JP5222410B1 - 25−ヒドロキシビタミンd2の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】CYP2R1をコードするDNAを発現させた組み換え酵母(Saccharomyces cerevisiae)に紫外線照射する工程、紫外線照射後の組み換え酵母をインキュベートする工程、培養液中の25-ヒドロキシビタミンD2(以下、25(OH)D2と略記する)を回収する工程を含む25(OH)D2の製造方法。
【選択図】なし
Description
紫外線照射後の組み換え酵母をインキュベートする工程、
培養液中の25-ヒドロキシビタミンD2(以下、25(OH)D2と略記する)を回収する工程
を含む25(OH)D2の製造方法に関する。
(1)CYP2R1をコードするDNAを発現させた組み換え酵母(Saccharomyces cerevisiae)に紫外線照射する工程、
(2)紫外線照射後の組み換え酵母をインキュベートする工程、
(3)培養液中の25(OH)D2を回収する工程
CYP2R1は、例えば、哺乳類由来のCYP2R1であることができ、より具体的にはヒト由来CYP2R1であることができる。ヒト由来CYP2R1(AY323817)以外に、例えば、マウス由来CYP2R1(AY323818)、イヌ由来CYP2R1(XM849440)、アカゲザル由来CYP2R1(NM001193958)を挙げることもできる。各CYP2R1のDNAの配列番号と各CYP2R1のDNA配列の同一性(%)を以下の表に示す。尚、由来が異なるcDNAの間の同一性の検証結果は、図5〜10に示す。
工程(2)においては、紫外線照射後の組み換え酵母を同じ緩衝液中(例えば、グルコースを含む)でインキュベートする。
紫外線照射により図1に示すように、組み換え酵母内においてエルゴステロールがプレビタミンD2に変換され、さらに、プレビタミンD2のビタミンD2への変換を促進するため、及び酵母に導入されたCYP2R1によるビタミンD2の25(OH)D2への変換を促進するために、上記培養は実施される。従って、工程(2)における培養は、プレビタミンD2のビタミンD2への変換及びビタミンD2の25(OH)D2への変換を促進し得る条件で実施すればよい。そのような組み換え酵母のインキュベートは、組み換え酵母で発現しているCYP2R1が安定に高い活性を維持する条件を考慮して適宜決定することができる。温度条件としては、例えば、25〜40℃の範囲とすることができる。インキュベート時間は、プレビタミンD2のビタミンD2への変換及びビタミンD2の25(OH)D2への変換の進捗状況を考慮して適宜選択できる。
工程(3)においては、培養液中の25(OH)D2を回収する。組み換え酵母工程内で生成した25(OH)D2は、菌体内から菌体外にほとんど分泌されない。従って、25(OH)D2の回収は、例えば、実施例に記載のように、酵母菌体を培養液中から有機溶媒を用いて抽出することで行うことができる。溶媒抽出により回収された25(OH)D2は、さらに公知の方法で、適宜精製することもできる。
非特許文献1に記載の方法に従って、ヒト由来CYP2R1をコードするcDNAをクローニングし、酵母発現ベクターに導入した。酵母発現ベクターとしては小胞体膜酵素であるシトクロムP450の発現で実績のあるpGYR (図2)を用いた。得られたプラスミドをpGYR-2R1と命名した。塩化リチウム法によりサッカロマイセス・セレビシエAH22株を形質転換し、ヒトCYP2R1発現酵母を得た。
ヒトCYP2R1発現酵母を5mLのSD液体培地(2% グルコース、0.67% 窒素源 アミノ酸不含、20μg/ml L-ヒスチジン)に植菌し、30℃、200rpmで振盪培養を行った。得られた培養液を初期OD610値が0.1になるように50mLのSD液体培地に添加し、30℃、200rpmで振盪培養を行った。OD610値が2.5に到達した時点で、培養液全量を5000rpm、10分間遠心し、集菌した菌体を、5mLの100mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.4)で懸濁した。懸濁液に、グルコース(終濃度4%)、3-ヒドロキシプロピル-β‐シクロデキストリン(終濃度 0%もしくは0.2%)、および各基質ビタミンD3(VD3)もしくはビタミンD2(VD2);終濃度 50μM)を添加し、37℃、200rpmで振盪培養を行った。基質添加後、24時間後にグルコース(終濃度4%)を再添加し、さらに培養を続けた。48時間後の培養液500μLを回収し、この培養液(菌体懸濁液)に3倍容のクロロホルム:メタノール=3:1を加え、室温で20分間攪拌し、有機層を遠心エバポレーターで乾固した後、残渣をアセトニトリルに溶解し、HPLCにより、25(OH)D2を回収した。さらに、下記に示した方法により、回収した代謝物のHPLC分析を行った。
VD3代謝物;m/z 365 (M+H-2H2O), 12%; m/z 383 (M+H-H2O), 50%; m/z 401 (M+H),100%
VD2代謝物;m/z 395 (M+H-H2O), 40%; m/z 413 (M+H), 100%
ヒトCYP2R1発現酵母を20mLのSD液体培地に植菌し、30℃、200rpmで振盪培養を行った。得られた培養液を初期OD610値が0.1になるように200mLのSD液体培地に添加し、30℃、200rpmで振盪培養を行った。OD610値が2.5に到達した時点で、培養液全量を5000rpm、10分間遠心し、集菌した菌体を、20mLの100mMリン酸バッファー(pH 7.4)で懸濁し、グルコース(終濃度4%)を添加した。
配列番号2:アカゲザルCYP2R1のcDNA配列
配列番号3:イヌCYP2R1のcDNA配列
配列番号4:マウスCYP2R1のcDNA配列
配列番号5:ヒトCYP2R1のアミノ酸配列
配列番号6:アカゲザルCYP2R1のアミノ酸配列
配列番号7:イヌCYP2R1のアミノ酸配列
配列番号8:マウスCYP2R1のアミノ酸配列
Claims (4)
- ビタミンD2の25位水酸化活性を有するタンパク質であるCYP2R1をコードするDNAを発現させた組み換え酵母(Saccharomyces cerevisiae)に紫外線照射する工程、
紫外線照射後の組み換え酵母をインキュベートする工程、
培養液中の25-ヒドロキシビタミンD2(以下、25(OH)D2と略記する)を回収する工程
を含む25(OH)D2の製造方法。 - CYP2R1は、哺乳類由来である請求項1に記載の製造方法。
- CYP2R1をコードするDNAは、(a)配列表の配列番号1〜4のいずれかに記載の核酸配列を有するDNA、(b) 配列表の配列番号1に記載の核酸配列において1から150個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する核酸配列を有し、かつビタミンD2の25位水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNA、(c)配列表の配列番号5〜8のいずれかに記載のCYP2R1のアミノ酸配列をコードするDNA、または(d) 配列表の配列番号5に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつビタミンD2の25位水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNAである請求項1または2に記載の製造方法。
- 紫外線は、UV-Bを含む請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
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