ES2617133T3 - Procedimiento para la preparación biotecnológica de dihidrochalconas - Google Patents

Procedimiento para la preparación biotecnológica de dihidrochalconas Download PDF

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Abstract

Microorganismo transgénico, que contiene como transgén - una sección de ácido nucleico (a), que comprende o consiste en un gen que codifica una chalcona-isomerasa bacteriana, y/o una sección de ácido nucleico (a'), que comprende o consiste en un gen que codifica una chalcona-isomerasa vegetal, así como - una sección de ácido nucleico (b), que comprende o consiste en un gen que codifica una enoato-reductasa bacteriana, no siendo el microorganismo transgénico un microorganismo del orden Clostridiales y presentando el microorganismo actividad de chalcona-isomerasa y enoato-reductasa, aunque no presenta actividad de floretinahidrolasa.

Description

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De preferencia, el gen que codifica una chalcona-isomerasa bacteriana codifica o codifican una chalcona-isomerasa proveniente de un microorganismo del filo Firmicutes, preferiblemente de la clase Clostridia, principalmente del orden Clostridiales, particularmente preferible una chalcona-isomerasa proveniente de E. ramulus,
y/o
el gen que codifica una chalcona-isomerasa vegetal codifica una chalcona isomerasa proveniente de una planta del orden Brassicales, de preferencia de la familia Brassicaceae, preferiblemente de la tribu Camelineae, principalmente del género Arabidopsis, ante todo del tipo Arabidopsis thaliana, o del orden Fabales, de preferencia de la familia Fabaceae, preferiblemente de la subfamilia Faboidae, principalmente del género Medicago, ante todo del tipo Medicago sativa, es decir que codifica de modo particularmente preferido una chalcona-isomerasa proveniente de A. thaliana o M. sativa (cf. Con respecto a esto el documento WO2005084305 A2 (Schmidt-Dannert) y el documento WO2006010117A2 (Koffas)),
y/o
el gen que codifica una enoato-reductasa codifica una enoato-reductasa proveniente de un microorganismo del filo Firmicutes, de preferencia de la clase Clostridia, principalmente del orden Clostridiales, codifica de modo particularmente preferible una enoato-reductasa proveniente de E. ramulus.
Particularmente se prefiere un procedimiento (tal como se ha descrito en la presente) de acuerdo con la invención en el cual la sección de ácido nucleico (a) comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO:1 (secuencia de nucleótidos del gen que codifica CHI bacteriana proveniente de E. ramulus DSM 16296) o una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de nucleótidos de 40 % o más con la SEQ ID NO:1, de preferencia de 50 % o más, 60 % o más o 80 % o más, de modo particularmente preferido de 95 % o más
y/o
la sección de ácido nucleico (a’) comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO:6 (secuencia de nucleótidos de la CHI proveniente de ARNm de M. sativa (cultivar Iroquois) (MsCHI-1), cds) completos o SEQ ID NO:7 (secuencia de nucleótidos de ARNm de isomerasa 1 de chalcona-flavonona (TT5) proveniente de Arabidopsis thaliana, cds) completos o una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de nucleótidos de 40 % o más a la SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, de preferencia de 50 % o más, 60 % o más o 80 %
o más, de modo particularmente preferido de 95 % o más,
y/o
la sección de ácido nucleico (b) comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO:2 (secuencia de nucleótidos del gen que codifica la ERED bacteriana proveniente de E. ramulus DSM 16296) o SEQ ID NO:5 (secuencia de nucleótidos optimizada de codón del gen que codifica la ERED bacteriana proveniente de E. ramulus DSM 16296, principalmente para la expresión en E. coli BL21, integrada en pET 22b (clonada por medio de Nde1 y BamH1)) o una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de nucleótidos de 40 %
o más a la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:5, preferentemente de 50 % o más, 60 % o más u 80 % o más, de modo particularmente preferido de 95 % o más.
De acuerdo con la invención se prefiere además un procedimiento (tal como se ha descrito antes) en el cual la chalcona-isomerasa bacteriana comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:3 (secuencia de aminoácidos de la CHI bacteriana proveniente de E. ramulus DSM 16296) o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de aminoácidos de 40 % o más a la SEQ ID NO:3, preferentemente de 50 % o más, 60 % o más u 80 % o más, de modo particularmente preferido de 95 % o más
y/o
la chalcona-isomerasa vegetal comprende por consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:8 (secuencia de aminoácidos de la chalcona-isomerasa proveniente de Medicago sativa) o SEQ ID NO:9 (secuencia de aminoácidos de la isomerasa 1 de chalcona-flavonona proveniente de Arabidopsis thaliana) o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de aminoácidos de 40 % o más a la SEQ ID NO:8 o la SEQ ID NO:9, preferentemente de 50 % o más, 60 % o más o 80 % o más, de modo particularmente preferido de 95 % o más
y/o
la enoato-reductasa bacteriana comprende por o consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO:4 (secuencia de aminoácidos de la ERED bacteriana proveniente de E. ramulus DSM 16296) o una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de aminoácidos de 40 % o más a la SEQ ID NO:4, preferentemente de 50 % o más, 60 % o más u 80 % o más, de modo particularmente preferido de 95 % o más.
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pET28b_CHI para la expresión heteróloga y caracterización de CHI proveniente de E. ramulus DSM 16296; Fig 3: Plásmido pET22b_ERED para la expresión heteróloga y caracterización de ERED proveniente de E. ramulus DSM 16296).
La presente invención también se refiere a un microorganismo transgénico (tal como se ha descrito antes) en forma de una célula hospedera que contiene uno o varios vectores idénticos o diferentes, tal como se han descrito en la presente. De acuerdo con la invención se prefiere una célula hospedera que contiene tanto uno como varios vectores con una sección de ácido nucleico (a) que comprende o consiste en un gen que codifica una chalconaisomerasa bacteriana y/o una sección de ácido nucleico (a’) que comprende o consiste en un gen que codifica una chalcona-isomerasa vegetal, como también uno o varios vectores con una sección de ácido nucleico (b), que comprende o consiste en un gen que codifica una enoato-reductasa bacteriana. Particularmente se prefiere una célula hospedera que contiene uno o varios vectores tanto con una sección (a) y/o de ácido nucleico (a’), como también con una sección de ácido nucleico (b).
La célula hospedera según la invención es un microorganismo que puede usarse de acuerdo con la invención o un microorganismo según la invención (tal como se ha descrito antes). Las células hospederas según la invención, descritas en la presente, o los microorganismos de la invención o que pueden usarse según la invención son o sirven preferentemente como cepa (de producción) para la preparación biotecnológica de dihidrochalconas descritas en la presente, principalmente de floretina (tal como se ha descrito antes).
A continuación, la presente invención se explica más detalladamente por medio de ejemplos aunque estos no restringen el objeto de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1: suministro de microorganismos transgénicos (cf. etapa (i))
1.1 CHI:
Por medio de la secuencia génica identificada de la chalcona-isomerasa proveniente de E. ramulus se produjeron dos cebadores que fueron usados para la reproducción del ADN genómico promedio de PCR. En este caso con la ayuda de los cebadores antes del gen a la secuencia objetivo se añadió un sitio de corte de restricción para Kpn1 y BamH1 así como detrás del gen se añadió un sitio de corte para Not1, los cuales fueron usados para la ligazón de la sección génica en el vector objetivo.
Los cebadores usados (secciones de secuencia que se enlazan directamente al gen se representan con letra cursiva):
hacia delante:
CTAATCGGATCCGGTACCATGGCAGATTTCAAATTCGAACCAATG
al revés:
TCAGTAGCGGCCGCTTATCTCATGGTGATGTATCCACGATAATT
La adición del fragmento de ADN que se genera del gen de chalcona-isomerasa fue añadida por medio de TOPO TA Cloning® (de Invitrogen, Carlsbad, California, USA) al vector pCR®2.1-TOPO®. Después de una transformación exitosa de este constructo, el gen de chalcona-isomerasa fue cortado de este vector por Nco1 y Not1 y añadido al vector objetivo pET28b cortado igualmente con Nco1 y Not1. El plásmido fue introducido a E. coli Rosetta y expresado allí exitosamente.
Después de transformación exitosa se confirmó la identidad de secuencia mediante una secuenciación.
1.2 ERED:
La enoato-reductasa fue amplificada con los siguientes cebadores específicos a partir del ADN genómico (secciones de secuencia que se enlazan directamente al gen se representan con letra cursiva):
hacia delante:
GATCCTCGAGATGGCAGAAAAAAATCAGTATTTTCCACA
al revés:
GATCAAGCTTAGATAATTTCCATTGCTGCGGTCCA
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Ejemplo 3: Caracterización de la CHI expresada
Después de la expresión de, por ejemplo, pET28b_CHI en E. coli (cf. antes), CHI puede detectarse tanto en las fracciones solubles como también en las fracciones insolubles.
Después de una purificación, por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrófuga, cromatografía de exclusión de tamaño y/o purificación de Resource Q, la CHI puede aislarse para caracterización (en la fig. 7 se muestran a manera de ejemplo los resultados de las etapas individuales de purificación después de expresión del vector pET28b_CHI en E.coli).
En el contexto de las investigaciones propias se obtuvieron los valores mencionados en la tabla 1:
Tabla 1: Caracterización de la actividad enzimática de la después de la expresión del vector pET28b_CHI en
E. coli
KM [μmol/l]
Vmax [U/mg] kcat [s-1] kcat / KM [l*mol-1*s1]
36,83
107,3 416+,7 1,13 * 107
Ejemplo 4: Caracterización (adicional) de las enzimas expresadas CHI y ERED
Las tablas en las figuras 4 y 5 muestran resultados (adicionales) de la caracterización de las enzimas expresadas CHI y ERED (provenientes de E. ramulus DSM 16296 en caso de conversión anaeróbica (cf. antes)).
Las enzimas CHI y ERED (provenientes de E. ramulus DSM 16296) se colocaron por separado para la expresión en un sistema de vector adecuado en E. coli para la expresión (cf. antes). A continuación su actividad puede determinarse por medio de HPLC después de adicionar naringenina a un medio de cultivo definido.
Los valores de la tabla en la Fig. 4 muestran como función del tiempo la formación de floretina (con una reducción de la concentración de naringenina), lo cual indica la actividad de las enzimas CHI y ERED.
Los valores de la tabla en la figura 5 muestran resultados (adicionales respecto de la actividad de chalconaisomerasa de la CHI expresada, obtenidos mediante determinación fotométrica (a 368 nm) en conexión con la degradación de naringeninchalcona (en floretina).
En el contexto de una determinación foto métrica, para seguir estudiando la actividad de CHI, como función del tiempo pudo observarse la reducción de la concentración de naringenina-chalcona en un extracto crudo de proteína libre de células, con pH regulador. Un ensayo de control (plásmido sin CHI) no produjo una reducción de la naringeninachalcona como sustancia marcadora.
Ejemplo 5: Resultados de ensayos de expresión (comparativos) con E. ramulus
E. ramulus (DSMZ 16296) fue cultivado de acuerdo con Herles et al. (Arch Microbiol (2004) 181 : 428-434) en condiciones anaeróbicas en el medio ST. Para su preparación 9 g de peptona de carne tratada con tríptico, 1 g de peptona, 3 g de extracto de carne, 4 g de extracto de levadura, 6 g de glucosa, 3 g de cloruro de sodio, 2 g de hidrofosfato disódico, 0,5 ml de Tween 80, 0,25 g de cistina, 0,25 g de cisteína -HCl, 0,1 g de sulfato de magnesio hepahidrato, 5 mg de sulfato de hierro -heptahidrato y 3,4 mg de sulfato de manganeso dihidrato se ajustaron a pH 7,0, se completaron hasta 1 L con agua destilada y a continuación se sometieron a autoclave durante 15 minutos a 121 °C.
Los cultivos se realizaron tanto en un reactor clásico de acero con agitador, como también en reactores de bolsa con sistema Wipp en condiciones anóxicas, en cuyo caso la temperatura se mantuvo a 37 °C y el pH a 7,0 con solución de ácido y solución alcalina (HCl y NaOH).
En una fermentación a modo de ejemplo se adicionaron al medio, antes de iniciar el cultivo, 275 mM de naringenina y el crecimiento así como la conversión del sustrato fueron determinados (véanse los resultados en la figura 10).
SEQ ID NO:1
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SEQ ID NO:4
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SEQ ID NO: 5
secuencia de dinucleótido optimizada con codón para la expresión de ERED en E. coli BL21, integrada en pET 22b, fue clonada con Nde1 y BamH1:
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Claims (1)

  1. imagen1
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