JP2022548904A - 最適化されたテトラヒドロカンナビノール酸（ｔｈｃａ）合成ポリペプチド - Google Patents

最適化されたテトラヒドロカンナビノール酸（ｔｈｃａ）合成ポリペプチド Download PDF

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Abstract

本開示は、一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアント、当該操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、当該核酸を含む改変された宿主細胞を製造する方法、当該操作されたバリアントを発現する改変された宿主細胞、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための方法、およびテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをスクリーニングする方法を提供する。TIFF2022548904000096.tif152157

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月１８日に出願された米国特許出願第６２／９０２，３００号の継続出願であり、その各開示内容は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記述
配列表のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルが、米国特許法施行規則１．８２１（ｃ）のもと本明細書に付随して提出され、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。当該ファイルの詳細が、米国特許法施行規則１．５２（ｅ）（５）および１．７７（ｂ）（５）のもと要求され、以下のとおりである：ファイルの名称は、ＤＥＭＴ＿００７＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、作成日は２０２０年９月１７日、サイズは６９７１７６バイトである。コンピュータ可読形態で記録された配列表情報の内容は、（存在する場合）書面の配列表と同一であり、元の出願人によって提供される配列情報と同一であり、新たな内容を含まない。（存在する場合）電子形態で記録された情報は、本出願とともにＲｕｌｅ １３ｔｅｒのもと提出され、出願された明細書に含有される配列表と同一である。
背景
カンナビス属の植物は、何千年もの間、その医薬特性のためにヒトによって使用されてきた。現代では、カンナビスの生理活性効果は、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）およびカンナビジオール（ＣＢＤ）を含む数百の構造類似体が存在する、「カンナビノイド」と呼ばれる化合物の一種に起因する。これらの分子およびカンナビス材料の調製物は、慢性疼痛、多発性硬化症、癌関連悪心および嘔吐、体重減少、食欲喪失、痙縮、発作、ならびに他の状態のための治療剤としての適用が最近見出された。
Figure 2022548904000002
特定のカンナビノイドの生理学的効果は、ヒトおよび他の動物に見られる二つの細胞受容体との相互作用によって仲介されると考えられている。カンナビノイド受容体１型（ＣＢ１）は、脳、生殖系、および眼に共通する。カンナビノイド受容体２型（ＣＢ２）は、免疫系に共通し、動物モデルにおいて炎症に関連する治療効果を仲介する。カンナビノイド受容体および植物由来のカンナビノイドとのその相互作用の発見は、内因性リガンドの同定に先行した。
ＴＨＣおよびＣＢＤの他に、何百もの他のカンナビノイドが、カンナビスで同定されている。しかしながら、これらの化合物の多くは、低レベルで、より豊富なカンナビノイドと共に存在し、これにより、それらの治療能を研究するために植物から純粋な試料を得ることを困難にする。同様に、これらのタイプの生成物を化学的に合成する方法は、煩雑で費用がかかり、不十分な収率となる傾向がある。したがって、純粋なカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を製造する追加の方法が必要とされる。
一つの可能性のある方法は、酵母などの操作された微生物の発酵を介した生成である。微生物における関連する植物酵素の生成を操作することによって、潜在的に、植物から入手可能なものよりもはるかに低いコスト、かつはるかに高い純度での、様々な供給原料の広範なカンナビノイドへの変換を達成することが可能であり得る。この取り組みに対する重大な課題は、微生物における植物酵素、特に、カンナビノイド合成酵素などの分泌酵素の発現の困難さであり、これは、折り畳まれ、機能するために微生物の分泌経路をうまく横断しなければならない。カンナビノイド合成酵素の操作されたバリアント、改変された宿主細胞、および新規方法が、これらの課題に対処するために必要とされる。
概要
本開示は、一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアント、当該操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、当該核酸を含む改変された宿主細胞を製造する方法、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法、およびテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをスクリーニングする方法を提供する。本開示の操作されたバリアントは、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体（例えば、天然に存在しないカンナビノイド）を生成するのに有用であり得る。本開示の改変された宿主細胞は、カンナビノイドもしくはカンナビノイド誘導体（例えば、天然に存在しないカンナビノイド）の生成および／または本開示の操作されたバリアントを発現するのに有用であり得る。本開示はまた、本開示の操作されたバリアントを発現させるための改変された宿主細胞を提供する。加えて、本開示は、本開示の操作されたバリアントの調製を提供する。
本開示の態様は、一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントに関する。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、配列番号４４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、シグナルポリペプチド、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合ドメイン、ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）ドメイン、または前述の組み合わせにおいて少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、少なくとも一つの表面に露出したアミノ酸の置換を含む。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｒ３１、Ｐ４３、Ｐ４９、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ｈ５６、Ｌ５９、Ｍ６１、Ｍ６１、Ｓ６２、Ｌ７１、Ｓ１００、Ｖ１０３、Ｔ１０９、Ｑ１２４、Ｖ１２５、Ｌ１３２、Ｓ１３７、Ｈ１４３、Ｖ１４９、Ｗ１６１、Ｋ１６５、Ｎ１６８、Ｅ１６７、Ｓ１７０、Ｆ１７１、Ｐ１７２、Ｙ１７５、Ｇ１８０、Ｎ１９６、Ｈ２０８、Ｇ２３５、Ａ２５０、Ｉ２５７、Ｋ２６１、Ｌ２６９、Ｇ３１１、Ｆ３１７、Ｌ３２７、Ｋ３９０、Ｔ３７９、Ｓ４２９、Ｎ４６７、Ｙ５００、Ｎ５２８、Ｐ５３９、Ｐ５４２、Ｈ５４３、Ｈ５４４、およびＨ５４５からなる群から選択されるアミノ酸で、少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｒ３１Ｑ、Ｐ４３Ｅ、Ｐ４９Ｅ、Ｐ４９Ｋ、Ｐ４９Ｑ、Ｋ５０Ｔ、Ｌ５１Ｉ、Ｑ５５Ｅ、Ｑ５５Ｐ、Ｈ５６Ｅ、Ｌ５９Ｅ、Ｍ６１Ｗ、Ｍ６１Ｈ、Ｍ６１Ｓ、Ｓ６２Ｑ、Ｌ７１Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｖ１０３Ｆ、Ｔ１０９Ｖ、Ｑ１２４Ｄ、Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１２４Ｎ、Ｖ１２５Ｅ、Ｖ１２５Ｑ、Ｌ１３２Ｍ、Ｓ１３７Ｇ、Ｈ１４３Ｄ、Ｗ１６１Ｒ、Ｗ１６１Ｙ、Ｗ１６１Ｋ、Ｋ１６５Ａ、Ｎ１６８Ｓ、Ｅ１６７Ｐ、Ｙ１７５Ｆ、Ｇ１８０Ａ、Ｎ１９６Ｑ、Ｎ１９６Ｖ、Ｈ２０８Ｔ、Ａ２５０Ｔ、Ｉ２５７Ｖ、Ｋ２６１Ｃ、Ｇ３１１Ａ、Ｆ３１７Ｙ、Ｌ３２７Ｉ、Ｋ３９０Ｅ、Ｔ３７９Ｓ、Ｙ５００Ｍ、Ｙ５００Ｖ、Ｎ５２８Ｅ、Ｐ５４２Ｅ、Ｐ５４２Ｖ、Ｈ５４３Ｖ、Ｈ５４４Ａ、Ｈ５４５Ｄ、およびＨ５４５Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を少なくとも一つ含む。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、および配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５２、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、および配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合ドメイン、ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）ドメイン、または前述の組み合わせにおける少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、ＦＡＤ結合ドメインにおける少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５の不変のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、ＢＢＥドメインにおける少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５の不変のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ａ２８、Ｆ３４、Ｌ３５、Ｃ３７、Ｌ６４、Ｎ７０、Ｐ８７、Ｉ９３、Ｃ９９、Ｒ１０８、Ｒ１１０、Ｇ１１２、Ｅ１１７、Ｇ１１８、Ｓ１２０、Ｐ１２６、Ｆ１２７、Ｄ１３１、Ｄ１４１、Ｗ１４８、Ｇ１５２、Ａ１５３、Ｌ１５５、Ｇ１５６、Ｅ１５７、Ｙ１５９、Ｙ１６０、Ｎ１６３、Ａ１７３、Ｇ１７４、Ｃ１７６、Ｐ１７７、Ｔ１７８、Ｖ１７９、Ｇ１８２、Ｇ１８３、Ｈ１８４、Ｆ１８５、Ｇ１８７、Ｇ１８８、Ｇ１８９、Ｙ１９０、Ｇ１９１、Ｐ１９２、Ｌ１９３、Ｒ１９５、Ａ２０１、Ｄ２０２、Ｉ２０５、Ｄ２０６、Ｖ２１０、Ｇ２１４、Ｇ２２３、Ｄ２２５、Ｌ２２６、Ｆ２２７、Ｗ２２８、Ｒ２３１、Ｇ２３４、Ｓ２３７、Ｆ２３８、Ｇ２３９、Ｋ２４５、Ｉ２４６、Ｌ２４８、Ｖ２５１、Ｖ２５９、Ｑ２７６、Ｆ３１２、Ｓ３１３、Ｌ３２３、Ｃ３４１、Ｆ３５２、Ｓ３５４、Ｆ３８０、Ｋ３８１、Ｉ３８２、Ｋ３８３、Ｄ３８５、Ｙ３８６、Ｉ３９１、Ｍ４１２、Ｌ４１５、Ｇ４１９、Ｍ４２２、Ｉ４２５、Ｉ４３０、Ｐ４３１、Ｐ４３３、Ｈ４３４、Ｒ４３５、Ｇ４３７、Ｙ４４０、Ｗ４４３、Ｙ４４４、Ｉ４４５、Ｉ４６４、Ｙ４６５、Ｍ４６８、Ｔ４６９、Ｙ４７１、Ｖ４７２、Ｐ４７６、Ｒ４８４、Ｎ４９８、Ａ５０２、Ｎ５１３、Ｆ５１４、Ｋ５２１、Ｎ５２８、Ｆ５２９、Ｅ５３３、Ｑ５３４、およびＳ５３５からなる群から選択される少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｃ３７、Ｎ７０、Ｉ９３、Ｃ９９、Ｅ１１７、Ｓ１２０、Ｆ１２７、Ｄ１３１、Ｇ１５６、Ｅ１５７、Ｙ１５９、Ｇ１７４、Ｃ１７６、Ｇ１８２、Ｇ１８３、Ｆ１８５、Ｇ１８７、Ｇ１８８、Ｇ１８９、Ｙ１９０、Ｇ１９１、Ｐ１９２、Ｒ１９５、Ｄ２０２、Ｄ２０６、Ｇ２１４、Ｗ２２８、Ｇ２３４、Ｆ２３８、およびＬ２４８からなる群から選択される少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５の不変のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）でカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成する。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）でＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによって生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率で、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成する。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方に切断を含む。一部の実施形態では、切断された操作されたバリアントは、シグナルポリペプチドまたは膜アンカーを含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、天然のシグナルポリペプチドを欠く。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｃ末端に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のアミノ酸の切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｃ末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸の切断を含む。
本開示の別の態様は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、および配列番号１８５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、および配列番号１８５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。本開示の核酸の一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本開示の態様は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法に関し、方法は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を宿主細胞に導入することを含む。
本開示の別の態様は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むベクターに関する。
本開示の態様は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法に関し、方法は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む一つまたは複数のベクターを宿主細胞に導入することを含む。
本開示の別の態様は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞に関し、改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＧＯＴポリペプチドは、配列番号１７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＮｐｈＢポリペプチドは、配列番号１８８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、テトラケチド合成酵素（ＴＫＳ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸およびオリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＴＫＳポリペプチドは、配列番号１９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む三つ以上の異種核酸を含む。一部の実施形態では、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号２１または配列番号４８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む三つ以上の異種核酸を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、アシル活性化酵素（ＡＡＥ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＡＡＥポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、以下の：ａ）ＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧＳ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｂ）切断された３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル－ＣｏＡ還元酵素（ｔＨＭＧＲ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｃ）メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｄ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｅ）メバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素（ＭＶＤ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；またはｆ）イソペンテニル二リン酸異性化酵素（ＩＤＩ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸の一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＩＤＩ１ポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｔＨＭＧＲポリペプチドは、配列番号２７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＨＭＧＳポリペプチドは、配列番号２９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＭＫポリペプチドは、配列番号３９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＭＫポリペプチドは、配列番号３７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＭＶＤ１ポリペプチドは、配列番号３３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドは、配列番号３１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＰＤＣポリペプチドは、配列番号３５に対する少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＧＰＰＳポリペプチドは、配列番号４１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＫＡＲ２ポリペプチドは、配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＰＤＩ１ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＩＲＥ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＩＲＥ１ポリペプチドは、配列番号１１または配列番号１９０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＥＲＯ１ポリペプチドは、配列番号７に対する少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＦＡＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＦＡＤ１ポリペプチドは、配列番号１９２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＰＥＰ４ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＰＥＰ４ポリペプチドは、配列番号１５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＲＯＴ２ポリペプチドは、配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、真核細胞である。ある特定のこのような実施形態では、真核細胞は、酵母細胞である。ある特定のこのような実施形態では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。ある特定のこのような実施形態では、サッカロマイセス・セレビシエは、サッカロマイセス・セレビシエのタンパク質分解酵素欠損株である。
本開示の一部の実施形態では、一つまたは複数の核酸の少なくとも一つは、改変された宿主細胞の染色体に組み込まれる。本開示の一部の実施形態では、一つまたは複数の核酸の少なくとも一つは、染色体外で維持される。本開示の一部の実施形態では、一つまたは複数の核酸の少なくとも一つは、誘導性プロモーターに動作可能に連結される。本開示の一部の実施形態では、一つまたは複数の核酸の少なくとも一つは、構造性プロモーターに動作可能に連結される。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率と比較して、より速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞により生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率で、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く。
本開示の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。
本開示の別の態様は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法に関し、方法は、ａ）本開示の改変された宿主細胞を培地において培養することを含む。ある特定のこのような実施形態では、方法は、ｂ）生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を回収することを含む。一部の実施形態では、培地は、カルボン酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたＣ３－Ｃ１８カルボン酸である。ある特定のこのような実施形態では、置換されていないか、または置換されたＣ３－Ｃ１８カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたヘキサン酸である。一部の実施形態では、培地は、オリベトール酸またはオリベトール酸誘導体を含む。一部の実施形態では、カンナビノイドは、カンナビジオール酸、カンナビジオール、カンナビジバリン酸、またはカンナビジバリンである。一部の実施形態では、培地は、発酵性糖を含む。一部の実施形態では、培地は、前処理されたセルロース供給原料を含む。一部の実施形態では、培地は、非発酵性炭素源を含む。ある特定のこのような実施形態では、非発酵性炭素源は、エタノールを含む。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。
本開示の方法の一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本開示の改変された宿主細胞の代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を培養することを含む方法で生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）よりも多い量で生成され、この場合において、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠き、ならびにこの場合において、本開示の改変された宿主細胞、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で培養される。
本開示の方法の一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本開示の改変された宿主細胞の代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を培養することを含む方法で生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成され、この場合において、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠き、ならびにこの場合において、本開示の改変された宿主細胞、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で培養される。
本開示方法の一部の実施形態では、カンナビノイドは、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）であり、およびこの場合において、当該方法は、本開示の改変された宿主細胞の代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を培養することを含む方法において生成される場合と比較して、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率でＴＨＣＡを生成し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く。
本開示の態様は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法に関し、方法は、本開示の操作されたバリアントの使用を含む。ある特定のこのような実施形態では、方法は、生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を回収することを含む。本開示方法の一部の実施形態では、カンナビノイドは、テトラヒドロカンナビノール酸、テトラヒドロカンナビバリン酸、またはテトラヒドロカンナビバリンである。
本開示の方法の一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本開示の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの使用を含む方法で生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量よりも多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成され、この場合において本開示の操作されたバリアント、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される。
本開示の方法の一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本開示の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの使用を含む方法で生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％高い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成され、この場合において本開示の操作されたバリアント、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される。
本開示の方法の一部の実施形態では、カンナビノイドは、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）であり、この場合において当該方法は、本開示の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの使用を含む方法で生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率でＴＨＣＡを生成し、この場合において本開示の操作されたバリアント、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される。
本開示方法の一部の実施形態では、方法は、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。
本開示の別の態様は、一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをスクリーニングする方法に関するものであり、当該方法は、ａ）宿主細胞の集団を、対照集団と試験集団に分けること；ｂ）対照集団において、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドと、比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドを共発現させることであって、当該配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドは、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を第一のカンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）に変換することができ、比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、同じＣＢＧＡを異なる第二のカンナビノイドに変換することができること；ｃ）試験集団において、操作されたバリアントと比較テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドを共発現させることであって、当該操作されたバリアントは、ＣＢＧＡを、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドと同じ第一のカンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）に変換することができ、この場合において当該比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、同じＣＢＧＡを第二のカンナビノイドに変換することができ、そして試験集団および対照集団において、同様のレベルで発現されること；ｄ）試験集団と対照集団の両方により生成される、第二のカンナビノイドに対する第一のカンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）の比率を測定すること；およびｅ）試験集団と対照集団の両方により生成される、第一のカンナビノイドの量（ｍｇ／ＬまたはｍＭ）を測定すること、を含む。ある特定のこのような実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドと比較して、改善されたインビボ性能を有する操作されたバリアントを含む試験集団が特定され、この場合において改善されたインビボ性能は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で対照集団によって生成されるものと比較した、試験集団によって生成される第二のカンナビノイドに対する第一のカンナビノイドの比率の増大によって示される。ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、同様の培養条件下、同じ長さの時間で対照集団によって生成される量と比較して、試験集団によってより多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で第一のカンナビノイドを生成することによって、配列番号３のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドと比較して改善されたインビボ性能を有する操作されたバリアントを含む試験集団が特定される。
ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、カンナビジオール酸合成酵素ポリペプチドである。ある特定のこのような実施形態では、カンナビジオール酸合成酵素（ＣＢＤＡＳ）ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、第二のカンナビノイドは、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）である。
ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントをスクリーニングする方法の一部の実施形態では、操作されたバリアントは、本開示の操作されたバリアントである。
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、Ｓ２９株の生成において使用した発現コンストラクトを描写する。図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃに描写したコンストラクトも、以下の株：Ｓ６１、Ｓ１２２、Ｓ１７１、Ｓ１８１、Ｓ２２０、Ｓ２４１、Ｓ２７０、Ｓ４８７、Ｓ９５１、Ｓ１０００－Ｓ１０５９、Ｓ１０７２－１０７９、およびＳ１０８１の産生において使用された。図全体を通じて、表１の特定のコード配列に加えて、コンストラクトマップは、表５に記載する制御配列、非コード配列およびゲノムカセット配列を描写する。コンストラクトマップはまた、下流の制御（ターミネーター）配列の２００～２５０塩基対（ｂｐ）を有する、表１のオープンリィーディングフレームを特定する、先行する「ｍ」を用いて示される遺伝子を描写する（例えば、ｍＥＲＧ１３）。コンストラクトマップ中の矢印は、ある特定のＤＮＡ対の方向性を示す。部分名に先行する「！」は、使用したＤＮＡ設計ソフトウェアの出力であり、矢印の方向性と重複しており、無視できる。 同上。 同上。
図２は、Ｓ１８１株の生成において使用した発現コンストラクトを描写する。図２に描写した発現コンストラクトも、以下の株：Ｓ２２０、Ｓ２４１、Ｓ２７０、Ｓ４８７、Ｓ９５１、Ｓ１０００－Ｓ１０５９、Ｓ１０７２－１０７９、およびＳ１０８１の産生において使用された。
図３は、Ｓ２２０株の生成において使用した発現コンストラクトを描写する。図３に描写した発現コンストラクトも、以下の株：Ｓ２４１、Ｓ２７０、Ｓ４８７、Ｓ９５１、Ｓ１０００－Ｓ１０５９、Ｓ１０７２－１０７９、およびＳ１０８１の産生において使用された。
図４は、Ｓ２４１株の生成において使用した発現コンストラクトを描写する。図４に描写した発現コンストラクトも、以下の株：Ｓ２７０、Ｓ４８７、Ｓ９５１、Ｓ１０００－Ｓ１０５９、Ｓ１０７２－１０７９、およびＳ１０８１の産生において使用された。
図５は、Ｓ６１株の生成において使用した着地パッドコンストラクトを描写する。図５に描写した発現コンストラクトも、以下の株：Ｓ１２２、Ｓ１７１、Ｓ１８１、Ｓ２２０、Ｓ２４１、Ｓ２７０、Ｓ４８７、Ｓ９５１、Ｓ１０００－Ｓ１０５９、Ｓ１０７２－１０７９、およびＳ１０８１の産生において使用された。
図６は、Ｓ１２２株の生成において使用した発現コンストラクトを描写する。図６に描写した発現コンストラクトも、以下の株：Ｓ１７１、Ｓ１８１、Ｓ２２０、Ｓ２４１、Ｓ２７０、Ｓ４８７、Ｓ９５１、Ｓ１０００－Ｓ１０５９、Ｓ１０７２－１０７９、およびＳ１０８１の産生において使用された。
図７は、Ｓ１７１株の生成において使用した発現コンストラクトを描写する。図７に描写した発現コンストラクトも、以下の株：Ｓ１８１、Ｓ２２０、Ｓ２４１、Ｓ２７０、Ｓ４８７、Ｓ９５１、Ｓ１０００－Ｓ１０５９、Ｓ１０７２－１０７９、およびＳ１０８１の産生において使用された。
図８は、Ｓ２７０株の生成において使用した発現コンストラクトを描写する。図８に描写した発現コンストラクトも、以下の株：Ｓ４８７、Ｓ９５１、Ｓ１０００－Ｓ１０５９、Ｓ１０７２－１０７９、およびＳ１０８１の産生において使用された。
図９Ａおよび９Ｂは、Ｓ４８７株の産生において使用された発現コンストラクトを描写する。図９Ａおよび９Ｂにおいて描写された発現コンストラクトも、以下の株：Ｓ９５１、Ｓ１０００－Ｓ１０５９、Ｓ１０７２－１０７９、およびＳ１０８１の産生において使用された。 同上。
図１０は、Ｓ１０４２株の産生において使用した発現コンストラクトを描写する。
図１１は、以下の株の産生において使用した発現コンストラクトを描写する：Ｓ９５１、Ｓ１０００－Ｓ１０４１、Ｓ１０４３－Ｓ１０５９、Ｓ１０７２－１０７９、およびＳ１０８１。
詳細な説明
合成生物学は、産業宿主生物、例えば微生物を操作して、単純な糖原料を医薬品に変換することを可能にする。このアプローチには、標的分子を生成する遺伝子を特定することおよび産業宿主においてその活性を最適化することが含まれる。微生物生成は、農業および化学合成よりも有意にコスト上有利であり、可変性を低くし、標的分子の調整を可能にする。しかしながら、産業宿主生物において標的分子を生成するための経路を再構成するか、または創出することは、経路遺伝子と宿主の両方の有意な操作を必要とする場合がある。本開示は、一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアント、当該操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、当該核酸を含む改変された宿主細胞を製造する方法、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法、およびＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントをスクリーニングする方法を提供する。本開示の操作されたバリアントは、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体（例えば、天然に存在しないカンナビノイド）を生成するのに有用であり得る。本開示の改変された宿主細胞は、カンナビノイドもしくはカンナビノイド誘導体（例えば、天然に存在しないカンナビノイド）の生成および／または本開示の操作されたバリアントを発現するのに有用であり得る。本開示はまた、本開示の操作されたバリアントを発現させるための改変された宿主細胞を提供する。加えて、本開示は、本開示の操作されたバリアントの調製を提供する。
テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素、カンナビクロメン酸合成酵素、またはカンナビジオール酸合成酵素ポリペプチドなどの、カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、カンナビノイドの生合成において重要な役割を果たす。しかしながら、改変された宿主細胞におけるそれらの活性の再構成は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成における難題であり、その進歩を妨げると証明されている。カンナビノイド合成酵素は、分泌経路をうまく横断して、適切にフォールディングし、機能しなければならない。これらの分泌された植物酵素は、酵母細胞において発現されるように進化しておらず、結果として、乏しい活性を有し、それらの基質であるカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）のカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、またはテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）への変換が制限されている。酵素の活性を増大させる簡単な方法は、そのコピー数（発現）を増大させることである。しかしながら、酵母におけるＣＢＤＡＳおよびテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）遺伝子の発現は、有毒であり（タンパク質のミスフォールディングが原因である可能性が高い）、遺伝子の複数コピーを統合することにより活性をブーストする単純な試みは失敗する。生成物特性は、別の課題も呈する。天然のＣＢＤＡＳ酵素の主生成物はＣＢＤＡであるが、酵素はまた、多量のＴＨＣＡも生成し、これは、産業プロセスにおいて分離するための高価な追加の下流精製工程を必要とする、望ましくない副生成物である。
これらの理由から、天然のＣＢＤＡＳまたはＴＨＣＡＳ酵素は、産業目的に最適ではなく、改善された酵素が必要である。対象のパラメータには、触媒活性、生成物特性、酵素安定性、ならびにｐＨおよび温度最適条件が含まれる。酵素改善は、典型的には、多様性の生成（操作されたバリアントのライブラリー）を、対象の特性のスクリーンまたは選択と結び付けることによって達成される。操作されたバリアントをコードするＤＮＡライブラリーは、様々な方法で創出することができる。例えば、ライブラリーは、野生型遺伝子配列を鋳型として使用して、エラー傾向ＰＣＲを使用して創出することができる。得られたライブラリーは、ランダムな位置での可変数の変異を有する遺伝子からなる、非常に巨大なものであり得る。エラー傾向ＰＣＲは、安価で便利であるが、いくつかの欠点がある。まず、構築物一つ当たりの正確な数の変異の代わりに、分布が得られる。これは残念な交換を示す。少数の変異を中心とする分布は、スクリーニング能力を無駄にする多量のゼロ変異の野生型コンストラクトを含む。より多い数の変異を中心とする分布は、機能変異の所望の獲得の特定を妨げる機能変異の喪失を蓄積したコンストラクトを創出する可能性が高い。第二に、エラー傾向ＰＣＲは、変異バイアス（使用される低忠実度ポリメラーゼの固有特性）を導入し、これは、ライブラリーがある特定のタイプの変異を過小に表していることを意味する。エラー傾向ＰＣＲの強力な代替法は、飽和変異誘発であり、これには、タンパク質におけるあらゆる位置であらゆる可能性のあるアミノ酸を含有するライブラリーの合成を含む。ＤＮＡ合成技術の最近の進歩により、これらのライブラリーの品質は大幅に向上した。
操作されたバリアントをコードするライブラリーが創出されると、対象の特性を有する操作されたバリアントを選択またはスクリーニングする必要がある。これは、タンパク質産生宿主を使用して、操作されたバリアントを発現させ、精製し、その後、インビトロで試験することによって達成することができる。このようなアプローチは、操作されたバリアントの動態パラメータの慎重な測定、および注意深く制御された条件下での性能の評価を可能にする。しかしながら、操作された微生物株における適用については、どのインビトロシステムも細胞環境を正確に表さないため、インビトロデータは極めて誤解を招く可能性がある。この場合、最善の選択肢は、操作された生成株内で最終的に実行しなければならない、正確な状況で操作されたバリアントを試験することである。カンナビノイド合成酵素の場合、このような生成株は、基質ＣＢＧＡを過剰に生成するように操作されるであろう。このインビボシステムに伴う一つの課題は、変動性が高いことである。大きなライブラリーを試験するとき、この変動性により、野生型酵素活性よりもわずかに改善されたクローンを識別することが難しくなる可能性がある。ライブラリー酵素生成力価と不変の競合酵素力価の比率を計算することによって、データの変動性を有意に低減することが可能である。これは、生物学的変数が、両方の酵素に同じように影響を与える傾向があり、これにより、効果の正規化が可能になるためである。動態パラメータとは異なり、競合比は、ＫｍおよびＫｃａｔなどの酵素触媒パラメータの変化ならびに機能的操作されたバリアントの定常状態レベルの変化の両方（発現および安定性）について報告する。
上記の方法の使用を通じて、本開示は、テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントを提供する。本明細書において、様々な操作されたバリアントがスクリーニングされた。ＴＨＣＡの力価は、５８の異なるバリアントにおいて改善された（野生型の標準偏差外）。本開示のこれら操作されたバリアントは、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体（例えば、天然に存在しないカンナビノイド）を生成するのに有用であり得る。本開示の操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）でカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成し得る。加えて、本開示の操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによって生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得る。同様の条件は、同じ温度、ｐＨ、緩衝液、および／または発酵条件での、ならびに同じ培地および／または反応溶媒を含み得る。
本開示の方法は、天然で生じるおよび天然に存在しないカンナビノイドを生成するための本開示のＴＨＣＡＳポリペプチドの操作された微生物（例えば、改変された宿主細胞）または操作されたバリアントを使用することを含み得る。天然で生じるカンナビノイドおよび天然に存在しないカンナビノイド（例えば、カンナビノイド誘導体）は、その複雑な構造に起因して化学合成を使用して生成するための課題である。本開示の方法により、糖およびカルボン酸などの単純な前駆体から注文のカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための生きている細胞内の代謝経路の構築を可能にする。本明細書において開示される一つまたは複数のポリペプチドまたは操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む本明細書において開示される一つまたは複数の核酸（例えば、異種核酸）は、宿主微生物に導入され、これにより、安価な供給原料、例えば、糖の、最終生成物：カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体への段階的変換を可能になり得る。これらの生成物は、本明細書において開示される一つまたは複数の核酸（例えば、異種核酸）を含む発現コンストラクトまたはベクターの選択および構築によって特定することができ、これにより、ＴＨＣおよびＴＨＣＡなどの、選択されたカンナビノイドならびにカンナビスにおいて低レベルで見られるあまり一般的でないカンナビノイド種；またはカンナビノイド誘導体の効率的なバイオプロダクションが可能になる。バイオプロダクションはまた、化学合成を使用して行う課題である、定義された立体化学を有するカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の合成を可能にする。改変された宿主細胞内でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成し、生合成経路を創出するために、本開示のＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸の組み合わせを発現するか、または過剰発現し得る。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本開示はまた、本開示のＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸（例えば、異種核酸）を用いて改変された宿主細胞の分泌経路改変を提供する。一部の実施形態では、ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。宿主細胞における分泌経路の改変は、これらのバリアントが、分泌経路を通じて処理されるので、本開示の操作されたバリアントの発現および溶解性を改善し得る。改変された酵母細胞などの、改変された宿主細胞における、本開示の操作されたバリアントなどの、分泌経路を通じて処理されたポリペプチドの活性の再構成は、課題であり、不確かであり得る。頻繁には、発現された操作されたバリアントは、ミスフォールディングされるか、または誤った場所に局在化されてもよく、活性を欠く低発現の発現された操作されたバリアント、操作されたバリアント凝集、低減した宿主細胞生存率、および／または細胞死を生じる。加えて、ミスフォールディングされるか、または誤った場所に局在化される発現された操作されたバリアントの蓄積は、改変された宿主細胞内での代謝ストレスを誘導し、これにより、改変された宿主細胞を傷害し得る。発現された操作されたバリアントは、ジスルフィド結合、グリコシル化およびトリミングなどの、フォールディングならびに活性、ならびに低減した酵素活性を有する不活性なポリペプチドまたはポリペプチドを与える補因子についての必須の翻訳後改変を欠き得る。
本開示の改変された宿主細胞は、改変された酵母細胞であってもよい。酵母細胞は、既知の条件を使用して培養され、迅速に増殖し、安全であると一般にみなされ得る。酵母細胞は、全ての真核生物に共通する分泌経路を含有する。本明細書において考察される通り、本開示のＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸（例えば、異種核酸）を用いて改変された酵母宿主細胞におけるその分泌経路の操作は、改変されたサッカロマイセス・セレビシエなどの、改変された酵母宿主細胞の操作されたバリアントの発現、フォールディング、および酵素活性ならびに生存率を改善し得る。さらに、本開示の操作されたバリアントをコードするコドン最適化されているヌクレオチド配列の使用は、操作されたバリアントの発現および活性ならびに改変されたサッカロマイセス・セレビシエなどの、改変された酵母宿主細胞の生存率を改善し得る。
所望のカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を可能にすることに加えて、本開示は、農業ベースの生成より、信頼でき、かつ経済的なプロセスを提供する。微生物発酵は、農作物に必要な月数に対して数日で完了することができ、気候変化または土壌汚染（例えば、重金属による）の影響を受けず、高い力価で純粋な生成物を生成することができる。
本開示はまた、ＴＨＣを含む高価値のカンナビノイド、ならびにその誘導体の経済的な生成のためのプラットフォームを提供する。これはまた、実行可能な生成方法が存在しない、異なるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。本明細書において開示される操作されたバリアント、方法、および改変された宿主細胞を使用して、カンナビノイドおよびカンナビノイド誘導体は、培地１リットル当たり１００ｍｇを超える量、培地１リットル当たり１ｇを超える量、培地１リットル当たり１０ｇを超える量、培地１リットル当たり１００ｇを超える量で生成されてもよい。
加えて、本開示は、ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアント、単純な前駆体からカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体をインビボまたはインビトロで生成するための方法、改変された宿主細胞、および核酸を提供する。本明細書において開示される核酸（例えば、異種核酸）は、微生物（例えば、改変された宿主細胞）に導入され、本開示の操作されたバリアントなどの、一つまたは複数のポリペプチドの発現または過剰発現をもたらし、次いで、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成のため、インビトロまたはインビボで利用され得る。一部の実施形態では、インビトロの方法は、無細胞である。
カンナビノイド生合成
ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントをコードする一つまたは複数の核酸（例えば、異種核酸）に加えて、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体生合成経路に存在するポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する一つまたは複数のポリペプチドをコードする一つまたは複数の核酸（例えば、異種核酸）は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生合成のための方法および改変された宿主細胞において有用であり得る。カンナビノイド前駆体としては、例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡが挙げられ得る。
カンナビスにおいて、カンナビノイドは、三つのポリペプチドの作用によって、共通の代謝産物前駆体であるゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）およびヘキサノイル－ＣｏＡから生成される。ヘキサノイル－ＣｏＡおよびマロニル－ＣｏＡを組み合わせて、テトラケチド合成酵素（ＴＫＳ）ポリペプチドによって、１２－炭素テトラケチド中間体を得る。次いで、このテトラケチド中間体を、オリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）ポリペプチドによって環化して、オリベトール酸を生成する。次いで、オリベトール酸を、共通のイソプレノイド前駆体ＧＰＰを用いて、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）ポリペプチド（例えば、ＣｓＰＴ４ポリペプチド）によってプレニル化して、「マザーカンナビノイド」としても知られるカンナビノイドである、ＣＢＧＡを生成する。次いで、本開示のＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントは、ＣＢＧＡを他のカンナビノイド、例えば、ＴＨＣＡなどに変換する。熱または光の存在下で、酸性カンナビノイドは、脱カルボキシ化を経て、例えば、ＴＨＣＡがＴＨＣを生成し得る。
ＧＰＰおよびヘキサノイル－ＣｏＡは、いくつかの経路を通じて創出され得る。これらの経路に存在するポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する一つまたは複数のポリペプチドをコードする一つまたは複数の核酸（例えば、異種核酸）は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の合成のための方法および改変された宿主細胞において有用であり得る。
ＧＰＰを創出するか、またはＧＰＰを創出する生合成経路の一部であるポリペプチドは、メバロン酸（ＭＥＶ）経路に存在するポリペプチド（例えば、一つまたは複数のＭＥＶ経路ポリペプチド）の少なくとも一つの活性を有する一つまたは複数のポリペプチドであってもよい。本明細書において使用される場合、用語「メバロン酸経路」または「ＭＥＶ経路」は、アセチル－ＣｏＡをイソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換する生合成経路を指し得る。メバロン酸経路は、以下の工程：（ａ）アセチル－ＣｏＡの二つの分子を縮合して、アセトアセチル－ＣｏＡを生じる工程（例えば、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドの作用による）；（ｂ）アセトアセチル－ＣｏＡをアセチル－ＣｏＡと縮合して、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）を形成する工程（例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧＳ）ポリペプチドの作用による）；（ｃ）ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸に変換する工程（例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）ポリペプチドの作用による）；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５－ホスフェートにリン酸化する工程（例えば、メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）ポリペプチドの作用による）；（ｅ）メバロン酸５－ホスフェートをメバロン酸５－ピロホスフェートに変換する工程（例えば、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチドの作用による）；（ｆ）メバロン酸５－ピロホスフェートをイソペンテニルピロホスフェートに変換する工程（例えば、メバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素（ＭＶＤ１）ポリペプチドの作用による）；および（ｇ）イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換する工程（例えば、イソペンテニルピロホスフェート異性化酵素（ＩＤＩ１）ポリペプチドの作用による）を触媒するポリペプチドを含む。次いで、ゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＰＰＳ）ポリペプチドは、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ上で作用して、ＧＰＰを創出する。
ヘキサノイル－ＣｏＡを創出するポリペプチドは、アシル－ＣｏＡ化合物またはアシル－ＣｏＡ化合物誘導体（例えば、アシル活性化酵素ポリペプチド、脂肪酸アシル－ＣｏＡ合成酵素ポリペプチド、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチド）を創出するポリペプチドを含み得る。ヘキサノイルＣｏＡ誘導体、アシル－ＣｏＡ化合物、またはアシル－ＣｏＡ化合物誘導体はまた、このようなポリペプチドを介して形成され得る。
Figure 2022548904000003
ＧＰＰおよびヘキサノイル－ＣｏＡはまた、アセチル－ＣｏＡの二つの分子を縮合して、ピルビン酸からアセトアルデヒドを介してアセチル－ＣｏＡを創出するアセトアセチル－ＣｏＡおよびピルビン酸脱炭酸酵素ポリペプチドを創出するポリペプチドを含む経路を通じて創出されてもよい。ヘキサノイルＣｏＡ誘導体、アシル－ＣｏＡ化合物、またはアシル－ＣｏＡ化合物誘導体はまた、このような経路を介して形成され得る。
一般的な情報
ある特定の態様では、本開示の実施は、別段の示唆がない限り、当分野の技術の範囲内にある分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を利用する。このような技術は、文献：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，”（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）．Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４），ａｎｄ Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）において完全に説明されており、これらは、当業者に、本出願において使用される多くの用語の一般的な指針を提供する。
本明細書で使用される場合、「カンナビノイド」または「カンナビノイド化合物」は、今までカンナビス・サティバでのみ見出されてきた、ある種の固有のメロテルペノイドのメンバーを指し得る。カンナビノイドとしては、カンナビクロメン（ＣＢＣ）型（例えば、カンナビクロメン酸）、カンナビゲロール（ＣＢＧ）型（例えば、カンナビゲロール酸）、カンナビジオール（ＣＢＤ）型（例えば、カンナビジオール酸）、Δ９－トランス－テトラヒドロカンナビノール（Δ９－ＴＨＣ）型（例えば、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸）、Δ８－トランス－テトラヒドロカンナビノール（Δ８－ＴＨＣ）型、カンナビシクロール（ＣＢＬ）型、カンナビエルソイン（ＣＢＥ）型、カンナビノール（ＣＢＮ）型、カンナビノジオール（ＣＢＮＤ）型、カンナビトリオール（ＣＢＴ）型、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）、カンナビゲロール酸モノメチルエーテル（ＣＢＧＡＭ）、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビゲロールモノメチルエーテル（ＣＢＧＭ）、カンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）、カンナビゲロバリン（ＣＢＧＶ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビクロメバリン酸（ＣＢＣＶＡ）、カンナビクロメバリン（ＣＢＣＶ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビジオールモノメチルエーテル（ＣＢＤＭ）、カンナビジオール－Ｃ４（ＣＢＤ－Ｃ４）、カンナビジバリン酸（ＣＢＤＶＡ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビジオールコール（ＣＢＤ－Ｃ１）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸Ａ（ＴＨＣＡ－Ａ）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸Ｂ（ＴＨＣＡ－Ｂ）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸－Ｃ４（ＴＨＣＡ－Ｃ４）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール－Ｃ４（ＴＨＣ－Ｃ４）、Δ９－テトラヒドロカンナビバリン酸（ＴＨＣＶＡ）、Δ９－テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）、Δ９－テトラヒドロカンナビオルコリ酸（ＴＨＣＡ－Ｃ１）、Δ９－テトラヒドロカンナビオルコール（ＴＨＣ－Ｃ１）、Δ７－シス－イソ－テトラヒドロカンナビバリン、Δ８－テトラヒドロカンナビノール酸（Δ８－ＴＨＣＡ）、Δ８－テトラヒドロカンナビノール（Δ８－ＴＨＣ）、カンナビシクロール酸（ＣＢＬＡ）、カンナビシクロール（ＣＢＬ）、カンナビシクロバリン（ＣＢＬＶ）、カンナビエルソン酸Ａ（ＣＢＥＡ－Ａ）、カンナビエルソン酸Ｂ（ＣＢＥＡ－Ｂ）、カンナビエルソイン（ＣＢＥ）、カンナビエルソイン酸、カンナビシトラン酸、カンナビノリック酸（ＣＢＮＡ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビノールメチルエーテル（ＣＢＮＭ）、カンナビノール－Ｃ４、（ＣＢＮ－Ｃ４）、カンナビバリン（ＣＢＶ）、カンナビノール－Ｃ２（ＣＮＢ－Ｃ２）、カンナビオルコール（ＣＢＮ－Ｃ１）、カンナビノジオール（ＣＢＮＤ）、カンナビノジバリン（ＣＢＶＤ）、カンナビトリオール（ＣＢＴ）、１０－エチオキシ－９－ヒドロキシ－デルタ－６ａ－テトラヒドロカンナビノール、８，９－ジヒドロキシル－デルタ－６ａ－テトラヒドロカンナビノール、カンナビトリオールバリン（ＣＢＴＶＥ）、デヒドロカンナビフラン（ＤＣＢＦ）、カンナビフラン（ＣＢＦ）、カンナビクロマノン（ＣＢＣＮ）、カンナビシトラン（ＣＢＴ）、１０－オキソ－デルタ－６ａ－テトラヒドロカンナビノール（ＯＴＨＣ）－デルタ－９－シス－テトラヒドロカンナビノール（シス－ＴＨＣ）、３，４，５，６－テトラヒドロ－７－ヒドロキシ－アルファ－アルファ－２－トリメチル－９－ｎ－プロピル－２，６－メタノ－２Ｈ－１－ベンゾキソシン－５－メタノール（ＯＨ－イソ－ＨＨＣＶ）、カンナビリプソール（ＣＢＲ）、およびトリヒドロキシ－デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（トリＯＨ－ＴＨＣ）が、挙げられ得るが、これらに限定されない。
本明細書において詳細に示されるアシル－ＣｏＡ化合物は、以下の構造：
Figure 2022548904000004
（式中、Ｒは、置換されていない脂肪酸側鎖、あるいは一つまたは複数の官能基および／もしくは反応基で置換されているか、またはそれを含む、脂肪酸側鎖であり得る）を有する化合物（すなわち、アシル－ＣｏＡ化合物誘導体）を含み得る。
本明細書で使用される場合、ヘキサノイルＣｏＡ誘導体、アシル－ＣｏＡ化合物誘導体、カンナビノイド誘導体、またはオリベトール酸誘導体は、一つまたは複数の官能基および／もしくは反応基で置換された、またはそれで置換されたヘキサノイルＣｏＡ、アシル－ＣｏＡ化合物、カンナビノイド、あるいはオリベトール酸を指し得る。官能基としては、アジド、ハロ（例えば、塩化物、ブ臭化物、ヨウ化物、フッ素）、メチル、アルキル（分岐および直鎖アルキル基を含む）、アルキニル、アルケニル、メトキシ、アルコキシ、アセチル、アミノ、カルボキシル、カルボニル、オキソ、エステル、ヒドロキシル、チオ（例えば、チオール）、シアノ、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルケニル、シクロアルキルアルキニル、シクロアルケニルアルキル、シクロアルケニルアルケニル、シクロアルケニルアルキニル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロシクリル、スピロシクリル、ヘテロスピロシクリル、チオアルキル（またはアルキルチオ）、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、スルホン、スルホニル、スルホキシド、アミド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノ、Ｎ－オキシド、イミド、エナミン、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ニトリル、アラルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、ニトロ、チオキソなどが、挙げられ得るが、これらに限定されない。適当な反応基としては、アジド、カルボキシル、カルボニル、アミン（例えば、アルキルアミン（例えば、低級アルキルアミン）、アリールアミン）、ハロゲン化物、エステル（例えば、アルキルエステル（例えば、低級アルキルエステル、ベンジルエステル）、アリールエステル、置換されたアリールエステル）、シアノ、チオエステル、チオエーテル、ハロゲン化スルホニル、アルコール、チオール、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ヨードアセトアミド、マレイミド、ヒドラジン、アルキニル、アルケニルなどが、挙げられ得るが、これらに必ずしも限定されない。反応基は、対象の分子の共有結合を促進し得る。対象の適切な分子には、検出可能な標識；画像化剤；毒素（細胞毒を含む）；リンカー；ペプチド；薬物（例えば、小分子薬）；特定の結合対のメンバー；エピトープタグ；標的受容体による結合のためのリガンド；精製を目的とするためのタグ；溶解性を増大させる分子；バイオアベイラビリティを増強する分子；インビボ半減期を増大させる分子；特定の細胞型を標的とする分子；特定の組織を標的とする分子；血液脳関門を通過させる分子；表面への選択的結合を促進するための分子などが、挙げられ得るが、これらに限定されない。官能基および反応基は、置換されていないか、または一つまたは複数の官能基もしくは反応基で置換されていてもよい。
カンナビノイド誘導体またはオリベトール酸誘導体はまた、天然のカンナビノイドまたはオリベトール酸に存在する一つまたは複数の化学部分を欠く化合物を指す場合もある。そのような化学部分としては限定されないが、メチル、アルキル、アルケニル、メトキシ、アルコキシ、アセチル、カルボキシル、カルボニル、オキソ、エステル、ヒドロキシル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルケニル、シクロアルケニルアルキル、ヘテロアルケニルアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロアリールアルケニル、アリールアルケニル、ヘテロシクリル、アラルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキルなどが挙げられ得る。一部の実施形態では、カンナビノイド誘導体またはオリベトール酸誘導体は、本明細書において記載される官能基および／または反応基のいずれかの一つまたは複数を含んでもよい。官能基および反応基は、置換されていないか、または一つまたは複数の官能基もしくは反応基で置換されていてもよい。
本明細書で使用される「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指してもよい。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは複数鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、遺伝子、合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはポリマーを含むプリンおよびピリミジン塩基、あるいは他の天然で生じる、化学的もしくは生化学的に改変された、天然で生じない、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むが、これらに限定されない。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され得、コードアミノ酸および非コードアミノ酸、ならびに化学的もしくは生化学的に改変されたアミノ酸または誘導体化されたアミノ酸が含まれ得る、任意の長さのアミノ酸の高分子形態を指し得る。本明細書において開示されるポリペプチドは、全長ポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、切断されたポリペプチド、融合ポリペプチド、または改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。本明細書において開示されるポリペプチドはまた、アミノ酸挿入、欠失、変異、および／または置換によって、特異的に列挙された「参照」ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）とは異なるバリアントであってもよい。
「テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの操作されたバリアント」または「本開示の操作されたバリアント」は、テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素活性を有する非野生型ポリペプチドを示し得る。当業者は、公知の方法を使用して、操作されたバリアントのテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素活性を測定することができる。例えば、ＧＣ－ＭＳまたはＬＣ－ＭＳによって、または本明細書において提供される実施例において記載される通りである。操作されたバリアントは、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドなどの、野生型テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素配列と比較して、アミノ酸置換を有し得る。置換に加えて、操作されたバリアントは、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドなどの、野生型テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素配列と比較して、切断、付加、および／もしくは欠失、ならびに／または他の変異を含んでもよい。操作されたバリアントは、非野生型テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素配列と比較して、置換を有してもよい。置換に加えて、操作されたバリアントは、非野生型テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素配列と比較して、切断、付加、および／もしくは欠失ならびに／または他の変異を含んでもよい。本明細書に記載される操作されたバリアントは、親テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドからの少なくとも一つのアミノ酸残基置換を含有する。一部の実施形態では、親テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、野生型配列である。一部の実施形態では、親テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、非野生型配列である。
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、通常、天然では見出されないものを指し得る。そのため、異種ヌクレオチド配列は、（ａ）その宿主細胞に対して外来性（すなわち、細胞に対して「外因性」である）；（ｂ）宿主細胞において天然に見出される（すなわち、「内因性」）が、細胞において非天然の量（すなわち、宿主細胞において天然で見出されるものより多い量または少ない量）で存在する；（ｃ）宿主細胞において天然で見出されるが、天然の座位の外側に位置する；または（ｄ）宿主細胞において天然で見出されるが、イントロンが除去されるか、もしくは付加されてもよい。用語「異種ヌクレオチド配列」または用語「異種核酸」は、天然で所定の細胞において通常見出されない核酸またはヌクレオチド配列を指し得る。コドン最適化されているヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列の例であってもよい。用語「異種酵素」または「異種ポリペプチド」は、天然で所定の細胞において通常見出されない酵素またはポリペプチドを指し得る。用語は、（ａ）所定の細胞に対して外因性である（すなわち、宿主細胞に天然で存在しないか、または宿主細胞における所定の状況で、天然で存在しない核酸によってコードされる）；または（ｂ）宿主細胞において天然で見出される（例えば、細胞にとって内因性である核酸によってコードされる酵素またはポリペプチド）が、非天然（例えば、天然で見出されるより多いもしくは少ない）量で宿主細胞において生成される、酵素あるいはポリペプチドを包含する。例えば、異種ポリペプチドは、宿主細胞において天然に存在するポリペプチドの変異したバージョンを含んでもよい。異種核酸は、（ａ）その宿主細胞に対して外来性（すなわち、細胞に対して「外因性」である）；（ｂ）宿主細胞において天然に見出される（すなわち、「内因性」）が、細胞において非天然の量（すなわち、宿主細胞において天然で見出されるものより多い量または少ない量）で存在する；または（ｃ）宿主細胞において天然で見出されるが、天然の座位の外側に位置してもよい。一部の実施形態では、異種核酸は、コドン最適化されているヌクレオチド配列を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、用語「一つまたは複数の異種核酸」または「一つまたは複数の異種ヌクレオチド配列」は、一つまたは複数のポリペプチドをコードする一つまたは複数のヌクレオチド配列を含む異種核酸を指してもよい。一部の実施形態では、これらの一つまたは複数の異種核酸は、一つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。他の実施形態では、これらの一つまたは複数の異種核酸は、一つより多くのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。一部の実施形態では、これらの一つまたは複数の異種核酸は、同じポリペプチドの複数コピーをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。一部の実施形態では、これらの一つまたは複数の異種核酸は、異なるポリペプチドの複数のコピーをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「増大した比」は、本明細書において開示される別のポリペプチド、操作されたバリアント、方法、および／または改変された宿主細胞（例えば、本明細書において開示される比較ポリペプチド、操作されたバリアント、方法、および／または改変された宿主細胞）によって生成される同じ二つの生成物間のモル比、質量（もしくは重量）比、モル濃度比、または集団濃度比と比較して、本明細書において開示されるポリペプチド、操作されたバリアント、方法、および／または改変された宿主細胞によって生成される二つの分子間のモル比の増大、質量（もしくは重量）比の増大、モル濃度比の増大、または集団濃度（例えば、ｍｇ／Ｌもしくはｍｇ／ｍＬ）の増大を指してもよい。例えば、本明細書において開示される操作されたバリアントにより生成されるＣＢＣＡに対するＴＨＣＡの比率１００：１は、本明細書において開示される異なる操作されたバリアントにより生成されるＣＢＣＡに対するＴＨＣＡの比率１１：１と比較して、ＣＢＣＡに対するＴＨＣＡの割合が高い。
本明細書で使用される場合、ＣＢＣＡに対するＴＨＣＡの比率などの、本明細書において開示されるポリペプチド、操作されたバリアント、方法、および／または改変された宿主細胞によって生成される生成物の比は、モル比、質量（もしくは重量）比、モル濃度比、または集団濃度（例えば、ｍｇ／Ｌもしくはｍｇ／ｍＬ）比を指してもよい。例えば、本明細書に開示される改変宿主細胞が、４ｍＭ ＴＨＣＡと、１ｍＭ ＣＢＣＡを生成した場合、ＣＢＣＡに対するＴＨＣＡの比率は、４：１である。
「動作可能に連結された」は、記載される成分が、それらが通常の機能を果たすように構成される、エレメントの配置を指し得る。したがって、コード配列に動作可能に連結された制御配列は、コード配列の発現に影響を与えることができる。制御配列は、その発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続する必要はない。したがって、例えば、介在する、翻訳されていないが転写された配列は、プロモーター配列とコード配列の間に存在することができ、プロモーター配列は、コード配列に依然として「動作可能に連結されている」とみなすことができる。
「単離された」は、その天然の状態でそれらに通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まないポリペプチドまたは核酸を指し得る。単離されたポリペプチドまたは核酸は、それが天然で見出される形態または設定以外であってもよい。したがって、単離されたポリペプチドおよび核酸は、それらが天然の細胞に存在するポリペプチドおよび核酸と区別され得る。単離された核酸またはポリペプチドは、このような成分が存在する場合、単離された核酸またはポリペプチドを含む混合物における一つまたは複数の他の成分から精製されてもよい。
「改変された宿主細胞」（「組み換え宿主細胞」と呼称される場合もある）とは、例えば発現ベクターまたはコンストラクトなどの異種核酸が導入された宿主細胞を指す場合もある。例えば、改変された真核宿主細胞は、異種核酸を適切な真核宿主細胞へ導入することにより生成されてもよい。
本明細書で使用される場合、「無細胞システム」は、細胞溶解物、細胞抽出物あるいは調整物中の細胞の実質的に全てが、破壊されているか、またはそうでなければ、全てまたは選択された細胞成分、例えば、小器官、タンパク質、核酸、細胞膜自体（またはそのフラグメントもしくは成分）などが、細胞から放出されるか、または適当な培地に再懸濁されるか、および／または細胞環境から精製されるように、処理された、他の調製物を指してもよい。無細胞システムは、精製および／または単離されたポリペプチドから調製される反応混合物、ならびに適切な試薬および緩衝液を含み得る。
一部の実施形態では、保存的置換が、ポリペプチドの３次元構造または機能を破壊することなく、ポリペプチドのアミノ酸配列においてなされてもよい。保存的置換は、当業者によって、アミノ酸を、互いに同様の疎水性、極性、およびＲ鎖長で置換することによって、達成され得る。加えて、異なる種由来の相同なタンパク質の整列させた配列を比較することによって、保存的置換は、コードされるタンパク質の基本的機能を変更することなく、種間で変異されているアミノ酸残基を位置決定することによって、同定されてもよい。「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指し得る。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなり得；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンからなり得；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンからなり得；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなり得；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなり得；酸性側鎖を有するアミノ酸の群は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなり得；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンからなり得る。典型的な保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンである。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する特定のパーセント「配列同一性」を有し、これは、整列されたとき、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが、二つの配列を比較するとき、同じであり、かつ同じ相対位置にあることを意味する。配列同一性は、多数の異なる方法で決定することができる。配列同一性を決定するために、配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｌｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ，ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｔｃｏｆｆｅｅ／ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／
Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／．を含むサイトにおいて世界中で入手可能な、様々な方法およびコンピュータープログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ－ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴなど）を使用して整列することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０を参照のこと。
本開示がさらに記載される前に、本開示が、それ自体が当然変動し得る、記載される特定の実施形態に限定されないことは理解されるべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるため、本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態を記述する目的でのみ使用されており、限定は意図されないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈が別段に明確に示さない限り下限の１０分の１までの、それぞれの介在する値およびその規定される範囲における介在する値が、本開示に包含されることは、理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、より小さな範囲に独立して含まれてもよく、また、既定の範囲における任意の具体的に排除された限界を条件として、本開示内に包含される。既定の範囲が、限界の一方または両方を含む場合、その含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も、本開示に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または均等な任意の方法および材料も、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。本明細書において言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されるものと併せて、方法および／または材料を開示し、記載するため、参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指さない限り、複数の参照元を含み得ることに留意されたい。したがって、例えば、「カンナビノイド化合物」または「カンナビノイド」への言及は、複数のこのような化合物を含んでもよく、「改変された宿主細胞」への言及は、一つまたは複数の改変された宿主細胞および当業者に公知のその均等物などを含んでもよい。さらに、請求の範囲が、任意の適宜選択構成要素を排除するために、記載され得ることに留意されたい。したがって、本陳述は、請求項の構成要素の列挙、または「負」の制限の使用と併せて、このような排他的用語を「単独」、「のみ」などの使用のための先行する基礎として役立つことが意図される。
明確にするため、別々の実施形態の文脈において記載される、本開示のある特定の特性はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことは、理解される。反対に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載される、本開示の様々な特性はまた、別々に、または任意の適当な下位組み合わせで提供されてもよい。本開示に関する実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、それぞれおよびすべての組み合わせが個別にかつ明示的に開示されるかのように、本明細書において開示される。加えて、様々な実施形態およびその構成要素のすべての下位の組み合わせもまた、本開示により具体的に包含され、それぞれおよびすべてのこのような下位組み合わせが個別にかつ明示的に本明細書において開示されるかのように、本明細書において開示される。
テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアント
本明細書において、一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントが開示される。本発明者らは、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＴＨＣＡＳポリペプチドのアミノ酸位置を特定し、それらは置換されたとき、操作されたバリアントの一つまたは複数の性能の改善を生じさせ得る。本開示の一態様では、置換は、カンナビス・サティバ由来の配列番号４４のＴＨＣＡＳポリペプチドにおける位置に対応する部位においてである。カンナビス・サティバ由来の配列番号４４のＴＨＣＡＳポリペプチドは、以下のドメインを含む：
１．シグナルポリペプチド：アミノ酸１～２８。
２．ＦＡＤ結合ドメイン：アミノ酸７７～２５１。
３．ＢＢＥドメイン：アミノ酸４８０～５３８。
カンナビス・サティバ由来の配列番号４４のＴＨＣＡＳポリペプチドは、以下のドメイン表面露出アミノ酸も含む：２８～３３、３５、３６、３９～４５、４７～５０、５２、５５～５９、６１、６２、６５、６６、６９、７１～７７、７９、８０、８２、８８、８９、９０、９４、９８、１０１、１０２、１０４、１０９、１１４、１１５、１２４、１２５、１２６、１３３、１３４、１３６～１３９、１４１～１４５、１４８、１５０、１６１、１６４～１６８、１７６、１８３、１９７、２０２、２０５、２０８、２１３、２１５～２２１、２２３、２２４、２２５、２３１、２３６、２４５、２４７、２５０、２５２、２５３、２５９、２６１、２６２～２６８、２７１、２７４、２７５、２７８、２７９、２８１、２８２、２８４、２８５、２８６、２９２、２９４、２９６～３０６、３１２、３１８、３２１、３２２、３２３、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３６、３３８～３４１、３４３、３４４、３４９、３５６、３５８～３６８、３７１～３７４、３７７、３７８、３８９、３９０、３９１、３９３、３９４、３９５、３９９、４０２、４０３、４０５、４０６、４０８、４０９、４１０、４１３、４２２、４２４～４３０、４３７、４３８、４４４、４４６、４４８、４５０、４５１～４５４、４５６、４５７、４６０、４６３、４６４、４６７、４６８、４７０、４７１、４７２、４７５～４７８、４８３、４８４、４８７、４８８、４９１、４９３～５０２、５０４、５０５、５０８、５０９、５１３、５１６、５１７、５２０、５２４、５２５、５２７、５２８、５３０、５３２、および５４０～５４５。
本明細書において開示される操作されたバリアントにおける残基位置は、参照アミノ酸配列である、カンナビス・サティバ由来の配列番号４４のＴＨＣＡＳポリペプチド（本明細書において表１において示される；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ８ＧＴＢ６）に関連して特定される。したがって、「Ｆ３１７」への言及は、カンナビス・サティバ由来の配列番号４４のＴＨＣＡＳポリペプチドにおいて、Ｎ末端から３１７番目のアミノ酸であるアミノ酸を特定し、この場合においてメチオニンが第一のアミノ酸である。３１７番目のアミノ酸は、カンナビス・サティバ由来の配列番号４４のＴＨＣＡＳポリペプチドにおいて、フェニルアラニン（Ｆ）である。当業者は、Ｆ３１７アミノ酸が、異なる種由来のＴＨＣＡＳポリペプチドまたは異なるアイソフォームにおいては、異なる位置を有し得ることを理解する。これらの操作されたバリアントは、本開示によって包含されることが意図される。
特定のアミノ酸またはアミノ酸変更（「残基の相違」）が存在するポリペプチド配列位置は、「Ｘｎ」、または「位置ｎ」（式中、ｎは、参照配列に関するアミノ酸位置を指す）として本明細書において記載されるときもある。したがって、「Ｘ３１７」への言及は、カンナビス・サティバ由来の配列番号４４のＴＨＣＡＳポリペプチドにおいて、Ｎ末端から３１７番目のアミノ酸であるアミノ酸を特定する。
異なる特定された残基での参照配列における特定のアミノ酸の置換である特定の置換変異は、慣習的な表記法「Ｘ（数）Ｙ」（式中、Ｘは、参照配列におけるアミノの１文字識別子であり、「数」は、参照配列におけるアミノ酸位置であり、Ｙは、操作された配列におけるアミノ酸置換の１文字識別子である）により示され得る。したがって、「Ｆ３１７Ｙ」への言及は、カンナビス・サティバ由来の配列番号４４のＴＨＣＡＳポリペプチドにおいて、Ｎ末端から３１７番目のアミノ酸であるフェニルアラニンが、チロシンにより置き換えられる置換を特定する。
分泌されたポリペプチドであるカンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、改変された酵母細胞などの、改変された宿主細胞における発現を邪魔し得る構造特性を有する。カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、ジスルフィド結合、Ｎ－グリコシル化部位を含む多数のグリコシル化部位、および両共有結合したフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子部分を含む。したがって、改変された酵母細胞などの、改変された宿主細胞における発現カンナビノイド合成酵素ポリペプチドの活性の再構成は、課題であり、不確かであり得る。頻繁に、これらの分泌されたポリペプチドは、ミスフォールディングされるか、または誤った場所に局在化され、これにより、低発現、活性を欠くポリペプチド、低減した宿主細胞生存率、および／または細胞死がもたらされる。本明細書において考察される、操作されたバリアントは、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＴＨＣＡＳポリペプチドと比較して、改善された発現、フォールディング、および酵素活性を有し得る。加えて、本開示の操作されたバリアントの発現は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＴＨＣＡＳポリペプチドを発現する改変された宿主細胞と比較して、本明細書において開示される改変された宿主細胞の生存率を増強し得る。
本開示は、一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントを提供する。特定のかかる実施形態では、操作されたバリアントは、配列番号４４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、配列番号４４に対して少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示は、一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントを提供し、操作されたバリアントは、シグナルポリペプチド、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合ドメイン、ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）ドメイン、または前述の組み合わせにおいて少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、少なくとも一個のアミノ酸置換は、シグナルポリペプチドに存在する。ある特定のこのような実施形態では、操作されたバリアントは、シグナルポリペプチドにおける少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、シグナルポリペプチドにおける１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、少なくとも一個のアミノ酸置換は、ＦＡＤ結合ドメインに存在する。ある特定のこのような実施形態では、操作されたバリアントは、ＦＡＤ結合ドメインにおける少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、ＦＡＤ結合ドメインにおける１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のアミノ酸置換を含む。少なくとも一個のアミノ酸置換がＦＡＤドメインに存在する一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｘ１００、Ｘ１０３、Ｘ１０９、Ｘ１２４、Ｘ１２５、Ｘ１３２、Ｘ１３７、Ｘ１４３、Ｘ１４９、Ｘ１６１、Ｘ１６５、Ｘ１６７、Ｘ１６８、Ｘ１７０、Ｘ１７１、Ｘ１７２、Ｘ１７５、Ｘ１８０、Ｘ１９６、Ｘ２０８、Ｘ２３５、およびＸ２５０からなる群から選択されるアミノ酸において少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。少なくとも一個のアミノ酸置換がＦＡＤドメインに存在する一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｓ１００、Ｖ１０３、Ｔ１０９、Ｑ１２４、Ｖ１２５、Ｌ１３２、Ｓ１３７、Ｈ１４３、Ｖ１４９、Ｗ１６１、Ｋ１６５、Ｅ１６７、Ｎ１６８、Ｓ１７０、Ｆ１７１、Ｐ１７２、Ｙ１７５、Ｇ１８０、Ｎ１９６、Ｈ２０８、Ｇ２３５、およびＡ２５０からなる群から選択されるアミノ酸において少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。少なくとも一個のアミノ酸置換がＦＡＤドメインに存在する一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｌ１３２Ｍ、Ｓ１７０Ｔ、Ｆ１７１Ｉ、Ｎ１９６Ｔ、Ｎ１９６Ｑ、およびＮ１９６Ｖからなる群から選択される少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、少なくとも一個のアミノ酸置換は、ＢＢＥドメインに存在する。ある特定のこのような実施形態では、操作されたバリアントは、ＢＢＥドメインにおける少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、ＢＢＥドメインにおける１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のアミノ酸置換を含む。少なくとも一個のアミノ酸置換がＢＢＥドメインに存在する一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｘ５００およびＸ５２８からなる群から選択されるアミノ酸において少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。ＢＢＥドメインでは、操作されたバリアントは、Ｙ５００およびＮ５２８からなる群から選択されるアミノ酸で少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。少なくとも一個のアミノ酸置換がＢＢＥドメインに存在する一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｙ５００Ｍ、Ｙ５００Ｖ、およびＮ５２８Ｅからなる群から選択される少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。
本開示は、一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントを提供し、操作されたバリアントは、少なくとも一個の表面に露出したアミノ酸の置換を含む。ある特定のこのような実施形態では、少なくとも一つの疎水性表面に露出したアミノ酸は、親水性アミノ酸で置換される。一部の実施形態では、少なくとも一つの親水性表面に露出したアミノ酸は、疎水性アミノ酸で置換される。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５の表面に露出したアミノ酸の置換を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の表面に露出したアミノ酸の置換を含む。操作されたバリアントが少なくとも一つの表面に露出したアミノ酸の置換を含む一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｘ１３２、Ｘ１７０、Ｘ１７１、Ｘ１９６、Ｘ２６１、Ｘ２６９、Ｘ３１７、およびＸ５３９からなる群から選択される少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。操作されたバリアントが少なくとも一つの表面に露出したアミノ酸の置換を含む一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｌ１３２、Ｓ１７０、Ｆ１７１、Ｎ１９６、Ｋ２６１、Ｌ２６９、Ｆ３１７、およびＰ５３９からなる群から選択される少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。操作されたバリアントが少なくとも一つの表面に露出したアミノ酸の置換を含む一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｌ１３２Ｍ、Ｓ１７０Ｔ、Ｆ１７１Ｉ、Ｎ１９６Ｔ、Ｎ１９６Ｑ、Ｎ１９６Ｖ、Ｋ２６１Ｃ、Ｌ２６９Ｉ、Ｆ３１７Ｙ、およびＰ５３９Ｔからなる群から選択される少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。親水性アミノ酸での疎水性の表面に露出したアミノ酸の置換は、水性（非トリコーム）環境における本開示の操作されたバリアントの溶解性を改善し得る、溶媒に曝露させたアミノ酸の親水性を増大させ得る。
本開示は操作されたバリアントを提供するものであり、この場合において当該操作されたバリアントは、Ｘ３１、Ｘ４３、Ｘ４９、Ｘ５０、Ｘ５１、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ５９、Ｘ６１、Ｘ６２、Ｘ７１、Ｘ１００、Ｘ１０３、Ｘ１０９、Ｘ１２４、Ｘ１２５、Ｘ１３２、Ｘ１３７、Ｘ１４３、Ｘ１４９、Ｘ１６１、Ｘ１６５、Ｘ１６８、Ｘ１６７、Ｘ１７０、Ｘ１７１、Ｘ１７２、Ｘ１７５、Ｘ１８０、Ｘ１９６、Ｘ２０８、Ｘ２３５、Ｘ２５０、Ｘ２５７、Ｘ２６１、Ｘ２６９、Ｘ３１１、Ｘ３１７、Ｘ３２７、Ｘ３９０、Ｘ３７９、Ｘ４２９、Ｘ４６７、Ｘ５００、Ｘ５２８、Ｘ５３９、Ｘ５４２、Ｘ５４３、Ｘ５４４、およびＸ５４５からなる群から選択されるアミノ酸で少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。かかる操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得る。一部の実施形態では、かかる操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによりＣＢＧＡから生成されたＴＨＣＡの量よりも多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得、そして同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドにより生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得る。
本開示は操作されたバリアントを提供するものであり、この場合において当該操作されたバリアントは、Ｒ３１、Ｐ４３、Ｐ４９、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ｈ５６、Ｌ５９、Ｍ６１、Ｓ６２、Ｌ７１、Ｓ１００、Ｖ１０３、Ｔ１０９、Ｑ１２４、Ｖ１２５、Ｌ１３２、Ｓ１３７、Ｈ１４３、Ｗ１６１、Ｋ１６５、Ｎ１６８、Ｅ１６７、Ｙ１７５、Ｇ１８０、Ｎ１９６、Ｈ２０８、Ａ２５０、Ｉ２５７、Ｋ２６１、Ｇ３１１、Ｆ３１７、Ｌ３２７、Ｋ３９０、Ｔ３７９、Ｄ４２９、Ｙ５００、Ｎ５２８、Ｐ５４２、Ｈ５４３、Ｈ５４４、およびＨ５４５からなる群から選択されるアミノ酸で少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。かかる操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得る。一部の実施形態では、かかる操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによりＣＢＧＡから生成されたＴＨＣＡの量よりも多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得、そして同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドにより生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得る。
本開示は操作されたバリアントを提供するものであり、この場合において当該操作されたバリアントは、Ｒ３１Ｑ、Ｐ４３Ｅ、Ｐ４９Ｅ、Ｐ４９Ｋ、Ｐ４９Ｑ、Ｋ５０Ｔ、Ｌ５１Ｉ、Ｑ５５Ｅ、Ｑ５５Ｐ、Ｈ５６Ｅ、Ｌ５９Ｅ、Ｍ６１Ｗ、Ｍ６１Ｈ、Ｍ６１Ｓ、Ｓ６２Ｑ、Ｌ７１Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｖ１０３Ｆ、Ｔ１０９Ｖ、Ｑ１２４Ｄ、Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１２４Ｎ、Ｖ１２５Ｅ、Ｖ１２５Ｑ、Ｌ１３２Ｍ、Ｓ１３７Ｇ、Ｈ１４３Ｄ、Ｗ１６１Ｒ、Ｗ１６１Ｙ、Ｗ１６１Ｋ、Ｋ１６５Ａ、Ｎ１６８Ｓ、Ｅ１６７Ｐ、Ｙ１７５Ｆ、Ｇ１８０Ａ、Ｎ１９６Ｑ、Ｎ１９６Ｖ、Ｈ２０８Ｔ、Ａ２５０Ｔ、Ｉ２５７Ｖ、Ｋ２６１Ｃ、Ｇ３１１Ａ、Ｆ３１７Ｙ、Ｌ３２７Ｉ、Ｋ３９０Ｅ、Ｔ３７９７Ｓ、Ｙ５００Ｍ、Ｙ５００Ｖ、Ｎ５２８Ｅ、Ｐ５４２Ｅ、Ｐ５４２Ｖ、Ｈ５４３Ｖ、Ｈ５４４Ａ、Ｈ５４５Ｄ、およびＨ５４５Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を少なくとも一つ含む。かかる操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得る。一部の実施形態では、かかる操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによりＣＢＧＡから生成されたＴＨＣＡの量よりも多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得、そして同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドにより生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得る。
本開示は操作されたバリアントを提供するものであり、この場合において当該操作されたバリアントは、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５２、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、および配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。かかる操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得る。一部の実施形態では、かかる操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによりＣＢＧＡから生成されたＴＨＣＡの量よりも多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得、そして同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドにより生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得る。
本開示は操作されたバリアントを提供するものであり、この場合において当該操作されたバリアントは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。本開示は操作されたバリアントを提供するものであり、この場合において当該操作されたバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載されるアミノ酸置換の組み合わせが為され、得られた操作されたバリアントは、テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）の性能の改善についてスクリーニングされる。本明細書において記載される置換の全ての組み合わせを含む操作されたバリアントは、本開示によって包含されることが意図される。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、本明細書において記載されるアミノ酸置換の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の本明細書において記載されるアミノ酸置換（例えば、１～３０個の本明細書において記載されるアミノ酸置換）を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の本明細書において記載されるアミノ酸置換（例えば、１～１５個の本明細書において記載されるアミノ酸置換）を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の本明細書において記載されるアミノ酸置換（例えば、１～１０個の本明細書において記載されるアミノ酸置換）を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、１個、２個、３個、４個、または５個の本明細書において記載されるアミノ酸置換（例えば、１～５個の本明細書において記載されるアミノ酸置換）を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、１個、２個、３個、または４個の本明細書において記載されるアミノ酸置換（例えば、１～４個の本明細書において記載されるアミノ酸置換）を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、１個、２個、または３個の本明細書において記載されるアミノ酸置換（例えば、１～３個の本明細書において記載されるアミノ酸置換）を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、１個または２個の本明細書において記載されるアミノ酸置換（例えば、１～２個の本明細書において記載されるアミノ酸置換）を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、１個の本明細書において記載されるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、２個の本明細書において記載されるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、３個の本明細書において記載されるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、４個の本明細書において記載されるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、５個の本明細書において記載されるアミノ酸置換を含む。
本開示は、操作されたバリアントを提供し、操作されたバリアントは、少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む。本開示は、操作されたバリアントを提供し、操作されたバリアントは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合ドメイン、ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）ドメイン、または前述の組み合わせにおいて少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、ＦＡＤ結合ドメインにおいて少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、操作されたバリアントは、ＦＡＤ結合ドメインにおける少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５の不変のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、ＦＡＤ結合ドメインにおいて少なくとも一つの不変のアミノ酸を含み、この場合において当該少なくとも一つの不変のアミノ酸は、Ｘ８７、Ｘ９３、Ｘ９９、Ｘ１０８、Ｘ１１０、Ｘ１１２、Ｘ１１７、Ｘ１１８、Ｘ１２０、Ｘ１２６、Ｘ１２７、Ｘ１３１、Ｘ１４１、Ｘ１４８、Ｘ１５２、Ｘ１５３、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５７、Ｘ１５９、Ｘ１６０、Ｘ１６３、Ｘ１７０、Ｘ１７１、Ｘ１７２、Ｘ１７３、Ｘ１７４、Ｘ１７６、Ｘ１７７、Ｘ１７８、Ｘ１７９、Ｘ１８２、Ｘ１８３、Ｘ１８４、Ｘ１８５、Ｘ１８７、Ｘ１８８、Ｘ１８９、Ｘ１９０、Ｘ１９１、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ１９５、Ｘ２０１、Ｘ２０２、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１４、Ｘ２２３、Ｘ２２５、Ｘ２２６、Ｘ２２７、Ｘ２２８、Ｘ２３１、Ｘ２３４、Ｘ２３７、Ｘ２３８、Ｘ２３９、Ｘ２４５、Ｘ２４６、Ｘ２４８、およびＸ２５１からなる群から選択される。一部の実施形態では、これら不変のアミノ酸のうちの一つ以上が変異することにより、一つ以上のカンナビノイドの力価が低下する。一部の実施形態では、アミノ酸のＸ１７０、Ｘ１７１、および／またはＸ１７２のうちの一つ以上が変異することにより、一つ以上のカンナビノイドの力価が低下する。操作されたバリアントがＦＡＤ結合ドメインにおいて少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む一部の実施形態では、当該少なくとも一つの不変のアミノ酸は、Ｐ８７、Ｉ９３、Ｃ９９、Ｒ１０８、Ｒ１１０、Ｇ１１２、Ｅ１１７、Ｇ１１８、Ｓ１２０、Ｐ１２６、Ｆ１２７、Ｄ１３１、Ｄ１４１、Ｗ１４８、Ｇ１５２、Ａ１５３、Ｌ１５５、Ｇ１５６、Ｅ１５７、Ｙ１５９、Ｙ１６０、Ｎ１６３、Ｓ１７０、Ｆ１７１、Ｐ１７２、Ｇ１７３、Ｇ１７４、Ｃ１７６、Ｐ１７７、Ｔ１７８、Ｖ１７９、Ｇ１８２、Ｇ１８３、Ｈ１８４、Ｆ１８５、Ｇ１８７、Ｇ１８８、Ｇ１８９、Ｙ１９０、Ｇ１９１、Ａ１９２、Ｌ１９３、Ｒ１９５、Ａ２０１、Ｄ２０２、Ｉ２０５、Ｄ２０６、Ｖ２１０、Ｇ２１４、Ｇ２２３、Ｄ２２５、Ｌ２２６、Ｆ２２７、Ｗ２２８、Ｒ２３１、Ｇ２３４、Ｎ２３７、Ｆ２３８、Ｇ２３９、Ｋ２４５、Ｉ２４６、Ｌ２４８、およびＶ２５１からなる群から選択される。一部の実施形態では、アミノ酸のＳ１７０、Ｆ１７１、および／またはＰ１７２のうちの一つ以上が変異することにより、一つ以上のカンナビノイドの力価が低下する。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、ＢＢＥドメインにおいて少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、操作されたバリアントは、ＢＢＥドメインにおける少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５の不変のアミノ酸を含む。操作されたバリアントがＢＢＥドメインにおいて少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む一部の実施形態では、当該少なくとも一つの不変のアミノ酸は、Ｘ４８５、Ｘ４９９、Ｘ５０３、Ｘ５１４、Ｘ５１５、Ｘ５２２、Ｘ５２９、Ｘ５３０、Ｘ５３４、Ｘ５３５、およびＸ５３６からなる群から選択される。操作されたバリアントがＢＢＥドメインにおいて少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む一部の実施形態では、当該少なくとも一つの不変のアミノ酸は、Ｒ４８５、Ｎ４９９、Ａ５０３、Ｎ５１４、Ｆ５１５、Ｋ５２２、Ｎ５２９、Ｆ５３０、Ｅ５３４、Ｑ５３５、およびＳ５３６からなる群から選択される。
本開示は操作されたバリアントを提供するものであり、この場合において当該操作されたバリアントは、Ｘ２８、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３７、Ｘ６４、Ｘ７０、Ｘ８７、Ｘ９３、Ｘ９９、Ｘ１０８、Ｘ１１０、Ｘ１１２、Ｘ１１７、Ｘ１１８、Ｘ１２０、Ｘ１２６、Ｘ１２７、Ｘ１３１、Ｘ１４１、Ｘ１４８、Ｘ１５２、Ｘ１５３、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５７、Ｘ１５９、Ｘ１６０、Ｘ１６３、Ｘ１７３、Ｘ１７４、Ｘ１７６、Ｘ１７７、Ｘ１７８、Ｘ１７９、Ｘ１８２、Ｘ１８３、Ｘ１８４、Ｘ１８５、Ｘ１８７、Ｘ１８８、Ｘ１８９、Ｘ１９０、Ｘ１９１、Ｘ１９２、Ｘ１９３、Ｘ１９５、Ｘ２０１、Ｘ２０２、Ｘ２０５、Ｘ２０６、Ｘ２１０、Ｘ２１４、Ｘ２２３、Ｘ２２５、Ｘ２２６、Ｘ２２７、Ｘ２２８、Ｘ２３１、Ｘ２３４、Ｘ２３７、Ｘ２３８、Ｘ２３９、Ｘ２４５、Ｘ２４６、Ｘ２４８、Ｘ２５１、Ｘ２６０、Ｘ２７７、Ｘ３１３、Ｘ３１４、Ｘ３２４、Ｘ３４２、Ｘ３５３、Ｘ３５５、Ｘ３８１、Ｘ３８２、Ｘ３８３、Ｘ３８４、Ｘ３８６、Ｘ３８７、Ｘ３９２、Ｘ４１３、Ｘ４１６、Ｘ４２０、Ｘ４２３、Ｘ４２６、Ｘ４３１、Ｘ４３２、Ｘ４３４、Ｘ４３５、Ｘ４３６、Ｘ４３８、Ｘ４４１、Ｘ４４４、Ｘ４４５、Ｘ４４６、Ｘ４６５、Ｘ４６６、Ｘ４６９、Ｘ４７０、Ｘ４７２、Ｘ４７３、Ｘ４７７、Ｘ４８５、Ｘ４９９、Ｘ５０３、Ｘ５１４、Ｘ５１５、Ｘ５２２、Ｘ５２９、Ｘ５３０、Ｘ５３４、Ｘ５３５、およびＸ５３６からなる群から選択される少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む。特定のかかる実施形態では、操作されたバリアントは、Ｘ３７、Ｘ７０、Ｘ９３、Ｘ９９、Ｘ１１７、Ｘ１２０、Ｘ１２７、Ｘ１３１、Ｘ１５６、Ｘ１５７、Ｘ１５９、Ｘ１７４、Ｘ１７６、Ｘ１８２、Ｘ１８３、Ｘ１８５、Ｘ１８７、Ｘ１８８、Ｘ１８９、Ｘ１９０、Ｘ１９１、Ｘ１９２、Ｘ１９５、Ｘ２０２、Ｘ２０６、Ｘ２１４、Ｘ２２８、Ｘ２３４、Ｘ２３８、Ｘ２４８、Ｘ２７７、Ｘ３１４、Ｘ３２４、Ｘ３５５、Ｘ３８２、Ｘ３８４、Ｘ３８６、Ｘ４２０、Ｘ４２３、Ｘ４３６、Ｘ４４１、Ｘ４４４、Ｘ４４５、Ｘ４７２、Ｘ４７７、Ｘ５１４、Ｘ５１５、Ｘ５２９、およびＸ５３５からなる群から選択される少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ａ２８、Ｆ３４、Ｌ３５、Ｃ３７、Ｌ６４、Ｎ７０、Ｐ８７、Ｉ９３、Ｃ９９、Ｒ１０８、Ｒ１１０、Ｇ１１２、Ｅ１１７、Ｇ１１８、Ｓ１２０、Ｐ１２６、Ｆ１２７、Ｄ１３１、Ｄ１４１、Ｗ１４８、Ｇ１５２、Ａ１５３、Ｌ１５５、Ｇ１５６、Ｅ１５７、Ｙ１５９、Ｙ１６０、Ｎ１６３、Ａ１７３、Ｇ１７４、Ｃ１７６、Ｐ１７７、Ｔ１７８、Ｖ１７９、Ｇ１８２、Ｇ１８３、Ｈ１８４、Ｆ１８５、Ｇ１８７、Ｇ１８８、Ｇ１８９、Ｙ１９０、Ｇ１９１、Ｐ１９２、Ｌ１９３、Ｒ１９５、Ａ２０１、Ｄ２０２、Ｉ２０５、Ｄ２０６、Ｖ２１０、Ｇ２１４、Ｇ２２３、Ｄ２２５、Ｌ２２６、Ｆ２２７、Ｗ２２８、Ｒ２３１、Ｇ２３４、Ｓ２３７、Ｆ２３８、Ｇ２３９、Ｋ２４５、Ｉ２４６、Ｌ２４８、Ｖ２５１、Ｖ２６０、Ｑ２７７、Ｆ３１３、Ｓ３１４、Ｌ３２４、Ｃ３４２、Ｆ３５３、Ｓ３５５、Ｆ３８１、Ｋ３８２、Ｉ３８３、Ｋ３８４、Ｄ３８６、Ｙ３８７、Ｉ３９２、Ｍ４１３、Ｌ４１６、Ｇ４２０、Ｍ４２３、Ｉ４２６、Ｉ４３１、Ｐ４３２、Ｐ４３４、Ｈ４３５、Ｒ４３６、Ｇ４３８、Ｙ４４１、Ｗ４４４、Ｙ４４５、Ｉ４４６、Ｉ４６５、Ｙ４６６、Ｍ４６９、Ｔ４７０、Ｙ４７２、Ｖ４７３、Ｐ４７７、Ｒ４８５、Ｎ４９９、Ａ５０３、Ｎ５１４、Ｆ５１５、Ｋ５２２、Ｎ５２９、Ｆ５３０、Ｅ５３４、Ｑ５３５、およびＳ５３６からなる群から選択される少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む。特定のかかる実施形態では、操作されたバリアントは、Ｃ３７、Ｎ７０、Ｉ９３、Ｃ９９、Ｅ１１７、Ｓ１２０、Ｆ１２７、Ｄ１３１、Ｇ１５６、Ｅ１５７、Ｙ１５９、Ｇ１７４、Ｃ１７６、Ｇ１８２、Ｇ１８３、Ｆ１８５、Ｇ１８７、Ｇ１８８、Ｇ１８９、Ｙ１９０、Ｇ１９１、Ｐ１９２、Ｒ１９５、Ｄ２０２、Ｄ２０６、Ｇ２１４、Ｗ２２８、Ｇ２３４、Ｆ２３８、Ｌ２４８、Ｑ２７７、Ｓ３１４、Ｌ３２４、Ｓ３５５、Ｋ３８２、Ｋ３８４、Ｄ３８６、Ｇ４２０、Ｍ４２３、Ｒ４３６、Ｙ４４１、Ｗ４４４、Ｙ４４５、Ｙ４７２、Ｐ４７７、Ｎ５１４、Ｆ５１５、Ｎ５２９、およびＱ５３５からなる群から選択される少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む。
本開示は操作されたバリアントを提供するものであり、この場合において当該操作されたバリアントは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５の不変のアミノ酸を含み、但し、当該操作されたバリアントは、配列番号４４と比較して、少なくとも一つのアミノ酸置換を有する。本明細書に記載される不変のアミノ酸および置換の組み合わせを有する操作されたバリアントが作製され得、得られた操作されたバリアントは、テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）の性能の改善についてスクリーニングされる。本明細書において記載される置換および不変のアミノ酸の全ての組み合わせを含む操作されたバリアントは、本開示によって包含されることが意図される。
本開示は、操作されたバリアントを提供し、操作されたバリアントは、Ｃ末端に少なくとも一個のアミノ酸置換を含む。ある特定のこのような実施形態では、親水性アミノ酸は、疎水性アミノ酸で置換される。操作されたバリアントが、Ｃ末端において少なくとも一個のアミノ酸置換を含む、一部の実施形態では、疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸で置換される。かかる操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成し得る。
本開示は、操作されたバリアントを提供し、操作されたバリアントは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方において切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｎ末端において切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｃ末端において切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｎ末端とＣ末端の両方において切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、天然のシグナルポリペプチド（すなわち、配列番号４４のアミノ酸１～２８）を欠く。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方において切断を含み、配列番号４４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方において切断を含み、配列番号４４に対して少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｃ末端に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のアミノ酸の切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｃ末端において少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０のアミノ酸の切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｃ末端において少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０のアミノ酸の切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｃ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸（例えば、Ｃ末端における１～１０のアミノ酸）の切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｃ末端において１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸（例えば、Ｃ末端における１１～２０のアミノ酸）の切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｃ末端において２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のアミノ酸（例えば、Ｃ末端における２１～３０のアミノ酸）の切断を含む。
一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｎ末端に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のアミノ酸の切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｎ末端において少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０のアミノ酸の切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｎ末端において少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０のアミノ酸の切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｎ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸（例えば、Ｎ末端における１～１０のアミノ酸）の切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｎ末端において１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸（例えば、Ｎ末端における１１～２０のアミノ酸）の切断を含む。一部の実施形態では、操作されたバリアントは、Ｎ末端において２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のアミノ酸（例えば、Ｎ末端における２１～３０のアミノ酸）の切断を含む。
一部の実施形態では、本開示の切断された操作されたバリアントは、シグナルポリペプチドを含んでもよい。ある特定のこのような実施形態では、切断された操作されたバリアントは、天然のシグナルポリペプチドを欠く。一部の実施形態では、シグナルポリペプチドは、分泌性シグナルポリペプチドである。一部の実施形態では、分泌性シグナルポリペプチドは、天然の分泌性シグナルポリペプチドである。一部の実施形態では、分泌性シグナルポリペプチドは、合成の分泌性シグナルポリペプチドである。一部の実施形態では、分泌性シグナルポリペプチドは、小胞体保持シグナルポリペプチドである。ある特定のこのような実施形態では、小胞体保持シグナルポリペプチドは、ＨＤＥＬポリペプチドまたはＫＤＥＬポリペプチドである。一部の実施形態では、分泌性シグナルポリペプチドは、ミトコンドリア標的化シグナルポリペプチドである。一部の実施形態では、分泌性シグナルポリペプチドは、ゴルジ標的化シグナルポリペプチドである。一部の実施形態では、分泌性シグナルポリペプチドは、液胞型局在性シグナルポリペプチドである。ある特定のこのような実施形態では、液胞型局在性シグナルポリペプチドは、ＰＥＰ４ｔポリペプチドまたはＰＲＣ１ｔポリペプチドである。ある特定のこのような実施形態では、液胞型局在性シグナルポリペプチドは、ＰＥＰ４ｔポリペプチドである。一部の実施形態では、分泌性シグナルポリペプチドは、細胞膜局在性シグナルポリペプチドである。一部の実施形態では、分泌性シグナルポリペプチドは、ペルオキシソーム標的化シグナルポリペプチドである。一部の実施形態では、ペルオキシソーム標的化シグナルポリペプチドは、ＰＥＸ８ポリペプチドである。一部の実施形態では、分泌性シグナルポリペプチドは、接合因子分泌性シグナルポリペプチド（例えば、ＭＦポリペプチドまたは進化したＭＦポリペプチド（ＭＦｅｖ））である。一部の実施形態では、シグナルポリペプチドは、操作されたバリアントのＮ末端に連結される。
一部の実施形態では、本開示の切断された操作されたバリアントは、膜アンカーを含んでもよい。膜アンカーは、細胞における膜に挿入し、そこに結合したポリペプチドを固定する配列であり得る。膜アンカーは、細胞にとって外部（例えば、ＧＰＩポリペプチド）または細胞にとって内部（例えば、テールアンカー、ＥＲアンカリング）の膜に存在してもよい。膜アンカーの例としては、グリコシルホスファチジルイノシトール膜アンカー（ＧＰＩポリペプチド、例えば、ＡＧＡ１）、ＣＡＡＸボックスポリペプチド（プレニル化された、例えば、ＲＡＳ１）、または疎水性Ｃ末端を有するテール固定されたポリペプチド（例えば、ホスファチジルイノシトール４，５－ビスホスフェート５－ホスファターゼ（ＩＮＰ５４）は、ＥＲ膜において疎水性テールアンカーを有するか、またはシナプトブレビン２（ＶＡＭＰ２）は、小胞膜における疎水性ポリ－Ｉテールアンカーを有する）が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示は、操作されたバリアントを提供し、操作されたバリアントは、一つまたは複数のアミノ酸の付加および／または欠失を含む。
ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントが作製され得、例えば同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成するなどの性能の改善についてスクリーニングされる。加えて、ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントが作製され得、例えば同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによって生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成するなどの性能の改善についてスクリーニングされる。同様の条件は、同じ温度、ｐＨ、緩衝液、および／または発酵条件での、ならびに同じ培地および／または反応溶媒における反応条件を指し得る。
本開示の一部の実施形態では、操作されたバリアントは、同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成する。
本開示の一部の実施形態では、操作されたバリアントは、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。
これらの改善された性能は、本開示の単離および／または精製された操作されたバリアントを用いたインビトロでの、または操作されたバリアントを発現する改変された宿主細胞の文脈においてインビボでの、ＣＢＣＡからＴＨＣＡへの変換、または代わりに、別の出発材料の所望のカンナビノイドもしくはカンナビノイド誘導体への変換によって評価されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＭＥＶ経路に関与するポリペプチドおよび／またはカンナビノイド生合成に関与するポリペプチドを発現し、および／または分泌性経路に対する改変を含む。一つまたは複数の試験条件において様々な程度の安定性、溶解性、活性、および／または発現レベルを有する本開示の操作されたバリアントが、多様な宿主細胞においてカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成のための使用が、本開示において見出すことが、企図される。
加えて、ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントが作製され得、例えば同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞がカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するなどの性能の改善についてスクリーニングされる。
加えて、ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントが作製され得、例えば同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率と比較して、当該操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞がより速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有するなどの性能の改善についてスクリーニングされる。加えて、ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントが作製され得、例えば同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く改変された宿主細胞により生成されるものと比較して、当該操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞が、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）よりも高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成するなどの性能の改善についてスクリーニングされる。同様の培養条件は、同じ培地において、同じ温度、ｐＨ、および／または発酵条件において増殖させた宿主細胞を指してもよい。
さらに、ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントが作製され得、例えば同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く改変された宿主細胞と比較して、当該操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、増殖率または生存率が有意に低下していないなどの性能の改善についてスクリーニングされる。加えて、ＴＨＣＡＳポリペプチドの操作されたバリアントが作製され得、非改変の宿主細胞と比較して、当該操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、増殖または生存率が有意にしていないなどの性能の改善についてスクリーニングされる。
テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびに発現ベクターおよびコンストラクト
本開示は、本明細書に開示されるテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびに当該核酸を含む発現ベクターおよびコンストラクトを提供する。
本開示は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示の一部の実施形態は、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、および配列番号１８６に記載されるアミノ酸配列を含む、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本開示の一部の実施形態は、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５２、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、または配列番号１８６に記載されるアミノ酸配列を含む、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本開示は、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供するものであり、この場合において当該ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、または配列番号１８５に記載されるヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本開示は、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供するものであり、この場合において当該ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、または配列番号１８５に記載されるヌクレオチド配列、または前述のいずれかのコドン縮重配列である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本開示は、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供するものであり、この場合において当該ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、または配列番号１８５に記載されるヌクレオチド配列、または前述のいずれかのコドン縮重配列である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本開示は、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供するものであり、この場合において当該ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、または配列番号１８５に記載されるヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本明細書において開示される核酸にハイブリダイズする核酸が、さらに含まれる。本明細書において開示されるポリペプチドをコードする核酸に存在するヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の配列同一性が存在する場合、ハイブリダイゼージョンが生じるハイブリダイゼージョン条件が、ストリンジェントであり得る。ストリンジェントな条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／ミリリットル 変性せん断サーモン精子ＤＮＡを有する溶液における４２℃での一晩のインキュベーション、続いて、０．１×ＳＳＣにおける約６５℃でのハイブリダイゼージョン支持体の洗浄などの、公知のサザンハイブリダイゼージョンのため使用されるものを含み得る。他の公知のハイブリダイゼージョン条件が周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）に記載される。
本明細書において開示される核酸の長さは、意図される使用に依存し得る。。例えば、意図される使用が、例えば、ＰＣＲ増幅またはライブラリーのスクリーニングのための、プライマーまたはプローブとしてのものである場合、核酸の長さは、全長配列より短い、例えば、１５～５０ヌクレオチドである。ある特定のこのような実施形態では、プライマーまたはプローブは、ヌクレオチド配列の高度に保存された領域と実質的に同一であるか、またはヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端に実質的に同一であってもよい。ある場合では、これらのプライマーまたはプローブは、「実質的に同一」であるが、依然として、配列認識において柔軟性をもたらすように、ある位置における普遍的な塩基を使用してもよい。適当なプライマーおよびプローブハイブリダイゼージョン条件が、当該技術分野において周知であることに留意されたい。
本開示の一部の実施形態は、本明細書において開示される一つまたは複数の核酸を含むベクターに関する。本開示の一部の実施形態は、本明細書において開示される一つまたは複数の核酸を含む発現コンストラクトに関する。本開示の一部の実施形態は、本開示の操作されたバリアントをコードするコドン最適化されているヌクレオチド配列を含む核酸に関する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸は、異種性である。
テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントのスクリーニング方法
本開示は、一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントのスクリーニング方法を提供する。ある特定のこのような実施形態では、方法は、本開示の操作されたバリアントが、関連する酵素と共に、改変された宿主細胞において発現される、競合アッセイを含む。
本開示の一部の実施形態は、一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントのスクリーニング方法に関するものであり、当該方法は、
ａ）宿主細胞の集団を対照集団および試験集団に分けること；
ｂ）対照集団において、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドと、比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドを共発現させることであって、当該配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドは、ＣＢＧＡを第一のカンナビノイドであるＴＨＣＡに変換することができ、比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、同じＣＢＧＡを異なる第二のカンナビノイドに変換することができること、
ｃ）試験集団において、操作されたバリアントと、比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドを共発現させることであって、当該操作されたバリアントは、ＣＢＧＡを、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドと同じ第一のカンナビノイドであるＴＨＣＡに変換してもよく、およびこの場合において当該比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、同じＣＢＧＡを第二のカンナビノイドに変換することができ、試験集団および対照集団において同様のレベルで発現されること、
ｄ）試験集団と対照集団の両方によって生成される第二のカンナビノイドに対する第一のカンナビノイドであるＴＨＣＡの比率を測定すること；および
ｅ）試験集団と対照集団の両方によって生成される第一のカンナビノイドの量（ｍｇ／ＬまたはｍＭ）を測定すること、を含む。ある特定のこのような実施形態では、操作されたバリアントは、本開示の操作されたバリアントである。
一部の実施形態では、同様の培養条件下、同じ長さの時間で対照集団によって生成される量と比較して、試験集団によってより多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で第一のカンナビノイドを生成することによって、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドと比較して改善されたインビボ性能を有する操作されたバリアントを含む試験集団が特定される。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドと比較して、改善されたインビボ性能を有する操作されたバリアントを含む試験集団が特定され、この場合において改善されたインビボ性能は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で対照集団によって生成されるものと比較して、試験集団によって生成される第二のカンナビノイドに対する第一のカンナビノイドの比率の高いことによって示される。
一部の実施形態では、カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、カンナビジオール酸合成酵素（ＣＢＤＡＳ）ポリペプチドである。特定のかかる実施形態では、ＣＢＤＡＳポリペプチドは、配列番号３に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＢＤＡＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号２に記載されるヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ＣＢＤＡＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは配列番号２に記載されるヌクレオチド配列、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ＣＢＤＡＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号２に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、第二のカンナビノイドは、ＣＢＤＡである。
テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントを発現させるため、ならびにカンナビノイドおよびカンナビノイド誘導体を作製するための改変宿主細胞。
本開示は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を提供する。ある特定のこのような実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、操作されたバリアントを発現させるため、および／またはカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するためのものである。一部の実施形態では、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本開示はまた、微生物（例えば、改変された宿主細胞）に導入し、これにより、本開示の操作されたバリアントの発現または過剰発現をもたらすことができ、次いで、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成のため、インビトロ（例えば、無細胞）またはインビボで利用することができる、核酸（例えば、異種核酸）を提供する。一部の実施形態では、これらの核酸は、操作されたバリアントをコードするコドン最適化されているヌクレオチド配列を含む。
カンナビノイド合成酵素ポリペプチドである、本開示の操作されたバリアントなどの分泌されたポリペプチドは、改変された酵母細胞などの、改変された宿主細胞における発現を邪魔し得る、構造特性を有する。本開示の操作されたバリアントを含む、カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、ジスルフィド結合、Ｎ－グリコシル化部位を含む、多数のグリコシル化部位、および両共有結合したフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子部分を含む。頻繁に、これらの分泌されたポリペプチドは、ミスフォールディングされるか、または誤った場所に局在化され、これにより、低発現、活性を欠くポリペプチド、低減した宿主細胞生存率、および／または細胞死がもたらされる。本明細書において考察される通り、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を用いて改変された宿主細胞における分泌経路の操作は、本開示の操作されたバリアントの発現、フォールディング、および酵素活性ならびに改変された宿主細胞の生存率を改善し得る。ある特定のこのような実施形態では、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成し、改変された宿主細胞内で生合成経路を生成するために、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸の組み合わせを発現させるか、または過剰発現させ得る。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための、本開示の改変された宿主細胞は、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドの発現を調節するための一つまたは複数の改変を含む。一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドの発現を調節するための一つまたは複数の改変は、宿主細胞に、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸および／または宿主細胞における一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失もしくは下方制御を導入することを含み得る。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための、本開示の改変された宿主細胞は、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、これにより、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドの発現または過剰発現がもたらされる。一部の実施形態では、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含み、これにより、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドの発現が低減されるか、または除去される。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失を含む。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の下方制御を含む。
一部の実施形態では、培地における、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞の培養は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の合成を提供する。
本開示の操作されたバリアントを発現させるために、改変された宿主細胞は、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を発現するか、または過剰発現し得る。一部の実施形態では、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の操作されたバリアントを発現させるための、本開示の改変された宿主細胞は、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドの発現を調節するための一つまたは複数の改変を含む。一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドの発現を調節するための一つまたは複数の改変は、宿主細胞に、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸および／または宿主細胞における一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失もしくは下方制御を導入することを含み得る。一部の実施形態では、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の操作されたバリアントを発現させるための本開示の改変された宿主細胞は、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、これにより、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドの発現または過剰発現がもたらされる。一部の実施形態では、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の操作されたバリアントを発現させるための改変された宿主細胞は、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含み、これにより、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドの発現が低減されるか、または除去される。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失を含む。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の下方制御を含む。
分泌経路の改変
本開示の改変された宿主細胞における発現が調節された分泌経路ポリペプチドとしては、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＲＯＴ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、ＰＥＰ４ポリペプチド、およびＩＲＥ１ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。分泌経路ポリペプチドの発現は、宿主細胞に、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、および／または宿主細胞において一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失もしくは下方制御を導入することによって、調節され得る。一部の実施形態では、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、以下の遺伝子：ＲＯＴ２遺伝子またはＰＥＰ４遺伝子の一つまたは複数の欠失または下方制御を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、以下の遺伝子：ＲＯＴ２遺伝子またはＰＥＰ４遺伝子の一つまたは複数の欠失を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、以下の遺伝子：ＲＯＴ２遺伝子またはＰＥＰ４遺伝子の一つまたは複数の下方制御を含む。
分泌経路ポリペプチド、および一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸は、任意の適当な供給源、例えば、細菌、酵母、真菌、藻類、ヒト、植物、またはマウスからもたらされ得る。一部の実施形態では、分泌経路ポリペプチド、および一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（現在、コマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）として知られる）、ピキア・フィンランジカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア属、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（現在、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）として知られる）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クリベロマイセス属、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、シェフェルソマイセス・スティピィティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｅｓ）、デッケラ・ブルクセレンシス（Ｄｅｋｋｅｒａ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ）、ブラストボトリーズ・アデニニヴォランス（Ｂｌａｓｔｏｂｏｔｒｙｓ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）（正式には、アークスラ・アデニニヴォランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ））、カンジダ・アルビカンス（カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フサリウム属、フサリウム・グラニューム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などからもたらされ得る。一部の実施形態では、本開示はまた、本明細書において開示される分泌経路ポリペプチドをコードするオルソロガス遺伝子を包含する。本明細書において開示される典型的な分泌経路ポリペプチドはまた、全長分泌経路ポリペプチド、分泌経路ポリペプチドのフラグメント、分泌経路ポリペプチドのバリアント、切断された分泌経路ポリペプチド、または分泌経路ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。
本明細書において開示される典型的なＫＡＲ２ポリペプチドは、全長ＫＡＲ２ポリペプチド、ＫＡＲ２ポリペプチドのフラグメント、ＫＡＲ２ポリペプチドのバリアント、切断されたＫＡＲ２ポリペプチド、またはＫＡＲ２ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。
本明細書において開示される典型的なＲＯＴ２ポリペプチドは、全長ＲＯＴ２ポリペプチド、ＲＯＴ２ポリペプチドのフラグメント、ＲＯＴ２ポリペプチドのバリアント、切断されたＲＯＴ２ポリペプチド、またはＲＯＴ２ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。
本明細書において開示される典型的なＰＤＩ１ポリペプチドは、全長ＰＤＩ１ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチドのフラグメント、ＰＤＩ１ポリペプチドのバリアント、切断されたＰＤＩ１ポリペプチド、またはＰＤＩ１ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。
本明細書において開示される典型的なＥＲＯ１ポリペプチドは、全長ＥＲＯ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドのフラグメント、ＥＲＯ１ポリペプチドのバリアント、切断されたＥＲＯ１ポリペプチド、またはＥＲＯ１ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。
本明細書において開示される典型的なＦＡＤ１ポリペプチドは、全長ＦＡＤ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドのフラグメント、ＦＡＤ１ポリペプチドのバリアント、切断されたＦＡＤ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。
本明細書において開示される典型的なＰＥＰ４ポリペプチドは、全長ＰＥＰ４ポリペプチド、ＰＥＰ４ポリペプチドのフラグメント、ＰＥＰ４ポリペプチドのバリアント、切断されたＰＥＰ１ポリペプチド、またはＰＥＰ４ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。
本明細書において開示される典型的なＩＲＥ１ポリペプチドは、全長ＩＲＥ１ポリペプチド、ＩＲＥ１ポリペプチドのフラグメント（例えば、最初の７つのアミノ酸を失っている）、ＩＲＥ１ポリペプチドのバリアント、切断されたＩＲＥ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。
本開示の改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＲＯＴ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、ＰＥＰ４ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数の発現を調節するための一つまたは複数の改変を含み得る。ＫＡＲ２ポリペプチド、ＲＯＴ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、ＰＥＰ４ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数の発現を調節するための一つまたは複数の改変は、宿主細胞に、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を導入すること、および／または宿主細胞において、ＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を導入することを含み得る。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、これにより、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの発現または過剰発現がもたらされる。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含み、これにより、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの発現が低減されるか、または除去される。
一部の実施形態では、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドの発現を調節するための一つまたは複数の改変は、改変された宿主細胞生存率を改善し得る。改変された宿主細胞生存率の改善は、工業的な発酵プロセスを改善し得る。ＥＲＯ１ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィド異性化酵素ポリペプチドである、ＰＤＩ１ポリペプチドのパートナーとして役立ち得る。ＩＲＥ１ポリペプチドの発現の調節は、本開示の発現された操作されたバリアントの分解を防ぎ得る。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、配列番号５（ＫＡＲ２ポリペプチド）、配列番号９（ＰＤＩ１ポリペプチド）、配列番号７（ＥＲＯ１ポリペプチド）、配列番号１９２（ＦＡＤ１ポリペプチド）、配列番号１１（ＩＲＥ１ポリペプチド）、または配列番号１９０（ＩＲＥ１ポリペプチドフラグメント）に記載されるアミノ酸配列を含む一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、配列番号５（ＫＡＲ２ポリペプチド）、配列番号９（ＰＤＩ１ポリペプチド）、配列番号７（ＥＲＯ１ポリペプチド）、配列番号１９２（ＦＡＤ１ポリペプチド）、配列番号１１（ＩＲＥ１ポリペプチド）、または配列番号１９０（ＩＲＥ１ポリペプチドフラグメント）に記載されるアミノ酸配列、または前述のいずれかの保存的置換アミノ酸配列を含む一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、配列番号５（ＫＡＲ２ポリペプチド）、配列番号９（ＰＤＩ１ポリペプチド）、配列番号７（ＥＲＯ１ポリペプチド）、配列番号１９２（ＦＡＤ１ポリペプチド）、配列番号１１（ＩＲＥ１ポリペプチド）、または配列番号１９０（ＩＲＥ１ポリペプチドフラグメント）に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の、欠失または下方制御を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、配列番号１３（ＲＯＴ２ポリペプチド）または配列番号１５（ＰＥＰ４ポリペプチド）に記載されるアミノ酸配列を含む一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの二つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの三つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＩＲＥ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの二つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの三つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＦＡＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドおよびＰＥＰ４ポリペプチドをコードする遺伝子の欠失または下方制御を含む。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長分泌経路ポリペプチド、分泌経路ポリペプチドのフラグメント、分泌経路ポリペプチドのバリアント、切断された分泌経路ポリペプチド、または分泌経路ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＫＡＲ２ポリペプチド、ＫＡＲ２ポリペプチドのフラグメント、ＫＡＲ２ポリペプチドのバリアント、切断されたＫＡＲ２ポリペプチド、またはＫＡＲ２ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＲＯＴ２ポリペプチド、ＲＯＴ２ポリペプチドのフラグメント、ＲＯＴ２ポリペプチドのバリアント、切断されたＲＯＴ２ポリペプチド、またはＲＯＴ２ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＲＯＴ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＰＤＩ１ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチドのフラグメント、ＰＤＩ１ポリペプチドのバリアント、切断されたＰＤＩ１ポリペプチド、またはＰＤＩ１ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＥＲＯ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドのフラグメント、ＥＲＯ１ポリペプチドのバリアント、切断されたＥＲＯ１ポリペプチド、またはＥＲＯ１ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＦＡＤ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドのフラグメント、ＦＡＤ１ポリペプチドのバリアント、切断されたＦＡＤ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＦＡＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＰＥＰ４ポリペプチド、ＰＥＰ４ポリペプチドのフラグメント、ＰＥＰ４ポリペプチドのバリアント、切断されたＰＥＰ１ポリペプチド、またはＰＥＰ４ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＰＥＰ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＩＲＥ１ポリペプチド、ＩＲＥ１ポリペプチドのフラグメント（例えば、最初の７つのアミノ酸を失っている）、ＩＲＥ１ポリペプチドのバリアント、切断されたＩＲＥ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＩＲＥ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドなどの、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドは、改変された宿主細胞において過剰発現される。過剰発現は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドなどの、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸のコピー数を、例えば、多いコピー数の発現ベクター（例えば、一個の細胞当たり１０～４０コピーまたは約１００コピーで存在するプラスミド）の使用を通じて、増大させることによって、および／またはＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドなどの、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、強力なプロモーターに動作可能に連結させることによって、達成されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドなどの、分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドなどの、分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドなどの、分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドなどの、分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドなどの、分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドなどの、分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピー以上の異種核酸を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、配列番号４（ＫＡＲ２ポリペプチドをコードする）、配列番号８（ＰＤＩ１ポリペプチドをコードする）、配列番号６（ＥＲＯ１ポリペプチドをコードする）、配列番号１９１（ＦＡＤ１ポリペプチドをコードする）、配列番号１０（ＩＲＥ１ポリペプチドをコードする）、および配列番号１８９（ＩＲＥ１ポリペプチドフラグメントをコードする）に記載されるヌクレオチド配列からなる群から選択される一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、配列番号４（ＫＡＲ２ポリペプチドをコードする）、配列番号８（ＰＤＩ１ポリペプチドをコードする）、配列番号６（ＥＲＯ１ポリペプチドをコードする）、配列番号１９１（ＦＡＤ１ポリペプチドをコードする）、配列番号１０（ＩＲＥ１ポリペプチドをコードする）、および配列番号１８９（ＩＲＥ１ポリペプチドフラグメントをコードする）、または前述のいずれかのコドン縮重ヌクレオチド配列に記載されるヌクレオチド配列からなる群から選択される一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、配列番号４（ＫＡＲ２ポリペプチドをコードする）、配列番号８（ＰＤＩ１ポリペプチドをコードする）、配列番号６（ＥＲＯ１ポリペプチドをコードする）、配列番号１９１（ＦＡＤ１ポリペプチドをコードする）、配列番号１０（ＩＲＥ１ポリペプチドをコードする）、および配列番号１８９（ＩＲＥ１ポリペプチドフラグメントをコードする）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、配列番号１２（ＲＯＴ２ポリペプチドをコードする）および配列番号１４（ＰＥＰ４ポリペプチドをコードする）に記載されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２遺伝子の欠失または下方制御を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２遺伝子の欠失を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２遺伝子の下方制御を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＥＰ４遺伝子の欠失または下方制御を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＥＰ４遺伝子の欠失を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＥＰ４遺伝子の下方制御を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＥＰ４遺伝子およびＲＯＴ２遺伝子の欠失または下方制御を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＥＰ４遺伝子およびＲＯＴ２遺伝子の欠失を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＥＰ４遺伝子およびＲＯＴ２遺伝子の下方制御を含む。
カンナビノイドおよびカンナビノイド前駆体生合成経路の改変
本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞はまた、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含んでもよい。本開示の操作されたバリアントに加えて、このようなポリペプチドとしては、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）ポリペプチド、テトラケチド合成酵素（ＴＫＳ）ポリペプチド、オリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）ポリペプチド、メバロン酸（ＭＥＶ）経路に存在するポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する一つまたは複数のポリペプチド（例えば、一つまたは複数のＭＥＶ経路ポリペプチド）、アシル活性化酵素（ＡＡＥ）ポリペプチド、ＧＰＰを生じるポリペプチド（例えば、ゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＰＰＳ）ポリペプチド）、アセチル－ＣｏＡの二つの分子を縮合して、アセトアセチル－ＣｏＡを生じるポリペプチド（例えば、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチド）、およびピルビン酸脱炭酸酵素ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体の生合成に関与するポリペプチド、およびカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸は、任意の適当な供給源、例えば、細菌、酵母、真菌、藻類、ヒト、植物（例えば、カンナビス）、またはマウスからもたらされ得る。一部の実施形態では、本開示はまた、本明細書において開示されるカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体生合成に関与するポリペプチドをコードするオルソロガス遺伝子を包含する。
テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアント
本開示の改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含んでもよい。ある特定のこのような実施形態では、テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、配列番号４４のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、この場合において当該操作されたバリアントは、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、または配列番号１８６に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、この場合において当該操作されたバリアントは、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５２、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、または配列番号１８６に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントは、改変された宿主細胞において過剰発現される。過剰発現は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸のコピー数を、例えば、多いコピー数の発現ベクター（例えば、一個の細胞当たり１０～４０コピーまたは約１００コピーで存在するプラスミド）の使用を通じて、増大させることによって、および／または本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を強力なプロモーターに動作可能に連結させることによって、達成されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、６コピーの核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、７コピーの核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピーの核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピー以上の核酸を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、この場合において当該ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、または配列番号１８５に記載されるヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、この場合において当該ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、もしくは配列番号１８５に記載されるヌクレオチド配列、または前述のいずれかのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、この場合において当該ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、または配列番号１８５に記載されるヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、この場合において当該ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、または配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、または配列番号１８５に記載されるヌクレオチド配列、または前述のいずれかのコドン縮重配列である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸の少なくとも一つは、誘導性プロモーターに動作可能に連結される。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸の少なくとも一つは、構造性プロモーターに動作可能に連結される。
ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）ポリペプチド
本開示の改変された宿主細胞は、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含んでもよい。
本明細書において開示される典型的なＧＯＴポリペプチドは、全長ＧＯＴポリペプチド、ＧＯＴポリペプチドのフラグメント、ＧＯＴポリペプチドのバリアント、切断されたＧＯＴポリペプチド、またはＧＯＴポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ＧＯＴポリペプチドは、芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）活性を有する。一部の実施形態では、ＧＯＴポリペプチドは、カンナビノイド前駆体またはカンナビノイド前駆体誘導体を改変する。ある特定のこのような実施形態では、ＧＯＴポリペプチドは、オリベトール酸またはオリベトール酸誘導体を改変する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＯＴポリペプチドは、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＯＴポリペプチドは、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＯＴポリペプチドは、配列番号１７に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＯＴポリペプチドは、配列番号１７に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＯＴポリペプチドは、配列番号１７に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＯＴポリペプチドは、配列番号１７に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＧＯＴポリペプチド、ＧＯＴポリペプチドのフラグメント、ＧＯＴポリペプチドのバリアント、切断されたＧＯＴポリペプチド、またはＧＯＴポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、ＧＯＴポリペプチドは、改変された宿主細胞において過剰発現される。過剰発現は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸のコピー数を、例えば、多いコピー数の発現ベクター（例えば、一個の細胞当たり１０～４０コピーまたは約１００コピーで存在するプラスミド）の使用を通じて、増大させることによって、および／またはＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を強力なプロモーターに動作可能に連結させることによって、達成されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、６コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、７コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピー以上の異種核酸を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１６に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１６に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
ＮｐｈＢポリペプチド
一部の実施形態では、ＮｐｈＢポリペプチドを、ＧＯＴポリペプチドの代わりに使用して、ＧＰＰおよびオリベトール酸からカンナビゲロール酸を生じさせる。本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含んでもよい。
本明細書において開示される典型的なＮｐｈＢポリペプチドは、全長ＮｐｈＢポリペプチド、ＮｐｈＢポリペプチドのフラグメント、ＮｐｈＢポリペプチドのバリアント、切断されたＮｐｈＢポリペプチド、またはＮｐｈＢポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ＮｐｈＢポリペプチドは、芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）活性を有する。一部の実施形態では、ＮｐｈＢポリペプチドは、カンナビノイド前駆体またはカンナビノイド前駆体誘導体を改変する。ある特定のこのような実施形態では、ＮｐｈＢポリペプチドは、オリベトール酸またはオリベトール酸誘導体を改変する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＮｐｈＢポリペプチドは、配列番号１８８に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＮｐｈＢポリペプチドは、配列番号１８８に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＮｐｈＢポリペプチドは、配列番号１８８に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＮｐｈＢポリペプチドは、配列番号１８８に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＮｐｈＢポリペプチドは、配列番号１８８に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＮｐｈＢポリペプチド、ＮｐｈＢポリペプチドのフラグメント、ＮｐｈＢポリペプチドのバリアント、切断されたＮｐｈＢポリペプチド、またはＮｐｈＢポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、ＮｐｈＢポリペプチドは、改変された宿主細胞において過剰発現される。過剰発現は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸のコピー数を、例えば、多いコピー数の発現ベクター（例えば、一個の細胞当たり１０～４０コピーまたは約１００コピーで存在するプラスミド）の使用を通じて、増大させることによって、および／またはＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を強力なプロモーターに動作可能に連結させることによって、達成されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、６コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、７コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピー以上の異種核酸を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８７に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８７に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８７に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８７に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
アシル－ＣｏＡ化合物またはアシル－ＣｏＡ化合物誘導体を生じるポリペプチド
本開示の改変された宿主細胞は、アシル－ＣｏＡ化合物またはアシル－ＣｏＡ化合物誘導体を生じるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含んでもよい。このようなポリペプチドとしては、アシル活性化酵素（ＡＡＥ）ポリペプチド、脂肪酸アシル－ＣｏＡ合成酵素（ＦＡＡ）ポリペプチド、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
ＡＡＥポリペプチド、ＦＡＡポリペプチド、および脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドは、カルボン酸をそれらのＣｏＡ形態に変換し、アシル－ＣｏＡ化合物またはアシル－ＣｏＡ化合物誘導体を生じることができる。ＣｓＡＡＥ１およびＣｓＡＡＥ３ポリペプチド、ＦＡＡポリペプチド、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドなどの、混合アシル活性化酵素ポリペプチドは、カンナビノイド誘導体（例えば、カンナビゲロール酸誘導体）、ならびにカンナビノイド（例えば、カンナビゲロール酸）の生成を可能にし得る。一部の実施形態では、置換されていないか、もしくは置換されたヘキサン酸以外の、置換されていないか、もしくは置換されたヘキサン酸またはカルボン酸を、ＡＡＥポリペプチド、ＦＡＡポリペプチド、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドを発現している改変された宿主細胞に加え（例えば、細胞が増殖される培地に存在する）て、ヘキサノイル－ＣｏＡ、アシル－ＣｏＡ化合物、ヘキサノイル－ＣｏＡの誘導体、またはアシル－ＣｏＡ化合物の誘導体を生じる。次いで、ヘキサノイル－ＣｏＡ、アシル－ＣｏＡ化合物、ヘキサノイル－ＣｏＡの誘導体、またはアシル－ＣｏＡ化合物の誘導体を、改変された宿主細胞がさらに利用して、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生じることができる。ある特定のこのような実施形態では、細胞培地は、置換されていないか、または置換されたヘキサン酸塩を含む改変された宿主細胞を含む。一部の実施形態では、細胞培地は、置換されていないか、または置換されたヘキサン酸以外のカルボン酸塩を含む改変された宿主細胞を含む。
本明細書において開示される典型的なＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドは、全長ＡＡＥ、ＦＡＡ、もしくは脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチド；ＡＡＥ、ＦＡＡ、もしくは脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドのフラグメント；ＡＡＥ、ＦＡＡ、もしくは脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドのバリアント；切断されたＡＡＥ、ＦＡＡ、もしくは脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチド；またはＡＡＥ、ＦＡＡ、もしくは脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＡＡＥポリペプチドは、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＡＡＥポリペプチドは、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＡＡＥポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＡＡＥポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＡＡＥポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＡＡＥ、ＦＡＡ、もしくは脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチド；ＡＡＥ、ＦＡＡ、もしくは脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドのフラグメント；ＡＡＥ、ＦＡＡ、もしくは脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドのバリアント；切断されたＡＡＥ、ＦＡＡ、もしくは脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチド；またはＡＡＥ、ＦＡＡ、もしくは脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、一つまたは複数のＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドは、改変された宿主細胞において過剰発現される。過剰発現は、ＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸のコピー数を、例えば、多いコピー数の発現ベクター（例えば、一個の細胞当たり１０～４０コピーまたは約１００コピーで存在するプラスミド）の使用を通じて、増大させることによって、および／またはＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を強力なプロモーターに動作可能に連結させることによって、達成されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、６コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、７コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＡＡＥ、ＦＡＡ、または脂肪酸アシル－ＣｏＡリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピー以上の異種核酸を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２２に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２２に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２２に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
アシル－ＣｏＡ化合物またはアシル－ＣｏＡ化合物誘導体をマロニル－ＣｏＡと縮合して、オリベトール酸またはオリベトール酸の誘導体を生じるポリペプチド
本開示の改変された宿主細胞は、ヘキサノイル－ＣｏＡなどの、アシル－ＣｏＡ化合物、またはヘキサノイル－ＣｏＡ誘導体などの、アシル－ＣｏＡ化合物誘導体を、マロニル－ＣｏＡと縮合して、オリベトール酸、またはオリベトール酸の誘導体を生じる一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含んでもよい。アシル－ＣｏＡ化合物またはアシル－ＣｏＡ化合物誘導体をマロニル－ＣｏＡと反応させて、オリベトール酸、またはオリベトール酸の誘導体を生じるポリペプチドは、ＴＫＳおよびＯＡＣポリペプチドを含み得る。広範な基質特異性を有し、これにより、カンナビノイド誘導体またはカンナビノイドの生成を可能にする、ＴＫＳおよびＯＡＣポリペプチドが見出された。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
本明細書において開示される典型的なＴＫＳまたはＯＡＣポリペプチドは、全長ＴＫＳもしくはＯＡＣポリペプチド、ＴＫＳもしくはＯＡＣポリペプチドのフラグメント、ＴＫＳもしくはＯＡＣポリペプチドのバリアント、切断されたＴＫＳもしくはＯＡＣポリペプチド、またはＴＫＳもしくはＯＡＣポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＴＫＳポリペプチドは、配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＴＫＳポリペプチドは、配列番号１９に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＴＫＳポリペプチドは、配列番号１９に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＴＫＳポリペプチドは、配列番号１９に対する少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＴＫＳポリペプチドは、配列番号１９に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号２１または配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号２１または配列番号４８に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号２１または配列番号４８に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号２１または配列番号４８に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号２１または配列番号４８に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号２１に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号２１に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号２１に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号２１に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号２１に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を含むバリアントＯＡＣ（Ｙ２７Ｆバリアント）ポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号４８に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含むバリアントＯＡＣ（Ｙ２７Ｆバリアント）ポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号４８に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントＯＡＣ（Ｙ２７Ｆバリアント）ポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号４８に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントＯＡＣ（Ｙ２７Ｆバリアント）ポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、配列番号４８に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントＯＡＣ（Ｙ２７Ｆバリアント）ポリペプチドである。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＴＫＳもしくはＯＡＣポリペプチド、ＴＫＳもしくはＯＡＣポリペプチドのフラグメント、ＴＫＳもしくはＯＡＣポリペプチドのバリアント、切断されたＴＫＳもしくはＯＡＣポリペプチド、またはＴＫＳもしくはＯＡＣポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＴＫＳまたはＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、ＴＫＳポリペプチドは、改変された宿主細胞において過剰発現される。過剰発現は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸のコピー数を、例えば、多いコピー数の発現ベクター（例えば、一個の細胞当たり１０～４０コピーまたは約１００コピーで存在するプラスミド）の使用を通じて、増大させることによって、および／またはＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を強力なプロモーターに動作可能に連結させることによって、達成されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、６コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、７コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、９コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１０コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１２コピー以上の異種核酸を有する。
一部の実施形態では、ＯＡＣポリペプチドは、改変された宿主細胞において過剰発現される。過剰発現は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸のコピー数を、例えば、多いコピー数の発現ベクター（例えば、一個の細胞当たり１０～４０コピーまたは約１００コピーで存在するプラスミド）の使用を通じて、増大させることによって、および／またはＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を強力なプロモーターに動作可能に連結させることによって、達成されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、６コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、７コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、９コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１０コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１２コピー以上の異種核酸を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２０または配列番号４７に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２０または配列番号４７に記載されるもの、または前述のいずれかのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２０または配列番号４７に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２０または配列番号４７に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２０に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２０に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２０に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２０に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、バリアントＯＡＣ（Ｙ２７Ｆバリアント）ポリペプチドである、ヌクレオチド配列は、配列番号４７に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、バリアントＯＡＣ（Ｙ２７Ｆバリアント）ポリペプチドであり、ヌクレオチド配列は、配列番号４７に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、バリアントＯＡＣ（Ｙ２７Ｆバリアント）ポリペプチドであり、ヌクレオチド配列は、配列番号４７に対する少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＯＡＣポリペプチドは、バリアントＯＡＣ（Ｙ２７Ｆバリアント）ポリペプチドであり、ヌクレオチド配列は、配列番号４７に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
ゲラニルピロリン酸を生じるポリペプチド
本開示の改変された宿主細胞は、ＧＰＰを生じるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、ＧＰＰを生じるポリペプチドは、ゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＰＰＳ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＧＰＰＳポリペプチドはまた、ファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰＳ）ポリペプチド活性を有する。一部の実施形態では、ＧＰＰＳポリペプチドは、改変されたＧＰＰＳポリペプチドがもたらされる対応する野生型または親ＧＰＰＳポリペプチドより、低減したＦＰＰＳポリペプチド活性（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９０％より高く少ないＦＰＰＳポリペプチド活性）を有するように、それは、改変される。一部の実施形態では、ＧＰＰＳポリペプチドは、実質的にＦＰＰＳポリペプチド活性を有さないように、それは改変される。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
本明細書において開示される典型的なＧＰＰＳポリペプチドは、全長ＧＰＰＳポリペプチド、ＧＰＰＳポリペプチドのフラグメント、ＧＰＰＳポリペプチドのバリアント、切断されたＧＰＰＳポリペプチド、またはＧＰＰＳポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含んでもよい。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＰＰＳポリペプチドは、配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を含むバリアントＧＰＰＳ（ＥＲＧ２０ｍｕｔ、Ｆ９６Ｗ、Ｎ１２７Ｗ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＰＰＳポリペプチドは、配列番号４１に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含むバリアントＧＰＰＳ（ＥＲＧ２０ｍｕｔ、Ｆ９６Ｗ、Ｎ１２７Ｗ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＰＰＳポリペプチドは、配列番号４１に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントＧＰＰＳ（ＥＲＧ２０ｍｕｔ、Ｆ９６Ｗ、Ｎ１２７Ｗ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＰＰＳポリペプチドは、配列番号４１に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントＧＰＰＳ（ＥＲＧ２０ｍｕｔ、Ｆ９６Ｗ、Ｎ１２７Ｗ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＰＰＳポリペプチドは、配列番号４１に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むバリアントＧＰＰＳ（ＥＲＧ２０ｍｕｔ、Ｆ９６Ｗ、Ｎ１２７Ｗ）ポリペプチドである。このアミノ酸配列における変異は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）に対するＧＰＰの比をシフトし、これにより、ＣＢＤＡまたはＴＨＣＡを生成するために必要とされるＧＰＰの生成が増大される。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＧＰＰＳポリペプチド、ＧＰＰＳポリペプチドのフラグメント、ＧＰＰＳポリペプチドのバリアント、切断されたＧＰＰＳポリペプチド、またはＧＰＰＳポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、ＧＰＰＳポリペプチドは、改変された宿主細胞において過剰発現される。過剰発現は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸のコピー数を、例えば、多いコピー数の発現ベクター（例えば、一個の細胞当たり１０～４０コピーまたは約１００コピーで存在するプラスミド）の使用を通じて、増大させることによって、および／またはＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を強力なプロモーターに動作可能に連結させることによって、達成されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、６コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、７コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピー以上の異種核酸を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＰＰＳポリペプチドは、バリアントＧＰＰＳ（ＥＲＧ２０ｍｕｔ、Ｆ９６Ｗ、Ｎ１２７Ｗ）ポリペプチドであり、ヌクレオチド配列は、配列番号４０に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＰＰＳポリペプチドは、バリアントＧＰＰＳ（ＥＲＧ２０ｍｕｔ、Ｆ９６Ｗ、Ｎ１２７Ｗ）ポリペプチドであり、ヌクレオチド配列は、配列番号４０に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＰＰＳポリペプチドは、バリアントＧＰＰＳ（ＥＲＧ２０ｍｕｔ、Ｆ９６Ｗ、Ｎ１２７Ｗ）ポリペプチドであり、ヌクレオチド配列は、配列番号４０に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＧＰＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＧＰＰＳポリペプチドは、バリアントＧＰＰＳ（ＥＲＧ２０ｍｕｔ、Ｆ９６Ｗ、Ｎ１２７Ｗ）ポリペプチドであり、ヌクレオチド配列は、配列番号４０に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
ピルビン酸からアセチル－ＣｏＡを生じるポリペプチド
本開示の改変された宿主細胞は、ピルビン酸からアセチル－ＣｏＡを生じるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含んでもよい。ピルビン酸からアセチル－ＣｏＡを生じるポリペプチドは、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）ポリペプチドを含み得る。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
本明細書において開示される典型的なＰＤＣポリペプチドは、全長ＰＤＣポリペプチド、ＰＤＣポリペプチドのフラグメント、ＰＤＣポリペプチドのバリアント、切断されたＰＤＣポリペプチド、またはＰＤＣポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含んでもよい。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＰＤＣポリペプチドは、配列番号３５に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＰＤＣポリペプチドは、配列番号３５に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＰＤＣポリペプチドは、配列番号３５に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＰＤＣポリペプチドは、配列番号３５に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＰＤＣポリペプチドは、配列番号３５に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＰＤＣポリペプチド、ＰＤＣポリペプチドのフラグメント、ＰＤＣポリペプチドのバリアント、切断されたＰＤＣポリペプチド、またはＰＤＣポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、ＰＤＣポリペプチドは、改変された宿主細胞において過剰発現される。過剰発現は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸のコピー数を、例えば、多いコピー数の発現ベクター（例えば、一個の細胞当たり１０～４０コピーまたは約１００コピーで存在するプラスミド）の使用を通じて、増大させることによって、および／またはＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を強力なプロモーターに動作可能に連結させることによって、達成されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピー以上の異種核酸を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３４に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３４に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３４に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＤＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
アセチル－ＣｏＡの二つの分子を縮合して、アセトアセチル－ＣｏＡを生じるポリペプチド
本開示の改変された宿主細胞は、アセチル－ＣｏＡの二つの分子を縮合して、アセトアセチル－ＣｏＡを生じるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、アセチル－ＣｏＡの二つの分子を縮合して、アセトアセチル－ＣｏＡを生じるポリペプチドは、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
本明細書において開示される典型的なアセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドは、全長アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチド、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドのフラグメント、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドのバリアント、切断されたアセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチド、またはアセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドは、配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドは、配列番号３１に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドは、配列番号３１に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドは、配列番号３１に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドは、配列番号３１に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチド、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドのフラグメント、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドのバリアント、切断されたアセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチド、またはアセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドは、改変された宿主細胞において過剰発現される。過剰発現は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸のコピー数を、例えば、多いコピー数の発現ベクター（例えば、一個の細胞当たり１０～４０コピーまたは約１００コピーで存在するプラスミド）の使用を通じて、増大させることによって、および／またはアセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を強力なプロモーターに動作可能に連結させることによって、達成されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピー以上の異種核酸を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３０に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３０に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３０に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３０に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
メバロン酸経路ポリペプチド
本開示の改変された宿主細胞は、メバロン酸（ＭＥＶ）経路に存在するポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含んでもよい。ある特定のこのような実施形態では、メバロン酸（ＭＥＶ）経路に存在するポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する一つまたは複数のポリペプチドは、一つまたは複数のＭＥＶ経路ポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＧＰＰを生じる生合成経路の一部である一つまたは複数のポリペプチドは、メバロン酸経路に存在するポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する一つまたは複数のポリペプチドである。メバロン酸経路は、以下の工程：（ａ）アセチル－ＣｏＡの二つの分子を縮合して、アセトアセチル－ＣｏＡを生じる工程（例えば、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドの作用による）；（ｂ）アセトアセチル－ＣｏＡをアセチル－ＣｏＡと縮合して、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）を形成する工程（例えば、ＨＭＧＳポリペプチドの作用による）；（ｃ）ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸に変換する工程（例えば、ＨＭＧＲポリペプチドの作用による）；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５－ホスフェートにリン酸化する工程（例えば、ＭＫポリペプチドの作用による）；（ｅ）メバロン酸５－ホスフェートをメバロン酸５－ピロホスフェートに変換する工程（例えば、ＰＭＫポリペプチドの作用による）；（ｆ）メバロン酸５－ピロホスフェートをイソペンテニルピロホスフェートに変換する工程（例えば、メバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素（ＭＰＤまたはＭＶＤ１）ポリペプチドの作用による）；および（ｇ）イソペンテニルピロホスフェートをジメチルアリルピロホスフェートに変換する工程（例えば、イソペンテニルピロホスフェート異性化酵素（ＩＤＩ１）ポリペプチドの作用による）を触媒するポリペプチドを含み得る。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、２個以上のＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、３個以上のＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、４個以上のＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、５個以上のＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、６個以上のＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、７個以上のＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、全てのＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
本明細書において開示される典型的なＭＥＶ経路ポリペプチドはまた、全長ＭＥＶ経路ポリペプチド、ＭＥＶ経路ポリペプチドのフラグメント、ＭＥＶ経路ポリペプチドのバリアント、切断されたＭＥＶ経路ポリペプチド、またはＭＥＶ経路ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドを含み得る。一部の実施形態では、一つまたは複数のＭＥＶ経路ポリペプチドは、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチド、ＨＭＧＳポリペプチド、ＨＭＧＲポリペプチド、ＭＫポリペプチド、ＰＭＫポリペプチド、ＭＶＤ１ポリペプチド、およびＩＤＩ１ポリペプチドからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＨＭＧＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＨＭＧＳポリペプチドは、配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＨＭＧＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＨＭＧＳポリペプチドは、配列番号２９に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＨＭＧＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＨＭＧＳポリペプチドは、配列番号２９に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＨＭＧＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＨＭＧＳポリペプチドは、配列番号２９に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＨＭＧＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＨＭＧＳポリペプチドは、配列番号２９に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＨＭＧＲポリペプチドは、切断されたＨＭＧＲ（ｔＨＭＧＲ）ポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ｔＨＭＧＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ｔＨＭＧＲポリペプチドは、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ｔＨＭＧＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ｔＨＭＧＲポリペプチドは、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ｔＨＭＧＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ｔＨＭＧＲポリペプチドは、配列番号２７に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ｔＨＭＧＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ｔＨＭＧＲポリペプチドは、配列番号２７に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ｔＨＭＧＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ｔＨＭＧＲポリペプチドは、配列番号２７に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＭＫポリペプチドは、配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＭＫポリペプチドは、配列番号３９に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＭＫポリペプチドは、配列番号３９に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＭＫポリペプチドは、配列番号３９に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＭＫポリペプチドは、配列番号３９に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＰＭＫポリペプチドは、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＰＭＫポリペプチドは、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＰＭＫポリペプチドは、配列番号３７に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＰＭＫポリペプチドは、配列番号３７に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＰＭＫポリペプチドは、配列番号３７に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＶＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＭＶＤ１ポリペプチドは、配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＶＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＭＶＤ１ポリペプチドは、配列番号３３に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＶＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＭＶＤ１ポリペプチドは、配列番号３３に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＶＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＭＶＤ１ポリペプチドは、配列番号３３に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＶＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＭＶＤ１ポリペプチドは、配列番号３３に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＩＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＩＤＩ１ポリペプチドは、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＩＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＩＤＩ１ポリペプチドは、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列、またはその保存的に置換されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＩＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＩＤＩ１ポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＩＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＩＤＩ１ポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＩＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ＩＤＩ１ポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書において開示される典型的な異種核酸は、全長ＭＥＶ経路ポリペプチド、ＭＥＶ経路ポリペプチドのフラグメント、ＭＥＶ経路ポリペプチドのバリアント、切断されたＭＥＶ経路ポリペプチド、またはＭＥＶ経路ポリペプチドの少なくとも一つの活性を有する融合ポリペプチドなどの、ＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、一つまたは複数のＭＥＶ経路ポリペプチドは、改変された宿主細胞において過剰発現される。過剰発現は、ＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸のコピー数を、例えば、多いコピー数の発現ベクター（例えば、一個の細胞当たり１０～４０コピーまたは約１００コピーで存在するプラスミド）の使用を通じて、増大させることによって、および／またはＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を強力なプロモーターに動作可能に連結させることによって、達成されてもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの異種核酸を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＭＥＶ経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピー以上の異種核酸を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＨＭＧＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２８に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＨＭＧＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２８に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＨＭＧＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２８に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＨＭＧＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２８に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＨＭＧＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２６に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ｔＨＭＧＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２６に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ｔＨＭＧＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２６に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ｔＨＭＧＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２６に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ｔＨＭＧＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ｔＨＭＧＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つの異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３８に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３８に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３８に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３８に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３６に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３６に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３６に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＰＭＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３６に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＶＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３２に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＶＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３２に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＶＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３２に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＭＶＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３２に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＩＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２４に記載されるものである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＩＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２４に記載されるもの、またはそのコドン縮重ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＩＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２４に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ＩＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号２４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する。
カンナビノイドもしくはカンナビノイド誘導体を生成するため、および／または本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞
本開示は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を提供する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するため、および／または本開示の操作されたバリアントを発現するためのものであり得る。
本開示は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を提供する。カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するため、本明細書において開示される改変された宿主細胞を改変して、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチド、および／あるいはカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドの一つまたは複数である、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む本明細書において開示される一つまたは複数の核酸を発現するか、または過剰発現させてもよい。カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含んでもよい。ある特定のこのような実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失を含んでもよい。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の下方制御を含んでもよい。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードする、コドン最適化されたヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与するＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチド、および／または一つもしくは複数のポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本開示はまた、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を発現するか、または過剰発現するよう改変された、改変された宿主細胞を提供する。本開示の操作されたバリアントを発現させるための改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む本明細書において開示される本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列および一つまたは複数の異種核酸を含む一つまたは複数の核酸を含む。本開示の操作されたバリアントを発現させるための改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列およびＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む一つまたは複数の核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失を含んでもよい。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。本開示の操作されたバリアントを発現させるための改変された宿主細胞の一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されているヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するために、改変された宿主細胞における本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸の発現または過剰発現は、本明細書において開示される一つまたは複数の異種核酸（例えば、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸）の改変された宿主細胞による発現または過剰発現および／あるいはＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御と組み合わせて行われてもよい。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されたヌクレオチド配列である。
本開示の操作されたバリアントを発現させか、または過剰発現させるために、改変された宿主細胞における操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸の発現または過剰発現は、本明細書において開示される一つまたは複数の異種核酸（例えば、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸）の改変された宿主細胞による発現または過剰発現および／あるいはＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御と組み合わせて行われてもよい。一部の実施形態では、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されたヌクレオチド配列である。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量よりも多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはバイオマス収率と類似の、またはそれより低い増殖速度および／またはバイオマス収率を有する。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／もしくはバイオマス収率と類似した、またはそれより低い増殖速度および／またはバイオマス収率、ならびに改変された宿主細胞と比較して高いＴＨＣＡ力価を有する。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／または高いバイオマス収率と比較して、より速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有する。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／または高いバイオマス収率より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有する。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現させるための本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／もしくはバイオマス収率と類似した、またはそれより低い増殖速度および／またはバイオマス収率を有する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現させるための本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／もしくはバイオマス収率と類似した、またはそれより低い増殖速度および／またはバイオマス収率、ならびに改変された宿主細胞と比較して高いＴＨＣＡ力価を有する。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現させるための本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率と比較して、より速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現させるための本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはバイオマス収率より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、もしくは少なくとも１０００％速い増殖速度および／または高いバイオマス収率を有する。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはバイオマス収率と類似した、もしくはそれよりも低い増殖速度および／またはバイオマス収率を有する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／もしくはバイオマス収率と類似した、またはそれよりも低い増殖速度および／またはバイオマス収率、ならびに改変された宿主細胞と比較して高いＴＨＣＡ力価を有する。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率と比較して、より速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはバイオマス収率より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、もしくは少なくとも１０００％速い増殖速度および／または高いバイオマス収率を有する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率と比較して、より速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率と比較して、より速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、もしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率と比較して、より速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％高い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。本開示の一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して、高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む本開示の改変された宿主細胞は、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して、高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞によって生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して、高いＴＨＣＡの比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞は、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１より高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための本開示の改変された宿主細胞の増殖および／または生存率は、改変されていない宿主細胞の増殖および／または生存率と比較して、有意に減少しない。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成のための本開示の改変された宿主細胞の培養物は、同じ期間、同じ培地中、同じ培養条件下で増殖させた、改変されていない対照宿主細胞の培養物の細胞密度と比較して、少なくとも２５％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも３５％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも４５％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも５５％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも６５％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも７５％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、少なくとも１００％以上、少なくとも１１０％以上、少なくとも１２０％以上、少なくとも１３０％以上、少なくとも１４０％以上、または少なくとも１５０％以上の細胞密度を有する。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現させるための本開示の改変された宿主細胞の成長および／または生存率は、改変されていない宿主細胞の増殖および／または生存率と比較して、有意に減少しない。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現させるための、本開示の改変された宿主細胞の培養物は、同じ期間、同じ培地中、同じ培養条件下で増殖させた、改変されていない対照宿主細胞の培養物の細胞密度と比較して、少なくとも２５％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも３５％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも４５％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも５５％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも６５％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも７５％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、少なくとも１００％以上、少なくとも１１０％以上、少なくとも１２０％以上、少なくとも１３０％以上、少なくとも１４０％以上、または少なくとも１５０％以上の細胞密度を有する。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞の増殖および／または生存率は、改変されていない宿主細胞の増殖および／または生存率と比較して、有意に減少しない。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む、本開示の改変された宿主細胞の培養物は、同じ期間、同じ培地中、同じ培養条件下で増殖させた、改変されていない対照宿主細胞の培養物の細胞密度と比較して、少なくとも２５％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも３５％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも４５％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも５５％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも６５％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも７５％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、少なくとも１００％以上、少なくとも１１０％以上、少なくとも１２０％以上、少なくとも１３０％以上、少なくとも１４０％以上、または少なくとも１５０％以上の細胞密度を有する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む本開示の改変された宿主細胞の増殖および／または生存率は、改変されていない宿主細胞の増殖および／または生存率と比較して、有意に減少しない。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、本開示の改変された宿主細胞の培養物は、同じ期間、同じ培地中、同じ培養条件下で増殖させた、改変されていない対照宿主細胞の培養物の細胞密度と比較して、少なくとも２５％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも３５％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも４５％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも５５％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも６５％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも７５％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、少なくとも１００％以上、少なくとも１１０％以上、少なくとも１２０％以上、少なくとも１３０％以上、少なくとも１４０％以上、または少なくとも１５０％以上の細胞密度を有する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、ＦＡＤ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞の増殖および／または生存率は、改変されていない宿主細胞の増殖および／または生存率と比較して、有意に減少しない。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む、本開示の改変された宿主細胞の培養物は、同じ期間、同じ培地中、同じ培養条件下で増殖させた、改変されていない対照宿主細胞の培養物の細胞密度と比較して、少なくとも２５％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも３５％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも４５％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも５５％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも６５％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも７５％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、少なくとも１００％以上、少なくとも１１０％以上、少なくとも１２０％以上、少なくとも１３０％以上、少なくとも１４０％以上、または少なくとも１５０％以上の細胞密度を有する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞の増殖および／または生存率は、改変されていない宿主細胞の増殖および／または生存率と比較して、有意に減少しない。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む、本開示の改変された宿主細胞の培養物は、同じ期間、同じ培地中、同じ培養条件下で増殖させた、改変されていない対照宿主細胞の培養物の細胞密度と比較して、少なくとも２５％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも３５％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも４５％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも５５％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも６５％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも７５％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、少なくとも１００％以上、少なくとも１１０％以上、少なくとも１２０％以上、少なくとも１３０％以上、少なくとも１４０％以上、または少なくとも１５０％以上の細胞密度を有する。本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチドもしくはＩＲＥ１ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドもしくはＰＥＰ４ポリペプチドのうちの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む本開示の改変された宿主細胞の一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、またはヘキサノイル－ＣｏＡ）の生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。
適当な宿主細胞
本開示の改変された宿主細胞の創出における使用に適当である親宿主細胞は、真核細胞を含み得る。一部の実施形態では、真核細胞は、酵母細胞である。
宿主細胞（親宿主細胞および改変された宿主細胞を含む）は、一部の実施形態では、単細胞生物であるか、または単一細胞として培養において増殖する。一部の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。適当な真核生物の宿主細胞としては、酵母細胞および真菌細胞が挙げられ得るが、これらに限定されない。適当な真核生物の宿主細胞としては、ピキア・パストリス（現在、コマガタエラ・ファフィとして知られる）、ピキア・フィンランジカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラメ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンチエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピジュペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア属、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（現在、ピキア・アングスタとして知られる）、ヤロウィア・リポリティカ、クリベロマイセス属、クリベロマイセス・ラクチス、クリベロマイセス・マルキシアヌス、シゾサッカロミセス・ポンベ、シェフェルソマイセス・スティピィティス、デッケラ・ブルクセレンシス、ブラストボトリーズ・アデニニヴォランス（正式には、アークスラ・アデニニヴォランス）、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フサリウム属、フサリウム・グラニューム、フザリウム・ベネナタム、ニューロスポラ・クラッサなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書において開示される改変された宿主細胞は、インビトロで培養される。
一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、酵母細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエのタンパク質分解酵素欠損株である。タンパク質分解酵素欠損酵母株は、発現した異種タンパク質の分解の低減において有効であり得る。このような株において欠損したタンパク質分解酵素の例としては、以下の：ＰＥＰ４、ＰＲＢ１、およびＫＥＸ１の一つまたは複数が挙げられ得る。
一部の実施形態では、宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞の創出における使用のための宿主細胞は、培養の容易さ；迅速な増殖；プロモーターおよびベクターなどの、改変のためのツールの有用性；ならびに宿主細胞の安全性特性を理由に、選択されてもよい。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞の創出における使用のための宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントなどの、発現したポリペプチドにある特定の翻訳後改変を導入するその能力または無能を理由に、選択されてもよい。例えば、改変されたコマガタエラ・ファフィ宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントを高グリコシル化し得、高グリコシル化は、得られた発現したポリペプチドの活性を変更し得る。
宿主細胞の遺伝子改変および本開示の典型的な改変された宿主細胞
本開示は、改変された宿主細胞および本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を製造する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞を製造する方法は、宿主細胞に、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を導入することを含む。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、コドン最適化されているヌクレオチド配列を含む。
本開示は、宿主細胞に、本明細書において開示される一つまたは複数の核酸（例えば、異種）を導入することを含む、改変された宿主細胞およびカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供する。一部の実施形態では、核酸は、コドン最適化されているヌクレオチド配列を含む。
本開示は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、ａ）宿主細胞に、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を導入することを含む。ある特定のこのような実施形態では、方法は、ｂ）宿主細胞に、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を導入することを含む。一部の実施形態では、方法は、ｂ）宿主細胞に、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を導入することを含む。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードする、コドン最適化されたヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＩＲＥ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸およびＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＦＡＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸およびＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドおよびＰＥＰ４ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。本開示は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞に、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸およびＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を導入することを含む。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＩＲＥ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸ならびにＲＯＴ２ポリペプチドおよびＰＥＰ４ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
本開示は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞に：ａ）本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ｂ）ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびｃ）ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を導入することを含む。
本開示は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞に：ａ）本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸およびｂ）ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を導入することを含む。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸の組み合わせを発現するか、または過剰発現し得る。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法は、宿主細胞に、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を導入することを含む。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御、およびカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＩＲＥ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸ならびにＲＯＴ２ポリペプチドおよびＰＥＰ４ポリペプチドをコードする遺伝子の欠失または下方制御を含む。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＦＡＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
本開示は、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞に、本明細書において開示される一つまたは複数の核酸を導入することを含む。本開示は、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞に：ａ）本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸およびｂ）ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を導入することを含む。本開示は、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞に：ａ）本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸およびｂ）ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を導入することを含む。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列含む一つまたは複数の核酸を含み、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＩＲＥ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列含む一つまたは複数の核酸を含み、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＦＡＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＲＯＴ２ポリペプチドおよびＰＥＰ４ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。本開示は、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞に：ａ）本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸およびｂ）ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を導入することを含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびＩＲＥ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸ならびにＲＯＴ２ポリペプチドおよびＰＥＰ４ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
本開示は、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞に：ａ）本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ｂ）ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびｃ）ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を導入することを含む。
本開示は、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞に：ａ）本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸およびｂ）ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を導入することを含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含み、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸の組み合わせを発現するか、または過剰発現し得る。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞を製造する方法は、宿主細胞に、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を導入することを含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＩＲＥ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＲＯＴ２ポリペプチドまたはＰＥＰ４ポリペプチドの一つまたは複数をコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御、およびカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＩＲＥ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸ならびにＲＯＴ２ポリペプチドおよびＰＥＰ４ポリペプチドをコードする遺伝子の欠失または下方制御を含む。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸、ＫＡＲ２ポリペプチド、ＰＤＩ１ポリペプチド、ＥＲＯ１ポリペプチド、またはＦＡＤ１ポリペプチドの一つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸およびカンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体（例えば、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、リン酸プレニル、オリベトール酸、もしくはヘキサノイル－ＣｏＡ）生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、ＦＡＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアントを発現するための改変された宿主細胞は、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む。
本開示の改変された宿主細胞を生成するために親宿主細胞を改変するために、本明細書において開示される一つまたは複数の核酸（例えば、異種）は、確立された技術を使用して、宿主細胞に安定または一過性に導入され得る。このような技術としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン介在性トランスフェクション、リポソーム介在性トランスフェクション、酢酸リチウム法などを含み得るが、これらに限定されない。Ｇｉｅｔｚ，Ｒ．Ｄ．ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｗｏｏｄｓ．（２００２）ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＯＦ ＹＥＡＳＴ ＢＹ ＴＨＥ Ｌｉａｃ／ＳＳ ＣＡＲＲＩＥＲ ＤＮＡ／ＰＥＧ ＭＥＴＨＯＤを参照されたい。安定な形質転換に関して、核酸（例えば、異種核酸）は概して、選択マーカー、例えば、ネオマイシン抵抗性、アンピシリン抵抗性、テトラサイクリン抵抗性、クロラムフェニコール抵抗性、カナマイシン抵抗性などの、いくつかの公知の選択マーカーのいずれかを含む。一部の実施形態では、本明細書において開示される一つまたは複数の核酸（例えば、異種）を用いて親宿主細胞を改変するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、親宿主細胞を改変して、本開示の改変された宿主細胞を生成する。
一部の実施形態では、改変された宿主細胞における、操作されたバリアントの発現レベル、および／またはカンナビノイドもしくはカンナビノイド誘導体の産生を変化させることは、遺伝子コピー数、プロモーター強度、および／またはプロモーター制御を変えることにより行われてもよい。
本明細書に開示される一つまたは複数の核酸（例えば、異種核酸）は、発現ベクターまたはコンストラクト中に存在し得る。適当な発現ベクターとしては、プラスミド、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および対象の特定の宿主（酵母など）に特異的な任意の他のベクターが挙げられ得るが、これらに限定されない。したがって、例えば、メバロン酸経路遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸（例えば、異種）は、メバロン酸経路遺伝子産物を発現するための様々な発現ベクターのいずれか一つに含まれる。このようなベクターは、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。
本開示は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞に、本明細書において開示される一つまたは複数のベクターを導入することを含む。ある特定のこのような実施形態では、一つまたは複数のベクターは、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸（例えば、異種）を含む一つまたは複数のベクターを含む。ある特定のこのような実施形態では、一つまたは複数のベクターは、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸（例えば、異種）を含む一つまたは複数のベクターを含む。一部の実施形態では、方法は、宿主細胞に、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を導入することを含む。一部の実施形態では、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、一つまたは複数のベクターは、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸（例えば、異種）を含む一つまたは複数のベクターを含む。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド前駆体生合成に関与する一つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本開示は、カンナビノイド合成酵素ポリペプチドを発現するための改変された宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞に、本明細書において開示される一つまたは複数のベクターを導入することを含む。ある特定のこのような実施形態では、一つまたは複数のベクターは、本開示の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸（例えば、異種）を含む一つまたは複数のベクターを含む。ある特定のこのような実施形態では、一つまたは複数のベクターは、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸（例えば、異種）を含む一つまたは複数のベクターを含む。一部の実施形態では、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、方法は、宿主細胞に、一つまたは複数の分泌経路ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を導入することを含む。
多数の追加の適当な発現ベクターが、当業者に知られており、多くが、市販されている。以下のベクターは、例示の目的で提供される；酵母について、小コピーＣＥＮ ＡＲＳおよび大コピー２ミクロンプラスミドである。しかしながら、任意の他のプラスミドまたは他のベクターは、それらが、宿主細胞と適合する限り、使用され得る。
一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の一つまたは複数は、単一の発現ベクターに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の二つ以上は、単一の発現ベクターに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の三つ以上は、単一の発現ベクターに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の四つ以上は、単一の発現ベクターに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の五つ以上は、単一の発現ベクターに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の六つ以上は、単一の発現ベクターに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の七つ以上は、単一の発現ベクターに存在する。
一部の実施形態では、本明細書において開示される二つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現ベクターにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される三つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現ベクターにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される四つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現ベクターにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される五つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現ベクターにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される六つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現ベクターにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される七つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現ベクターにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される八つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現ベクターにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される九つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現ベクターにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される１０以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現ベクターにある。
一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の一つまたは複数は、単一の発現コンストラクトに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の二つ以上は、単一の発現コンストラクトに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の三つ以上は、単一の発現コンストラクトに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の四つ以上は、単一の発現コンストラクトに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の五つ以上は、単一の発現コンストラクトに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の六つ以上は、単一の発現コンストラクトに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の七つ以上は、単一の発現コンストラクトに存在する。
一部の実施形態では、本明細書において開示される二つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現コンストラクトにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される三つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現コンストラクトにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される四つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現コンストラクトにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される五つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現コンストラクトにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される六つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現コンストラクトにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される七つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現コンストラクトにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される八つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現コンストラクトにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される九つ以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現コンストラクトにある。一部の実施形態では、本明細書において開示される十以上の核酸（例えば、異種）は、別々の発現コンストラクトにある。
一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の一つまたは複数は、多コピー数のプラスミド、例えば、一個の細胞当たり約１０～５０コピーまたは一個の細胞当たり５０より多くのコピーで存在するプラスミドに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の一つまたは複数は、小コピー数のプラスミドに存在する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）の一つまたは複数は、中コピー数のプラスミドに存在する。プラスミドのコピー数を選択して、本開示の操作されたバリアントなどの、本明細書において開示される一つまたは複数のポリペプチドの発現を低減してもよい。プラスミドのコピー数を限定することによる発現の低減は、分泌経路の飽和を防ぎ、これにより、可能なタンパク質分解および／または改変された宿主細胞死もしくは改変された宿主細胞生存率の喪失を導き得る。
一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、２コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、３コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、４コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、５コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、６コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、７コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、８コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、９コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１０コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１１コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１２コピーの核酸（例えば、異種）を有する。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１２コピー以上の核酸（例えば、異種）を有する。
利用される宿主／ベクターまたは宿主／コンストラクトシステムに依存して、構造性および誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、多数の適当な転写および翻訳調整エレメントのいずれかが、発現ベクターまたはコンストラクトにおいて使用され得る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照のこと）。
一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸（例えば、異種）は、プロモーターに動作可能に連結される。一部の実施形態では、プロモーターは、構造性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、真核細胞において機能的である。一部の実施形態では、プロモーターは、発現の強力な駆動であり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、発現の弱い駆動であり得る。一部の実施形態では、プロモーターは、発現の中程度の駆動であり得る。プロモーターを選択して、本開示の操作されたバリアントなどの、本明細書において開示される一つまたは複数のポリペプチドの発現を低減してもよい。プロモーター選択を通じた発現の低減は、分泌経路の飽和を防ぎ、これにより、可能なタンパク質分解および／または改変された宿主細胞死または改変された宿主細胞生存率の喪失を導き得る。強力な構造性プロモーターの例としては、ｐＴＤＨ３およびｐＦＢＡ１が挙げられるが、これらに限定されない。中程度の構造性プロモーターの例としては、ｐＡＣＴ１およびｐＣＹＣ１が挙げられるが、これらに限定されない。弱い構造性プロモーターの例としては、ｐＳＬＮ１が挙げられるが、これに限定されない。強力な誘導性プロモーターの例としては、ｐＧＡＬ１およびｐＧＡＬ１０が挙げられるが、これらに限定されない。中程度の誘導性プロモーターの例としては、ｐＧＡＬ７が挙げられるが、これに限定されない。弱い誘導性プロモーターの例としては、ｐＧＡＬ３が挙げられるが、これに限定されない。
適当な真核生物のプロモーターの非限定的な例としては、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン－Ｉが挙げられ得る。適当なベクター、コンストラクト、およびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。発現ベクターまたはコンストラクトはまた、翻訳開始および転写ターミネーターのためのリボソーム結合部位を含有してもよい。発現ベクターまたはコンストラクトはまた、発現を増幅するための適当な配列を含んでもよい。
酵母において、構造性または誘導性プロモーターを含有する多数のベクターまたはコンストラクトが使用されてもよい。レビューについては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２，１９８８，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈ．１３；Ｇｒａｎｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｕ ＆ Ｇｒｏｓｓｍａｎ，３１９８７，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１５３，ｐｐ．５１６－５４４；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８６，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３；ａｎｄ Ｂｉｔｔｅｒ，１９８７，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１５２，ｐｐ．６７３－６８４；ａｎｄ Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，１９８２，Ｅｄｓ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩを参照のこと。ｐＡＤＨ、ｐＴＤＨ３、ｐＦＢＡ１、ｐＡＣＴ１、ｐＣＹＣ１、およびｐＳＬＮ１などの構造性酵母プロモーターまたはｐＧＡＬ１、ｐＧＡＬ１０、ｐＧＡＬ７、およびｐＧＡＬ３などの誘導性プロモーターが使用されてもよい（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｙｅａｓｔ，Ｃｈ．３，Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ Ｉｎ：ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．１１，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．ＤＭ Ｇｌｏｖｅｒ，１９８６，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．）。あるいは、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への組込みを促進するベクターが、使用されてもよい。
一般に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択可能なマーカー、例えば、抗生物質に対する抵抗性をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＲＰ１遺伝子または遺伝子カセットなど；およびコード配列の転写を指揮する高度に発現した遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、特に、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α－因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などの糖分解酵素をコードする遺伝子配列からもたらされ得る。
誘導性プロモーターは、当該技術分野で公知である。適当な誘導性プロモーターとしては、テトラサイクリン誘導性プロモーター；エストラジオール誘導性プロモーター、糖誘導性プロモーター、例えば、ｐＧａｌ１またはｐＳＵＣ２、アミノ酸誘導性プロモーター、例えば、ｐＭｅｔ２５；金属誘導性プロモーター、例えば、ｐＣｕｐ１、メタノール－誘導性プロモーター、例えば、ｐＡＯＸ１などが挙げられ得るが、これらに限定されない。
さらに、多くの実施形態では、発現ベクターまたはコンストラクトは、一つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含有し、それにより例えば、真核細胞培養に関してはジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン抵抗性など、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質が提供される。
一部の実施形態では、本明細書において開示される一つまたは複数の核酸（例えば、異種）は、本明細書において開示される改変された宿主細胞のゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書において開示される一つまたは複数の核酸（例えば、異種）は、本明細書において開示される改変された宿主細胞の染色体に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書において開示される一つまたは複数の核酸（例えば、異種）は、エピソームにとどまる（すなわち、改変された宿主細胞のゲノムまたは染色体に組み込まれない）。一部の実施形態では、本明細書に開示される一つまたは複数の核酸（例えば、異種核酸）のうちの少なくとも一つは、染色体外で維持される。本開示の操作されたバリアントなどの、本明細書において開示される一つまたは複数のポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の遺伝子コピー数を選択して、本開示の操作されたバリアントなどの、本明細書において開示される一つまたは複数のポリペプチドの発現を低減し得る。遺伝子コピー数を限定することによる発現の低減は、分泌経路の飽和を防ぎ、これにより、可能なタンパク質分解および／または改変された宿主細胞死もしくは改変された宿主細胞生存率の喪失を導き得る。
当業者によって理解される通り、ヌクレオチド配列におけるわずかな変化は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を必ずしも変更しない。コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させる特定の遺伝子配列におけるヌクレオチドの同定の変化が、遺伝子の低減または増強した有効性をもたらし得ること、およびある場合（例えば、アンチセンス、共抑制、またはＲＮＡｉ）では、部分配列が、しばしば、全長バージョンと同じくらい有効に働くことを、当業者は理解するだろう。ヌクレオチド配列を変動させるか、または短くし得る方法は、変更された遺伝子の有効性を試験する方法と同様に、当業者に周知である。ある特定の実施形態では、有効性は、例えば、従来のガスクロマトグラフィーによって容易に試験され得る。故に、遺伝子の全てのこのようなバリエーションは、本開示の一部として含まれる。
タンパク質をコードするオープンリィーディングフレームのゲノム欠失は、遺伝子の全ての発現を消失させ得る。遺伝子の下方制御は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルでいくつかの方法で達成することができ、細胞における活性なタンパク質の量の低減である結果を伴う。オープンリィーディングフレームの切断またはタンパク質を不安定化するか、もしくは触媒活性を低減する変異の導入は、タンパク質を不安定化する「デグロン」ポリペプチドを融合するのと同様のゴールに至る。遺伝子の制御領域の操作をまた使用して、遺伝子発現を変化させることもできる。プロモーター配列の変更または異なるプロモーターとの置換は、一つの方法である。少量のｍＲＮＡ摂動（ＤＡｍＰ：ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ｍＲＮＡ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）としても知られている、ターミネーターの短縮化も、遺伝子発現を低下させることが知られている。ｍＲＮＡの安定性を低下させる他の方法は、シス－またはトランス－作用リボザイム、例えば、自己切断リボザイム、またはエキソヌクレアーゼを動員するＲＮＡエレメント、またはアンチセンスＤＮＡの使用を含む。ＲＮＡｉを使用して、他の種由来の必要とされるタンパク質因子、例えば、ＤｒｏｓｈａまたはＤｉｃｅ（Ｄｒｉｎｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ ２００９）の移入を介して、発芽酵母株において遺伝子を発現停止させてもよい。遺伝子発現はまた、Ｄ－Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲシステム（Ｑｉ ｅｔ ａｌ ２０１３）を使用して、任意の座位にて達成され得る、天然もしくは異種サイレンシング因子またはリプレッサーの動員を介して、サッカロミセス・セレビシエにおいて発現停止されてもよい。タンパク質レベルはまた、標的タンパク質のアミノ酸配列を操作することによって、低減することもできる。アミノ末端でのユビキチン融合およびＮ末端ルール残基を含むが、これらに限定されない、様々なデグロン配列を使用して、迅速な分解にタンパク質を標的としてもよい。これらの方法は、恒常的または条件付様式で実施されてもよい。
導入システム
絶えず変化する環境に適応するために、酵母などの微生物は、広範な天然の誘導性プロモーターシステムを進化させている。小分子または環境（温度、ｐＨ、酸素レベル、浸透圧、酸化的損傷）の変化によって制御される任意のプロモーターは、原則、異種遺伝子の発現のための誘導性システムに変換され得る。サッカロミセス・セレビシエにおける最も知られてシステムは、グルコースによって強く抑制され、ガラクトースによって活性化されるガラクトースレギュロンである。ガラクトース誘導性プロモーターの制御下の異種遺伝子経路は、同様に制御され、したがって、操作された系統をグルコース培地において増殖させて、バイオマスを構築し、次いで、ガラクトースに切り替えて、経路発現を誘導することができる。非常に強力なｐＧＡＬ１から比較的弱いｐＧＡＬ３までの広範な発現レベルを達成することができる。しかしながら、ガラクトースは高価であり、サッカロミセス・セレビシエの炭素源が乏しい場合がある。それ故、産業用途については、細胞を非ガラクトース培地において誘導できるように、レギュロンを再操作することが有利であり得る。ガラクトースレギュロンは、この目的のために、以下を含む多くの方法で改変することができる。
・ グルコースからスクロースへの切り替えが、ＧＡＬ８０発現を解放し、経路を活性化するように、誘導性プロモーター、例えば、ｐＳＵＣ２－ＧＡＬ３からＧＡＬ８０、ＧＡＬ３の陰性制御因子を過剰発現させること。
・ 発現が、グルコースからスクロースへの切り替えによって誘導されるように、リプレッサーＧＡＬ８０を欠失させ、天然のＧＡＬ４カセットを、スクロース誘導性プロモーター、例えばｐＳＵＣ２－ＧＡＬ４の制御下のバージョンと置換すること。
・ 発現が、スクロースからグルコースへの切り替えによって誘導されるように、天然のＧＡＬ８０遺伝子を、誘導性バージョン、例えば、ｐＳＵＣ２－ＧＡＬ８０と置き換えること。
これらの戦略は、頻繁に、適切な動態（オフ状態では非常に低いか、または全く発現せず、オン状態で所望の発現レベル）を達成するために、活性化因子およびリプレッサーレベルの微細な調整を必要とする。タンパク質安定化タグもしくは分解タグ（例えば、デグロン）の使用、または活性化因子もしくは制御因子の温度感受性変異体の使用を含む、タンパク質発現を微細に調整する様々な方法がある。上記の例では、ｐＳＵＣ２プロモーターを使用して、スクロース培地においてガラクトースレギュロンを誘導する。しかしながら、任意の誘導性プロモーターは、この目的のため、またはガラクトースレギュロンの文脈外で、個々の遺伝子の調節のため使用することができる。以下のリストは、いくつかの例を提供する：
・ リン酸制御プロモーター、例えば、ｐＰＨＯ５
・ 炭素源制御プロモーター、例えば、ｐＡＤＨ２
・ アミノ酸制御プロモーター、例えば、ｐＭＥＴ２５
・ 金属イオン誘導性プロモーター、例えば、ｐＣＵＰ１
・ 温度制御プロモーター、例えば、ｐＨＳＰ１２、ｐＨＳＰ２６
・ ｐＨ制御プロモーター、例えば、ｐＨＳＰ１２、ｐＨＳＰ２６
・ 酸素レベル制御プロモーター、例えば、ｐＤＡＮ１
・ 酸化ストレス制御プロモーター、例えば、ＡＨＰ１、ＴＲＲ１、ＴＲＸ２、ＴＳＡ１、ＧＰＸ２、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＧＬＲ１、ＳＯＤ１、またはＳＯＤ２遺伝子に由来するプロモーター。
・ ＥＲストレス制御プロモーター、例えば、フォールディングされていないタンパク質応答エレメントプロモーター。
これらの天然の例に加えて、様々な合成誘導性プロモーターシステムがある。これらは、一般に、新規の転写因子を作製するための、基礎プロモータースキャフォールドへの天然もしくは外来転写エレメントへの再配置および／または活性化因子ドメインとＤＮＡ結合ドメインの融合に基づく。二つの例が、以下に提供される。
・ 結合部位を有する合成プロモーターまたは天然のプロモーターと対形成された、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインへのエストラジオール受容体の融合を含むエストラジオール誘導性システム。
・ ｔｅｔＯ含有プロモーターと対形成された、ｔｅｔトランス活性化因子（ｔＴＡ）または逆ｔｅｔトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）システム。
一部の実施形態では、上記の誘導性プロモーターシステムの一つが、本開示の改変された宿主細胞において使用される。一部の実施形態では、誘導性プロモーターシステムは、天然の誘導性プロモーターシステムである。一部の実施形態では、誘導性プロモーターシステムは、合成誘導性プロモーターシステムである。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞を培養するための適当な培地は、本明細書において開示されるインデューサーの一つまたは複数を含む。可能なインデューサーは、以下を含む：
・ リン酸制御プロモーター、例えば、ｐＰＨＯ５
ｏ ＫＨ２ＰＯ４
・ 炭素源制御プロモーター、例えば、ｐＡＤＨ２
ｏ ガラクトース（例えば、ｐＧＡＬ１）
ｏ グルコース（例えば、ｐＡＤＨ２）
ｏ スクロース（例えば、ｐＳＵＣ２、ｐＧＰＨ１、ｐＭＡＬ１２）
ｏ マルトース（例えば、ｐＭＡＬ１２、ｐＭＡＬ３２）
・ アミノ酸制御プロモーター、例えば、ｐＭＥＴ２５
ｏ メチオニン（例えば、ｐＭＥＴ２５）
ｏ リジン（例えば、ｐＬＹＳ９）
ｏ 他のアミノ酸
・ 金属イオン誘導性プロモーター、例えば、ｐＣＵＰ１
ｏ ＣｕＳＯ４
・ 温度制御プロモーター、例えば、ｐＨＳＰ１２、ｐＨＳＰ２６
ｏ 温度の変化、例えば、３０℃～３７℃
・ ｐＨ制御プロモーター、例えば、ｐＨＳＰ１２、ｐＨＳＰ２６
ｏ ｐＨの変化、例えば、ｐＨ６～ｐＨ４
・ 酸素レベル制御プロモーター、例えば、ｐＤＡＮ１
ｏ 酸素レベルの変化、例えば、２０％～１％溶解酸素レベル
・ 酸化ストレス制御プロモーター、例えば、ｐＳＯＤ１
ｏ 過酸化水素またはスーパーオキシド生成薬剤メナジオンの添加
・ ＥＲストレス制御プロモーター、例えば、フォールディングされていないタンパク質応答エレメントプロモーター。
ｏ ツニカマイシン、またはミスフォールディングしやすいタンパク質（例えば、カンナビノイド合成酵素）の発現
・ 結合部位を有する合成プロモーターまたは天然のプロモーターと対形成された、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインへのエストラジオール受容体の融合を含むエストラジオール誘導性システム。
ｏ エストラジオール
・ ｔｅｔＯ含有プロモーターと対形成された、ｔｅｔトランス活性化因子（ｔＴＡ）または逆ｔｅｔトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）システム。
ｏ ドキシサイクリン
コドン使用
当業者に周知であるように、特定のアミノ酸（すなわち、コドン）をコードするヌクレオチド配列を、宿主生物においてより良好に発現される別のコドンで置換すること（すなわち、コドン最適化）によって、宿主生物における異種核酸の発現を改善することが可能である。この効果が生じる一つの理由は、異なる生物が、異なるコドンへの優先を示すという事実に起因する。一部の実施形態では、本明細書において開示される核酸は、ヌクレオチド配列が、特定の宿主細胞に優先のコドンを反映するように、改変されるか、または最適化される。例えば、ヌクレオチド配列は、一部の実施形態では、酵母コドンの優先のため改変されるか、または最適化される。一部の実施形態では、本明細書において開示されるヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。例えば、Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ （１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（６）：３０２６－３０３１を参照のこと。
様々な生物においてコドン使用バイアスを解析するための統計法が創出され、多くのコンピュータアルゴリズムが、コドン最適化遺伝子配列の設計においてこれらの統計解析を実施するために開発されている（Ｌｉｔｈｗｉｃｋ Ｇ，Ｍａｒｇａｌｉｔ Ｈ（２００３）Ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：２６６５－７３）。コドンバイアスに依存しないタンパク質発現を増大させるためのコドン使用における他の改変も記載されている（Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９年）。
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列のコドン使用は、コードされるｍＲＮＡの翻訳のレベルが、減少するように、改変されるか、または最適化される。一部の実施形態では、コドン最適化されているヌクレオチド配列は、コードされるｍＲＮＡの翻訳のレベルが、減少するように、最適化されてもよい。コドン使用を改変することによってｍＲＮＡの翻訳のレベルを低減することは、宿主細胞によって稀に使用されるか、または一般的には使用されないコドンを含むようにヌクレオチド配列を改変することによって達成されてもよい。特定の生物がアミノ酸をコードするための特定のコドンを使用する、機会のパーセンテージを要約する、多くの生物についてのコドン使用表が、入手可能である。特定のコドンは、他の「稀な」コドンよりも頻繁に使用される。ヌクレオチド配列における「稀な」コドンの使用は、一般に、その翻訳速度を減少する。したがって、例えば、ヌクレオチド配列は、翻訳速度に影響するが、翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列には影響しない、一つまたは複数の稀なコドンを導入することによって改変される。例えば、アルギニンをコードする六つのコドン：ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧがある。大腸菌において、コドンＣＧＴおよびＣＧＣは、コドンＡＧＧ（大腸菌においてアルギニンのおよそ２％をコードする）よりはるかに頻繁に使用される（それぞれの大腸菌において、アルギニンのおよそ４０％をコードする）。遺伝子の配列内のＣＧＴコドンをＡＧＧコドンに改変することは、ポリペプチドの配列を変化させないが、遺伝子の翻訳速度を減少する可能性が高い。
一部の実施形態では、コドン最適化されているヌクレオチド配列は、酵母細胞における発現に最適化されてもよい。ある特定のこのような実施形態では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
さらに、本開示は、当業者によって理解され、以下の表に図示されるコドン使用の縮重を包含することは、理解される。
コドン縮重
Figure 2022548904000005
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を作製する方法、またはテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントを発現させる方法および／もしくは作製する方法
本開示は、本開示のテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントを発現する方法を提供する。ある特定のこのような実施形態では、方法は、本開示の改変された宿主細胞を培地において培養することを含む。本開示はさらに、本開示のテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントを作製する方法を提供する。本開示はまた、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法を提供し、方法は、本開示の操作されたバリアントの使用を含む。
本開示はまた、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法を提供する。本開示の方法は、本明細書において開示される操作されたバリアントを使用した、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を含み得る。方法は、培地において本開示の改変された宿主細胞を培養することおよび生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を回収することを含んでもよい。方法はまた、本開示の改変された宿主細胞によって発現されるか、または過剰発現される、本開示の操作されたバリアントなどの、本明細書において開示される一つまたは複数のポリペプチドを使用した、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の無細胞生成を含んでもよい。方法はまた、本明細書において開示される操作されたバリアントを使用して、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の無細胞生成を含んでもよい。
本開示の操作されたバリアント、方法、または改変された宿主細胞を用いて生成され得るカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体としては、限定されないが、カンナビクロメン（ＣＢＣ）型（例えば、カンナビクロメン酸）、カンナビジオール（ＣＢＤ）型（例えば、カンナビジオール酸）、Δ９－トランス－テトラヒドロカンナビノール（Δ９－ＴＨＣ）型（例えば、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸）、Δ８－トランス－テトラヒドロカンナビノール（Δ８－ＴＨＣ）型、カンナビシクロール（ＣＢＬ）型、カンナビエルソイン（ＣＢＥ）型、カンナビノール（ＣＢＮ）型、カンナビノジオール（ＣＢＮＤ）型、カンナビトリオール（ＣＢＴ）型、前述のいずれかの誘導体、およびＥｌｓｏｈｌｙ Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｓｌａｄｅ Ｄ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００５ Ｄｅｃ ２２；７８（５）：５３９－４８．Ｅｐｕｂ ２００５ Ｓｅｐ ３０に挙げられる他のものが挙げられ得る。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
本開示の操作されたバリアント、方法、または改変された宿主細胞を用いて生成され得るカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体としては、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビクロメバリン酸（ＣＢＣＶＡ）、カンナビクロメバリン（ＣＢＣＶ）、ＣＢＤＡ、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビジオールモノメチルエーテル（ＣＢＤＭ）、カンナビジオール－Ｃ４（ＣＢＤ－Ｃ４）、カンナビジバリン酸（ＣＢＤＶＡ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビジオールコール（ＣＢＤ－Ｃ１）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸Ａ（ＴＨＣＡ－Ａ）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸Ｂ（ＴＨＣＡ－Ｂ）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸－Ｃ４（ＴＨＣＡ－Ｃ４）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール－Ｃ４（ＴＨＣ－Ｃ４）、Δ９－テトラヒドロカンナビバリン酸（ＴＨＣＶＡ）、Δ９－テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）、Δ９－テトラヒドロカンナビオルコリ酸（ＴＨＣＡ－Ｃ１）、Δ９－テトラヒドロカンナビオルコール（ＴＨＣ－Ｃ１）、Δ７－シス－イソ－テトラヒドロカンナビバリン、Δ８－テトラヒドロカンナビノール酸（Δ８－ＴＨＣＡ）、Δ８－テトラヒドロカンナビノール（Δ８－ＴＨＣ）、カンナビシクロール酸（ＣＢＬＡ）、カンナビシクロール（ＣＢＬ）、カンナビシクロバリン（ＣＢＬＶ）、カンナビエルソン酸Ａ（ＣＢＥＡ－Ａ）、カンナビエルソン酸Ｂ（ＣＢＥＡ－Ｂ）、カンナビエルソイン（ＣＢＥ）、カンナビエルソイン酸、カンナビシトラン酸、カンナビノリック酸（ＣＢＮＡ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビノールメチルエーテル（ＣＢＮＭ）、カンナビノール－Ｃ４（ＣＢＮ－Ｃ４）、カンナビバリン（ＣＢＶ）、カンナビノール－Ｃ２（ＣＮＢ－Ｃ２）、カンナビオルコール（ＣＢＮ－Ｃ１）、カンナビノジオール（ＣＢＮＤ）、カンナビノジバリン（ＣＢＶＤ）、カンナビトリオール（ＣＢＴ）、１０－エチオキシ－９－ヒドロキシ－デルタ－６ａ－テトラヒドロカンナビノール、８，９－ジヒドロキシル－デルタ－６ａ－テトラヒドロカンナビノール、カンナビトリオールバリン（ＣＢＴＶＥ）、デヒドロカンナビフラン（ＤＣＢＦ）、カンナビフラン（ＣＢＦ）、カンナビクロマノン（ＣＢＣＮ）、カンナビシトラン（ＣＢＴ）、１０－オキソ－デルタ－６ａ－テトラヒドロカンナビノール（ＯＴＨＣ）－デルタ－９－シス－テトラヒドロカンナビノール（シス－ＴＨＣ）、３，４，５，６－テトラヒドロ－７－ヒドロキシ－アルファ－アルファ－２－トリメチル－９－ｎ－プロピル－２，６－メタノ－２Ｈ－１－ベンゾキソシン－５－メタノール（ＯＨ－イソ－ＨＨＣＶ）、カンナビリプソール（ＣＢＲ）、トリヒドロキシ－デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（トリＯＨ－ＴＨＣ）、ＣＢＧＡ－ヒドロケイ皮酸（３‐［（２Ｅ）‐３，７‐ジメチルオクタ‐２，６‐ジエン‐１‐イル］‐２，４‐ジヒドロキシ‐６‐（２‐フェニルエチル）安息香酸）、ＣＢＧ－ヒドロケイ皮酸（２‐［（２Ｅ）‐３，７‐ジメチルオクタ‐２，６‐ジエン‐１‐イル］‐５‐（２‐フェニルエチル）ベンゼン‐１，３‐ジオール）、ＣＢＤＡ－ヒドロケイ皮酸（２，４‐ジヒドロキシ‐３‐［３‐メチル‐６‐（プロプ‐１‐エン‐２‐イル）シクロヘキサ‐２‐エン‐１‐イル］‐６‐（２‐フェニルエチル）安息香酸）、ＣＢＤ－ヒドロケイ皮酸（２‐［３‐メチル‐６‐（プロプ‐１‐エン‐２‐イル）シクロヘキサ‐２‐エン‐１‐イル］‐５‐（２‐フェニルエチル）ベンゼン‐１，３‐ジオール）、ＴＨＣＡ－ヒドロケイ皮酸（１‐ヒドロキシ‐６，６，９‐トリメチル‐３‐（２‐フェニルエチル）‐６Ｈ，６ａＨ，７Ｈ，８Ｈ，１０ａＨ‐ベンゾ［ｃ］イソクロメン‐２‐カルボン酸）、ＴＨＣ－ヒドロケイ皮酸（６，６，９‐トリメチル‐３‐（２‐フェニルエチル）－６Ｈ，６ａＨ，７Ｈ，８Ｈ，１０ａＨ‐ベンゾ［ｃ］イソクロメン‐１‐オール、ペロテティエン）、および前述のいずれかの誘導体が、挙げられ得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアント、方法、または改変された宿主細胞を用いて生成されるカンナビノイドは、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸、Δ９－テトラヒドロカンナビノール、Δ８－テトラヒドロカンナビノール酸、Δ８－テトラヒドロカンナビノール、カンナビジオール酸、カンナビジオール、カンナビクロメン酸、カンナビクロメン、カンナビノリック酸、カンナビノール、カンナビジバリン酸、カンナビジバリン、テトラヒドロカンナビバリン酸、テトラヒドロカンナビバリン、カンナビクロメバリン酸、カンナビクロメバリン、カンナビゲロバリン酸、カンナビゲロバリン、カンナビシクロール酸、カンナビシクロール、カンナビエルソイン酸、カンナビエルソイン、カンナビシトラン酸、またはカンナビシトランである。一部の実施形態では、カンナビノイドは、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドは、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
一部の実施形態では、本開示の操作されたバリアント、方法または改変された宿主細胞を用いて生成されるカンナビノイドは、テトラヒドロカンナビノール酸、テトラヒドロカンナビバリン酸、またはテトラヒドロカンナビバリンである。一部の実施形態では、カンナビノイドは、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドは、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
本開示の操作されたバリアント、方法、または改変された宿主細胞を用いて生成され得るさらなるカンナビノイドおよびカンナビノイド誘導体としてはまた、ＣＢＤＡ、ＣＢＤ、ＣＢＧＡ、ＴＨＣ、ＴＨＣＡ、ＴＨＣＶＡ、ＣＢＤＶＡ、（６ａＲ，１０ａＲ）－１－ヒドロキシ－６，６，９－トリメチル－３－ブチル－６ａ，７，８，１０ａ－テトラヒドロ－６Ｈ－ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン－２－カルボン酸、（６ａＲ，１０ａＲ）－１－ヒドロキシ－６，６，９－トリメチル－３－（３－メチルペンチル）－６ａ，７，８，１０ａ－テトラヒドロ－６Ｈ－ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン－２－カルボン酸、（６ａＲ，１０ａＲ）－１－ヒドロキシ－６，６，９－トリメチル－３－（４－ペンテニル）－６ａ，７，８，１０ａ－テトラヒドロ－６Ｈ－ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン－２－カルボン酸、（６ａＲ，１０ａＲ）－１－ヒドロキシ－６，６，９－トリメチル－３－ヘキシル－６ａ，７，８，１０ａ－テトラヒドロ－６Ｈ－ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン－２－カルボン酸、（６ａＲ，１０ａＲ）－１－ヒドロキシ－６，６，９－トリメチル－３－（５－ヘキシニル）－６ａ，７，８，１０ａ－テトラヒドロ－６Ｈ－ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン－２－カルボン酸、および本明細書において参照により取り込まれる、Ｂｏｗ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ Ｒｉｍｏｌｄｉ，Ｊ．Ｍ．，“Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ：ＣＢ１／ＣＢ２ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，”Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６：８ １７－３９ ｄｏｉ：１０．４１３７／ＰＭＣ．Ｓ３２１７１に挙げられる他のものが挙げられ得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
本開示の操作されたバリアント、方法または改変された宿主細胞を用いて生成され得るさらなるカンナビノイドおよびカンナビノイド誘導体としてはさらに、限定されないが、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－（ヘキサン－２－イル）－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－ヘキシル－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（３－メチルペンチル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－（４－クロロブチル）－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（４－メチルペンチル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（４－（メチルチオ）ブチル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（（Ｅ）－ペンタ－１－エン－１－イル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（（Ｅ）－ペンタ－３－エン－１－イル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（（Ｅ）－ペンタ－２－エン－１－イル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－（ブタ－３－イン－１－イル）－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－（（Ｅ）－ブタ－１－エン－１－イル）－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（ペンタ－４－イン－１－イル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－４－ウンデシル－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－（ヘキサ－５－イン－１－イル）－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－（（Ｅ）－ヘプタ－１－エン－１－イル）－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－オクチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（（Ｅ）－オクタ－１－エン－１－イル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－ノニル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（３－フェニルプロピル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’フェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（４－フェニルブチル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（５－フェニルペンチル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（６－フェニルヘキシル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（２－メチルペンチル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－イソプロピル－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－デシル－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－４－トリデシル－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（Ｅ）－３－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）アクリル酸、（Ｚ）－３－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）アクリル酸、７－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）ヘプタン酸、８－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）オクタン酸、９－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）ノナン酸、１１－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）ウンデカン酸、（１’’Ｒ，２’’Ｒ）－３’，５’－ジヒドロキシ－５’’－メチル－２’’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’’，２’’，３’’，４’’－テトラヒドロ－［１，１’：４’，１’’－テルフェニル］－２－カルボン酸、（１’’Ｒ，２’’Ｒ）－３’，５’－ジヒドロキシ－５’’－メチル－２’’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’’，２’’，３’’，４’’－テトラヒドロ－［１，１’：４’，１’’－テルフェニル］－３－カルボン酸、（１’’Ｒ，２’’Ｒ）－３’，５’－ジヒドロキシ－５’’－メチル－２’’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’’，２’’，３’’，４’’－テトラヒドロ－［１，１’：４’，１’’－テルフェニル］－４－カルボン酸、（１’’Ｒ，２’’Ｒ）－３’，５’－ジヒドロキシ－５’’－メチル－２’’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’’，２’’，３’’，４’’－テトラヒドロ－［１，１’：４’，１’’－テルフェニル］－３，５－ジカルボン酸、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－（４－ヒドロキシブチル）－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－（４－アミノブチル）－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、５－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）ペンタンニトリル、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（３－メチルヘキサン－２－イル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－４－プロピル－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－ブチル－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－ペンチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４－ヘプチル－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、（１’Ｒ，２’Ｒ）－５’－メチル－４－（ペンタ－４－エン－１－イル）－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、３－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）プロパン酸、（１’Ｒ，２’Ｒ）－４，５’－ジメチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－２，６－ジオール、２－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）酢酸、４－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）ブタン酸、（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボン酸、５－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）ペンタン酸、および６－（（１’Ｒ，２’Ｒ）－２，６－ジヒドロキシ－５’－メチル－２’－（プロパ－１－エン－２－イル）－１’，２’，３’，４’－テトラヒドロ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）ヘキサン酸が挙げられ得る。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
カンナビノイド誘導体は、天然カンナビノイド中に存在する一つまたは複数の化学部分を欠く場合がある。そのような化学部分としては限定されないが、メチル、アルキル、アルケニル、メトキシ、アルコキシ、アセチル、カルボキシル、カルボニル、オキソ、エステル、ヒドロキシル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルケニル、シクロアルケニルアルキル、ヘテロアルケニルアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロアリールアルケニル、アリールアルケニル、ヘテロシクリル、アラルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキルなどが挙げられ得る。一部の実施形態では、天然カンナビノイド中に存在する一つまたは複数の化学部分を欠くカンナビノイド誘導体はさらに、本明細書において記載される官能基および／または反応基のいずれかのうちの一つまたは複数を含んでもよい。官能基および反応基は、置換されていないか、または一つまたは複数の官能基もしくは反応基で置換されていてもよい。
カンナビノイド誘導体は、一つまたは複数の官能基および／または反応基で置換されたか、またはそれを含むカンナビノイドであってもよい。官能基としては、アジド、ハロ（例えば、塩化物、ブ臭化物、ヨウ化物、フッ素）、メチル、アルキル、アルキニル、アルケニル、メトキシ、アルコキシ、アセチル、アミノ、カルボキシル、カルボニル、オキソ、エステル、ヒドロキシル、チオ（例えば、チオール）、シアノ、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルケニル、シクロアルキルアルキニル、シクロアルケニルアルキル、シクロアルケニルアルケニル、シクロアルケニルアルキニル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、スピロシクリル、ヘテロスピロシクリル、ヘテロシクリル、チオアルキル（またはアルキルチオ）、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、スルホン、スルホニル、スルホキシド、アミド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノ、Ｎ－オキシド、イミド、エナミン、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ニトリル、アラルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、ニトロ、チオキソなどが、挙げられ得るが、これらに限定されない。適当な反応基としては、アジド、カルボキシル、カルボニル、アミン（例えば、アルキルアミン（例えば、低級アルキルアミン）、アリールアミン）、ハロゲン化物、エステル（例えば、アルキルエステル（例えば、低級アルキルエステル、ベンジルエステル）、アリールエステル、置換されたアリールエステル）、シアノ、チオエステル、チオエーテル、スルホニルハロゲン化物、アルコール、チオール、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ヨードアセトアミド、マレイミド、ヒドラジン、アルキニル、アルケニル、アセチルなどが挙げられ得るが、必ずしもこれらに限定されない。一部の実施形態では、反応基は、カルボキシル、カルボニル、アミン、エステル、チオエステル、チオエーテル、スルホニルハロゲン化物、アルコール、チオール、アルキン、アルケン、アジド、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ヨードアセトアミド、マレイミド、およびヒドラジンから選択される。官能基および反応基は、置換されていないか、または一つまたは複数の官能基もしくは反応基で置換されていてもよい。
「アルキル」は、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を指し得る。例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキル基は、１～６個の炭素原子を含有する。Ｃ１～Ｃ６アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチルおよびｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、ならびにネオペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。
「アルケニル」は、２～１２個の炭素原子を含有する非分岐（すなわち、直鎖）または分岐の炭化水素鎖を含み得る。「アルケニル」基は、少なくとも一つの二重結合を含有する。アルケニル基の二重結合は、コンジュゲートされていないか、または別の不飽和基にコンジュゲートされていてもよい。アルケニル基の例としては、エチルエニル、ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ブタジエニル、ペンタジエニル、ヘキサジエニル、２－エチルヘキセニル、２－プロピル－２－ブテニル、４－（２－メチル－３－ブテン）－ペンテニルなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。
カンナビノイドおよびカンナビノイド誘導体などの、本明細書において開示される化合物は、本明細書において一般的に例示される、または本開示の特定のクラス、サブクラス、および種によって例示されるものなどの、一つまたは複数の置換基で置換されてもよい。一般に、用語「置換された」は、所定の構造における水素原子の、特定の置換基での置換を指す。本開示によって示される置換基の組み合わせは、典型的には、安定的または化学的に実行可能な化合物の形成をもたらすものである。
本明細書で使用される場合、用語「置換されていない」は、指定された基が列挙された部分を超えて置換基を生じない（例えば、水素によって満たされた原子価）ことを意味する。
反応基は、対象の分子の共有結合を促進し得る。対象の適当な分子としては、検出可能なラベル；画像化剤；毒素（細胞毒を含む）；リンカー；ペプチド；薬物（例えば、小分子薬）；特定の結合対のメンバー；エピトープタグ；標的受容体による結合のためのリガンド；精製を目的とするためのタグ；溶解性を増大させる分子などが挙げられ得るが、これらに限定されない。リンカーは、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーであってもよい。
一部の実施形態では、アジドで置換されたカンナビノイド誘導体は、アジド－アルキンシクロ付加としても知られる、ヘテロシクリルを含む生成物を創出するための「クリックケミストリー」を介してアルキン基を含む化合物と反応してもよい。一部の実施形態では、アルキンで置換されたカンナビノイド誘導体は、ヘテロシクリルを含む生成物を創出するためのクリックケミストリーを介して、アジド基を含む化合物と反応してもよい。
カンナビノイド誘導体への結合に望ましい対象のさらなる分子としては、検出可能なラベル（例えば、スピンラベル、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）型色素、例えば、インビボで生物分子の構造を研究するため）；小分子薬；細胞毒性分子（例えば、薬物）；造影剤；標的受容体による結合のためのリガンド；例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を目的とするタグ（例えば、ＦＬＡＧエピトープの結合）；溶解性を増大させる分子（例えば、ポリ（エチレングリコール））；バイオアベイラビリティを増強する分子；インビボ半減期を増大させる分子；特定の細胞タイプを標的とする分子（例えば、標的細胞上のエピトープに特異的な抗体）；特定の組織を標的とする分子；血液脳関門の通過をもたらす分子；および表面への選択的結合を促進するための分子などが、挙げられ得るが、必ずしもこれらに限定されない。
一部の実施形態では、対象の分子は、画像化剤を含む。適当な画像化剤は、陽性造影剤および陰性造影剤を含んでもよい。適当な陽性造影剤としては、ガドリニウムテトラアザシクロドデカンテトラ酢酸（Ｇｄ－ＤＯＴＡ）；ガドリニウム－ジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｇｄ－ＤＴＰＡ）；ガドリニウム－１，４，７－トリス（カルボニルメチル）－１０－（２’－ヒドロキシプロピル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（Ｇｄ－ＨＰ－ＤＯ３Ａ）；マンガン（ＩＩ）－ジピリドキサル二リン酸塩（Ｍｎ－ＤＰＤＰ）；Ｇｄ－ジエチレントリアミンペンタアセテート－ビス（メチルアミド）（Ｇｄ－ＤＴＰＡ－ＢＭＡ）などが、挙げられ得るが、これらに限定されない。適当な陰性造影剤としては、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）画像化剤；およびペルフルオロカーボン（適当なペルフルオロカーボンとしては、フルオロヘプタン、フルオロシクロヘプタン、フルオロメチルシクロヘプタン、フルオロヘキサン、フルオロシクロヘキサン、フルオロペンタン、フルオロシクロペンタン、フルオロメチルシクロペンタン、フルオロジメチルシクロペンタン、フルオロメチルシクロブタン、フルオロジメチルシクロブタン、フルオロトリメチルシクロブタン、フルオロブタン、フルオロシクロブタンゼ、フルオロプロパン、フルオロエーテル、フルオロポリエーテル、フルオロトリエチルアミン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロプロパン、サルファーヘキサフルオリドなどが、挙げられ得るが、これらに限定されない）が、挙げられ得るが、これらに限定されない。
本開示の操作されたバリアント、方法、または改変された宿主細胞を用いて生成され得る、さらなるカンナビノイド誘導体は、薬物代謝および薬物動態（例えば、溶解性、バイオアベイラビリティ、吸収、分布、血漿半減期および代謝クリアランス）を改変するための有機合成または酵素経路を介して改変された誘導体を含んでもよい。改変の例としては、ハロゲン化、アセチル化、およびメチル化が、挙げられ得るが、これらに限定されない。
本明細書において記載されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、すべての薬学的に許容される同位体的標識されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体をさらに含む。同位体標識された」または「放射線標識された」化合物は、一つまたは複数の原子が、天然で典型的に見出される（すなわち、天然に存在する）原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子で置き換えられるか、または置換されている、化合物である。例えば、一部の実施形態では、本明細書において記載されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体において、水素原子は、一つまたは複数のジュウテリウムまたはトリチウムで置き換えられるか、または置換される。本開示の特定の同位体標識されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体、例えば、放射性同位元素を取り込んだものは、薬物および／または基質組織分布研究において有用である。放射性同位元素トリチウム、すなわち、３Ｈ、および炭素１４、すなわち、１４Ｃは、それらの取り込みの容易さおよび用意された検出手段の観点から、この目的に特に有用である。ジュウテリウム、すなわち２Ｈなどのより重い同位体での置換は、より大きな代謝安定性から生じる特定の治療上の利点、例えば、増大したインビボ半減期または低減した投薬要件を与え、したがって、一部の状況では好ましい場合がある。本明細書において記載されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体に取り込まれ得る適当な同位体としては、２Ｈ（ジュウテリウムについてＤとしても記載される）、３Ｈ（トリチウムについてＴとしても記載される）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１８Ｆ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎなどの、陽電子放出同位体を用いた置換は、陽電子放出トポグラフィー（ＰＥＴ）研究において有用であり得る。
本明細書において開示されるバイオプロダクション方法、改変された宿主細胞、および操作されたバリアントは、化学合成を使用して行う課題である、定義された立体化学を有するカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の合成を可能にする。本明細書において開示されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、エナンチオマーまたはジアステレオマーであってもよい。用語「エナンチオマー」は、互いの重ね合わせることができないミラー画像である一対の立体異性体を指し得る。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、（Ｓ）－エナンチオマーであってもよい。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、（Ｒ）－エナンチオマーであってもよい。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、（＋）または（－）エナンチオマーであってもよい。用語「ジアステレオマー」は、単結合周りの回転によって重ね合わせることができない立体異性体のセットを指し得る。例えば、二環式環系および異なる相対的配置を有する複数の立体形成中心を含有する化合物上でのシス－およびトランス－二重結合、エンド置換およびエクソ置換は、ジアステレオマーであるとみなされ得る。用語「ジアステレオマー」は、化合物のこのセットの任意のメンバーを指し得る。本明細書において開示されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、二重結合または融合環を含み得る。ある特定のこのような実施形態では、二重結合または融合環は、配置が具体的に定義されない限り、シスまたはトランスであってもよい。カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体が、二重結合を含有する場合、配置が具体的に定義されない限り、置換基は、ＥまたはＺ配置であり得る。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体が、本明細書において開示される一つまたは複数のポリペプチドおよび／または操作されたバリアントを含む、細胞溶解物から；培地から；改変された宿主細胞から；細胞溶解物と培地の両方から；改変された宿主細胞と培地の両方から；細胞溶解物、改変された宿主細胞、および培地から；または無細胞反応混合物から回収されるとき、回収されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、塩の形態である。ある特定のこのような実施形態では、塩は、薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、次いで、回収されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の塩は、本明細書において開示される通り、精製される。
本開示は、本明細書において記載されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の薬学的に許容される塩を含む。「薬学的に許容される塩」は、生物学的にまたは別段望ましくないものではない、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持する、その塩を指してもよい。代表的な薬学的に許容される塩としては、例えば、酢酸塩、アムソネート（４，４－ジアミノスチルベン－２，２－ジスルホネート）、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゾネート、重炭酸塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、ブロミド、ブチラート、カルシウム、エデト酸カルシウム、カンシラート、炭酸塩、クロリド、クエン酸塩、クラブラリエート、ジヒドロクロリド、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フィウナレート、グルセプテート、グルコネート、グルタミン酸、グリコリルアルサニレート、ヘキサフルオロホスフェート、ヘキシルリゾルシネート、ヒドラバミン、ヒドロブロミド、ヒドロクロリド、ヒドロキシナフトエート、ヨウ化物、セチオネート、ラクテート、ラクトビオネート、ラウラート、マグネシウム、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、メチルブロミド、メチルニトレート、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、ナプシレート、ニトレート－エン－メチルグルカミンアンモニウム塩、３－ヒドロキシ－２－ナフトエート、オレエート、オキサレート、パルミテート、パモエート（１，１－メテン－ビス－２－ヒドロキシ－３－ナフトエート，アインボネート）、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロ酸塩、プロピオン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリチル酸塩、スラメート、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシレート、トリエチオダイド、およびバレレート塩などの、水溶性塩および水不溶性塩が、挙げられるが、これらに限定されない。
「薬学的に許容される塩」はまた、酸付加塩と塩基付加塩の両方を含む。「薬学的に許容される酸付加塩」は、生物学的でないか、またはそうでなければ不所望であり、非限定的に、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの、無機酸および非限定的に、酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４－アセタミド安息香酸、ショウノウ酸、カンフル－１０－スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２－オキソ－グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、ナフタレン－ｌ，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ｌ－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸などの、有機酸と形成される、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持する、それらの塩を指し得る。
「薬学的に許容される塩基付加塩」は、生物学的にまたは別段望ましくないものではない、遊離酸の生物学的有効性および特性を保持する、その塩を指してもよい。これらの塩は、無機塩基または有酸塩基の遊離酸への付加から調製される。無機塩基からもたらされる塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、無機塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。有酸塩基からもたらされる塩としては、初級、２級、および３級アミン、天然に存在する置換されたアミンを含む、置換されたアミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えば、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの塩が、挙げられるが、これらに限定されない。
本開示は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法を提供し、方法は、本開示の操作されたバリアントの使用を含む。特定のかかる実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本開示の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドの使用を含む方法において生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成される。特定のかかる実施形態では、本開示の操作されたバリアント、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される。本開示のカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法の一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本開示の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの使用を含む方法において生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成される。特定のかかる実施形態では、本開示の操作されたバリアント、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される。
本開示のカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法の一部の実施形態では、カンナビノイドは、ＴＨＣＡであり、方法は、本開示の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの使用を含む方法において生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して、高いＴＨＣＡの比率で、ＴＨＣＡを生成する。特定のかかる実施形態では、本開示の操作されたバリアント、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される。本開示のカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法の一部の実施形態では、カンナビノイドは、ＴＨＣＡであり、方法は、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。
宿主細胞を使用して、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法
本開示は、本明細書において記載されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法を提供し、方法は、本開示の改変された宿主細胞を培地において培養することを含む。ある特定のこのような実施形態では、方法は、生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を回収することを含む。ある特定のこのような実施形態では、次いで、生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本明細書において開示される通り、精製される。
一部の実施形態では、培地における本開示の改変された宿主細胞の培養は、同様の条件下で培養された改変されていない宿主細胞と比較して増大した量で、本明細書において記載されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の合成を提供する。
本開示は、本明細書において記載されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法を提供し、方法は、本開示の改変された宿主細胞をカルボン酸を含む培地において培養することを含む。ある特定のこのような実施形態では、方法は、生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を回収することを含む。ある特定のこのような実施形態では、次いで、生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本明細書において開示される通り、精製される。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体が、細胞溶解物から；培地から；改変された宿主細胞から；細胞溶解物と培地の両方から；改変された宿主細胞と培地の両方から；細胞溶解物、改変された宿主細胞、および培地から、回収される。ある特定のこのような実施形態では、次いで、回収されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本明細書において開示される通り、精製される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体が、本明細書において開示される一つまたは複数のポリペプチドを含む、細胞溶解物から；培地から；改変された宿主細胞から；細胞溶解物と培地の両方から；改変された宿主細胞と培地の両方から；細胞溶解物、改変された宿主細胞、および培地から；または無細胞反応混合物から、回収されるとき、回収されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、塩の形態である。ある特定のこのような実施形態では、塩は、薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、次いで、回収されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の塩は、本明細書において開示される通り、精製される。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、カルボン酸を含む培地において培養される。一部の実施形態では、カルボン酸は、一つまたは複数の官能基および／もしくは反応基で置換されるか、またはそれを含んでもよい。官能基としては、アジド、ハロ（例えば、塩化物、ブ臭化物、ヨウ化物、フッ素）、メチル、アルキル、アルキニル、アルケニル、メトキシ、アルコキシ、アセチル、アミノ、カルボキシル、カルボニル、オキソ、エステル、ヒドロキシル、チオ（例えば、チオール）、シアノ、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルケニル、シクロアルキルアルキニル、シクロアルケニルアルキル、シクロアルケニルアルケニル、シクロアルケニルアルキニル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、スピロシクリル、ヘテロスピロシクリル、ヘテロシクリル、チオアルキル（またはアルキルチオ）、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、スルホン、スルホニル、スルホキシド、アミド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノ、Ｎ－オキシド、イミド、エナミン、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ニトリル、アラルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、ニトロ、チオキソなどが、挙げられ得るが、これらに限定されない。反応基としては、アジド、カルボキシル、カルボニル、アミン（例えば、アルキルアミン（例えば、低級アルキルアミン）、アリールアミン）、エステル（例えば、アルキルエステル（例えば、低級アルキルエステル、ベンジルエステル）、アリールエステル、置換されたアリールエステル）、シアノ、チオエステル、チオエーテル、ハロゲン化スルホニル、アルコール、チオール、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ヨードアセトアミド、マレイミド、ヒドラジン、アルキニル、アルケニルなどが、挙げられ得るが、これらに必ずしも限定されない。一部の実施形態では、反応基は、カルボキシル、カルボニル、アミン、エステル、チオエステル、チオエーテル、ハロゲン化スルホニル、アルコール、チオール、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ヨードアセトアミド、マレイミド、アジド、アルキン、アルケン、およびヒドラジンから選択される。官能基および反応基は、置換されていないか、または一つまたは複数の官能基もしくは反応基で置換されていてもよい。
一部の実施形態では、カルボン酸は、同位体または放射線標識される。一部の実施形態では、カルボン酸は、エナンチオマーまたはジアステレオマーであってもよい。一部の実施形態では、カルボン酸は、（Ｓ）－エナンチオマーであってもよい。一部の実施形態では、カルボン酸は、（Ｒ）－エナンチオマーであってもよい。一部の実施形態では、カルボン酸は、（＋）または（－）エナンチオマーであってもよい。一部の実施形態では、カルボン酸は、二重結合または融合環を含んでもよい。ある特定のこのような実施形態では、二重結合または融合環は、配置が具体的に定義されない限り、シスまたはトランスであってもよい。カルボン酸が、二重結合を含有する場合、配置が具体的に定義されない限り、置換基は、ＥまたはＺ配置であり得る。
一部の実施形態では、カルボン酸は、Ｃ＝Ｃ基を含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、アルキン基を含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、Ｎ３基を含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、ハロゲンを含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、ＣＮ基を含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、ヨードを含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、ブロモを含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、クロロを含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、フルオロを含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、カルボニルを含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、アセチルを含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、アルキル基を含む。一部の実施形態では、カルボン酸は、アリール基を含む。
カルボン酸としては、置換されていないか、または置換されたＣ３－Ｃ１８脂肪酸、Ｃ３－Ｃ１８カルボン酸、Ｃ１－Ｃ１８カルボン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、Ｃ１５－Ｃ１８脂肪酸、Ｃ１５－Ｃ１８カルボン酸、フマル酸、イタコン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、マロン酸、グルタル酸、グルカル酸、シュウ酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ドデカンジオン酸、グルタコン酸、オルトフタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、クエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリカルバリル酸、およびトリメシン酸が、挙げられ得るが、これらに限定されない。カルボン酸としては、置換されていないか、または置換されたＣ１－Ｃ１８カルボン酸が挙げられ得る。カルボン酸としては、置換されていないか、または置換されたＣ３－Ｃ１８カルボン酸が挙げられ得る。カルボン酸としては、置換されていないか、または置換されたＣ３－Ｃ１２カルボン酸が挙げられ得る。カルボン酸としては、置換されていないか、または置換されたＣ４－Ｃ１０カルボン酸が挙げられ得る。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたＣ４カルボン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたＣ５カルボン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたＣ６カルボン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたＣ７カルボン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたＣ８カルボン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたＣ９カルボン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたＣ１０カルボン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換された酪酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換された吉草酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたヘキサン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたヘプタン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたオクタン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたノナン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたデカン酸である。
カルボン酸としては、２－メチルヘキサン酸、３－メチルヘキサン酸、４－メチルヘキサン酸、５－メチルヘキサン酸、２－ヘキセン酸、３－ヘキセン酸、４－ヘキセン酸、５－ヘキセン酸、５－クロロ吉草酸、５－アミノ吉草酸、５－シアノ吉草酸、５－（メチルスルファニル）吉草酸、５－ヒドロキシ吉草酸、５－フェニル吉草酸、２，３－ジメチルヘキサン酸、ｄ３－ヘキサン酸、４－ペンチン酸－トランス－２－ペンテン酸、５－ヘキシン酸－トランス－２－ヘキセン酸、６－ヘプチン酸－トランス－２－オクテン酸－トランス－２－ノネン酸、４－フェニル酪酸、６－フェニルヘキサン酸、７－フェニリヘプタン酸などが、挙げられ得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、カルボン酸は、２－メチルヘキサン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、３－メチルヘキサン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、４－メチルヘキサン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、５－メチルヘキサン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、２－ヘキセン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、３－ヘキセン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、４－ヘキセン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、５－ヘキセン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、５－クロロ吉草酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、５－アミノ吉草酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、５－シアノ吉草酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、５－（メチルスルファニル）吉草酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、５－ヒドロキシ吉草酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、５－フェニル吉草酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、２，３－ジメチルヘキサン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、ｄ３－ヘキサン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、４－ペンチン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、トランス－２－ペンテン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、５－ヘキシン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、トランス－２－ヘキセン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、６－ヘプチン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、トランス－２－オクテン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、トランス－２－ノネン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、４－フェニル酪酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、６－フェニルヘキサン酸である。一部の実施形態では、カルボン酸は、７－フェニルヘプタン酸である。
本開示の改変された宿主細胞が、カルボン酸を含む培地において培養される、一部の実施形態では、カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたＣ３－Ｃ１８カルボン酸である。ある特定のこのような実施形態では、置換されていないか、または置換されたＣ３－Ｃ１８カルボン酸は、置換されていないか、または置換されたヘキサン酸である。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
本開示の改変された宿主細胞が、カルボン酸を含む培地において培養される、一部の実施形態では、カルボン酸は、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、オクタン酸、２－メチルヘキサン酸、３－メチルヘキサン酸、４－メチルヘキサン酸、５－メチルヘキサン酸、２－ヘキセン酸、３－ヘキセン酸、４－ヘキセン酸、５－ヘキセン酸、ヘプタン酸、５－クロロ吉草酸、５－（メチルスルファニル）吉草酸、４－ペンチン酸－トランス－２－ペンテン酸、５－ヘキシン酸－トランス－２－ヘキセン酸、６－ヘプチン酸－トランス－２－オクテン酸、ノナン酸－トランス－２－ノネン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、４－フェニル酪酸、５－フェニル吉草酸、６－フェニルヘキサン酸、７－フェニルヘプタン酸、イソ酪酸、フマル酸、イタコン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、マロン酸、グルタル酸、グルカル酸、シュウ酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ドデカンジオン酸、グルタコン酸、オルトフタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、クエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリカルバリル酸、トリメシン酸、５－アミノ吉草酸、５－シアノ吉草酸、５－ヒドロキシ吉草酸、または２，３－ジメチルヘキサン酸である。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
本開示の改変された宿主細胞が、カルボン酸を含む培地において培養される、一部の実施形態では、カルボン酸は、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、オクタン酸、２－メチルヘキサン酸、３－メチルヘキサン酸、４－メチルヘキサン酸、５－メチルヘキサン酸、２－ヘキセン酸、３－ヘキセン酸、４－ヘキセン酸、５－ヘキセン酸、ヘプタン酸、５－クロロ吉草酸、５－（メチルスルファニル）吉草酸、４－ペンチン酸－トランス－２－ペンテン酸、５－ヘキシン酸－トランス－２－ヘキセン酸、６－ヘプチン酸－トランス－２－オクテン酸、ノナン酸－トランス－２－ノネン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、４－フェニル酪酸、５－フェニル吉草酸、６－フェニルヘキサン酸、７－フェニルヘプタン酸、イソ酪酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、マロン酸、グルタル酸、シュウ酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ドデカンジオン酸、オルトフタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、トリメシン酸、５－アミノ吉草酸、５－シアノ吉草酸、５－ヒドロキシ吉草酸、または２，３－ジメチルヘキサン酸である。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
本開示の改変された宿主細胞が、カルボン酸を含む培地において培養される、一部の実施形態では、カルボン酸は、２－メチルヘキサン酸、３－メチルヘキサン酸、４－メチルヘキサン酸、５－メチルヘキサン酸、２－ヘキセン酸、３－ヘキセン酸、４－ヘキセン酸、ヘプタン酸、５－クロロ吉草酸、５－（メチルスルファニル）吉草酸、４－ペンチン酸－トランス－２－ペンテン酸、５－ヘキシン酸－トランス－２－ヘキセン酸、６－ヘプチン酸－トランス－２－オクテン酸、ノナン酸－トランス－２－ノネン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、４－フェニル酪酸、５－フェニル吉草酸、６－フェニルヘキサン酸、７－フェニルヘプタン酸、イソ酪酸、フマル酸、イタコン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グルカル酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ドデカンジオン酸、グルタコン酸、オルトフタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、クエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリカルバリル酸、トリメシン酸、５－アミノ吉草酸、５－シアノ吉草酸、５－ヒドロキシ吉草酸、または２，３－ジメチルヘキサン酸である。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
本開示の改変された宿主細胞が、カルボン酸を含む培地において培養される、一部の実施形態では、カルボン酸は、２－メチルヘキサン酸、３－メチルヘキサン酸、４－メチルヘキサン酸、５－メチルヘキサン酸、２－ヘキセン酸、３－ヘキセン酸、４－ヘキセン酸、ヘプタン酸、５－クロロ吉草酸、５－（メチルスルファニル）吉草酸、４－ペンチン酸－トランス－２－ペンテン酸、５－ヘキシン酸－トランス－２－ヘキセン酸、６－ヘプチン酸－トランス－２－オクテン酸、ノナン酸－トランス－２－ノネン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、４－フェニル酪酸、５－フェニル吉草酸、６－フェニルヘキサン酸、７－フェニルヘプタン酸、イソ酪酸、フマル酸、マレイン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ドデカンジオン酸、オルトフタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、トリメシン酸、５－アミノ吉草酸、５－シアノ吉草酸、５－ヒドロキシ吉草酸、または２，３－ジメチルヘキサン酸である。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
本開示の改変された宿主細胞が、カルボン酸を含む培地において培養される、一部の実施形態では、カルボン酸は、４－ペンチン酸－トランス－２－ペンテン酸、５－ヘキシン酸－トランス－２－ヘキセン酸、６－ヘプチン酸－トランス－２－オクテン酸、ノナン酸－トランス－２－ノネン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、４－フェニル酪酸、５－フェニル吉草酸、６－フェニルヘキサン酸、または７－フェニルヘプタン酸である。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
本開示の改変された宿主細胞が、カルボン酸を含む培地において培養される、一部の実施形態では、カルボン酸は、２－メチルヘキサン酸、４－メチルヘキサン酸、５－メチルヘキサン酸、２－ヘキセン酸、３－ヘキセン酸、４－ヘキセン酸、ヘプタン酸、５－クロロ吉草酸、または５－（メチルスルファニル）吉草酸である。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
本開示はまた、本明細書において記載されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法を提供し、方法は、本開示の改変された宿主細胞を、オリベトール酸またはオリベトール酸誘導体を含む培地において培養することを含む。ある特定のこのような実施形態では、方法は、生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を回収することを含む。ある特定のこのような実施形態では、次いで、生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本明細書において開示される通り、精製される。
本明細書において使用されるオリベトール酸誘導体は、本明細書において開示される一つまたは複数の反応基および／もしくは官能基で置換されるか、それを含んでもよい。一部の実施形態では、オリベトール酸誘導体は、オリベトール酸において見られる一つまたは複数の化学部分を欠いてもよい。一部の実施形態では、培地が、オリベトール酸誘導体を含むとき、オリベトール酸誘導体は、オルセリン酸である。一部の実施形態では、培地が、オリベトール酸誘導体を含むとき、オリベトール酸誘導体は、ジバリン酸である。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量で生成される。
本開示は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための、本開示の改変された宿主細胞を使用する方法を提供する。カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための、本開示の改変された宿主細胞を使用する方法の一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞を培養することを含む方法において生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、生成される。特定のかかる実施形態では、本開示の改変された宿主細胞、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で培養される。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための、本開示の改変された宿主細胞を使用する方法の一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞を培養することを代わりに含む方法において生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成される。特定のかかる実施形態では、本開示の改変された宿主細胞、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で培養される。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための、本開示の改変された宿主細胞を使用する方法の一部の実施形態では、カンナビノイドは、ＴＨＣＡであり、方法は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させた、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、改変された宿主細胞を培養することを代わりに含む方法において生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対して、高いＴＨＣＡの比率で、ＴＨＣＡを生成する。カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための、本開示の改変された宿主細胞を使用する方法の一部の実施形態では、カンナビノイドは、ＴＨＣＡであり、方法は、約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する。
典型的な細胞培養条件
本開示の改変された宿主細胞を培養するのに適当な培地は、標準的な培地（例えば、ルリア－ベルターニ培地、任意選択で、一つまたは複数の追加の剤を添加したルリア－ベルターニ培地（例えば、本明細書において開示される核酸が、誘導性プロモーターの制御下にある場合など）；標準的な酵母培地など）を含み得る。一部の実施形態では、培地は、発酵性糖（例えば、ヘキソース糖、例えば、グルコース、キシロースなど）を添加することができる。酵母によって発酵可能な糖としては、スクロース、デキストロース、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、およびマルトースなどが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、培地は、非置換もしく置換されたヘキサン酸塩、非置換もしくは置換されたヘキサン酸塩以外のカルボン酸、オリベトール酸、またはオリベトール酸誘導体を補充されてもよい。一部の実施形態では、培地は、前処理されたセルロース供給原料（例えば、ヒメカモジグサ、小麦わら、大麦わら、モロコシ、稲藁、サトウキビわら、バガス、スイッチグラス、トウモロコシわら、トウモロコシ繊維、穀物、またはその任意の組み合わせ）を添加することができる。一部の実施形態では、培地は、オレイン酸を添加することができる。一部の実施形態では、培地は、非発酵性炭素源を含む。ある特定のこのような実施形態では、非発酵性炭素源は、エタノールを含む。一部の実施形態では、適当な培地は、インデューサーを含む。ある特定のこのような実施形態では、インデューサーは、ガラクトースを含む。一部の実施形態では、インデューサーは、ＫＨ２ＰＯ４、ガラクトース、グルコース、スクロース、マルトース、アミノ酸（例えば、メチオニン、リジン）、ＣｕＳＯ４、温度の変化（例えば、３０℃から３７℃）、ｐＨの変化（例えば、ｐＨ６からｐＨ４）、酸素レベルの変化（例えば、２０％から１％溶解酸素レベル）、薬物メナジオンを生じる過酸化水素またはスーパーオキシドの添加、ツニカマイシン、ミスフォールディング傾向のタンパク質（例えば、カンナビノイド合成酵素）の発現、エストラジオール、またはドキシサイクリンを含む。追加の誘導システムは、本明細書において詳述される。
好適な培地中の炭素源は、グルコースの様な単純な糖から、酵母抽出物などの他のバイオマスのより複雑な加水分解物まで、大きく変動することができる。塩の添加は、一般に、細胞が、ポリペプチドおよび核酸を合成することを可能にするための、マグネシウム、窒素、リン、および硫黄などの必須構成要素を提供する。適当な培地にまた、抗生物質などの選択剤を添加して、ある特定のプラスミドの維持などのため選択することもできる。例えば、微生物がアンピシリンまたはテトラサイクリンなどのある特定の抗生物質に抵抗性である場合、次いで、その抗生物質が、抵抗性を欠く細胞が増殖するのを防ぐために培地に加えることができる。適当な培地に、他の化合物を添加して、必要に応じて、特定のアミノ酸などの、所望の生理学的特徴または生化学的特徴を選択することができる。
一部の実施形態では、本明細書において開示される改変された宿主細胞は、最小培地で増殖する。本明細書で使用される場合、「最小培地」という用語は、概して常にではないが一つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸）が存在しない、細胞増殖が可能な最小限の栄養素を含有する増殖培地を指す場合がある。最小培地は、典型的には、（１）細胞（例えば、細菌または酵母）増殖のための炭素源、（２）細胞（例えば、細菌または酵母）の種類および増殖条件によって変化し得る様々な塩、および（３）水を含む。
一部の実施形態では、本明細書において開示される改変された宿主細胞は、富栄養培地で増殖する。ある特定のこのような実施形態では、富栄養培地または複数の富栄養培地は、水、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏペプトン、および２０ｇ／Ｌデキストロース（グルコース）を含む酵母抽出物ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地を含む。一部の実施形態では、富栄養培地は、ＹＰ＋２０ｇ／Ｌガラクトース、および１ｇ／Ｌグルコースを含む。一部の実施形態では、富栄養培地または複数の富栄養培地は、カルボン酸（例えば、１ｍＭオリベトール酸、１ｍＭオリベトール酸誘導体、２ｍＭ置換されていないか、もしくは置換されたヘキサン酸、または置換されていないか、もしくは置換されたヘキサン酸以外の２ｍＭカルボン酸）を含む。一部の実施形態では、富栄養培地は、最小培地と比較して、より急速な細胞増殖をもたらす。
本開示の組み換え細胞の維持および増殖に適した材料および方法は、本明細書において、例えば、実施例のセクションにおいて記載される。細胞（例えば、細菌または酵母）培養物の維持および増殖に適した他の材料および方法は、当技術分野で周知である。典型的な技術は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国公開第２０１０／０００３７１６号、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｇｅｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ（１９９４）ｏｒ Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡにおいて見ることができる。
標準的な細胞培養条件を使用して、本明細書において開示される改変された宿主細胞を培養することができる（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号およびそこで引用される参考文献を参照されたい）。一部の実施形態では、細胞は、適切な温度、ガス混合物、ならびにｐＨにおいて（例えば、約２０℃～約３７℃、約０．０４％～約８４％ＣＯ２、約０％～約１００％溶解酸素、およびｐＨ約２～約９において）増殖および維持される。一部の実施形態では、本明細書において開示される改変された宿主細胞は、約３４℃で、適当な細胞培地において増殖する。一部の実施形態では、本明細書において開示される改変された宿主細胞は、約２０℃～約３７℃で、適当な細胞培地において増殖する。サッカロミセス・セレビシエに最適な増殖は、約３０℃である一方、より高い温度、例えば、３４℃で細胞を培養することは、産業用発酵タンクを冷却するためのコストを低減することによって有利であり得る。一部の実施形態では、本明細書において開示される改変された宿主細胞は、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、または約３７℃で、適当な細胞培地において増殖する。一部の実施形態では、発酵のためのｐＨ範囲は、約ｐＨ３．０～約ｐＨ９．０（例えば、約ｐＨ３．０、約ｐＨ３．５、約ｐＨ４．０、約ｐＨ４．５、約ｐＨ５．０、約ｐＨ５．５、約ｐＨ６．０、約ｐＨ６．５、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．５、約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．５、約ｐＨ６．０～約ｐＨ８．０または約６．５～約７．０）である。一部の実施形態では、発酵のためのｐＨ範囲は、約ｐＨ４．５～約ｐＨ５．５である。一部の実施形態では、発酵のためのｐＨ範囲は、約ｐＨ４．０～約ｐＨ６．０である。一部の実施形態では、発酵のためのｐＨ範囲は、約ｐＨ３．０～約ｐＨ６．０である。一部の実施形態では、発酵のためのｐＨ範囲は、約ｐＨ３．０～約ｐＨ５．５である。一部の実施形態では、発酵のためのｐＨ範囲は、約ｐＨ３．０～約ｐＨ５．０である。一部の実施形態では、溶解した酸素は、約０％～約１０％、約０％～約２０％、約０％～約３０％、約０％～約４０％、約０％～約５０％、約０％～約６０％、約０％～約７０％、約０％～約８０％、約０％～約９０％、約５％～約１０％、約５％～約２０％、約５％～約３０％、約５％～約４０％、約５％～約５０％、約５％～約６０％、約５％～約７０％、約５％～約８０％、約５％～約９０％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％または約１０％～約５０％である。一部の実施形態では、ＣＯ２レベルは、約０．０４％～約０．１％ＣＯ２、約０．０４％～約１％ＣＯ２、約０．０４％～約５％ＣＯ２、約０．０４％～約１０％ＣＯ２、約０．０４％～約２０％ＣＯ２、約０．０４％～約３０％ＣＯ２、約０．０４％～約４０％ＣＯ２、約０．０４％～約５０％ＣＯ２、約０．０４％～約６０％ＣＯ２、約０．０４％～約７０％ＣＯ２、約０．１％～約５％ＣＯ２、約０．１％～約１０％ＣＯ２、約０．１％～約２０％ＣＯ２、約０．１％～約３０％ＣＯ２、約０．１％～約４０％ＣＯ２、約０．１％～約５０％ＣＯ２、約１％～約５％ＣＯ２、約１％～約１０％ＣＯ２、約１％～約２０％ＣＯ２、約１％～約３０％ＣＯ２、約１％～約４０％ＣＯ２、約１％～約５０％ＣＯ２、約５％～約１０％ＣＯ２、約１０％～約２０％ＣＯ２、約１０％～約３０％ＣＯ２、約１０％～約４０％ＣＯ２、約１０％～約５０％ＣＯ２、約１０％～約６０％ＣＯ２、約１０％～約７０％ＣＯ２、約１０％～約８０％ＣＯ２、約５０％～約６０％ＣＯ２、約５０％～約７０％ＣＯ２、または約５０％～約８０％ＣＯ２である。本明細書において開示される本明細書において開示される改変された宿主細胞は、細胞の要件に基づき好気、無酸素、微好気、または嫌気条件下で成長することができる。
標準的培養条件および使用することができるバッチ、フェドバッチ、または連続発酵などの、発酵の様式は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国公開第２０１０／０００３７１６号に記載され、そのそれぞれの内容が、その全体が、参照により本明細書に取り込まれる。バッチおよびフェドバッチ発酵は、当該技術分野で一般的かつ周知であり、例が、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．において見ることができる。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成および生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の回収
本開示は、ある量のカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｍｇ～培地１Ｌ当たり約１ｇの量での、本開示の改変された宿主細胞による、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｍｇ～培地１Ｌ当たり約５００ｍｇの量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｍｇ～培地１Ｌ当たり約１００ｍｇの量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。例えば、一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｍｇ～培地１Ｌ当たり約５ｍｇ、培地１Ｌ当たり約５ｍｇ～培地１Ｌ当たり約１０ｍｇ、培地１Ｌ当たり約１０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約２５ｍｇ、培地１Ｌ当たり約２５ｍｇ～培地１Ｌ当たり約５０ｍｇ、培地１Ｌ当たり約５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約７５ｍｇ、または培地１Ｌ当たり約７５ｍｇ～培地１Ｌ当たり約１００ｍｇの量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１００ｍｇ～培地１Ｌ当たり約１５０ｍｇ、培地１Ｌ当たり約１５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約２００ｍｇ、培地１Ｌ当たり約２００ｍｇ～培地１Ｌ当たり約２５０ｍｇ、培地１Ｌ当たり約２５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約５００ｍｇ、培地１Ｌ当たり約５００ｍｇ～培地１Ｌ当たり約７５０ｍｇ、または培地１Ｌ当たり約７５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約１ｇの量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約１００ｍｇ、培地１Ｌ当たり約５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約１５０ｍｇ、培地１Ｌ当たり約５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約２００ｍｇ、培地１Ｌ当たり約５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約２５０ｍｇ、培地１Ｌ当たり約５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約５００ｍｇ、または培地１Ｌ当たり約５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約７５０ｍｇの量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。
一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約１００ｇ、または培地１Ｌ当たり１００ｇより多い量での、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約５０ｍｇ～培地１Ｌ当たり約１００ｍｇ、または培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量での、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり５０ｍｇより多い量での、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量での、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１００ｍｇ～培地１Ｌ当たり約５００ｍｇ、または培地１Ｌ当たり５００ｍｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約５００ｍｇ～培地１Ｌ当たり約１ｇ、または培地１Ｌ当たり１ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｇ～培地１Ｌ当たり約１０ｇ、または培地１Ｌ当たり１０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１０ｇ～培地１Ｌ当たり約１００ｇ、または培地１Ｌ当たり１００ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｇ～培地１Ｌ当たり約２０ｇ、または培地１Ｌ当たり２０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｇ～培地１Ｌ当たり約３０ｇ、または培地１Ｌ当たり３０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｇ～培地１Ｌ当たり約４０ｇ、または培地１Ｌ当たり４０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｇ～培地１Ｌ当たり約５０ｇ、または培地１Ｌ当たり５０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｇ～培地１Ｌ当たり約６０ｇ、または培地１Ｌ当たり６０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｇ～培地１Ｌ当たり約７０ｇ、または培地１Ｌ当たり７０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｇ～培地１Ｌ当たり約８０ｇ、または培地１Ｌ当たり８０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１ｇ～培地１Ｌ当たり約９０ｇ、または培地１Ｌ当たり９０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１０ｇ～培地１Ｌ当たり約２０ｇ、または培地１Ｌ当たり２０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１０ｇ～培地１Ｌ当たり約３０ｇ、または培地１Ｌ当たり３０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１０ｇ～培地１Ｌ当たり約４０ｇ、または培地１Ｌ当たり４０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１０ｇ～培地１Ｌ当たり約５０ｇ、または培地１Ｌ当たり５０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１０ｇ～培地１Ｌ当たり約６０ｇ、または培地１Ｌ当たり６０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１０ｇ～培地１Ｌ当たり約７０ｇ、または培地１Ｌ当たり７０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１０ｇ～培地１Ｌ当たり約８０ｇ、または培地１Ｌ当たり８０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約１０ｇ～培地１Ｌ当たり約９０ｇ、または培地１Ｌ当たり９０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約５０ｇ～培地１Ｌ当たり約１００ｇ、または培地１Ｌ当たり１００ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約５０ｇ～培地１Ｌ当たり約６０ｇ、または培地１Ｌ当たり６０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約５０ｇ～培地１Ｌ当たり約７０ｇ、または培地１Ｌ当たり７０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約５０ｇ～培地１Ｌ当たり約８０ｇ、または培地１Ｌ当たり８０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約５０ｇ～培地１Ｌ当たり約９０ｇ、または培地１Ｌ当たり９０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約２０ｇ～培地１Ｌ当たり約１００ｇ、または培地１Ｌ当たり１００ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約２０ｇ～培地１Ｌ当たり約３０ｇ、または培地１Ｌ当たり３０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約２０ｇ～培地１Ｌ当たり約４０ｇ、または培地１Ｌ当たり４０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約２０ｇ～培地１Ｌ当たり約５０ｇ、または培地１Ｌ当たり５０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約２０ｇ～培地１Ｌ当たり約６０ｇ、または培地１Ｌ当たり６０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約２０ｇ～培地１Ｌ当たり約７０ｇ、または培地１Ｌ当たり７０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約２０ｇ～培地１Ｌ当たり約８０ｇ、または培地１Ｌ当たり８０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、培地１Ｌ当たり約２０ｇ～培地１Ｌ当たり約９０ｇ、または培地１Ｌ当たり９０ｇより多い量での、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を提供する。
一部の実施形態では、本明細書において開示される改変された宿主細胞は、カルボン酸、オリベトール酸、またはオリベトール酸誘導体を含む液体培地において培養される。
一部の実施形態では、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法は、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を支持する条件下で、本開示の改変された酵母細胞を培養することを含んでもよく、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、改変された酵母細胞により生成され、改変された酵母細胞が培養される培地（例えば、液体培地）に存在する。一部の実施形態では、改変された酵母細胞が培養される培地は、１ｎｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌ（例えば、１ｎｇ／Ｌ～５０ｎｇ／Ｌ、５０ｎｇ／Ｌ～１００ｎｇ／Ｌ、１００ｎｇ／Ｌ～５００ｎｇ／Ｌ、５００ｎｇ／Ｌ～１μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ～５０μｇ／Ｌ、５０μｇ／Ｌ～１００μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌ～５００μｇ／Ｌ、５００μｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ～５０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌ、または５００ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌ）の量でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された酵母細胞は、改変されたサッカロミセス・セレビシエである。一部の実施形態では、改変された酵母細胞が培養される培地は、５０ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌの量でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された酵母細胞は、改変されたサッカロミセス・セレビシエである。一部の実施形態では、改変された酵母細胞が培養される培地は、１００ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌの量でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された酵母細胞は、改変されたサッカロミセス・セレビシエである。一部の実施形態では、改変された酵母細胞が培養される培地は、５００ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌの量でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された酵母細胞は、改変されたサッカロミセス・セレビシエである。一部の実施形態では、改変された酵母細胞が培養される培地は、１ｇ／Ｌより多い量でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を含む。ある特定のこのような実施形態では、改変された酵母細胞は、改変されたサッカロミセス・セレビシエである。
一部の実施形態では、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法は、糖の発酵を支持する条件下、およびカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成を支持する条件下で、本開示の改変された酵母細胞を培養することを含んでもよく、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、改変された酵母細胞により生成され、改変された酵母細胞により生成されるアルコールに存在する。本開示は、改変された酵母細胞により生成されるアルコール飲料を提供し、アルコール飲料は、改変された酵母細胞により生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を含む。アルコール飲料は、ビール、ワイン、および蒸留アルコール飲料を含み得る。一部の実施形態では、本開示のアルコール飲料は、１ｎｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌ（例えば、１ｎｇ／Ｌ～５０ｎｇ／Ｌ、５０ｎｇ／Ｌ～１００ｎｇ／Ｌ、１００ｎｇ／Ｌ～５００ｎｇ／Ｌ、５００ｎｇ／Ｌ～１μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ～５０μｇ／Ｌ、５０μｇ／Ｌ～１００μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌ～５００μｇ／Ｌ、５００μｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ～５０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌ、または５００ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌ）の量でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を含む。一部の実施形態では、本開示のアルコール飲料は、１ｇ／Ｌより多い量で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を含む。
本開示は、改変された酵母細胞により生成される飲料を提供し、飲料は、改変された酵母細胞により生成される、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を含む。一部の実施形態では、本開示の飲料は、１ｎｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌ（例えば、１ｎｇ／Ｌ～５０ｎｇ／Ｌ、５０ｎｇ／Ｌ～１００ｎｇ／Ｌ、１００ｎｇ／Ｌ～５００ｎｇ／Ｌ、５００ｎｇ／Ｌ～１μｇ／Ｌ、１μｇ／Ｌ～５０μｇ／Ｌ、５０μｇ／Ｌ～１００μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌ～５００μｇ／Ｌ、５００μｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ～５０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌ、または５００ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌ）の量でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を含む。一部の実施形態では、本開示の飲料は、１ｇ／Ｌより多い量で、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を含む。一部の実施形態では、本開示の飲料は、アルコールではない。
一部の実施形態では、本開示の方法は、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の増大した生成を提供する。ある特定のこのような実施形態では、培地における本明細書において開示される改変された宿主細胞の培養は、同様の条件下で培養された改変されていない宿主細胞と比較して、増大した量でのカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の合成を提供する。本明細書において開示される改変された宿主細胞によるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成は、同様の条件下で培養された改変されていない宿主細胞と比較して、約５％～約１，０００，０００増大し得る。本明細書において開示される改変された宿主細胞によるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成は、同様の条件下で培養された改変されていない宿主細胞によるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成と比較して、約１０％～約１，０００，０００倍（例えば、約５０％～約１，０００，０００倍、約１～約５００，０００倍、約１～約５０，０００倍、約１～約５，０００倍、約１～約１，０００倍、約１～約５００倍、約１～約１００倍、約１～約５０倍、約５～約１００，０００倍、約５～約１０，０００倍、約５～約１，０００倍、約５～約５００倍、約５～約１００倍、約１０～約５０，０００倍、約５０～約１０，０００倍、約１００～約５，０００倍、約２００～約１，０００倍、約５０～約５００倍、または約５０～約２００倍）増大してもよい。本明細書において開示される改変された宿主細胞によるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成はまた、同様の条件下で培養された、改変されていない宿主細胞によるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍の少なくともおよそいずれか、増大してもよい。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞による、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成はまた、同様の条件下で培養される改変されていない宿主細胞によるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の少なくともおよそいずれか、増大してもよい。一部の実施形態では、本明細書において開示される改変された宿主細胞によるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成は、同様の条件下で培養される改変されていない宿主細胞によるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成と比較して、１～２０％、２～２０％、５～２０％、１０～２０％、１５～２０％、１～１５％、１～１０％、２～１５％、２～１０％、５～１５％、１０～１５％、１～５０％、１０～５０％、２０～５０％、３０～５０％、４０～５０％、５０～１００％、５０～６０％、５０～７０％、５０～８０％、または５０～９０％の少なくともおよそいずれか、増大してもよい。
本開示の改変された宿主細胞によるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成は、ＬＣ－ＭＳ解析により決定される。ある特定のこのような実施形態では、それぞれのカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、真正の標準から決定された保持時間、および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）転移により同定される。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、酵母細胞である。ある特定のこのような実施形態では、本明細書において開示される改変された宿主細胞は、バイオリアクターにおいて培養される。一部の実施形態では、改変された宿主細胞は、置換されていないか、または置換されたヘキサン酸、置換されていないか、もしくは置換されたヘキサン酸、オリベトール酸、またはオリベトール酸誘導体以外のカルボン酸を添加した培地において培養される。一部の実施形態では、改変された酵母細胞は、改変されたサッカロミセス・セレビシエである。
一部の実施形態では、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、例えば、本明細書において開示される改変された宿主細胞を溶解すること、および溶解物からカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体誘導体を回収することによって、細胞溶解物から回収される。他の場合では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本明細書に開示される改変された宿主細胞が培養される培地から回収される。他の場合では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、細胞溶解物と培地の両方から回収される。他の場合では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、改変された宿主細胞から回収される。他の場合では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、改変された宿主細胞と培地の両方から回収される。他の場合では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、細胞溶解物、改変された宿主細胞、および培地から回収される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体が、本明細書において開示される一つまたは複数のポリペプチドを含む、細胞溶解物から；培地から；改変された宿主細胞から；細胞溶解物と培地の両方から；改変された宿主細胞と培地の両方から；細胞溶解物、改変された宿主細胞、および培地から；または無細胞反応混合物から、回収されるとき、回収されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、塩の形態である。ある特定のこのような実施形態では、塩は、薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、次いで、回収されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の塩は、本明細書において開示される通り、精製される。
一部の実施形態では、次いで、本明細書において開示されるものなどの、回収されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、精製される。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞を含む培養物由来の細胞ブロス全体を、適当な有機溶媒を用いて抽出して、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を得てもよい。適当な有機溶媒としては、ヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、石油エーテル、ならびにジ－エチルエーテル、クロロホルム、および酢酸エチルが、挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、適当な有機溶媒は、ヘキサンを含む。一部の実施形態では、適当な有機溶媒は、１０：１の比（有機溶媒１重量部に、細胞ブロス全体１０重量部）で、本開示の改変された宿主細胞を含む発酵由来の細胞ブロス全体に加えられ、３０分間撹拌され得る。ある特定のこのような実施形態では、有機画分は、分離され、等体積の酸性水（ｐＨ２．５）で２回抽出されてもよい。次いで、有機層は、分離され、濃縮器（減圧下での回転蒸発器または薄膜蒸発器）において乾燥させて、粗カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体結晶を得てもよい。ある特定のこうした実施形態では、粗結晶を加熱するか、または光に曝露して、粗カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を脱炭酸してもよい。ある特定のこのような実施形態では、粗結晶を、１０５℃まで１５分間加熱し、続いて、１４５℃で５５分間加熱して、粗カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を脱炭酸してもよい。ある特定のこのような実施形態では、粗結晶性生成物を、適当な溶媒（例えば、ｎ－ペンタン）において再溶解し、再結晶化し、濾過して、任意の不溶性物質を除去してもよい。ある特定のこのような実施形態では、次いで、溶媒を、例えば、回転蒸発によって除去して、純粋な結晶性生成物を生成してもよい。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、純粋、であり、例えば、少なくとも約４０％純粋、少なくとも約５０％純粋、少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％、または９８％より高く純粋であり、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の文脈における「純粋」は、他のカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体、高分子、混入物などを含まない、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を刺してもよい。
テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントを作製する方法
ある態様では、本開示は、テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントを作製するための方法を提供する。ある特定のこのような実施形態では、方法は、本開示の改変された宿主細胞を培地において培養することを含んでもよい。一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞は、ピキア属である。方法は、本明細書において記載される通り、発現された操作されたバリアントを単離することおよび／または精製することを含み得る。
一部の実施形態では、操作されたバリアントを調製する方法は、操作されたバリアントを単離することまたは精製することを含む。本開示の操作されたバリアントは、本明細書において記載される通り、改変された宿主細胞において発現され、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のため使用される周知の技術の任意の一つまたは複数を使用して、改変された宿主細胞および／または培地から単離され得る。本開示の操作されたバリアントを単離するためのクロマトグラフィー技術は、とりわけ、逆相クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーを含み得る。一部の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーが使用される。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞において発現された本開示の操作されたバリアントは、粗抽出物（例えば、無細胞溶解物）、粉末（例えば、振とうフラスコ粉末）、凍結乾燥物、グリセロールまたは別の抗凍結剤で作製された凍結ストック、および実質的に純粋な調製物（例えば、ＤＳＰ粉末）を含むが、これらに限定されない、様々な形態で調製され、使用され得る。
一部の実施形態では、本開示の改変された宿主細胞において発現された本開示の操作されたバリアントは、精製された形態で調製され、使用され得る。一般に、特定の操作されたバリアントを精製する条件は、一部、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの、要因に依存し、当業者には明らかである。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の無細胞生成方法
本開示の方法は、本開示の改変された宿主細胞によって発現されるか、または過剰発現される、本明細書において開示される操作されたバリアントを使用した、本明細書において開示されるものなどの、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の無細胞生成を含み得る。一部の実施形態では、本明細書において開示される操作されたバリアントは、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成のための無細胞システムにおいて使用される。ある特定のこのような実施形態では、本開示の操作されたバリアントは、単離され、および／または精製される。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の生成における使用に適切な出発材料を、適当な反応容器において、本明細書において開示される操作されたバリアントと一緒に混合して、反応物を得てもよい。本明細書において開示される操作されたバリアントを組み合わせて使用して、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の適切な出発材料からの完全な合成を果たしてもよい。一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、本明細書において開示される操作されたものを含む無細胞反応混合物から回収される。
一部の実施形態では、次いで、本明細書において開示されるものなどの、回収されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、精製される。ある特定のこのような実施形態では、本明細書において開示される操作されたバリアントを含む無細胞反応混合物を、適当な有機溶媒を用いて抽出して、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を得てもよい。適当な有機溶媒としては、ヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、石油エーテル、ならびにジ－エチルエーテル、クロロホルム、および酢酸エチルが、挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、適当な有機溶媒は、ヘキサンを含む。一部の実施形態では、適当な有機溶媒は、１０：１の比（反応混合物１０重量部に、有機溶媒１重量部）で、本明細書において開示されるポリペプチドの一つまたは複数を含む無細胞反応混合物に加えられ、３０分間撹拌され得る。ある特定のこのような実施形態では、有機画分は、分離され、等体積の酸性水（ｐＨ２．５）で２回抽出されてもよい。次いで、有機層は、分離され、濃縮器（減圧下での回転蒸発器または薄膜蒸発器）において乾燥させて、粗カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体結晶を得てもよい。ある特定のこうした実施形態では、粗結晶を加熱するか、または光に曝露して、粗カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を脱炭酸してもよい。ある特定のこのような実施形態では、粗結晶を、１０５℃まで１５分間加熱し、続いて、１４５℃で５５分間加熱して、粗カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を脱炭酸してもよい。ある特定のこのような実施形態では、粗結晶性生成物を、適当な溶媒（例えば、ｎ－ペンタン）において再溶解し、再結晶化し、濾過して、任意の不溶性物質を除去してもよい。ある特定のこのような実施形態では、次いで、溶媒を、例えば、回転蒸発によって除去して、純粋な結晶性生成物を生成してもよい。
一部の実施形態では、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体が、本明細書において開示される一つまたは複数の操作されたバリアントを含む無細胞反応混合物から回収されるとき、回収されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、塩の形態である。ある特定のこのような実施形態では、塩は、薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、次いで、回収されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の塩は、本明細書において開示される通り、精製される。
一部の実施形態では、本明細書において開示される操作されたバリアントによるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の無細胞生成は、ＬＣ－ＭＳ解析によって決定される。ある特定のこのような実施形態では、それぞれのカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、真正の標準から決定された保持時間、および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）転移により同定される。
本開示の非限定的な実施形態の例
本明細書において開示される本主題の実施形態は、単独で、または一つまたは複数の他の実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を制限することなく、Ｉ－１～Ｉ－１２１の番号が付けられた本開示のある特定の非限定的な実施形態が、以下に提供される。本開示を読んだ際に当業者には明らかであるように、個々に番号付けられた実施形態のそれぞれは、前または後の、個々に番号付けられた実施形態のいずれかと一緒に使用するか、または組み合わせてもよい。これは、実施形態のすべてのこのような組み合わせについての支持を提供することを意図しており、以下に明示的に提供される実施形態の組み合わせに限定されない。
本開示の一部の実施形態は、実施形態Ｉのものである。
実施形態Ｉ－１。
一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－２。
操作されたバリアントが、配列番号４４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－１に記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－３。
操作されたバリアントが、シグナルポリペプチド、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合ドメイン、ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）ドメイン、または前述の組み合わせにおいて少なくとも一個のアミノ酸置換を含む、実施形態Ｉ－１またはＩ－２の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－４。
操作されたバリアントが、シグナルポリペプチドにおいて少なくとも一個のアミノ酸置換を含む、実施形態Ｉ－３の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－５。
操作されたバリアントが、ＦＡＤ結合ドメインにおいて少なくとも一個のアミノ酸置換を含む、実施形態Ｉ－３またはＩ－４の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－６。
操作されたバリアントが、ＢＢＥドメインにおいて少なくとも一個のアミノ酸置換を含む、実施形態Ｉ－３～Ｉ－５のいずれか一つの操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－７。
操作されたバリアントが、少なくとも一つの表面に露出したアミノ酸の置換を含む、実施形態Ｉ－３～Ｉ－６のいずれか一つの操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－８。
操作されたバリアントが、Ｒ３１、Ｐ４３、Ｐ４９、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ｈ５６、Ｌ５９、Ｍ６１、Ｓ６２、Ｌ７１、Ｓ１００、Ｖ１０３、Ｔ１０９、Ｑ１２４、Ｖ１２５、Ｌ１３２、Ｓ１３７、Ｈ１４３、Ｖ１４９、Ｗ１６１、Ｋ１６５、Ｎ１６８、Ｅ１６７、Ｓ１７０、Ｆ１７１、Ｐ１７２、Ｙ１７５、Ｇ１８０、Ｎ１９６、Ｈ２０８、Ｇ２３５、Ａ２５０、Ｉ２５７、Ｋ２６１、Ｌ２６９、Ｇ３１１、Ｆ３１７、Ｌ３２７、Ｋ３９０、Ｔ３７９、Ｓ４２９、Ｎ４６７、Ｙ５００、Ｎ５２８、Ｐ５３９、Ｐ５４２、Ｈ５４３、Ｈ５４４、およびＨ５４５からなる群から選択されるアミノ酸で、少なくとも一個のアミノ酸置換を含む、実施形態Ｉ－１またはＩ－２に記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－９。
本開示は操作されたバリアントを提供するものであり、この場合において当該操作されたバリアントは、Ｒ３１Ｑ、Ｐ４３Ｅ、Ｐ４９Ｅ、Ｐ４９Ｋ、Ｐ４９Ｑ、Ｋ５０Ｔ、Ｌ５１Ｉ、Ｑ５５Ｅ、Ｑ５５Ｐ、Ｈ５６Ｅ、Ｌ５９Ｅ、Ｍ６１Ｗ、Ｍ６１Ｈ、Ｍ６１Ｓ、Ｓ６２Ｑ、Ｌ７１Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｖ１０３Ｆ，Ｔ１０９Ｖ，Ｑ１２４Ｄ、Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１２４Ｎ、Ｖ１２５Ｅ、Ｖ１２５Ｑ、Ｌ１３２Ｍ、Ｓ１３７Ｇ、Ｈ１４３Ｄ、Ｖ１４９Ｉ、Ｗ１６１Ｒ、Ｗ１６１Ｙ、Ｗ１６１Ｋ、Ｋ１６５Ａ、Ｎ１６８Ｓ、Ｅ１６７Ｐ、Ｓ１７０Ｔ、Ｆ１７１Ｉ、Ｐ１７２Ｖ、Ｙ１７５Ｆ、Ｇ１８０Ａ、Ｎ１９６Ｑ、Ｎ１９６Ｖ、Ｈ２０８Ｔ、Ｇ２３５Ｐ、Ａ２５０Ｔ、Ｉ２５７Ｖ、Ｋ２６１Ｗ、Ｋ２６１Ｃ、Ｌ２６９Ｉ、Ｇ３１１Ａ、Ｇ３１１Ｃ、Ｆ３１７Ｙ、Ｌ３２７Ｉ、Ｋ３９０Ｅ、Ｔ３７９Ｓ、Ｓ４２９Ｌ、Ｎ４６７Ｄ、Ｙ５００Ｍ、Ｙ５００Ｖ、Ｎ５２８Ｅ、Ｐ５３９Ｔ、Ｐ５４２Ｅ、Ｐ５４２Ｖ、Ｈ５４３Ｖ、Ｈ５４４Ａ、Ｈ５４５Ｄ、およびＨ５４５Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を少なくとも一つ含む、実施形態Ｉ－８に記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－１０。
操作されたバリアントが、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、および配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－１またはＩ－２に記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－１１。
操作されたバリアントが、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－９のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－１２。
操作されたバリアントが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－９のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－１３。
操作されたバリアントが、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合ドメイン、ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）ドメイン、または前述の組み合わせにおいて、少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１２のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－１４。
操作されたバリアントが、ＦＡＤ結合ドメインにおいて、少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む、実施形態Ｉ－１３に記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－１５。
操作されたバリアントが、ＦＡＤ結合ドメインにおいて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５個の不変のアミノ酸を含む、実施形態Ｉ－１４に記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－１６。
操作されたバリアントが、ＢＢＥドメインにおいて、少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む、実施形態Ｉ－１３～Ｉ－１５のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－１７。
操作されたバリアントが、ＢＢＥドメインにおいて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５個の不変のアミノ酸を含む、実施形態Ｉ－１６に記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－１８。
操作されたバリアントが、Ａ２８、Ｆ３４、Ｌ３５、Ｃ３７、Ｌ６４、Ｎ７０、Ｐ８７、Ｉ９３、Ｃ９９、Ｒ１０８、Ｒ１１０、Ｇ１１２、Ｅ１１７、Ｇ１１８、Ｓ１２０、Ｐ１２６、Ｆ１２７、Ｄ１３１、Ｄ１４１、Ｗ１４８、Ｇ１５２、Ａ１５３、Ｌ１５５、Ｇ１５６、Ｅ１５７、Ｙ１５９、Ｙ１６０、Ｎ１６３、Ａ１７３、Ｇ１７４、Ｃ１７６、Ｐ１７７、Ｔ１７８、Ｖ１７９、Ｇ１８２、Ｇ１８３、Ｈ１８４、Ｆ１８５、Ｇ１８７、Ｇ１８８、Ｇ１８９、Ｙ１９０、Ｇ１９１、Ｐ１９２、Ｌ１９３、Ｒ１９５、Ａ２０１、Ｄ２０２、Ｉ２０５、Ｄ２０６、Ｖ２１０、Ｇ２１４、Ｇ２２３、Ｄ２２５、Ｌ２２６、Ｆ２２７、Ｗ２２８、Ｒ２３１、Ｇ２３４、Ｓ２３７、Ｆ２３８、Ｇ２３９、Ｋ２４５、Ｉ２４６、Ｌ２４８、Ｖ２５１、Ｖ２５９、Ｑ２７６、Ｆ３１２、Ｓ３１３、Ｌ３２３、Ｃ３４１、Ｆ３５２、Ｓ３５４、Ｆ３８０、Ｋ３８１、Ｉ３８２、Ｋ３８３、Ｄ３８５、Ｙ３８６、Ｉ３９１、Ｍ４１２、Ｌ４１５、Ｇ４１９、Ｍ４２２、Ｉ４２５、Ｉ４３０、Ｐ４３１、Ｐ４３３、Ｈ４３４、Ｒ４３５、Ｇ４３７、Ｙ４４０、Ｗ４４３、Ｙ４４４、Ｉ４４５、Ｉ４６４、Ｙ４６５、Ｍ４６８、Ｔ４６９、Ｙ４７１、Ｖ４７２、Ｐ４７６、Ｒ４８４、Ｎ４９８、Ａ５０２、Ｎ５１３、Ｆ５１４、Ｋ５２１、Ｎ５２８、Ｆ５２９、Ｅ５３３、Ｑ５３４、およびＳ５３５からなる群から選択される少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１７のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－１９。
操作されたバリアントが、Ｃ３７、Ｎ７０、Ｉ９３、Ｃ９９、Ｅ１１７、Ｓ１２０、Ｆ１２７、Ｄ１３１、Ｇ１５６、Ｅ１５７、Ｙ１５９、Ｇ１７４、Ｃ１７６、Ｇ１８２、Ｇ１８３、Ｆ１８５、Ｇ１８７、Ｇ１８８、Ｇ１８９、Ｙ１９０、Ｇ１９１、Ｐ１９２、Ｒ１９５、Ｄ２０２、Ｄ２０６、Ｇ２１４、Ｗ２２８、Ｇ２３４、Ｆ２３８、Ｌ２４８、Ｑ２７７、Ｓ３１４、Ｌ３２４、Ｓ３５５、Ｋ３８２、Ｋ３８４、Ｄ３８６、Ｇ４２０、Ｍ４２３、Ｒ４３６、Ｙ４４１、Ｗ４４４、Ｙ４４５、Ｙ４７２、Ｐ４７７、Ｎ５１４、Ｆ５１５、Ｎ５２９、およびＱ５３５からなる群から選択される少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む、実施形態Ｉ－１８に記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－２０。
操作されたバリアントが、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の不変のアミノ酸を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１９のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－２１。
同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、操作されたバリアントが、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２０のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－２２。
同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、操作されたバリアントが、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２１のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－２３。
同様の条件下、同じ長さの時間で配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによって生成されるものと比較して、操作されたバリアントが、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率で、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２２のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－２４。
約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、操作されたバリアントが、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２３のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－２５。
操作されたバリアントが、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方に切断を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２４のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－２６。
切断された、操作されたバリアントが、シグナルポリペプチドまたは膜アンカーを含む、実施形態Ｉ－２５に記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－２７。
操作されたバリアントが、天然のシグナルポリペプチドを欠く、実施形態Ｉ－２５またはＩ－２６に記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－２８。
操作されたバリアントが、Ｃ末端で、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個のアミノ酸の切断を含む、実施形態Ｉ－２５～Ｉ－２７のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－２９。
操作されたバリアントが、Ｃ末端で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸の切断を含む、実施形態Ｉ－２５～Ｉ－２７のいずれか一つに記載の操作されたバリアント。
実施形態Ｉ－３０。
実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
実施形態Ｉ－３１。
一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、当該ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、および配列番号１８５からなる群から選択される、核酸。
実施形態Ｉ－３２。
ヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、実施形態Ｉ－３０またはＩ－３１に記載の核酸。
実施形態Ｉ－３３。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法であって、実施形態Ｉ－３０～Ｉ－３２のいずれか一つに記載の一つまたは複数の核酸を、宿主細胞に導入することを含む、方法。
実施形態Ｉ－３４。
実施形態Ｉ－３０～Ｉ－３２のいずれか一つに記載の一つまたは複数の核酸を含む、ベクター。
実施形態Ｉ－３５。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法であって、実施形態Ｉ－３４に記載の一つまたは複数のベクターを宿主細胞に導入することを含む、方法。
実施形態Ｉ－３６。
改変された宿主細胞が、実施形態Ｉ－３０～Ｉ－３２のいずれか一つに記載の一つまたは複数の核酸を含む、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－３７。
改変された宿主細胞が、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－３８。
ＧＯＴポリペプチドが、配列番号１７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－３７に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－３９。
改変された宿主細胞が、ＧＯＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３７またはＩ－３８に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－４０。
改変された宿主細胞が、ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－４１。
ＮｐｈＢポリペプチドが、配列番号１８８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－４０に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－４２。
改変された宿主細胞が、テトラケチド合成酵素（ＴＫＳ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびオリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－４１のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－４３。
ＴＫＳポリペプチドが、配列番号１９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－４２に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－４４。
改変された宿主細胞が、ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む三つ以上の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－４２またはＩ－４３に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－４５。
ＯＡＣポリペプチドが、配列番号２１または配列番号４８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－４２～Ｉ－４４のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－４６。
改変された宿主細胞が、ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む三つ以上の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－４２～Ｉ－４５のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－４７。
改変された宿主細胞が、アシル活性化酵素（ＡＡＥ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－４６のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－４８。
ＡＡＥポリペプチドが、配列番号２３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－４７に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－４９。
改変された宿主細胞が、ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－４７またはＩ－４８に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－５０。
改変された宿主細胞が、以下：ａ）ＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧＳ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｂ）切断された３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル－ＣｏＡ還元酵素（ｔＨＭＧＲ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｃ）メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｄ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｅ）メバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素（ＭＶＤ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；またはｆ）イソペンテニル二リン酸異性化酵素（ＩＤＩ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、のうちの一つまたは複数を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－４９のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－５１。
ＩＤＩ１ポリペプチドが、配列番号２５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－５０に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－５２。
ｔＨＭＧＲポリペプチドが、配列番号２７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－５０またはＩ－５１に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－５３。
ＨＭＧＳポリペプチドが、配列番号２９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－５０～Ｉ－５２のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－５４。
ＭＫポリペプチドが、配列番号３９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－５０～Ｉ－５３のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－５５。
ＰＭＫポリペプチドが、配列番号３７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－５０～Ｉ－５４のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－５６。
ＭＶＤ１ポリペプチドが、配列番号３３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－５０～Ｉ－５５のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－５７。
改変された宿主細胞が、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－５６のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－５８。
アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドが、配列番号３１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－５７に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－５９。
改変された宿主細胞が、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－５８のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－６０。
ＰＤＣポリペプチドが、配列番号３５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－５９に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－６１。
改変された宿主細胞が、ゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－６０のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－６２。
ＧＰＰＳポリペプチドが、配列番号４１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－６１に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－６３。
改変された宿主細胞が、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－６２のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－６４。
ＫＡＲ２ポリペプチドが、配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－６３に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－６５。
改変された宿主細胞が、ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－６３またはＩ－６４に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－６６。
改変された宿主細胞が、ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－６５のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－６７。
ＰＤＩ１ポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－６６に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－６８。
改変された宿主細胞が、ＩＲＥ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－６７のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－６９。
ＩＲＥ１ポリペプチドが、配列番号１１または配列番号１９０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－６８に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－７０。
改変された宿主細胞が、ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－６９のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－７１。
ＥＲＯ１ポリペプチドが、配列番号７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－７０に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－７２。
改変された宿主細胞が、ＦＡＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－７１のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－７３。
ＦＡＤ１ポリペプチドが、配列番号１９２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－７２に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－７４。
改変された宿主細胞が、ＰＥＰ４ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－７３のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－７５。
ＰＥＰ４ポリペプチドが、配列番号１５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－７４に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－７６。
改変された宿主細胞が、ＲＯＴ２ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－７５のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－７７。
ＲＯＴ２ポリペプチドが、配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－７６に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－７８。
改変された宿主細胞が、真核細胞である、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－７７のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－７９。
真核細胞が、酵母細胞である、実施形態Ｉ－７８に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－８０。
酵母細胞が、サッカロマイセス・セレビシエである、実施形態Ｉ－７９に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－８１。
サッカロマイセス・セレビシエが、サッカロマイセス・セレビシエのタンパク質分解酵素欠損株である、実施形態Ｉ－８０に記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－８２。
一つまたは複数の核酸のうちの少なくとも一つが、改変された宿主細胞の染色体に組み込まれる、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－８１のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－８３。
一つまたは複数の核酸のうちの少なくとも一つが、染色体外で維持される、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－８１のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－８４。
一つまたは複数の核酸のうちの少なくとも一つが、誘導性プロモーターに動作可能に連結される、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－８３のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－８５。
一つまたは複数の核酸のうちの少なくとも一つが、構造性プロモーターに動作可能に連結される、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－８３のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－８６。
改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－８５のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－８７。
改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）でカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－８６のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－８８。
改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率と比較して、より速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－８７のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－８９。
改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－８８のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－９０。
改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞により生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率で、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－８９のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－９１。
約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、改変された宿主細胞が、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－９０のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞。
実施形態Ｉ－９２。
ａ）実施形態Ｉ－３６～Ｉ－９１のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞を培地において培養することを含む、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法。
実施形態Ｉ－９３。
方法が、ｂ）生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を回収すること、を含む、実施形態Ｉ－９２に記載の方法。
実施形態Ｉ－９４。
培地が、カルボン酸を含む、実施形態Ｉ－９２またはＩ－９３に記載の方法。
実施形態Ｉ－９５。
カルボン酸が、置換されていないか、または置換されたＣ３－Ｃ１８カルボン酸である、実施形態Ｉ－９４に記載の方法。
実施形態Ｉ－９６。
置換されていないか、または置換されたＣ３－Ｃ１８カルボン酸が、置換されていないか、または置換されたヘキサン酸である、実施形態Ｉ－９５に記載の方法。
実施形態Ｉ－９７。
培地が、オリベトール酸またはオリベトール酸誘導体を含む、実施形態Ｉ－９２またはＩ－９３に記載の方法。
実施形態Ｉ－９８。
カンナビノイドが、テトラヒドロカンナビノール酸、テトラヒドロカンナビバリン酸、またはテトラヒドロカンナビバリンである、実施形態Ｉ－９２またはＩ－９３に記載の方法。
実施形態Ｉ－９９。
培地が、発酵性糖を含む、実施形態Ｉ－９２～Ｉ－９８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１００。
培地が、前処理されたセルロース供給原料を含む、実施形態Ｉ－９２～Ｉ－９８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１０１。
培地が、非発酵性炭素源を含む、実施形態Ｉ－９２～Ｉ－９８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１０２。
非発酵性炭素源が、エタノールを含む、実施形態Ｉ－１０１に記載の方法。
実施形態Ｉ－１０３。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体が、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される、実施形態Ｉ－９２～Ｉ－１０２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１０４。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、実施形態Ｉ－３４～Ｉ－８９のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞の代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を培養することを含む方法で生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）よりも、多い量で生成され、この場合において、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠き、ならびにこの場合において、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－９１のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で培養される、実施形態Ｉ－９２～Ｉ－１０３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１０５。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－９１のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞の代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を培養することを含む方法で生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成され、この場合において、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠き、ならびにこの場合において、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－９１のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で培養される実施形態Ｉ－９２～Ｉ－１０４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１０６。
カンナビノイドは、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）であり、およびこの場合において、当該方法は、実施形態Ｉ－３６～Ｉ－９１のいずれか一つに記載の改変された宿主細胞の代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を培養することを含む方法において生成される場合と比較して、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率でＴＨＣＡを生成し、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、実施形態Ｉ－９２～Ｉ－１０５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１０７。
約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、当該方法は、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する、実施形態Ｉ－９２～Ｉ－１０６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１０８。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法であって、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントの使用を含む、方法。
実施形態Ｉ－１０９。
方法が、生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を回収することを含む、実施形態Ｉ－１０８に記載の方法。
実施形態Ｉ－１１０。
カンナビノイドが、テトラヒドロカンナビノール酸、テトラヒドロカンナビバリン酸、またはテトラヒドロカンナビバリンである、実施形態Ｉ－１０８またはＩ－１０９に記載の方法。
実施形態Ｉ－１１１。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの使用を含む方法で生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量よりも、多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成され、この場合において実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアント、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される、実施形態Ｉ－１０８～Ｉ－１１０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１１２。
カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの使用を含む方法で生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％高い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成され、この場合において実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアント、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される、実施形態Ｉ－１０８～Ｉ－１１１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１１３。
カンナビノイドは、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）であり、この場合において当該方法は、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの使用を含む方法で生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率でＴＨＣＡを生成し、この場合において実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアント、および配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される、実施形態Ｉ－１０８～Ｉ－１１２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１１４。
約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、当該方法は、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する、実施形態Ｉ－１０８～Ｉ－１１３いずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１１５。
一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをスクリーニングする方法であって、ａ）宿主細胞の集団を、対照集団と試験集団に分けること；ｂ）対照集団において、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドと、比較テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドを共発現させることであって、当該配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドは、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を第一のカンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）に変換することができ、比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、同じＣＢＧＡを異なる第二のカンナビノイドに変換することができること；ｃ）試験集団において、操作されたバリアントと比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドを共発現させることであって、当該操作されたバリアントは、ＣＢＧＡを、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドと同じ第一のカンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）に変換することができ、この場合において当該比較テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同じＣＢＧＡを第二のカンナビノイドに変換することができ、そして試験集団および対照集団において、同様のレベルで発現されること；ｄ）試験集団と対照集団の両方により生成される、第二のカンナビノイドに対する第一のカンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）の比率を測定すること；およびｅ）試験集団と対照集団の両方により生成される、第一のカンナビノイドの量（ｍｇ／ＬまたはｍＭ）を測定すること、を含む、方法。
実施形態Ｉ－１１６。
配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドと比較して、改善されたインビボ性能を有する操作されたバリアントを含む試験集団が特定され、この場合において改善されたインビボ性能は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で対照集団によって生成されるものと比較して、試験集団によって生成される第二のカンナビノイドに対する第一のカンナビノイドの比率が高いことによって示される、実施形態Ｉ－１１５に記載の方法。
実施形態Ｉ－１１７。
同様の培養条件下、同じ長さの時間で対照集団によって生成される量と比較して、試験集団によってより多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で第一のカンナビノイドを生成することによって、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドと比較して改善されたインビボ性能を有する操作されたバリアントを含む試験集団が特定される、実施形態Ｉ－１１５またはＩ－１１６に記載の方法。
実施形態Ｉ－１１８。
カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、カンナビジオール酸合成酵素ポリペプチドである、実施形態Ｉ－１１５～Ｉ－１１７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１１９。
カンナビジオール酸合成酵素ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ｉ－１１８に記載の方法。
実施形態Ｉ－１２０。
第二のカンナビノイドが、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）である、実施形態Ｉ－１１５～Ｉ－１１９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１２１。
操作されたバリアントが、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２９のいずれか一つに記載の操作されたバリアントである、実施形態Ｉ－１１５～Ｉ－１１９のいずれか一つに記載の方法。
本明細書において開示されるアミノ酸およびヌクレオチド配列が、表１において提供される。属および／または種が示される場合、配列は、特定される属および／または種のみに限定されると解釈されるべきではなく、当該配列を発現する他の属および／または種も含むべきである。表１に開示される配列のオルソログも、本開示に包含され得る。表１に最適化されたコドンとして示されるヌクレオチド配列は、サッカロミセス・セレビシエにおける発現に最適化されたコドンである。表１において、配列の末端として使用される「＊」は、停止コドンを示す。ＯＡＣ＊への言及において、「＊」は、変異が配列に存在することを示す。
（表１）本開示のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列
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以下の実施例は、当業者に、本開示の作製方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するために提示されており、発明者がその開示とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験がすべてであり、または実施された実験のみであることを表すことを意図していない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するために努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差が、考慮に入れられるべきである。別段示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏であり、圧力は、大気圧またはその付近である。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対、ｋｂ、キロ塩基、ｓまたはｓｅｃ、秒、分、時間、時間、ａａ、アミノ酸、ｂｐ、塩基対、ｎｔ、ヌクレオチドなどを使用してもよい。
ＴＨＣＡＳの変異、構築、および形質転換
本明細書に記載されるＴＨＣＡＳの変異は、以前に実施されたＣＢＤＡＳ酵素の飽和変異誘導に基づいて構築された。２０１９年５月２２日に出願された米国特許出願第６２／８５１，５６０号を参照のこと。当該出願の内容は、その全体で全ての目的に対し、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＢＤＡＳを改善した選択変異をＴＨＣＡＳコンストラクトに移植し、ＯＡからＣＢＧＡを産生する株で試験した。表２は、酵素に関する、複数の別個の組み込み（すべての遺伝子型に対し、ｎ＞１０）の性能を表すデータを示す。ここでの対照株であるＤ４８８は、野生型ＴＨＣＡＳを含有し、予測レベルの性能であった。成績結果を表２および３に示す。
競合アッセイ株
試験されたこの１０個の変異の初期セットでは、全ての変異ではないが、力価の増加をもたらした。このことから、ＣＢＤＡＳとＴＨＣＡＳの変異の間に、１：１の関係性がないことが示唆される。ＣＢＤＡＳのいくつかの有益な変異は、ＴＨＣＡＳ酵素にもよく似た利益をもたらす。ＴＨＣＡ力価における、なんらかの改善の程度は驚くほど大きく、ＣＢＤＡＳで観察されたものを上回っている。例えば、ＴＨＣＡＳでのＦ３７１Ｙ変異は、約８１％の力価上昇をもたらし、一方でＣＢＤＡＳでの構造的に同等のＦ３１６Ｙ変異は、４３％の力価上昇のみであった。
（表２）ＴＨＣＡＳ変異。すべての株は、ｎ＝３以上でアッセイされた。ＮＡ＝該当なし、ＮＤ＝未実施。
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Figure 2022548904000079
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酵母形質転換法
本明細書に開示される一つまたは複数の異種核酸を含む各ＤＮＡコンストラクト（例えば、表４に詳述されるコンストラクト）は、最適化酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）形質転換法において標準的な分子生物学技術を用いてサッカロマイセス・セレビシエ（ＣＥＮ．ＰＫ２、Ｓ４株）に組み込まれた。簡潔に述べると、細胞を、酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地中で一晩、振とうしながら（２００ｒｐｍ）３０℃で増殖させ、ＹＰＤ中で０．１７５のＯＤ６００に希釈し、そして０．６～０．８のＯＤ６００に増殖させた。形質転換は、１ウェル当たり１．６７ｍＬの培養物を使用して、９６ウェルプレート形式で実施した。全培養物体積を遠心分離により回収し、等量の滅菌水で洗浄して再度スピンダウンさせ、等量の１００ｍＭ ＬｉＡｃ中で洗浄した。再度細胞をスピンダウンし、上清を取り除いて、そして細胞を、８０μＬ ５０％ ＰＥＧ、１２μＬ １Ｍ ＬｉＡｃ、３．３μＬ煮沸鮭精子ＤＮＡ、５μＬのＰＣＲ増幅ライブラリＤＮＡ、および１９．７μＬの水（形質転換の回数により増減）からなる形質転換ミックス中に再懸濁させた。４２℃で４０分間の熱ショック後、細胞を、ＹＰＤ培地において一晩回収し、その後、選択培地でプレーティングした。ＤＮＡ組込みを、コロニー試料についての組込みに特異的なプライマーを用いたコロニーＰＣＲによって確認し、高い率の組込みを確認した。
酵母培養条件
改変した宿主細胞である、本明細書において開示するライブラリーコンストラクト核酸を含む酵母コロニーを、ＹＰＤ（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏペプトン、２０ｇ／Ｌデキストロース（グルコース））３６０μＬを含有する９６ウェルマイクロタイタープレートに拾い上げ、通気性フィルムシールで封止した。培養物が炭素枯渇に達するまで、細胞を、３０℃、大容量マイクロタイタープレートインキュベーターにおいて、１０００ｒｐｍで振とうしながら、８０％湿度で、２日間培養した（「前培養」と称する）。成長飽和培養物を、飽和培養物から１５μＬを取り出し、新鮮培地３６０μＬに希釈することによって、ＹＰＧＡＬおよびオリベトール酸もしくはヘキサン酸のいずれか、またはオリベトール酸誘導体もしくはヘキサン酸以外のカルボン酸（１０ｇ／Ｌ酵母抽出液、２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏペプトン、２０もしくは４０ｇ／Ｌガラクトース、１ｇ／Ｌグルコースおよび、１ｍＭオリベトール酸もしくは２ｍＭヘキサン酸のいずれか、または１ｍＭオリベトール酸誘導体もしくは２ｍＭヘキサン酸以外のカルボン酸）を含有する新鮮プレートに継代し、通気性フィルムシールで封止した。生成培地における改変した宿主細胞を、３０℃、高容量マイクロタイタープレート振とう器において、１０００ｒｐｍおよび８０％湿度で、抽出および解析前にさらに５日間培養した。完了時に、全細胞ブロス２５μＬを、メタノール９７５μＬに希釈し、ホイルシールで封止し、１２００ｒｐｍで６０秒間振とうして、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を抽出した。振とう後、プレートを１０００×ｇで６０秒間遠心分離して、任意の固体を除去した。遠心分離後、シールを除去し、上清１０μＬを、メタノール２４０μＬを含有する新鮮アッセイプレートに移し、ホイルシールで封止し、９００ｒｐｍで６０秒間振とうし、ＬＣ－ＭＳにより分析した。
分析方法
試料を、以下の勾配を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘフェニル－ヘキシル２．１×３０ｍｍ、２．６μｍの分析カラムを使用して、ＬＣ－ＭＳ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ ６４７０）により分析した（移動相Ａ：０．１％ギ酸を含むＬＣ－ＭＳグレード水；移動相Ｂ：０．１％ギ酸を含むＬＣ－ＭＳグレードアセトニトリル）：
Figure 2022548904000081
質量分析計を、陰イオン多重反応モニタリングモードで操作した。それぞれのカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を、真正の標準から決定した保持時間、および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）転移により同定した：
Figure 2022548904000082
回収および精製
本開示の改変された宿主細胞を含む培養物由来の細胞ブロス全体を、適当な有機溶媒を用いて抽出して、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を得る。適当な有機溶媒としては、ヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、石油エーテル、ならびにジ－エチルエーテル、クロロホルム、および酢酸エチルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘキサンなどの適当な有機溶媒を、１０：１の比（有機溶媒１重量部に、細胞ブロス全体１０重量部）で、本開示の改変された宿主細胞を含む発酵由来の細胞ブロス全体に加え、３０分間撹拌する。有機画分を分離し、等体積の酸性水（ｐＨ２．５）で２回抽出する。次いで、有機層を分離し、濃縮器（減圧下での回転蒸発器または薄膜蒸発器）において乾燥させて、粗カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体結晶を得る。次いで、粗結晶を、１０５℃まで１５分間加熱し、続いて、１４５℃で５５分間加熱して、粗カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を脱炭酸してもよい。粗結晶性生成物を、適当な溶媒（例えば、ｎ－ペンタン）において再溶解し、再結晶化し、１μｍのフィルターを通して濾過して、任意の不溶性物質を除去する。次いで、溶媒を、例えば、回転蒸発によって除去して、純粋な結晶性生成物を生成する。
インビトロ酵素アッセイおよびカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の無細胞生成
一部の実施形態では、改変した宿主細胞、例えば、改変した酵母細胞を、ＹＰＤ（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏペプトン、２０ｇ／Ｌデキストロース（グルコース））３６０μＬを含有する９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて培養し、通気性フィルムシールで封止した。次いで、培養物が炭素枯渇に達するまで、細胞を、３０℃、大容量マイクロタイタープレートインキュベーターにおいて、１０００ｒｐｍで振とうしながら、８０％湿度で、３日間培養する。次いで、成長飽和培養物を、ＹＰＧＡＬ培地２００ｍＬ中、ＯＤ６００ ０．２まで継代し、３０℃で２０時間振とうしながらインキュベートする。次いで、細胞を、４℃で５分間、３０００×ｇで遠心分離することによって回収する。次いで、回収した細胞を、緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．４、ベンゾナーゼ１２５単位）５０ｍＬに再懸濁し、次いで、溶解する（Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３、Ａｖｅｓｔｉｎ，ＩＮＣ．、６０ｂａｒ、１０分）。細胞の破片を、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分、４℃）により除去する。その後、上清を超遠心分離（１５０，０００×ｇ、１時間、４℃、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌ－９０Ｋ、ＴＩ－７０）に供する。次いで、得られた膜画分を、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０、１０％グリセロール）３．３ｍにおいて再懸濁し、組織グラインダーで可溶化する。次いで、０．０２％（ｖ／ｖ）のそれぞれの膜調製物を、反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．５）および基質（５００μＭオピレント酸、５００μＭ ＧＰＰ）において、総体積５０ｍＬまで溶解し、３０℃で１時間インキュベートする。次いで、２種の反応体積の酢酸エチルを加え、続いて、ボルテックスし、遠心分離することによってアッセイ物を抽出する。有機層を３０分間蒸発させ、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／ギ酸（８０：２０：０．０５％）において再懸濁し、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）－ＭＣカラム（０．２２μｍの孔径、ＰＶＤＦ膜材料）で濾過する。次いで、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を、ＬＣ－ＭＳを介して検出し、および／または回収し、精製する。
バイオリアクターにおける酵母培養
本明細書において開示する改変した宿主細胞を含む単一の酵母コロニーを、５０ｍＭコハク酸塩（ｐＨ５．０）および２％グルコースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎ ｅｔ ａｌ，Ｙｅｓｔ ８（７）：５０１－１７によって最初に記載された）１５ｍＬにおいて、１２５ｍＬフラスコ中、３０℃で、２００ｒｐｍで振とうしながら、ＯＤ６００ ４～９まで成長させる。次いで、グリセロールを２０％の濃度まで培養物に加え、１ｍＬのバイアルの改変した宿主細胞懸濁液のバイアルを、－８０℃で保存する。１～２個のバイアルの改変した宿主細胞を解凍し、５０ｍＭコハク酸塩（ｐＨ５．０）および４％スクロースを含むＶｅｒｄｕｙｎ培地において２４時間増殖させ、次いで、同じ培地においてＯＤ６００ ０．１読み取り値まで継代した。振とうしながら３０℃で２４時間成長させた後、培養物６５ｍＬを使用して、ヘキサン酸（２ｍＭ）、ヘキサン酸（２ｍＭ）以外のカルボン酸、オリベトール酸（１ｍＭ）、またはオリベトール酸誘導体（１ｍＭ）を添加した２０ｇ／Ｌガラクトースを含有するＶｅｒｄｕｙｎ発酵培地５８５ｍＬと共に、１．３リットルの発酵槽（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＡＳＧＩＰ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）に接種する。ポリ－アルファ－オレフィンを、抽出剤として発酵槽に加えてもよい。発酵槽を、ＮＨ４ＯＨを加えて、３０℃およびｐＨ５．０で維持する。初期バッチ相では、発酵槽を、１分当たり０．５体積のエア（ＶＶＭ）で通気し、撹拌は、３０％溶解酸素を維持するように傾斜させる。初期糖を消費した後、溶解酸素の上昇により、ガラクトース＋ヘキサン酸（１リットル当たりガラクトース８００ｇ＋１リットル当たりヘキサン酸９．２８ｇ）の供給を、１回の投与当たり１リットル当たりガラクトース１０ｇのパルスで、１時間当たり１リットル当たりガラクトース１０ｇで誘発する（あるいは、ヘキサン酸、オリベトール酸、オリベトール酸誘導体、またはヘキサン酸以外のカルボン酸を、改変した宿主細胞に与える）。
パルス間では、供給速度を、１時間当たり１リットル当たりガラクトース５ｇまで低下させる。溶解酸素が１０％上昇すると、供給速度を、１０ｇＬ－１／時間－１で再開する。改変した宿主細胞密度が増加すると、溶解した酸素は、０％に到達し、パルス量は、１リットル当たりガラコース５０ｇに増大させる。酸素移動速度を、体積が増加するにつれて撹拌を調節することによって、１時間当たり１リットル当たり１００ｍＭのフルスケール条件を表す速度で維持する。供給速度を動的に調整して、高い供給速度と低い供給速度間を代替するアルゴリズムを使用して、需要を満たす。低い供給速度の間、改変した宿主細胞は、ガラクトースおよびヘキサン酸、または代替的に、オリベトール酸、オリベトール酸誘導体、もしくはヘキサン酸以外のカルボン酸、ならびに高供給速度中に蓄積した任意のオーバーフロー代謝産物を消費するべきである。溶解した酸素の上昇は、高い供給速度を再開させる。低い供給速度に費やす時間の長さは、改変した宿主細胞が、以前の高い供給速度パルスで過剰供給または低供給される程度を反映し、次いで、この情報をモニターし、高い供給速度を上または下に調整するために使用し、低い供給速度を定義した範囲内で維持する。
経時的に、供給速度は、改変した宿主細胞からの需要に合致する、糖およびヘキサン酸、または代替的に、オリベトール酸、オリベトール酸誘導体、もしくはヘキサン酸以外のカルボン酸と一致する。このアルゴリズムは、カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体；バイオマス；およびＣＯ２以外の発酵生成物の正味の蓄積を最小限にする。一部の実施形態では、プロセスは、５～１４日間継続する。ある特定のこのような実施形態では、蓄積したブロスを、毎日取り出し、バイオマスおよびカンナビノイド、またはカンナビノイド誘導体濃度についてアッセイする。ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４の濃縮溶液、微量金属、およびビタミンを定期的に添加し、定常状態濃度を維持する。
（表４）実施例で使用したコンストラクトおよび株
Figure 2022548904000083
Figure 2022548904000084
Figure 2022548904000085
* 株が親株を有する場合、それは子株である。親株に存在するコンストラクトのすべてがまた、子株に存在する。
** S4は、遺伝子型MATalpha；URA3；TRP1；LEU2；HIS3；MAL2-8C；SUC2を有するCEN.PK113-1Aである。
*** S487は、THCA合成酵素コンストラクトを試験するために使用された基本株である。この株では、pGAL1_tTDH1の空の発現カセットをコードするヌクレオチド配列が加えられており、i33座位は、そこでCBDASコンストラクトを削除することによってその本来の配列へと戻る。
（表５）制御エレメントおよび他のエレメントのリスト
Figure 2022548904000086
Figure 2022548904000087
Figure 2022548904000088
Figure 2022548904000089
Figure 2022548904000090
Figure 2022548904000091
Figure 2022548904000092
Figure 2022548904000093
Figure 2022548904000094
Figure 2022548904000095
表５ 説明文：図において言及される非コードＤＮＡ領域（制御領域およびその他）を表５に列挙する。隣接相同領域は、特定のゲノム座位での組み換えを指示する。隣接相同上流配列を、「ｕ」で示し、下流を「ｄ’」で示す。「Ｉ」は、遺伝子間組込み部位、例えば、ｕｉ７、ｄｉ７が、遺伝子間領域７に隣接する領域であることを示す。オープンリーディングフレームを欠失させる組込みは、示した欠失した遺伝子との隣接相同性を有し、例えば、ｕＰＥＰ４、ｄＰＥＰ４は、ＰＥＰ４遺伝子に隣接する領域である。合成組み換え配列（ＳＲＳ）は、同じ座位での組込みを標的とした二つのＤＮＡコンストラクトの内部組み換えを指示する。リンカーは、ＤＮＡコンストラクトを組み立てる際に使用する短い配列であり、これらは、示した部分の間に介在している。リンカーＧ１、Ｇ７、Ｇ１０、ＲＧ１、およびＬＴＴＤＨ１は、上流のＤＮＡ部分の最後の３６ｂｐを含有し、これらのリンカーを使用する場合、リンカーは、上流部分から省略した配列を再構成して、下流部分とのシームレスな接合部を形成すると想定する。リンカーＤ０およびＤ９は、ＤＮＡコンストラクトのクローニングベクターへの進入を指示する末端リンカーであり、ゲノムに組み込まれない。リンカーを、部分間に示さない場合、接合部もシームレスである。
本開示は、その特定の実施形態を参照して記載されたが、様々な変更がなされてもよく、均等物が、本開示の真の趣旨および範囲から逸脱することなく置換されてもよいことを当業者は理解すべきである。加えて、本開示の目的、趣旨および範囲に特定の状況、材料、物質組成、プロセス、プロセス工程または複数の工程を適合させるために、多くの修正がなされてもよい。すべてのこのような修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であることが意図されている。

Claims (121)

  1. 一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む、テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアント。
  2. 配列番号４４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の操作されたバリアント。
  3. シグナルポリペプチド、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合ドメイン、ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）ドメイン、または前述の組み合わせにおいて少なくとも一個のアミノ酸置換を含む、請求項１または２に記載の操作されたバリアント。
  4. 前記シグナルポリペプチドにおいて少なくとも一個のアミノ酸置換を含む、請求項３に記載の操作されたバリアント。
  5. 前記ＦＡＤ結合ドメインにおいて少なくとも一個のアミノ酸置換を含む、請求項３または４に記載の操作されたバリアント。
  6. 前記ＢＢＥドメインにおいて少なくとも一個のアミノ酸置換を含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  7. 少なくとも一つの表面に露出したアミノ酸の置換を含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  8. Ｌ１３２、Ｓ１７０、Ｆ１７１、Ｎ１９６、Ｋ２６１、Ｌ２６９、Ｆ３１７、Ｐ５３９、Ｒ３１、Ｐ４３、Ｐ４９、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ｈ５６、Ｌ５９、Ｍ６１、Ｓ６２、Ｌ７１、Ｓ１００、Ｖ１０３、Ｔ１０９、Ｑ１２４、Ｖ１２５、Ｌ１３２、Ｓ１３７、Ｈ１４３、Ｖ１４９、Ｗ１６１、Ｋ１６５、Ｅ１６７、Ｎ１６８、Ｓ１７０、Ｆ１７１、Ｐ１７２、Ｙ１７５、Ｇ１８０、Ｎ１９６、Ｈ２０８、Ｇ２３５、Ａ２５０、Ｉ２５７、Ｋ２６１、Ｌ２６９、Ｇ３１１、Ｆ３１７、Ｌ３２７、Ｔ３７９、Ｋ３９０、Ｓ４２９、Ｎ４６７、Ｙ５００、Ｎ５２８、Ｐ５３９、Ｐ５４２、Ｈ５４３、Ｈ５４４、およびＨ５４５からなる群から選択されるアミノ酸で少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、請求項１または２に記載の操作されたバリアント。
  9. Ｌ１３２Ｍ、Ｓ１７０Ｔ、Ｆ１７１Ｉ、Ｎ１９６Ｔ、Ｎ１９６Ｑ、Ｎ１９６Ｖ、Ｋ２６１Ｃ、Ｌ２６９Ｉ、Ｆ３１７Ｙ、Ｐ５３９Ｔ、Ｒ３１Ｑ、Ｐ４３Ｅ、Ｐ４９Ｅ、Ｐ４９Ｋ、Ｐ４９Ｑ、Ｋ５０Ｔ、Ｌ５１Ｉ、Ｑ５５Ｅ、Ｑ５５Ｐ、Ｈ５６Ｅ、Ｌ５９Ｅ、Ｍ６１Ｈ、Ｍ６１Ｓ、Ｍ６１Ｗ、Ｓ６２Ｑ、Ｌ７１Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｖ１０３Ｆ、Ｔ１０９Ｖ、Ｑ１２４Ｄ、Ｑ１２４Ｅ、Ｑ１２４Ｎ、Ｖ１２５Ｅ、Ｖ１２５Ｑ、Ｓ１３７Ｇ、Ｈ１４３Ｄ、Ｖ１４９Ｉ、Ｗ１６１Ｋ、Ｗ１６１Ｒ、Ｗ１６１Ｙ、Ｋ１６５Ａ、Ｅ１６７Ｐ、Ｎ１６８Ｓ、Ｐ１７２Ｖ、Ｙ１７５Ｆ、Ｇ１８０Ａ、Ｈ２０８Ｔ、Ｇ２３５Ｐ、Ａ２５０Ｔ、Ｉ２５７Ｖ、Ｋ２６１Ｗ、Ｇ３１１Ａ、Ｇ３１１Ｃ、Ｌ３２７Ｉ、Ｔ３７９Ｓ、Ｋ３９０Ｅ、Ｓ４２９Ｌ、Ｎ４６７Ｄ、Ｑ４７５Ｓ、Ｙ５００Ｍ、Ｙ５００Ｖ、Ｎ５２８Ｅ、Ｐ５４２Ｅ、Ｐ５４２Ｖ、Ｈ５４３Ｖ、Ｈ５４４Ａ、Ｈ５４４Ｅ、Ｈ５４５Ｄ、およびＨ５４５Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を少なくとも一つ含む、請求項８に記載の操作されたバリアント。
  10. 配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、および配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の操作されたバリアント。
  11. 少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  12. １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  13. フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合ドメイン、ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）ドメイン、または前述の組み合わせにおいて、少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  14. 前記ＦＡＤ結合ドメインにおいて、少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む、請求項１３に記載の操作されたバリアント。
  15. 前記ＦＡＤ結合ドメインにおいて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５個の不変のアミノ酸を含む、請求項１４に記載の操作されたバリアント。
  16. 前記ＢＢＥドメインにおいて、少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  17. 前記ＢＢＥドメインにおいて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５個の不変のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の操作されたバリアント。
  18. Ａ２８、Ｆ３４、Ｌ３５、Ｃ３７、Ｌ６４、Ｎ７０、Ｐ８７、Ｉ９３、Ｃ９９、Ｒ１０８、Ｒ１１０、Ｇ１１２、Ｅ１１７、Ｇ１１８、Ｓ１２０、Ｐ１２６、Ｆ１２７、Ｄ１３１、Ｄ１４１、Ｗ１４８、Ｇ１５２、Ａ１５３、Ｌ１５５、Ｇ１５６、Ｅ１５７、Ｙ１５９、Ｙ１６０、Ｎ１６３、Ａ１７３、Ｇ１７４、Ｃ１７６、Ｐ１７７、Ｔ１７８、Ｖ１７９、Ｇ１８２、Ｇ１８３、Ｈ１８４、Ｆ１８５、Ｇ１８７、Ｇ１８８、Ｇ１８９、Ｙ１９０、Ｇ１９１、Ｐ１９２、Ｌ１９３、Ｒ１９５、Ａ２０１、Ｄ２０２、Ｉ２０５、Ｄ２０６、Ｖ２１０、Ｇ２１４、Ｇ２２３、Ｄ２２５、Ｌ２２６、Ｆ２２７、Ｗ２２８、Ｒ２３１、Ｇ２３４、Ｓ２３７、Ｆ２３８、Ｇ２３９、Ｋ２４５、Ｉ２４６、Ｌ２４８、Ｖ２５１、Ｖ２６０、Ｑ２７７、Ｆ３１３、Ｓ３１４、Ｌ３２４、Ｃ３４２、Ｆ３５３、Ｓ３５５、Ｆ３８１、Ｋ３８２、Ｉ３８３、Ｋ３８４、Ｄ３８６、Ｙ３８７、Ｉ３９２、Ｍ４１３、Ｌ４１６、Ｇ４２０、Ｍ４２３、Ｉ４２６、Ｉ４３１、Ｐ４３２、Ｐ４３４、Ｈ４３５、Ｒ４３６、Ｇ４３８、Ｙ４４１、Ｗ４４４、Ｙ４４５、Ｉ４４６、Ｉ４６５、Ｙ４６６、Ｍ４６９、Ｔ４７０、Ｙ４７２、Ｖ４７３、Ｐ４７７、Ｒ４８５、Ｎ４９９、Ａ５０３、Ｎ５１４、Ｆ５１５、Ｋ５２２、Ｎ５２９、Ｆ５３０、Ｅ５３４、Ｑ５３５、およびＳ５３６からなる群から選択される少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  19. Ｃ３７、Ｎ７０、Ｉ９３、Ｃ９９、Ｅ１１７、Ｓ１２０、Ｆ１２７、Ｄ１３１、Ｇ１５６、Ｅ１５７、Ｙ１５９、Ｇ１７４、Ｃ１７６、Ｇ１８２、Ｇ１８３、Ｆ１８５、Ｇ１８７、Ｇ１８８、Ｇ１８９、Ｙ１９０、Ｇ１９１、Ｐ１９２、Ｒ１９５、Ｄ２０２、Ｄ２０６、Ｇ２１４、Ｗ２２８、Ｇ２３４、Ｆ２３８、Ｌ２４８、Ｑ２７７、Ｓ３１４、Ｌ３２４、Ｓ３５５、Ｋ３８２、Ｋ３８４、Ｄ３８６、Ｇ４２０、Ｍ４２３、Ｒ４３６、Ｙ４４１、Ｗ４４４、Ｙ４４５、Ｙ４７２、Ｐ４７７、Ｎ５１４、Ｆ５１５、Ｎ５２９、およびＱ５３５からなる群から選択される少なくとも一つの不変のアミノ酸を含む、請求項１８に記載の操作されたバリアント。
  20. 少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の不変のアミノ酸を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  21. 同様の条件下、同じ長さの時間で、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビジオール酸（ＴＨＣＡ）を生成する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  22. 同様の条件下、同じ長さの時間で、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによってＣＢＧＡから生成されるＴＨＣＡの量より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  23. 同様の条件下、同じ長さの時間で、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドによって生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率で、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  24. 約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  25. Ｎ末端、Ｃ末端、または前記Ｎ末端とＣ末端の両方に切断を含む、請求項１～９または１１～２４のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  26. 前記切断された、操作されたバリアントが、シグナルポリペプチドまたは膜アンカーを含む、請求項２５に記載の操作されたバリアント。
  27. 天然のシグナルポリペプチドを欠く、請求項２５または２６に記載の操作されたバリアント。
  28. 前記Ｃ末端で、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個のアミノ酸の切断を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  29. 前記Ｃ末端で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸の切断を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の操作されたバリアント。
  30. 請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
  31. 一つまたは複数のアミノ酸置換を含む配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、および配列番号１８５からなる群から選択される、核酸。
  32. 前記ヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、請求項３０または３１に記載の核酸。
  33. カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法であって、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の一つまたは複数の核酸を、宿主細胞に導入することを含む、方法。
  34. 請求項３０～３２のいずれか一項に記載の一つまたは複数の核酸を含む、ベクター。
  35. カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞を製造する方法であって、請求項３４に記載の一つまたは複数のベクターを宿主細胞に導入することを含む、方法。
  36. カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成するための改変された宿主細胞であって、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の一つまたは複数の核酸を含む、改変された宿主細胞。
  37. ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６に記載の改変された宿主細胞。
  38. 前記ＧＯＴポリペプチドが、配列番号１７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の改変された宿主細胞。
  39. 前記ＧＯＴポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む、請求項３７または３８に記載の改変された宿主細胞。
  40. ＮｐｈＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６に記載の改変された宿主細胞。
  41. 前記ＮｐｈＢポリペプチドが、配列番号２９４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の改変された宿主細胞。
  42. テトラケチド合成酵素（ＴＫＳ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸、およびオリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  43. 前記ＴＫＳポリペプチドが、配列番号１９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の改変された宿主細胞。
  44. ＴＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む三つ以上の異種核酸を含む、請求項４２または４３に記載の改変された宿主細胞。
  45. 前記ＯＡＣポリペプチドが、配列番号２１または配列番号４８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  46. ＯＡＣポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む三つ以上の異種核酸を含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  47. アシル活性化酵素（ＡＡＥ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６～４６のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  48. 前記ＡＡＥポリペプチドが、配列番号２３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の改変された宿主細胞。
  49. ＡＡＥポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む、請求項４７または４８に記載の改変された宿主細胞。
  50. 以下：ａ）ＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧＳ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｂ）切断された３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル－ＣｏＡ還元酵素（ｔＨＭＧＲ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｃ）メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｄ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；ｅ）メバロン酸ピロリン酸脱炭酸酵素（ＭＶＤ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸；またはｆ）イソペンテニル二リン酸異性化酵素（ＩＤＩ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸
    のうちの一つまたは複数を含む、請求項３６～４９のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  51. 前記ＩＤＩ１ポリペプチドが、配列番号２５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５０に記載の改変された宿主細胞。
  52. 前記ｔＨＭＧＲポリペプチドが、配列番号２７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５０または５１に記載の改変された宿主細胞。
  53. 前記ＨＭＧＳポリペプチドが、配列番号２９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  54. 前記ＭＫポリペプチドが、配列番号３９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  55. 前記ＰＭＫポリペプチドが、配列番号３７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  56. 前記ＭＶＤ１ポリペプチドが、配列番号３３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５０～５５のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  57. アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６～５６のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  58. 前記アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼポリペプチドが、配列番号３１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の改変された宿主細胞。
  59. ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６～５８のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  60. 前記ＰＤＣポリペプチドが、配列番号３５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の改変された宿主細胞。
  61. ゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６～６０のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  62. 前記ＧＰＰＳポリペプチドが、配列番号４１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載の改変された宿主細胞。
  63. ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６～６２のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  64. 前記ＫＡＲ２ポリペプチドが、配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の改変された宿主細胞。
  65. ＫＡＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む二つ以上の異種核酸を含む、請求項６３または６４に記載の改変された宿主細胞。
  66. ＰＤＩ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６～６５のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  67. 前記ＰＤＩ１ポリペプチドが、配列番号９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の改変された宿主細胞。
  68. ＩＲＥ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６～６７のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  69. 前記ＩＲＥ１ポリペプチドが、配列番号１１または配列番号１９０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載の改変された宿主細胞。
  70. ＥＲＯ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６～６９のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  71. 前記ＥＲＯ１ポリペプチドが、配列番号７に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の改変された宿主細胞。
  72. ＦＡＤ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の異種核酸を含む、請求項３６～７１のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  73. 前記ＦＡＤ１ポリペプチドが、配列番号１９２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の改変された宿主細胞。
  74. ＰＥＰ４ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む、請求項３６～７３のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  75. 前記ＰＥＰ４ポリペプチドが、配列番号１５に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７４に記載の改変された宿主細胞。
  76. ＲＯＴ２ポリペプチドをコードする一つまたは複数の遺伝子の欠失または下方制御を含む、請求項３６～７５のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  77. 前記ＲＯＴ２ポリペプチドが、配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載の改変された宿主細胞。
  78. 真核細胞である、請求項３６～７７のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  79. 前記真核細胞が、酵母細胞である、請求項７８に記載の改変された宿主細胞。
  80. 前記酵母細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項７９に記載の改変された宿主細胞。
  81. 前記サッカロマイセス・セレビシエが、サッカロマイセス・セレビシエのタンパク質分解酵素欠損株である、請求項８０に記載の改変された宿主細胞。
  82. 前記一つまたは複数の核酸のうちの少なくとも一つが、前記改変された宿主細胞の染色体に組み込まれる、請求項３６～８１のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  83. 前記一つまたは複数の核酸のうちの少なくとも一つが、染色体外で維持される、請求項３６～８２のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  84. 前記一つまたは複数の核酸のうちの少なくとも一つが、誘導性プロモーターに動作可能に連結される、請求項３６～８３のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  85. 前記一つまたは複数の核酸のうちの少なくとも一つが、構造性プロモーターに動作可能に連結される、請求項３６～８３のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  86. 前記改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、前記カンナビノイドまたは前記カンナビノイド誘導体を生成し、
    配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む前記改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、
    請求項３６～８５のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  87. 前記改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞によって生成されるカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体の量より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％より多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で、前記カンナビノイドまたは前記カンナビノイド誘導体を生成し、
    配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む前記改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、
    請求項３６～８６のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  88. 前記改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率と比較して、より速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有し、
    配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む前記改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、
    請求項３６～８７のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  89. 前記改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞の増殖速度および／またはより高いバイオマス収率より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％速い増殖速度および／またはより高いバイオマス収率を有し、
    配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む前記改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、
    請求項３６～８８のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  90. 前記改変された宿主細胞は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞により生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率で、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）を生成し、
    配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む前記改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、
    請求項３６～８９のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  91. 約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する、請求項３６～９０のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞。
  92. カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法であって、
    ａ）培地において請求項３６～９１のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞を培養すること
    を含む、方法。
  93. ｂ）前記生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を回収すること
    を含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記培地が、カルボン酸を含む、請求項９２または９３に記載の方法。
  95. 前記カルボン酸が、置換されていないかまたは置換されたＣ３－Ｃ１８カルボン酸である、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記置換されていないかまたは置換されたＣ３－Ｃ１８カルボン酸が、置換されていないかまたは置換されたヘキサン酸である、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記培地が、オリベトール酸またはオリベトール酸誘導体を含む、請求項９２または９３に記載の方法。
  98. 前記カンナビノイドが、テトラヒドロカンナビノール酸、テトラヒドロカンナビバリン酸、またはテトラヒドロカンナビバリンである、請求項９２または９３に記載の方法。
  99. 前記培地が、発酵性糖を含む、請求項９２～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記培地が、前処理されたセルロース供給原料を含む、請求項９２～９８のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記培地が、非発酵性炭素源を含む、請求項９２～９８のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記非発酵性炭素源が、エタノールを含む、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記カンナビノイドまたは前記カンナビノイド誘導体が、培地１Ｌ当たり１００ｍｇより多い量で生成される、請求項９２～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体は、請求項３６～９１のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞の代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を培養することを含む方法で生成される前記カンナビノイドまたは前記カンナビノイド誘導体の量よりも多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成され、
    配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む前記改変された宿主細胞は、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠き、ならびに
    請求項３６～９１のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞と、配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く前記改変された宿主細胞とは、同様の培養条件下、同じ長さの時間で培養される、
    請求項９２～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記カンナビノイドまたは前記カンナビノイド誘導体は、請求項３６～９１のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞の代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を培養することを含む方法で生成される前記カンナビノイドまたは前記カンナビノイド誘導体の量よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成され、
    配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む前記改変された宿主細胞は、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠き、ならびに
    請求項３６～９１のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞と、配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含むが、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く前記改変された宿主細胞とは、同様の培養条件下、同じ長さの時間で培養される、
    請求項９２～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記カンナビノイドは、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）であり、
    前記方法は、請求項３６～９１のいずれか一項に記載の改変された宿主細胞の代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む改変された宿主細胞を培養することを含む方法において生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率でＴＨＣＡを生成し、
    配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含む一つまたは複数の核酸を含む前記改変された宿主細胞は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で増殖させたとき、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を欠く、
    請求項９２～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する、請求項９２～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. カンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を生成する方法であって、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントの使用を含む、方法。
  109. 前記生成されたカンナビノイドまたはカンナビノイド誘導体を回収することを含む、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記カンナビノイドが、テトラヒドロカンナビノール酸、テトラヒドロカンナビバリン酸、またはテトラヒドロカンナビバリンである、請求項１０８または１０９に記載の方法。
  111. 前記カンナビノイドまたは前記カンナビノイド誘導体は、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの使用を含む方法で生成される前記カンナビノイドまたは前記カンナビノイド誘導体の量よりも多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成され、
    請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアント、および配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される、
    請求項１０８～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記カンナビノイドまたは前記カンナビノイド誘導体は、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの使用を含む方法で生成される前記カンナビノイドまたは前記カンナビノイド誘導体の量よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％高い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で生成され、
    請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアント、および配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される、
    請求項１０８～１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記カンナビノイドは、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）であり、
    前記方法は、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントの代わりに、配列番号４４のアミノ酸配列を有するテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドの使用を含む方法で生成されるものと比較して、別のカンナビノイド（例えば、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ））に対して高いＴＨＣＡの比率でＴＨＣＡを生成し、
    請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアント、および配列番号４４の前記アミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドは、同様の条件下、同じ長さの時間使用される、
    請求項１０８～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 約１１：１、約１１．５：１、約１２：１、約１２．５：１、約１３：１、約１３．５：１、約１４：１、約１４．５：１、約１５：１、約１５．５：１、約１６：１、約１６．５：１、約１７：１、約１７．５：１、約１８：１、約１８．５：１、約１９：１、約１９．５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約５００：１であるか、または約５００：１よりも高い、ＴＨＣＡの別のカンナビノイド（例えば、ＣＢＣＡ）に対する比率で、ＣＢＧＡからＴＨＣＡを生成する、請求項１０８～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 一個または複数のアミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含むテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡＳ）ポリペプチドの操作されたバリアントのスクリーニング方法であって、
    ａ）宿主細胞の集団を対照集団および試験集団に分けること；
    ｂ）前記対照集団において、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＴＨＣＡＳポリペプチドと、比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドとを共発現させることであって、配列番号４４のアミノ酸配列を有する前記ＴＨＣＡＳポリペプチドは、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を第一のカンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）に変換することができ、前記比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、同じＣＢＧＡを異なる第二のカンナビノイドに変換することができる、共発現させること；
    ｃ）前記試験集団において、前記操作されたバリアントと、前記比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドとを共発現させることであって、前記操作されたバリアントは、ＣＢＧＡを、配列番号４４のアミノ酸配列を有する前記ＴＨＣＡＳポリペプチドと同じ第一のカンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）に変換してもよく、前記比較カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、同じＣＢＧＡを前記第二のカンナビノイドに変換することができ、かつ前記試験集団および前記対照集団において同様のレベルで発現される、共発現させること；
    ｄ）前記試験集団と前記対照集団の両方によって生成される前記第二のカンナビノイドに対する、前記第一のカンナビノイドであるテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）の比率を測定すること；および
    ｅ）前記試験集団と前記対照集団の両方によって生成される前記第一のカンナビノイドの量（ｍｇ／ＬまたはｍＭ）を測定すること
    を含む、方法。
  116. 配列番号４４のアミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドと比較して、改善されたインビボ性能を有する操作されたバリアントを含む前記試験集団が特定され、
    改善されたインビボ性能は、同様の培養条件下、同じ長さの時間で前記対照集団によって生成されるものと比較して、前記試験集団によって生成される前記第二のカンナビノイドに対する前記第一のカンナビノイドの比率が高いことによって示される、
    請求項１１５に記載の方法。
  117. 同様の培養条件下、同じ長さの時間で前記対照集団によって生成される量と比較して、前記試験集団によってより多い量（ｍｇ／ＬまたはｍＭで測定される）で前記第一のカンナビノイドを生成することによって、配列番号４４のアミノ酸配列を有する前記テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素ポリペプチドと比較して改善されたインビボ性能を有する操作されたバリアントを含む前記試験集団が特定される、請求項１１５または１１６に記載の方法。
  118. 前記カンナビノイド合成酵素ポリペプチドは、カンナビジオール酸合成酵素ポリペプチドである、請求項１１５～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記カンナビジオール酸ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記第二のカンナビノイドが、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）である、請求項１１５～１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記操作されたバリアントが、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたバリアントである、請求項１１５～１２０のいずれか一項に記載の方法。
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