EP2692729B1 - Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Dihydrochalkonen - Google Patents

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EP2692729B1
EP2692729B1 EP13176159.5A EP13176159A EP2692729B1 EP 2692729 B1 EP2692729 B1 EP 2692729B1 EP 13176159 A EP13176159 A EP 13176159A EP 2692729 B1 EP2692729 B1 EP 2692729B1
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seq
microorganism
chalcone isomerase
bacterial
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Dr. Jens-Michael Hilmer
Egon Gross
Dr. Gerhard Krammer
Dr. Jakob Peter Ley
Mechthild Gall
Prof. Dr. rer. nat. Uwe Bornscheuer
Maren Thomsen
Christin Peters
Patrick Jonczyk
Dr. rer. nat. Sascha Beutel
Prof. Dr. rer. nat. Tomas Scheper
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Symrise AG
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Definitions

  • the present invention relates primarily to a process for the preparation of a dihydrochalcone, in particular of phloretin, or a process for the reduction of flavanones using a transgenic microorganism comprising a nucleic acid section (a) comprising or consisting of a gene coding for a bacterial chalcone isomerase , and / or a nucleic acid section (a ') comprising or consisting of a gene coding for a plant chalcone isomerase, as well as a nucleic acid section (b), comprising or consisting of a coding for a bacterial enoate reductase gene.
  • a transgenic microorganism comprising a nucleic acid section (a) comprising or consisting of a gene coding for a bacterial chalcone isomerase , and / or a nucleic acid section (a ') comprising or consisting of a gene coding for a plant chalcone is
  • the present invention relates to a transgenic microorganism which comprises a nucleic acid section (a) comprising or consisting of a gene coding for a bacterial chalcone isomerase, and / or a nucleic acid section (a '), comprising or consisting of one for a plant Chalcone isomerase coding gene, as well as a nucleic acid section (b), comprising or consisting of a coding for a bacterial enoate reductase gene.
  • the present invention also relates to a vector, in particular a plasmid vector containing a nucleic acid section (a), comprising or consisting of a for a bacterial chalcone isomerase-encoding gene, and / or a nucleic acid portion (a ') comprising or consisting of a gene coding for a plant chalcone isomerase gene, and / or a nucleic acid portion (b), comprising or consisting of a bacterial Enoat Reductase-encoding gene.
  • a nucleic acid section comprising or consisting of a for a bacterial chalcone isomerase-encoding gene
  • a ' comprising or consisting of a gene coding for a plant chalcone isomerase gene
  • b nucleic acid portion
  • the present invention relates to a host cell containing one or more identical or different vectors according to the invention.
  • Dihydrochalcones are usually prepared by either chemical reduction of chalcones or by Friedel-Crafts-type acylation of phenols with dihydrocinnamic acids. Disadvantage of these methods is that food additives, flavorings or flavorings produced therewith may not be considered natural.
  • dihydrochalcones, especially phloretin can be obtained by extraction, e.g. of the corresponding glycoside (eg from Malus spp.-raw materials) are obtained with subsequent generation of the aglycone.
  • this process is time-consuming, costly and seasonal.
  • Phloretin eg EP 1,998,636 B1
  • Phloridzin trilobatin
  • Yamasaki, K .; Kohda, H .; Tanaka, O .; Mahato, SB Dihydrochalcone glucosides as sweet principles of Symplocos ssp. Planta Medica 1980, (Suppl.), 81-83
  • Naringinedihydrochalcone and neohesperidin dihydrochalcone Crosby, GA, New Sweeteners. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 1976, (June), 297-323 ).
  • the primary object of the present invention was to provide an efficient, industrially feasible and preferably inexpensive process for the preparation of dihydrochalcones, in particular phloretin.
  • Another object was to provide suitable means to perform such a method.
  • Particularly preferred flavanones and the dihydrochalcones formed therefrom are: naringenin and phloretin, naringin and naringinedihydrochalcone, narirutine and phloridzin, hesperetin and hesperetin dihydrochalcone, hesperidin and hesperidin dihydrochalcone, neohesperidin and neohesperidin dihydrochalcone, and eriodictyol and 3-hydroxyphloretin.
  • One aspect of the present invention accordingly relates to a biotechnological process for the production of (natural) dihydrochalcones, in particular of (natural) phloretin, starting from one or more corresponding flavanones and / or a precursor or a derivative thereof, in particular naringin and / or one Precursor or a derivative of naringin, in particular naringin or naringenin, using a bacterial chalcone isomerase (particularly preferably from microorganisms as described below) and / or a plant chalcone isomerase (particularly preferably from plants as described below) in combination with a bacterial Enoate reductase (preferably from microorganisms as described below) in a transgenic microorganism.
  • a bacterial chalcone isomerase particularly preferably from microorganisms as described below
  • a plant chalcone isomerase particularly preferably from plants as described below
  • a preferred embodiment relates to a biotechnological process for the production of (natural) phloretin, starting from naringin and / or a precursor or a derivative of naringin, in particular naringin, narirutin or naringenin, using one or more chalcone isomerases (as described herein) in Combination with an enoate reductase (as described herein) using a transgenic microorganism (also as described herein).
  • a particularly preferred embodiment relates to a biotechnological process for the production of (natural) phloretin starting from naringin and / or a precursor or a derivative of naringin, in particular naringin, narirutin or naringenin, using a bacterial chalcone isomerase (preferably from the anaerobic organism Eubacterium ramulus, as described below) in combination with a plant chalcone isomerase (preferably from Arabidopsis thaliana or Medicago sativa, as described below) and a bacterial enoate reductase (also preferably from the anaerobic organism Eubacterium ramulus, as described below) Use of a transgenic microorganism (as described herein).
  • a bacterial chalcone isomerase preferably from the anaerobic organism Eubacterium ramulus, as described below
  • plant chalcone isomerase preferably from Arabidopsis
  • the anaerobic microorganism Eubacterium ramulus is capable of degrading naringenin to form phloretin as an intermediate.
  • this does not mean a (biotechnological) process for the production of phloretin for the purposes of the present invention, in particular no process (as described above) which is suitable for the industrial production of phloretin, ie for the production of phloretin on an industrial scale.
  • the intermediate formed phloretin is in fact metabolized directly in Eubacterium ramulus (cf. Schneider et al, Anaerobic degradation of flavonoids by Eubacterium ramulus, Arch. Microbiol. (2000) 173: 71-75 ), as shown in the following reaction scheme (see in particular the phloretin hydrolase (PhH) mediated reaction):
  • transgenic microorganism is to be understood as meaning a genetically modified or modified microorganism in which nucleic acid sections (see nucleic acid sections (a) and (b) as described herein) are specifically prepared by means of biotechnological methods. Genes of another organism (so-called transgenes) have been introduced.
  • a “chalcone isomerase” in the context of the present invention is an enzyme which activates the reaction "Chalcone
  • the CHI catalyzes the reaction of / to naringenin to / from naringenin chalcone (see the reaction scheme shown above), for the purposes of the present invention especially the reaction of naringenin to naringenin chalcone.
  • an "enoate reductase” is an enzyme which catalyzes the dehydrogenation of certain compounds, in particular the reaction of naringenin chalcone to phloretin (compare the reaction scheme shown above).
  • the transgenic microorganism used in the method of the present invention is not Eubacterium ramulus, and not a microorganism of the order Clostridiales, preferably not a microorganism of the genus Clostridia, more preferably no phylum (division) microorganism of the firmicut.
  • the microorganism is preferably selected from the group consisting of optionally anaerobic microorganisms, in particular facultative aerobic bacteria, preferably proteobacteria, in particular enterobacteria, for example of the genus Escherichia, preferably E. coli, in particular E. coli BL21, E. coli Rosetta (derivative of E.
  • those microorganisms are preferred which can grow under aerobic conditions and (also) can express the introduced genes (transgenes, supra) under exclusion of oxygen.
  • Preferred in accordance with the present invention is a method (as described above) wherein in step (ii) naringin and / or an aglycone thereof is added.
  • a bacterial chalcone isomerase for chalcone isomerase derived from a microorganism from the Phylus of Firmicutes, preferably of the class Clostridia, in particular of the order Clostridiales, particularly preferably for a chalcone isomerase from E.
  • WO2005084305 A2 (Schmidt-Dannert ) and WO2006010117A2 (Koffas )), and or the coding for a bacterial enoate reductase gene for an enoate reductase from a microorganism from the phylum of Firmicutes, preferably the class Clostridia, in particular the order Clostridiales, particularly preferred for an enoate reductase from E. ramulus.
  • the nucleic acid section comprises (a) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 (nucleotide sequence of the gene coding for the bacterial CHI from E. ramulus DSM 16296) or a nucleotide sequence with a nucleotide sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 1 , preferably 50% or more, 60% or more or 80% or more, more preferably 95% or more, comprises or consists of and or the nucleic acid section (a ') a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 (nucleotide sequence of CHI from M.
  • SEQ ID NO: 7 nucleotide sequence of chalcone-flavonones isomerase 1 (TT5) Arabidopsis thaliana mRNA , complete cds
  • SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 nucleotide sequence having a nucleotide sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 , preferably 50% or more, 60% or more or 80% or more , more preferably 95% or more, comprises or consists of and or the nucleic acid section (b) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 2 (nucleotide sequence of the bacterial ERED from E.
  • SEQ ID NO: 5 codon optimized nucleotide sequence of the bacterial ERED from E. ramulus DSM 16296 coding gene, in particular for expression in E. coli BL21, integrated into pET 22b (cloned by Nde1 and BamH1)) or a nucleotide sequence with a nucleotide sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 , preferably from 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferably 95% or more, comprises or consists thereof.
  • the bacterial chalcone isomerase has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 (amino acid sequence of the bacterial CHI from E. ramulus DSM 16296) or an amino acid sequence with an amino acid sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 3 , preferably of 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferably 95% or more, comprises or consists thereof and or the plant chalcone isomerase has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 8 (amino acid sequence of the chimeric isomerase from Medicago sativa) or SEQ ID NO: 9 (amino acid sequence of Chalcone flavonone isomerase 1 from Arabidopsis thaliana) or an amino acid sequence with an amino acid sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 , preferably of 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferably 95% or more and
  • amino acid sequence identity is preferably based on the Waterman-Smith algorithm with a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the BLOSUM62 matrix (for example, for the Waterman-Smith algorithm, see Smith, TF and Waterman, MS, Identification of Common Molecular Subsequences, Journal of Molecular Biology (1981), 147: 195-197 ; implemented online via the corresponding tool page of the EMBL).
  • a chalcone isomerase which has one, several or all of the following properties and / or a temperature and pH stability according to Fig. 8A and Fig. 9 having: K M [ ⁇ mol / l] V max [U / mg] k cat [s -1 ] k cat / K M [l * mol -1 * s -1 ] 36.83 107.3 416.7 1.13 * 107
  • transgenic microorganism (as described herein)
  • any method known to the person skilled in the art can be used to prepare the nucleic acid sections (a), (a ') and (b) described herein. to introduce the transgenes described herein into the microorganisms, eg, principally by conjugation, transduction or transformation, preferably by heat shock treatment, electroporation, conjugation, gene gun, lithium acetate method or transduction.
  • a transgenic microorganism according to the present invention may contain one or more copies of the introduced nucleic acid segments or the transgenes described herein.
  • Methods for enabling expression of the desired amino acid sequences or of the desired enzymes on the basis of the introduced nucleic acid segments or of the transgenes are likewise sufficiently known to the person skilled in the art, e.g. using a regulatory element, in particular a promoter (see also the attached examples).
  • step (ii) of a method of the invention one or more flavanones and / or one or more precursors or derivatives thereof are added to the transgenic microorganism, wherein the transgenic microorganism is cultured under conditions, which enable the reaction of the flavanone (s) and / or the precursor (s) or the derivative (s) thereof, in particular naringin and / or the precursor or the derivative of naringin, to give a dihydrochalcone, in particular phloretin.
  • naringin and / or a precursor or derivative of naringin is most preferably added to the transgenic microorganism, wherein the transgenic microorganism is cultured under conditions involving the reaction of the naringin and / or the precursor or the derivative of naringin to phloretin.
  • the (transgenic) microorganisms are first cultured, ie before step (ii), under aerobic conditions, preferably until a maximum biomass concentration is reached.
  • the OD 600 should preferably be at least in the Range from 8 to 15 or above, preferably in the range of 5 to 190, in particular in the range of 10 to 180, preferably in the range of 15 to 170.
  • the microorganisms in step (ii) are preferably cultured under anaerobic conditions, wherein the Expression of the desired amino acid sequences or the desired enzymes on the basis of the injected nucleic acid sections or the transgenes infiltrated, for example, stimulated by induction by IPTG and / or lactose (when using a corresponding suitable promoter or a corresponding, suitable expression system).
  • step (ii) takes place at least partially or completely under anaerobic conditions.
  • step (ii) may provide suitable environmental conditions for the purposes of the present invention and, in particular, provide a suitable (culture) medium.
  • the cultivation is preferably carried out in LB or TB medium.
  • a (more complex) medium consisting of or comprising vegetable raw materials, in particular from citrus, grapefruit and orange plants, can be used.
  • the cultivation is carried out, for example, at a temperature of more than 20 ° C, preferably of more than 25 ° C, in particular of more than 30 ° C (preferably in the range of 30 to 40 ° C), which favor in particular the phloretin formation or the yield can increase.
  • a temperature for induction (see above) of less than 40 ° C, in particular less than 35 ° C (preferably in the range of 20 to 30 ° C), favor the Phloretin Guess or increase the yield.
  • Naringin or the precursor or derivative thereof is preferably used in step (ii) in an amount of 0.1 mM to 100 mM (mmol / L), based on the (culture) medium containing the transgenic microorganisms 0.5 to 95 mM, more preferably from 1 to 90 mM added to the transgenic microorganism.
  • Suitable (co-) solvents can be used here.
  • inducers eg IPTG or lactose
  • the inducer with respect to the (culture) medium containing the transgenic microorganisms, in step (ii) in an amount of 0.001 to 1 mM, preferably from 0.005 to 0.9 mM, particularly preferably from 0.01 to 0.8 mM, since in this case particularly good yields can be achieved.
  • organic solvents preferably selected from the following list: isobutane, 2-propanol, toluene, methyl acetate, cyclohexane, 2-butanol, hexane, 1-propanol, light petroleum, 1,1,1,2-tetrafluoroethane, methanol, propane, 1-butanol, butane, ethyl methyl ketone, ethyl acetate, diethyl ether, ethanol, dibutyl ether, CO 2, tert-butyl methyl ether, acetone, dichloromethane and N 2 O), particularly preferably those which are mixed with water form an optically detectable phase boundary.
  • organic solvents preferably selected from the following list: isobutane, 2-propanol, toluene, methyl acetate, cyclohexane, 2-butanol, hexane, 1-propanol, light petroleum, 1,1,1,2-tetrafluoroe
  • a further aspect of the present invention relates to a transgenic microorganism comprising a nucleic acid section (a) comprising or consisting of a gene coding for a bacterial chalcone isomerase (as a transgene) and / or a nucleic acid section (a ') comprising or consisting of a gene coding for a plant chalcone isomerase (as a transgene), and a nucleic acid section (b), comprising or consisting of a coding for a bacterial enoate reductase gene (as another transgene), wherein the transgenic microorganism no microorganism of order Clostridiales and wherein the microorganism has chalcone isomerase and enoate reductase activity, but no phloretinhydrolase activity.
  • microorganisms according to the invention result correspondingly from the above statements on microorganisms preferably to be used in the context of a method according to the invention.
  • the microorganism according to the invention has at least one chalcone isomerase and one enoate reductase activity, but no phloretinhydrolase activity.
  • the microorganism is not Eubacterium ramulus, and is not a microorganism of the order Clostridiales, more preferably not a microorganism of the genus Clostridia, more preferably not a microorganism of the phylum of Firmicutes, and is more preferably selected from the group consisting of facultative anaerobic microorganisms, especially facultative aerobic bacteria Proteobacteria, in particular enterobacteria, for example of the genus Escherichia, preferably E. coli, in particular E. coli Rosetta, E. coli BL21 and E. coli SE1, and yeasts, for example S. cerevesiae and P. pastoris.
  • the microorganisms preferably to be used in the context of a method according to the invention applies correspondingly.
  • a microorganism according to the invention is particularly preferred, wherein the gene coding for a bacterial chalcone isomerase for a chalcone isomerase from a microorganism from the phylum of Firmicutes, preferably the class Clostridia, in particular the order Clostridiales, particularly preferably for a chalcone isomerase from E. ramulus encoded, and or the gene coding for a plant chalcone isomerase codes for a chalcone isomerase from A. thaliana or M.
  • sativa for further preferred sources see above
  • coding for a bacterial enoate reductase gene for an enoate reductase from a microorganism from the phylum of Firmicutes preferably the class Clostridia, in particular the order Clostridiales, particularly preferably encodes an enoate reductase from E. ramulus .
  • the nucleic acid section comprises (a) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence with a nucleotide sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 1 , preferably of 50% or more, 60% or more or 80% or more, more preferably 95% or more, comprises or consists of and or the nucleic acid section (a ') has a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or a nucleotide sequence with a nucleotide sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 , preferably of 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferably 95% or more, comprises or consists of and or the nucleic acid section (b) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO : 2 or SEQ ID NO : 5 or a nucleotide sequence with a nucleotide sequence identity of
  • the bacterial chalcone isomerase has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence with an amino acid sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 3 , preferably 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferred 95% or more and or the plant chalcone isomerase has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or an amino acid sequence with an amino acid sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO : 9 , preferably of 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferably 95% or more, comprises or consists thereof and or the bacterial enoate reducatase has an amino acid sequence according to SEQ ID NO : 4 or an amino acid sequence with an amino acid sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO : 4 , preferably of 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferably of 95% or more, comprises or consists thereof.
  • a vector i. a transport vesicle ("geneva shuttle") for the transfer of foreign nucleic acid (s) into a recipient cell, in particular a plasmid vector, which allows the cloning of one or more nucleic acid sections, comprising a nucleic acid section (a), comprising or consisting of a for a bacterial chalcone isomerase-encoding gene, and / or a nucleic acid portion (a ') comprising or consisting of a gene coding for a plant chalcone isomerase gene, and / or a nucleic acid portion (b), comprising or consisting of a bacterial Enoat Reductase-encoding gene. It is preferred if the vector contains both a nucleic acid section (a) and / or (a ') and a nucleic acid section (b).
  • such a vector for the purposes of the present invention optionally contains further customary constituents, in particular those which express the expression of the transgenes described herein in microorganisms, in particular in such as described above, improve or possibly only make it possible.
  • a vector preferably also contains one or more further constituents or elements selected from the group consisting of promoter, ori sequence, sequence for affinity chromatographic purification, selection marker, operator sequence, terminator, ribosomal binding sites, protease cleavage sequence, recombination binding sites, sequences of fusion proteins and chaperone sequences.
  • the gene coding for a bacterial chalcone isomerase for a chalcone isomerase from a microorganism from the phylum of Firmicutes preferably the class Clostridia, in particular the order Clostridiales, particularly preferably for a chalcone isomerase from E. ramulus encoded and or the gene coding for a plant chalcone isomerase codes for a chalcone isomerase from A. thaliana or M.
  • sativa for further preferred sources see above
  • coding for a bacterial enoate reductase gene for an enoate reductase from a microorganism from the phylum of Firmicutes preferably the class Clostridia, in particular the order Clostridiales, particularly preferably encodes an enoate reductase from E. ramulus .
  • the nucleic acid section comprises (a) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence with a nucleotide sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 1 , preferably of 50% or more, 60% or more or 80% or more, more preferably 95% or more, comprises or consists of and or the nucleic acid section (a ') has a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or a nucleotide sequence with a nucleotide sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 , preferably of 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferably 95% or more, comprises or consists of and or the nucleic acid section (b) a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 or a nucleotide sequence with a nucleotide sequence identity of 40% or more
  • the bacterial chalcone isomerase has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence with an amino acid sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 3 , preferably 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferred 95% or more and or the plant chalcone isomerase has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or an amino acid sequence with an amino acid sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 , preferably of 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferably 95% or more, comprises or consists thereof and or the bacterial enoate reducatase has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence with an amino acid sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 4 , preferably of 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferably of 95% or more, comprises or consists thereof.
  • Fig. 1 Plasmid pET52b_EREDstrep for heterologous expression and characterization of ERED from E. ramulus DSM 16296;
  • Fig. 2 Plasmid pET28b_CHI for heterologous expression and characterization of CHI from E. ramulus DSM 16296;
  • Fig. 3 Plasmid pET22b_ERED for heterologous expression and characterization of ERED from E. ramulus DSM 16296).
  • the present invention also relates to a transgenic microorganism (as described above) in the form of a host cell containing one or more identical or different vectors as described herein.
  • a host cell which comprises both one or more vectors with a nucleic acid section (a) comprising or consisting of a gene coding for a bacterial chalcone isomerase and / or a nucleic acid section (a ') comprising or consisting of a for a gene coding for a plant chalcone isomerase, as well as one or more vectors with a nucleic acid section (b), comprising or consisting of a coding for a bacterial enoate reductase gene.
  • a host cell containing one or more vectors having both a nucleic acid portion (a) and / or (a ') and a nucleic acid portion (b).
  • a host cell according to the invention is a microorganism to be used according to the invention or a microorganism according to the invention (as described above).
  • the host cells according to the invention or microorganisms to be used according to the invention or described herein are preferably used as (production) strain for the biotechnological production of dihydrochalcones described herein, in particular of phloretin (as described above).
  • Insertion of the resulting DNA fragment of the chalcone isomerase gene was inserted into the vector pCR®2.1-TOPO® by TOPO TA Cloning® (from Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Following successful transformation of this construct, the chalcone isomerase gene was excised from this vector via Nco1 and Not1 and inserted into the target vector pET28b, also cut with Nco1 and Not1. The plasmid was introduced into E. coli Rosetta and successfully expressed there.
  • an interface for SacI was inserted in front of the gene and an interface for HindIII behind the gene, in order to enable later cloning.
  • the pCR®2.1-TOPO® vector also contains an SacI site which was used for further cloning.
  • this PCR product was digested with Sac1 and Kpn1 and then ligated into plasmid pET52b also digested with Sac1 and Kpn1.
  • the gene construct was expressed in E. coli Rosetta.
  • a codon-optimized sequence was ligated with the Nde1 and BamH1 sites in the vector pET-22b and expressed in E. coli BL21.
  • the gene sections of the CHI can be integrated via the BamHI and XHO1 interfaces into the plasmid pET22b with the synthetic ERED gene.
  • the CHI gene is amplified by PCR with the forward primer GTCTAGGATCCAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA and the pET-rP primer CTAGTTATTGCTCAGCGG, wherein the Xba1 site is mutated before the CHI gene via the forward primer into a BamHI site.
  • the construct from both genes is then cut out of the plasmid via the Xba1 and Xho1 cleavage sites and ligated into the plasmid pStaby1.2 prepared with Xba1 and Xho1.
  • antibiotic-free expression can be carried out by the StabyExpress system.
  • TB medium consisting of 24 g of yeast extract, 12 g of tryptone and 4 g of glycerol is made up to 900 ml and autoclaved at 121 ° C for 15 minutes.
  • a separately prepared saline solution (0.72 M on K 2 HPO 4 and 0.17 M on KH 2 PO 4 ) is autoclaved under the same conditions. Subsequently, 100 ml of the saline solution is added to 900 ml of the sterile TB medium.
  • LB medium consisting of 5 g of yeast extract, 10 g of tryptone and 10 g of NaCl is made up to 1000 ml with distilled water and autoclaved for 15 minutes at 121 ° C.
  • the E. coli Rosetta or E. coli BL21 transformed, for example, according to Example 1 are first in 250 ml Erlenmeyer flasks (with chicane), which are filled with 50 ml of LB medium for about 8 hours at 37 ° C. and cultivated 180 rpm. From this culture, 7 ml are then removed and inoculated a mini-fermenter containing 700 ml of TB medium (as described above). The culture is grown overnight at 25 ° C with 150 to 200 rpm and 40% oxygen saturation to reach a maximum biomass concentration.
  • the air supply is stopped and the oxygen present is expelled with nitrogen.
  • an IPTG concentration of 1 mM is initially set in the medium and then 7 ml of a naringenin solution (100 mM in DMSO) are added.
  • CHI can be detected both in the soluble and in the insoluble fractions.
  • the CHI can be isolated for characterization (in Fig. 7 the results of the individual purification steps after expression of the vector pET28b_CHI in E. coli are shown by way of example).
  • Fig. 4 and 5 show (further) results of the characterization of the expressed enzymes CHI and ERED (from E. ramulus DSM 16296 in anaerobic conversion (see above)).
  • Enzyme CHI and ERED were separately expressed in a vector system suitable for E. coli (see above). Subsequently, their activity - after addition of naringenin in a defined culture medium - can be determined by HPLC.
  • E. ramulus was after Herles et al. (Arch Microbiol (2004) 181: 428-434 ) anaerobically cultivated in ST medium.
  • 275 ⁇ M naringenin was added to the medium at the beginning of the cultivation and the growth and conversion of the substrate were determined (for results see Fig. 10 ).
  • SEQ ID NO: 5 codon-optimized nucleotide sequence for expression of ERED in E. coli BL21, integrated into pET 22b, was cloned with Nde1 and BamH1:

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft primär ein Verfahren zur Herstellung eines Dihydrochalkons, insbesondere von Phloretin, bzw. ein Verfahren zur Reduktion von Flavanonen unter Verwendung eines transgenen Mikroorganismus, enthaltend einen Nukleinsäure-Abschnitt (a), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Chalconisomerase kodierenden Gen, und/oder einen Nukleinsäure-Abschnitt (a'), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierenden Gen, sowie einen Nukleinsäure-Abschnitt (b), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierenden Gen.
  • Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen transgenen Mikroorganismus, der einen Nukleinsäure-Abschnitt (a), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Chalconisomerase kodierenden Gen, und/oder einen Nukleinsäure-Abschnitt (a'), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierenden Gen, sowie einen Nukleinsäure-Abschnitt (b), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierenden Gen, enthält.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vektor, insbesondere einen Plasmidvektor, enthaltend einen Nukleinsäure-Abschnitt (a), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Chalconisomerase kodierenden Gen, und/oder einen Nukleinsäure-Abschnitt (a'), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierenden Gen, und/oder einen Nukleinsäure-Abschnitt (b), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierenden Gen.
  • Zudem betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, die ein oder mehrere identische oder unterschiedliche erfindungsgemäße Vektoren enthält.
  • Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung, den Beispielen sowie insbesondere den beigefügten Patentansprüchen.
  • Dihydrochalcone, insbesondere Phloretin, werden üblicherweise entweder durch chemische Reduktion von Chalkonen oder durch Friedel-Crafts-artige Acylierung von Phenolen mit Dihydrozimtsäuren hergestellt. Nachteil dieser Verfahren ist, dass damit hergestellte Lebensmittelzusatzstoffe, Geschmackstoffe oder Aromastoffe nicht als natürlich bezeichnet werden dürfen. Zudem können Dihydrochalcone, insbesondere Phloretin, durch Extraktion z.B. des entsprechenden Glycosids (z. B. aus Malus spp.-Rohstoffen) mit anschließender Generierung des Aglycons gewonnen werden. Dieser Prozess ist jedoch zeit- und kostenaufwändig und zudem Saison-abhängig.
  • Bedeutende Geschmacks- und Aromastoffe mit Dihydrochalkonstruktur sind z.B. Phloretin (z.B. nach EP 1,998,636-B1 ), Phloridzin, Trilobatin (vgl. Tanaka, T.; Yamasaki, K.; Kohda, H.; Tanaka, O.; Mahato, S. B., Dihydrochalcone-glucosides as sweet principles of Symplocos ssp. Planta Medica 1980, (Suppl.), 81-83), Naringindihydrochalkon und Neohesperidindihydrochalkon (Crosby, G. A., New Sweeteners. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 1976, (June), 297-323).
  • Aufgrund des bestehenden und auch zukünftigen Bedarfs an vorteilhaften Dihydrochalkonen, insbesondere an Phloretin, bestand die primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein effizientes, in industriellem Maßstab durchführbares und vorzugsweise kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von Dihydrochalkonen, insbesondere von Phloretin, bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe bestand in der Bereitstellung geeigneter bzw. notwendiger Mittel, um ein solches Verfahren durchzuführen.
  • Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung sowie insbesondere den beigefügten Patentansprüchen.
  • Die primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch ein innovatives biotechnologisches Verfahren zur Herstellung eines Dihydrochalkons, insbesondere von Phloretin, unter Verwendung eines transgenen Mikroorganismus, umfassend folgende Schritte:
    1. (i) Bereitstellen eines transgenen Mikroorganismus, enthaltend (als Transgene)
      • einen Nukleinsäure-Abschnitt (a), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Chalconisomerase kodierenden Gen,
        und/oder einen Nukleinsäure-Abschnitt (a'), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierenden Gen, sowie
      • einen Nukleinsäure-Abschnitt (b), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierenden Gen,
    2. (ii) Hinzufügen von einem oder mehreren Flavanonen, insbesondere Hinzufügen von Naringin, und/oder von einer oder mehreren Vorstufen oder einem oder mehreren Derivaten davon, insbesondere von einer Vorstufe oder einem Derivat von Naringin, zu dem transgenen Mikroorganismus und Kultivieren des transgenen Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Umsetzung des bzw. der Flavanone und/oder der Vorstufe(n) oder des Derivats bzw. der Derivate davon, insbesondere von Naringin und/oder der Vorstufe bzw. des Derivats von Naringin, zu einem Dihydrochalkon, insbesondere zu Phloretin, ermöglichen,
    3. (iii) optional: Isolieren sowie gegebenenfalls Aufreinigen des Dihydrochalkons, insbesondere von Phloretin,
    wobei der transgene Mikroorganismus kein Mikroorganismus der Ordnung Clostridiales ist und wobei der Mikroorganismus Chalconisomerase- und Enoat-Reduktase-Aktivität aufweist, jedoch keine Phloretinhydrolase-Aktivität.
  • Das bzw. ein, mehrere oder sämtliche der erfindungsgemäß zu verwendenden Flavanone bzw. Vorstufen oder Derivate davon sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
    • Naringenin, Naringin, Narirutin, oder andere Naringeninglycoside, Hesperetin, Hesperidin, Neohesperidin, Hesperetin-7-O-glucosid, oder andere Hesperetinglycoside, Eriodictyol, Eriocitrin, oder andere Eriodictyolglycoside, Sterubin, Sterubinglycoside, Sakuranetin, Sakuranetinglycoside, Isosakuranetin, Isosakuranetinglycoside, 4',7-Dihydroxy-flavanon oder dessen Glycoside, 4',7-Dihydroxy-3'-methoxy-flavanon oder dessen Glycoside, 3',7-Dihydroxy-4'-methoxy-flavanon oder dessen Glycoside, 3',4',7-Trihydroxy-flavanon oder dessen Glycoside, wobei die Flavanone bezüglich der 2-Position des Flavanongerüsts als (S)-, als (R)-Enantiomer, als Racemat oder als beliebige Mischung der beiden Enantiomere vorliegen können.
  • Im Folgenden sind einige der bevorzugt einzusetzenden Flavanone exemplarisch abgebildet:
    Figure imgb0001
    Figure imgb0002
    Figure imgb0003
    Figure imgb0004
    Figure imgb0005
  • Das erfindungsgemäß herzustellende Dihydrochalkon ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
    • Phloretin, Naringindihydrochalkon, Phloridzin oder andere Phloretin-Glycoside , Hesperetindihydrochalkon, Hesperidindihydrochalkon, Neohesperidindihydrochalkon, oder andere Hesperetindihydrochalkonglycoside, Eriodictyoldihydrochalkon (3-Hydroxyphloretin), oder andere Eriodictyoldihydrochalkonglycoside, Sterubindihydrochalkon, Sterubindihydrochalkonglycoside, Sakuranetindihydrochalkon, Sakuranetindihydrochalkonglycoside, Isosakuranetindihydrochalkon, Isosakuranetindihydrochalkonglycoside, 2',4',4-Trihydroxydihydrochalkon (Davidigenin) oder dessen Glycoside, 3-Methoxy-2',4',4-trihydroxydihydrochalkon oder dessen Glycoside, 4-Methoxy-2',3,4'-trihydroxydihydrochalkon oder dessen Glycoside oder 2',4,4',3-Tetrahydroxydihydrochalkon oder dessen Glycoside.
  • Im Folgenden sind erfindungsgemäß bevorzugte Dihydrochalkone abgebildet:
    Figure imgb0006
    Figure imgb0007
    Figure imgb0008
    Figure imgb0009
    Figure imgb0010
  • Besonders bevorzugte Flavanone und die jeweils daraus gebildeten Dihydrochalkone sind: Naringenin und Phloretin, Naringin und Naringindihydrochalkon, Narirutin und Phloridzin, Hesperetin und Hesperetindihydrochalkon, Hesperidin und Hesperidindihydrochalkon, Neohesperidin und Neohesperidindihydrochalkon sowie Eriodictyol und 3-Hydroxyphloretin.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft demnach ein biotechnologisches Verfahren zur Produktion von (natürlichen) Dihydrochalkonen, insbesondere von (natürlichem) Phloretin, ausgehend von einem oder mehreren entsprechenden Flavanonen und/oder einer Vorstufe bzw. eines Derivats davon, insbesondere von Naringin und/oder einer Vorstufe bzw. eines Derivats von Naringin, insbesondere von Naringin oder Naringenin, unter Verwendung einer bakteriellen Chalconisomerase (besonders bevorzugt aus Mikroorganismen wie weiter unten beschrieben) und/oder einer pflanzlichen Chalconisomerase (besonders bevorzugt aus Pflanzen wie weiter unten beschrieben) in Kombination mit einer bakteriellen Enoat-Reduktase (bevorzugt aus Mikroorganismen wie weiter unten beschrieben) in einem transgenen Mikroorganismus.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft ein biotechnologisches Verfahren zur Produktion von (natürlichem) Phloretin, ausgehend von Naringin und/oder einer Vorstufe bzw. eines Derivats von Naringin, insbesondere von Naringin, Narirutin oder Naringenin, unter Verwendung einer oder mehrerer Chalconisomerasen (wie hierin beschrieben) in Kombination mit einer Enoat-Reduktase (wie hierin beschrieben) unter Verwendung eines transgenen Mikroorganismus (wie ebenfalls hierin beschrieben).
  • Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ein biotechnologisches Verfahren zur Produktion von (natürlichem) Phloretin, ausgehend von Naringin und/oder einer Vorstufe bzw. eines Derivats von Naringin, insbesondere von Naringin, Narirutin oder Naringenin, unter Verwendung einer bakteriellen Chalconisomerase (bevorzugt aus dem anaeroben Organismus Eubacterium ramulus, wie weiter unten beschrieben) in Kombination mit einer pflanzlichen Chalconisomerase (bevorzugt aus Arabidopsis thaliana oder Medicago sativa, wie weiter unten beschrieben) sowie einer bakteriellen Enoat-Reduktase (ebenfalls bevorzugt aus dem anaeroben Organismus Eubacterium ramulus, wie weiter unten beschrieben) unter Verwendung eines transgenen Mikroorganismus (wie hierin beschrieben).
  • Im Stand der Technik war bekannt, dass der anaerobe Mikroorganismus Eubacterium ramulus in der Lage ist, Naringenin abzubauen, wobei intermediär Phloretin gebildet wird. Hierunter ist jedoch kein (biotechnologisches) Verfahren zur Herstellung von Phloretin im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verstehen, insbesondere kein Verfahren (wie oben beschrieben), das sich zur industriellen Herstellung von Phloretin eignet, d.h. zur Herstellung von Phloretin im industriellen Maßstab. Das intermediär gebildete Phloretin wird in Eubacterium ramulus nämlich unmittelbar weiter verstoffwechselt (vgl. Schneider et al, Anaerobic degradation of flavonoids by Eubacterium ramulus, Arch Microbiol (2000) 173 : 71-75), wie in dem folgenden Reaktionsschema dargestellt ist (siehe insbesondere die durch die Phloretinhydrolase (PhH) vermittelte Reaktion):
    Figure imgb0011
  • Im Rahmen der Untersuchungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung konnten für die Zwecke des hierin beschriebenen Verfahrens entscheidende molekularbiologische und biochemische Grundlagen der Biotransformation - mit dem Ziel der Produktion von Phloretin in industriellem Maßstab (ohne unmittelbaren Abbau des gebildeten Phloretin) - aufgeklärt und charakterisiert werden.
  • Im Stand der Technik sind zwar unterschiedliche Einsatzmöglichkeiten von Enzymsystemen und Methoden der mikrobiellen Biotransformation beschrieben; bekannt ist beispielsweise die Möglichkeit einer einfachen Reduktion von Doppelbindungen mittels Hefen (z.B. Saccharomyces). Enzymatische Etherspaltungen wurden bisher jedoch kaum untersucht.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sei grundsätzlich auf folgende Veröffentlichungen verwiesen: Schoefer et al, Anaerobic Degradation of Flavonoids by Clostridium orbiscindens, Appl. Environ. Microbiol., Oct. 2003, p. 5849-5854; und Herles et al, First bacterial chalcone isomerase isolated from Eubacterium ramulus, Arch Microbiol (2004) 181 : 428-434. Erkenntnisse im Zusammenhang mit dem Abbau von Lignin sind beispielsweise von Masai et al. beschrieben worden (Masai et al., 1993; Otsuka et al., 2003; s. auch JP 2002034557 ).
  • In WO 2006010117 von Koffas et al. und WO 2005084305 von Schmidt-Dannert et al. ist die Anwendung heterologer Expression zur Bildung von Flavonoiden beschrieben. Darin werden (ausschließlich) pflanzliche Gene beschrieben, die für eine heterologe Expression verschiedener Substanzen (ausgehend von L-Phenylalanin, Tyrosin und Zimtsäure) genutzt werden.
  • Zudem sei an dieser Stelle auf folgende weitere Dokumente des Standes der Technik verwiesen, die das selbe oder ein ähnliches technisches Gebiet betreffen:
    • SCHMIDT A ET AL: JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, Bd. 150, 1. November 2010, Seite 307, XP027489759
    • SCHNEIDER H ET AL: ARCHIVES OF MICROBIOLOGY, SPRINGER, DE, Bd. 173, Nr. 1,1. Januar 2000, Seiten 71 -75, XP008115183
    • HERLES CLAUDIA ET AL: ARCHIVES OF MICROBIOLOGY, Bd. 181, Nr. 6, Juni 2004 (2004-06), Seiten 428-434
    • HWANG E I ET AL: APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, Bd. 69, Nr. 5, 1. Mai 2003, Seiten 2699-2706, XP008117399
  • US 2005/208643 A1 (SCHMIDT-DANNERT CLAUDIA [US] ET AL) 22. September 2005
  • Überraschenderweise konnten anhand der Genomsequenz von Eubacterium ramulus die Gene kodierend (a) für eine Chalconisomerase und (b) für eine Enoatreduktase (zur Umsetzung von Naringin bzw. einer Vorstufe oder eines Derivats von Naringin zu Phloretin; vgl. hierzu das oben gezeigte Reaktionsschema) identifiziert und daraufhin heterolog in transgenen Mikroorganismen exprimiert werden. Durch die heterologe Expression dieser Enzyme in einem transgenen Mikroorganismus gelingt es vorteilhafterweise, die in E. ramulus üblicherweise stattfindende Folgereaktion von Phloretin zu Phloroglucinol und 3-(4-Hydroxyphenyl)propansäure (HPP) durch die Phloretinhydrolase (vgl. hierzu das oben gezeigte Reaktionsschema) zu vermeiden bzw. zu umgehen, um im Ergebnis eine Herstellung von Phloretin in industriellem Maßstab bzw. eine signifikant erhöhte Produktausbeute zu ermöglichen.
  • Unter einem "transgenen Mikroorganismus" ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein gentechnisch veränderter bzw. modifizierter Mikroorganismus zu verstehen, in den gezielt mittels biotechnologischer Verfahren Nukleinsäure-Abschnitte (siehe Nukleinsäure-Abschnitte (a) und (b) wie hierin beschrieben) bzw. Gene eines anderen Organismus (sog. Transgene) eingeschleust worden sind.
  • Eine "Chalconisomerase" (CHI) im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Enzym, das die Reaktion "Chalcon
    Figure imgb0012
    Flavanon" katalysiert. Insbesondere katalysiert die CHI die Reaktion von/zu Naringenin zu/von Naringeninchalcon (vgl. das oben gezeigte Reaktionsschema), für die Zwecke der vorliegenden Erfindung insbesondere die Reaktion von Naringenin zu Naringeninchalcon.
  • Eine "Enoat-Reduktase" (ERED) im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Enzym, das die Dehydrierung bestimmter Verbindungen katalysiert, insbesondere die Reaktion von Naringeninchalcon zu Phloretin (vgl. das oben gezeigte Reaktionsschema).
  • In Anbetracht der oben erläuterten Zusammenhänge ist der im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte transgene Mikroorganismus nicht Eubacterium ramulus, und kein Mikroorganismus der Ordnung Clostridiales, bevorzugt kein Mikroorganismus der Klasse Clostridia, besonders bevorzugt kein Mikroorganismus des Phylus (Abteilung) der Firmicutes. Vielmehr ist der Mikroorganismus bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus fakultativ anaeroben Mikroorganismen, insbesondere fakultativ aeroben Bakterien, bevorzugt Proteobakterien, insbesondere Enterobakterien, zum Beispiel der Gattung Escherichia, bevorzugt E. coli, insbesondere E. coli BL21, E. coli Rosetta (Derivat von E. coli BL 21) und E. coli SE1, und Hefen, zum Beispiel S. cerevesiae und P. pastoris. Gemäß einem bevorzugten Aspekt sind für die Zwecke der hierin beschriebenen Erfindung grundsätzlich solche Mikroorganismen bevorzugt, die unter aeroben Bedingungen wachsen und (auch) unter Sauerstoff-Ausschluss die eingeschleusten Gene (Transgene; s. oben) exprimieren können.
  • Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Verfahren (wie oben beschrieben), wobei in Schritt (ii) Naringin und/oder ein Aglycon davon hinzugefügt wird bzw. werden.
  • Vorzugsweise kodiert bzw. kodieren das für eine bakterielle Chalconisomerase kodierende Gen für eine Chalconisomerase aus einem Mikroorganismus aus dem Phylus der Firmicutes, vorzugsweise der Klasse Clostridia, insbesondere der Ordnung Clostridiales, besonders bevorzugt für eine Chalconisomerase aus E. ramulus,
    und/oder
    das für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierende Gen für eine Chalconisomerase aus einer Pflanze der Ordnung der Brassicales, vorzugsweise der Familie der Brassicaceae, bevorzugt dem Tribus der Camelineae, insbesodnere der Gattung der Arabidopsis, vor allem der Art Arabidopsis thaliana, oder der Ordnung der Fabales, vorzugsweise der Familie der Fabaceae, bevorzugt der Unterfamilie der Faboidae, insbesondere der Gattung der Medicago, vor allem der Art Medicago sativa, also besonders bevorzugt für eine Chalconisomerase aus A. thaliana oder M. sativa (vgl. hierzu WO2005084305 A2 (Schmidt-Dannert ) und WO2006010117A2 (Koffas )),
    und/oder
    das für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierende Gen für eine Enoat-Reduktase aus einem Mikroorganismus aus dem Phylus der Firmicutes, vorzugsweise der Klasse Clostridia, insbesondere der Ordnung Clostridiales, besonders bevorzugt für eine Enoat-Reduktase aus E. ramulus.
  • Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren (wie hierin beschrieben), wobei
    der Nukleinsäure-Abschnitt (a) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 (Nukleotidsequenz des für die bakterielle CHI aus E. ramulus DSM 16296 kodierenden Gens) oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:1, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst oder daraus besteht
    und/oder
    der Nukleinsäure-Abschnitt (a') eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:6 (Nukleotidsequenz der CHI aus M. sativa (cultivar Iroquois) (MsCHI-1) mRNA, complete cds) oder SEQ ID NO:7 (Nukleotidsequenz der chalcone-flavonone isomerase 1 (TT5) mRNA aus Arabidopsis thaliana, complete cds) oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:7, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst oder daraus besteht
    und/oder
    der Nukleinsäure-Abschnitt (b) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:2 (Nukleotidsequenz des für die bakterielle ERED aus E. ramulus DSM 16296 kodierenden Gens) oder SEQ ID NO:5 (codon optimierte Nukleotidsequenz des für die bakterielle ERED aus E. ramulus DSM 16296 kodierenden Gens, insbesondere zur Expression in E. coli BL21, integriert in pET 22b (kloniert mittels Nde1 und BamH1)) oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:5, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst oder daraus besteht.
  • Erfindungsgemäß bevorzugt ist weiterhin ein Verfahren (wie oben beschrieben), wobei
    die bakterielle Chalconisomerase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:3 (Aminosäuresequenz der bakteriellen CHI aus E. ramulus DSM 16296) oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:3, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst bzw. daraus besteht
    und/oder
    die pflanzliche Chalconisomerase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:8 (Aminosäuresequenz der Chalconeisomerase aus Medicago sativa) oder SEQ ID NO:9 (Aminosäuresequenz der Chalcone-flavonone isomerase 1 aus Arabidopsis thaliana) oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:9, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst bzw. daraus besteht
    und/oder
    die bakterielle Enoat-Redukatase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:4 (Aminosäuresequenz der bakteriellen ERED aus E. ramulus DSM 16296) oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:4, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst bzw. daraus besteht.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die "Aminosäuresequenz-Identität" bevorzugt anhand des Waterman-Smith-Algorhytmus mit einer Lückeneröffnungs-Strafe ("gap open penalty") von 10, einer Lückenvergrößerungsstrafe ("gap extension penalty") von 0,5 und der BLOSUM62-Matrix zu bestimmen (bezüglich des Waterman-Smith-Algorhytmus siehe beispielsweise Smith, T.F. and Waterman, M.S., Identification of common molecular subsequences, Journal of Molecular biology (1981), 147:195-197; online implementiert über die entsprechende Werkzeugseite des EMBL).
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt ist die Verwendung einer Chalconisomerase, die eine, mehrere oder sämtliche der folgenden Eigenschaften und/oder eine Temperatur- und pH-Stabilität gemäß Fig. 8A und Fig. 9 aufweist:
    KM [µmol/l] Vmax [U/mg] kcat [s-1] kcat / KM [l*mol-1*s-1]
    36,83 107,3 416,7 1,13 * 107
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist die Verwendung einer Enoat-Reduktase, die eine, mehrere oder sämtliche der folgenden Eigenschaften aufweist:
    • Proteingröße von 74,455 kDa
    • wird sowohl in der löslichen als auch in der unlöslichen Proteinfraktion nach bis zu 20h unter anoxischen Bedingungen bei verschiedenen Temperaturen exprimiert.
  • Im Folgenden werden weitere, erfindungsgemäß besonders bevorzugte Einzelheiten eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Phloretin beschrieben.
  • Betreffend das Bereitstellen eines transgenen Mikroorganismus (wie hierin beschrieben) ist anzumerken, dass grundsätzlich jede dem Fachmann geläufige Methode verwendet werden kann, um die hierin beschriebenen Nukleinsäure-Abschnitte (a), (a') und (b) bzw. die hierin beschriebenen Transgene in die Mikroorganismen einzuschleusen, z.B. grundsätzlich durch Konjugation, Transduktion oder Transformation, vorzugsweise durch Hitzeschock-Behandlung, Elektroporation, Konjugation, Gene-gun, Litium-Acetat-Methode oder Transduktion. Generell ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedoch bevorzugt, wenn die Nukleinsäure-Abschnitte (a), (a') und (b) bzw. die beschriebenen Transgene mittels eines Vektors, insbesondere eines Plasmidvektors, vorzugsweise eines erfindungsgemäßen Vektors wie hierin beschrieben (s. unten), eingeschleust werden. Methoden hierzu sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
  • Ein transgener Mikroorganismus im Sinne der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehrere Kopien der eingeschleusten Nukleinsäure-Abschnitte bzw. der hierin beschriebenen Transgene enthalten.
  • Methoden, um auf Basis der eingeschleusten Nukleinsäure-Abschnitte bzw. der Transgene eine Expression der gewünschten Aminosäuresequenzen bzw. der gewünschten Enzyme zu ermöglichen, sind dem Fachmann ebenfalls hinreichend bekannt, z.B. unter Verwendung eines regulatorischen Elements, insbesondere eines Promotors (s. hierzu auch die beigefügten Beispiele).
  • Wie oben beschrieben wird bzw. werden in Schritt (ii) eines erfindungsgemäßen Verfahrens ein oder mehrere Flavanone und/oder eine oder mehrere Vorstufe(n) oder Derivat(e) davon zu dem transgenen Mikroorganismus hinzugefügt, wobei der transgene Mikroorganismus unter Bedingungen kultiviert wird, die die Umsetzung des bzw. desr Flavanone und/oder der Vorstufe(n) oder des Derivats bzw. der Derivate davon, insbesondere von Naringin und/oder der Vorstufe bzw. des Derivats von Naringin, zu einem Dihydrochalkon, insbesondere zu Phloretin, ermöglichen.
  • Wie oben beschrieben wird in Schritt (ii) eines erfindungsgemäßen Verfahrens besonders bevorzugt Naringin und/oder eine Vorstufe oder ein Derivat von Naringin zu dem transgenen Mikroorganismus hinzugefügt, wobei der transgene Mikroorganismus unter Bedingungen kultiviert wird, die die Umsetzung des Naringin und/oder der Vorstufe bzw. des Derivats von Naringin zu Phloretin ermöglichen.
  • Gemäß einer bevorzugten Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens (wie hierin beschrieben) werden die (transgenen) Mikroorgansimen zunächst, d.h. vor Schritt (ii), unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise bis zum Erreichen einer maximalen Biomassenkonzentration, kultiviert. Dabei sollte die OD600 bevorzugt wenigstens im Bereich von 8 bis 15 oder darüber liegen, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 190, insbesondere im Bereich von 10 bis 180, bevorzugt im Bereich von 15 bis 170. Anschließend werden die Mikroorganismen in Schritt (ii) bevorzugt unter anaeroben Bedingungen kultiviert, wobei die Expression der gewünschten Aminosäuresequenzen bzw. der gewünschten Enzyme auf Basis der eingeschleusten Nukleinsäure-Abschnitte bzw. der eingeschleusten Transgene erfolgt, beispielsweise angeregt mittels Induktion durch IPTG und/oder Lactose (bei Verwendung eines entsprechenden, geeigneten Promotors bzw. eines entsprechenden, geeigneten Expressionssystems).
  • Grundsätzlich ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Inkubation in Schritt (ii) zumindest teilweise oder vollständig unter anaeroben Bedingungen erfolgt.
  • Je nach Mikroorganismus kann der Fachmann in Schritt (ii) für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Umgebungsbedingungen schaffen und insbesondere ein geeignetes (Kultivierungs-)Medium bereitstellen. Die Kultivierung erfolgt vorzugsweise in LB-oder TB-Medium. Alternativ kann ein (komplexeres) Medium bestehend oder umfassend pflanzliche Rohstoffe, insbesondere aus Zitrus-, Grapefruit- und Orange-Pflanzen, verwendet werden. Die Kultivierung erfolgt beispielsweise bei einer Temperatur von mehr als 20 °C, bevorzugt von mehr als 25 °C, insbesondere von mehr als 30 °C (bevorzugt im Bereich von 30 bis 40 °C), was insbesondere die Phloretinbildung begünstigen bzw. die Ausbeute erhöhen kann. Weiterhin kann auch eine Temperatur zur Induktion (vgl. oben) von weniger als 40 °C, insbesondere von weniger als 35 °C (bevorzugt im Bereich von 20 bis 30 °C), die Phloretinbildung begünstigen bzw. die Ausbeute erhöhen.
  • Naringin bzw. die Vorstufe oder das Derivat davon wird bezogen auf das (Kultivierungs-) Medium, das die transgenen Mikrorganismen enthält, in Schritt (ii) vorzugsweise in einer Menge von 0,1 mM bis 100 mM (mMol / L), bevorzugt von 0,5 bis 95 mM, besonders bevorzugt von 1 bis 90 mM, zu dem transgenen Mikroorganismus hinzugefügt. Hierbei können geeignete (Ko-)Solventien zum Einsatz kommen.
  • Falls zur Induktion (z.B. des lac-operons) ein oder mehrere geeignete Induktoren, z.B. IPTG oder Lactose , verwendet werden (vgl. oben), ist es bevorzugt, den Induktor bezogen auf das (Kultivierungs-)Medium, das die transgenen Mikrorganismen enthält, in Schritt (ii) in einer Menge von 0,001 bis 1 mM, bevorzugt von 0,005 bis 0,9 mM, besonders bevorzugt von 0,01 bis 0,8 mM, einzusetzen, da hierbei besonders gute Ausbeuten erzielt werden können.
  • Betreffend das optionale Isolieren sowie gegebenenfalls Aufreinigen von Phloretin: Hierbei können beispielsweise Extraktionen mit organischen Lösemitteln (bevorzugt ausgewählt aus der folgenden Liste: Isobutan, 2-Propanol, Toluol, Methylacetat, Cyclohexan, 2-Butanol, Hexan, 1-Propanol, Light petroleum, 1,1,1,2-Tetrafluorethan, Methanol, Propan, 1-Butanol, Butan, Ethylmethylketon, Ethylacetat, Diethylether, Ethanol, Dibutylether, CO2, tert. Butylmethylether, Aceton, Dichloromethan und N2O), besonders bevorzugt solchen, die mit Wasser eine optisch erkennbare Phasengrenze ausbilden, vorgenommen werden. Hiernach kann sich eine Entfernung des Restwassers im Lösemittel sowie die Entfernung des Lösemittels selbst anbieten, an die sich wiederum ein Rücklösen des (z.B.) Phloretins in einem (ggf. anderen) Lösemittel anschließen kann, welches z.B. für eine gegebenenfalls nachfolgende Kristallisation und Trocknung des Produkts geeignet ist. Alternativ oder ergänzend kann eine adsorptive, eine destillative und/oder eine chromatographische Aufreinigung erfolgen.
  • Weitere Einzelheiten eines erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den beigefügten Beispielen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen transgenen Mikroorganismus, enthaltend einen Nukleinsäure-Abschnitt (a), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Chalconisomerase kodierenden Gen (als Transgen), und/oder einen Nukleinsäure-Abschnitt (a'), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierenden Gen (als Transgen), sowie einen Nukleinsäure-Abschnitt (b), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierenden Gen (als weiteres Transgen), wobei der transgene Mikroorganismus kein Mikroorganismus der Ordnung Clostridiales ist und wobei der Mikroorganismus Chalconisomerase- und Enoat-Reduktase-Aktivität aufweist, jedoch keine Phloretinhydrolase-Aktivität.
  • Dabei gilt bezüglich der verwendeten Begriffe das oben für diese Begriffe Gesagte entsprechend. Bevorzugte erfindungsgemäße Mikroorganismen ergeben sich entsprechend aus den obigen Ausführungen zu im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt einzusetzenden Mikroorganismen.
  • Der erfindungsgemäße Mikroorganismus weist wenigstens eine Chalconisomerase- und eine Enoat-Reduktase-Aktivität, jedoch keine Phloretinhydrolase-Aktivität auf. Entsprechendes gilt für im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens einzusetzende Mikroorganismen (wie oben beschrieben).
  • Der Mikroorganismus ist kein Eubacterium ramulus, und kein Mikroorganismus der Ordnung Clostridiales, weiter bevorzugt kein Mikroorganismus der Klasse Clostridia, besonders bevorzugt kein Mikroorganismus des Phylus der Firmicutes, und ist besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend fakultativ anaeroben Mikroorganismen, insbesondere fakultativ aeroben Bakterien, bevorzugt Proteobakterien, insbesondere Enterobakterien, zum Beispiel der Gattung Escherichia, bevorzugt E. coli, insbesondere E. coli Rosetta, E. coli BL21 und E. coli SE1, und Hefen, zum Beispiel S. cerevesiae und P. pastoris. Im Übrigen gilt das oben für im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt einzusetzende Mikroorganismen Gesagte entsprechend.
  • Dementsprechend ist ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus besonders bevorzugt, wobei
    das für eine bakterielle Chalconisomerase kodierende Gen für eine Chalconisomerase aus einem Mikroorganismus aus dem Phylus der Firmicutes, vorzugsweise der Klasse Clostridia, insbesondere der Ordnung Clostridiales, besonders bevorzugt für eine Chalconisomerase aus E. ramulus, kodiert,
    und/oder
    das für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierende Gen für eine Chalconisomerase aus A. thaliana oder M. sativa kodiert (für weitere bevorzugte Quellen vgl. oben),
    und/oder
    das für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierende Gen für eine Enoat-Reduktase aus einem Mikroorganismus aus dem Phylus der Firmicutes, vorzugsweise der Klasse Clostridia, insbesondere der Ordnung Clostridiales, besonders bevorzugt für eine Enoat-Reduktase aus E. ramulus kodiert.
  • Ferner ist es bevorzugt, wenn
    der Nukleinsäure-Abschnitt (a) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:1, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst oder daraus besteht
    und/oder
    der Nukleinsäure-Abschnitt (a') eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:7 oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:7, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst oder daraus besteht
    und/oder
    der Nukleinsäure-Abschnitt (b) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:5 oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:5, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst oder daraus besteht.
  • Außerdem ist es bevorzugt, wenn
    die bakterielle Chalconisomerase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:3 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:3, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst bzw. daraus besteht
    und/oder
    die pflanzliche Chalconisomerase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:9 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:9, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst bzw. daraus besteht
    und/oder
    die bakterielle Enoat-Redukatase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:4 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:4, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst bzw. daraus besteht.
  • Für die Bestimmung der Nukleotidsequenz- und Aminosäuresequenz-Identität gilt dabei das oben Gesagte entsprechend.
  • Hierin beschrieben wird auch ein Vektor, d.h. ein Transportvesikel ("Genfähre") zur Übertragung von Fremd-Nukleinsäure(n) in eine Empfängerzelle, insbesondere ein Plasmidvektor, der das Klonieren eines oder mehrerer Nukleinsäure-Abschnitte ermöglicht, enthaltend einen Nukleinsäure-Abschnitt (a), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Chalconisomerase kodierenden Gen, und/oder einen Nukleinsäure-Abschnitt (a'), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierenden Gen, und/oder einen Nukleinsäure-Abschnitt (b), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierenden Gen. Dabei ist es bevorzugt, wenn der Vektor sowohl einen Nukleinsäure-Abschnitt (a) und/oder (a'), als auch einen Nukleinsäure-Abschnitt (b) enthält.
  • Neben Nukleinsäure-Abschnitt(en) (a), (a') und/oder (b) enthält ein solcher Vektor für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls weitere übliche Bestandteile, insbesondere solche, die die Expression der hierin beschriebenen Transgene in Mikroorganismen, insbesondere in solchen wie oben beschrieben, verbessern oder gegebenenfalls erst ermöglichen. Grundsätzlich enthält ein solcher Vektor vorzugsweise zudem einen oder mehrere weitere Bestandteile bzw. Elemente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Promotor, ori-Sequenz, Sequenz zur affinitätschromatographischen Reinigung, Selektionsmarker, Operatorsequenz, Terminator, ribosomale Bindestellen, Proteasespaltsequenz, Rekombinationsbindestellen, Sequenzen von Fusionsproteinen und Chaperon-sequenzen.
  • Auch bei den Vektoren wie oben beschrieben ist es bevorzugt, wenn
    das für eine bakterielle Chalconisomerase kodierende Gen für eine Chalconisomerase aus einem Mikroorganismus aus dem Phylus der Firmicutes, vorzugsweise der Klasse Clostridia, insbesondere der Ordnung Clostridiales, besonders bevorzugt für eine Chalconisomerase aus E. ramulus, kodiert
    und/oder
    das für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierende Gen für eine Chalconisomerase aus A. thaliana oder M. sativa kodiert (für weitere bevorzugte Quellen vgl. oben),
    und/oder
    das für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierende Gen für eine Enoat-Reduktase aus einem Mikroorganismus aus dem Phylus der Firmicutes, vorzugsweise der Klasse Clostridia, insbesondere der Ordnung Clostridiales, besonders bevorzugt für eine Enoat-Reduktase aus E. ramulus kodiert.
  • Besonders bevorzugt ist es, wenn
    der Nukleinsäure-Abschnitt (a) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:1, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst oder daraus besteht
    und/oder
    der Nukleinsäure-Abschnitt (a') eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:7 oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:7, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst oder daraus besteht
    und/oder
    der Nukleinsäure-Abschnitt (b) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:5 oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:5, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst oder daraus besteht.
  • Weiterhin ist es bevorzugt, wenn
    die bakterielle Chalconisomerase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:3 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:3, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst bzw. daraus besteht
    und/oder
    die pflanzliche Chalconisomerase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:9 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:9, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst bzw. daraus besteht
    und/oder
    die bakterielle Enoat-Redukatase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:4 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:4, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst bzw. daraus besteht.
  • Auch hierbei gilt für die Bestimmung der Nukleotidsequenz- und Aminosäuresequenz-Identität das oben Gesagte entsprechend.
  • Besonders bevorzugte und für die Zwecke der Erfindung besonders geeignete Vektoren und Bestandteile bzw. Elemente davon ergeben sich auch aus den beigefügten Beispielen und Figuren (Fig. 1: Plasmid pET52b_EREDstrep zur heterologen Expression und Charakterisierung der ERED aus E. ramulus DSM 16296; Fig. 2: Plasmid pET28b_CHI zur heterologen Expression und Charakterisierung der CHI aus E. ramulus DSM 16296; Fig 3: Plasmid pET22b_ERED zur heterologen Expression und Charakterisierung der ERED aus E. ramulus DSM 16296).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen transgenen Mikroorganismus (wie oben beschrieben) in Form einer Wirtszelle, enthaltend ein oder mehrere identische oder unterschiedliche Vektoren wie hierin beschrieben. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Wirtszelle, die sowohl ein oder mehrere Vektoren mit einem Nukleinsäure-Abschnitt (a), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Chalconisomerase kodierenden Gen, und/oder einem Nukleinsäure-Abschnitt (a'), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierenden Gen, als auch ein oder mehrere Vektoren mit einem Nukleinsäure-Abschnitt (b), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierenden Gen, enthält. Besonders bevorzugt ist eine Wirtszelle, die ein oder mehrere Vektoren mit sowohl einem Nukleinsäure-Abschnitt (a) und/oder (a'), als auch einem Nukleinsäure-Abschnitt (b) enthält.
  • Bei einer erfindungsgemäßen Wirtszelle handelt es sich um einen erfindungsgemäß einzusetzenden bzw. einen erfindungsgemäßen Mikroorganismus (wie oben beschrieben). Die hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Wirtszellen bzw. erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismen sind bzw. dienen vorzugsweise als (Produktions-)Stamm zur biotechnologischen Herstellung hierin beschriebener Dihydrochalkone, insbesondere von Phloretin (wie oben beschrieben).
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert, wobei diese den Gegenstand der beigefügten Patentansprüche jedoch nicht beschränken.
    • Beispiel 1: Bereitstellen transgener Mikroorganismen (vgl. Schritt (i)) 1.1 CHI:
  • Anhand der identifizierten Gensequenz der Chalconisomerase aus E. ramulus wurden zwei Primer erstellt, die zur Vervielfältigung der genomischen DNA mittels PCR verwendet wurden. Hierbei wurden mit Hilfe der Primer vor dem Gen eine Restriktionsschnittstellen für Kpn1 und BamH1 sowie hinter dem Gen eine Schnittstelle für Not1 an die Zielsequenz angefügt, die für die Ligation des Genabschnitts in den Zielvektor verwendet wurden.
  • Verwendete Primer (Sequenzabschnitte, die direkt an das Gen binden sind kursiv dargestellt):
    • forward: CTAATCGGATCCGGTACCATGGCAGATTTCAAATTCGAACCAATG
    • reverse: TCAGTAGCGGCCGCTTATCTCATGGTGATGTATCCACGATAATT
  • Das Einfügen des entstandenen DNA-Fragmentes des Chalconisomerase-Gens wurde mittels TOPO TA Cloning® (von Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) in den Vektor pCR®2.1-TOPO® eingefügt. Nach erfolgreicher Transformation dieses Konstruktes wurde das Chalconisomerase-Gen aus diesem Vektor über Nco1 und Not1 ausgeschnitten und in den ebenfalls mit Nco1 und Not1 geschnittenen Zielvektor pET28b eingefügt. Das Plasmid wurde in E. coli Rosetta eingeschleust und dort erfolgreich exprimiert.
  • Nach erfolgreicher Transformation wurde die Sequenzidentität über eine Sequenzierung bestätigt.
    • 1.2 ERED:
  • Die Enoatreduktase wurde mit folgenden spezifischen Primern aus der genomischen DNA amplifiziert (Sequenzabschnitte, die direkt an das Gen binden, sind kursiv dargestellt):
    • forward: GATCCTCGAGATGGCAGAAAAAAATCAGTATTTTCCACA
    • reverse: GATCAAGCTTAGATAATTTCCATTGCTGCGGTCCA
  • Dabei wurde vor dem Gen eine Schnittstelle für SacI und hinter dem Gen eine Schnittstelle für HindIII eingefügt, um eine spätere Klonierung zu ermöglichen.
  • Auch dieses Fragment wurde mit dem TOPO TA Cloning®-Kit weiterbearbeitet. Die Sequenzidentität des resultierenden Klons (mit Vektor pCR®2.1-TOPO® und darin enthaltenem Gen für die Enoatreduktase) wurde über eine Sequenzierung bestätigt.
  • Im Anschluss wurde das Gen aus diesem Plasmid heraus mit Primern amplifziert, die vor dem Gen eine KpnI Schnittstelle einfügten (Sequenzabschnitte, die direkt an das Gen binden, sind kursiv dargestellt; die in den forward-Primer (der keine Sequenzabschnitte beinhaltet, die direkt an das Gen binden) eingefügte KpnI-Schnittstelle wurde fett markiert):
    • forward: AGTGTGATGGGTACCTGCAGAATTCGCC
    • reverse: GATCAAGCTTAGATAATTTCCATTGCTGCGGTCCA (vgl. oben)
  • Im Vektor pCR®2.1-TOPO® ist ebenfalls eine Sacl-Schnittstelle enthalten, die für die weitere Klonierung verwendet wurde.
  • Nach der PCR erfolgte ein Verdau dieses PCR-Produktes mit Sac1 und Kpn1 und anschließend die Ligation in das ebenfalls mit Sac1 und Kpn1 verdaute Plasmid pET52b. Das Genkonstrukt wurde in E. coli Rosetta exprimiert.
  • Über eine Sequenzierung wurde bestätigt, dass das Gen der Enoatreduktase erfolgreich in das Plasmid pET52b ligiert wurde, wobei der eingefügte N-terminale Strep-tag vorhanden blieb, der eine hochspezifische Proteinaufreinigung ermöglicht.
  • Im Rahmen eines weiteren Ansatzes wurde eine codonoptimierte Sequenz mit den Schnittstellen Nde1 und BamH1 in den Vektor pET-22b ligiert und in E. coli BL21 exprimiert.
    • 1.3 antibiotikafreie Expression:
  • Weiterhin können die Genabschnitte der CHI über die Schnittstellen BamHI und XHO1 in das Plasmid pET22b mit dem synthetischen ERED-Gen integriert werden.
  • Dafür wird das CHI-Gen über eine PCR mit dem forward-Primer GTCTAGGATCCAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA und dem pET-rP-Primer CTAGTTATTGCTCAGCGG amplifiziert, wobei die Xba1-Schnittstelle vor dem CHI-Gen über den forward-Primer in eine BamHI-Schnittstelle mutiert wird. Danach wird das Konstrukt aus beiden Genen über die Schnittstellen Xba1 und Xho1 aus dem Plasmid geschnitten und in das mit Xba1 und Xho1 vorbereitete Plasmid pStaby1.2 ligiert.
  • Anschließend kann eine antibiotikafreie Expression durch das StabyExpress-System erfolgen.
    • Beispiel 2: Biotechnologische Herstellung von Phloretin (vgl. Schritt (ii))
  • TB-Medium bestehend aus 24 g Hefeextrakt, 12 g Trypton und 4 g Glycerin wird auf 900 ml aufgefüllt und bei 121 °C für 15 Minuten autoklaviert. Eine separat hergestellte Salzlösung (0,72 M an K2HPO4 und 0,17 M an KH2PO4) wird bei den gleichen Bedingungen autoklaviert. Im Anschluss daran werden 100 ml der Salzlösung zu 900 ml des sterilen TB-Mediums zugegeben. LB-Medium bestehend aus 5 g Hefeextrakt, 10 g Trypton und 10 g NaCl wird auf 1000 ml mit destilliertem Wasser aufgefüllt und für 15 Minuten bei 121 °C autoklaviert.
  • Die z.B. gemäß Beispiel 1 transformierten E. coli Rosetta bzw. E. coli BL21 (vgl. oben) werden zunächst in 250 ml Erlenmeyerkolben (mit Schikane), die mit 50 ml LB-Medium gefüllt sind, für etwa 8 Stunden bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Von dieser Kultur werden dann 7 ml entnommen und ein Minifermenter inokuliert, in dem sich 700 ml TB-Medium (wie oben beschrieben) befinden. Die Kultur wird über Nacht bei 25 °C mit 150 bis 200 rpm und 40% Sauerstoffsättigung zum Erreichen einer maximalen Biomassekonzentration angezogen.
  • Vor der (Über-)Expression der eingeschleusten Nukleinsäure-Abschnitte bzw. der eingeschleusten Transgene wird die Luftzufuhr beendet und der vorhandene Sauerstoff wird mit Stickstoff ausgetrieben.
  • Zur Induktion der (Über-)Expression wird zunächst eine IPTG-Konzentration von 1 mM im Medium eingestellt und dann 7 ml einer Naringenin-Lösung (100mM in DMSO) zugegeben.
  • Im Anschluss wird für mindestens 8 - 20 Stunden unter anoxischen Bedingungen während der Expressionsphase weiter kultiviert.
  • Beispiel 3: Charakterisierung der exprimierten CHI
  • Nach der Expression von z.B. pET28b_CHI in E. coli (vgl. oben) kann CHI sowohl in den löslichen als auch in den unlöslichen Fraktionen nachgewiesen werden.
  • Nach einer Aufreinigung mit z.B. Anionenaustauschchromatographie, Hydrophober Interaktionschromatographie, Größenausschlusschromatographie und/oder Resource Q-Aufreinigung kann die CHI zur Charakterisierung isoliert werden (in Fig. 7 sind beispielhaft die Ergebnisse der einzelnen Aufreinigungsschritte nach Expression des Vektors pET28b_CHI in E.coli gezeigt).
  • Im Rahmen eigener Untersuchungen ergaben sich die in Tabelle 1 genannten Werte: Tabelle 1: Charakterisierung der Enzymaktivität der CHI nach Expression des Vektors pET28b_CHI in E. coli
    KM [µmol/l] Vmax [U/mg] kcat [s-1] kcat / KM [l*mol-1*s-1]
    36,83 107,3 416+,7 1,13 * 107
    • Beispiel 4: (Weitere) Charakterisierung der exprimierten Enzyme CHI und ERED
  • Die Tabellen in Fig. 4 und 5 zeigen (weitere) Ergebnisse der Charakterisierung der exprimierten Enzyme CHI und ERED (aus E. ramulus DSM 16296 bei anaerober Umsetzung (vgl. oben)).
  • Die Enyzme CHI und ERED (aus E. ramulus DSM 16296) wurden in einem für E. coli geeignetem Vektorsystem separat zur Expression gebracht (vgl. oben). Anschließend kann deren Aktivität - nach Zugabe von Naringenin in ein definiertes Kulturmedium - mittels HPLC bestimmt werden.
  • Die Werte der Tabelle in Fig. 4 zeigen im zeitlichen Verlauf die Bildung von Phloretin (unter Abnahme der Naringenin-Konzentration), was auf die Aktivität der Enzyme CHI und ERED hinweist.
  • Die Werte der Tabelle in Fig. 5 zeigen (weitere) Ergebnisse bezüglich der Chalkonisomerase-Aktivität der exprimierten CHI, erhalten durch photometrische Bestimmung (bei 368 nm) im Zusammenhang mit dem Abbau von Naringeninchalcon (zu Phloretin).
  • Im Rahmen einer photometrischen Bestimmung konnte - zur weiteren Untersuchung der CHI-Aktivität - im zeitlichen Verlauf die Abnahme der Konzentration von Naringeninchalcon in einem zellfreien, gepufferten Proteinrohextrakt beobachtet werden. Ein Kontrollversuch (Plasmid ohne CHI) ergab keine Abnahme des als Markersubstanz verwendeten Naringeninchalcons.
    • Beispiel 5: Ergebnisse aus (Vergleichs-)Expressionsversuchen mit E. ramulus
  • E. ramulus (DSMZ 16296) wurde nach Herles et al. (Arch Microbiol (2004) 181 : 428-434) anaerob in ST Medium kultiviert. Zu dessen Herstellung wurden 9 g tryptisch behandeltes Fleischpepton, 1 g Pepton, 3 g Fleischextraktt, 4 g Hefeextrakt, 6 g Glucose, 3 g Natriumchlorid, 2 g Di-Natriumhydrogenphosphat, 0,5 ml Tween 80, 0,25 g Cystine, 0,25 g Cystein-HCl, 0,1 g Magnesiumsulfat-heptahydrat, 5 mg Eisensulfat-heptahydrat und 3.4 mg Mangansulfat-dihydrat auf pH 7.0 eingestellt, auf 1 L mit destilliertem Wasser aufgefüllt und anschließend bei 121 °C für 15 Minuten autoklaviert.
  • Kultivierungen wurden sowohl in einem klassischen Stahlreaktor mit Rührwerk, als auch in Beutelreaktoren mit Wipp-System unter anoxischen Bedingungen durchgeführt, wobei die Temperatur bei 37 °C und der pH bei 7,0 mit Säure und Lauge (HCl bzw. NaOH) gehalten wurde.
  • In einer Beispielfermentation wurde dem Medium zu Beginn der Kultivierung 275 µM Naringenin zugegeben und das Wachstum sowie die Umsetzung des Substrates bestimmt (für Ergebnisse siehe Fig. 10).
  • SEQ ID NO:1
    Figure imgb0013
  • SEQ ID NO:2
    Figure imgb0014
    Figure imgb0015
  • SEQ ID NO:3
    Figure imgb0016
  • SEQ ID NO:4
    Figure imgb0017
  • SEQ ID NO: 5
    codonoptimierte Nukleotidsequenz zur Expression der ERED in E. coli BL21, integriert in pET 22b, kloniert wurde mit Nde1 und BamH1:
    Figure imgb0018
    Figure imgb0019
  • SEQ ID NO:6
    Figure imgb0020
  • SEQ ID NO:7
    Figure imgb0021
    Figure imgb0022
  • SEQ ID NO:8
    Figure imgb0023
  • SEQ ID NO:9
    Figure imgb0024
    • SEQUENCE LISTING
    • <110> SYMRISE AG
    • <120> Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Dihydrochalkonen
    • <140> noch nicht bekannt
      <141> 2013-07-11
    • <150> DE10 2012 213 492.1
      <151> 2012-07-31
    • <160> 9
    • <170> BiSSAP 1.0
    • <210> 1
      <211> 852
      <212> DNA
      <213> Eubacterium ramulus
    • <220>
      <221> source
      <222> 1..852
      <223> /mol_type="DNA"
      /organism="Eubacterium ramulus"
    • <400> 1
      Figure imgb0025
    • <210> 2
      <211> 2037
      <212> DNA
      <213> Eubacterium ramulus
    • <220>
      <221> source
      <222> 1..2037
      <223> /mol_type="DNA"
      /organism="Eubacterium ramulus"
    • <400> 2
      Figure imgb0026
      Figure imgb0027
    • <210> 3
      <211> 678
      <212> PRT
      <213> Eubacterium ramulus
    • <220>
      <221> SOURCE
      <222> 1..678
      <223> /mol_type="protein"
      /organism="Eubacterium ramulus"
    • <400> 3
      Figure imgb0028
      Figure imgb0029
    • <210> 4
      <211> 283
      <212> PRT
      <213> Eubacterium ramulus
    • <220>
      <221> SOURCE
      <222> 1..283
      <223> /mol_type="protein"
      /organism="Eubacterium ramulus"
    • <400> 4
      Figure imgb0030
      Figure imgb0031
    • <210> 5
      <211> 2037
      <212> DNA
      <213> Eubacterium ramulus
    • <220>
      <221> source
      <222> 1..2037
      <223> /mol_type="DNA"
      /organism="Eubacterium ramulus"
    • <400> 5
      Figure imgb0032
      Figure imgb0033
    • <210> 6
      <211> 897
      <212> DNA
      <213> Medicago sativa
    • <220>
      <221> source
      <222> 1..897
      <223> /mol_type="DNA" /organism="Medicago sativa"
    • <400> 6
      Figure imgb0034
    • <210> 7
      <211> 765
      <212> DNA
      <213> Arabidopsis thaliana
    • <220>
      <221> source
      <222> 1..765
      <223> /mol_type="DNA"
      /organism="Arabidopsis thaliana"
    • <400> 7
      Figure imgb0035
      Figure imgb0036
    • <210> 8
      <211> 222
      <212> PRT
      <213> Medicago sativa
    • <220>
      <221> SOURCE
      <222> 1..222
      <223> /mol_type="protein"
      /organism="Medicago sativa"
    • <400> 8
      Figure imgb0037
    • <210> 9
      <211> 246
      <212> PRT
      <213> Arabidopsis thaliana
    • <220>
      <221> SOURCE
      <222> 1..246
      <223> /mol_type="protein"
      /organism="Arabidopsis thaliana"
    • <400> 9
      Figure imgb0038

Claims (9)

  1. Transgener Mikroorganismus, enthaltend als Transgen
    - einen Nukleinsäure-Abschnitt (a), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Chalconisomerase kodierenden Gen,
    und/oder einen Nukleinsäure-Abschnitt (a'), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierenden Gen,
    sowie
    - einen Nukleinsäure-Abschnitt (b), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierenden Gen,
    wobei der transgene Mikroorganismus kein Mikroorganismus der Ordnung Clostridiales ist und wobei der Mikroorganismus Chalconisomerase- und Enoat-Reduktase-Aktivität aufweist, jedoch keine Phloretinhydrolase-Aktivität.
  2. Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei
    das für eine bakterielle Chalconisomerase kodierende Gen für eine Chalconisomerase aus einem Mikroorganismus aus dem Phylus der Firmicutes kodiert,
    und/oder
    das für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierende Gen für eine Chalconisomerase aus A. thaliana oder M. sativa kodiert,
    und/oder
    das für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierende Gen für eine Enoat-Reduktase aus einem Mikroorganismus aus dem Phylus der Firmicutes kodiert.
  3. Mikroorganismus nach einem der vorangehenden Ansprüche, enthaltend ein oder mehrere identische oder unterschiedliche Vektoren, insbesondere Plasmidvektoren, enthaltend einen
    - Nukleinsäure-Abschnitt (a), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Chalconisomerase kodierenden Gen, und/oder einen Nukleinsäure-Abschnitt (a'), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierenden Gen,
    und/oder
    - einen Nukleinsäure-Abschnitt (b), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierenden Gen,
    wobei
    das für eine bakterielle Chalconisomerase kodierende Gen für eine Chalconisomerase aus einem Mikroorganismus aus dem Phylus der Firmicutes kodiert,
    und/oder
    das für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierende Gen für eine Chalconisomerase aus A. thaliana oder M. sativa kodiert,
    und/oder
    das für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierende Gen für eine Enoat-Reduktase aus einem Mikroorganismus aus dem Phylus der Firmicutes kodiert.
  4. Mikroorganismus nach Anspruch 3, enthaltend
    sowohl ein oder mehrere Vektoren mit einem Nukleinsäure-Abschnitt (a), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Chalconisomerase kodierenden Gen, und/oder einem Nukleinsäure-Abschnitt (a'), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche Chalconisomerase kodierenden Gen,
    als auch ein oder mehrere Vektoren mit einem Nukleinsäure-Abschnitt (b), umfassend oder bestehend aus einem für eine bakterielle Enoat-Reduktase kodierenden Gen.
  5. Verfahren zur Herstellung eines Dihydrochalkons, unter Verwendung eines transgenen Mikroorganismus, umfassend folgende Schritte:
    (i) Bereitstellen eines transgenen Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
    (ii) Hinzufügen von einem oder mehreren Flavanonen und/oder von einer oder mehreren Vorstufen oder einem oder mehreren Derivaten davon zu dem transgenen Mikroorganismus und Kultivieren des transgenen Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Umsetzung des bzw. der Flavanone und/oder der Vorstufe(n) oder des Derivats bzw. der Derivate davon zu einem Dihydrochalkon ermöglichen,
    (iii) optional: Isolieren sowie gegebenenfalls Aufreinigen des Dihydrochalkons.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der transgene Mikroorgansimus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus fakultativ anaeroben Mikroorganismen.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei in Schritt (ii) Naringin und/oder ein Aglycon davon hinzugefügt wird bzw. werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei
    der Nukleinsäure-Abschnitt (a) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:1 umfasst oder daraus besteht
    und/oder
    der Nukleinsäure-Abschnitt (a') eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:7 oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:7 umfasst oder daraus besteht
    und/oder
    der Nukleinsäure-Abschnitt (b) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:5 oder eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:5 umfasst oder daraus besteht.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei
    die bakterielle Chalconisomerase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:3 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:3 umfasst bzw. daraus besteht
    und/oder
    die pflanzliche Chalconisomerase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:9 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:9 umfasst bzw. daraus besteht
    und/oder
    die bakterielle Enoat-Redukatase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:4 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:4 umfasst bzw. daraus besteht.
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