムミルクを含むＬＢプレート上で透明なハ
ローを作れないことから分るように菌株ＢＧ２０３６は
ｐＢＳ４２ＢＳＢＡで形質転換されてもプロテアーゼを
生成しない。この結果は、そのプラスミドが、枯草菌（
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）のアルカリプロテアーゼ遺
伝子のカルボキシル末端コドンとＢ．アミロリクエファ
シエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ−ｆａｃｉｅｎ
ｓ ）のアルカリプロテアーゼ遺伝子のアミノ末端コド
ンを欠いていることから予想された。
リクエファシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）アルカリ・プロテアーゼ前駆体プラスミド
ｐＢ３４２ＢＳＢＡの構築 図４に記しであるように、枯草菌（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌ
ｉｓ）アルカリ・プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミド
ｐ３１６８．１（４４，３２）をＥｃｏＲｌとＮｃｏｌ
で消化した。より小さいフラグメント（フラグメントＡ
）を単離した。全てのＢ．アミロリクエファシエンス（
Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） ・ア
ルカリ・プロテアーゼ遺伝子を含んでいるプラスミドｐ
Ｓ４−５ （４４，３３）をＥｃｏＲｌとＡｖａｌで消
化した。より大きいベクターフラグメント（フラグメン
トＢ）を単離した。ＮｃｏｌとＡｖａｌの粘着末端と、
それら末端間にＰｓｔｌ、５ａｉｌ及びＫｐｎ１部位を
含む２つの相補的な合成オリゴヌクレオチドを、９５℃
に加熱したのち２３℃に冷却することによってアニール
しフラグメントＣを形成した。フラグメンｌ−Ａ、Ｂ及
びＣを連結し、この連結したベクターを大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ） ２９４を形質転換するのに用いた。プラ
スミドｐＢ３４２ＢＳＢＡを含むクロラムフェニコール
耐性コロニーを確保した。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ ）株ＢＧ２０３６ （４４）は染色体アルカリプロ
テアーゼと中性プロテアーゼ遺伝子を欠失している。０
．１％のスキムミルクを含むＬＢプレート上で透明なハ
ローを作れないことから分るように菌株ＢＧ２０３６は
ｐＢＳ４２ＢＳＢＡで形質転換されてもプロテアーゼを
生成しない。この結果は、そのプラスミドが、枯草菌（
Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）のアルカリプロテアーゼ遺
伝子のカルボキシル末端コドンとＢ．アミロリクエファ
シエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ−ｆａｃｉｅｎ
ｓ ）のアルカリプロテアーゼ遺伝子のアミノ末端コド
ンを欠いていることから予想された。
さらに、後者遺伝子のコドンは前者遺伝子のコドンとそ
の読み枠が同じではない。これに対して、プラスミドｐ
３１６８．１又はｐＳ４−５を含む枯草菌（Ｂ、 ５
ｕｂｔｉｌｉｓ ）株・ＢＧ２０３６はＬＢ−スキムミ
ルク寒天プレート上に透明なハローを生成することによ
り分るように活性のあるアルカリ・プロテアーゼを生成
する。この結果は、これら２つのプラスミドが完全なア
ルカリ・プロテアーゼ遺伝子を含有することから予想さ
れることであった。ここで、ｐ Ｓ ｌ ６８．１、ｐ
Ｓ４−５又はｐＢ３４２ＢＳＢＡで形質転換した大腸菌
（Ｅ。
の読み枠が同じではない。これに対して、プラスミドｐ
３１６８．１又はｐＳ４−５を含む枯草菌（Ｂ、 ５
ｕｂｔｉｌｉｓ ）株・ＢＧ２０３６はＬＢ−スキムミ
ルク寒天プレート上に透明なハローを生成することによ
り分るように活性のあるアルカリ・プロテアーゼを生成
する。この結果は、これら２つのプラスミドが完全なア
ルカリ・プロテアーゼ遺伝子を含有することから予想さ
れることであった。ここで、ｐ Ｓ ｌ ６８．１、ｐ
Ｓ４−５又はｐＢ３４２ＢＳＢＡで形質転換した大腸菌
（Ｅ。
ｃｏｌｉ） ２９４は、ＬＢスキムミルク寒天プレート
上でハロー生成ができないことから分るようにアルカリ
・プロテアーゼを生成しないことに注目すべきである。
上でハロー生成ができないことから分るようにアルカリ
・プロテアーゼを生成しないことに注目すべきである。
このことは、他にも説明がつくかもしれないが、バチル
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のアルカリ・プロテアーゼプロモ
ーターが大腸ｍ （Ｅ、ｃｏｌｉ）中 −では
活性をもたないことを示しているのかもしれない。
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のアルカリ・プロテアーゼプロモ
ーターが大腸ｍ （Ｅ、ｃｏｌｉ）中 −では
活性をもたないことを示しているのかもしれない。
Ｂ、ハイブリッドアルカリ・プロテアーゼＤＮＡ配列の
生成とハイブリッドタンパク質の発現ｌｏｇのプラスミ
ドｐＢＳ４２ＢＳＢＡを大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ２
９４を形質転換するのに用いた。
生成とハイブリッドタンパク質の発現ｌｏｇのプラスミ
ドｐＢＳ４２ＢＳＢＡを大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ２
９４を形質転換するのに用いた。
この反応物をＬＢジクロムフェニコール寒天プレート上
にまき、約２Ｘ１０”ケのコロニーを得た。
にまき、約２Ｘ１０”ケのコロニーを得た。
アルファ・アミラーゼの場合と違って、アルカリプロテ
アーゼは完全な遺伝子からでさえ大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌ
ｔ）中では発現されない。プラスミド上に存在する枯草
菌（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）とＢ．アミロリクエフ
ァシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）の約１ｋｂのアルカリプロテアーゼ遺伝子フラグメ
ントを含む相同的領域の間で組み換えが起っているかど
うかを決めるために、ハイブリダイゼーション技術を用
いることが必要となる。このハイブリダイゼーション実
験において、その形質転換体中に含まれるプラスミド中
にフラグメントＣが存在するかどうかをテストした。そ
のＤＮＡ配列間での組み換えがすべての場合に起こって
いるならば、フラグメントＣを含む配列は欠失している
だろうし、一方、組み換えを起こしていないプラスミド
は依然としてそれらのフラグメントを維持しているであ
ろうと考えた。ハイブリダイゼーション実験は次のよう
に行った。コロニーはプレート上からニトロセルロース
フィルター上につり上げ、さらにそのフィルターは標準
法によりハイブリダイゼーションに供された。（２７）
、標準法に従って、ハイブリダイゼーションは低ストリ
ンジエン） （ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件で行なわれ
た。使用したプローブはフラグメントＣをｒ”Ｐ−ＡＴ
ＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで末端ラベルしたセ
ンス（アッパー）ストランドである。この方法により、
約１．０Ｘ１０３ケのコロニーをテストした。
アーゼは完全な遺伝子からでさえ大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌ
ｔ）中では発現されない。プラスミド上に存在する枯草
菌（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）とＢ．アミロリクエフ
ァシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）の約１ｋｂのアルカリプロテアーゼ遺伝子フラグメ
ントを含む相同的領域の間で組み換えが起っているかど
うかを決めるために、ハイブリダイゼーション技術を用
いることが必要となる。このハイブリダイゼーション実
験において、その形質転換体中に含まれるプラスミド中
にフラグメントＣが存在するかどうかをテストした。そ
のＤＮＡ配列間での組み換えがすべての場合に起こって
いるならば、フラグメントＣを含む配列は欠失している
だろうし、一方、組み換えを起こしていないプラスミド
は依然としてそれらのフラグメントを維持しているであ
ろうと考えた。ハイブリダイゼーション実験は次のよう
に行った。コロニーはプレート上からニトロセルロース
フィルター上につり上げ、さらにそのフィルターは標準
法によりハイブリダイゼーションに供された。（２７）
、標準法に従って、ハイブリダイゼーションは低ストリ
ンジエン） （ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件で行なわれ
た。使用したプローブはフラグメントＣをｒ”Ｐ−ＡＴ
ＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで末端ラベルしたセ
ンス（アッパー）ストランドである。この方法により、
約１．０Ｘ１０３ケのコロニーをテストした。
このうちの３つがプローブとハイブリダイズしないこと
がわかり、それゆえ２つの部分的に相同的なアルカリプ
ロテアーゼ遺伝子フラグメント間の組み換えが起ってい
るプラスミドを含むと考えられた。
がわかり、それゆえ２つの部分的に相同的なアルカリプ
ロテアーゼ遺伝子フラグメント間の組み換えが起ってい
るプラスミドを含むと考えられた。
実施例５
他の実験において、多くのそのような推定の組み換えが
Ｂ５４２１３ＳＢＡで形質転換した大腸菌（Ｅ、 ｃｏ
ｌｉ） ２９４由来のプラスミド調製物を前消化処理
することにより行なわれた。プラスミド調製物を、大腸
菌（Ｅ、 ｃｏｌｔ） ２９４の形質転換する前に制限
酵素Ｐｓ口、Ｓａｌ Ｉ 、 Ｋｐｎ Ｔを組み合せて
消化した。このように消化した３ｎｇのプラスミドは８
つのクロラムフェニコール耐性の形質転換体を生じた。
Ｂ５４２１３ＳＢＡで形質転換した大腸菌（Ｅ、 ｃｏ
ｌｉ） ２９４由来のプラスミド調製物を前消化処理
することにより行なわれた。プラスミド調製物を、大腸
菌（Ｅ、 ｃｏｌｔ） ２９４の形質転換する前に制限
酵素Ｐｓ口、Ｓａｌ Ｉ 、 Ｋｐｎ Ｔを組み合せて
消化した。このように消化した３ｎｇのプラスミドは８
つのクロラムフェニコール耐性の形質転換体を生じた。
これらのコロニーに対し、フラグメントＣに含まれるヌ
クレオチド配列の存在を上述のハイブリダイゼーション
操作に従ってテストした。これらのコロニーのうちの７
つはハイブリダイズしなかったので、２つの部分的に相
同的な遺伝子配列の間で組み換えが起っているプラスミ
ドを含むと考えられた。ハイブリダイズしなかったコロ
ニーが活性なハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼを
コードするハイブリッド遺伝子をもつプラスミドを含む
かどうかをテストするために、これらのプラスミドを単
離し、枯草菌（Ｂ。
クレオチド配列の存在を上述のハイブリダイゼーション
操作に従ってテストした。これらのコロニーのうちの７
つはハイブリダイズしなかったので、２つの部分的に相
同的な遺伝子配列の間で組み換えが起っているプラスミ
ドを含むと考えられた。ハイブリダイズしなかったコロ
ニーが活性なハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼを
コードするハイブリッド遺伝子をもつプラスミドを含む
かどうかをテストするために、これらのプラスミドを単
離し、枯草菌（Ｂ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ） Ｂ Ｇ ２０３６を形質転換させ
た。この菌株は組み換えアルカリ・プロテアーゼ・ハイ
ブリッド遺伝子を含むと考えられる、いかなるプラスミ
ドで形質転換されても、ＬＢスキムミルク・クロラムフ
ェニコール寒天プレート上に透明領域をつくった。これ
に対し、組み換えを起こしていないと推定されるｐＢ３
４２ＢＳＢＡプラスミド（テストされた８ケの単離物）
は、スキムミルクプレート上に透明なゾーンを作れない
ことから示されるように、活性アルカリ・プロテアーゼ
を、菌株ＢＧ２０３６形質転換体については、生成でき
ない。
た。この菌株は組み換えアルカリ・プロテアーゼ・ハイ
ブリッド遺伝子を含むと考えられる、いかなるプラスミ
ドで形質転換されても、ＬＢスキムミルク・クロラムフ
ェニコール寒天プレート上に透明領域をつくった。これ
に対し、組み換えを起こしていないと推定されるｐＢ３
４２ＢＳＢＡプラスミド（テストされた８ケの単離物）
は、スキムミルクプレート上に透明なゾーンを作れない
ことから示されるように、活性アルカリ・プロテアーゼ
を、菌株ＢＧ２０３６形質転換体については、生成でき
ない。
実施例６
Ａ、大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ２９４のアルカリ・
プロテアーゼを生成するｐＢＳ４２ＢＳＢＡ形質転換体
に含まれるハイブリッドＤＮＡ配列の特性化 アルカリ・プロテアーゼ陽性コロニーは、その配列が相
同的な領域で開始する、枯草菌（Ｂ。
プロテアーゼを生成するｐＢＳ４２ＢＳＢＡ形質転換体
に含まれるハイブリッドＤＮＡ配列の特性化 アルカリ・プロテアーゼ陽性コロニーは、その配列が相
同的な領域で開始する、枯草菌（Ｂ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ）とＢ．アミロリクエファシエンス（
Ｂ。
Ｂ。
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）のＤＮＡ配列
間でのｐＢＳ４２ＢＳＢＡプラスミド内単−交叉現象の
結果として起こると仮定した。そのような組み換え遺伝
子は枯草菌（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） ｉｌｔ伝子
白子由来′側配列と、Ｂ．アミロリクエファシエンス（
Ｂ。
間でのｐＢＳ４２ＢＳＢＡプラスミド内単−交叉現象の
結果として起こると仮定した。そのような組み換え遺伝
子は枯草菌（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） ｉｌｔ伝子
白子由来′側配列と、Ｂ．アミロリクエファシエンス（
Ｂ。
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）遺伝子由来の
３′側配列を含んでいることが理解できよう。初期の交
叉は、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌ
ｏｌｉｑｕｅ−ｆａｃｉｅｎｓ ）遺伝子由来の３′側
配列を含むことが予想されよう。一方、Ｂ．アミロリク
エファシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ−ｆａｃ
ｉｅｎｓ ）遺伝子由来の小さい３′側配列断片は後期
の交叉中に存在するであろう。Ｂ．アミロリクエファシ
エンス（Ｂ。
３′側配列を含んでいることが理解できよう。初期の交
叉は、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌ
ｏｌｉｑｕｅ−ｆａｃｉｅｎｓ ）遺伝子由来の３′側
配列を含むことが予想されよう。一方、Ｂ．アミロリク
エファシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ−ｆａｃ
ｉｅｎｓ ）遺伝子由来の小さい３′側配列断片は後期
の交叉中に存在するであろう。Ｂ．アミロリクエファシ
エンス（Ｂ。
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ−ｆａｃｉｅｎｓ）のアルカリ・
プロテアーゼをコードする配列内には、ｐＢｓ４２Ｂｓ
ＢＡ中に存在する１カ所切断のＰｖｕ１１部位がある（
図４参照）。Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ。
プロテアーゼをコードする配列内には、ｐＢｓ４２Ｂｓ
ＢＡ中に存在する１カ所切断のＰｖｕ１１部位がある（
図４参照）。Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ。
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）遺伝子由来の
３′側領域がＰｖｕ１１部位の５′側まで伸びるような
交叉は１カ所切断のＰｖｕ１１部位をもつプラスミドを
生ずるであろう。さらに、このＰｖｕ１１部位は組み換
えられていないｐＢ５４２ＢＳＢＡプラスミド中でより
も１カ所切断のＥｃｏＲ１部位（プロモーターの５′側
に存在する）に近く存在することになる。
３′側領域がＰｖｕ１１部位の５′側まで伸びるような
交叉は１カ所切断のＰｖｕ１１部位をもつプラスミドを
生ずるであろう。さらに、このＰｖｕ１１部位は組み換
えられていないｐＢ５４２ＢＳＢＡプラスミド中でより
も１カ所切断のＥｃｏＲ１部位（プロモーターの５′側
に存在する）に近く存在することになる。
ＥＣ０ＲＩとＲｖｕ口で消化した推定のハイブリッド２
．６．７及び８はＲｖｕＩＩＢ位の存在を指示する制限
パターンを示した。これに対し、Ｂ．アミロリクエファ
シエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
）遺伝子由来の３′側領域がＲｖｕＩＩＢ位の５′側ま
で伸びていない交叉はＲｖｕ１１部位をもたないプラス
ミドを生ずるであろう。推定のハイブリッド１．３及び
４はＲｖｕＩＩによる消化に対して耐性を示すことから
後者のカテゴリーに属する。これらのデータは、推定の
ハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼ遺伝子を含むプ
ラスミド中に、初期及び後期の交叉が存在することを示
している。
．６．７及び８はＲｖｕＩＩＢ位の存在を指示する制限
パターンを示した。これに対し、Ｂ．アミロリクエファ
シエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
）遺伝子由来の３′側領域がＲｖｕＩＩＢ位の５′側ま
で伸びていない交叉はＲｖｕ１１部位をもたないプラス
ミドを生ずるであろう。推定のハイブリッド１．３及び
４はＲｖｕＩＩによる消化に対して耐性を示すことから
後者のカテゴリーに属する。これらのデータは、推定の
ハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼ遺伝子を含むプ
ラスミド中に、初期及び後期の交叉が存在することを示
している。
Ｂ、ハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼのＤＮＡ配
列によりコードされるハイブリッド・アルカリ・プロテ
アーゼの解析 上記のハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼ遺伝子を
コードするプラスミドを含む枯草菌（Ｂ。
列によりコードされるハイブリッド・アルカリ・プロテ
アーゼの解析 上記のハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼ遺伝子を
コードするプラスミドを含む枯草菌（Ｂ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ） ＢＧ ２０３６により生成される
ノ１イブリッドタンパク質を予備的に特徴づけるために
、合成基質をつかってＫｍ値を測定した。酵素源として
、■培養上清を用いた。つかわれた基質はサクシニル−
Ｌ −ａｌａ −Ｌ −ａｌａ −Ｌ −ｐｒｏ −Ｌ
−ｔｙｒ −Ｌ−ｐａｒａ−ニトロアナリドである。
ノ１イブリッドタンパク質を予備的に特徴づけるために
、合成基質をつかってＫｍ値を測定した。酵素源として
、■培養上清を用いた。つかわれた基質はサクシニル−
Ｌ −ａｌａ −Ｌ −ａｌａ −Ｌ −ｐｒｏ −Ｌ
−ｔｙｒ −Ｌ−ｐａｒａ−ニトロアナリドである。
生成物ｐａｒａ−ニトロアナリドの放出をコリオメトリ
カル（ｃｏｌｉｏｍｅｔｒｉｃａｌ ）に、ヒヱーレソ
ト中バッカード（Ｉｌｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ
）のダイオード・アレー・スペクトロフォトメーター・
モチコル８４５１Ａｔ−用い、４３０ｎｍの吸光度を測
定することによりモニターした。
カル（ｃｏｌｉｏｍｅｔｒｉｃａｌ ）に、ヒヱーレソ
ト中バッカード（Ｉｌｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ
）のダイオード・アレー・スペクトロフォトメーター・
モチコル８４５１Ａｔ−用い、４３０ｎｍの吸光度を測
定することによりモニターした。
枯草菌（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）及びＢ．アミロリ
クエファシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃ
ｉｅｎｓ）の親酵素のＫｍ値も測定した。この研究結果
を表２に示す。
クエファシエンス（Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃ
ｉｅｎｓ）の親酵素のＫｍ値も測定した。この研究結果
を表２に示す。
表２
合成基質
サクシニル−Ｌ−ａｌａ−Ｌ−ａｌａ−Ｌ−ｐｒｏ−Ｌ
−ｔｙｒ−Ｌ−ｐａｒａ−ニトロアナリドに関する親ア
ルカリプロテアーゼとハイブリッド・アルカリ・プロテ
アーゼのＫｍ値プラスミド Ｋｍ （Ｍｘｌ
ＯＳ）ｐＳ４−５ ２．３８ （±、
０９）ｐ５１６８．１ ３．３９ （±
、１５）ハイブリッド１ ５．５４ （±、１
０）ハイブリッド２ ５．１２ （±、１０）
ハイブリッド３ ５．４２ （±、０６）ハイ
ブリッド４ ５．３９ （±、１１）ハイブリ
ッド６ ２．８６ （±、１３）ハイブリッド
７ ５．４２ （±、１２）ハイブリッド８
２．７５ （±、０８）１、全ての場合につい
て宿主は枯草菌（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ２０３
６であった。
−ｔｙｒ−Ｌ−ｐａｒａ−ニトロアナリドに関する親ア
ルカリプロテアーゼとハイブリッド・アルカリ・プロテ
アーゼのＫｍ値プラスミド Ｋｍ （Ｍｘｌ
ＯＳ）ｐＳ４−５ ２．３８ （±、
０９）ｐ５１６８．１ ３．３９ （±
、１５）ハイブリッド１ ５．５４ （±、１
０）ハイブリッド２ ５．１２ （±、１０）
ハイブリッド３ ５．４２ （±、０６）ハイ
ブリッド４ ５．３９ （±、１１）ハイブリ
ッド６ ２．８６ （±、１３）ハイブリッド
７ ５．４２ （±、１２）ハイブリッド８
２．７５ （±、０８）１、全ての場合につい
て宿主は枯草菌（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ２０３
６であった。
ハイブリッド酵素は、基本的に２つに分類されるのは明
らかである。ハイブリッド１．２．３．４及び７に代表
される第１のクラスは各々の親酵素のそれよりいくぶん
高いＫｍ値をもっている。
らかである。ハイブリッド１．２．３．４及び７に代表
される第１のクラスは各々の親酵素のそれよりいくぶん
高いＫｍ値をもっている。
ハイブリッド６と８に代表される第２のクラスは両親酵
素の中間のＫｍ値をもっている。
素の中間のＫｍ値をもっている。
これらの結果は、ハイブリッド・アルカリ・プロテアー
ゼは、この合成基質に対し、種々のＫｍ値をとり、それ
らは親酵素のものと異なることを示している。他の合成
基質を用いたＫｍ値の測定も、ある範囲をもつ結果を与
えるだろうし、また、種々のハイブリッド酵素に対して
、好ましい基質が変化することも示されることが予想さ
れる。
ゼは、この合成基質に対し、種々のＫｍ値をとり、それ
らは親酵素のものと異なることを示している。他の合成
基質を用いたＫｍ値の測定も、ある範囲をもつ結果を与
えるだろうし、また、種々のハイブリッド酵素に対して
、好ましい基質が変化することも示されることが予想さ
れる。
実施例７
別な好ましい具体例では、ハイブリッド・アルファ・ア
ミラーゼのＤＮＡ配列を含むプラスミドは２つの親アル
ファ・アミラーゼＤＮＡ配列間での相同組み換えの結果
として、転写ターミネータ−を欠いてしまったテトラサ
イクリン耐性検体を組み換え後転写法により選択した。
ミラーゼのＤＮＡ配列を含むプラスミドは２つの親アル
ファ・アミラーゼＤＮＡ配列間での相同組み換えの結果
として、転写ターミネータ−を欠いてしまったテトラサ
イクリン耐性検体を組み換え後転写法により選択した。
機能的プロモーターをＢ、リチェニホルミス（Ｂ、 Ｉ
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラーゼＤ
ＮＡ配列に実施可能なよう連結した。転写ターミネータ
−はこの遺伝子の３側で、Ｂ、ステアロサーモフィラス
（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）の
アルファ・アミラーゼをコードするＤＮＡ配列の５′側
にある。それ自身のプロモーターを欠いているテトラサ
イクリン耐性遺伝子をＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）のＤＮ
Ａ配列の丁度３′側に位置する。これらの特性をもった
プラスミドを含む細胞は、上流の活性プロモーターから
転写の読み通しが転写ターミネータ−によって妨害され
る為にテトラサイクリン耐性となるであろう。しかしな
がら、２つのアルファ・アミラーゼＤＮＡ配列の間で組
み換えが起こるとすると、そのターミネータ−が切り出
され、結果的にテトラサイクリン耐性遺伝子の転写が行
なわれる。この相同的組み換えを起こすプラスミドを含
む細胞を、非組み換えプラスミド由来のすべてのバンク
グランドを除外することにより、テトラサイクリン耐性
で選択できる。この方法はいがなる２つの相同的遺伝子
フラグメントを組み換えることに対し完全に応用できる
。
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラーゼＤ
ＮＡ配列に実施可能なよう連結した。転写ターミネータ
−はこの遺伝子の３側で、Ｂ、ステアロサーモフィラス
（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）の
アルファ・アミラーゼをコードするＤＮＡ配列の５′側
にある。それ自身のプロモーターを欠いているテトラサ
イクリン耐性遺伝子をＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）のＤＮ
Ａ配列の丁度３′側に位置する。これらの特性をもった
プラスミドを含む細胞は、上流の活性プロモーターから
転写の読み通しが転写ターミネータ−によって妨害され
る為にテトラサイクリン耐性となるであろう。しかしな
がら、２つのアルファ・アミラーゼＤＮＡ配列の間で組
み換えが起こるとすると、そのターミネータ−が切り出
され、結果的にテトラサイクリン耐性遺伝子の転写が行
なわれる。この相同的組み換えを起こすプラスミドを含
む細胞を、非組み換えプラスミド由来のすべてのバンク
グランドを除外することにより、テトラサイクリン耐性
で選択できる。この方法はいがなる２つの相同的遺伝子
フラグメントを組み換えることに対し完全に応用できる
。
Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ）とＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）の親遺伝子由来の組
み換えアルファ・アミラーゼ遺伝子の選択に対し、この
方法を使用するために、図８に示したようなプラスミド
を構築した。完全なり、リチェニホルミス（Ｂ、 ｌｉ
ｃｈｅｎｉ−ｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラーゼ遺
伝子を含むプラスミドｐＢＳ４２ＢＬをＥｃｏＲｌとＨ
ｉｎｄＩ［［で消化した。より小さいフラグメント（フ
ラグメントＡ）を単離した。プラスミドｐＵＣ１３をＥ
ｃ。
ｉｓ）とＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）の親遺伝子由来の組
み換えアルファ・アミラーゼ遺伝子の選択に対し、この
方法を使用するために、図８に示したようなプラスミド
を構築した。完全なり、リチェニホルミス（Ｂ、 ｌｉ
ｃｈｅｎｉ−ｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラーゼ遺
伝子を含むプラスミドｐＢＳ４２ＢＬをＥｃｏＲｌとＨ
ｉｎｄＩ［［で消化した。より小さいフラグメント（フ
ラグメントＡ）を単離した。プラスミドｐＵＣ１３をＥ
ｃ。
Ｒ１とＰｓｔｌで切断し、より大きいフラグメント（フ
ラグメントＣ）を単離した。２つの合成オリゴヌクレオ
チドを合成し、一度９５℃に加熱してから２３℃に冷却
することによりアニールさせた。
ラグメントＣ）を単離した。２つの合成オリゴヌクレオ
チドを合成し、一度９５℃に加熱してから２３℃に冷却
することによりアニールさせた。
生じたフラグメント（フラグメントＢ）は、旧ｎｄ■部
位により５′末端の、５ａｌｒ、ＰｖｕｌとＰｓｔ１部
位によって３′末端の横に位置する大腸菌（Ｅ、 ｃｏ
ｌｔ）のｔ。転写ターミネータ−（ボックス内）を含ん
でいる。フラグメン）Ａ、Ｂ、Ｃを連結し、大腸菌（Ｅ
、 ｃｏｌｉ） ２９４を形質転換するのに用いた。
位により５′末端の、５ａｌｒ、ＰｖｕｌとＰｓｔ１部
位によって３′末端の横に位置する大腸菌（Ｅ、 ｃｏ
ｌｔ）のｔ。転写ターミネータ−（ボックス内）を含ん
でいる。フラグメン）Ａ、Ｂ、Ｃを連結し、大腸菌（Ｅ
、 ｃｏｌｉ） ２９４を形質転換するのに用いた。
このプラスミドを含むアンピシリン耐性コロニーをｐＵ
ｃ１３ＢＬと命名した。このプラスミドを５ａｌｌで完
全消化し、Ｐｖｕｌで部分分解した。フラグメントＤを
単離した。プラスミドｐＵｃ１３ＢｓをＴａｑｌとＢｓ
ｔＸ １で切断し、そのフラグメント（フラグメントＥ
）を単離した。
ｃ１３ＢＬと命名した。このプラスミドを５ａｌｌで完
全消化し、Ｐｖｕｌで部分分解した。フラグメントＤを
単離した。プラスミドｐＵｃ１３ＢｓをＴａｑｌとＢｓ
ｔＸ １で切断し、そのフラグメント（フラグメントＥ
）を単離した。
同様のプラスミドをＢｓｔＸｌとＰｖｕｌで切断し、よ
り小さいフラグメント（フラグメントＦ）を単離する。
り小さいフラグメント（フラグメントＦ）を単離する。
フラグメントＤ、Ｅ、Ｆを連結し、大腸菌（Ｅ、 ｃｏ
ｌｔ） ２９４を形質転換するのに用いた。
ｌｔ） ２９４を形質転換するのに用いた。
アンピシリン耐性の形質転換体はプラスミドｐＵｃ１３
ＢＬＢｓを含んでいる。このプラスミドは、最初の８ケ
のコドン以外は完全なり、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）遺伝子
のコード配列が引き続き、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の転
写ターミネータ−を従えた、その本来のプロモーターを
含んでいる、全Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラーゼ遺転子を
含有する。さらにプラスミドｐＵｃ１３ＢＬＢＳをＥｃ
ｏＲｌとＢｓｔＸ １で切断し、より小さいフラグメン
ト（フラグメントＧ）を単離した。
ＢＬＢｓを含んでいる。このプラスミドは、最初の８ケ
のコドン以外は完全なり、ステアロサーモフィラス（Ｂ
、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）遺伝子
のコード配列が引き続き、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の転
写ターミネータ−を従えた、その本来のプロモーターを
含んでいる、全Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラーゼ遺転子を
含有する。さらにプラスミドｐＵｃ１３ＢＬＢＳをＥｃ
ｏＲｌとＢｓｔＸ １で切断し、より小さいフラグメン
ト（フラグメントＧ）を単離した。
またこのプラスミドをＢｓｔＸ １とＨ４ｎｄｌｌｌで
切断し、フラグメントＨを単離した。プラスミドｐＢＲ
３２２をＥｃｏＲｌとＨ４ｎｄｌｌｌで切断し、より大
きいヘクターフラグメント（フラグメント■）を単離し
た。フラグメントＧ、１（、■を連結し、大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ） ２９４に形質転換した。アンピシリン耐
性形質転換体はプラスミドｐＢＲ３２２ＢＬＢＳＴＣ３
を含んでいる。このプラスミドはコード化領域と、テト
ラサイクリン耐性遺伝子のリボース結合部位の、Ｂ、ス
テアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈＨｕｓ ）のアルファ・アミラーゼコード化領域
の３′末端への融合によりｐＵｃ１３ＢＬＢｓとは非常
に異なる。
切断し、フラグメントＨを単離した。プラスミドｐＢＲ
３２２をＥｃｏＲｌとＨ４ｎｄｌｌｌで切断し、より大
きいヘクターフラグメント（フラグメント■）を単離し
た。フラグメントＧ、１（、■を連結し、大腸菌（Ｅ、
ｃｏｌｉ） ２９４に形質転換した。アンピシリン耐
性形質転換体はプラスミドｐＢＲ３２２ＢＬＢＳＴＣ３
を含んでいる。このプラスミドはコード化領域と、テト
ラサイクリン耐性遺伝子のリボース結合部位の、Ｂ、ス
テアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈＨｕｓ ）のアルファ・アミラーゼコード化領域
の３′末端への融合によりｐＵｃ１３ＢＬＢｓとは非常
に異なる。
レソクＡプラスの大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｔ） ２９４中
でのｐＢＲ３２２ＢＳＢＬＴＣ３の複製は、２つのアル
ファ・アミラーゼＤＮＡ配列間での相同的組み換えによ
り転写ターミネータ−の切除をもたらす。この組み換え
プラスミドの発現は、Ｂ、ｌＪチェニホルミス（Ｂ、ｌ
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラーゼ遺
伝子プロモーターから、ハイブリッドパアルファ・アミ
ラーゼ遺伝子を通して、テトラサイクリン耐性遺伝子ま
で転写を起こし、ハイブリッド・アルファ・アミラーゼ
とテトラサイクリン耐性のタンパク質を与えるべ（翻訳
されるポリシストロニヅクｍＲＮＡを生じる。このよう
に、そのような組み換えプラスミドを含む形質転換体は
、再形質転換と５μｇ／ｍβのテトラサイクリンを含む
ＬＢ寒天プレート上での選択により選らぶことができる
。
でのｐＢＲ３２２ＢＳＢＬＴＣ３の複製は、２つのアル
ファ・アミラーゼＤＮＡ配列間での相同的組み換えによ
り転写ターミネータ−の切除をもたらす。この組み換え
プラスミドの発現は、Ｂ、ｌＪチェニホルミス（Ｂ、ｌ
ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラーゼ遺
伝子プロモーターから、ハイブリッドパアルファ・アミ
ラーゼ遺伝子を通して、テトラサイクリン耐性遺伝子ま
で転写を起こし、ハイブリッド・アルファ・アミラーゼ
とテトラサイクリン耐性のタンパク質を与えるべ（翻訳
されるポリシストロニヅクｍＲＮＡを生じる。このよう
に、そのような組み換えプラスミドを含む形質転換体は
、再形質転換と５μｇ／ｍβのテトラサイクリンを含む
ＬＢ寒天プレート上での選択により選らぶことができる
。
前述のものは特に好ましい具体化例について言及してい
るが、本発明を制限するものではないことが理解されよ
う。種々の修正が公開した具体例に対してなされ、それ
らの修正が本発明の範囲内にあると考えられるというこ
とがこの分野に通常に精通した人々に生ずるであろう。
るが、本発明を制限するものではないことが理解されよ
う。種々の修正が公開した具体例に対してなされ、それ
らの修正が本発明の範囲内にあると考えられるというこ
とがこの分野に通常に精通した人々に生ずるであろう。
次の文献目録にもとめられ、前述本文内に各々カッコ付
の数字で書かれた参照文献が組み込まれている。
の数字で書かれた参照文献が組み込まれている。
文献目録
１、ゴソデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）等、自然（Ｎａｔｕｒ
ｅ） 、２８１．２、ペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ ）等、
自然（Ｎａｔｕｒｅ） 、３０１゜３、タルマッシ（Ｔ
ａ Ｉｍａｄｇｅ）等、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。
ｅ） 、２８１．２、ペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ ）等、
自然（Ｎａｔｕｒｅ） 、３０１゜３、タルマッシ（Ｔ
ａ Ｉｍａｄｇｅ）等、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。
米国７７（７１，３９８８−３９９２（１９８０）４、
ワイズマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ） 、Ｅ Ｐ Ｏ出版０
０３２１３４号１９８１．７月１５日出版 ５、ウニバー（Ｗｅｂｅｒ ）等、核酸研究（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） １１．５６
６１ （１９８３）６、ローン（Ｌａｕｎ ）等、核酸
研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）
９．６１０３ （１９８１）７、ゴソデル（Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ ）等、核酸研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） ８．４０５７ （１９８０）８、
マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、分子クローニング
、実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−研
究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｅｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング−／”ｔ−
バー（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｔｌａｒｂｅｒ） 、ニ
ューヨーク、ｐｌｄ６ （１９８２）９、マンデル（Ｍ
ａｎｄｅｌ）等、分子生物学雑誌（Ｊ。
ワイズマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ） 、Ｅ Ｐ Ｏ出版０
０３２１３４号１９８１．７月１５日出版 ５、ウニバー（Ｗｅｂｅｒ ）等、核酸研究（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） １１．５６
６１ （１９８３）６、ローン（Ｌａｕｎ ）等、核酸
研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）
９．６１０３ （１９８１）７、ゴソデル（Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ ）等、核酸研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） ８．４０５７ （１９８０）８、
マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、分子クローニング
、実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−研
究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｅｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング−／”ｔ−
バー（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｔｌａｒｂｅｒ） 、ニ
ューヨーク、ｐｌｄ６ （１９８２）９、マンデル（Ｍ
ａｎｄｅｌ）等、分子生物学雑誌（Ｊ。
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ ） ５３．１５４ （１９７０
）１０、アナグノストホラス（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏ
ｌｏｕｓ ）等＼細菌学雑誌Ｕ、 Ｂａｃｔ ） ８１
．７９１ （１９６１）１１、フレア（Ｃｒｅａ） 、
Ｐ、 Ｎ、 Ａ、 Ｓ、米国、−Ｌ」−１５７６５−５
７６９（１９７８）１２、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）等、分子クローニング、実験マニュアル、コールド
・スプリング・ハーバ−研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ｌ１ａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コール
ド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｔ
ｌａｒｂｅｒ） 、ニューヨーク、ｐ ９０ （１９
８２）１３、カーノ（Ｋａｒｎ）等、酵素学における方
法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
１０１．３−１９１４、ホーン（Ｉｌｏｈｎ）酵素学に
おける方法（Ｍｅｔｈｏｄｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
） ６８．２２９ （１９７９）１５、カーノ（Ｋａ
ｒｎ）等、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、米国、７７．５１７２−５
１７６ （１９８０）１６、コーネリス（Ｃｏｒｎｅｌ
ｉｓ）等、分子一般遺伝学（Ｍｏｌｅｃ、 Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔ、） ｌ ８６．５０７−５１１ （１
９ｇ２） １７． ウエルス（Ｗｅｌｌｓ）等、核酸研究（Ｎｕ
ｃ、 Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、） ｌ １．７９１１−７９
２５ （１９８３）１８、バック７７ （Ｂａｃｋｍａ
ｎ ）等、Ｐ、Ｎ、Δ、Ｓ。
）１０、アナグノストホラス（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏ
ｌｏｕｓ ）等＼細菌学雑誌Ｕ、 Ｂａｃｔ ） ８１
．７９１ （１９６１）１１、フレア（Ｃｒｅａ） 、
Ｐ、 Ｎ、 Ａ、 Ｓ、米国、−Ｌ」−１５７６５−５
７６９（１９７８）１２、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）等、分子クローニング、実験マニュアル、コールド
・スプリング・ハーバ−研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ｌ１ａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コール
ド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇｔ
ｌａｒｂｅｒ） 、ニューヨーク、ｐ ９０ （１９
８２）１３、カーノ（Ｋａｒｎ）等、酵素学における方
法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
１０１．３−１９１４、ホーン（Ｉｌｏｈｎ）酵素学に
おける方法（Ｍｅｔｈｏｄｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
） ６８．２２９ （１９７９）１５、カーノ（Ｋａ
ｒｎ）等、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、米国、７７．５１７２−５
１７６ （１９８０）１６、コーネリス（Ｃｏｒｎｅｌ
ｉｓ）等、分子一般遺伝学（Ｍｏｌｅｃ、 Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔ、） ｌ ８６．５０７−５１１ （１
９ｇ２） １７． ウエルス（Ｗｅｌｌｓ）等、核酸研究（Ｎｕ
ｃ、 Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、） ｌ １．７９１１−７９
２５ （１９８３）１８、バック７７ （Ｂａｃｋｍａ
ｎ ）等、Ｐ、Ｎ、Δ、Ｓ。
米国、７３．４１７４−４１７８ （１９７６）１９、
メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ） 、マクロ分子に関する第
３回クリーブランドシンポジウム二組み換えＤＮＡ、Ａ
、ワルトン（Ａ、Ｗａｌｔｏｎ ）著、エルスピア（Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ ） 、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ）、２０、サウザー７ （Ｓｏｎｔｈｅｒｎ）
：分子生物学雑誌（Ｊ、 Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ ） 、
９８．５０３−５１７［９７５） ２１、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ ）等、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ
、米国、７４．５４６３−５４６７ （１９７７）２２
、 ７＝アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、細胞（Ｃｅｌ
１）、１５．６８７−７０１ （１９７８） ２３、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ）等、核酸研
究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、） ８．
１７３１ （１９８０）２４、 ７＝アチス（Ｍａｎ
ｉａｔ ｉｓ）等、分子クローニング、実験マニュアル
、コールド・スプリング・ハーバ−研究所（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
。
メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ） 、マクロ分子に関する第
３回クリーブランドシンポジウム二組み換えＤＮＡ、Ａ
、ワルトン（Ａ、Ｗａｌｔｏｎ ）著、エルスピア（Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ ） 、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ）、２０、サウザー７ （Ｓｏｎｔｈｅｒｎ）
：分子生物学雑誌（Ｊ、 Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ ） 、
９８．５０３−５１７［９７５） ２１、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ ）等、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ
、米国、７４．５４６３−５４６７ （１９７７）２２
、 ７＝アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、細胞（Ｃｅｌ
１）、１５．６８７−７０１ （１９７８） ２３、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ）等、核酸研
究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、） ８．
１７３１ （１９８０）２４、 ７＝アチス（Ｍａｎ
ｉａｔ ｉｓ）等、分子クローニング、実験マニュアル
、コールド・スプリング・ハーバ−研究所（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
。
コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇｌｌａｒｂｅｒ） 、ニューヨーク、ｐ ３７０
（１９８２）２５、ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ ）等
、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２．９５−１１３ （１９７７
） ２６、ヴイエラ（Ｖｉｅｒａ ）等、遺伝子（Ｇｅｎｅ
）、１９．２５９ （１９８２） ２７、マニアチス（Ｍａｎｔａｔｉｓ）等、分子クロー
ニング、実験マニュアル、コールド・スプリング・ハー
バ−研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｅｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハ
ーバ−（Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｅｒ） 、、
ニューヨーク、ｐ ３８７ （１９８２）２８、ワ
ラス（Ｗａｌｌａｃｅ ）等、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１
６．２１−２６ （１９８１） ２９、コツシュランド（Ｋｏｓｈｌａｎｄ）等、細胞（
Ｃｅｌｌ）、２０．７４９−７６０ （１９８０） ３０、ジャレットＵａｒｒｅｔｔ）等、生物化学雑誌（
Ｊ。
ｎｇｌｌａｒｂｅｒ） 、ニューヨーク、ｐ ３７０
（１９８２）２５、ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ ）等
、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２．９５−１１３ （１９７７
） ２６、ヴイエラ（Ｖｉｅｒａ ）等、遺伝子（Ｇｅｎｅ
）、１９．２５９ （１９８２） ２７、マニアチス（Ｍａｎｔａｔｉｓ）等、分子クロー
ニング、実験マニュアル、コールド・スプリング・ハー
バ−研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｅｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハ
ーバ−（Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｅｒ） 、、
ニューヨーク、ｐ ３８７ （１９８２）２８、ワ
ラス（Ｗａｌｌａｃｅ ）等、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１
６．２１−２６ （１９８１） ２９、コツシュランド（Ｋｏｓｈｌａｎｄ）等、細胞（
Ｃｅｌｌ）、２０．７４９−７６０ （１９８０） ３０、ジャレットＵａｒｒｅｔｔ）等、生物化学雑誌（
Ｊ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ２５３．４６７６（’
１９７８）３１、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆａｒｄ
） 、分析生物化学（Ａｎａｌ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ、）
７２．２４８ （１９７６）３２、ストール（Ｓｔａ
ｈｌ ）等、細菌学雑誌（Ｊ。
１９７８）３１、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆａｒｄ
） 、分析生物化学（Ａｎａｌ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ、）
７２．２４８ （１９７６）３２、ストール（Ｓｔａ
ｈｌ ）等、細菌学雑誌（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ） １５ Ｂ、４１１−４１
８ （１９８４）３３、ウェルス（Ｗｅｌｌｓ）等、
核酸研究（Ｎｕｃ、 Ａｃ１ｄｓＲｅｓ 、 ）土工、
７９１１−７９２５ （１９８３）３４゜リチャード
ソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）核酸研究における操作（
Ｐｒｏｃｅｄｎｒｅ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｏ Ａｃ１ｄ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）Ｇ、 Ｌ、カントン（Ｃａｎｔｏ
ｎｉ）、Ｄ、 Ｒ，ディピース（Ｄａｖｉｅｓ）著、２
：８１５−８２８、バーバー、アンド壷ロー（Ｈａｒｐ
ｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ） 、二ｘ−ヨーク（１９７１） ３５、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ ） 、自然（Ｎａｔｕｒ
ｅ） 、２７５．３６、ハアンズ（Ｄｙｎａｓ ）等、
分子細胞生物学（Ｍｏｌ。
８ （１９８４）３３、ウェルス（Ｗｅｌｌｓ）等、
核酸研究（Ｎｕｃ、 Ａｃ１ｄｓＲｅｓ 、 ）土工、
７９１１−７９２５ （１９８３）３４゜リチャード
ソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）核酸研究における操作（
Ｐｒｏｃｅｄｎｒｅ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｏ Ａｃ１ｄ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）Ｇ、 Ｌ、カントン（Ｃａｎｔｏ
ｎｉ）、Ｄ、 Ｒ，ディピース（Ｄａｖｉｅｓ）著、２
：８１５−８２８、バーバー、アンド壷ロー（Ｈａｒｐ
ｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ） 、二ｘ−ヨーク（１９７１） ３５、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ ） 、自然（Ｎａｔｕｒ
ｅ） 、２７５．３６、ハアンズ（Ｄｙｎａｓ ）等、
分子細胞生物学（Ｍｏｌ。
Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、 ） ３．１４３０−１４３９
（１９８３）３７、ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ）
等、科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０９．１４２２−１４２
７ （１９８０）３８、リナート（Ｒｅｎａｎ ｔ）等
、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、上】、８１、（１９８１） ３９、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）等、遺伝子（Ｇｅｎ
ｅ）、２０、２３、 （１９Ｂ ２） ４０、デ・ボーア（ｄｅ Ｂｏｅｒ ）等、Ｐ、 Ｎ、
Ａ、 Ｓ。
（１９８３）３７、ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ）
等、科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０９．１４２２−１４２
７ （１９８０）３８、リナート（Ｒｅｎａｎ ｔ）等
、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、上】、８１、（１９８１） ３９、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）等、遺伝子（Ｇｅｎ
ｅ）、２０、２３、 （１９Ｂ ２） ４０、デ・ボーア（ｄｅ Ｂｏｅｒ ）等、Ｐ、 Ｎ、
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米国、−亀」−１２１（１９８３）
４１、タキネン（Ｔａｋｋｉｎｅｎ）等、生物化学雑誌
（Ｊ。
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Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ２５８．１００７−１０
１３４２、ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ ）等、生物化学
雑誌（Ｊ。
１３４２、ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ ）等、生物化学
雑誌（Ｊ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ２５５．２５９６−２６
０５４３、ベンチラ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ）等、分子一般
遺伝学（Ｍｏｌｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、）
１９４．４９４−４９９４４、ポット （Ｂｏｔｔ）等
、ＥＰＯ出版１３０７５６号、１９８５年１月９日出版
０５４３、ベンチラ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ）等、分子一般
遺伝学（Ｍｏｌｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、）
１９４．４９４−４９９４４、ポット （Ｂｏｔｔ）等
、ＥＰＯ出版１３０７５６号、１９８５年１月９日出版
図１はＢ、リチェニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ）とＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ−ｏｐｈｉｌｕｓ ）由来のアル
ファ・アミラーゼＤＮＡ配列の部分的制限地図を描いで
ある。 図２Ａと２Ｂは、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）とＢ、リヂ
エニホルミス（ｒｌ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）
由来のアルファ・アミラーゼに対するヌクレオチド配列
と双方に共通ずる配列を記述しである。 図３ａはＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ。 ５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋ｎｏｐｈｉｌｕｓ ）のアルフ
ァ・アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミ
ドの構築を示す。 図３ｂはＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ。 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）のアルファ
・アミラーゼの一部と、Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、
ｌｉｃｈｅｎｉ−ｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラー
ゼの一部をコードするＤＮＡ配列を並んだ形で含んでい
るプラスミドの構築を示している。 図４は、３ケの１力所切断制限部位を含む１つの合成オ
ルゴヌクレオチドにより分離される枯草菌（Ｂ、 ５ｕ
ｂｔｆｌｉｓ ）とＢ．アミロリクエファシエンス（Ｂ
、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のアル
カリ・プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を含むプラ
スミドの構築を示す。 図５は時間に対する、９０℃での種々のハイブリッド・
アルファ・アミラーゼの熱安定性を描いである。 図６、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒ
−ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）とＢ、リチェニホル
ミス（Ｂ。 １ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のアルファ・アミラ
ーゼに対するアミノ酸配列とその各々に共通したアミノ
酸配列を示している。 図７は各温度での種々のハイブリッド・アルファ・アミ
ラーゼの比活性を描いである。 図８、ひとつの合成転写終止配列により、アルファ・ア
ミラーゼのＤＮＡ配列が分離され、テトラサイクリン耐
性をコードするＤＮＡ配列がＢ。 ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のアルファ・アミラーゼをコー
ドする配列の３′側に位置するような、Ｂ、ステアロサ
ーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ）とＢ、リチェニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈｅ
ｎｔｆｏｒｍｉｓ）由来のアルファ・アミラーゼをコー
ドするＤＮＡ配列を含むプラスミドの構築を示している
。 ＝ ＝古ぺ ＝ ：８菖（＝＝大に ＝ ＝
キも＝ ＝林 ＝：ｉ”−（〈 ミ ＝：づＦ
へく ； ミ５Ｅ島（ｉ ；尊 ＝＝ｉ刊＝
＝鯖（
ｏｒｍｉｓ）とＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ−ｏｐｈｉｌｕｓ ）由来のアル
ファ・アミラーゼＤＮＡ配列の部分的制限地図を描いで
ある。 図２Ａと２Ｂは、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）とＢ、リヂ
エニホルミス（ｒｌ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）
由来のアルファ・アミラーゼに対するヌクレオチド配列
と双方に共通ずる配列を記述しである。 図３ａはＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ。 ５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋ｎｏｐｈｉｌｕｓ ）のアルフ
ァ・アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミ
ドの構築を示す。 図３ｂはＢ、ステアロサーモフィラス（Ｂ。 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）のアルファ
・アミラーゼの一部と、Ｂ、リチェニホルミス（Ｂ、
ｌｉｃｈｅｎｉ−ｆｏｒｍｉｓ）のアルファ・アミラー
ゼの一部をコードするＤＮＡ配列を並んだ形で含んでい
るプラスミドの構築を示している。 図４は、３ケの１力所切断制限部位を含む１つの合成オ
ルゴヌクレオチドにより分離される枯草菌（Ｂ、 ５ｕ
ｂｔｆｌｉｓ ）とＢ．アミロリクエファシエンス（Ｂ
、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のアル
カリ・プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を含むプラ
スミドの構築を示す。 図５は時間に対する、９０℃での種々のハイブリッド・
アルファ・アミラーゼの熱安定性を描いである。 図６、Ｂ、ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒ
−ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）とＢ、リチェニホル
ミス（Ｂ。 １ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のアルファ・アミラ
ーゼに対するアミノ酸配列とその各々に共通したアミノ
酸配列を示している。 図７は各温度での種々のハイブリッド・アルファ・アミ
ラーゼの比活性を描いである。 図８、ひとつの合成転写終止配列により、アルファ・ア
ミラーゼのＤＮＡ配列が分離され、テトラサイクリン耐
性をコードするＤＮＡ配列がＢ。 ステアロサーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のアルファ・アミラーゼをコー
ドする配列の３′側に位置するような、Ｂ、ステアロサ
ーモフィラス（Ｂ、 ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ）とＢ、リチェニホルミス（Ｂ、 ｌｉｃｈｅ
ｎｔｆｏｒｍｉｓ）由来のアルファ・アミラーゼをコー
ドするＤＮＡ配列を含むプラスミドの構築を示している
。 ＝ ＝古ぺ ＝ ：８菖（＝＝大に ＝ ＝
キも＝ ＝林 ＝：ｉ”−（〈 ミ ＝：づＦ
へく ； ミ５Ｅ島（ｉ ；尊 ＝＝ｉ刊＝
＝鯖（
Claims (19)
- （１）複製可能なＤＮＡ配列、ハイブリッドポリペプチ
ドのアミノ末端部分をコードする第１のＤＮＡ配列、ハ
イブリッドポリペプチドのカルボキシル末端部分をコー
ドする第２のＤＮＡ配列、少なくとも１つの１カ所切断
制限部位を含み第１と第２のＤＮＡ配列の間に存在する
第３のＤＮＡ配列を含む環状ベクターを形成し、 レック・プラス（ｒｅｃ＾＋）の第１の微生物への上記
ベクターの形質転換して多量の上記環状ベクターを含む
細胞集団を作り、かつ少なくとも１つの上記ベクターを
交叉組み換えして第３ＤＮＡ配列の切り出し、上記ハイ
ブリッドポリペプチドをコードする上記第１と第２のＤ
ＮＡ配列を含むハイブリッドＤＮＡをもつ組み換え環状
ベクターを形成し、 上記細胞集団からの上記環状ベクター及び組み換え環状
ベクターを単離し、 上記第３ＤＮＡ配列中の１カ所切断制限部位に特異的な
制限エンドヌクレアーゼでその単離した環状ベクター及
び組み換え環状ベクターを処理して上記環状ベクターを
線状にし、かつ 上記の線状化したベクターと組み換え環状ベクターを第
２の微生物にさらし、上記の組み換え環状ベクターをそ
の第２の微生物に形質転換すること、 を含むハイブリッドＤＮＡ配列の製造方法。 - （２）ハイブリッドＤＮＡ配列がハイブリッド酵素をコ
ードする特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （３）ハイブリッド酵素がハイブリッドアミラーゼであ
る特許請求の範囲第２項記載の方法。 - （４）ハイブリッド酵素がハイブリッドプロテアーゼで
ある特許請求の範囲第２項記載の方法。 - （５）第３ＤＮＡ配列の不在を検出することによって、
組み換えベクターが形質転換した第２の微生物を同定す
るステップを含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （６）複製可能なＤＮＡ配列、第１の親ポリペプチド配
列の第１の部分に対応するハイブリッドポリペプチドの
アミノ末端部分をコードする配列を切断可能な状態で結
合した機能的プロモーターを含む第１のＤＮＡ配列、第
２の親ポリペプチド配列の第１の部分に対応する上記の
ハイブリッドポリペプチドのカルボキシル末端部分をコ
ードする第２のＤＮＡ配列、及び上記第１の親ポリペプ
チド配列の第２部分と上記第２の親ポリペプチド配列の
第２の部分をコードする第１と第２のＤＮＡ配列の間の
第３のＤＮＡ配列を含む環状ベクターを形成し、 上記環状ベクターをレック・プラス微生物へ形質転換し
て多量の上記環状ベクターを含む細胞集団を作り、かつ
少なくとも１つの上記環状ベクターの交叉組み換えをし
て第３ＤＮＡ配列を切り出し、上記ハイブリッドポリペ
プチドをコードする上記の第１と第２のＤＮＡ配列を含
むハイブリッドＤＮＡ配列を有する組み換え環状ベクタ
ーを形成し、かつ 上記ハイブリッドＤＮＡ配列の発現を検出することによ
る上記組み換え環状ベクターを含む形質転換体を同定す
ること、 を含むハイブリッドＤＮＡ配列を形成するプロセス。 - （７）ハイブリッドＤＮＡ配列がハイブリッド酵素をコ
ードする特許請求の範囲第６項記載の方法。 - （８）ハイブリッド酵素がハイブリッドアミラーゼであ
る特許請求の範囲第７項記載の方法。 - （９）ハイブリッド酵素がハイブリッドプロテアーゼで
ある特許請求の範囲第７項記載の方法。 - （１０）第１の親ポリペプチド配列がＢ．ステアロサー
モフィラス（Ｂ．Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）菌のアルファ・アミラーゼの全体もしくは一部であ
り、第１親ポリペプチド配列の第１部分が上記Ｂ．ステ
アロサーモフィラス（Ｂ．Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）菌のアルファ・アミラーゼの全体もしくは
一部分であり、第２親ポリペプチド配列がＢ．リチェニ
ホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌のアル
ファ・アミラーゼであり、そして、第２親ポリペプチド
配列の第１部分が上記Ｂ．リチェニホルミス（Ｂ．ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌のアルファ・アミラーゼの
カルボキシル末端部分である特許請求の範囲第６項記載
の方法。 - （１１）第１親ポリペプチド配列が枯草菌（Ｂ．ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）のアルカリ・プロテアーゼの全体もしくは
一部分であり、第１親ポリペプチド配列の第１部分が、
上記枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアルカリ・プロ
テアーゼのアミノ末端部分であり、第２親ポリペプチド
配列がＢ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏ
ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のアルカリ・プロテアーゼ
の全体もしくは一部分であり、かつ第２親ポリペプチド
配列の第１部分がＢ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のアルカリ・プ
ロテアーゼのカルボキシル末端部分である特許請求の範
囲第６項記載の方法。 - （１２）第１の親アミラーゼからのアミノ末端配列と第
２のアミラーゼのカルボキシル末端を含み、該アミノ末
端とカルボキシル末端がその基礎をなすＤＮＡが制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を含まない領域で結合しているハ
イブリッドアミラーゼ。 - （１３）第１の親プロテアーゼのアミノ末端と第２の親
プロテアーゼのカルボキシル末端を含み、該アミノ末端
とカルボキシル末端が、その基礎をなすＤＮＡが制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を含まない領域で結合しているハ
イブリッドプロテアーゼ。 - （１４）Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．Ｓｔｅａｒ
ｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌のアルファ・アミラ
ーゼからのアミノ末端配列と、Ｂ．リチェニホルミス（
Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌のアルファ・アミ
ラーゼからのカルボキシル末端配列を含み、該アミノ末
端とカルボキシル末端配列が、その基礎をなすＤＮＡが
制限エンドヌクレアーゼ部位を含まない領域で結合して
いるハイブリッド・アルファ・アミラーゼ。 - （１５）枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアルカリ・
プロテアーゼからの末端配列とＢ．アミロリクエファシ
エンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）菌
のアルカリ・プロテアーゼからカルボキシル末端配列を
含み、該アミノ末端とカルボキシル末端配列が、その基
礎をなすＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼ部位を含まな
い領域で結合しているハイブリッド・アルカリ・プロテ
アーゼ。 - （１６）複製可能なＤＮＡ配列、第１の親ポリペプチド
配列の第１部分に対応するハイブリッドポリペプチドの
アミノ末端部分をコードする第１ＤＮＡ配列、第２親ポ
リペプチド配列のカルボキシル末端部分をコードする第
２ＤＮＡ配列、上記第１親ポリペプチド配列の第２部分
と上記第２親ポリペプチド配列の第２部分をコードし、
第１と第２ＤＮＡ配列の間に存在する第３ＤＮＡ配列を
含むベクターであって上記第３ＤＮＡ配列を交叉切り出
しが可能なベクター。 - （１７）複製可能なＤＮＡ配列、ハイブリッドポリペプ
チドのアミノ末端部分をコードする第１ＤＮＡ配列、ハ
イブリッドポリペプチドのカルボキシル末端部分をコー
ドする第２ＤＮＡ配列及び上記の第１と第２のＤＮＡ配
列の間にあって少なくとも１つの１カ所切断制限部位を
含む第３ＤＮＡ配列を含むベクターであって上記第３Ｄ
ＮＡ配列を交叉切り出しが可能なベクター。 - （１８）複製可能なＤＮＡ配列、ハイブリッドポリペプ
チドのアミノ末端部分をコードする第１ＤＮＡ配列、ハ
イブリッドポリペプチドのカルボキシル末端部分をコー
ドする第２ＤＮＡ配列及び上記の第１と第２のＤＮＡ配
列の間にあって、上記第２ＤＮＡ配列の発現を妨げるＤ
ＮＡ配列を含む第３ＤＮＡ配列を含むベクターであって
、上記第３ＤＮＡ配列ベクターの交叉切り出し可能なベ
クター。 - （１９）複製可能なＤＮＡ配列、ハイブリッドポリペプ
チドのアミノ末端部分をコードする第１ＤＮＡ配列、ハ
イブリッドポリペプチドのカルボキシル末端部分をコー
ドする第２ＤＮＡ配列、上記の第１と第２ＤＮＡ配列の
間にあって、上記第２ＤＮＡ配列の発現を阻止するＤＮ
Ａ配列を含む第３ＤＮＡ配列、上記第２ＤＮＡ配列の３
′側に存在し、上記第３ＤＮＡ配列を交叉切り出し可能
にするある決った選択特性をコードした第４ＤＮＡ配列
を含むベクターであって上記第３ＤＮＡベクターの交叉
切り出し可能なベクター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75226785A | 1985-07-03 | 1985-07-03 | |
| US752267 | 1985-07-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6283891A true JPS6283891A (ja) | 1987-04-17 |
| JPH0829091B2 JPH0829091B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
ID=25025597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61157163A Expired - Fee Related JPH0829091B2 (ja) | 1985-07-03 | 1986-07-03 | ハイブリッドｐｍａ配列の製造方法及び該方法に使用するベクター |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5093257A (ja) |
| EP (1) | EP0208491B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0829091B2 (ja) |
| AT (1) | ATE93541T1 (ja) |
| AU (1) | AU5945086A (ja) |
| CA (1) | CA1312836C (ja) |
| DE (2) | DE3688920D1 (ja) |
| IE (1) | IE59875B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2011520432A (ja) * | 2008-04-30 | 2011-07-21 | ダニスコ・ユーエス・インク | 新規キメラアルファアミラーゼ変異体 |
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