JPH06121675A - ラット肝チトクロムＰ−４５０ ｃの製造方法 - Google Patents
ラット肝チトクロムＰ−４５０ ｃの製造方法Info
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- JPH06121675A JPH06121675A JP4290681A JP29068192A JPH06121675A JP H06121675 A JPH06121675 A JP H06121675A JP 4290681 A JP4290681 A JP 4290681A JP 29068192 A JP29068192 A JP 29068192A JP H06121675 A JPH06121675 A JP H06121675A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】ラット肝チトクロムP-450cの製造
【構成】ラット肝チトクロムP-450cをコードする遺伝子
を保有する酵母を培養することを特徴とするラット肝チ
トクロムP-450cの製造法 【効果】 一原子酸素添加活性を有するラット肝チトク
ロムP-450cを効率的に製造することができる。
を保有する酵母を培養することを特徴とするラット肝チ
トクロムP-450cの製造法 【効果】 一原子酸素添加活性を有するラット肝チトク
ロムP-450cを効率的に製造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換え技術によ
るラット肝チトクロムＰ−450ｃの製造方法に関する。
るラット肝チトクロムＰ−450ｃの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】３−メチルコラントレン投与により誘導
されるラット肝チトクロムＰ−450cは、ヘム蛋白質であ
り、分子内にヘムを含有し、ミクロソームの電子伝達系
と連絡することにより、ステロイドや脂肪酸、外来の脂
溶性有機化合物に対し一原子酸素添加活性を示す。 ３
−メチルコラントレン投与により誘導されるラット肝チ
トクロムＰ−450cをラット肝チトクロムＰ−450MC と称
する場合があるが、本明細書では、ラット肝チトクロム
Ｐ−450cの名称を用い、以下Ｐ−450 ｃと略称する。
されるラット肝チトクロムＰ−450cは、ヘム蛋白質であ
り、分子内にヘムを含有し、ミクロソームの電子伝達系
と連絡することにより、ステロイドや脂肪酸、外来の脂
溶性有機化合物に対し一原子酸素添加活性を示す。 ３
−メチルコラントレン投与により誘導されるラット肝チ
トクロムＰ−450cをラット肝チトクロムＰ−450MC と称
する場合があるが、本明細書では、ラット肝チトクロム
Ｐ−450cの名称を用い、以下Ｐ−450 ｃと略称する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】近年、大腸菌や酵母を
宿主として異種遺伝子を発現させた例が多く報告されて
いるが、膜蛋白質を多量に発現させたという報告はまだ
なく、しかもラット肝チトクロムＰ−450ｃのようなヘ
ムを含有する膜蛋白質を発現させ、その機能を発現させ
たという報告は皆無である。本発明は、ラット肝チトク
ロムＰ−450ｃをコードする遺伝子を酵母で発現させ効
率良くＰ−450cを製造し、各種の酸化反応に利用するこ
とを目的とする。
宿主として異種遺伝子を発現させた例が多く報告されて
いるが、膜蛋白質を多量に発現させたという報告はまだ
なく、しかもラット肝チトクロムＰ−450ｃのようなヘ
ムを含有する膜蛋白質を発現させ、その機能を発現させ
たという報告は皆無である。本発明は、ラット肝チトク
ロムＰ−450ｃをコードする遺伝子を酵母で発現させ効
率良くＰ−450cを製造し、各種の酸化反応に利用するこ
とを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の酵母菌体は、Ｐ
−450ｃ遺伝子を保有する組み換えプラスミドによりサ
ッカロミセス（Saccharomyce) 属に属する酵母を形質転
換することにより製造することができる。
−450ｃ遺伝子を保有する組み換えプラスミドによりサ
ッカロミセス（Saccharomyce) 属に属する酵母を形質転
換することにより製造することができる。
【０００５】
【発明の効果】本発明により得られる酵母菌体は、下記
のアミノ酸配列を有するラット肝チトクロムＰ−450ｃ
を生産し、これに由来する一原子酸素添加活性を有して
おり、この菌体自体あるいはその培養物より取得したＰ
−450ｃを酸化反応工程や産業排水中の有機化合物の酸
化除去等に応用することができる。
のアミノ酸配列を有するラット肝チトクロムＰ−450ｃ
を生産し、これに由来する一原子酸素添加活性を有して
おり、この菌体自体あるいはその培養物より取得したＰ
−450ｃを酸化反応工程や産業排水中の有機化合物の酸
化除去等に応用することができる。
【０００６】本発明に用いるプラスミド、例えば、プラ
スミドｐＡＭＣ１は本発明者らの発明に係る特許出願
(特願昭59-122953 、昭和59年６月16日出願）に記載し
たように、Ｐ─450 ｃ蛋白質の全コーデイング領域を持
つ組み換えプラスミドｐＡＵ157 より単離したＰ−450
ｃ遺伝子を酵母アルコール脱水素酵素 (以下ＡＤＨと略
称する）プロモーター及びターミネターを保有する発現
ベクターｐＡＡＨ５(Washington Research Fundationか
ら入手可能、Methods in Enzymology, 101, partC,p192
〜201,Amererらの方法により製造できる。なお酵母ＡＤ
Ｈ１遺伝子のプロモーターはWashington Research Fund
ation の米国特許出願第299,733 に含まれており、米国
において工業的、商業的目的で使用する場合は権利者か
らの権利許諾を必要とする。) へ組み込むことにより構
築することができる。
スミドｐＡＭＣ１は本発明者らの発明に係る特許出願
(特願昭59-122953 、昭和59年６月16日出願）に記載し
たように、Ｐ─450 ｃ蛋白質の全コーデイング領域を持
つ組み換えプラスミドｐＡＵ157 より単離したＰ−450
ｃ遺伝子を酵母アルコール脱水素酵素 (以下ＡＤＨと略
称する）プロモーター及びターミネターを保有する発現
ベクターｐＡＡＨ５(Washington Research Fundationか
ら入手可能、Methods in Enzymology, 101, partC,p192
〜201,Amererらの方法により製造できる。なお酵母ＡＤ
Ｈ１遺伝子のプロモーターはWashington Research Fund
ation の米国特許出願第299,733 に含まれており、米国
において工業的、商業的目的で使用する場合は権利者か
らの権利許諾を必要とする。) へ組み込むことにより構
築することができる。
【０００７】本発明においては、サッカロミセス (Sacc
haromyces)属に属する酵母、例えば、サッカロミセス・
セレビシェー (Saccharomyces cerevisiae) ＳＨＹ３
（ＡＴＣＣ44771)、サッカロミセス・セレビシェー (Sa
ccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２（ＡＴＣＣ38626)、
サッカロミセス・セレビシェー (Saccharomyces cerevi
siae) ＮＡ８７−１１Ａなどを用いることができる。こ
れらの酵母をプラスミドにより形質転換は、プロトプラ
スト法等で行うことができる〔Nature, 275, p104-109,
(1978）〕。
haromyces)属に属する酵母、例えば、サッカロミセス・
セレビシェー (Saccharomyces cerevisiae) ＳＨＹ３
（ＡＴＣＣ44771)、サッカロミセス・セレビシェー (Sa
ccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２（ＡＴＣＣ38626)、
サッカロミセス・セレビシェー (Saccharomyces cerevi
siae) ＮＡ８７−１１Ａなどを用いることができる。こ
れらの酵母をプラスミドにより形質転換は、プロトプラ
スト法等で行うことができる〔Nature, 275, p104-109,
(1978）〕。
【０００８】
【実施例】以下に示す本発明を実施例によって更に詳細
に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例のみに限
定されるものではない。 実施例 １ ＹＰＡＤ培地（１％ Yeast Extract ２％ ポリペプト
ン ２％グルコース、0.04％ アデニン）５ｍl にサッ
カロミセス・セレビシェー（Saccharomyces cerevisia
e) ＡＨ２２株を白金耳で植菌し、３０℃で１６−１８
時間振盪、遠心分離（5,000xg,５分）により集菌した。
得られた菌体を５ｍｌの無菌水に懸濁した後、再び遠心
分離（5,000xg,５分）した。得られたペレットに２ｍｌ
のＤＴＴ溶液〔1.２Ｍソルビトール、２５mM ＥＤＴＡ
,５０mM ＤＴＴ (pH 8.0) 〕を加え懸濁した後３０℃
で１０分後、放置し、その後遠心分離（3,000xg,２分）
した。
に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例のみに限
定されるものではない。 実施例 １ ＹＰＡＤ培地（１％ Yeast Extract ２％ ポリペプト
ン ２％グルコース、0.04％ アデニン）５ｍl にサッ
カロミセス・セレビシェー（Saccharomyces cerevisia
e) ＡＨ２２株を白金耳で植菌し、３０℃で１６−１８
時間振盪、遠心分離（5,000xg,５分）により集菌した。
得られた菌体を５ｍｌの無菌水に懸濁した後、再び遠心
分離（5,000xg,５分）した。得られたペレットに２ｍｌ
のＤＴＴ溶液〔1.２Ｍソルビトール、２５mM ＥＤＴＡ
,５０mM ＤＴＴ (pH 8.0) 〕を加え懸濁した後３０℃
で１０分後、放置し、その後遠心分離（3,000xg,２分）
した。
【０００９】得られたペレットを５ｍｌの1.２Ｍ ソル
ビトールに懸濁し再び遠心分離した。同じ遠心分離操作
を２回繰り返した後、得られたペレットを２ｍｌのザイ
モリエース（Zymolyase)溶液 (1.２Ｍ ソルビトール、
0.１Ｍ コハク酸ナトリウム(pH5.8), 0.2ｍｇ／ｍｌ
Zymolyase 60,000) に懸濁し３０℃で６０分振盪し
た。その後、遠心分離 (3,000xg,２分）により得たペレ
ットを５ｍｌの1.２Ｍソルビトール／１０mM CaCl 2 溶
液に懸濁した後、遠心分離 (3,000xg,２分）した。
ビトールに懸濁し再び遠心分離した。同じ遠心分離操作
を２回繰り返した後、得られたペレットを２ｍｌのザイ
モリエース（Zymolyase)溶液 (1.２Ｍ ソルビトール、
0.１Ｍ コハク酸ナトリウム(pH5.8), 0.2ｍｇ／ｍｌ
Zymolyase 60,000) に懸濁し３０℃で６０分振盪し
た。その後、遠心分離 (3,000xg,２分）により得たペレ
ットを５ｍｌの1.２Ｍソルビトール／１０mM CaCl 2 溶
液に懸濁した後、遠心分離 (3,000xg,２分）した。
【００１０】同じ遠心分離操作をさらに２回繰り返した
後ペレットに0.５ｍｌの1.２Ｍソルビトール／１０mM
CaCl 2 溶液を加えて懸濁し約１μg のプラスミドｐＡ
ＭＣl を加えて室温で１０分間放置した。次に、２ｍｌ
のポリエチレングリコール溶液〔２０％ ポリエチレン
グリコール4000, １０mM CaCl 2,１０mM Tris−HCl(pH
7.5) 〕を加えて攪拌し室温で１５分間放置した。その
後遠心分離（3,000xg、２分）して得たペレットに0.1ml
の1.２Ｍソルビトール／１０mM CaCl 2 溶液、0.05
ｍl の1.２Ｍソルビトール／ＹＰＡＤ培地を加え懸濁し
た後３０℃で３０分振盪した。次に、この溶液を４５℃
に保温した再生培地（２２％ソルビトール、２％グルコ
ース、0.７％窒素源（Ｗ／Ｏ）、３％寒天）に加え寒天
プレートの上にまき、３０℃で３−４日インキュベート
し、Ｐ−450 Ｃ遺伝子を保有する形質転換菌体サッカロ
ミセス・セレビシェー（Saccharomyces cerevisiae) Ａ
Ｈ２２（ｐＡＭＣ１） (微工研菌寄第7752号) を得た。
なお、寒天プレートの組成は、２２％ソルビトール、２
％グルコース、0.７％窒素源Ｗ／Ｏ，２％寒天に２０μ
ｇ／ｍｌが含まれるものである。
後ペレットに0.５ｍｌの1.２Ｍソルビトール／１０mM
CaCl 2 溶液を加えて懸濁し約１μg のプラスミドｐＡ
ＭＣl を加えて室温で１０分間放置した。次に、２ｍｌ
のポリエチレングリコール溶液〔２０％ ポリエチレン
グリコール4000, １０mM CaCl 2,１０mM Tris−HCl(pH
7.5) 〕を加えて攪拌し室温で１５分間放置した。その
後遠心分離（3,000xg、２分）して得たペレットに0.1ml
の1.２Ｍソルビトール／１０mM CaCl 2 溶液、0.05
ｍl の1.２Ｍソルビトール／ＹＰＡＤ培地を加え懸濁し
た後３０℃で３０分振盪した。次に、この溶液を４５℃
に保温した再生培地（２２％ソルビトール、２％グルコ
ース、0.７％窒素源（Ｗ／Ｏ）、３％寒天）に加え寒天
プレートの上にまき、３０℃で３−４日インキュベート
し、Ｐ−450 Ｃ遺伝子を保有する形質転換菌体サッカロ
ミセス・セレビシェー（Saccharomyces cerevisiae) Ａ
Ｈ２２（ｐＡＭＣ１） (微工研菌寄第7752号) を得た。
なお、寒天プレートの組成は、２２％ソルビトール、２
％グルコース、0.７％窒素源Ｗ／Ｏ，２％寒天に２０μ
ｇ／ｍｌが含まれるものである。
【００１１】実施例 ２ 実施例１と同様にし、サッカロミセス・セレビシェー
（Saccharomyces cerevisiae) ＳＨＹ３株を用いＰ−45
0 ｃ遺伝子を保有する形質転換体サッカロミセス・セレ
ビシェー（Saccharomyces cerevisiae) ＳＨＹ３（ｐＡ
ＭＣ１）（微工研菌寄第7751号) を得た。なお、寒天プ
レートには、２０μｇ／ｍｌのヒスチジン、トリプトフ
ァン、ウラシル及びアデニンが含まれる。
（Saccharomyces cerevisiae) ＳＨＹ３株を用いＰ−45
0 ｃ遺伝子を保有する形質転換体サッカロミセス・セレ
ビシェー（Saccharomyces cerevisiae) ＳＨＹ３（ｐＡ
ＭＣ１）（微工研菌寄第7751号) を得た。なお、寒天プ
レートには、２０μｇ／ｍｌのヒスチジン、トリプトフ
ァン、ウラシル及びアデニンが含まれる。
【００１２】実施例 ３ 実施例１と同様にし、サッカロミセス・セレビシェー
（Saccharomyces cerevisiae) ＮＡ８７−１１Ａ株を用
いＰ−450 ｃ遺伝子を保有する形質転換体 サッカロミ
セス・セレビシェー（Saccharomyses cerevisiae) ＮＡ
８７−１１Ａ（ｐＡＭＣ１）（微工研菌寄第7753号) を
得た。なお、寒天プレートには、２０μｇ／ｍl のヒス
チジン、トリプトファンが含まれる。なお、実施例１−
３と同様にし、プラスミドｐＡＭＣ１の代わりにＰ−45
0 ｃ遺伝子を含まない発現ベクターｐＡＡＨ５を用い形
質転換を行い、形質転換体ＡＨ２２（ｐＡＡＨ５）株、
ＳＨＹ３（ｐＡＡＨ５）株及びＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡ
ＡＨ５）株を製造した。
（Saccharomyces cerevisiae) ＮＡ８７−１１Ａ株を用
いＰ−450 ｃ遺伝子を保有する形質転換体 サッカロミ
セス・セレビシェー（Saccharomyses cerevisiae) ＮＡ
８７−１１Ａ（ｐＡＭＣ１）（微工研菌寄第7753号) を
得た。なお、寒天プレートには、２０μｇ／ｍl のヒス
チジン、トリプトファンが含まれる。なお、実施例１−
３と同様にし、プラスミドｐＡＭＣ１の代わりにＰ−45
0 ｃ遺伝子を含まない発現ベクターｐＡＡＨ５を用い形
質転換を行い、形質転換体ＡＨ２２（ｐＡＡＨ５）株、
ＳＨＹ３（ｐＡＡＨ５）株及びＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡ
ＡＨ５）株を製造した。
【００１３】本発明により得られたＰ−450 ｃ遺伝子を
保有する酵母サッカロミセス・セレビシェー（Saccharo
myces cerevisiae) ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株、ＳＨＹ
３（ｐＡＭＣ１）株及びＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡＭＣ
１）株は、それぞれ新規であり工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第7752号，7751号，7753号の番号
で寄託した。
保有する酵母サッカロミセス・セレビシェー（Saccharo
myces cerevisiae) ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株、ＳＨＹ
３（ｐＡＭＣ１）株及びＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡＭＣ
１）株は、それぞれ新規であり工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第7752号，7751号，7753号の番号
で寄託した。
【００１４】形質転換体の培養 このようにして得られた、本発明の酵母菌は、グルコー
ス、ガラクトースなどの炭素源、アミノ酸を含まない窒
素源とそれぞれの菌株の要求性のアミノ酸（但しロイシ
ンを除く）塩基を添加した培地中で、３０℃を培養する
ことができる。例えば、サッカロミセス・セレビシェー
（Saccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）
株の場合、ＳＤ合成培地〔２％デキストロズ（dextros
e）、0.67％ Bacto-yeast nitrogen base W/O amino a
cids (Difco社) 〕にヒスチジンを２０μｇ／ｍl の割
合で添加した培地を用いる。水は、蒸溜水を用い、pHを
特に調節する必要はない。ＳＨＹ３（ｐＡＭＣ１）株の
場合は、ＳＤ合成培地に、それぞれ２０μｇ／ｍｌのヒ
スチジン、トリプトファン、ウラシルおよびアデニンを
添加した培地を用いる。ＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡＭＣ
１）株の場合は、ＳＤ合成培地に、それぞれ２０μｇ／
ｍｌのヒスチジン、トリプトファンを添加した培地を用
いる。 以下に本発明の酵母の培養例を示す。
ス、ガラクトースなどの炭素源、アミノ酸を含まない窒
素源とそれぞれの菌株の要求性のアミノ酸（但しロイシ
ンを除く）塩基を添加した培地中で、３０℃を培養する
ことができる。例えば、サッカロミセス・セレビシェー
（Saccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）
株の場合、ＳＤ合成培地〔２％デキストロズ（dextros
e）、0.67％ Bacto-yeast nitrogen base W/O amino a
cids (Difco社) 〕にヒスチジンを２０μｇ／ｍl の割
合で添加した培地を用いる。水は、蒸溜水を用い、pHを
特に調節する必要はない。ＳＨＹ３（ｐＡＭＣ１）株の
場合は、ＳＤ合成培地に、それぞれ２０μｇ／ｍｌのヒ
スチジン、トリプトファン、ウラシルおよびアデニンを
添加した培地を用いる。ＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡＭＣ
１）株の場合は、ＳＤ合成培地に、それぞれ２０μｇ／
ｍｌのヒスチジン、トリプトファンを添加した培地を用
いる。 以下に本発明の酵母の培養例を示す。
【００１５】実施例 ４ 実施例１−３で得られた形質転換体をそれぞれ上記の培
養条件で２×１０7 cells／ｍｌまで培養した。この培
養液100 ｍｌを6,000xg で１０分間遠心分離して得た菌
体を５０ｍｌの蒸溜水に懸濁後、再び6,000xg で１０分
間遠心分離した。得られた菌体を100mM リン酸カルシウ
ム緩衝液 (pH7.4)に約１０9 cells ／ｍｌの濃度に懸濁
した後、J.Biol.Chem.289, 2870 (1964)に従って還元型
CO結合物差スペクトルを測定した。その結果を図１から
図３に示す。この図から明らかなように、Ｐ−450 ｃを
コードする領域を持たないプラスミドｐＡＡＨ５を保有
する酵母ＡＨ２２（ｐＡＡＨ５）株、ＳＨＹ３（ｐＡＡ
Ｈ５）株、及びＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡＡＨ５）株で
は、450 nm付近にピークは存在しないが、Ｐ−450 ｃを
コードする領域をもつプラスミドｐＡＭＣ１を保有する
酵母ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株、ＳＨＹ３（ｐＡＭＣ
１）株及びＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡＭＣ１）株では、45
0 nm付近にＰ−450 ｃに由来するピークが見られた。菌
体で測定した場合、Ｐ−450 ｃ含量は実際の含量よりも
低く見積もられる（約２／３）。その点を考慮するとＡ
Ｈ２２（ｐＡＭＣ１）株では約４×１０5 分子／cell、
ＳＨＹ３（ｐＡＭＣ１）株及びＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡ
ＭＣ１）株では、約1.５×１０5 分子／cellのヘムを含
有するチトクロムＰ−450 ｃが生産されていた。即ち、
ＡＨ２２（ｐＨＭＣ１）株では、酵母菌体内で合成され
たラット肝チトクロムＰ−450 ｃタンパク質の約５０％
が、ＳＨＹ３（ｐＡＭＣ１）株およびＮＡ８７−１１Ａ
（ｐＡＭＣ１）株では約４０％が、分子内にヘムを含有
していることがわかる。
養条件で２×１０7 cells／ｍｌまで培養した。この培
養液100 ｍｌを6,000xg で１０分間遠心分離して得た菌
体を５０ｍｌの蒸溜水に懸濁後、再び6,000xg で１０分
間遠心分離した。得られた菌体を100mM リン酸カルシウ
ム緩衝液 (pH7.4)に約１０9 cells ／ｍｌの濃度に懸濁
した後、J.Biol.Chem.289, 2870 (1964)に従って還元型
CO結合物差スペクトルを測定した。その結果を図１から
図３に示す。この図から明らかなように、Ｐ−450 ｃを
コードする領域を持たないプラスミドｐＡＡＨ５を保有
する酵母ＡＨ２２（ｐＡＡＨ５）株、ＳＨＹ３（ｐＡＡ
Ｈ５）株、及びＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡＡＨ５）株で
は、450 nm付近にピークは存在しないが、Ｐ−450 ｃを
コードする領域をもつプラスミドｐＡＭＣ１を保有する
酵母ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株、ＳＨＹ３（ｐＡＭＣ
１）株及びＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡＭＣ１）株では、45
0 nm付近にＰ−450 ｃに由来するピークが見られた。菌
体で測定した場合、Ｐ−450 ｃ含量は実際の含量よりも
低く見積もられる（約２／３）。その点を考慮するとＡ
Ｈ２２（ｐＡＭＣ１）株では約４×１０5 分子／cell、
ＳＨＹ３（ｐＡＭＣ１）株及びＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡ
ＭＣ１）株では、約1.５×１０5 分子／cellのヘムを含
有するチトクロムＰ−450 ｃが生産されていた。即ち、
ＡＨ２２（ｐＨＭＣ１）株では、酵母菌体内で合成され
たラット肝チトクロムＰ−450 ｃタンパク質の約５０％
が、ＳＨＹ３（ｐＡＭＣ１）株およびＮＡ８７−１１Ａ
（ｐＡＭＣ１）株では約４０％が、分子内にヘムを含有
していることがわかる。
【００１６】Ｐ−450 ｃの細胞内局在性およびミクロソ
ーム画分の調製 本発明の酵母は、Ｐ−450 ｃを細胞内に多量に生産する
が、そのほとんどが、酵母ミクロソーム画分に局在す
る。従って、本発明の酵母を培養後、Ｐ−450 ｃを分
離、精製することも可能であるが、これを分離せずミク
ロソーム画分を種々の酸化反応に用いることも可能であ
る。ミクロソーム画分の分離は、例えば、菌体をプロト
プラスト化、超音波破砕後、遠心分離することより容易
に得ることができる。以下にミクロソーム画分の調製法
に関する実施例を示す。
ーム画分の調製 本発明の酵母は、Ｐ−450 ｃを細胞内に多量に生産する
が、そのほとんどが、酵母ミクロソーム画分に局在す
る。従って、本発明の酵母を培養後、Ｐ−450 ｃを分
離、精製することも可能であるが、これを分離せずミク
ロソーム画分を種々の酸化反応に用いることも可能であ
る。ミクロソーム画分の分離は、例えば、菌体をプロト
プラスト化、超音波破砕後、遠心分離することより容易
に得ることができる。以下にミクロソーム画分の調製法
に関する実施例を示す。
【００１７】実施例 ５ 2.０×１０7 cells/ｍｌまで培養したサッカロミセス・
セビシェー（Saccharomyces serevisiae) ＡＨ２２（ｐ
ＡＭＣ１）株3.３l を集菌した後、菌体を100ｍｌの緩
衝液Ａ（１０mM Tris−ＨＣｌ（pH 7.5) 、２Ｍ ソル
ビトール、0.１mM ＤＴＴ，0.２mM ＥＤＴＡ）に懸濁
し300 ｍｇザイモリエース5000（Zymolyase)を加え３０
℃で６０分間インキュベートした。5,000xg で１０分間
遠心分離して得られたスフェロプラストを100 ｍｌの緩
衝液Ａに懸濁した後、遠心分離（5,000xg 、１０分間）
した。同じ遠心分離操作をもう一度繰り返してスフェロ
プラストの洗浄を行った後、スフェロプラストを６０ｍ
ｌの緩衝液〔１０mM Tris−ＨＣl （pH7.５）、0.65Ｍ
ソルビトール、0.１mM ＤＴＴ）に懸濁し、６０Ｗで
５分間超音波破砕した。10,000xgで２０分間遠心分離し
て上清を取り、これを125,000xg で７０分間遠心分離し
て沈殿を集め、緩衝液 (0.１Ｍリン酸（pH7.２）、１０
mM ＥＤＴＡ）に懸濁しホモジナイズした後、再度125,
000xg で７０分間遠心分離して得られた沈殿を１１ｍｌ
の0.１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（pH7.０）に懸濁しホ
モジナイズし、ミクロソーム画分を得た。上記のように
して得られたミクロソーム画分は、ベンツピレン水酸化
活性、７−エトキシクマリン Ｏ−脱エチル化活性等を
有し種々の酸化反応に用いることができる。次に、本発
明により得られたミクロソーム画分の酸化活性の測定例
を以下に示す。
セビシェー（Saccharomyces serevisiae) ＡＨ２２（ｐ
ＡＭＣ１）株3.３l を集菌した後、菌体を100ｍｌの緩
衝液Ａ（１０mM Tris−ＨＣｌ（pH 7.5) 、２Ｍ ソル
ビトール、0.１mM ＤＴＴ，0.２mM ＥＤＴＡ）に懸濁
し300 ｍｇザイモリエース5000（Zymolyase)を加え３０
℃で６０分間インキュベートした。5,000xg で１０分間
遠心分離して得られたスフェロプラストを100 ｍｌの緩
衝液Ａに懸濁した後、遠心分離（5,000xg 、１０分間）
した。同じ遠心分離操作をもう一度繰り返してスフェロ
プラストの洗浄を行った後、スフェロプラストを６０ｍ
ｌの緩衝液〔１０mM Tris−ＨＣl （pH7.５）、0.65Ｍ
ソルビトール、0.１mM ＤＴＴ）に懸濁し、６０Ｗで
５分間超音波破砕した。10,000xgで２０分間遠心分離し
て上清を取り、これを125,000xg で７０分間遠心分離し
て沈殿を集め、緩衝液 (0.１Ｍリン酸（pH7.２）、１０
mM ＥＤＴＡ）に懸濁しホモジナイズした後、再度125,
000xg で７０分間遠心分離して得られた沈殿を１１ｍｌ
の0.１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（pH7.０）に懸濁しホ
モジナイズし、ミクロソーム画分を得た。上記のように
して得られたミクロソーム画分は、ベンツピレン水酸化
活性、７−エトキシクマリン Ｏ−脱エチル化活性等を
有し種々の酸化反応に用いることができる。次に、本発
明により得られたミクロソーム画分の酸化活性の測定例
を以下に示す。
【００１８】実施例 ６ ベンツピレン水酸化活性の測定 実施例５で得たミクロソーム画分８６μl （0.３n mol
のＰ−450 ｃを含む）と1.０ｍｌの0.１Ｍ リン酸カリ
ウム緩衝液（pH7.０）と２５μl の２０mM ＮＡＤＰＨ
水溶液を混合し３７℃で３分間振盪した後、３０μl の
４mMベンツピレン−アセトン溶液を添加し反応を開始し
た。３７℃で一定時間（２、５、１０分間）反応させた
後、1.０ｍｌの氷冷アセトンを添加して反応を停止し、
反応混液を2,000xg で５分間遠心分離して得られた上清
0.６ｍｌに8.５％トリエチルアミン水溶液を1.４ｍｌ加
え、J.Biol.Chem., 243, 6242 (1968)に従って反応生成
物３−ヒドロキシベンツピレンを測定した。測定の結
果、反応速度は、0.87n mol３−ヒドロキシベンツピレ
ン／min ／n mol Ｐ−450 ｃとなった。この活性は、
ウサギ抗血清から調製した抗−Ｐ−450 ｃ IgGにより特
異的に阻害され、チトクロムＰ−450 ｃ依存性ベンツピ
レン水酸化活性であることが明らかになった。また、対
照として用いたサッカロミセス・セレビシェー（Saccha
romyces cerevisiae) ＡＨ２２（ｐＡＡＨ５）株から調
製したミクロソーム画分では全く活性が認められなかっ
た。
のＰ−450 ｃを含む）と1.０ｍｌの0.１Ｍ リン酸カリ
ウム緩衝液（pH7.０）と２５μl の２０mM ＮＡＤＰＨ
水溶液を混合し３７℃で３分間振盪した後、３０μl の
４mMベンツピレン−アセトン溶液を添加し反応を開始し
た。３７℃で一定時間（２、５、１０分間）反応させた
後、1.０ｍｌの氷冷アセトンを添加して反応を停止し、
反応混液を2,000xg で５分間遠心分離して得られた上清
0.６ｍｌに8.５％トリエチルアミン水溶液を1.４ｍｌ加
え、J.Biol.Chem., 243, 6242 (1968)に従って反応生成
物３−ヒドロキシベンツピレンを測定した。測定の結
果、反応速度は、0.87n mol３−ヒドロキシベンツピレ
ン／min ／n mol Ｐ−450 ｃとなった。この活性は、
ウサギ抗血清から調製した抗−Ｐ−450 ｃ IgGにより特
異的に阻害され、チトクロムＰ−450 ｃ依存性ベンツピ
レン水酸化活性であることが明らかになった。また、対
照として用いたサッカロミセス・セレビシェー（Saccha
romyces cerevisiae) ＡＨ２２（ｐＡＡＨ５）株から調
製したミクロソーム画分では全く活性が認められなかっ
た。
【００１９】実施例 ７ ７−エトキシクマリン Ｏ−脱エチル化活性の測定 実施例５で得たミクロソーム画分８６μl （0.３n mol
のＰ−450 ｃを含む）と1.０ｍｌの0.１Ｍ リン酸カリ
ウム緩衝液（pH7.０）と２５μl の20mM ＮＡＤＰＨ水
溶液を混合し３７℃で３分間振盪した後、２５μl の２
０mM ７−エトキシクマリン（メタノール：水＝１：１
に溶解）を添加し反応を開始した。３７℃で一定時間
（２、５、１０分間）反応させた後、62.5μl の１５％
トリクロロ酢酸水溶液を添加して反応を停止した。反
応生成物である７−ヒドロキシクマリンの定量はJ. Pha
rmacol. Exp. Ther. 205, 596 (1978)に従った。反応速
度は、1.１n mol ７−ヒドロキシクマリン／min ／n mo
l Ｐ─450 ｃとなった。なお、対照として用いたＡＨ２
２（ｐＡＡＨ５）株から調製したミクロソーム画分では
全く活性が認められなかった。
のＰ−450 ｃを含む）と1.０ｍｌの0.１Ｍ リン酸カリ
ウム緩衝液（pH7.０）と２５μl の20mM ＮＡＤＰＨ水
溶液を混合し３７℃で３分間振盪した後、２５μl の２
０mM ７−エトキシクマリン（メタノール：水＝１：１
に溶解）を添加し反応を開始した。３７℃で一定時間
（２、５、１０分間）反応させた後、62.5μl の１５％
トリクロロ酢酸水溶液を添加して反応を停止した。反
応生成物である７−ヒドロキシクマリンの定量はJ. Pha
rmacol. Exp. Ther. 205, 596 (1978)に従った。反応速
度は、1.１n mol ７−ヒドロキシクマリン／min ／n mo
l Ｐ─450 ｃとなった。なお、対照として用いたＡＨ２
２（ｐＡＡＨ５）株から調製したミクロソーム画分では
全く活性が認められなかった。
【００２０】Ｐ−450 ｃの分離、精製 Ｐ−450 ｃは、上述のようにして得たミクロソーム画分
から通常の蛋白精製法に従って分離、精製することがで
きる。例えば、ミクロソーム画分を界面活性剤を含む緩
衝液により可溶化した後、ＤＥＡＥ−セルロース、ヒド
ロキシルアパタイト、ＤＥＡＥ−セファローズＣＬ−６
Ｂ、ＣＭ−セファデックスなどの担体を用いたカラムク
ロマトグラフィーを複数適宜組合せることによりチトク
ロムＰ−450 ｃを精製することができる。例えば、ＤＥ
ＡＥ−セルロースカラムを用い、グリセロール、ＥＤＴ
Ａ等を含むリン酸カリウム緩衝液（pH7.４）中における
KCl などの無機電解質の濃度を直線的に徐々に上げるこ
とによりＰ−450 ｃを溶出することにより容易に精製す
ることができる。以下に、Ｐ−450 ｃの分離、精製に関
する実施例を挙げる。
から通常の蛋白精製法に従って分離、精製することがで
きる。例えば、ミクロソーム画分を界面活性剤を含む緩
衝液により可溶化した後、ＤＥＡＥ−セルロース、ヒド
ロキシルアパタイト、ＤＥＡＥ−セファローズＣＬ−６
Ｂ、ＣＭ−セファデックスなどの担体を用いたカラムク
ロマトグラフィーを複数適宜組合せることによりチトク
ロムＰ−450 ｃを精製することができる。例えば、ＤＥ
ＡＥ−セルロースカラムを用い、グリセロール、ＥＤＴ
Ａ等を含むリン酸カリウム緩衝液（pH7.４）中における
KCl などの無機電解質の濃度を直線的に徐々に上げるこ
とによりＰ−450 ｃを溶出することにより容易に精製す
ることができる。以下に、Ｐ−450 ｃの分離、精製に関
する実施例を挙げる。
【００２１】実施例 ８ Ｐ−450 ｃの精製 Step１：ミクロソームの可溶化 サッカロミセス・セレビシェー（Saccharomyces cerevi
siae) ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株から上述のように調製
した１５ｍｌのミクロソーム画分（８２n molＰ−450
ｃ／205 ｍｇタンパク質）に100 ｍｌの緩衝液Ｂ〔１０
mM リン酸カリウム (pH7.４）２０％グリセロール、0.
５％コール酸、0.２％エマルゲン913、0.１mM ＥＤＴ
Ａ〕を加え４℃で１０分間攪拌した後、125,000xg で７
０分間遠心分離し、上清を得た。これを５L の透析緩衝
液〔２０mMリン酸カリウム（pH7.４）、２０％グリセロ
ール、0.２％エマルゲン913 〕に対し、１４時間透析し
た。
siae) ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株から上述のように調製
した１５ｍｌのミクロソーム画分（８２n molＰ−450
ｃ／205 ｍｇタンパク質）に100 ｍｌの緩衝液Ｂ〔１０
mM リン酸カリウム (pH7.４）２０％グリセロール、0.
５％コール酸、0.２％エマルゲン913、0.１mM ＥＤＴ
Ａ〕を加え４℃で１０分間攪拌した後、125,000xg で７
０分間遠心分離し、上清を得た。これを５L の透析緩衝
液〔２０mMリン酸カリウム（pH7.４）、２０％グリセロ
ール、0.２％エマルゲン913 〕に対し、１４時間透析し
た。
【００２２】Step２：ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロ
マトグラフィー（１st） 緩衝液Ｂにより平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム
（1.６×１５cm）に透析後の可溶化ミクロソームをのせ
４０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した後カラム上部の赤いバン
ドを切り取った。
マトグラフィー（１st） 緩衝液Ｂにより平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム
（1.６×１５cm）に透析後の可溶化ミクロソームをのせ
４０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した後カラム上部の赤いバン
ドを切り取った。
【００２３】Step３：ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロ
マトグラフィー（２nd) 上記Step２で得たゲルを緩衝液Ｂで懸濁した後、新たな
ＤＥＡＥ−セルロースカラム（1.6 ×２０cm）にのせ、
150 ｍｌの２０−200mM KCl 直線濃度勾配により溶出し
た。さらに、得られたＰ−450 ｃ溶出液を２l の透析緩
衝液〔２０mMリン酸カリウム（pH7.４）、２０％グリセ
ロール、0.２％エマルゲン913 〕に対し１４時時間透析
した。
マトグラフィー（２nd) 上記Step２で得たゲルを緩衝液Ｂで懸濁した後、新たな
ＤＥＡＥ−セルロースカラム（1.6 ×２０cm）にのせ、
150 ｍｌの２０−200mM KCl 直線濃度勾配により溶出し
た。さらに、得られたＰ−450 ｃ溶出液を２l の透析緩
衝液〔２０mMリン酸カリウム（pH7.４）、２０％グリセ
ロール、0.２％エマルゲン913 〕に対し１４時時間透析
した。
【００２４】Step４：ヒドロキシルアパタイトカラムク
ロマトグラフィー Step３で得たＰ−450 ｃを含む溶液１０mMリン酸カリウ
ム（pH7.４）、２０％グリセロールで平衡化したヒドロ
キシルアパタイトカラム（1.６×７cm）にかけ120 ｍｌ
の１０−250 mMリン酸カリウム直線濃度勾配−緩衝液Ｂ
によって溶出した。さらに、得られたＰ−450 ｃ溶出液
を２l の透析緩衝液〔２０mM リン酸カリウム（pH7.
４）、２０％グリセロール、0.２％エマルゲン913 〕に
対し透析した。
ロマトグラフィー Step３で得たＰ−450 ｃを含む溶液１０mMリン酸カリウ
ム（pH7.４）、２０％グリセロールで平衡化したヒドロ
キシルアパタイトカラム（1.６×７cm）にかけ120 ｍｌ
の１０−250 mMリン酸カリウム直線濃度勾配−緩衝液Ｂ
によって溶出した。さらに、得られたＰ−450 ｃ溶出液
を２l の透析緩衝液〔２０mM リン酸カリウム（pH7.
４）、２０％グリセロール、0.２％エマルゲン913 〕に
対し透析した。
【００２５】Step５：ＤＥＡＥ−セファローズＣＬ−６
Ｂカラムクロマトグラフィー ２０％グリセロールを含む３３mMリン酸カリウム緩衝液
（pH7.４）により平衡化したＤＥＡＥ−セファローズＣ
Ｌ−６Ｂ（0.９×５cm）にＳＴＥＰ４で得たＰ−450 ｃ
溶液をのせ、平衡化に用いた緩衝液により洗浄した。Ａ
280 ＝0.005 になったところで400 mM KCl を含む平衡
化緩衝液により溶出した。以上の操作で得たＰ−450 ｃ
の比含量は１４nmol/ ｍｇタンパク質であった。図４に
精製Ｐ−450 ｃの酸化型吸収スペクトルおよび還元型の
CO結合物差スペクトルを示す。酸化型吸収スペクトルは
典型的な低スピン型のスペクトルで417nmにピークを有
し、還元型CO結合物差スペクトルは447 nmにピークを有
した。
Ｂカラムクロマトグラフィー ２０％グリセロールを含む３３mMリン酸カリウム緩衝液
（pH7.４）により平衡化したＤＥＡＥ−セファローズＣ
Ｌ−６Ｂ（0.９×５cm）にＳＴＥＰ４で得たＰ−450 ｃ
溶液をのせ、平衡化に用いた緩衝液により洗浄した。Ａ
280 ＝0.005 になったところで400 mM KCl を含む平衡
化緩衝液により溶出した。以上の操作で得たＰ−450 ｃ
の比含量は１４nmol/ ｍｇタンパク質であった。図４に
精製Ｐ−450 ｃの酸化型吸収スペクトルおよび還元型の
CO結合物差スペクトルを示す。酸化型吸収スペクトルは
典型的な低スピン型のスペクトルで417nmにピークを有
し、還元型CO結合物差スペクトルは447 nmにピークを有
した。
【００２６】
配列番号：１ 配列の長さ：523 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：長鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Pro Ser Val Tyr Gly Phe Pro Ala Phe Thr Ser Ala Thr Glu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Val Thr Thr Phe Cys Leu Gly Phe Trp Val Val Arg Val Thr 20 25 30 Arg Thr Trp Val Pro Lys Gly Leu Lys Ser Pro Pro Gly Pro Trp Gly 35 40 45 Leu Pro Phe Ile Gly His Val Leu Thr Leu Gly Lys Asn Pro His Leu 50 55 60 Ser Leu Thr Lys Leu Ser Gln Gln Tyr Gly Asp Val Leu Gln Ile Arg 65 70 75 80 Ile Gly Ser Thr Pro Val Val Val Leu Ser Gly Leu Asn Thr Ile Lys 85 90 95 Gln Ala Leu Val Lys Gln Gly Asp Asp Phe Lys Gly Arg Pro Asp Leu 100 105 110 Tyr Ser Phe Thr Leu Ile Ala Asn Gly Gln Ser Met Thr Phe Asn Pro 115 120 125 Asp Ser Gly Pro Leu Trp Ala Ala Arg Arg Arg Leu Ala Gln Asn Ala 130 135 140 Leu Lys Ser Phe Ser Ile Ala Ser Asp Pro Thr Leu Ala Ser Ser Cys 145 150 155 160 Tyr Leu Glu Glu His Val Ser Lys Glu Ala Glu Tyr Leu Ile Ser Lys 165 170 175 Phe Gln Lys Leu Met Ala Glu Val Gly His Phe Asp Pro Phe Lys Tyr 180 185 190 Leu Val Val Ser Val Ala Asn Val Ile Cys Ala Ile Cys Phe Gly Arg 195 200 205 Arg Tyr Asp His Asp Asp Gln Glu Leu Leu Ser Ile Val Asn Leu Ser 210 215 220 Asn Glu Phe Gly Glu Val Thr Gly Ser Gly Tyr Pro Ala Asp Phe Ile 225 230 235 240 Pro Ile Leu Arg Tyr Leu Pro Asn Ser Ser Leu Asp Ala Phe Lys Asp 245 250 255 Leu Asn Lys Lys Phe Tyr Ser Phe Met Lys Lys Leu Ile Lys Glu His 260 265 270 Tyr Arg Thr Phe Glu Lys Gly His Ile Arg Asp Ile Thr Asp Ser Leu 275 280 285 Ile Glu His Cys Gln Asp Arg Arg Leu Asp Glu Asn Ala Asn Val Gln 290 295 300 Leu Ser Asp Asp Lys Val Ile Thr Ile Val Phe Asp Leu Phe Gly Ala 305 310 315 320 Gly Phe Asp Thr Ile Thr Thr Ala Ile Ser Trp Ser Leu Met Tyr Leu 325 330 335 Val Thr Asn Pro Arg Ile Gln Arg Lys Ile Gln Glu Glu Leu Asp Thr 340 345 350 Val Ile Gly Arg Asp Arg Gln Pro Arg Leu Ser Asp Arg Pro Gln Leu 355 360 365 Pro Tyr Leu Glu Ala Phe Ile Leu Glu Thr Phe Arg His Ser Ser Phe 370 375 380 Val Pro Phe Thr Ile Pro His Ser Thr Ile Arg Asp Thr Ser Leu Asn 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Ile Pro Lys Gly His Cys Val Phe Val Asn Gln Trp Gln 405 410 415 Val Asn His Asp Gln Glu Leu Trp Gly Asp Pro Asn Glu Phe Arg Pro 420 425 430 Glu Arg Phe Leu Thr Ser Ser Gly Thr Leu Asp Lys His Leu Ser Glu 435 440 445 Lys Val Ile Leu Phe Gly Leu Gly Lys Arg Lys Cys Ile Gly Glu Thr 450 455 460 Ile Gly Arg Leu Glu Val Phe Leu Phe Leu Ala Ile Leu Leu Gln Gln 465 470 475 480 Met Glu Phe Asn Val Ser Pro Gly Glu Lys Val Asp Met Thr Pro Ala 485 490 495 Tyr Gly Leu Thr Leu Lys His Ala Arg Cys Glu His Phe Gln Val Gln 500 505 510 Met Arg Ser Ser Gly Pro Gln His Leu Gln Ala 515 520 523
【図１】 本発明により得られたＰ−450 ｃ遺伝子を保
有する酵母菌体サッカロミセス・セレビシェー（Saccha
romyces cerevisiae) ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株及びＰ
−450 ｃ遺伝子を持たないプラスミドｐＡＡＨ５を有す
る酵母菌体の還元型CO結合物差スペクトルである。
有する酵母菌体サッカロミセス・セレビシェー（Saccha
romyces cerevisiae) ＡＨ２２（ｐＡＭＣ１）株及びＰ
−450 ｃ遺伝子を持たないプラスミドｐＡＡＨ５を有す
る酵母菌体の還元型CO結合物差スペクトルである。
【図２】 本発明により得られたＰ−450 ｃ遺伝子を保
有する酵母菌体サッカロミセス・セレビシェー（Saccha
romyces cerevisiae) ＳＨＹ３（ｐＡＭＣ１）株及びＰ
−450 ｃ遺伝子を持たないプラスミドｐＡＡＨ５を有す
る酵母菌体の還元型CO結合物差スペクトルである。
有する酵母菌体サッカロミセス・セレビシェー（Saccha
romyces cerevisiae) ＳＨＹ３（ｐＡＭＣ１）株及びＰ
−450 ｃ遺伝子を持たないプラスミドｐＡＡＨ５を有す
る酵母菌体の還元型CO結合物差スペクトルである。
【図３】 本発明により得られたＰ−450 ｃ遺伝子を保
有する酵母菌体サッカロミセス・セレビシェー（Saccha
romyces cerevisiae) ＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡＭＣ１）
株及びＰ−450 ｃ遺伝子を持たないプラスミドｐＡＡＨ
５を有する酵母菌体の還元型CO結合物差スペクトルであ
る。
有する酵母菌体サッカロミセス・セレビシェー（Saccha
romyces cerevisiae) ＮＡ８７−１１Ａ（ｐＡＭＣ１）
株及びＰ−450 ｃ遺伝子を持たないプラスミドｐＡＡＨ
５を有する酵母菌体の還元型CO結合物差スペクトルであ
る。
【図４】 精製Ｐ−450 ｃの酸化型吸収スペクトル及び
還元型CO結合物差スペクトルである。
還元型CO結合物差スペクトルである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (6)
- 【請求項１】 化１のアミノ酸配列を有するラット肝チ
トクロムＰ−450 ｃをコードする遺伝子を保有しラット
肝チトクロムＰ−450 ｃを生産する形質転換酵母を培養
することを特徴とするラット肝チトクロムＰ−450 ｃの
製造方法 【化１】 配列番号１ - 【請求項２】 ラット肝チトクロムＰ−450 ｃ遺伝子を
コードする領域を保有する組み換えプラスミドｐＡＭＣ
１を保持する酵母を培養することを特徴とする請求項１
の製造方法 - 【請求項３】 該酵母がサッカロミセス（Saccharomyce
s)属に属することを特徴とする請求項１の製造方法 - 【請求項４】 該酵母がサッカロミセス・セレビシェー
（Saccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２（pAMC１）株
(微工研菌寄第7752号) であることを特徴とする請求項
１の製造方法 - 【請求項５】 該酵母がサッカロミセス・セレビシェー
（Saccharomyces cerevisiae) ＳＨＹ３（ｐＡＭＣ１）
株 (微工研菌寄第7751号) であることを特徴とする請求
項１の製造方法 - 【請求項６】該酵母がサッカロミセス・セレビシェー
（Saccharomyces cerevisiae) ＮＡ８７−１１Ａ (ｐＡ
ＭＣ１）株 (微工研菌寄第7753号) であることを特徴と
する請求項１の製造方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4290681A JPH06104063B2 (ja) | 1984-08-24 | 1992-08-14 | ラット肝チトクロムＰ−４５０ ｃの製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59175159A JPS6156072A (ja) | 1984-08-24 | 1984-08-24 | ラット肝チトクロムｐ―４５０ｃに由来する一原子酸素添加活性を有する酵母菌株 |
| JP4290681A JPH06104063B2 (ja) | 1984-08-24 | 1992-08-14 | ラット肝チトクロムＰ−４５０ ｃの製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59175159A Division JPS6156072A (ja) | 1984-06-16 | 1984-08-24 | ラット肝チトクロムｐ―４５０ｃに由来する一原子酸素添加活性を有する酵母菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06121675A true JPH06121675A (ja) | 1994-05-06 |
| JPH06104063B2 JPH06104063B2 (ja) | 1994-12-21 |
Family
ID=26496513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4290681A Expired - Lifetime JPH06104063B2 (ja) | 1984-08-24 | 1992-08-14 | ラット肝チトクロムＰ−４５０ ｃの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06104063B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4842087A (en) * | 1986-07-11 | 1989-06-27 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Motor driven type power steering control device |
-
1992
- 1992-08-14 JP JP4290681A patent/JPH06104063B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4842087A (en) * | 1986-07-11 | 1989-06-27 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Motor driven type power steering control device |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06104063B2 (ja) | 1994-12-21 |
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