EP3870723A1 - Bereitstellung von malonyl-coa in coryneformen bakterien sowie verfahren zur herstellung von polyphenolen und polyketiden mit coryneformen bakterien - Google Patents
Bereitstellung von malonyl-coa in coryneformen bakterien sowie verfahren zur herstellung von polyphenolen und polyketiden mit coryneformen bakterienInfo
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- EP3870723A1 EP3870723A1 EP19816511.0A EP19816511A EP3870723A1 EP 3870723 A1 EP3870723 A1 EP 3870723A1 EP 19816511 A EP19816511 A EP 19816511A EP 3870723 A1 EP3870723 A1 EP 3870723A1
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine coryneforme Bakterienzelle mit einer gegenüber ihrem Urtyp erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA, ein Protein für eine Fettsäuresynthase FasB mit verminderter Funktionalität sowie die sie kodierende Nukleinsäuresequenz. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA sowie ein Verfahren zur Herstellung von Polyketiden oder Polyphenolen mit coryneformen Bakterienzellen sowie Verwendungen davon.
Description
Beschreibung
Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien sowie Verfahren zur Herstellung von Polyphenolen und Polyketiden mit coryneformen Bakterien
Die vorliegende Erfindung betrifft ein System für die Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Sekundärmetaboliten, wie z. B. Polyphenolen und Polyketiden mit coryneformen Bakterien.
Eine große Zahl verschiedenster Moleküle aus den Gruppen der Polyphenole (Stilbene, Flavonoide) und der Polyketide stellen wirtschaftlich interessante Sekundärmetabolite mit großem Potential für die pharmakologische Anwendung dar. Dem Stilben Resveratrol beispielsweise wird anti-Tumor, anti-bakterielle, anti-inflammatorische und anti-aging Wirkung vorausgesagt (Pangeni et al. 2014; https://doi.org/10.1517/17425247.2014.919253). Ebenfalls diskutiert wird die Wirkung in der Prävention von kardiovaskulären Erkrankungen. Ähnliche Effekte einschließlich anti-mutagene, anti-oxidative, anti-proliferative und anti atherogene Wirkung sind für Flavonoide, wie z.B. Naringenin oder dessen Derivate beschrieben (Erlund, 2004; https://doi.Org/10.1016/i. nutres.2004.07.005, Harbone, 2013; https://doi.Org/10.1007/978-1-4899-2915-0).
Allerdings bilden und akkumulieren die natürlichen Produzenten dieser Substanzen (Pflanze, Pilze, Bakterien) entweder nur sehr geringe Produktmengen, oder lassen sich schwer oder gar nicht kultivieren. Insbesondere die Extraktion aus Pflanzen ist wirtschaftlich uninteressant. Eine mikrobielle Produktion pharmakologisch und/oder biotechnologisch interessanter Polyphenole und/oder Polyketide im großtechnischen Maßstab ist daher wünschenswert.
Die Herstellung von Sekundärmetaboliten mit dem Bakterium E. coli und der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist beschrieben (Xu et al; 2011 , https://doi.Org/10.1016/i.vmben.2011.06.008; Li et al; 2016, https://doi.org/ 10.1038/srep36827). Allerdings sind große Bedenken zur Sicherheit beim Einsatz von E. coli für die Produktion solcher komplexen Sekundärmetoabolite und insbesondere deren Einsatz in der Medizin bekannt. Daher ist der Einsatz eines GRAS-Mikroorganismus (Generally Recognized As Safe), der zudem bereits eine industriell bewährte Zellfabrik darstellt, sehr wünschenswert. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher ein System und
Verfahren zur mikrobiellen, großtechnischen Herstellung von Molekülen aus den Gruppen der Polyphenole (Stilbene, Flavonoide) und der Polyketide mit coryneformen Bakterien, die als GRAS eingestuft sind, zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es durch gezielte Stammkonstruktion einen genau charakterisierten Bakterienstamm zur Verfügung zu stellen, der die bekannten Nachteile übenwindet.
Ein entscheidender Baustein für die Synthese der Polyphenole oder Polyketide ist Malonyl- CoA. Während für Vertreter der Gruppe der Flavonoide und Stilbene 3 Mol Malonyl-CoA / mol Produkt benötigt werden, werden Polyketide fast ausschließlich auf Basis von Malonyl- CoA Einheiten aufgebaut. Malonyl-CoA ist ein zentrales Intermediat im Stoffwechsel von Bakterien, der nicht durch die Zellmembran transportiert werden kann, sodass eine extrazelluläre Zufütterung in einem mikrobiellen Herstellprozess nicht möglich ist. Zwar wird Malonyl-CoA durch Carboxylierung von Acetyl-CoA, dem Endprodukt der Glykolyse, in Bakterienzellen gebildet, allerdings setzen Mikroorganismen Malonyl-CoA fast ausschließlich zur Fettsäuresynthese um, was einer erhöhten Bereitstellung entgegensteht. Außerdem stellt die Fettsäuresynthese eine sehr kostenintensive Synthese für die Zelle dar, so dass folglich die Synthese von Malonyl-CoA streng reguliert ist.
Ein indirektes Mittel zur Erhöhung der intrazellulären Konzentration von Malonyl-CoA in Mikroorganismen ist beispielsweise die Zugabe von Inhibitoren der Fettsäuresynthese, wie z. B. Cerulenin. Die Herstellung von Resveratrol mit Corynebacterium glutamicum ist auch bei Kallscheuer et al. (2016, https://doi.Org/10.1016/j.ymben.2016.06.003) beschreiben. Auch hier wird Cerulenin zu Hemmung der Fettsäuresynthese eingesetzt, um die Bildung von Resveratrol zu erreichen. Ein wesentlicher Nachteil der Cerulenin-Zugabe ist allerdings, dass die Zellen nach der Zugabe von Cerulenin ihr Wachstum komplett einstellen. Dies wiederum ist negativ für die Malonyl-CoA-Bereitstellung in der Zelle, die nur bei Wachstum stattfindet.
Cerulenin ist ein Antibiotikum, das selektiv die Fettsäuresynthese irreversibel inhibiert (Omura et al; 1976; PMID 791237). Durch diese Hemmung wird Malonyl-CoA nicht mehr für die endogene Synthese von Fettsäuren verbraucht und könnte für eine anderweitige Umsetzung, wie z.B. zur Synthese von Sekundärmetaboliten zur Verfügung stehen. Allerdings ist Cerulenin sehr teuer und wäre daher für den Einsatz in einem großtechnisch bzw. industriell interessanten mikrobiellen Herstellungsverfahren wenig geeignet. Ein viel wesentlicher Nachteil von Cerulenin ist ferner, dass die Zellen durch die Hemmung der Fettsäuresynthese extrem in ihrem Wachstum gehemmt werden und in der Regel nach kurzer Zeit (eine Zellteilung) schließlich gar nicht mehr wachsen können. Der Einsatz von Cerulenin in einem mikrobiellen bzw. biotechnologischen Herstellungsverfahren stellt daher
mit Blick auf die hohen Kosten und nicht weiter optimierbaren Ausbeuten bedingt durch Zelltod keine sinnvolle wirtschaftliche Alternative dar. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit in der Bereitstellung eines Systems und Verfahrens zur Steigerung der Konzentration des zentralen Metaboliten Malonyl-CoA in corynformen Bakterien, welche von der Zugabe von Cerulenin unabhängig ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wirtschaftlich interessantes System bereitzustellen, welches für die biotechnologische Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien geeignet ist und bei dem das Wachstum der Zellen unbeeinflusst bleibt bzw. nicht negativ beeinflusst wird oder gar zum Erliegen kommt.
Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Eingriffe in den Stoffwechsel des Zellsystems coryneformer Bakterien zu vermeiden, die weitreichend Undefinierte physiologische Auswirkungen haben können, wie es zum Beispiel der Fall ist, wenn ein oder mehrere zentral agierende Regulatoren (wie z. B. das Regulatorprotein FasR) ausgeschaltet sind, die Einfluss auf eine Vielzahl von Genen oder Proteinen in einer Zelle ausüben. Somit ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines gezielt erstellten und genau definierten Zellsystems und eines oder mehrerer definierter, homologer Strukturelemente, die eine mikrobielle Herstellung von Malonyl-CoA mit nicht-rekombinanten coryneformen Bakterien (non-GVO) ermöglichen und gleichzeitig bekannte Nachteile überwinden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von wirtschaftlich interessanten Sekundärmetaboliten, wie z. B. Molekülen aus den Gruppen der Polyphenole (Stilbene, Flavonoide) und der Polyketide, in coryneformen Bakterien bereitzustellen, bei dem die bekannten Nachteile überwunden werden.
Diese Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung, wie nachfolgend ausgeführt, in vorteilhafter Weise gelöst.
Es folgt zunächst die kurze Beschreibung der vorliegenden Erfindung, ohne dass der Ge genstand der Erfindung dadurch limitiert wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine coryneforme Bakterienzelle mit einer gegenüber ihrem Urtyp erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA bei die die Regulation und/oder Expression der Gene, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend fasB, gltA, accBC
und accD1 , und/oder die Funktionalität der durch sie kodierten Enzyme gezielt modifiziert ist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfasst eine coryneforme Bakterienzelle, die eine oder mehrere gezielte Modifikationen aufweist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) Verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB; b) Mutation oder teilweise oder komplette Deletion des für die Fettsäuresynthase kodierende Gen fasB; c) Verminderte Funktionalität des mit dem Citratsynthase-Gen gtIA operativ- verknüpften Promotors; d) Verminderte Expression des für die Citratsynthase CS kodierende Gens gltA; e) Verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität der Operator-Bindestellen (fasO) für den Regulator FasR in den Promotorbereichen der Gene accBC und accD1 kodierend für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten; f) Dereprimierte Expression der für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten kodierenden Gene accBC und accD1 ; g) eine oder mehrere Kombinationen aus a) - f).
Erfindungsgemäß umfasst ist somit auch eine coryneforme Bakterienzelle, bei der die Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB vermindert oder ausgeschaltet ist und/oder das für die Fettsäuresynthase kodierende Gen fasB gezielt mutiert, bevorzugt durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, oder teilweise oder komplett deletiert ist.
Erfindungsgemäß auch umfasst ist eine coryneforme Bakterienzelle, bei der die Expression des für die Citratsynthase kodierende Gens gltA durch Mutation, bevorzugt mehrere Nukleotidsubstitutionen, des operativ-verknüpften Promotors vermindert ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, bei der die Funktionalität der Operator-Bindestellen (fasO) für den Regulator FasR in den Promotorbereichen der Gene accBC und accD1 kodierend für die Acetyl-CoA-Carboxylase- Untereinheiten, bevorzugt durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, vermindert oder ausgeschaltet ist und die Expression der für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten kodierenden Gene accBC und accD1 dereprimiert, bevorzugt gesteigert, ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, die eine Kombination aus verminderter Expression und/oder Aktivität der Citratsynthase (CS) und deregulierter, gesteigerter, Expression und/oder Aktivität der Acetyl-
CoA-Carboxylase-Untereinheiten (AccBC und AccD1) aufweist.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, die eine Kombination aus verminderter Expression und/oder Aktivität der Citratsynthase (CS) und deregulierter, gesteigerter, Expression und/oder Aktivität der Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten (AccBC und AccD1) und verminderter oder ausgeschalteter Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB aufweist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle zur Herstellung von Polyphenolen oder Polyketiden, die Modifikationen der vorgenannten Art aufweist und bei der zusätzlich der katabole Stoffwechselweg von aromatischen Komponenten, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Phenylpropanoide und Benzoesäure-Derivate, ausgeschaltet ist.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, die zusätzlich Gene kodierend für eine feedback-resistente 3-Deoxy-D-Arabinoheptulosonat-7-Phosphat- Synthase (aroH), bevorzugt aus E. coli, und für eine Tyrosinammonium-Lyase (tal), bevorzugt aus Flavobacterium johnsoniae, aufweist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle der zuvor genannten Art, die zusätzlich aus Pflanzen abgeleiteten Enzyme oder die sie kodierenden Gene für die Polyphenol- oder Polyketid-Synthese aufweist.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei der coryneformen Bakterienzelle um die Gattung ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium und Brevibacterium, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, besonders bevorzugt Corynebacterium glutamicum ATCC13032 oder deren gezielt gentechnisch veränderten Varianten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien mit den zuvor genannten coryneformen Bakterien sowie ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Polyphenolen oder Polyketiden in coryneformen Bakterien. Erfindungsgemäß sind die Verfahren unabhängig von der Zugabe von Cerulenin.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien, sowie die Verwendung einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle zur Herstellung von Polyphenolen oder Polyketiden mit coryneformen Bakterien.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine Zusammensetzung enthaltend Sekundärmetabolite
ausgewählt aus der Gruppe der Polyphenole und Polyketide, bevorzugt der Stilbene, Flavonoide und Polyketide, besonders bevorzugt Resveratrol, Naringenin und Noreugenin, hergestellt mit einer erfindungsgemäßen coryneformen oder einem erfindungsgemäßen Verfahren. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung einer zuvor genannten erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Herstellung von Pharmazeutika, Lebensmitteln, Futtermitteln, und/oder zum Einsatz in der Pflanzenphysiologie.
Nachfolgend wird der Gegenstand der Erfindung durch Beispiele und anhand von Figuren näher erläutert, ohne dass der Gegenstand der Erfindung dadurch limitiert wird. Der Beschreibung der Ausführungsbeispiele sind einige Definitionen vorangestellt, die für das Verständnis der vorliegenden Erfindung wichtig sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine coryneforme Bakterienzelle mit einer gegenüber ihrem Urtyp erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA bei die die Regulation und/oder Expression der Gene, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend fasB, gltA, accBC und accD1 , und/oder die Funktionalität der durch sie kodierten Enzyme gezielt modifiziert ist.
Erfindungsgemäß umfasst ist somit eine coryneforme Bakterienzelle, die eine oder mehrere gezielte Modifikationen aufweist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) Verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB; b) Mutation oder teilweise oder komplette Deletion des für die Fettsäuresynthase kodierende Gen fasB; c) Verminderte Funktionalität des mit dem Citratsynthase-Gen gtIA operativ- verknüpften Promotors; d) Verminderte Expression des für die Citratsynthase CS kodierende Gens gltA; e) Verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität der Operator-Bindestellen (fasO) für den Regulator FasR in den Promotorbereichen der Gene accBC und accD1 kodierend für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten; f) Dereprimierte Expression der für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten kodierenden Gene accBC und accD1 ;
g) eine oder mehrere Kombinationen aus a) - f).
Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, bei der die Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB vermindert oder ausgeschaltet ist und/oder das für die Fettsäuresynthase kodierende Gen fasB gezielt mutiert, bevorzugt durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, oder teilweise oder komplett deletiert ist.
Erfindungsgemäß ebenfalls umfasst ist eine coryneforme Bakterienzelle, bei der die Expression des für die Citratsynthase kodierende Gens gltA durch Mutation, bevorzugt mehrere Nukleotidsubstitutionen, des operativ-verknüpften Promotors vermindert ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, bei der die Funktionalität der Operator-Bindestellen (fasO) für den Regulator FasR in den Promotorbereichen der Gene accBC und accD1 kodierend für die Acetyl-CoA-Carboxylase- Untereinheiten, bevorzugt durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, vermindert oder ausgeschaltet ist und die Expression der für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten kodierenden Gene accBC und accD1 dereprimiert, bevorzugt gesteigert, ist.
Mutationen der /äsO-Bindestelle vor accBC und accD1 sind bekannt (Nickel et al., 2010; https://doi.Org/10.1111/j.1365-2958.2010.07337.x). Hier sind Mutationen der fasO- Bindestelle beschrieben, die zu einem Verlust der Bindung des Fettsäuresynthese- Regulators FasR führen. Im Falle von accBC liegt die /asO-Bindestelle upstream des accBC- Gens, sodass die Mutation von (Nickel et al., 2010) übernommen werden konnte. Im Fall von accD1 überlappen der Leserahmen und die /asO-Bindestelle (Figur 23; ATG in der linken, grau-hinterlegten Box ist das Startcodon von accD1). Eine Mutation in diesem Bereich ist daher nicht möglich, da hier sonst das Startcodon mutiert werden würde. Da durch die Mutation auch kein alternatives Startcodon (GTG oder TTG) gebildet wird, ist eine Translation nicht möglich mit der Folge, dass keine AccD1 -Untereinheit und somit keine funktionsfähige Acetyl-CoA Carboxylase-Aktivität vorliegt. Dies hat weiter zur Folge, dass kein Malonyl-CoA gebildet werden kann und die Zellen vermutlich letal oder stark verkrüppelt sind. Somit sind die Mutationen nach Nickel et al. für die vorliegende Erfindung nicht geeignet.
Erfindungsgemäß wird eine neue fasO-Bindestelle 5‘- operativ-verknüpft vor dem accD1-Gen coryneformer Bakterien zur Verfügung gestellt. Diese zeichnet sich in vorteilhafter Weise dadurch aus, dass sie unter Berücksichtigung der Aminosäuresequenz und der bestmöglichen Codonverwendung in coryneformen Bakterien eine maximale Abweichung von der nativen fasO Sequenz: MTISSPX aufweist (Figur 23). Dabei liegen in der fasO-
Bindestelle vor accBC an den Positionen 1 1-13 (tga -> gtc) und 20-22 (cct -> aag) Nukleotidsubstitutionen vor. In der fasO-Bindestelle vor accD1 liegen an den Positionen 20- 24 (cctca -> gtacg) Nukleotidsubstitutionen vor. In einer Variante der vorliegenden Erfindung weisen die erfindungsgemäßen fasO-Bindestellen vor den Genen accBD bzw. accD1 eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 bzw. 15 auf.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, die eine Kombination aus verminderter Expression und/oder Aktivität der Citratsynthase (CS) und deregulierter, gesteigerter, Expression und/oder Aktivität der Acetyl- CoA-Carboxylase-Untereinheiten (AccBC und AccDI) aufweist.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, die eine Kombination aus verminderter Expression und/oder Aktivität der Citratsynthase (CS) und deregulierter, gesteigerter, Expression und/oder Aktivität der Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten (AccBC und AccD1) und verminderter oder ausgeschalteter Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB aufweist.
Dabei zeichnet sich eine erfindungsgemäße coryneforme Bakterienzelle insbesondere dadurch aus, dass gezielt der Anabolismus von Malonyl-CoA gesteigert ist und gleichzeitig das Wachstum der Zelle unbeeinflusst ist. Eine solche coryneforme Bakterienzelle ist bislang nicht beschrieben. Herkömmlicherweise wird zur Steigerung der Malonyl-CoA-Konzentration in der Zelle der katabolen Stoffwechsels von Malonyl-CoA ausgeschaltet, was jedoch den negativen Effekt mit sich bringt, dass die Zellen nicht mehr wachsen können. Beschrieben ist dies in vielfältiger Weise z. B. durch die Zugabe von Cerulenin. Mangelndes Wachstum beeinflusst jedoch die streng kontrollierte Malonyl-CoA-Bereitstellung negativ, d.h. es wird weniger Malonyl-CoA bereitgestellt, was sich somit als kontrapoduktiv erweist. Die vorliegende Erfindung überwindet solche Nachteile in vorteilhafter Weise.
Der Begriff „Urtyp“ ist im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl der„Wildtyp“ einer coryneformen Bakterienzelle zu verstehen, der z. B. ein genetisch nicht verändertes Ausgangsgen oder Ausgangsenzym bereitstellt, als auch direkte Abkömmlinge davon. Bevorzugt sind coryneforme Wildtypzellen der Gattung Corynbacterium oder Brevibacterium; besonders bevorzugt sind coryneforme Bakterienzellen des Wildtyps Corynebacterium glutamicum; ganz besonders bevorzugt sind coryneforme Bakterienzellen des Wildtyps Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Unter dem Begriff „Urtyp“ fallen erfindungsgemäß somit neben dem„Wildtyp“ auch gezielt abgeleitete, exakt definierte und
genau charakterisierte „Abkömmlinge“ des Wildtyps. Die „Abkömmlinge“ weisen dabei Veränderungen auf, die mittels molekularbiologischer Methoden gezielt, gerichtet und kontrolliert erfolgt sind und bei denen es sich um homologe, nicht-rekombinante Veränderungen handelt, wie z. B. Nukleotidsubstitutionen oder Deletionen oder die Anpassung Heterologe Nukleinsäure Sequenzen an die Codonverwendung (codon-usage) des Wildtyps. Der resultierende Abkömmling ist physiologisch genau charakterisiert und trägt keine heterologen Nukleinsäure Sequenzen; weder chromosomal-kodiert noch plasmid- kodiert. Als Beispiel für einen „Urtyp“ im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine coryneforme Bakterienzelle des Wildtyps genannt, bei der die Gene verantwortlich für den Abbau aromatischer Komponenten aus dem Genom deletiert sind. Neben Deletionen sind auch gezielte Nukleotidsubstitutionen im Genom denkbar, durch die der Wildtyp genetisch ein homologer, nicht-rekombinanter Organismus bleibt. Dieses Beispiel ist nicht limitierend für die vorliegende Erfindung auszulegen. Da es sich erfindungsgemäß um gezielte Nukleotidaustausche des gleichen, homologen Wirtsorganismus handelt, ist der resultierende Organismus erfindungsgemäß nicht-rekombinant verändert. Unter„homolog“ im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die erfindungsgemäßen Enzyme und die sie kodierenden erfindungsgemäßen Nukleinsäure Sequenzen und die erfindungsgemäßen mit diesen regulatorisch-verknüpften nicht-kodierenden Nukleinsäure Sequenzen verwandtschaftlich von einem gemeinsamen Ausgangsstamm coryneformer Bakterienzellen abstammen. „Homolog“ wird erfindungsgemäß synonym benutzt mit dem Begriff „nicht heterolog“. Ein erfindungsgemäßer „Urtyp“ ist genetisch und physiologisch exakt charakterisiert, homolog, nicht-rekombinant und kann mit dem „Wildtyp“ gleichgesetzt werden. Die Begriffe „Wildtyp“, „Abkömmlinge“ und „Urtyp“ werden erfindungsgemäß synonym verwendet.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich eine„verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität“ beispielsweise sowohl auf die Funktionalität der erfindungsgemäßen Fettsäuresynthase FasB auf Proteinebene als auch auf die sie kodierende erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz. „Funktionalität“ umfasst somit allgemein die Funktion eines Proteins oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, die beispielsweise durch Nukleotidsubstitution oder Deletion vermindert oder ausgeschaltet sein kann. Die„Funktionalität“ umfasst somit auch die Aktivität eines Proteins, die verändert sein kann, wie beispielsweise vermindert oder ausgeschaltet. Die veränderte Aktivität eines Proteins kann dabei erfindungsgemäß sowohl Veränderungen im aktiven, katalytischen Zentrum als auch regulatorischen Zentrum umfassen. Diese Varianten sind erfindungsgemäß ebenfalls umfasst.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist eine coryneforme Bakterienzelle umfasst, die
sich dadurch auszeichnet, dass sie eine modifizierte Funktionalität eines Enzyms und/oder der kodierenden Nukleinsäuresequenz und/oder einer operativ-verknüpften, regulatorischen, nicht-kodierenden Nukleinsäuresequenz aufweist. Eine weitere Variante einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle zeichnet sich dadurch aus, dass die Modifikation auf Veränderungen beruht, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) Veränderung der Regulation oder von Signalstrukturen zur Genexpression, b) Veränderung der Transkriptionsaktivität der kodierenden Nukleinsäuresequenz, oder c) Veränderung der kodierenden Nukleinsäuresequenz. Erfindungsgemäß umfasst sind dabei beispielsweise Veränderung der Signalstrukturen der Genexpression, wie beispielsweise durch Veränderung der Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren; Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, des Startkodons, Terminatoren. Ebenso umfasst sind das Einfuhren eines stärkeren oder schwächeren Promoters oder eines induzierbaren Promotors in das Genom der erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle oder Deletionen oder Nukleotidsubstitutionen in kodierenden oder nicht-kodierenden Bereichen, wobei die molekularbiologischen Methoden dem Fachmann bekannt sind. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine coryneforme Bakterienzelle bei der die Veränderungen chromosomal-kodiert im Genom vorliegen oder extrachromosomal, d.h. Vektor-kodiert oder Plasmid-kodiert, vorliegen. Erfindungsgemäß eignen sich als Plasmide solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al. , Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKExI (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold- Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891 ) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden (O. Kirchner 2003, J. Biotechnol. 104:287-99). Ebenso können Vektoren mit regulierbarer Expression benutzt werden, wie zum Beispiel pEKEx2 (B. Eikmanns, 1991 Gene 102:93-8; O. Kirchner 2003, J. Biotechnol. 104:287-99) oder pEKEx3 (Gande, R. ; Dover, L.G. ; Krumbach, K. ; Besra, G.S. ; Sahm, H. ; Oikawa, T. ; Eggeling, L, 2007. “The two carboxylases of Corynebacterium glutamicum essential for fatty acid and mycolic acid synthesis.” Journal of Bacteriology, 189 (14), 5257- 5264. https://doi.Org/10.1128/JB 00254-07). Auch kann das Gen durch Integration in das Chromosom in einfacher Kopie (P. Vasicova 1999, J. Bacteriol. 181 :6188-91), oder mehrfacher Kopie (D. Reinscheid 1994 Appl. Environ Microbiol 60:126-132) exprimiert werden. Die Transformation des gewünschten Stammes mit einem Vektor erfolgt durch Konjugation oder Elektroporation des gewünschten Stammes von beispielsweise C. glutamicum. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology (1994) 60:756-759) beschrieben. Methoden zur Transformation
sind beispielsweise bei Tauch et al. (FEMS Microbiological Leiters (1994)123:343-347) beschrieben.
Neben erfindungsgemäß bevorzugten partiellen oder kompletten Deletionen kodierender Nukleinsäure Sequenzen und/oder regulatorischer Strukturen sind erfindungsgemäß auch Veränderungen, wie z. B. Transitionen, Transversionen oder Insertionen umfasst, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Veränderungen können bekannten Lehrbüchern (R. Knippers„Molekulare Genetik“, 8. Auflage, 2001 , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland) entnommen werden. Bevorzugt sind erfindungsgemäß Nukleinsäuresubstitutionen oder Deletionen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich eine„verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität“ nicht nur auf die Funktionalität eines Gens oder Proteins, sondern auch auf eine veränderte Funktionalität von Regulator-Bindungsstellen, wie z. B. die Operatorbindestelle fasO, an die normalerweise ein zentral-agierendes Regulator-Protein, wie z. B. fasR bindet, und wodurch die Expression der kodierenden Nukleinsäuresequenz reprimiert wird.„Vermindert“ oder„ausgeschaltet“ im Sinne der vorliegenden Erfindung meint somit auch, dass die Expression der kodierenden Nukleinsäuresequenz im Vergleich zur Situation in einer Wildtyp- oder Urtyp-Wirtszelle im Sinne der Erfindung schlechter erfolgt oder nicht mehr unter der Expressionskontrolle des Regulators steht. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist „vermindert“ oder „ausgeschaltet“, gleichbedeutend für „dereguliert“ oder „dereprimiert“ zu versehen. Eine „dereprimierte Funktionalität“ einer Regulator-Bindestelle kann somit im Sinne der Erfindung auch zu einer erhöhten Expression des betreffenden, nachfolgenden Gens führen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich eine„verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität“ auch auf eine veränderte Funktionalität von Promotorbereichen in der 5‘- regulatorischen Region vor einem kodierenden Gen. Veränderungen der„Funktionalität“ können die Aktivität des Promotors verstärkten oder aber auch vermindern. In einer erfindungsgemäßen Variante wird ein Promotor, wie z. B. vor dem Gen gtIA kodierend für die Citratsynthase in seiner Funktion und damit Aktivität vermindert. Dies hat zur Folge, dass das durch diesen Promotor kodierte Gen schwächer exprimiert wird. Die Regulationsmechanismen und ihre Auswirkungen bei Veränderung sind dem Fachmann in allen Varianten vertraut.
Die vorliegende Erfindung meint mit dem Begriff „Modifikation“ eine „Veränderung“ beispielsweise auch„genetische Veränderung“, wobei erfindungsgemäß gemeint ist, dass zwar eine gentechnische Methode angewandt wird, aber keine Insertionen von Nukleinsäuremolekülen erzeugt werden. Im Sinne der Erfindung sind mit„Modifikationen“
oder „Veränderungen“ Substitutionen und/oder Deletionen gemeint, bevorzugt Substitutionen.„Modifikation“„.Veränderung“ oder„genetische Veränderung“ im Sinne der vorliegenden Erfindung werden auch in einem regulatorischen, nicht-kodierenden Bereich der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren erzeugt. Es sind alle denkbaren Positionen in einem regulatorischen Bereich kodierender Gene oder Gen-Cluster im Sinne der Erfindung gemeint und umfasst, deren Veränderungen eine messbare Auswirkung auf die Funktionalität der fasO-Bindungsstellen und fasR-Bindung, im Sinne von„vermindert“ oder„ausgeschaltet“, hat.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Protein kodierend für eine Fettsäuresynthase FasB isoliert aus coryneformen Bakterien, deren Funktionalität vermindert oder ausgeschaltet ist und mit der eine erhöhte Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien ermöglicht wird, die Aminosäuresequenz wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe enthaltend SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 und 10 oder Fragmenten oder Allelen davon aufweist. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine Fettsäuresynthase FasB mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe enthaltend SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 und 10 oder Fragmenten oder Allelen davon. Ferner ist eine Fettsäuresynthase kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz enthaltend wenigstens 70% Identität zu der Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmente davon erfindungsgemäß umfasst. Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Fettsäuresynthase kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmente davon.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch Proteine kodierend für eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 75 oder 80%, bevorzugt wenigstens 81 , 82, 83, 84, 85 oder 86% Identität, be- sonders bevorzugt 87, 88, 89, 90 % Identität, ganz besonders bevorzugt wenigstens 91 , 92, 93, 94, 95 % Identität oder höchst bevorzugt 96, 97, 98, 99 oder 100% Identität zu der Ami- nosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 und 10 oder Fragmenten oder Allelen davon. Im Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Fettsäuresynthase FasB enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 und 10 oder Fragmente oder Allele da- von.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Fettsäure-Synthase FasB aus coryneformen Bakterien, deren Funktionalität vermindert oder ausgeschaltet ist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: a) eine Nukleinsäuresequenz enthaltend wenigstens 70% Identität zu der Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmente davon,
b) eine Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer komplementären Sequenz einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmenten davon hybridisiert, c) eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmente davon, oder d) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Fettsäure-Synthase FasB entsprechend jeder der Nukleinsäuren gemäß a) - c) , die sich jedoch von diesen Nukleinsäure Sequenzen gemäß a) - c) durch die Degeneriertheit des genetischen Codes oder funktionsneutrale Mutationen unterscheidet, zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Fettsäuresynthase FasB kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz enthaltend wenigstens 70% Identität zu der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmente davon. Erfindungsgemäß umfasst sind auch Nukleinsäure Sequenzen, welche wenigstens eine 75% oder 80%, bevorzugt wenigstens 81 , 82, 83, 84, 85 oder 86% Identität, besonders bevorzugt 87, 88, 89, 90 % Identität, ganz besonders bevorzugt wenigstens 91 , 92, 93, 94, 95 % Identität oder höchst bevorzugt 96, 97, 98, 99 oder 100% Identität zu der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmenten davon aufweist. Im Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Fettsäuresynthase FasB kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmente davon.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, die ein Protein kodierend für eine Fettsäuresynthase FasB mit verminderter oder ausgeschalteter Funktionalität aufweist bzw. eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Fettsäuresynthase FasB mit der zuvor benannten veränderten Funktionalität.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle umfasst, die eine oder mehrere gezielte Modifikationen aufweist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) Verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB mit wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe enthaltend SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 und 10 oder Fragmenten oder Allelen davon;
b) Mutation oder teilweise oder komplette Deletion des für die Fettsäuresynthase kodierende Gen fasB mit einer Nukleinsäuresequenz enthaltend wenigstens 70% Identität zu der Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmente davon; c) Verminderte Funktionalität des mit dem Citratsynthase-Gen gltA operativverknüpften Promotors gemäß SEQ ID NO. 11 ; d) Verminderte Expression des für die Citratsynthase (CS) kodierende Gens gltA; e) Verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität der Operator-Bindestellen (fasO) für den Regulator FasR in den Promotorbereichen der Gene accBC und accD1 kodierend für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten gemäß SEQ ID NO. 13 und 15; f) Dereprimierte Expression der für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten kodierenden Gene accBC und accD1 ; g) eine oder mehrere Kombinationen aus a) - f).
In Varianten der vorliegenden Erfindung sind auch Proteine der Fettsäuresynthase FasB aus coryneformen Bakterien und/oder Nukleinsäure Sequenzen kodierend eine Fettsäuresynthase FasB aus coryneformen Bakterien umfasst, bei denen Nukleotidsubstitutionen und entsprechend korrespondierende Aminsäureaustausche vorliegen. Solche Varianten sind in den Ausführungsbeispielen erläutert, die sich aber nicht limitierend auf die vorliegende Erfindung auswirken.
In Varianten der vorliegenden Erfindung ist auch der mit dem Citratsynthase-Gen gltA operativ-verknüpfte Promotor in seiner Funktionalität vermindert. Dazu können erfindungsgemäß Nukelotidsubstitutionen in den für die Bindung der Polymerase verantwortlichen Bindestellen erfolgen, oder ein Austausch einer gesamten Promotorsequenz eines schwächeren Promotors gegen die natürlicherweise vorkommende Promotorsequenz erfolgen, oder eine Kombination aus beiden, wobei ein schwächerer Promotor zusätzlich durch Nukleotidsubstitution weiter abgeschwächt wird. Da es sich erfindungsgemäß um gezielte Nukleotidaustausche des gleichen, homologen Wirtsorganismus handelt, ist der resultierende Organismus erfindungsgemäß nicht- rekombinant verändert.
Unter„homolog“ im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die erfindungsgemäßen En- zyme und die sie kodierenden erfindungsgemäßen Nukleinsäure Sequenzen und die erfin-
dungsgemäßen mit diesen regulatorisch-verknüpften nicht-kodierenden Nukleinsäure Se quenzen verwandtschaftlich von einem gemeinsamen Ausgangsstamm coryneformer Bakte rienzellen abstammen.„Homolog“ wird erfindungsgemäß synonym benutzt mit dem Begriff „nicht heterolog“.
Der Begriff „Nukleinsäuresequenz“ im Sinne der vorliegenden Erfindung meint jede homologe molekulare Einheit, die genetische Information transportiert. Dies betrifft entsprechend ein homologes Gen, bevorzugt ein natürlicherweise vorkommendes und/oder nicht-rekombinantes homologes Gen, ein homologes Transgen oder Codon-optimierte homologe Gene. Der Begriff„Nukleinsäuresequenz“ bezieht sich erfindungsgemäß auf eine Nukleinsäuresequenz oder Fragmente oder Allele davon, die ein spezifisches Protein kodiert bzw. exprimiert. Bevorzugt bezieht sich der Begriff „Nukleinsäuresequenz“ auf eine Nukleinsäuresequenz enthaltend regulatorische Sequenzen, die der kodierenden Sequenz vorangehen (upstream, stromaufwärts, 5’-nicht-kodierende Sequenz) und nachfolgen (downstream, stromabwärts, 3'-nicht-kodierende Sequenz). Der Begriff „natürlicherweise vorkommendes“ Gen betrifft ein in der Natur gefundenes Gen, z.B. aus einem Wildtyp- Stamm einer coryneformen Bakterienzelle, mit seinen eigenen regulatorischen Sequenzen.
Der Begriff „operativ-verknüpfter Bereich“ betrifft im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Assoziation von Nukleinsäure Sequenzen auf einem einzelnen Nukleinsäure-Fragment, so dass die Funktion der einen Nukleinsäuresequenz durch die Funktion der anderen Nukleinsäuresequenz beeinflusst ist. Im Kontext eines Promotors oder einer Bindungsstelle für ein Regulator-Protein meint der Begriff„operativ-verknüpft“ im Sinne der Erfindung, dass die kodierende Sequenz unter der Kontrolle der regulatorischen Region (insbesondere des Promotors oder der Regulator-Bindestelle) steht, die die Expression der kodierenden Sequenz reguliert.
Erfindungsgemäß wird auch eine neue fasO-Bindestelle 5‘- operativ-verknüpft vor dem accD1~Gen coryneformer Bakterien zur Verfügung gestellt. In Varianten der vorliegenden Erfindung ist auch eine verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität der Operator- Bindestellen (fasO) für den Regulator FasR in den Promotorbereichen der Gene accBC und accD1 kodierend für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten umfasst. Diese zeichnet sich in vorteilhafter Weise dadurch aus, dass sie unter Berücksichtigung der Aminosäuresequenz und der bestmöglichen Codonverwendung in coryneformen Bakterien eine maximale Abweichung von der nativen fasO Sequenz: MTISSPX aufweist (Figur 23). Dabei liegen in der fasO-Bindestelle vor accBC an den Positionen 1 1-13 (tga -> gtc) und 20- 22 (cct -> aag) Nukleotidsubstitutionen vor. In der fasO-Bindestelle vor accD1 liegen an den Positionen 20-24 (cctca -> gtacg) Nukleotidsubstitutionen vor.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch eine Nukleinsäuresequenz für eine operativ-verknüpfte fasO-Bindestelle im regulatorischen, nicht-kodierenden Bereich 5' vor dem accD1-Gen aus coryneformen Bakterien, die Nukleotidsubstitutionen gemäß SEQ ID NO. 15 aufweist. Aufgrund der in ihrer Funktionalität veränderten fasO-Bindestelle ist eine Bindung des FasR-Regulatorproteins nicht mehr möglich und führt zu einer Deregulation der Expression des accD1-Gens, resultierend in einer gesteigerten Expression der Untereinheit accD1. In Kombination mit einer erfindungsgemäßen deregulierten, d.h. gesteigerten, Expression der Untereinheit accBC führt dies erfindungsgemäß zu einer erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, bei der die erfindungsgemäßen Modifikationen in vorteilhafter Weise chromosomal-kodiert vorliegen. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, die nicht-rekombinant (non-GVO) ist.
Unter dem Begriff„nicht-rekombinant“ ist im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verstehen, dass das genetische Material der erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzellen lediglich so verändert ist, wie es auf natürliche Weise, z.B. durch natürliche Rekombination oder natürliche Mutation, entstehen könnte. Die erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzellen zeichnen sich somit als nicht-gentechnisch veränderter Organismus (non- GVO) aus.
Dies eröffnet auch die Möglichkeit, industriell interessante Produktionsstämme coryneformer Bakterien weiter zu optimieren, ohne rekombinantes oder heterologes Genmaterial in die Zelle einbringen zu müssen. Die vorliegende Erfindung stellt somit ein System bereit, mit dem die mikrobielle Produktion von Malonyl-CoA deutlich einfacher, stabiler, preiswerter und wirtschaftlicher durchgeführt werden kann. Denn alle bislang bekannten Bakterienstämme mit einer Malonyl-CoA-Synthesekapazität benötigen komplexe Medien für ihr Wachstum, wodurch die Kultivierung deutlich aufwendiger, teurer und damit unwirtschaftlicher wird. Hier sei vor allem der Zusatz von Inhibitoren der Fettsäuresynthese, wie z. B. Cerulenin, genannt, das sehr teuer ist und somit für den Einsatz in einem großtechnischen Herstellungsverfahren nicht geeignet ist. Außerdem sind alle bisher beschriebenen Malonyl-CoA-Produzenten keine GRAS-Organismen. Dadurch entsteht ein Nachteil für die Verwendung in bestimmten industriellen Bereichen (z. B. Lebensmittel- und Pharmaindustrie) infolge aufwändiger Genehmigungsverfahren.
Die erfindungsgemäße coryneforme Bakterienzelle bietet eine Vielzahl von Vorteilen, von denen eine Auswahl nachfolgend beschrieben wird. Bei coryneformen Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium, handelt es sich um einen„Generally Recognized As Safe“
(GRAS)-Organismus, welcher in allen industriellen Bereichen eingesetzt werden kann. Coryneforme Bakterien erreichen auf definierten Medien hohe Wachstumsraten und Biomasseerträge (Grünberger et al. , 2012) und es existiert umfangreiche Erfahrung im industriellen Einsatz coryneformer Bakterien (Becker et al., 2012).
Erfindungsgemäß sind coryneforme Bakterien der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium umfasst. Erfindungsgemäße Variante coryneformer Bakterien sind ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium und Brevibacterium, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, besonders bevorzugt Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum oder Brevibacterium divaricatum. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine coryneforme Bakterienzelle ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium glutamicum ATCC13032 oder gezielt veränderten Abkömmlingen oder Urtypen, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine coryneforme Bakterienzelle mit einer oder mehrerer der zuvor genannten erfindungsgemäßen Modifikationen ausgehend von Corynebacterium glutamicum, bevorzugt Corynebacterium glutamicum ATCC13032, bei der außerdem zusätzlich der katabole Stoffwechselweg von aromatischen Komponenten, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Phenylpropanoide und Benzoesäure-Derivate, ausgeschaltet ist.
Weitere erfindungsgemäße Varianten einer coryneformen Bakterienzelle zeichnet sich dadurch aus, dass die Funktionalität und/oder Aktivität der Enzyme oder die Expression der sie kodierenden Gene beteiligt am katabolen Stoffwechselweg von aromatischen Komponenten durch Deletionen der Gencluster cg0344-47 (phdBCDE-Operon ), cg2625-40 (cat, ben und pca), cg1226 ( pobA ) und cg0502 ( qsuB ) ausgeschaltet sind. Diese erfindungsgemäßen Zellen sind zielgerichtet verändert und nicht durch ungezielte Mutagenese entstanden. Sie zeichnen sich in vorteilhafter Weise dadurch aus, dass sie genetisch genau charakterisiert sind und die genannten Modifikationen durch Deletionen erzielt werden. Diese Deletionen liegen erfindungsgemäß chromosomal-kodiert vor. Somit weisen diese Zellen ausschließlich homologe DNA auf und sie sind nicht-rekombinant verändert. Dies zeichnet sie, zusätzlich zu der Eigenschaft zu den GRAS-Organismus zu zählen, in vorteilhafter Weise für eine mikrobielle Herstellung von Produkten, wie z. B.
sekundären Pflanzenmetaboliten, aus. Denn die erfindungsgemäße coryneforme Bakterienzelle ist in vorteilhafter Weise auch dadurch charakterisiert, dass sie zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA keine extrachromosomale DNA, wie z. B. Plasmide oder Vekoren, benötigt. Erstens sind Bakterien-Stämme mit mehr als 2 Plasmiden oder mehr als 2 Genen pro Plasmid in der Regel nicht stabil, zweitens muss bedacht werden, dass die erfindungsgemäß umfasste mikrobielle Herstellung von komplexen Sekundärmetaboliten in Bakterien eine heterologe Expression der entsprechenden pflanzlichen Gene zur Polyphenol- und/oder Polyketid-Herstellung erfordert und drittens sollten diese gewünschten Produkte oder ihre Vorstufen nicht durch zelleigene Aktivitäten, wie z.B. den enzymatischen Abbau aromatischer Komponenten, wieder zersetzt werden. Daher ist eine weitere, sehr komplexe Aufgabe der vorliegenden Erfindung, nämlich ein System für die erhöhte Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien bereitzustellen, ohne plasmid- kodierte Veränderungen vornehmen zu müssen und dabei gleichzeitig den Abbau der gewünschten Aromaten-enthaltende Produkte und deren Vorstufen in coryneformen Bakterien zu unterbinden, in sehr vorteilhafter Weise durch die erfindungsgemäßen corynformen Bakterienzellen gelöst. Dieses erfindungsgemäß sehr vorteilhafte System einer coryneformen Bakterienzelle erlaubt so große Freiheitsgrade, welche pflanzlichen oder anderen heterologen Gene extrachromosomal in das System eingebracht werden können, um so eine stabile, mikrobielle Herstellung von pflanzlichen Sekundärmetaboliten zu ermöglichen.
Gegenstand der vorliegenden ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, die sich dadurch auszeichnet, dass sie unabhängig von der Zugabe von Fettsäuresynthese-Inhibitoren eine erhöhte intrazelluläre Konzentration an Malonyl-CoA bereitstellt. Diese erhöhte Bereitstellung von Malonyl-CoA als zentralem Intermediat kann erfindungsgemäß zur Herstellung von Produkten genutzt werden, für deren Synthese eine erhöhte Konzentration an Malonyl-CoA erforderliche ist, wie z. B. die Fettsäure-Synthese oder die Synthese von Sekundärmetaboliten aus Pflanzen, wie Polyphenole oder Polyketide.
Gegenstand der vorliegenden ist auch coryneforme Bakterienzelle zur Herstellung von Polyphenolen oder Polyketiden, die erfindungsgemäße Modifikationen der zuvor genannten Art aufweist und bei der zusätzlich der katabole Stoffwechselweg von aromatischen Komponenten, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Phenylpropanoide und Benzoesäure-Derivate, ausgeschaltet ist. Coryneforme Bakterien weisen einen eigenen Stoffwechselweg zum Abbau von Phenylpropanoide oder Benzoesäure-Derivaten auf (Kallscheuer et al. , 2016; https://doi.org/10.1007/s00253-015-7165-1). Für die Herstellung von Polyketiden oder Polyphenolen mit coryneformen Bakterien wäre dies kontraproduktiv. Erfindungsgemäß wird dazu eine coryneforme Bakterienzelle bereitgestellt, die eine erhöhte
Bereitstellung von Malonyl-CoA ermöglicht und die sich zusätzlich dadurch auszeichnet, dass die Funktionalität und/oder Aktivität der Enzyme oder die Expression der sie kodierenden Gene, beteiligt am katabolen Stoffwechselweg von aromatischen Komponenten, durch Deletionen der Gencluster cg0344-47 (phdBCDE- Operon), cg2625-40 (' cat , ben und pca), cg 1226 ( pobA ) und cg0502 ( qsuB ) ausgeschaltet sind. Diese erfindungsgemäßen Zellen sind zielgerichtet verändert und nicht durch ungezielte Mutagenese entstanden. Sie zeichnen sich in vorteilhafter Weise dadurch aus, dass sie genetisch genau charakterisiert sind und die genannten Modifikationen durch Deletionen erzielt werden. Diese Deletionen liegen erfindungsgemäß chromosomal-kodiert vor. Somit weisen diese Zellen ausschließlich homologe DNA auf und sie sind nicht-rekombinant verändert. Dies zeichnet sie, zusätzlich zu der Eigenschaft zu den GRAS-Organismus zu zählen, in vorteilhafter Weise für eine mikrobielle Herstellung von Produkten, wie z. B. sekundären Pflanzenmetaboliten, aus. Denn die erfindungsgemäße coryneforme Bakterienzelle ist in vorteilhafter Weise auch dadurch charakterisiert, dass sie zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA und zur Vermeidung des Abbaus aromatischer Komponenten keine extrachromosomale DNA, wie z. B. Plasmide oder Vekoren, benötigt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, die, zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Modifikationen der zuvor genannten Art, die aus Pflanzen abgeleiteten Enzyme oder die sie kodierenden Gene für die Polyphenol- oder Polyketid-Synthese aufweist. In einer Varianten der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle umfasst, die die aus Pflanzen abgeleiteten Gene zur Polyphenol- oder Polyketid-Produktion, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend die Gene 4cl, sts, chs, chi und pcs, aufweist.
Die erfindungsgemäße coryneforme Bakterienzelle mit den auf zuvor beschriebene Art erfindungsgemäß ausgewiesenen Eigenschaften zeichnet sich in vorteilhafter weise dadurch aus, dass sie die Synthese von Polyketiden aus 5 Malonyl-CoA-Einheiten durchführen kann. Die Synthese von Polyphenolen kann ebenfalls mit der erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle der zuvor beschriebenen Art erfolgen, wobei eine Supplementation des entsprechenden Kulturmediums mit einer Polyphenol-Vorstufe, wie z. B. p-Cumarsäure, die Umsetzung von Malonyl-CoA zu Stilbenen oder Flavonoiden begünstigt. Ausgehend von Glukose als Kohlenstoffquelle benötigt die erfindungsgemäße coryneforme Baktienzelle die Enzyme 3-Deoxy-D-Arabinoheptulosonat-7-Phosphat-Synthase und Tyrosinammonium- Lyase kodiert durch die Gene aroH bzw. tal.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle umfasst, die Gene kodierend für eine feedback-resistente 3-Deoxy-D-Arabinoheptulosonat-7- Phosphat-Synthase (aroH), bevorzugt aus E. coli, und für eine Tyrosinammonium-Lyase (tal),
bevorzugt aus Flavobacertium johnsoniae, aufweist.
Bei dem Enzym 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase Aktivität (PCS) handelt es sich um eine Typ III Polyketidsynthase (EC 2.3.1.216, UniProt Q58VP7, (Abe et al. , 2005; https://doi.org/10.1021/ja0431206). Die PCS aus Aloe arborescens ist durch das pcs-Gen kodiert und als EC 2.3.1.216, UniProt Q58VP7 annotiert. Als vermeintliche Funktion ist die katalytische Aktivität zur Synthese von Noreugenin aus fünf Molekülen Malonyl-CoA be- schrieben. Erfindungsgemäß wurde das pcs-Gen aus Aloe arborescens mittels C. glutami- cum Codonverwendung synthetisiert und für die Klonierung und Transformation von erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzellen verwendet. Allerdings konnten mit der resul- tierenden coryneformen Bakterienzelle lediglich kleinste Spuren von Noreugenin detektiert werden. Das heißt, das etablierte Enzym PCS aus Aloe arborescens und das sie kodierende psc-Gen kann in seiner annotierten Funktion in coryneformen Bakterienzellen nicht bestätigt werden. Somit ist die annotierte 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase Aktivität (PCS) (EC 2.3.1.216, UniProt Q58VP7) für den erfindungsgemäßen Einsatz in coryneformen Bakte rienzellen nicht geeignet.
Durch die Isolierung und Bereitstellung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, kodierend für eine 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase (PCSSh0rt), mit gesteigerter Aktivität in coryneformen Bakterien wird ein weiteres Strukturelement verfügbar gemacht, mit dessen Hilfe in vorteilhafter Weise pflanzliche Sekundärmetabolite in coryneformen Bakterien hergestellt werden können. Dabei weist die erfindungsgemäße 5,7-Dihdroxy-2- Methylchromon-Synthase (PCSSh0rt) eine um 10 N-terminale Aminosäuren verkürzte Amino säuresequenz auf. Das resultierende Plasmid pMKEx2-pcs \aC8-short kann in jeden der zuvor beschriebenen C. glutamicum Stämme transformiert werden, wobei nach entsprechender Kultivierung und Probennahmen die Produktbildung analysiert wird. Beispielhaft wird das Plasmid in den C. glutamicum Stamm DelAro4-4c/PcCg-C7-mu/asO transformiert. Der resul tierende Stamm C. glutamicum DelAro4-4c/PcCg-C7-mu/asO pMKEx2-pcs iacg-short wird unter Standardbedingungen (CGXII + 4 % Glucose, 1 mM IPTG, 30 °C, 130 RPM, 72 h) kultiviert und die entnommenen Proben werden mittels LC-MS (siehe oben) auf Produktbildung analysiert. Mit dem Plasmid pMKEx2 -pcsshortAaCg kann unter Standardbedingungen eine deut lich gesteigerte Funktionalität sowie eine deutliche Produktbildung von Noreugenin gezeigt werden. Eine erfindungsgemäße 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase-Variante (PCSshon) und die sie kodierende Nukleinsäuresequenz pcsShort sind bislang nicht bekannt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Protein mit einer gesteigerten 5,7- Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase-Aktivität (PCSshort) in einer der zuvor beschriebenen
erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzellen zur Synthese von Polyketiden in coryne- formen Bakterien, wobei die Aminosäuresequenz wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 20 oder Fragmenten oder Allelen davon aufweist. In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist eine 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase um fasst, enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 20 oder Fragmenten oder Allelen davon. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon- Synthase kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz enthaltend wenigstens 70% Identität zu der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 19 oder Fragmente davon. In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist eine 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase umfasst, ko diert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 19 oder Fragmente davon.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäuresequenz (pcsshort) umfasst, kodierend für eine 5,7-Dihydroxy-2-Methylchromon-Synthase mit gesteigerter Aktivität zur Polyketid-Herstellung in coryneformen Bakterien ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: a) eine Nukleinsäuresequenz enthaltend wenigstens 70% Identität zu der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 19 oder Fragmente davon, b) eine Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer komplementären Sequenz einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 19 oder Fragmenten davon hybridisiert, c) eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 19 oder Fragmenten davon, oder d) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine 5,7-Dihydroxy-2- Methylchromon-Synthase (PCSShort) entsprechend jeder der Nukleinsäuren gemäß a) - c), die an die Codonverwendung coryneformer Bakterien angepasst ist, oder e) die sich von diesen Nukleinsäure Sequenzen gemäß a) - d) durch die Degeneriertheit des genetischen Codes oder funktionsneutrale Mutationen unterscheidet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle der zuvor beschriebenen Art, die ein Protein mit einer gesteigerten 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon- Synthase-Aktivität (PCSsh0rt) und/oder eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine 5,7- Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase (PCSsh0rt) mit gesteigerter Aktivität in coryneformen Bakterien aufweist. In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist auch ein Protein mit einer gesteigerten 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase-Aktivität (PCSshort) mit wenigstens
70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 20 oder Fragmente oder Allele davon umfasst. Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung umfasst auch ein Protein mit einer gesteigerten 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase-Aktivität (PCSsh0rt) gemäß SEQ ID NO. 20.
Alle aus Pflanzen oder anderen heterologen Systemen abgeleiteten Gene, wie z.B. aroH, tal und/oder die Gene für die Polyphenol-Synthese, bevorzugt die Stilben- und/oder Flavonoid- Synthese, besonders zu nennen die Gene sts, chs, chi oder die Gene für die Polyketid- Synthese, bevorzugt pcsSh0rt, wurden für die Expression in coryneformen Bakterien an die bakterielle Codonverwendung (codon-usage) dieser coryneformen Bakterien, bevorzugt der von Corynebacterium glutamicum, angepasst und optimiert. Der Anteil Heterologe Nukleinsäure Sequenzen wird dadurch erfindungsgemäß reduziert und die Expression in coryneformen Bakterienzellen in vorteilhafter Weise unterstützt.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle der zuvor genannten Art umfasst, bei der die pflanzlichen Gene unter der Expressionskontrolle eines induzierbaren Promotors vorliegen. In einer weiteren Variante liegt erfindungsgemäß ein mit IPTG-induzierbaren Promotor, bevorzugt der Promotor T7, vor.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist eine erfindungsgemäße coryneforme Bakterienzelle umfasst, bei der das Gen 4cl kodierend für die 4-Cumarat-CoA-Ligase (4CL) unter der Expressionskontrolle eines induzierbaren Promotors vorliegt, wobei der induzierbare Promotor und das damit regulativ-verknüpfte Gen in das Genom der coryneformen Bakterienzelle integriert wurde, d.h. chromosomal-kodiert vorliegt. In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung wird ein mit IPTG-induzierbaren Promotor, bevorzugt der Promotor T7, eingesetzt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch extrachromosomale Systeme, wie Vektoren oder Plasmide, mit den erforderlichen Eigenschaften für die Expression der benötigten Gene zur Synthese von Polyphenolen oder Polyketiden. In Varianten der vorliegenden Erfindung unterliegen die plasmid- bzw. vektor-kodierten Gene einem induzierbaren Promotor, bevorzugt einem mit IPTG-induzierbaren Promotor, bevorzugt dem Promotor T7. Der Einsatz eines induzierbaren Promotors hat erfindungsgemäß den Vorteil, dass die Expression der für die Sekundärmetabolite erforderlichen Gene gezielt gesteuert, d.h. angeschaltet werden können, in Abhängigkeit von den Wachstums- bzw. Kultivierungsbedingungen der erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzellen. Die erfindungsgemäßen corynformen Bakterienzellen der zuvor beschriebenen Art können so zunächst zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA kultiviert werden, welches dann nach gezielter Induktion der Expression der erforderlichen Gene weiter zu den gewünschten
Produkten umgesetzt wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine coryneforme Bakterienzelle, die Gene aufweist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) 4cl und sts für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Stilbene, besonders bevorzugt Resveratrol, oder b) chs und chi für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Flavonoide, besonders bevorzugt Naringenin, oder c) pcsshort für die Synthese von Polyketiden, bevorzugt Noreugenin, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, bevorzugt eines mit IPTG-induzierbaren Promotors, besonders bevorzugt des T7-Promotors.
Wie zuvor erwähnt, zeichnet sich die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise dadurch aus, dass die Gene oder mit ihnen regulatorisch-verknüpfte Bereiche zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA in das Genom der erfindungsgemäßen Zellen integriert ist, also chromosomal-kodiert vorliegen. Dies schafft Freiheitsgrade, um weitere heterologe Gene plasmid-kodiert in die Zellen einzubringen, ohne die Zelle zu überfordern. Die bekannten Nachteile, dass bakterielle Zellen mit mehr als 2 Plasmiden nicht stabil vermehrt werden können oder der große Nachteil, dass Plasmide mit mehr als 2 heterologen Genen in der Regel kein zufriedenstellendes Ergebnis hinsichtlich der Stabilität oder Expression hervorbringen, wird durch das erfindungsgemäß sehr vorteilhafte System einer coryneformen Bakterienzelle überwunden. Durch seinen Aufbau bietet es große Freiheitsgrade, welche pflanzlichen oder anderen heterologen Gene extrachromosomal in das System eingebracht werden können, um so eine stabile, mikrobielle Herstellung von pflanzlichen Sekundärmetaboliten ausgehend von Malonyl-CoA zu ermöglichen.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung liegt eine coryneforme Bakterienzelle vor, die Gene aufweist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) fasB und/oder gltA und/oder accBCDI , deren Funktionalität und/oder Expression für eine erhöhte Bereitstellung von Malonyl-CoA gezielt modifiziert ist, und b) cg0344-47 (phdBCDE- Operon), cg2625-40 ( cat , ben und pca), cg 1226 ( pobA ) und cg0502 ( qsuB ) deren Funktionalität für den Abbau aromatischer Komponenten, bevorzugt aus der Gruppe enthaltend Phenylpropanoide oder Benzoesäure-Derivate, ausgeschaltet ist, und
c) pcSshort kodierend für ein Protein mit einer gesteigerten 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon- Synthase-Aktivität (PCSsh0rt) für die Synthese von Polyketiden, bevorzugt Noreugenin, oder d) optional aroH und tal für die Vorstufen-Synthese von Polyphenolen ausgehend von Glukose, und e) 4cl und sts für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Stilbene, besonders bevorzugt Resveratrol, oder f) chs und chi für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Flavonoide, besonders bevorzugt Naringenin. In Varianten einer erfindungsgemäßen Bakterienzelle liegen die erfindungsgemäßen Gene bzw. die mit ihnen operativ-verknüpften regulatorischen Bereiche aus a) und b) im Genom kodiert vor. Die Gene bzw. die mit ihnen operativ-verknüpften regulatorischen Bereiche aus c) - f) liegen plasmid-kodiert vor. Erfindungsgemäß sind hierbei zur Herstellung von Polyketiden, bevorzugt Noreugenin, Kombinationen denkbar, wie z. B. mit Varianten von fasB (Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und Acg0344-47 {phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und pcsshort; mit gtIA und Acg0344-47 {phdBCDE-Opero ) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und pcssh0rt; mit gtIA und accBCDI und Acg0344-47 {phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und pcsShort; mit Varianten von fasB (Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und gtIA und accBCDI und Acg0344-47 {phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und pcsshort-
Zur Herstellung von Polyphenolen, bevorzugt Stilbene, weiter bevorzugt Resveratrol, sind Kombinationen denkbar, wie z. B. mit Varianten von fasB (Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und Acg0344-47 (phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 ( cat , ben und pca) und Acg1226 (poM) und Acg0502 ( qsuB ) und aroH und tal und 4cl und sts; mit gtIA und Acg0344-47 {phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und aroH und tal und 4cl und sts; mit gtIA und accBCDI und Acg0344- 47 {phdBCDE-Operon ) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und aroH und tal und 4cl und sts; mit Varianten von fasB
(Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und gtIA und accBCDI und Acg0344-47 {phdBCDE-Operon) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und aroH und tal und 4cl und sts. Diese zuvor genannten Variante erlauben die Herstellung der Polyphenole ausgehend von Glukose aufgrund der Expression der Gene
aroH und tal. Die Gene aroH und tal sind allerdings nicht erforderlich für eine mit der Vorstufe p-Cumarsäure supplementierte Kultivierung der erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle. Erfindungsgemäße Varianten der zuvor genannten coryneformen Bakterienzelle weisen dann die Gene aroH und tal nicht auf.
Zur Herstellung von Polyphenolen, bevorzugt Flavonoide, weiter bevorzugt Naringenin, sind Kombinationen denkbar, wie z. B. mit Varianten von fasB (Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und Acg0344-47 ( phdBCDE-Operon ) und Acg2625-40 ( cat , ben und pca) und Acg1226 (pobA) und Acg0502 ( qsuB ) und aroH und tal und chs und chi; mit gtIA und Acg0344-47 {phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 (cat, ben und pca) und Acg1226 (pobA) und Acg0502 ( qsuB ) und aroH und tal und chs und chi; mit gtIA und accBCDI und Acg0344-47 (phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 (cat, ben und pca) und Acg1226 (pobA) und Acg0502 (qsuB) und aroH und tal und chs und chi; mit Varianten von fasB (Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und gtIA und accBCDI und Acg0344-47 (phdBCDE-Operon) und Acg2625-40 (cat, ben und pca) und Acg1226 (pobA) und Acg0502 (qsuB) und aroH und tal und chs und chi. Diese zuvor genannten Variante erlauben die Herstellung der Polyphenole ausgehend von Glukose aufgrund der Expression der Gene aroH und tal. Die Gene aroH und tal sind allerdings nicht erforderlich für eine mit der Vorstufe p-Cumarsäure supplementierte Kultivierung der erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle. Erfindungsgemäße Varianten der zuvor genannten coryneformen Bakterienzelle weisen dann die Gene aroH und tal gegebenenfalls nicht auf.
In weiteren Varianten der vorliegenden Erfindung liegt eine coryneforme Bakterienzelle der zuvor genannten Art mit den zuvor genannten Variationen an Genkombinationen vor, die Gene aufweist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) fasB-Gen gemäß einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe enthaltend SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7, und 9 oder Fragmenten davon, kodierend für Fettsäuresynthasen FasB ausgewählt aus der Gruppe enthaltend SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, und 10 oder Fragmenten oder Allelen davon und/oder gltA-Gen mit operativ-verknüpfter Promotorregion gemäß SEQ ID NO. 11 und/oder accBCDI -Gencluster mit operativ-verknüpften fasO- Bindestellen ausgewählt aus der Gruppe enthaltend SEQ ID NO. 13 und 15, deren Funktionalität und/oder Expression für eine erhöhte Bereitstellung von Malonyl-CoA gezielt modifiziert ist, und b) cg0344-47 (phdBCDE- Operon), cg2625-40 (cat, ben und pca), cg 1226 (pobA) und cg0502 (qsuB) deren Funktionalität für den Abbau aromatischer Komponenten, bevorzugt aus der Gruppe enthaltend Phenylpropanoide oder Benzoesäure-Derivate, ausgeschaltet ist, und
c) pcSshort gemäß SEQ ID NO. 19 kodierend für ein Protein mit einer gesteigerten 5,7- Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase-Aktivität (PCSshort) gemäß SEQ ID NO: 20 oder Fragmente oder Allele davon für die Synthese von Polyketiden, bevorzugt Noreugenin, oder d) optional aroH gemäß SEQ ID NO. 30 oder Fragmente oder Allele davon, und tal gemäß SEQ ID NO: 32 oder Fragmente oder Allele davon, für die Vorstufen-Synthese von Polyphenolen ausgehend von Glukose, und e) 4cl gemäß SEQ ID NO. 22 oder Fragmente oder Allele davon, und sts gemäß SEQ ID 24 oder Fragmente oder Allele davon, für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Stilbene, besonders bevorzugt Resveratrol, oder f) chs gemäß SEQ ID NO. 26 oder Fragmente oder Allele davon, und chi gemäß SEQ ID NO. 28 oder Fragmente oder Allele davon, für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Flavonoide, besonders bevorzugt Naringenin.
Diese genannten Varianten sind Gegenstand der Erfindung ohne dass die Erfindung dadurch limitiert wird. Diese Beschreibung dient dem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien enthaltend die Schritte: a) Bereitstellen einer Lösung enthaltend Wasser und eine C6-Kohlenstoff-Quelle; b) mikrobielle Umsetzung der C6-Kohlenstoffquelle in einer Lösung gemäß Schritt a) zu Malonyl-CoA in Anwesenheit einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle bei der die Regulation und/oder Expression der Gene ausgewählt aus der Gruppe enthaltend fasB, gtIA, accBC und accD1 und/oder die Funktionalität der durch sie kodierten Enzyme gezielt modifiziert ist.
Unter „Lösung“ ist erfindungsgemäß gleichbedeutend zu verstehen „Medium“, „Kulturmedium“,„Kulturbrühe“ oder„Kulturlösung“. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist „mikrobiell“ gleichbedeutend zu verstehen mit„biotechnologisch“ oder„fermentative“. Unter „Umsetzung“ ist erfindungsgemäß gleichbedeutend zu verstehen „Verstoffwechslung“, „Metabolisierung“ oder „Kultivierung“. Unter „Aufbereitung“ ist erfindungsgemäß
gleichbedeutend zu verstehen„Abtrennung“,„Aufkonzentrierung“ oder„Aufreinigung“.
Das zu verwendende Kulturmedium sollte in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch “Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Neben Glukose als Ausgangssubstrat der Malonyl-CoA-Bereitstellung können als Kohlenstoffquelle Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische, Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium sollte weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden. Zur pH - Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure Verbindungen wie Salzsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z.B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren bei dem die Kultivierung diskontinuierlich oder kontinuierlich, bevorzugt im batch-, fed-batch-, repeated-fed-batch- oder kontinuierlichen Modus erfolgt.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA erfolgt die mikrobielle Umsetzung der C6-Kohlenstoffquelle in einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterien enthaltend eine der erfindungsgemäß beschriebenen Varianten von fasB, bei der die Fettsäuresynthase FasB vermindert oder ausgeschaltet ist und/oder das für die Fettsäuresynthase kodierende Gen fasB gezielt mutiert, bevorzugt durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, oder teilweise oder komplett deletiert ist.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA erfolgt die mikrobielle Umsetzung der C6-Kohlenstoffquelle in einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle enthaltend ein erfindungsgemäß für die Citratsynthase kodierendes Gens gltA, das durch Mutation, bevorzugt mehrere Nukleotidsubstitutionen, des operativ-verknüpften Promotors in seiner Expression vermindert ist.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA erfolgt die mikrobielle Umsetzung der C6-Kohlenstoffquelle in einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle enthaltend die erfindungsgemäßen Gene accBC und accD1 , bei der die Funktionalität der Operator-Bindestellen (fasO) für den Regulator FasR in den Promotorbereichen der Gene accBC und accD1 kodierend für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten, bevorzugt durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, vermindert oder ausgeschaltet ist und die Expression der für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten kodierenden Gene accBC und accD1 dereprimiert, bevorzugt gesteigert, ist.
In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA erfolgt die mikrobielle Umsetzung der C6-Kohlenstoffquelle in einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle, die eine Kombination aus verminderter Expression und/oder Aktivität der Citratsynthase (CS) und deregulierter, gesteigerter,
Expression und/oder Aktivität der Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten (AccBC und
AccD1 ) aufweist.
In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA erfolgt die mikrobielle Umsetzung der C6-Kohlenstoffquelle in einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle, die eine Kombination aus verminderter Expression und/oder Aktivität der Citratsynthase (CS) und deregulierter, gesteigerter,
Expression und/oder Aktivität der Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten (AccBC und
AccD1) und verminderter oder ausgeschalteter Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB aufweist.
In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA erfolgt die mikrobielle Umsetzung der C6-Kohlenstoffquelle in einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium. In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA erfolgt die mikrobielle Umsetzung der C6-Kohlenstoffquelle in einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium glutamicum, besonders bevorzugt Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum oder Brevibacterium divaricatum. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA erfolgt die mikrobielle Umsetzung der C6- Kohlenstoffquelle in einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle wie z. B. Corynebacterium glutamicum ATCC13032 oder gezielt veränderten Abkömmlingen oder Urtypen davon, wie z. B. Corynebacterium glutamicum ATCC13032 bei der außerdem zusätzlich der katabole Stoffwechselweg von aromatischen Komponenten, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Phenylpropanoide und Benzoesäure-Derivate, ausgeschaltet ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Polyphenolen oder Polyketiden in coryneformen Bakterien enthaltend die Schritte: a) Bereitstellen einer Lösung enthaltend Wasser und eine C6-Kohlenstoff-Quelle, b) mikrobielle Umsetzung der C6-Kohlenstoffquelle in einer Lösung gemäß Schritt a) zu Polyphenolen oder Polyketiden, in Anwesenheit einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle, wobei zunächst Malonyl-CoA in erhöhter Konzentration als Intermediat bereitgestellt und zur mikrobiellen Synthese von Polyphenolen oder Polyketiden weiter umgesetzt wird; c) Induktion der Expression Heterologe oder pflanzlicher Gene unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors durch Zugabe eines geeigneten Induktors in Schritt b), d) optional die Aufbereitung des gewünschten Produkts.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine coryneforme Bakterienzelle eingesetzt, die Gene aufweist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: a) fasB und/oder gltA und/oder accBCDI , deren Funktionalität und/oder Expression für
eine erhöhte Bereitstellung von Malonyl-CoA gezielt modifiziert ist, und b) cg0344-47 {phdBCDE- Operon), cg2625-40 ( cat , ben und pca), cg 1226 ( pobA ) und cg0502 ( qsuB ) deren Funktionalität für den Abbau aromatischer Komponenten, bevorzugt aus der Gruppe enthaltend Phenylpropanoide oder Benzoesäure-Derivate, ausgeschaltet ist, und c) pcsShort kodierend für ein Protein mit einer gesteigerten 5,7-Dihdroxy-2- Methylchromon-Synthase-Aktivität (PCSShort) für die Synthese von Polyketiden, bevorzugt Noreugenin oder d) aroH und tal für die Vorstufen-Synthese von Polyphenolen ausgehend von Glukose, und e) 4cl und sts für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Stilbene, besonders bevorzugt Resveratrol, oder f) chs und chi für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Flavonoide, besonders bevorzugt Naringenin.
Erfindungsgemäß sind hierbei zur Herstellung von Polyketiden, bevorzugt Noreugenin, Kombinationen denkbar, wie z. B. mit Varianten von fasB (Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und Acg0344-47 {phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und pcsshor1; oder mit gtIA und Acg0344-47 {phdBCDE-Operon) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und pcsshort; oder mit gtIA und accBCDI und Acg0344-47 {phdBCDE-Operon ) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und pcsSh0rt; oder mit Varianten von fasB (Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und gtIA und accBCDI und Acg0344-47 {phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und pcsshort.
Erfindungsgemäß sind zur Herstellung von Polyphenolen, bevorzugt Stilbene, weiter bevorzugt Resveratrol, sind Kombinationen denkbar, wie z. B. mit Varianten von fasB (Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und Acg0344-47 {phdBCDE-Opero ) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und aroH und tal und 4cl und sts; mit gtIA und Acg0344-47 {phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und aroH und tal und 4cl und sts; mit gtIA und accBCDI und Acg0344-47 {phdBCDE-Operon ) und Acg2625-40 {cat, ben und pca) und Acg1226 {pobA) und Acg0502 {qsuB) und aroH und tal und 4cl und sts; mit Varianten von fasB (Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und gtIA und accBCDI und Acg0344-
47 (phdBCDE-Operon ) und Acg2625-40 ( cat , ben und pca) und Acg1226 ( pobA ) und Acg0502 ( qsuB ) und aroH und tal und 4cl und sts. Diese zuvor genannten Variante erlauben die Herstellung der Polyphenole ausgehend von Glukose aufgrund der Expression der Gene aroH und tal. Die Gene aroH und tal sind allerdings nicht erforderlich für eine mit der Vorstufe p-Cumarsäure supplementierte Kultivierung der erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle. Erfindungsgemäße Varianten der zuvor genannten coryneformen Bakterienzelle weisen dann die Gene aroH und tal nicht auf oder die Expression dieser Gene wird nicht induziert.
Erfindungsgemäß sind zur Herstellung von Polyphenolen, bevorzugt Flavonoide, weiter bevorzugt Naringenin, Kombinationen denkbar, wie z. B. mit Varianten von fasB (Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und Acg0344-47 (phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 (cat, ben und pca) und Acg1226 ( pobA ) und Acg0502 ( qsuB ) und aroH und tal und chs und chi; mit gtIA und Acg0344-47 (phdBCDE-Operon) und Acg2625-40 (cat, ben und pca) und Acg1226 (pobA) und Acg0502 (qsuB) und aroH und tal und chs und chi; mit gtIA und accBCDI und Acg0344-47 (phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 (cat, ben und pca) und Acg1226 (pobA) und Acg0502 (qsuB) und aroH und tal und chs und chi; mit Varianten von fasB (Substitutionsmutanten oder Deletionsmutanten) und gtIA und accBCDI und Acg0344- 47 (phdBCDE- Operon) und Acg2625-40 (cat, ben und pca) und Acg1226 (pobA) und Acg0502 (qsuB) und aroH und tal und chs und chi. Diese zuvor genannten Variante erlauben die Herstellung der Polyphenole ausgehend von Glukose aufgrund der Expression der Gene aroH und tal. Die Gene aroH und tal sind allerdings nicht erforderlich für eine mit der Vorstufe p-Cumarsäure supplementierte Kultivierung der erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle. Erfindungsgemäße Varianten der zuvor genannten coryneformen Bakterienzelle weisen dann die Gene aroH und tal gegebenenfalls nicht auf.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Polyphenol-Herstellung wird die Lösung in Schritt b) mit der Polyphenol-Vorstufe, bevorzugt p-Cumarsäure, supplementiert.
Hierbei ist die Supplementation mit p-Cumarsäure in einer Konzentration von 1 - 10 mIVI, bevorzugt 2 - 8 mM, besonders bevorzugt 3 - 7 mM, ganz besonders bevorzugt 5 - 6 mM und insbesondere 5 mM sowie alle denkbaren Zwischenstufen geeignet.
Unter „Aufbereitung“ ist erfindungsgemäß gleichbedeutend zu verstehen „Abtrennung“, „Extraktion“, „Aufkonzentrierung“ oder„Aufreinigung“. Die Produktaufbereitung ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Polyketiden und Polyphenolen optional, da durch die vorteilhafte, gezielte Stammkonstruktion erfindungsgemäßer coryneformer
Bakterien die Produktion nur eines Sekundärmetaboliten erzielt wird, wie z. B. Resveratrol oder Naringenin oder Noreugenin. Dadurch ist in vorteilhafter Weise die Trennung mehrerer, verschiedener Produkte, wie z. B. Resveratrol und Naringenin, aus der Kulturlösung nicht erforderlich. Die ist ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung. Außerdem zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren in vorteilhafter Weise dadurch aus, dass es unabhängig von der Zugabe von Inhibitoren der Fettsäuresynthese, beispielsweise Cerulenin, ist. Eine weitere Extraktion, Aufbereitung der Zellen, Zellextrakte oder Zellüberstände sind dem Fachmann bekannt und können in bekannter Weise erfolgen.
In Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Kultivierung in einem diskontinuierlichen oder kontinuierlichen, bevorzugt batch-, fed-batch-, repeated-fed-batch- oder kontinuierlichen Modus. Die erforderlichen Vorgehensweisen zur Durchführung solcher Kultivierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle der zuvor beschriebenen Art und/oder eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Proteine und/oder einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Nukleotidsequenzen zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien.
Ebenso ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle und/oder eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Proteine und/oder einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Nukleotidsequenzen zur Polyketid- oder Polyphenol-Herstellung, bevorzugt zur Herstellung von Noreugenin oder zur Herstellung von Stilbenen, besonders bevorzugt Resveratrol, oder zur Herstellung von Flavonoiden, besonders bevorzugt Naringenin.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Zusammensetzung enthaltend Sekundärmetabolite ausgewählt aus der Gruppe der Polyphenole und Polyketide, bevorzugt der Stilbene, Flavonoide oder Polyketide, besonders bevorzugt Resveratrol, Naringenin und/oder Noreugenin, hergestellt mit einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle und/oder einem oder mehreren erfindungsgemäßen Proteinen und/oder einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Nukleotidsequenzen und/oder einem erfindungsgemäßen Verfahren der zuvor beschriebenen Art.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter die Verwendung von Resveratrol, Naringenin und/oder Noreugenin hergestellt mit einer erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzelle und/oder nach einem erfindungsgemäß Verfahren und/oder die Verwendung einer Zusammensetzung der zuvor beschriebenen Art zur Herstellung von Pharmazeutika, Lebensmitteln, Futtermitteln, und/oder zum Einsatz in der Pflanzenphysiologie. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weitere Stoffe aufweisen, die bei der Herstellung der gewünschten Produkte vorteilhaft sind. Eine Auswahl ist dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt.
Tabellen und Figuren:
Tabelle 1 zeigt eine Übersicht an Bakterienstämmen der vorliegenden Erfindung.
Tabelle 2 zeigt eine Übersicht an Plasmiden der vorliegenden Erfindung Tabelle 3 zeigt eine Übersicht der SEQ ID NO‘s der vorliegenden Erfindung.
Figur 1 zeigt Plasmid pK19mobsacB-fasß-E622 für die Aminosäuresubstitution E622K im fasß-Gen (cg2743), kodierend für eine Fettsäuresynthase FasB mit verminderter Funktionali- tät.
Figur 2 zeigt Plasmid pK19mobsacB-fasß-G1361 D für die Aminosäuresubstitution G1361 D im fasß-Gen (cg2743), kodierend für eine Fettsäuresynthase FasB mit verminderter Funktionalität.
Figur 3 zeigt Plasmid pK19mobsacB-fasß-G2153D, für die Aminosäuresubstitution G2153D im fasß-Gen (cg2743), kodierend für eine Fettsäuresynthase FasB mit verminderter Funktio nalität.
Figur 4 zeigt Plasmid pK19mobsacB-fasß-G2668S für die Aminosäuresubstitution G2668S im fasß-Gen (cg2743), kodierend für eine Fettsäuresynthase FasB mit verminderter Funktio- nalität.
Figur 5 zeigt Plasmid pK19mobsacB -AfasB für die in-frame Deletion von fasB (cg2743), für eine Fettsäuresynthase FasB deren Funktionalität ausgeschaltet ist.
Figur 6 zeigt Plasmid pK19mobsacB-P5/M::Ptiap/l-C7 für die chromosomale Integration des für C. glutamicum codon-optimierten Genes 4cl aus Petroselinum crispum unter Kontrolle des IPTG-induzierbaren T7-Promotors an den Deletionslocus Acg0344-47 (Acg 0344-47 ::P 7- 4clpcCg)·
Figur 7 zeigt Plasmid pK19mobsacB-mufasO-accßC zur Mutation der fasO-Bindestelle vor denen Genen accBC (cg0802), kodierend für eine AcetylCoA-Carboxylase-Untereinheit. Figur 8 zeigt Plasmid pK19mobsacB-mufasO-accD7 zur Mutation der fasO-Bindestelle vor dem Gen accD1 (cg0812), kodierend für eine AcetylCoA-Carboxylase-Untereinheit, unter Berücksichtigung des ATG-Startcodons und der Aminosäuresequenz von accD1.
Figur 9 zeigt Plasmid pMKEx2-stsAh-4dPc zur Expression der für C. glutamicum codon- optimierten Gene für eine Stilben Synthase ( sts ) aus Arachis hypogea und eine 4 Cumarat CoA Ligase {4c!) aus Petroselinum crispum unter Kontrolle des IPTG-induzierbaren T7- Promotors
Figur 10 zeigt Plasmid pMKEx2-chsPh-chiPhzur Expression der für C. glutamicum codon- optimierten Gene für eine Chalkon Synthase (chs) aus Petunia x hybrida und eine Chalkon Isomerase (chi) aus Petunia x hybrida unter Kontrolle des IPTG-induzierbaren T7-Promotors
Figur 11 zeigt Plasmid pMKEx2-pcsA3-short zur Expression einer verkürzten Variante des für C. glutamicum codon-optimierten Gens für eine Pentaketide Chromone Synthase (pcs) aus Aloe arborescens
Figur 12 zeigt Plasmid pK19mobsacB-cg0344-47-del mit dem das phdBCDE- Operon (cg0344-47), welches für Gene codiert, die am Katabolismus von Phenylpropanoiden betei- ligt sind, wie z. B. p-Cumarsäure, aus dem Genom deletiert wird.
Figur 13 zeigt Plasmid pK19mobsacB-cg2625-40-del mit dem die Gene cat, ben und pca (cg2625-40), die essentiell für den Abbau von 4-Hydroxybenzoat, Catechol, Benzoat und Protocatechuat sind, aus dem Genom deletiert werden.
Figur 14 zeigt Plasmid pK19mobsacB-Acg0344-47::PT7-4c/Pcfür die chromosomale Integrati on einer für C. glutamicum codon-optimierten Variante des 4cl- Gens aus Petroselinum cris- pum, unter Kontrolle des T7-Promotors (PT7-4C/Pc), an den Deletionslocus Dcg0344-47.
Figur 15 zeigt Plasmid pK19mobsacB-cg0502-del mit dem das Gen qsuB (cg0502), essenti- ell für die Akkumulation von Protocatechuat, aus dem Genom deletiert wird.
Figur 16 zeigt Plasmid pK19mobsacB-cg1226-del mit dem das Gen phobA (cg1226), kodie rend für 4-Hydroxybenzoate-3-Hydroxylase und essentiell für den Abbau von 4-Hydroxybenzoat, Catechol, Benzoat und Protocatechuat, aus dem Genom deletiert wird.
Figur 17 zeigt Plasmid pEKEx3-aro/-/£c-fa/Pcg mit denen Genen kodierend für eine feedbackresistente 3-Deoxy-D-Arabinoheptulosonat-7-Phosphat-Synthase (aroH), bevorzugt aus E. coli ( aroHEc ), sowie für eine and die Codonverwendung von C. glutamicum angepasste Tyro- sinammonium-Lyase (tal), bevorzugt aus Flavobacertium johnsoniae (talFj)· Diese Plasmid findet Einsatz bei der Synthese von Polyphenolen oder Polyketiden bei Wachstum ausge hend von Glukose.
Figur 18 zeigt Plasmid pMKEx2_sfS/u,_4c/Pc für die Expression der Gene sfs aus Arachis hypogea ( stsAh ) und 4c/ aus Petroselinum crispum (4c/Pc) in coryneformen Bakterienzellen.
Figur 19 zeigt Plasmid pMKEX2-cf/sP/,-c/i/' P/, für die Expression der Gene chs und chi aus Petunia x hybrida ( chsPh und chiph) in coryneformen Bakterienzellen.
Figur 20 zeigt Plasmid pMKEx2 _pcsAa für die Expression von pcs aus Aloe arborescens ( pcsAa ) mit Anpassung an die Codonverwendung von coryneformen Bakterienzellen.
Figur 21 zeigt Plasmid pMKEx2 _pcsAa- short für die Expression der Genvariante von pcs aus Aloe arborescens ( pcsAa ) in coryneformen Bakterienzellen.
Figur 22 zeigt einen Sequenz-Vergleich der nativen Promotor-Region PdaPA des C. glutami-
cum Wildtyp Gens mit dem erfindungsgemäßen PdapA-C7-Promotor, der den nativen gtlA- Promotor vor dem gtlA-Gen aus Corynebacterium glutamicum erfindungsgemäß ersetzt. Die erfindungsgemäße Promotorregion PgltA::PdapA-C7 weist neben dem Austausch der Pro- motorregion von gtIA (PgtIA) gegen den Promotor von dapA (PdapA) zusätzlich Nukleo- tidsubstitutionen an Position 95 (a->t) und 96 (g->a) vor dem Startcodon ATG von gtIA auf.
Figur 23 zeigt eine Übersicht über die fasO-Bindestellen 5'-operativ-verknüpft vor den Ge- nen accBC und accD1 mit erfindungsgemäßen Nukleotidsubstitutionen resultierend in einem Verlust der Bindung des fasR-Regulators und einer gesteigerten Funktionalität bzw. Expres- sion der accBCD1-Gene. Ferner ist eine Übersicht gezeigt über fasO-accD1 Sequenzen. Das accD1- Startcodon: unterstrichen (AS-Sequenz entsprechend ab hier translatiert), grau hinterlegt: konservierte Bereiche des fasO-Bindemotivs, die mutiert werden müssen, um eine FasR-Bindung zu verhindern rot: Unterschiede zur nativen Sequenz.
Figur 24 zeigt ein Diagramm mit Malonyl-CoA-Konzentrationen (gemessen in Form von mM Malonat) in erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzellen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch nicht limitierend sind:
Veränderung der regulatorischen Bindestelle im Promotorbereich der Citratsvnthase CS durch Nukleotidsubstitutionen zur Integration in das Genom coryneformer Bakterienzellen
Klonierung pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7
Zur Konstruktion des Plasmids pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 (Figur 6) wurde zunächst das Plasmid pK19mobsacB-A540 konstruiert. Hier wurden die flankierenden Bereiche so gewählt, dass ein 540 Basenpaar großes chromosomales Fragment, welches die native gltA Promotorregion mit den zwei Transkriptionsstart- und Operatorsequenzen trägt, deletiert werden kann. Zwischen die beiden Flanken up und down wurde ein 20 Basenpaar großer Linker eingefügt, der über die Schnittstellen Nsi\ und Xho\ verfügt. Über diese Schnittstellen wurde anschließend die C7-Variante des dapA-Promotors subkloniert.
Für die Klonierung von pK19mobsacB-A540 wurde das stromaufwärts gelegenen Fragment up mit dem Primerpaar PgltA-up-s / PgltA-up-as amplifiziert, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar PgltA-down-s / PgltA-down-as amplifiziert. Die Überprü- fung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gel- elektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequen zen der inneren Primer (PgltA-up-as / PgltA-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die bei- den amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten (inklusive des beschriebenen A/s/l/X/jol-Linkers. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte A540-fragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (PgltA-up-s / PgltA-down- as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Mutationsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion von pk19mobsacB-A540 wurden sowohl das generierte A540-Fragment als auch der pK19- mobsacB-Leervektor mit den FastDigest-V arianten (Thermo Fisher Scientific) der Restrikti onsenzyme Xba\ und Sma\ verdaut. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wur- den mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-KL (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation- Kit (Thermo Fis- her Scientific) wurde das Deletionsfragment in einem dreifachen molaren Überschuss ge-
genüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kom- petenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Ep- pendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wur- den 100 pl_ der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung von pk19mobsacB-A540 in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc. , Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zel- len der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolo- nie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese über- prüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung von pK19mobsacB- D540 hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolie rung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-KA (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizie- rungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Für die Konstruktion von pk19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 wurde die C7-Variante des dapA- Promotors mit dem Primerpaar PdapA-s / PdapA-as amplifiziert und auf die erwartete Ba- senpaargröße mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel überprüft. Das generierte Fragment wurde mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll gereinigt. Für die Konstruktion von pk19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 wurden sowohl das generierte PdapA-Fragment als auch der Zielvektor pk19mobsacB-A540 mit den FastDigest-V arianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Xho\ und Nsi\ verdaut. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation- Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das PdapA-Fragment in einem dreifachen molaren Über- schuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pk19mobsacB-A540 eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden
verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis rege- neriert bevor diese mit 800 mI_ LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Ther- momixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pl_ der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung von pk19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolo- nie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, wel- ches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte As- semblierung von pk19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 hindeutet, wurden über Nacht in LB- Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NudeoSpin Plasmid (NoLid)-KW (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum- Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit pk19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacß-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der an schließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Mutationsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen In- tegranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei er folgreicher Genomintegration des Mutationsplasmides wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachs tum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Mutationsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19 mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu mutierende Codon aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Mutationsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesen-
sitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 mI einer 1 :10- Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19 mobsacB auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (w/v) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Mutation auch zur Wiederherstellung der Wildtyp- Situation führen. Für den Nachweis des erfolgreichen Austausches in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde der entsprechende genomische Bereich per Kolonie-PCR amplifiziert (Primerpaar chk-PgltA-s / chk-PgltA-as) und auf die erwartete Fragmentgröße mittels Gel elektrophorese überprüft. PCR-Produkte, die einen Promotor-Austausch anzeigen, wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt und zur Verifikation des Austausches mit den Primern chk-PgltA-s und chk-PgltA-as sequenziert.
Die erfindungsgemäße Promotorregion PgltA::PdapA-C7 weist neben dem Austausch der Promotorregion von gtIA gegen dapA zusätzlich Nukleotidsubstitutionen an Position 95 (a->t) und 96 (g->a) vor dem Startcodon ATG auf (Figur 22).
Verwendete Primer
PgltA-up-s: TGCTCT AGAGCAT GAACTGGGACTT GAAG
PgltA-up-as: TATG C AT GTTT CT C G AGT GG G CC G AAC AAAT AT GTTT GAAAG G
PgltA-down-s: CCCACTCGAGAAACATGCATAGCGTTTTCAATAGTTCGGTGTC
PgltA-down-as: CCCCCCGGGGGGCCTAGGGAAAGGATGATCTCGTAGCC
PdapA-s: CCAATGCATTGGTTCTGCAGTTATCACACCCAAGAGCTAAAAAT
TCA
PdapA-as: CCGCTCGAGCGGCTCCGGTCTTAGCTGTTAAACCT
chk-PgltA-s: ATGAGTCCGAAGGTTGCTGCAT
chk-PgltA-as: TCGAGTGGGTTCAGCTGGTCC
univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
rsp: C AC AG G AAAC AG CTAT G AC CAT G
Veränderung der requlatorischen Bindestelle (Operator: fasO) für das FasR-Regulatorprotein im Promotorbereich der Acetyl-Carboxylasen AccBCDI durch Nukleotidsubstitutionen zur
Integration in das Genom corvneformer Bakterienzellen
Konstruktion pK19mobsacB-mufasO-accBC und pK19mobsacB-mufasO-accD1
Zur Konstruktion der Plasmide pK19mobsacB-mufasO-accBC (Figur 7) und pK19mobsacB- mufasO-accD1 (Figur 8) für die Mutation der jeweiligen /asO-Bindestelle der Gene accBC und accD1 in C. glutamicum, wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötig- ten flankierenden Fragmente per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.
Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar mu- accXX-up-s / mu-accXX-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar mu-accXX-down-s / mu-accXX-down-as amplifiziert. Die Codierung XX steht hierbei jeweils für eine der beiden acc-Genvarianten ( accBC oder accD1). Die Nukleotidse- quenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (fasB-(cg2743)-up-as / fasB-(cg2743)-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten, die für Voraussetzung für die spätere Gibson Assemblierung sind. Weiterhin werden über diese Primer die geplanten Mu- tationen innerhalb der jeweiligen fasO-Bindestelle eingeführt. Die Überprüfung der generier- ten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt und anschließend mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll gerei- nigt. Für die Konstruktion der Mutationsplasmide wurde der pK19-mobsacB-Leervektor mit der FastDigestA/ ariante (Thermo Fisher Scientific) des Restriktionsenzyms EcoRI lineari- siert. Der Restriktionsansatz wurde mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Mache rey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Assemblierung der DNA-Fragmente mittels Gibson As- sembly (Gibson et al., 2009a) wurden die amplifzierten Fragmente in einem dreifachen mola- ren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Die DNA-Fragmente wurde mit einem vorbereiten Gibson Assembly Master Mix versehen, der neben einem isothermalen Reaktionspuffer die für die Assemblierung benötigten Enzyme (T5-Exonuklease, Phusion DNA Polymerase und Taq DNA Ligase) beinhaltet. Die Assemb- lierung der Fragmente wird bei 50 °C für 60 Minuten in einem Thermocycler durchgeführt. Nach erfolgter Assemblierung der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pl_ LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pl_ der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Mutationsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR über- prüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das
Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Assemblierung der einge- setzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektropho- rese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung der Muta tionsplasmide pK19mobsacB-mufasO-accBC bzw. pK19mobsacB-mufasO-accD1 hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-K\t (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR- Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum- Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Mutationsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacß-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen wer den, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Mutationsplasmid erfolgreich über die homo logen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Mutationsplasmides wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Mutationsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19 mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu mutierende Codon aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Mutationsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesen sitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 pl einer 1 :10- Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19mobsacß auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (w/v) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt
worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resis- tenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Mutation auch zur Wiederherstellung der Wildtyp- Situation führen. Für den Nachweis der erfolgreichen Mutation in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde der entsprechende genomische Bereich per Kolonie-PCR amplifiziert (Primerpaar chk_accXX_s / chk_accXX_as). Die PCR-Produkte wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt und zur Verifikation der Muta tion mit den Primern chk_accXX_s / chk_accXX_as sequenziert.
Erfindungsgemäß liegen somit in der fasO-Bindestelle vor accBC an den Positionen 1 1 -13 (tga -> gtc) und 20-22 (cct -> aag) Nukleotidsubstitutionen vor. In der fasO-Bindestelle vor accD1 liegen an den Positionen 20-24 (cctca -> gtacg) Nukleotidsubstitutionen vor. In einer Variante der vorliegenden Erfindung weisen die erfindungsgemäßen fasO-Bindestellen vor den Genen accBD bzw. accD1 eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 bzw. 15 auf.
Verwendete Primer
univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
rsp: CACAGGAAACAGCTAT GACCAT G
mufasO-accBC
mu-accBC-up-s: ATCCCCGGGTACCGAGCTCGAACCAGCGCGCGTTCGTG mu-accBC-up-as: TT ACG ACT ATT CTGG G G G AATT CTTCT GTTTT AGG C AG GA
AATATGGCTTATG
mu-accBC-down-s: AG AAGAATT CCCCC AGAAT AGT CGTAAGT AAGCAT AT CT G
GTT GAGTT CTT CGGGGTTG
mu-accBC-down-as: TTGTAAAACGACGGCCAGTGGCCTTGGCGGTATCTGCG chk-accBC-s: GTTCGGCCACTCCGATGTCCGCCTG
chk-accBC-as: GCCTTGATGGCGATTGGGAGACC
mufasO-accD1
mu-accD1 -up-s: ATCCCCGGGTACCGAGCTCGTCATTCAACGCATCCATGA
CAGC
mu-accD1-up-as: CTAATGGTCATGTTTTGAAATCGTAGCGGTAGGCGGGG mu-accD1-down-s: ACCGCTACGATTT CAAAACAT GACCATTAGT AGCCCTTT G
ATT G ACGT CGCCAACCTT C
mu-accD1-down-as: TTGTAAAACGACGGCCAGTGCGCCAGAAGCCTGAATGTT
TTG
chk-accD1 -s: G G CTG AT ATT AGT G C CCC AACC G AT G AC
chk-accD1 -as: GATCACGTCTGGGCCGGTAACGAAC
Deletion des Gens fasB zur Ausschaltung der Funktionalität der Fettsäuresvnthase FasB zur Integration in das Genom coryneformer Bakterienzellen
Konstruktion pK19mobsacB-AfasB
Zur Konstruktion des Plasmids pK19mobsacB-AfasB (Figur 5) für die Deletion des Gens fasB in C. glutamicum, wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötigten flankie renden Fragmente per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.
Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar fasB- (cg2743)-up-s / fasB-(cg2743)-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar fasB-(cg2743)-down-s / fasB-(cg2743)-down-as amplifiziert. Die Nukleo tidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (fasB-(cg2743)- up-as / fasB-(cg2743)-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten, die für Voraus setzung für die spätere Gibson Assemblierung sind. Die Überprüfung der generierten DNA- Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt und anschließend mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll gereinigt. Für die Konstruktion des Deletionsplasmids wurde der pK19-mobsacB-Leervektor mit der Fast- Digest-V ariante (Thermo Fisher Scientific) des Restriktionsenzyms EcoRI linearisiert. Der Restriktionsansatz wurde mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Assemblierung der DNA-Fragmente mittels Gibson Assembly (Gibson et al., 2009a) wurden die amplifzierten Fragmente in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Die DNA-Fragmente wurde mit einem vorbereiten Gibson Assembly Master Mix versehen, der neben einem isothermalen Reaktionspuffer die für die Assemblierung benötigten Enzyme (T5-Exonuklease, Phusion DNA Polymerase und Taq DNA Ligase) beinhaltet. Die Assemb lierung der Fragmente wird bei 50 °C für 60 Minuten in einem Thermocycler durchgeführt. Nach erfolgter Assemblierung der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 mI_ LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 mI_ der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der
Mutationsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Assemblierung der einge setzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektropho rese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Deletionsplasmids pK19mobsacB-AfasB hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Ka- namycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden an schließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-K\t (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum- Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestri chen. Da das pK19mobsacB-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen wer den, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homo logen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei er folgreicher Genomintegration des Deletionsplasmid wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachs tum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19 mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu mutierende Codon aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Mutationsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 pl einer 1 :10- Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der
erfolgreichen Exzision von pK19 mobsacB auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (w/v) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Deletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp- Situation führen. Die erfolgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Deletion des mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer chk-fasB-s / chk-fasB-as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA-Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden.
Verwendete Primer
fasB-(cg2743)-up-s: ATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCGATTTCGATGC
CTGGATG
fasB-(cg2743)-up-as: CGCGGGAATCGAAGTTCCTGCTCAATTCGG
fasB-(cg2743)-down-s: CAGGAACTTCGATTCCCGCGCCCGCCTA
fasB-(cg2743)-down-as: TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGATACTGCAATATC
AAACCAAG AT CT CCATT CTCC
chk-fasB-s: GG AGGAT ACAT CCACGGT CATT G
chk-fasB-as: CGCTATGAGTT C AG GAT GTT GAT CG
Nukleotidsubstitution im Gen fasB kodierend für eine Fettsäuresvnthase mit verminderter Funktionalität zur Integration in das Genom coryneformer Bakterienzellen
C. glutamicum DelAro 4-4dPc Zellen wurden in 5 ml BHI Medium (Reagenzglas, 30 °C, 170 RPM) bis zu einer OD6oonm von 5 angezogen um sicherzustellen, dass die exponentielle Wachstumsphase erreicht wurde. Die Ganzzell-Mutagenese wurde durch Zugabe von Me- thylnitronitrosoguanidine (MNNG) gelöst in DMSO (Endkonzentration 0,1 mg/mL) für 15 Minuten bei 30 °C durchgeführt. Die behandelten Zellen wurden zweimal mit 45 ml NaCI, 0,9 % (w/v), gewaschen, in 10 ml BHI-Medium resuspendiert und anschließend 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM regeneriert. Die mutierten Zellen wurden als Glycerolstocks bei -30 °C in BHI Medium mit 40 % (w/v) Glycerol gelagert. Für die Bestimmung der Malonyl-CoA Bereitstellung wurden Verdünnungen der Zellbibliotheken auf BHI-Agarplatten ausplattiert, sodass einzelne Kolonien gepickt werden konnten. Einzelne Klone wurden zufällig gepickt und für die Bestimmung der Malonyl-CoA Bereitstellung nach dem beschriebenen LC-MS/MS Protokoll kultiviert. Im Anschluss wurde das Genom der Klone, für die eine verbesserte Bereitstel lung von Malonyl-CoA gemessen werden konnte, sequenziert. Zur Feststellung, welche der
detektierten Mutationen zu einer verbesserten Malonyl-CoA Bereitstellung beitragen, wurden ausgewählte Mutationen in den Stammhintergrund C. glutamicum DelAro 4-4dPc integriert. Anschließend wurde eine erneute Messung der Malonyl-CoA Bereitstellung mittels LC- MS/MS durchgeführt, um zu prüfen, ob die eingeführten Mutationen den vermuteten positi ven Einfluss auf die Malonyl-CoA Bereitstellung haben.
Konstruktion der Plasmide pK19mobsacB-fasB-E622K, pK19mobsacB-fasB-G1361 D, pK19mobsacB-fasB-G2153D und pK19mobsacB-fasB-G2668S
Zur Konstruktion der Plasmide pK19mobsacB-fasB-E622K (Figur 1 ), pK19mobsacB-fasB- G1361 D (Figur 2), pK19mobsacB-fasB-G2153D (Figur 3) und pK19mobsacB-fasB-G2668S (Figur 4) für die Integration der jeweiligen Aminosäure-Substitution in der Fettsäure Synthase B, welche in C. glutamicum durch das Gen fasB codiert wird, wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötigten flankierenden Fragmente des jeweils zu mutierenden Codons per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.
Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar Sbfl_XXX_s / OL_XXX_as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar OL_XXX_s / Xbal_XXX-as amplifiziert. Die Codierung XXX steht hierbei jeweils für die einzufügende Aminosäuresubstitution an einer spezifischen Position in der Fettsäure Synthase B. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaar größe wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu mutierenden Codon zugewandten) Primer (OL_XXX_as / OL_XXX_s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Frag mente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komple mentären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte Mutationsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (Sbfl_XXX_s / Xbal_XXX-as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE- Agarosegel wurde das finale Mutationsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean- up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion der Mutationsplasmide wurden sowohl die Mutationsfragmente als auch der pK19-mobsacB-Leervektor mit den FastDigest-V arianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Sbf\ und Xba\ linearisiert. Die Restriktionsansätze der genannten Frag mente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation- Kit
(Thermo Fisher Scientific) wurde jeweils eines Mutationsfragmente in einem dreifachen mo laren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Trans- formation chemisch kompetenter E. coli DFI5a-Zellen mittels Flitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Flitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Mutationsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR über- prüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturie- rungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese über- prüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des jeweiligen Mu- tationsplasmides pK19mobsacB-fasB-XXX hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-K\t (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum- Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Mutationsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestri- chen. Da das pK19moösacß-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen wer- den, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Mutationsplasmid erfolgreich über die homo- logen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei er- folgreicher Genomintegration des Mutationsplasmides wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachs- tum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Mutationsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19/nobsacß fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu mutierende Codon aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Mutationsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesen- sitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 pl einer 1 :10- Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19 mobsacB auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (w/v) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resis tenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Mutation auch zur Wiederherstellung der Wildtyp- Situation führen. Für den Nachweis der erfolgreichen Mutation in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde der entsprechende genomische Bereich per Kolonie-PCR amplifiziert (Primerpaar Sbfl_XXX_s / Xbal_XXX-as). Die PCR-Produkte wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt und zur Verifikation der Muta- tion mit den Primern Sbfl_XXX_s, OL_XXX_as, OL_XXX_s und Xbal_XXX-as sequenziert.
Verwendete Primer: univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: C AC AG G AAAC AG CTAT G ACC AT G
pK19mobsacB-fasB-E622K
OL_622-s: GT ACCGCT GCGAT GGCAACCAAGAAAGCAACCACCT CCCAG
GCCGTC
OL 622-as: GACGGCCTGGGAGGTGGTTGCTTTCTTGGTTGCCATCGCA
GCGGTAC
Sbfl 622-s: AAAACCTGCAGGGGCTGAGCTCGCTGGTGGCGGACAGGTTAC
CCCAG
Xbal 622-as: GGGGTCT AG AACGT CCTT AT CAAT GACGGGCACAAAGTT CAC
AGGC pK19mobsacB-fasB-G1361 D
OL 1361 -s: C CT CAC C C AGTT CAC C C AG GTG G AC AT G G C AACT CTGGGCGTT
GCTC
OL 1361-as: GAGCAACGCCCAGAGTTGCCATGTCCACCTGGGTGAACTGGGT
GAGG
Sbfl 1361 -s: AAAACCTGCAGGGTT GCACCT GAAT CCAT GCGCCCATTCGCT GT
GATC
Xbal 1361-as: GG AAT CT AG AT CG G CG G AAG C AG CCTT G AAAT C AG C C AAG AT CTC pK19mobsacB-fasB-G2153D
OL 2153-s: CATTCGCGGCACCTCGCGTGTCCGAATCCATGGCAGATGCAG
GCCCAC
OL 2153-as: GTGGGCCTGCATCTGCCATGGATTCGGACACGCGAGGTGCCGC
GAATG
Sbfl 2153-s: AAAACCTGCAGGTTGGCCACGTCAGGTTGCACCAAGCTTCGATG
AAG
Xbal 2153-as: AAAATCTAGACCGAGCTCGCCGGCGCCAACGATGACGACCATC
TCG pK19mobsacB-fasB-G2668S
OL_G2668S-s: AGTCCGACTTCGTTGTCGCATCCGGCTTCGATGCCCTGTCC OL_G2668S-as: GGACAGGGCATCGAAGCCGGATGCGACAACGAAGTCGGACT Sbfl G2668S-s: AAAACCTGCAGGCACTGACCTACGTCGACTCCGAGCCAGAACT
CAC
Xbal G2668S-as: GGGGTCTAGATGCGCAGCCAGACGAGGTGGGAATGCTTGGACAG
In Varianten der vorliegenden Erfindung sind auch Proteine der Fettsäuresynthase FasB aus coryneformen Bakterien und/oder Nukleinsäuresequenzen kodierend eine Fettsäuresynthase FasB aus coryneformen Bakterien umfasst, bei denen Nukleotidsubstitutionen und entsprechend korrespondierende Aminosäureaustausche vorliegen. Solche Varianten sind beispielsweise beschrieben in SEQ ID NO. 1 mit einer Nukleotidsubsitiution an Position 1864 (g -> a), in SEQ ID NO. 3 mit einer Nukleotidsubsitiution an Position 4082 (g -> a), in SEQ ID NO. 5 mit einer Nukleotidsubsitiution an Position 6458 (g -> a), in SEQ ID NO. 7 mit einer Nukleotidsubsitiution an den Positionen 8002-8004 (ggt->tcc) und in SEQ ID NO. 9 mit einer Deletion der Positionen 25-8943.
Allgemeine Methodik zur Deletion bzw. Mutation (Nukleotidsubstitution) von Genen bzw
Integration von DNA in coryneforme Bakterienzellen
Die nachfolgenden Schritte sind sowohl für Deletionen als auch für Integration/ Substitutio nen identisch. Der Einfachheit halber wird nur von Deletionsstämmen bzw. Deletionsplasmi den gesprochen.
Für die Konstruktion von C. g/ufam/cum-Deletionsstämmen werden pK19/77obsacß-basierte Deletionsplasmide kloniert (Schäfer et ai, 1994; https://doi.org/10/1016/0378:
1119(94)90324-7). Das Zielgen wird anschließend wie beschrieben (Niebisch & Bott, 2001 ; https://doi.org/10.1007/s002030100262) deletiert. Das hierfür benötigte Deletionsfragment wird dabei mittels cross-over- PCR (Link et al., 1997; https://doi.org/10.1128/jb.179.20.6228- 6237.1997) generiert. Dazu werden im ersten Schritt in zwei getrennten Reaktionen -500 bp große flankierende Fragmente generiert, die im Chromosom stromauf- und abwärts des zu deletierenden Gens liegen. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer werden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente zueinander komplementäre Überhänge enthalten. In einer zweiten PCR lagern sich die ge reinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize. Das so generierte Deletionsfragment wird in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert. Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel (Sambrook et al., 1989) wird das finale Deletionsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Das De letionsfragment wird im Anschluss mit dem Vektor pK19 mobsacB über die eingefügten und hydrolysierten Restriktionsschnittstellen ligiert. Im Anschluss werden chemisch kompetente E. coli DH5 Zellen mit dem gesamten Ligationssansatz transformiert. Die gewachsenen Transformanden werden mittels Kolonie-PCR auf das korrekte Ligationsprodukt überprüft; positive Deletionsplasmide werden isoliert und sequenziert. Im Falle von Insertionen wird die zu inserierende DNA-Sequenz zwischen die flankierenden Bereiche des Ziellocus kloniert. Die nachfolgenden Schritte sind sowohl für Deletionen als auch für Insertionen identisch. Der Einfachheit halber wird nur von Deletionsplasmiden gesprochen.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum- Zellen wird mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestri chen. Da das pK19moösacß-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen wer den, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homo logen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten werden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccha-
rose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Sac- charose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996;, PMID 8899981 ). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19 mobsacB findet in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wird. Da- zu werden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensi- tiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss werden je 100 mI einer 1 :10- Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 C inkubiert. Insgesamt werden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19 mobsacB auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (w/v) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der ge wünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die erfolg- reiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Excision wird über die erwartete Fragment größe bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer werden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom au- ßerhalb des deletierten DNA-Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden.
Mit dieser zuvor beschrieben Vorgehensweise werden ausgehend von dem Stamm C. glu- tamicum ATCC 13032 Stämme konstruiert, die im kodierenden Bereich des homologen Fett- säuresynthase-Gens fasB Nukleotidsubstitutionen (C.g.130232-fasB-E622K, C.g.130232- fasB-G1361 D, C.g.130232-fasB-G2153E, C.g.130232-fasB-G2668S) bzw. deletierte Berei- che (C.g 13032-AfasB), Veränderungen in der homologen fasO-Bindestelle vor dem Gen- cluster accBCDI (C.g.130232-mufasO), sowie eine homologe Promotorregion mit verminder- ter Aktivität vor dem Gen kodierend für die Citratsynthase gtIA (C.g. 13032-C7) aufweisen. Diese Stämme zeichnen sich dadurch aus, dass sie nicht-rekombinant verändert sind und sich damit als non-GVO auszeichnen.
Stammkonstruktion C. qlutamicum 13032 DelAro3/DelAro4
Die nachfolgend beschriebene Methodik wurde für die Konstruktion von C. glutamicum DelA- ro 4-4dpccg sowie alle entsprechenden Zwischenstufen, wie z.B. C. glutamicum DelAro3, DelAro4 und DelAro3-4c/PcCg verwendet.
Als Ausgangsstamm für die Konstruktion von C. glutamicum DelAro -4clPcCg wird der Stamm C. glutamicum MB001 (DE3) gewählt. Hierbei handelt sich um einen Prophagen-freien C. glutamicum ATCC13032 Wildtyp-Stamm (Stamm C. glutamicum MB001 ; Baumgart et al, 2013b, https://doi.org/10.1 128/AEM.01634-13), der im Weiteren über eine chromosomal- integrierte T7-Polymerase verfügt, welche die Nutzung des starken und induzierbaren T7- Promotors erlaubt (Stamm C. glutamicum MB001 (DE3); (Kortmann et al., 2015; https://doi.org/10.1111/1751-7915.12236). Dieser Promotor befindet sich auch auf den pMK- Ex2-Plasmiden, die für die Expression an der Synthese des jeweiligen Produkts beteiligter Gene pflanzlichen Ursprungs genutzt werden.
Ausgehend von C. glutamicum MB001 (DE3) wird durch Deletion der Gen(-cluster) cg0344-47, cg2625-40 und cg1226 der Stamm C. glutamicum DelAro3 konstruiert (Kall- scheuer et al., 2016, https://doi.Org/10.1016/j.ymben.2016.06.003).
Bei cg0344-47 handelt es sich um das phdBCDE- Operon, welches für Gene codiert, die am Katabolismus von Phenylpropanoiden, wie z. B. p-Cumarsäure beteiligt ist.
Um die unspezifische Umwandlung von Phenylpropanoiden durch Enzym-katalysierte Ring- Hydroxylierung oder Ring-spaltende Reaktionen zu verhindern (die natürlichen Substrate der jeweiligen Enzyme 4-Hydroxybenzoate-3-Hydroxylase PobA bzw. Protocatechuat Di- oxygenase PcaGH zeigen eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu Phenylpropanoiden) werden die entsprechenden Gen(-cluster) cg 1226 ( pobA ) und cg2625-40 ( cat , ben und pca Gene, die essentiell für den Abbau von 4-Hydroxybenzoat, Catechol, Benzoat und Protocatechuat sind) deletiert.
Während der Etablierung der Synthese von pflanzlichen Polyphenolen aus Glucose (zusätz- lich mit Plasmid pEKEx3_aro/-/£c_fa/P/) wird eine Akkumulation von 0,9 g/L Protocatechuat gemessen, aber es können weder L-Tyrosin noch p-Cumarsäure detektiert werden (Kallscheuer et al., 2016 https://doi.Org/10.1016/j.ymben.2016.06.003). Die 3-
Dehydroshikimat Dehydratase QsuB katalysiert die thermodynamisch irreversible Umwand- lung des Shikimat-Weg-Intermediates 3-Dehydroshikimat zu Protocatechuat und führt so zu einem ungewünschten Verlust von Intermediaten des Syntheseweges aromatischer Amino- säuren. Die Deletion von qsuB reduzierte die Akkumulation von Protocatechuat. Somit wird in dem konstruierten Stamm C. glutamicum DelAro3 zusätzlich das Gen cg0502 (qsuB) dele tiert, resultierend in dem Stamm C. glutamicum DelAro4.
Durch chromosomale Integration des 4clPcC8- Gens aus Petroselinum crispum unter Kontrolle des T7-Promotors an den Deletionlocus cg0344-47 (Acg0344-47::PT7-4c/PcCg) im Stamm C. glutamicum DelAro3 bzw. DelAro4 wurde C. glutamicum DelAro3-4c/PcCg bzw. C. glutamicum
DelAro4-4c/PcCg konstruiert.
Ausgehend von C. glutamicum DelAro3-4 clPcCg bzw. C. glutamicum DelAro4-4 clPccg werden analog (siehe oben Deletion bzw. Integration von DNA in coryneforme Bakterien) durch In tegration nicht-rekombinant veränderter DNA die entsprechenden C. glutamicum Stämme konstruiert, bei denen das Gen der Fettsäuresynthase fasB mutiert bzw. deletiert wird, die fasO-Bindestelle vor dem Gencluster accBCDI mutiert wird bzw. der Promotor vor dem Ci- tratsynthase-Gen gltA mutiert wird. Beispielhaft für alle oben aufgeführten C. glutamicum Stämme (DelAro3, DelAro4, DelAro3-4c/PcCg, DelAro4-4c/PcCg) werden so die Stämme mit C. glutamicum DelAro4-4c/PcC8-fasB-E622K, DelAro4-4c/PcC8-fasB-G1361 D, DelAro4-4c/PcC8-fasB- G2153E, DelAro4-4c/PcC8-fasB-G2668S, DelAro4-4c/PcCs?-AfasB, DelAro4-4c/PcC8-C7, DelAro4- 4c/PcC8-C7-mufasO, DelAro4-4c/PcC8-C7-mufasO-fasB-E622K, DelAro4-4c/PcC8-C7-mufasO- fasB-G1361 D, DelAro4-4c/PcC8-C7-mufasO-fasB-G2153E, DelAro4-4c/PcC8-C7-mufasO-fasB- G2668S, DelAro4-4c/PcC8-C7-mufasO-AfasB konstruiert. Auch alle anderen denkbaren Bakte rienstämme mit Kombinationen an Veränderungen in Genen von coryneformen Bakterien, wie z. B. fasB, fasO und gtIA, im Genom des C. glutamicum Wildtyps ATCC 13032 oder des sen Abkömmlingen C. glutamicum DelAro3, C. glutamicum DelAro4, C. glutamicum DelAro3- 4c/PcCg, C. glutamicum DelAro4-4 clpcCg werden auf die gleiche beschriebene Weise herge stellt.
Konstruktion pK19mobsacB-cg0344-47-del und pK19mobsacB-cg2625-40-del
Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-cg0344-47-del (Figur 12) und pK19mobsacB-cg2625-40-del (Figur 13) für die Deletion der Gencluster cg0344-47 und cg2625-40 in C. glutamicum wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötig ten flankierenden Fragmente des jeweils zu deletierenden Genclusters per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.
Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar cgXXXX-XX-up-s / cgXXXX-XX-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar cgXXXX-XX-down-s / cgXXXX-XX-down-as amplifiziert. Die Codierung XXXX-XX steht hierbei jeweils für die cg-Nummern der zu deletierenden Gene. Beispielswei se wird für die Deletion der Genclusters cg0344-47 das Primerpaar cg0344-47-up-s/ cg0344- 47-up-as benutzt und analog für die Deletion der Genclusters cg2625-40 das Primerpaar cg2625-40-up-s/ cg2625-40-up-as. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Aga- rosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zu gewandten) Primer (cgXXXX-XX-up-as / cgXXXX-XX-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Über-
hänge enthalten. Für das Gencluster cg0344-47 ist dies das Primerpaar cg0344-47-up-as/ cg0344-47-down-s und analog für das Gencluster cg2625-40 das Primerpaar cg2625-40- up-as/ cg2625-40-down-s. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so gene- rierte Deletionsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen ab- gewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (cgXXXX-XX-up-s / cgXXXX-XX-down- as). Für das Gencluster cg0344-47 ist dies das Primerpaar cg0344-47-up-s/ cg0344-47- down-as und analog für das Gencluster cg2625-40 das Primerpaar cg2625-40-up-s/ cg2625-40-down-as. Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Deletionsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Ma- cherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Kon- struktion der Deletionsplasmide wurden sowohl die Deletionfragmente als auch der pK19- mobsacB-Leervektor mit den FastDigest-\/a rianten (Thermo Fisher Scientific) der Restrikti onsenzyme Xba\ und EcoRI linearisiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation- Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde jeweils eines der beiden Deletionsfragmente in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Trans- formation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Deletionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR über- prüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturie rungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese über prüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des jeweiligen De letionsplasmides pK19mobsacB-cg0344-47-del bzw. pK19mobsacB-cg2625-40-del hindeu-
tet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plas mide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)- Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie- PCR-Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum- Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestri- chen. Da das pK19moösacß-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen wer- den, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homo logen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30°C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccha- rose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletions plasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19/77obsacß fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chro mosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 mI einer 1 :10- Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und % Saccharose (w/v) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccha rose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die er folgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Frag mentgröße bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer del-cgXXXX-XX-s / del-cgXXXX-XX-as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA-Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden. Für das Gencluster cg0344-
47 ist dies das Primerpaar del-cg0344-47-s/ del-cg0344-47-as und analog für das Gencluster cg2625-40 das Primerpaar del-cg2625-40-s / del-cg2625-40-as.
Verwendete Primer univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
rsp: CAC AG G AAAC AG CTAT G ACC AT G pK19mobsacB-cg0344-47-del
cg0344-47-up-s: CTCTCT AG AG CG GT G G CG AT GAT G ATCTTC GAG
cg0344-47-up-as: AAGCATATGAGCCAAGTACTATCAACGCGTCAGGGCGACT
TTT CCATT GAGAGACATTT C
cg0344-47-down-s: CT G ACGCGTT GAT AGTACTT GGCT CAT AT GCTTTTCCT CAC
CCGCTTCTACGCTTAAAAG
cg0344-47-down-as: GACGAATT CGT GTGGCCACCACCT CAAT CT GT G
del-cg0344-47-s: AGAGATTCACCCTCGGCGATGAG
del-cg0344-47-as: GACCCGCAATGGTGTCGCCAG pK19mobsacB-cg2625-40-del
cg2625-40-up-s: ACAT CTAGAGGT CGGCGAAT CAAGCT CCAT G
cg2625-40-up-as: CGTCTCGAGTTCACATATGCAACGCGTGCTCAAGATGA
CAAT AT CTT GAGGGTT C ATTTTTT G ATCCTT AATTT AG
cg2625-40-down-s: TTGAGCACGCGTTGCATATGT G AACT CGAGACGGTC
GGTGGAGGCGACCAGGGATAAC
cg2625-40-down-as: T CT GAATT CAT CAAGGCCAAT CAT GAT GAGT GCGAAAC del-cg2625-40-s: AAG AG G AGTT GAT G G GAT G GT CG AAC AAT C
del-cg2625-40-as: GTTG G CAT G CC AG CTTT GT G GG AT G
Konstru ktion pK19mobsacB-Acg0344-47 : : PT7-4c/Pc
Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-Acg0344-47::PT7-4c/Pc (Figur 14) für die chromosomale Integration an den Deletionslocus cg0344-47 einer für C. glutamicum codon- optimierten Variante des 4cl- Gens aus Petroselinum crispum unter Kontrolle des T7- Promotors (PT7-4C/Pc) wurde das Gen von GeneArt Gene Synthesis (Thermo Fisher Scienti- fic) chemisch als String DNA Fragment synthetisiert und als DNA-Template für die Amplifika- tion mit dem Primerpaar Mlul-PT7-4CLPcCg-s / Ndel-4CLPcCg-as verwendet. Für die Kon- struktion des Integrationsplasmides wurden sowohl das amplifizierte 4clPc- Gen als auch das Plasmid pK19mobsacB-cg0344-47~del mit den FastDigest-V arianten (Thermo Fisher Scienti fic) der Restriktionsenzyme Mlu\ und Nde I linearisiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation- Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das 4c/Pc-Fragment in einem dreifachen molaren Über-
schuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB-cg0344-47-del einge- setzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pl_ LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pl_ der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung des Insertionsplasmides in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR über- prüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc. , Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturie- rungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese über prüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Insertionsplas- mides pK19mobsacB-Acg0344-47::PT7 -4dPc hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)- Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum- Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem Insertionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacß-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließen- den Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass die- se nur ausgebildet wird, falls das Insertionsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei er folgreicher Genomintegration des Insertionsplasmides wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachs tum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das
Insertionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19 mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem der gewählte Integrationslocus aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Insertionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesen- sitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 pl einer 1 :10- Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19 mobsacB auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (w/v) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resis- tenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten PT7-4c/Pc-lnsertion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die erfolgreiche Insertion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Insertion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer del-cg0344-47-s / del- cg0344-47-as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des Insertions- locus und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden. PCR- Fragmente, die eine Insertion des Kontruktes PT7-4C/PC anzeigen, wurden mit dem Nucleo- Spin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt und zur Kontrolle der Insertion mit den Primern del-cg0344-47-s, cg0344-47-up-s, Mlul-PT7-4CLPcCg-s, Ndel- 4CLPcCg-as, cg0344-47-down-as und del-cg0344-47-as sequenziert.
Verwendete Primer
univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
rsp: C AC AG G AAAC AG CTAT G ACC AT G
Mlul-PT7-4CLPcCg-s: TC CT AC G CGTT AAT ACG ACT C ACT AT AGGG AG AT C AAG
GAGGCGGACAATGGGCGATTGCGTGGCAC
Ndel-4CLPcCg-as: GGACGTT CAT ATGTTACTTT GGCAGAT CACCGG ATGCG
ATC del-cg0344-47-s: AG AGATT CACCCT CGGCGAT GAG cg0344-47-up-s: CTCTCTAGAGCGGTGGCGATGATGATCTTCGAG cg 0344-47-down-as : GACGAATT CGT GT GGCCACCACCT CAAT CT GT G
del-cg0344-47-as: GACCCGCAATGGTGTCGCCAG
Konstruktion pK19mobsacB-cg0502-del
Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-cg0502-del (Figur 15) für die Deletion des Gens cg0502 in C. glutamicum wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benö- tigten flankierenden Fragmente per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutami cum DNA amplifiziert.
Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar cg0502-up-s / cg0502-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar cg0502-down-s / cg0502-down-as amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (cg0502-up-as / cg0502-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplemen- täre Überhänge enthalten. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so gene- rierte Deletionsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen ab- gewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (cg0502-up-s / cg0502-down-as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Deletions- fragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion des Deletionsplasmids wurden sowohl das Deletionfragment als auch der pK19-mobsacB-Leervektor mit den Fast- Digest-V arianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Hind\\\ und ßamHI linea- risiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-K\t (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysier- ten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation- Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das Deletionsfragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium ver- sehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Die korrekte Assemblierung der Deletionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien bei gesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minu- ten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA- Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Fal- le einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Deletionsplasmides pK19mobsacB-cg0502-del hindeutet, wur- den über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-KW. (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR- Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum- Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestri- chen. Da das pK19rr70ösacß-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen wer- den, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homo logen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei er- folgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachs- tum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19 mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chro mosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 pl einer 1 :10- Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen
und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19 mobsacB auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (w/v) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die erfolgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie- PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer del-cg0502-s / del-cg0502-as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA- Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden.
Verwendete Primer up-cg0502-s: ACGAAGCTTTGTCCGGCATGCTGGCTGAC up-cg0502-as: TGCGCATATGTGGCCGTCTAGATACGCGTACGTCAAA
CAAACAGTGGCAATGGATGTACGCATG
down-cg0502-s: ACGTACGCGTATCTAGACGGCCACATATGCGCAATCG
AGCGGGGAATCCCAAACTAGCATC down-cg0502-as: TATGGATCCTACGCCTGTACACCGTCGCACGTC
del-cg0502-s: GT GAACATT GT GTTT ACT GT GTGGGCACT GT C del-cg0502-as: T GAT GTT CAGGCCGTT GAAGCCAAGGT AGAG univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTAT GACCAT G
Konstruktion pK19mobsacB-cg1226-del
Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-cg1226-del (Figur 16) für die Deletion des Gens cg1226 in C. glutamicum wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benö- tigten flankierenden Fragmente per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutami cum DNA amplifiziert.
Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar cg1226-up-s / cg1226-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem
Primerpaar cg1226-down-s / cg1226-down-as amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (cg1226-up-as / cg1226-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplemen- täre Überhänge enthalten. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so gene- rierte Deletionsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen ab gewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (cg1226-up-s / cg1226-down-as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Deletions- fragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion des Deletionsplasmids wurden sowohl das Deletionfragment als auch der pK19-mobsacB-Leervektor mit den Fast- Digest-V arianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Hind\\\ und SamHI linea- risiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kti (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation- Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das Deletionsfragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium ver sehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Deletionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien bei gesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minu ten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA- Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Fal le einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Deletionsplasmides pK19mobsacB-cg1226-del hindeutet, wur-
den über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-KH (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR- Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum-ZeWen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestri- chen. Da das pK19moösacß-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen wer- den, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homo- logen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei er folgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachs- tum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19 mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chro- mosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 pl einer 1 :10- Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19 mobsacB auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (w/v) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resis- tenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wild- typ-Situation führen. Die erfolgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie- PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer del-cg1226-s / del-cg1226-as
wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA- Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden.
Verwendete Primer up-cg1226-s: CACAAGCTT CCACACG AT G AAAAT CAAT CCGCAG up-cg1226-as: TG CG GT AC CCT CG CAT ATG ATATCT CG AG AG CT AATT
GCCACTGGTACGT GGTT CAT G down-cg1226-s: AGCTCTCGAGATATCATATGCGAGGGTACCGCAGAC
CTACCACGCTTCGAGGTATAAACGCTC down-cg1226-as: AGT GAATT CCAAGGAAGGCGGTTGCTACTGC del-cg01226-s: T AAAT G GTG G AG AT AC C AAACT GT G AAG C del-cg1226-as: CG AGTT CTT CTTCGT GTT CGCGAT C univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: C AC AG G AAAC AG CTAT G AC CAT G
Codonoptimierunq heteroloqer Gene in coryneformen Bakterienzellen
Die Etablierung synthetischer Biosynthesewege, wie der Synthese von Polyphenolen oder Polyketiden, aus Pflanzen in coryneformen Bakterienzellen erfordert eine heterologe Expres sion der erforderlichen pflanzlichen Gene. Es ist bekannt, dass verschiedene Spezies Vari anten des universellen genetischen Codes mit unterschiedlicher Häufigkeit verwenden, was letztendlich auf unterschiedliche tRNA-Konzentrationen innerhalb der Zelle zurückzuführen ist. Man spricht in diesem Fall von Codonverwendung (engl. Codon Usage). Selten verwen dete Codons können die Translation ausbremsen, während häufiger genutzte Codons die Translation beschleunigen können. Dies führt dazu, dass heterologe Gene mit Codonver wendung spezifisch für den Zielorganismus synthetisiert werden. Hierzu wird die Aminosäu resequenz des heterologen Proteins von Interesse in die DNA-Sequenz mit spezifischer Co donverwendung umgeschrieben. Für C. glutamicum ist eine Datenbank über die Codonver wendung verfügbar unter http://www.kazusa.or.ip/codon/cqi- bin/showcodon.cqi?species=196627&aa=1 &style=N.
Expression der Gene aroH und tal in coryneformen Bakterienzellen
Konstruktion des Plasmids pEKEx3-aroH£c-fa/F7
Um die Synthese von pflanzlichen Polyphenolen ohne Supplementation der Polyphenol- Vorstufe p-Cumarsäure in corynformen Bakterien vornehmen zu können, also für die Syn- these von pflanzlichen Polyphenolen aus Glukose, werden zwei weitere Gene benötigt (Kallscheuer et al., 2016; https://doi.Org/10.1016/j.ymben.2016.06.003). Dies sind die Gene kodierend für eine feedback-resistente 3-Deoxy-D-Arabinoheptulosonat-7-Phosphat- Synthase (aroH), bevorzugt aus E. coli ( aroHEc ), sowie für eine Tyrosinammonium-Lyase (tal), bevorzugt aus Flavobacertium johnsoniae (talFj).
Für die Konstruktion des Plasmids pEKEx3-aro/-/Ec-fa/Fy (Figur 17) wird wie folgt vorgegan- gen:
Zur Konstruktion des Plasmides pEKEx3-aro/-/Ec-fa/Fycgfür die Expression der Gene aroH aus E. coli (aroHEc) und einer für C. glutamicum codon-optimierten Variante des tal- Gens aus Flavobacterium johnsoniae ( talFJCg ) werden die beiden Gene per PCR amplifiziert. Für die aro/-/Ec-Amplifikation per PCR wird genomische DNA von E. coli isoliert und mit dem Primer- paar aroHEc-s / aroHEc-as, welches spezifisch an das für das aroHEc- Gen ist, amplifiziert. Das für C. glutamicum codon-optimierte talFjC8- Gen wird von GeneArt Gene Synthesis (Thermo Fisher Scientific) chemisch als String DNA Fragment synthetisiert und als DNA- Template für die Amplifikation von talFJCg mit dem Primerpaar talFj-s / talFj-as verwendet. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wird mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Für die Konstruktion des Plasmides pEKEx3-aro/-/£c-fa/fyCg wird das Plasmid pEKEx3 mit den FastDigest- Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme BamH\ und EcoRI linearisiert. Die mit den gegebenen Primerpaaren amplifizierten Gene aroHEc bzw. talFjCg werden mit den Restriktionsenzymen ßa/nHI und Sapl bzw. Sapl und EcoRI hydrolysiert. Die Restriktionsan- sätze der genannten Fragmente werden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mit- tels Rapid DNA Ligation- Kit (Thermo Fisher Scientific) werden die beiden Inserts aroHEc und talFjCg in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pEKEx3 eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente werden das gesamte Ansatzvo- lumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock werden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen werden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regene- riert werden. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Specti- nomycin (100 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte As- semblierung der eingesetzten Fragmente in den gewachsenen Transformanden wird mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wird der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFis- her Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz
hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wird und für die DNA-Polymerase zugänglich ist. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wird das Primerpaar chk_pEKEx3_s / chk_pEKEx3_as verwendet, welches spezifisch an das pEKEx3-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, wel- ches per Gelelektrophorese überprüft wird. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Plasmides pEKEx3 -aroHEc-talFjcg hindeutet, wurden über Nacht in LB- Medium mit Spectinomycin (100 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide werden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kti (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequen- ziert. Das Plasmid ist in Figur 1 dargestellt.
Verwendete Primer:
aroHEc-s: CT CGGATCCAAGGAGGT CATAT CAT GAACAGAACGACGAA
CTCCGTACTGCGCGTATTG
aroHEc-as: TACGCTCTTCTGATTTAGAAGCGGGTATCTACCGCAGAGGCGAG talFj-s: TTCGCT CTT CAAT CT GGCAAGG AGGG AT CCGTAT G AACACCAT CA
ACGAATACCTGTCCCTGGAAG
talFj-as: AT CG AATT CTTAGTTGTTG AT C AG GTG ATC CTT C ACCTT CTG C AC chk_pEKEx3_s: GC AAAT ATT CT G AAAT G AG CTGTT G AC AATT AAT CAT C
chk_pEKEx3_as: C GTTCT G ATTT AAT CTGTAT C AG G CT G AAAAT CTTCTC
Expression heteroloqer Gene für die Synthese von Polyphenolen oder Polyketiden in coryne- formen Bakterienzellen
Konstruktion pMKEx2 _stsAh_4clPc
Zur Konstruktion des Plasmides pMKEx2_sfs^_4c/Pc (Figur 18) für die Expression der Gene sfs aus Arachis hypogea ( stsAh ) und 4cl aus Petroselinum crispum ( 4dPc ) wurden die beiden Gene als für C. glutamicum codon-optimierte Genvarianten von GeneArt Gene Synthesis (Thermo Fisher Scientific) chemisch als String DNA Fragment synthetisiert und als DNA- Template für die Amplifikation per PCR verwendet. Die Gene stsAh und 4clPc wurden per PCR mit dem Primerpaar stsAh-s / stsAh-as bzw. 4clPc-s / 4clPc-as, welches spezifisch für das jeweilige Gen ist, amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Aga- rosegel durchgeführt. Für die Konstruktion des Plasmides pMKEx2 _stsAh_4clPc wurde das Plasmid pMKEx2 mit den FastDigestA/ arianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktions- enzyme Nco\ und ßamHI linearisiert. Die mit den gegebenen Primerpaaren amplifizierten Gene stsAh und 4clPc wurden mit den Restriktionsenzymen L/col und Kpn\ bzw. Kpn\ und ßamHI hydrolysiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem Nu-
cleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation- Kit (Thermo Fisher Scientific) wurden die beiden Inserts stsAh und 4clPc in einem dreifachen molaren Überschuss gegen- über dem linearisierten Vektorrückgrat pMKEx2 eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompeten- ter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im An- schluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der eingesetzten Fragmente in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) ver- wendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR- Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freige- setzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie- PCR wurde das Primerpaar chk_pMKEx2_s / chk_pMKEx2_as verwendet, welches spezi- fisch an das pMKEx2-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der einge- setzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektropho- rese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Plas- mides pMKEx2 _stsAh_4clPc hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 gg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-K\t (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Verwendete Primer stsAh-s: ATACCATGGTAAGGAGGACAGCTATGGTGTCCGTGTCCGGCATC stsAh-as: CTCG GT ACCTTT AG ATT G C CAT AG AG CG C AG C ACC AC
4clPc-s: AGCGGTACCT AAG GAG GT GG AC AAT G G G CG ATT G C GT GG C AC
4clPc-as: CT GGGATCCAGGACTAGTTT CCAGAGT ACT ATT ACTTT GGCA
GATCACCGGATGCGATC chk_pMKEx2-s: CCCTCAAGACCCGTTTAGAGGC
chk_pMKEx2-as: TTAAT ACGACT CACT AT AGGGG AATT GT G AGC
Konstruktion pNlKEX2-chsPh-chiPh
Zur Konstruktion des Plasmides pMKEX2-chsPh-cbiPh (Figur 19) für die Expression der Gene chs und chi aus Petunia x hybrida ( chsPh und chiPh) wurden die beiden Gene als für C. glu- tamicum codon-optimierte Genvarianten von GeneArt Gene Synthesis (Thermo Fisher Scientific) chemisch als String DNA Fragment synthetisiert und als DNA-Template für die Ampli fikation per PCR verwendet. Die chsPh und chiPh wurden per PCR mit dem Primerpaar chsPh-s / chsPh-as bzw. chiPh-s / chiPh-as, welches spezifisch für das jeweilige Gen ist, amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaar größe wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Für die Konstruktion des Plasmides pMKEX2-chsPh-chiPh wurde das Plasmid pMKEx2 mit den FastDigest-V arianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Xba\ und Bam- Hl linearisiert. Die mit den gegebenen Primerpaaren amplifizierten Gene chsPh und chiPh wurden mit den Restriktionsenzymen Xba\ und L/col bzw. Nco\ und ßamHI hydrolysiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA- Fragmente mittels Rapid DNA Ligation- Kit (Thermo Fisher Scientific) wurden die beiden In- serts chsPh und chiPh in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pMKEx2 eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium ver- sehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der eingesetzten Fragmente in den gewachsenen Transforman- den wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA- Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar chk_pMKEx2_s / chk_pMKEx2_as verwendet, welches spezifisch an das pMKEx2- Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein
PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Plasmides pMKEx2_ chsPh und chiph hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Iso- lierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-K\t (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizie- rungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Verwendete Primer chsPh-s: GT AT CT AGAAAGG AGGT CG AAG ATGGT GACCGT GGAAG AAT AC
CGCAAG chsPh-as: CTCCCATGGTTAGGTTGCCACGGAGTGCAGCAC chiPh-s: CT CCCATGGTGCT AAAGGAGGT CGAAGAT GTCCCCACCAGT G
TCCGTGACCAAG chiPh-as: CT GGGAT CCTTACACGCCGAT CACT GGGATGGT G chk_pMKEx2-s: CCCTCAAGACCCGTTTAGAGGC chk_pMKEx2-as: TT AAT ACG ACT CACT AT AGGGG AATT GT G AGC
Expression der erfindunqsqemäßen Polyketidsynthase PCS in
Bakterienzellen
Konstruktion pMKEx2-pcsAa und pMKEx2-pcsAa-short
Zur Konstruktion der Plasmide pMKEx2 _pcsAa (Figur 20) und pMKEx2 ^cs^-short (Figur 21 ) für die Expression der Genvarianten von pcs aus Aloe arborescens ( pcsAa ) wurde das Gen als für C. glutamicum codon-optimierte Genvariante von GeneArt Gene Synthesis (Thermo Fisher Scientific) chemisch als String DNA Fragment synthetisiert und als DNA-Template für die Amplifikation per PCR verwendet. Das pcsAa- Gen wurde per PCR mit dem Primerpaar Gibson-PCS-s / Gibson-PCS-as bzw. Gibson-PCS-short-s / Gibson-PCS-as amplifiziert, um so die native als auch die verkürzte pcsAa- Sequenz zu generieren.
Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt und an- schließend mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll gereinigt. Für die Konstruktion der Expressionsplasmide wurde das Plasmid pMKEx2 -stsAh-4dPc mit der FastDigestA/ ariante (Thermo Fisher Scientific) der
Restriktionsenzyme Nco\ und Seal linearisiert. Der Restriktionsansatz wurde auf einem 1 % Agarosegel getrennt. Das erwartete Fragment des Vektorrückgrats wurde mit dem Nucleo- Spin Gel and PCR Clean-up- Kit (Macherey-Nagel, Düren) aus dem Gel gereinigt. Für die Assemblierung der DNA-Fragmente mittels Gibson Assembly (Gibson et al., 2009a) wurde je eines amplifzierten Fragmente ( csAa bzw. pcsAa- short) in einem dreifachen molaren Über schuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pMKEx2 eingesetzt. Die DNA- Fragmente wurde mit einem vorbereiten Gibson Assembly Master Mix versehen, der neben einem isothermalen Reaktionspuffer die für die Assemblierung benötigten Enzyme (T5- Exonuklease, Phusion DNA Polymerase und Taq DNA Ligase) beeinhaltet. Die Assemblie rung der Fragmente wird bei 50 °C für 60 Minuten in einem Thermocycler durchgeführt. Nach erfolgter Assemblierung der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Trans formation chemisch kompetenter E. coli DH5oc-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 mI_ LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 mI_ der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Expressionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Dena turierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, so- dass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar chk_pMKEx2_s / chk_pMKEx2_as verwendet, welches spezifisch an das pMKEx2-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Assemblierung der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bil det, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung der Expressionsplasmide Konstruktion rMKEc2-ro5L3 und pMKEx2- pcsAa- short hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-KW (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizie- rungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Verwendete Primer: chk_pMKEx2-s: CCCTCAAGACCCGTTTAGAGGC chk_pMKEx2-as: TT AAT ACG ACT CACT AT AGGGG AATT GT G AGC
pMKEx2-pcsAa
Gibson-PCS-s: ACTTT AAG AAGGAG AT AT ACCATGGTAAGG AGGACAGCT AT -
GT CCTCCTT GT CCAAC
Gibson-PCS-as: CCAGGACT AGTTT CCAG AGT ACT ATT ACAT G AGTGGCAGGGAG pMKEx2-pcsAa-short
Gibson-PCS-short-s: ACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGTAAGGAGGACAGCTATG-
GAAGATGTGCAGGGC
Gibson-PCS-as: CCAGGACT AGTTT CCAGAGTACT ATT ACAT GAGTGGCAGGGAG
Kultivierungsbedinqunqen
Sämtliche Kultivierungen von C. glutamicum zur Messung der intrazellulären Malonyl-CoA Bereitstellung oder der Synthese von Naringenin, Noreugenin und Resveratrol werden in 50 ml definiertem CGXII-Medium (Keilhauer et al., 1993) mit 4 % Glucose (w/v) in einem JRC-1- T Schüttelinkubator (Adolf Kühner AG, Birsfelden, Schweiz) durchgeführt (500 ml Schikane- kolben, 30 °C, 130RPM). Wenn angebracht, werden Selektionsantibiotika der genannten
Konzentrationen zugefügt:
Für die Kultivierung in CGXII-Medium werden die Stämme zunächst für 6-8 Stunden in 5 ml BHI-Medium ( Brain heart infusion, Difco Laboratories, Detroit, USA) in Reagenzgläsern bei 170 RPM inkubiert (erste Vorkultur) und anschließend genutzt, um 50 ml CGXII-Medium in einem 500 ml-Schikanekolben (mit zwei gegenüberliegenden Schikanen) zu beimpfen. Diese zweite Vorkultur wird bei 30 °C und 130 RPM über Nacht inkubiert. Die CGXII-Hauptkultur (50 ml in einem 500 ml-Schikanekolben) wird mit der bewachsenen zweiten Vorkultur auf eine OD600nm von 1 ,0 (Malonyl-CoA Messung) bzw. 5,0 (Produktion von Naringenin, Res- veratrol oder Noreugenin) angeimpft. Optional wird für die Synthese von Naringenin und Resveratrol zusätzlich 5 mM p-Cumarsäure (vorher gelöst in 80 mI DMSO) supplementiert.
Die Expression heterologer Gene, die entweder chromosomal integriert sind oder plasmid basiert eingebracht wurden, wird durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-ß-D-
thiogalactopyranosid (IPTG) 90 Minuten nach Inokulum induziert. Zu den angegebenen Zeit- punkten wird 1 ml Kultur abgenommen und bei -20 °C bis zur Verwendung gelagert. Die Produktbestimmung (Malonyl-CoA oder Polyphenole oder Polyketide) erfolgt wie unten be- schrieben. Gegen Ende der Fermentation kann Resveratrol, oder Naringenin oder Noreuge- nin aus der Kultivierungslösung optinal weiter aufbereitet, d.h. abgetrennt, aufgereinigt und/oder aufkonzentriert werden.
Die Bestimmung der Biomasse während Kultivierungen zur Messung der Malonyl-CoA Be- reitstellung oder der Produktion von Polyphenolen bzw. Polyketiden wird über die Messung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD6oonm) mit dem Ultrospec 3300 pro UVA/isible Spectrophotometer (Amersham Biosciences, Freiburg) durchgeführt. Hierzu werden 100 pL Probenvolumen der entsprechenden Kultivierung entnommen und so ver- dünnt, dass die gemessene OD60onm im linearen Messbereich des Photometers von 0, 2-0,6 lag. Durch Bereinigung um den Verdünnungsfaktor wird die tatsächliche OD60onm der Kultur berechnet. Sollte ein stärkerer Verdünnungsfaktor von >1 :10 (bspw. 1 :100) pipettiert werden, so wird dies sequentiell durchgeführt (Beispiel: für eine 1 :100 Verdünnung wurde zweimal 1 :10 verdünnt).
Malonyl-CoA-Quantifizierunq mittels LC-MS/MS
Die Probenvorbereitung für die Quantifizierung des intrazellulären Malonyl-CoA-Levels wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Kallscheuer et al., 2016). 5 mL der Kultur wird in 15 ml_ eiskaltem 60% MeOH in H20 im Triplikat gequencht und anschließend zentrifugiert. Die Bestimmung der Malonyl-CoA-Konzentration erfolgt im Zell-Extrakt und im Kulturüberstand. Zusätzlich erfolgt die Analytik in den erhaltenen Überständen nach dem Quenching. Für die Überstandsproben der Kultur und nach Quenching erfolgt eine Filtration durch 0.2 pm Celluloseacetat-Filter. Vom Kulturüberstand werden 250 pL mit 750 pL 60% MeOH verdünnt, der Quenching-Überstand wurde unverdünnt verwendet.
Die Quantifizierung der Malonyl-CoA-Konzentration in den erhaltene Proben (Zellextrakt, Kulturüberstand und Quenching-Überstand) erfolgt mittels LC-MS/MS-Analytik mit einem Agilent 1260 Infinity HPLC-System (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) bei 40 °C mit einer 150 * 2.1 mm Sequant ZIC-pHILIC-Säule mit 5 pm Partikelgröße und einer 20*2.1 mm-Vorsäule (Merck, Darmstadt, Germany). Die Trennung erfolgt mit 10 mM Ammoniumacetat (pH 9,2) (Puffer A) und Acetonitril (Puffer B). Vor jeder Injektion wurde die Säule für 15 min mit 90% Puffer B äquilibriert. Der folgende Gradient wird für die Trennung verwendet (Injektionsvolumen 5 pL): 0 min: 90% B, 1 min: 90% B, 10 min: 70% B, 25 min: 65 % B, 35 min: 10 % B, 45 min: 10% B, 55 min: 10% B. Die Messung erfolgt mit einem ESI- QqTOF-MS (TripleTOF 6600, AB Sciex, Darmstadt, Germany) mit einer lonDrive
lonenquelle. Zur Datenanalyse dient die Software Analyst TF 1.7 (AB Sciex, Concord, ON, Canada).
Als Referenz erfolgt eine Quantifizierung von komplett 13C-markiertem Zellextrakt aus Escherichia coli versetzt mit 13C3-markiertem Malonyl-CoA, um eine Konzentration von ca. 12,5 mM zu erhalten (Abschätzung basierend auf dem Molekulargewicht der freien Säure). 13C3-markiertes Malonyl-CoA enthielt [U-13C3]Malonat als Kontamination (Daten nicht gezeigt), das wahrscheinlich durch spontane Hydrolyse des Thioesters entsteht. Dieses wird als interner Standard für die Malonat-Quantifizierung genutzt und die Proben wurden mit gleichen Volumina der internen Standard-Lösung versetzt. Als externe Standardreihe dienen Malonat-Standards mit Konzentrationen von 0.01 -100 mM im 50 % Me0H/H20. Eine separate externe Standardreihe für Malonyl-CoA wurde analog angesetzt.
Als optimale Kollisionsenergien für die stärksten Transitionen von Malonyl-CoA (852.1 >79) und von Malonat (103>59) werden -130 eV bzw. -1 1 eV verwendet. Diese werden mithilfe der Metabolitstandards ermittelt. Während der Elution wurden die erwähnten Transitionen und die der internen Standards (855.1 >79 bzw. 106>61 ) für die Messung im MS/MS High Sensitivity Mode mit den optimalen Kollosionsenergien verwendet.
Für die Quantifizierung beider Metabolite wurde des 12C-13C-lsotopenverhältnis genutzt. Die Standardgerade wurde mittels linearer Regression der Isotopen-Verhältnisse und der Standardkonzentrationen ermittelt. Um den dynamischen Bereich zu ermitteln, wurden die Messsignale für die höchsten Konzentrationen entfernt, sodass R2 größer als 0.99 war. Das reduzierte Datenset wurde dann log10-transformiert, um niedrigere Konzentrationen gleichmäßig zu gewichten. In den log10-transformierten Werten werden Messsignale der niedrigsten Konzentrationen verworfen, sodass R2 größer als 0,99 war.
Beispielshaft werden mit erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzellen folgende Malo- nat-(Malonyl-CoA)-Titer bestimmt (Figur 24). Der Wildtyp C. glutamicum ATCC 13032 bzw. dessen Abkömmling der Urtyp C. glutamicum DelAro4-4c/PcCg weist unter Standardbedingun gen einen Malonat-Titer von 0,508 pM auf. Die Stämme C. glutamicum DelAro 4-4clpcCg fasB- E622K, DelAro4-4c/PcCg asß-G1361 D, DelAro4-4c/PcCg asß-G2153E und DelAro 4-4clPcCg fasB- G2668S weisen Malonat-Titer von 1 , 148 pM, 0,658 pM, 0,694 bzw. 0,484 pM auf. Der fasB- Deletionsstamm DelAro4-4clPccg AfasB erreicht sogar 1 ,909 pM Malonat. Mit dem Stamm C. glutamicum DelAro4-4clpcC8-C7 werden 0,741 pM Malonat erreicht. Die Stämme C. glutami- cum DelAro4-4clPcC8-C7 mufasO bzw. C. glutamicum DelAro4-4clPcC8-C7 mufasO AfasB wei- sen einen Titer von 2,261 pM Malonat bzw. 3,645 pM Malonat auf.
Polyphenol-ZPolyketid-Quantifizierung mittels Ethylacetatextraktion und LC-MS Messung
Die Extraktion der Produkte Naringenin, Noreugenin und Resveratroi wird wie beschrieben durchgeführt (Kallscheuer et al. , 2016). Die während der Kultivierung entnommenen Proben wurden aufgetaut und mit 1 ml Ethylacetat versehen und bei 1.400 RPM und 20 °C für 10 Minuten in einem Eppendorf Thermomixer (Hamburg, Deutschland) inkubiert. Die Suspension wurde anschließend bei 16.000 g 5 Minuten zentrifugiert. Von der Ethylacetat-Phase wur den 800 pl in eine Lösungsmittel-resistente 2 ml Deep-Well-Platte (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) überführt. Nach der Evaporation des Lösemittels über Nacht wurden die ge trockneten Extrakte in 800 pl Acetonitril resuspendiert und direkt für die LC-MS-Analyse ver wendet.
Die LC-MS-Analyse der jeweiligen Produkte in den Extrakten wurde wie beschrieben mit einem Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie 1290 Infinity System gekoppelt an ein 6130 Quadrupol LC-MS System (Agilent, Waldbronn, Deutschland) durchgeführt (Kallscheuer et al., 2016). Für die chromatographische Trennung wurde eine Kinetex 1.7 pm C18 Säule mit 100 A Porengröße (50 mm x 2,1 mm [interner Durchmesser]; Phenomenex, Torrance, CA, USA) bei 50 °C verwendet. Als mobile Phasen wurden 0, 1 % Essigsäure (Phase A) so wie Acetonitril + 0, 1 % Essigsäure (Phase B) bei einer Flussrate von 0,5 ml/min verwendet. Es folgte eine Gradientenelution, bei dem der Anteil von Phase B schrittweise erhöht wurde: Minute 0-6: 10-30 %, Minute 6-7: 30-50 %, Minute 7-8: 50-100 %, Minute 8-8,5: 100-10 %. Das Massenspektrometer wurde im negativen Elektrospray-Ionisationsmodus (ESI) betrie ben; die Datenaufnahme erfolgte im Selected-Ion-Monitoring-Modus (SIM). Für die Quantifi zierung wurden reine Produktstandards verschiedener Konzentrationen in Acetonitril ange setzt. Die gemessenen Flächen für die [M-H]— Massensignale ( m/z 271 für Naringenin, m/z 191 für Noreugenin, m/z 227 für Resveratroi) waren für Konzentrationen bis 250 mg/l linear. Als interner Standard diente Benzoat (Endkonzentration 100 mg/l, m/z 121 für Benzoat). Ei ne Eichkurve wurde basierend auf dem Verhältnis der gemessenen Flächen des Analyten zu internem Standard berechnet.
Mit den erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzellen werden folgende Polyphenol- bzw. Polyketid-Titer bestimmt, jeweils unter Standardbedingungen bei Wachstum auf Gluko se bzw. Glukose supplementiert mit p-Cumarsäure. Der Wildtyp C. glutamicum ATCC 13032 bzw. dessen Abkömmling der Urtyp C. glutamicum DelAro4-4c/PcCg pMKEx2-stsAh-4clPc weist unter Standardbedingungen einen Resveratrol-Titer von 8 mg/L bzw. 12 mg/L auf. Die Stämme C. glutamicum DelAro4-4c/pcCg fasB- E622K pMKEx2-stsAh-4clPc, DelAro4-4c/pcCg fasß-G1361 D pMKEx2-stsAh-4clPc, DelAro4-4c/pcCg fasß-G2153E pMKEx2-stsAh-4clPc und DelAro4-4c/PcCg fasB-G 2668S pMKEx2-stsAh-4clPc weisen Resveratrol-Titer von 9 mg/L bzw. 28,90 mg/L, 8,37 mg/L bzw. 18,20 mg/L, 8,49mg/L bzw. 20,30 mg/L und 7,89 mg/L bzw. 1 1 ,70 mg/L Resveratroi auf. Der fasB-Deletionsstamm DelAro4-4clPcCg AfasB pMKEx2-
stsAh-4clPc erreicht sogar 9,49 mg/L bzw. 37 mg/L Resveratrol. Mit dem Stamm C. glutami- cum DelAro4-4clPcC8-C7 pMKEx2-stsAh-4clPc werden 14 mg/L bzw. 1 13 mg/L Resveratrol erreicht. Die Stämme C. glutamicum DelAro4-4clPccg-C7-mufasO pMKEx2-stsAh-4clPc bzw. C. glutamicum DelAro4-4clPccg-C7-mufasO-AfasB pMKEx2-stsAh-4clPc weisen einen Titer von 22,85 mg/L bzw. 262 mg/L Resveratrol und 22,73 mg/L und 260 mg/L Resveratrol auf.
Hinsichtlich der Naringenin-Herstellung weisen die erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzellen folgende Titer auf, jeweils unter Standardbedingungen bei Wachstum auf Glukose bzw. Glukose supplementiert mit p-Cumarsäure. Der Wildtyp C. glutamicum ATCC 13032 bzw. dessen Abkömmling der Urtyp C. glutamicum DelAro4-4c/pcCg pMKEx2-chsPh-chiPh weist unter Standardbedingungen einen Naringenin-Titer von 1 mg/L bzw. 2,1 mg/L auf. Die Stämme C. glutamicum DelAro4-4c/PcCg fasß-E622K pMKEx2-chsPh-chiPh, DelAro4-4c/pcCg fasß-G1361 D pMKEx2-chsPh-chiPh, DelAro4-4c/PcCg fasB- G2153E pMKEx2-chsPh-chiPh und DelAro4-4c/pcCg fasß-G2668S pMKEx2-chsPh-chiPh weisen Naringenin-Titer von 1 ,78 mg/L bzw. 7,1 1 mg/L, 1 ,32 mg/L bzw. 4,54 mg/L, 1 ,55 mg/L bzw. 5,08 mg/L und 1 , 16 mg/L bzw. 2,84 mg/L Naringenin auf. Der fasB-Deletionsstamm DelAro4-4clPcCg AfasB pMKEx2- chsPh-chiPh erreicht sogar 2, 15 mg/L bzw. 9,61 mg/L Naringenin. Mit dem Stamm C. glutamicum DelAro4-4clPcC8-C7 pMKEx2-chsPh-chiPh werden 3,5 mg/L bzw. 18,5 mg/L Naringe- nin erreicht. Die Stämme C. glutamicum DelAro4-4clPccg-C7-mufasO pMKEx2-chsPh-chiPh bzw. C. glutamicum DelAro4-4clPcC8-C7-mufasO-AfasB pMKEx2-chsPh-chiPh weisen einen Titer von 10,59 mg/L bzw. 65 mg/L Naringenin und 9,83 mg/L und 60 mg/L Naringenin auf.
Die erfindungsgemäßen coryneformen Bakterienzellen weisen unter Standardbedingungen bei Wachstum auf Glukose folgende Noreugenin-Titer auf. Für den Wildtyp C. glutamicum ATCC 13032 pMKEx2-pcsAacg-short bzw. dessen Abkömmling der Urtyp C. glutamicum DelA- ro 4-4clpcCg pMKEx2-pcsAaC8-short konnte kein Noreugenin (0,002 mg/L) detektiert werden. Die Stämme C. glutamicum DelAro4-4c/pcCg asß-E622K pMKEx2-pcsAaCg-Short, DelAro4-4c/PcCg fasß-G1361 D pMKEx2-pcsAac5-short, DelAro4-4c/pcCg fasB- G2153E pMKEx2-pcsAaC8-Short und DelAro4-4c/pcCg fasB- G2668S pMKEx2-pcsAaCg-Short weisen Noreugenin-Titer von 0,004 mg/L, 0,003 mg/L, 0,003 mg/L und 0,003 mg/L Noreugenin auf. Mit dem Stamm C. glutamicum DelAro4-4clPccg-C7 pMKEx2-pcsAaCg-Short wird 0,86 mg/L Noreugenin bestimmt. Der Stamm C. glutamicum DelAro4-4clPcC8-C7-mufasO pMKEx2-pcsAaCg.Short weist einen Titer von 4,4 mg/L Noreugenin auf. Der Stamm C. glutamicum DelAro4-4clPcC8-C7-mufasO- AfasB pMKEx2- pcsAacg- short weist einen Titer von 4,51 mg/L Noreugenin auf.
Tabelle 1 :
Tabelle 2
Tabelle 3:
Claims
1. Coryneforme Bakterienzelle mit einer gegenüber ihrem Urtyp erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA, dadurch gekennzeichnet, dass die Regulation und/oder Expression der Gene, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend fasB, gltA, accBC und accD1 , und/oder die Funktionalität der durch sie kodierten Enzyme gezielt modifiziert ist.
2. Coryneforme Bakterienzelle nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere gezielte Modifikationen aufweist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a. Verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB; b. Mutation oder teilweise oder komplette Deletion des für die Fettsäuresynthase kodierende Gen fasB; c. Verminderte Funktionalität des mit dem Citratsynthase-Gen gtIA operativ verknüpften Promotors; d. Verminderte Expression des für die Citratsynthase CS kodierende Gens gltA; e. Verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität der Operator-Bindestellen (fasO) für den Regulator FasR in den Promotorbereichen der Gene accBC und accD1 kodierend für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten; f. Dereprimierte Expression der für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten kodierenden Gene accBC und accD1; g. eine oder mehrere Kombinationen aus a) - f).
3. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB vermindert oder ausgeschaltet ist und/oder das für die Fettsäuresynthase kodierende Gen fasB gezielt mutiert, bevorzugt durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, oder teilweise oder komplett deletiert ist.
4. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des für die Citratsynthase kodierende Gens gltA durch Mutation, bevorzugt mehrere Nukleotidsubstitutionen, des operativ-verknüpften Promotors vermindert ist.
5. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass die Funktionalität der Operator-Bindestellen (fasO) für den Regulator FasR in den Promotorbereichen der Gene accBC und accD1 kodierend für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten, bevorzugt durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, vermindert oder ausgeschaltet ist und die Expression der für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten kodierenden Gene accBC und accD1 dereprimiert, bevorzugt gesteigert, ist.
6. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Kombination aus verminderter Expression und/oder Aktivität der
Citratsynthase (CS) und deregulierter, gesteigerter Expression und/oder Aktivität der Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten (AccBC und AccD1 ) aufweist.
7. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Kombination aus verminderter Expression und/oder Aktivität der
Citratsynthase (CS) und deregulierter, gesteigerter Expression und/oder Aktivität der Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten (AccBC und AccD1) und verminderter oder ausgeschalteter Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB aufweist.
8. Protein mit einer Fettsäuresynthase FasB isoliert aus coryneformen Bakterien deren Funktionalität vermindert oder ausgeschaltet ist zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl- CoA in coryneformen Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe enthaltend SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 und 10 oder Fragmenten oder Allelen davon aufweist.
9. Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Fettsäure-Synthase FasB aus coryneformen Bakterien, deren Funktionalität vermindert oder ausgeschaltet ist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: a. eine Nukleinsäuresequenz enthaltend wenigstens 70% Identität zu der Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmente davon, b. eine Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer komplementären Sequenz einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmenten davon hybridisiert, c. eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmente davon, oder d. eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Fettsäure-Synthase FasB
entsprechend jeder der Nukleinsäuren gemäß a) - c) , die sich jedoch von diesen Nukleinsäuresequenzen gemäß a) - c) durch die Degeneriertheit des genetischen Codes oder funktionsneutrale Mutationen unterscheidet, zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien.
10. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein gemäß Anspruch 8 und/oder eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 9 aufweist.
1 1. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere gezielte Modifikationen aufweist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a. Verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität der Fettsäuresynthase FasB mit wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe enthaltend SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 und 10 oder Fragmenten oder Allelen davon; b. Mutation oder teilweise oder komplette Deletion des für die Fettsäuresynthase kodierende Gen fasB mit einer Nukleinsäuresequenz enthaltend wenigstens 70% Identität zu der Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NO. 1 , 3, 5, 7 und 9 oder Fragmente davon; c. Verminderte Funktionalität des mit dem Citratsynthase-Gen gltA operativ- verknüpften Promotors gemäß SEQ ID NO. 11 ; d. Verminderte Expression des für die Citratsynthase (CS) kodierende Gens gltA; e. Verminderte oder ausgeschaltete Funktionalität der Operator-Bindestellen (fasO) für den Regulator FasR in den Promotorbereichen der Gene accBC und accD1 kodierend für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten gemäß SEQ ID NO. 13 und 15; f. Dereprimierte Expression der für die Acetyl-CoA-Carboxylase-Untereinheiten kodierenden Gene accBC und accD1 ; g. eine oder mehrere Kombinationen aus a) - f).
12. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8, 10 und 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikationen chromosomal-kodiert vorliegen.
13. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8 und 10-12, dadurch
gekennzeichnet, dass sie nicht-rekombinant (non-GVO) verändert ist.
14. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8 und 10-13, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium und Brevibacterium, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, besonders bevorzugt Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium fiavum, Brevibacterium lactofermentum oder Brevibacterium divaricatum.
15. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8 und 10-14 zur Herstellung von Polyphenolen oder Polyketiden, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich der katabole Stoffwechselweg von aromatischen Komponenten, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Phenylpropanoide und Benzoesäure-Derivate, ausgeschaltet ist.
16. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8 und 10-15, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionalität und/oder Aktivität der Enzyme oder die Expression der sie kodierenden Gene beteiligt am katabolen Stoffwechselweg von aromatischen Komponenten durch Deletionen der Gencluster cg0344-47 (phdBCDE - Operon), cg2625-40 ( cat , ben und pca), cg 1226 {pobA ) und cg0502 ( qsuB ) ausgeschaltet sind.
17. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8 und 10-16, dadurch gekennzeichnet, dass sie Gene kodierend für eine feedback-resistente 3-Deoxy-D- Arabinoheptulosonat-7-Phosphat-Synthase (aroH), bevorzugt aus E. coli, und für eine Tyrosinammonium-Lyase (tal), bevorzugt aus Flavobacertium johnsoniae, aufweist.
18. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8 und 10-17, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich aus Pflanzen abgeleitete Enzyme oder die sie kodierenden Gene für die Polyphenol- oder Polyketid-Synthese aufweist.
19. Protein mit einer gesteigerten 5,7-Dihdroxy-2-Methylchromon-Synthase Aktivität
(PCSshort) zur Synthese von Polyketiden in coryneformen Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 22 oder Fragmenten oder Allelen davon aufweist.
20. Nukleinsäuresequenz (pcsS ort) kodierend für eine 5,7-Dihydroxy-2-Methylchromon- Synthase mit gesteigerter Aktivität zur Polyketid-Herstellung in coryneformen Bakterien ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: a. eine Nukleinsäuresequenz enthaltend wenigstens 70% Identität zu der
Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 21 oder Fragmente davon, b. eine Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer komplementären Sequenz einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 21 oder Fragmenten davon hybridisiert, c. eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 21 oder Fragmenten davon, oder d. eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine 5,7-Dihydroxy-2-Methylchromon- Synthase (PCSsh0rt) entsprechend jeder der Nukleinsäuren gemäß a) - c), die an die Codonverwendung coryneformer Bakterien angepasst ist, oder e. die sich von diesen Nukleinsäuresequenzen gemäß a) - d) durch die Degeneriertheit des genetischen Codes oder funktionsneutrale Mutationen unterscheidet.
21. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8 und 10-18, dadurch gekennzeichnet, dass sie die aus Pflanzen abgeleiteten Gene zur Polyphenol- oder Polyketid-Produktion, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend die Gene 4cl, sts, chs, chi und pcs aufweist.
22. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8, 10-18 und 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die pflanzlichen Gene unter der Expressionskontrolle eines induzierbaren Promotors vorliegen.
23. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8, 10-19, 21 und 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Gen 4clPc unter der Expressionskontrolle eines induzierbaren Promotors chromosomal-kodiert aufweist.
24. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8, 10-18 und 21-23, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein nach Anspruch 19 und/oder eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 20 aufweist.
25. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8, 10-18 und 21-24, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Gene ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a. 4cl und sts für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Stilbene, besonders bevorzugt Resveratrol, oder b. chs und chi für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Flavonoide, besonders bevorzugt Naringenin, oder
c. pcsshort für die Synthese von Polyketiden, bevorzugt Noreugenin unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors aufweist.
26. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8, 10-18 und 21-25, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Gene aufweist, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a. fasB und/oder gltA und/oder accBC und accD1 oder Kombinationen davon, deren Funktionalität und/oder Expression für eine erhöhte Bereitstellung von Malonyl- CoA gezielt modifiziert ist, und b. cg0344-47 (phdBCDE-Operon ), cg2625-40 ( cat , ben und pca), cg1226 ( pobA ) und cg0502 ( qsuB ) deren Funktionalität für den Abbau aromatischer Komponenten, bevorzugt aus der Gruppe enthaltend Phenylpropanoide oder Benzoesäure-Derivate, ausgeschaltet ist, und c. pcsshort kodierend für ein Protein mit einer gesteigerten 5,7-Dihdroxy-2- Methylchromon-Synthase-Aktivität (PCSsh0rt) für die Synthese von Polyketiden, bevorzugt Noreugenin, oder d. optional aroFI und tal für die Vorstufen-Synthese von Polyphenolen ausgehend von Glukose, und e. 4cl und sts für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Stilbene, besonders bevorzugt Resveratrol, oder f. chs und chi für die Synthese von Polyphenolen, bevorzugt Flavonoide, besonders bevorzugt Naringenin.
27. Coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8, 10-18 und 21-26, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium und Brevibacterium, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, besonders bevorzugt Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum oder Brevibacterium divaricatum.
28. Verfahren zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien enthaltend die Schritte: a. Bereitstellen einer Lösung enthaltend Wasser und eine C6-Kohlenstoff-Quelle; b. mikrobielle Umsetzung der C6-Kohlenstoffquelle in einer Lösung gemäß Schritt a) zu Malonyl-CoA in Anwesenheit einer coryneformen Bakterienzelle nach einem
der Ansprüche 1-8 und 10-16.
29. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Polyphenolen oder Polyketiden in coryneformen Bakterien enthaltend die Schritte: a. Bereitstellen einer Lösung enthaltend Wasser und eine C6-Kohlenstoff-Quelle, b. mikrobielle Umsetzung der C6-Kohlenstoffquelle in einer Lösung gemäß Schritt a) zu Polyphenolen oder Polyketiden, in Anwesenheit einer coryneformen Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 1-8, 10-18 und 21-27, wobei zunächst Malonyl-CoA in erhöhter Konzentration als Intermediat bereitgestellt und zur mikrobiellen Synthese von Polyphenolen oder Polyketiden weiter umgesetzt wird; c. Induktion der Expression pflanzlicher Gene unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors durch Zugabe eines geeigneten Induktors in Schritt b), d. optional die Aufbereitung des gewünschten Produkts.
30. Verfahren zur Polyphenol-Herstellung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung in Schritt b) mit der Polyphenol-Vorstufe, bevorzugt p-Cumarsäure, supplementiert wird.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung in einem diskontinuierliche oder kontinuierlichen, bevorzugt batch-, fed- batch-, repeated-fed-batch oder kontinuierlichen Modus erfolgt.
32. Verwendung einer coryneformen Bakterienzelle gemäß einem der Ansprüche 1-8, 10-18 und 21-27 und/oder eines Proteins nach Anspuch 8 und/oder einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 9 zur erhöhten Bereitstellung von Malonyl-CoA in coryneformen Bakterien.
33. Verwendung einer coryneformen Bakterienzelle gemäß einem der Ansprüche 1-8, 10-18 und 21-27 und/oder eines Proteins nach Anspuch 19 und/oder einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 20 zur Polyphenol- oder Polyketid-Herstellung in coryneformen Bakterien.
34. Zusammensetzung enthaltend Sekundärmetabolite ausgewählt aus der Gruppe der Polyphenole und Polyketide, bevorzugt der Stilbene, Flavonoide oder Polyketide, besonders bevorzugt Resveratrol, Naringenin und/oder Noreugenin, hergestellt mit einer coryneformen Bakterienzelle gemäß einem der Ansprüche 1-8, 10-18 und 21-27, und/oder einem oder mehreren Proteinen gemäß einem der Ansprüche 8 oder 19
und/oder einer oder mehrerer Nukleotidseuqenzen gemäß einem der Ansprüche 9 oder 20 und/oder einem Verfahren nach einem der Ansprüche 28-31.
35. Verwendung von Resveratrol, Naringenin und/oder Noreugenin hergestellt mit einer coryneformen Bakterienzelle gemäß einem der Ansprüche 1-8, 10-18 und 21-27 und/oder nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 28-31 und/oder die
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 34 zur Herstellung von Pharmazeutika, Lebensmitteln, Futtermitteln, und/oder zum Einsatz in der Pflanzenphysiologie.
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