JP2022503822A - コリネ型細菌におけるマロニルＣｏＡの供給ならびにコリネ型細菌を用いたポリフェノールおよびポリケチドの産生方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、その原型と比べてマロニルＣｏＡの供給が増加しているコリネ型細菌細胞、低下した機能性を有する脂肪酸合成酵素ＦａｓＢ用のタンパク質ならびにそれをコードする核酸配列に関する。さらに、本発明は、コリネ型細菌細胞を用いた、マロニルＣｏＡの供給を増加させる方法およびポリケチドまたはポリフェノールの産生方法、ならびにその使用に関する。
Description
本発明は、コリネ型細菌中でマロニルＣｏＡを供給するための系に関する。本発明は、コリネ型細菌を用いた、二次代謝物、例えば、ポリフェノールおよびポリケチドの産生方法にも関する。
ポリフェノール（スチルベン、フラボノイド）およびポリケチドの群からの非常に様々な分子の多数が、薬理学用途向けに大きな潜在能力をもつ経済的に興味を引く二次代謝物である。スチルベンであるレスベラトロールには、例えば、抗腫瘍、抗菌、抗炎症および抗加齢作用が予想される（Ｐａｎｇｅｎｉ等、２０１４；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５１７／１７４２５２４７．２０１４．９１９２５３（非特許文献１））。同じく、心血管疾患の予防における作用も討論されている。抗突然変異原、抗酸化、抗増殖、および抗アテローム生成作用を含む類似の効果が、フラボノイド、例えば、ナリンゲニンまたはその誘導体に対して記載されている（Ｅｒｌｕｎｄ、２００４；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ． ｎｕｔｒｅｓ．２００４．０７．００５（非特許文献２）、Ｈａｒｂｏｎｅ、２０１３；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－１－４８９９－２９１５－０（非特許文献３））。
もっとも、これらの物質の自然の産生生物（植物、真菌、細菌）は、非常にわずかな生成物量のみ形成および蓄積するか、または培養が困難もしくは不可能であるかのいずれかである。とりわけ植物からの抽出は経済的に興味を引かない。したがって、薬理学的および／または生物工学的に興味を引くポリフェノールおよび／またはポリケチドの大規模での微生物産生が望ましい。
細菌Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）による二次代謝物の産生が記載されている（Ｘｕ等、２０１１、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１１．０６．００８（非特許文献４）；Ｌｉ等、２０１６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／ １０．１０３８／ｓｒｅｐ３６８２７（非特許文献５））。もっとも、そのような複雑な二次代謝物の産生にＥ．ｃｏｌｉを使用する際、とりわけ医学分野でそれを使用する際の安全性に関する大きな懸念が知られている。したがって、その上すでに工業的に実証済みの細胞工場でもあるＧＲＡＳ微生物（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ（一般に安全と認められている））の使用が非常に望まれる。
Ｐａｎｇｅｎｉ等、２０１４；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５１７／１７４２５２４７．２０１４．９１９２５３
Ｅｒｌｕｎｄ、２００４；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ． ｎｕｔｒｅｓ．２００４．０７．００５
Ｈａｒｂｏｎｅ、２０１３；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－１－４８９９－２９１５－０
Ｘｕ等、２０１１、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１１．０６．００８
Ｌｉ等、２０１６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓｒｅｐ３６８２７
したがって、本発明の課題は、ポリフェノール類（スチルベン類、フラボノイド類）およびポリケチド類の群からの分子を、ＧＲＡＳと評価されるコリネ型細菌を用いて大規模に微生物産生するための系および方法を提供することである。本発明のさらなる課題は、狙いを定めた株構築により、詳細に特徴づけられた、公知の欠点を克服する細菌株を提供することである。
ポリフェノールまたはポリケチドを合成するための決定的に重要な成分はマロニルＣｏＡである。フラボノイドおよびスチルベンの群の代表物質に関してはｍｏｌ生成物当たり３ＭｏｌマロニルＣｏＡが必要とされるのに対して、ポリケチドは、ほぼ例外なくマロニルＣｏＡ単位のベース上に構築される。マロニルＣｏＡは、細菌の代謝における中心的中間体であり、細胞膜を介して輸送され得ないため、微生物産生プロセスでの細胞外補給はできない。マロニルＣｏＡは、解糖の最終生成物であるアセチルＣｏＡのカルボキシル化によって細菌細胞内で確かに形成されるが、微生物がマロニルＣｏＡをほぼ例外なく脂肪酸合成用に変換するため、供給の増加を妨げる。また、脂肪酸合成は細胞にとって非常に犠牲の大きい合成であるため、マロニルＣｏＡの合成は厳重に調節されている。
微生物での細胞内マロニルＣｏＡ濃度を増加させるための間接的な手段は、例えば、脂肪酸合成の阻害剤、例えばセルレニンの添加である。コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いたレスベラトロールの産生は、Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ等（２０１６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１６．０６．００３）においても記載されている。ここでも、レスベラトロールの形成を達成するためには、脂肪酸合成を阻害するセルレニンが使用される。もっとも、セルレニン添加の本質的な欠点は、セルレニンを添加すると細胞がその増殖を完全に停止することである。これはまた、増殖時にのみ起こる、細胞内でのマロニルＣｏＡ供給にとって不利である。
セルレニンは、脂肪酸合成を選択的に不可逆阻害する抗生物質である（Ｏｍｕｒａ等；１９７６；ＰＭＩＤ ７９１２３７）。この阻害により、マロニルＣｏＡはもはや脂肪酸の内因性合成には消費されず、別の変換、例えば、二次代謝物の合成に提供されるかもしれない。もっとも、セルレニンは非常に高価であるため、大規模または工業的に興味を引く微生物産生方法での使用にはわずかにのみ適切であろう。セルレニンのはるかに本質的な欠点は、さらに、脂肪酸合成の阻害により、細胞の増殖が極端に阻害され、細胞が通例は間もなく（細胞分裂を）、最終的にはもはやまったく増殖できなくなることである。したがって、微生物によるまたは生物工学的な産生方法でのセルレニンの使用は、高い費用、および細胞死ゆえさらには最適化できない収率に目を向けると、賢明な経済的代案ではない。それゆえ、本発明のさらなる課題は、セルレニンの添加に依存しない、コリネ型細菌中での中心的代謝物マロニルＣｏＡの濃度を増加させるための系および方法の提供にある。
本発明のさらなる課題は、コリネ型細菌中でのマロニルＣｏＡの生物工学的供給に適切であり、細胞の増殖が影響を受けないままであるか、もしくは不利には影響を受けないか、またはまったく停止することがない、経済的に興味を引く系を提供することである。
さらに、本発明の課題は、例えば、細胞内の多数の遺伝子またはタンパク質に対して影響を及ぼす中心的に作用する１つまたは複数の調節因子（例えば、調節タンパク質ＦａｓＲ）が消失している場合にそうであるように、広く不明確な生理学的影響を有し得る、コリネ型細菌の細胞系の代謝への介入を回避することである。それゆえ、本発明のさらなる課題は、非組換えコリネ型細菌（ｎｏｎ－ＧＭＯ）を用いたマロニルＣｏＡの微生物産生を可能にすると同時に公知の欠点を克服する、狙いを定めて作製され、正確に規定された細胞系および１つまたは複数の規定された類似の構造要素の提供である。
本発明のさらなる課題は、経済的に興味を引く二次代謝物、例えば、ポリフェノール（スチルベン、フラボノイド）およびポリケチドの群からの分子をコリネ型細菌中で微生物産生するための、公知の欠点を克服する方法を提供することである。
これらの課題は、以下で説明するように、本発明により有利な様式で解決される。
まず、本発明の手短な記載が続くが、それにより本発明の主題を限定するものではない。
本発明の主題は、その原型と比べてマロニルＣｏＡの供給が増加しており、ｆａｓＢ、ｇｌｔＡ、ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１を含む群から選択される遺伝子の調節および／もしくは発現、ならびに／またはそれらによってコードされる酵素の機能性が狙いを定めて改変されているコリネ型細菌細胞である。本発明のさらなる主題は、
ａ）脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性、
ｂ）脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢの突然変異または部分的もしくは完全な欠失、
ｃ）シトレート合成酵素遺伝子（Ｃｉｔｒａｔｓｙｎｔｈａｓｅ－Ｇｅｎ）ｇｔｌＡと作動可能に連結されたプロモーターの低下した機能性、
ｄ）シトレート合成酵素ＣＳをコードする遺伝子ｇｌｔＡの低下した発現、
ｅ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域内にある調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の低下または消失した機能性、
ｆ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の抑制解除された発現、
ｇ）ａ）～ｆ）からの１つまたは複数の組み合わせ
を含む群から選択される１つまたは複数の狙いを定めた改変を有するコリネ型細菌細胞を含む。
ａ）脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性、
ｂ）脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢの突然変異または部分的もしくは完全な欠失、
ｃ）シトレート合成酵素遺伝子（Ｃｉｔｒａｔｓｙｎｔｈａｓｅ－Ｇｅｎ）ｇｔｌＡと作動可能に連結されたプロモーターの低下した機能性、
ｄ）シトレート合成酵素ＣＳをコードする遺伝子ｇｌｔＡの低下した発現、
ｅ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域内にある調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の低下または消失した機能性、
ｆ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の抑制解除された発現、
ｇ）ａ）～ｆ）からの１つまたは複数の組み合わせ
を含む群から選択される１つまたは複数の狙いを定めた改変を有するコリネ型細菌細胞を含む。
それゆえ、脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの機能性が低下または消失している、および／あるいは脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢが、好ましくは１つもしくは複数のヌクレオチド置換により狙いを定めて突然変異しているか、または部分的もしくは完全に欠失しているコリネ型細菌細胞も本発明により含まれる。
シトレート合成酵素をコードする遺伝子ｇｌｔＡの発現が、作動可能に連結されたプロモーターの突然変異、好ましくは複数のヌクレオチド置換により低下しているコリネ型細菌細胞も本発明により含まれる。
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域内にある調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の機能性が、好ましくは１つまたは複数のヌクレオチド置換により低下または消失しており、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の発現が抑制解除されている、好ましくは増強しているコリネ型細菌細胞も本発明の主題である。
シトレート合成酵素（ＣＳ）の低下した発現および／または活性、ならびにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）の調節解除され、増強した発現および／または活性からなる組み合わせを有するコリネ型細菌細胞も本発明のさらなる主題である。
シトレート合成酵素（ＣＳ）の低下した発現および／または活性、ならびにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）の調節解除され、増強した発現および／または活性、ならびに脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性からなる組み合わせを有するコリネ型細菌細胞も本発明により含まれる。
ポリフェノールまたはポリケチドを産生するための、前記の種類の改変を有する、好ましくはフェニルプロパノイドおよび安息香酸誘導体を含む群から選択される芳香族成分の異化代謝経路が付加的に消失しているコリネ型細菌細胞も本発明の主題である。
好ましくはＥ．ｃｏｌｉ由来のフィードバック耐性３－デオキシ－Ｄ－アラビノヘプツロソネート－７－ホスフェート合成酵素（３－Ｄｅｏｘｙ－Ｄ－Ａｒａｂｉｎｏｈｅｐｔｕｌｏｓｏｎａｔ－７－Ｐｈｏｓｐｈａｔ－Ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ａｒｏＨ）および好ましくはフラボバクテリウム・ジョンソニエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）由来のチロシンアンモニウムリアーゼ（ｔａｌ）をコードする遺伝子を付加的に有するコリネ型細菌細胞も本発明により含まれる。
ポリフェノールまたはポリケチド合成用の、植物から誘導された酵素またはそれらをコードする遺伝子を付加的に有する前記の種類のコリネ型細菌細胞も本発明の主題である。
本発明によると、コリネ型細菌細胞は、コリネバクテリウムおよびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム、特に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２を含む群から選択される属またはそれらの特異的な遺伝子改変バリアントである。
前記のコリネ型細菌を用いてコリネ型細菌中でのマロニルＣｏＡの供給を増加させる方法およびコリネ型細菌中でのポリフェノール類またはポリケチド類の微生物産生方法も本発明の主題である。本発明によると、該方法はセルレニンの添加に依存しない。
コリネ型細菌中でのマロニルＣｏＡの供給を増加させるための本発明によるコリネ型細菌細胞の使用、およびコリネ型細菌を用いてポリフェノールまたはポリケチドを産生するための本発明によるコリネ型細菌細胞の使用も本発明の主題である。
ポリフェノール類およびポリケチド類、好ましくはスチルベン類、フラボノイド類およびポリケチド類、特に好ましくはレスベラトロール、ナリンゲニンおよびノルオイゲニン（Ｎｏｒｅｕｇｅｎｉｎ）の群から選択される、本発明によるコリネ型または本発明による方法を用いて産生された二次代謝物を含有する組成物も本発明により含まれる。医薬、食品、飼料を製造するため、および／または植物生理学において使用するための、前記の本発明による組成物の使用も本発明の主題である。
以下では本発明の主題を例によりおよび図をもとにより詳細に説明するが、それにより本発明の主題を限定はしない。
実施例を記載する前に、本発明の理解に重要であるいくつかの定義を先行して述べる。
本発明の主題は、その原型と比べてマロニルＣｏＡの供給が増加しており、ｆａｓＢ、ｇｌｔＡ、ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１を含む群から選択される遺伝子の調節および／もしくは発現、ならびに／またはそれらによってコードされる酵素の機能性が狙いを定めて改変されているコリネ型細菌細胞である。
それゆえ、
ａ）脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性、
ｂ）脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢの突然変異または部分的もしくは完全な欠失、
ｃ）シトレート合成酵素遺伝子ｇｔｌＡと作動可能に連結されたプロモーターの低下した機能性、
ｄ）シトレート合成酵素ＣＳをコードする遺伝子ｇｌｔＡの低下した発現、
ｅ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域内にある調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の低下または消失した機能性、
ｆ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の抑制解除された発現、
ｇ）ａ）～ｆ）からの１つまたは複数の組み合わせ
を含む群から選択される１つまたは複数の狙いを定めた改変を有するコリネ型細菌細胞が本発明により含まれる。
ａ）脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性、
ｂ）脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢの突然変異または部分的もしくは完全な欠失、
ｃ）シトレート合成酵素遺伝子ｇｔｌＡと作動可能に連結されたプロモーターの低下した機能性、
ｄ）シトレート合成酵素ＣＳをコードする遺伝子ｇｌｔＡの低下した発現、
ｅ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域内にある調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の低下または消失した機能性、
ｆ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の抑制解除された発現、
ｇ）ａ）～ｆ）からの１つまたは複数の組み合わせ
を含む群から選択される１つまたは複数の狙いを定めた改変を有するコリネ型細菌細胞が本発明により含まれる。
脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの機能性が低下または消失している、および／あるいは脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢが、好ましくは１つもしくは複数のヌクレオチド置換により特異的に突然変異しているか、または部分的もしくは完全に欠失しているコリネ型細菌細胞も本発明により含まれる。
シトレート合成酵素をコードする遺伝子ｇｌｔＡの発現が、作動可能に連結されたプロモーターの突然変異、好ましくは複数のヌクレオチド置換により低下しているコリネ型細菌細胞も同じく本発明により含まれる。
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域内にある調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の機能性が、好ましくは１つまたは複数のヌクレオチド置換により低下または消失しており、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の発現が抑制解除されている、好ましくは増強しているコリネ型細菌細胞も本発明の主題である。
ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１前方にあるｆａｓＯ結合部位の突然変異は公知である（Ｎｉｃｋｅｌ等、２０１０；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１３６５－２９５８．２０１０．０７３３７．ｘ）。ここでは、脂肪酸合成酵素調節因子ＦａｓＲの結合を損失させる、ｆａｓＯ結合部位の突然変異が記載されている。ａｃｃＢＣの場合、ｆａｓＯ結合部位は、ａｃｃＢＣ遺伝子の上流に位置するため、（Ｎｉｃｋｅｌ等、２０１０年）による突然変異を適用することができた。ａｃｃＤ１の場合、リーディングフレームとｆａｓＯ結合部位とが重複する（図２３；灰色強調表示された左側ボックス内のＡＴＧがａｃｃＤ１の開始コドンである）。したがって、この領域内の突然変異は、ここではさもなければ開始コドンを突然変異させることになるため不可能である。該突然変異により、選択的開始コドン（ＧＴＧまたはＴＴＧ）が形成されることもないため翻訳が不可能であり、ＡｃｃＤ１サブユニット、それゆえ機能性アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性が存在しないという結果になる。このためさらには、マロニルＣｏＡを形成できず、細胞はおそらく致死となるか、または著しく不具となる。それゆえ、Ｎｉｃｋｅｌ等による突然変異は、本発明には不適切である。
本発明により、コリネ型細菌のａｃｃＤ１遺伝子前方に５’作動可能に連結された新規ｆａｓＯ結合部位を提供する。この結合部位は、有利なことには、アミノ酸配列およびコリネ型細菌中での可能な限り最良のコドン使用頻度を考慮しつつ、天然ｆａｓＯ配列：ＭＴＩＳＳＰＸからの最大限の差異を有することが顕著である（図２３）。その際、ａｃｃＢＣ前方にあるｆａｓＯ結合部位中の１１～１３（ｔｇａ－＞ｇｔｃ）および２０～２２位（ｃｃｔ－＞ａａｇ）においてヌクレオチド置換が存在する。ａｃｃＤ１前方のｆａｓＯ結合部位中では、２０～２４位（ｃｃｔｃａ－＞ｇｔａｃｇ）にヌクレオチド置換が存在する。本発明の一バリアントでは、ａｃｃＢＤまたはａｃｃＤ１遺伝子前方にある本発明によるｆａｓＯ結合部位が、配列番号１３または１５による核酸配列を有する。
シトレート合成酵素（ＣＳ）の低下した発現および／または活性、ならびにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）の調節解除され、増強した発現および／または活性からなる組み合わせを有するコリネ型細菌細胞も本発明のさらなる主題である。
シトレート合成酵素（ＣＳ）の低下した発現および／または活性、ならびにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）の調節解除され、増強した発現および／または活性、ならびに脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性からなる組み合わせを有するコリネ型細菌細胞も本発明により含まれる。
その際、本発明によるコリネ型細菌細胞は、とりわけ、マロニルＣｏＡの同化作用が特異的に増強していると同時に細胞の増殖が影響を受けていないことが顕著である。そのようなコリネ型細菌細胞は、これまでのところ記載されていない。従来は、細胞内のマロニルＣｏＡ濃度を上げるためにマロニルＣｏＡの異化代謝を消失しているが、それは、細胞がもはや増殖できないという不利な効果を伴う。これは、多彩に、例えば、セルレニンの添加により記載されている。しかしながら、増殖の欠如は、厳重に制御されたマロニルＣｏＡ供給に不利な影響を及ぼす、すなわち、マロニルＣｏＡがわずかにのみ供給されるため、反産生的であると判明する。本発明は、そのような欠点を有利な様式で克服する。
用語「原型」は、本発明の主旨では、例えば、遺伝的に変化していない元の遺伝子または元の酵素を供給する、コリネ型細菌細胞の「野生型」と理解され得ると同様にその直接誘導体とも理解され得る。コリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム属のコリネ型野生型細胞が好ましく、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムのコリネ型細菌細胞が特に好ましく、野生型コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２のコリネ型細菌細胞がとりわけ好ましい。それゆえ本発明によると、用語「原型」には、「野生型」の他に、狙いを定めて誘導され、厳密に定義され、詳細に特徴づけられた、野生型の「誘導体」も含まれる。その際、「誘導体」は、分子生物学的方法を利用して、狙いを定めて、指向的にかつ制御下に生じた上に、同種、非組換え的な変化、例えば、ヌクレオチド置換または欠失または野生型のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ－ｕｓａｇｅ）への異種核酸配列の適合である変化を有する。結果として生じる誘導体は、生理学的に詳細に特徴づけられており、異種核酸配列を、染色体上にコードされてもプラスミドにコードされても担持しない。本発明の主旨での「原型」の例としては、芳香族成分の分解を担う遺伝子がゲノムから欠失している、野生型のコリネ型細菌細胞を挙げる。欠失の他に、それによると野生型が遺伝的に同種非組換え生物のままである、ゲノム中の狙いを定めた（ｇｅｚｉｅｌｔ）ヌクレオチド置換も可能である。この例は、本発明に関して限定的に解釈されるものではない。本発明によると、同一、同種の宿主生物の狙いを定めたヌクレオチド交換であるため、結果として生じる生物は本発明により非組換え的に変化している。本発明の主旨での「同種」とは、本発明による酵素およびそれをコードする本発明による核酸配列および本発明による、これらの核酸配列と調節的に連結された非コード核酸配列が、系統的に（ｖｅｒｗａｎｄｔｓｃｈａｆｔｌｉｃｈ）、コリネ型細菌細胞の共通の親株に由来することと理解される。「同種」とは、本発明により用語「非異種」と同義に利用する。本発明による「原型」は、遺伝的および生理学的に厳密に特徴づけられ、同種、非組換え的であり、「野生型」と同等に扱い得る。用語「野生型」、「誘導体」および「原型」は、本発明により同義で使用する。
本発明の主旨では、「低下または消失した機能性」とは、例えば、本発明による脂肪酸合成酵素ＦａｓＢのタンパク質レベルでの機能性と同様にそれをコードする本発明による核酸配列にも関する。それゆえ「機能性」は一般的に、タンパク質、またはそれをコードする、例えばヌクレオチド置換もしくは欠失によって低下もしくは消失していてもよい核酸配列の機能を含む。それゆえ「機能性」は、変化していてもよい、例えば、低下または消失していてもよいタンパク質の活性も含む。その際、タンパク質の活性の変化は、本発明によると、活性触媒中心と同様に調節中心における変化も含み得る。これらのバリアントも本発明により同じく含まれる。
本発明の一バリアントでは、酵素および／またはそのコード核酸配列および／または作動可能に連結された非コード調節核酸配列の改変された機能性を有することが顕著なコリネ型細菌細胞が含まれる。本発明によるコリネ型細菌細胞のさらなる一バリアントは、その改変が、ａ）遺伝子発現に関する調節もしくは信号構造の変化、ｂ）コードする核酸配列の転写活性の変化、またはｃ）コードする核酸配列の変化を含む群から選択される変化に基づくことが顕著である。その際、例えば、抑制遺伝子、活性化遺伝子、オペレーター、プロモーター、アテニュエーター、リボゾーム結合部位、開始コドン、ターミネーターの変化による、例えば、遺伝子発現の信号構造の変化が本発明によると含まれる。本発明によるコリネ型細菌細胞のゲノムへの、より強力もしくはより微弱なプロモーターまたは誘導性プロモーターの導入、あるいはコードまたは非コード領域内での欠失またはヌクレオチド置換も同じく含まれ、それらの分子生物学的方法は当業者には公知である。本発明の主題は、変化が、染色体上にコードされてゲノム中に存在するか、または染色体外、すなわちベクターにコードされて、もしくはプラスミドにコードされて存在するコリネ型細菌細胞である。本発明によると、プラスミドとして、コリネ型細菌中で複製されるようなものが適切である。多数の公知のプラスミドベクター、例えば、ｐＺ１（Ｍｅｎｋｅｌ等、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）６４：５４９～５５４）、ｐＥＫＥｘ１（Ｅｉｋｍａｎｎｓ等、Ｇｅｎｅ １０２：９３～９８（１９９１））、またはｐＨＳ２－１（Ｓｏｎｎｅｎ等、Ｇｅｎｅ １０７：６９～７４（１９９１））が、潜在プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に基づく。例えば、ｐＣＧ４（ＵＳ－Ａ４，４８９，１６０）、またはｐＮＧ２（Ｓｅｒｗｏｌｄ－Ｄａｖｉｓ等、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６６、１１９～１２４（１９９０））、またはｐＡＧ１（ＵＳ－Ａ５，１５８，８９１）に基づくような他のプラスミドベクターを同じ様式で使用できる（Ｏ． Ｋｉｒｃｈｎｅｒ ２００３、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０４：２８７～９９）。調節可能な発現を有するベクター、例えば、ｐＥＫＥｘ２（Ｂ． Ｅｉｋｍａｎｎｓ、１９９１ Ｇｅｎｅ １０２：９３～８（１９９１）；Ｏ． Ｋｉｒｃｈｎｅｒ ２００３、Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０４：２８７～９９）またはｐＥＫＥｘ３（Ｇａｎｄｅ， Ｒ．、Ｄｏｖｅｒ， Ｌ．Ｇ．、Ｋｒｕｍｂａｃｈ， Ｋ．、Ｂｅｓｒａ， Ｇ．Ｓ．、Ｓａｈｍ， Ｈ．、Ｏｉｋａｗａ， Ｔ．、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ， Ｌ、２００７「Ｔｈｅ ｔｗｏ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ａｎｄ ｍｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８９（１４）、５２５７～５２６４、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＪＢ ００２５４－０７）も同じく利用可能である。染色体への組込みにより遺伝子を単一コピー（Ｐ． Ｖａｓｉｃｏｖａ １９９９、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８１：６１８８～９１）または多コピー（Ｄ． Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ １９９４ Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６０：１２６～１３２）で発現してもよい。ベクターを用いた、望ましい株の形質転換は、例えばＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの望ましい株の接合またはエレクトロポレーションによって行う。接合の方法は、例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ等（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）６０：７５６～７５９）に記載されている。形質転換の方法は、例えば、Ｔａｕｃｈ等（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９４）１２３：３４３～３４７）に記載されている。
本発明により好ましい、コード核酸配列および／または調節構造の部分または完全欠失に加えて、例えば、転移、転換、または挿入のような変化、および指向性進化法も本発明により含まれる。そのような変化の生成に関する指示は、公知の手引き書（Ｒ． Ｋｎｉｐｐｅｒｓ「Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｋ」、第８版、２００１、Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ出版、シュトゥットガルト、ドイツ）から読み取れる。本発明によると核酸置換または欠失が好ましい。
本発明の主旨では、「低下または消失した機能性」とは、遺伝子またはタンパク質の機能性に関するのみならず、中心的に作用する調節タンパク質、例えばｆａｓＲが、そこに通常は結合することにより、コードする核酸配列の発現が抑制される調節因子結合部位、例えばオペレーター結合部位ｆａｓＯの変化した機能性にも関する。それゆえ、本発明の主旨での「低下した」または「消失した」とは、コードする核酸配列の発現が、本発明の主旨での野生型または原型宿主細胞における状況と比べて悪化しているか、またはもはや調節因子の発現制御下にないことも意味する。本発明の主旨では、「低下した」または「消失した」とは、「調節解除された」または「抑制解除された」と同じ意味と理解され得る。それゆえ、調節因子結合部位の「抑制解除された機能性」は、本発明の主旨では、該当する後続の遺伝子の増加した発現ももたらし得る。
本発明の主旨では、「低下または消失した機能性」とは、コードする遺伝子前方の５’調節領域内にあるプロモーター領域の変化した機能性にも関する。「機能性」の変化は、プロモーターの活性を増強、またはただし低下させることもできる。本発明による一バリアントでは、例えばシトレート合成酵素をコードする遺伝子ｇｔｌＡ前方にあるプロモーターが、その機能の点で、そのため活性が低下する。このため、このプロモーターによってコードされる遺伝子の発現が弱まる。調節機構および変化の際のその影響は、すべての変種において当業者は熟知している。
本発明は、用語「改変」により、「変化」例えば「遺伝子改変」も意味し、本発明によると、確かに遺伝子工学的方法を適用するが、核酸分子の挿入は生じないことを意味する。本発明の主旨では、「改変」または「変化」により置換および／または欠失、好ましくは置換が意味される。本発明の主旨での「改変」、「変化」または「遺伝子改変」は、本発明による核酸の非コード調節領域内でも生じる。本発明の主旨では、それらの変化がｆａｓＯ結合部位の機能性およびｆａｓＲ結合に対して測定可能な「低下」または「消失」の主旨での影響を及ぼす、コードする遺伝子または遺伝子クラスターの調節領域内にあるあらゆる可能な位置が意味され含まれる。
コリネ型細菌から単離された、その機能性が低下または消失しており、コリネ型細菌中でのマロニルＣｏＡの増加した供給を可能にする、そのアミノ酸配列が、配列番号２、４、６、８および１０を含む群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードするタンパク質も本発明の主題である。配列番号２、４、６、８および１０を含む群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を有する脂肪酸合成酵素ＦａｓＢも本発明により含まれる。配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列またはその断片よりコードされる脂肪酸合成酵素が、本発明によりさらに含まれる。本発明は、配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列またはその断片によってコードされる脂肪酸合成酵素も含む。
配列番号２、４、６、８および１０によるアミノ酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７５もしくは８０％、好ましくは少なくとも８１、８２、８３、８４、８５もしくは８６％の同一性、特に好ましくは８７、８８、８９、９０％の同一性、とりわけ好ましくは少なくとも９１、９２、９３、９４、９５％の同一性または非常に好ましくは９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするタンパク質も本発明により含まれる。さらには、本発明は、配列番号２、４、６、８および１０によるアミノ酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子を含有する脂肪酸合成酵素ＦａｓＢに関する。
本発明の主題は、コリネ型細菌中でのマロニルＣｏＡの供給を増加させるための、
ａ）配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列もしくはその断片、
ｂ）ストリンジェントな条件下に配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列の相補的配列もしくはその断片とハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列もしくはその断片、または
ｄ）ａ）～ｃ）による核酸の各々に応じて、脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードするが、遺伝暗号の縮重もしくは機能的中立突然変異により、ａ）～ｃ）によるこれらの核酸配列とは異なる核酸配列、
を含む群から選択される、その機能性が低下または消失しているコリネ型細菌由来の脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードする核酸配列でもある。
ａ）配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列もしくはその断片、
ｂ）ストリンジェントな条件下に配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列の相補的配列もしくはその断片とハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列もしくはその断片、または
ｄ）ａ）～ｃ）による核酸の各々に応じて、脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードするが、遺伝暗号の縮重もしくは機能的中立突然変異により、ａ）～ｃ）によるこれらの核酸配列とは異なる核酸配列、
を含む群から選択される、その機能性が低下または消失しているコリネ型細菌由来の脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードする核酸配列でもある。
本発明の主題は、配列番号１、３、５、７および９による核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列またはその断片によってコードされる脂肪酸合成酵素ＦａｓＢでもある。配列番号１、３、５、７および９による核酸配列またはその断片に対して少なくとも７５％もしくは８０％、好ましくは少なくとも８１、８２、８３、８４、８５もしくは８６％の同一性、特に好ましくは８７、８８、８９、９０％の同一性、とりわけ好ましくは少なくとも９１、９２、９３、９４、９５％の同一性または非常に好ましくは９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する核酸配列も本発明により含まれる。さらには、本発明は、配列番号１、３、５、７および９による核酸配列またはその断片によってコードされる脂肪酸合成酵素ＦａｓＢに関する。
低下または消失した機能性を有する脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードするタンパク質、または前記の変化した機能性を有する脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードする核酸配列を有するコリネ型細菌細胞も本発明により含まれる。
本発明の一バリアントでは、
ａ）配列番号２、４、６、８および１０を含む群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性、
ｂ）配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列またはその断片に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列を有する、脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢの突然変異または部分的もしくは完全な欠失、
ｃ）配列番号１１による、シトレート合成酵素遺伝子ｇｌｔＡと作動可能に連結されたプロモーターの低下した機能性、
ｄ）シトレート合成酵素（ＣＳ）をコードする遺伝子ｇｌｔＡの低下した発現、
ｅ）配列番号１３および１５による、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域内にある調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の低下または消失した機能性、
ｆ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の抑制解除された発現、
ｇ）ａ）～ｆ）からの１つまたは複数の組み合わせ
を含む群から選択される１つまたは複数の狙いを定めた改変を有するコリネ型細菌細胞も含まれる。
ａ）配列番号２、４、６、８および１０を含む群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性、
ｂ）配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列またはその断片に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列を有する、脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢの突然変異または部分的もしくは完全な欠失、
ｃ）配列番号１１による、シトレート合成酵素遺伝子ｇｌｔＡと作動可能に連結されたプロモーターの低下した機能性、
ｄ）シトレート合成酵素（ＣＳ）をコードする遺伝子ｇｌｔＡの低下した発現、
ｅ）配列番号１３および１５による、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域内にある調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の低下または消失した機能性、
ｆ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の抑制解除された発現、
ｇ）ａ）～ｆ）からの１つまたは複数の組み合わせ
を含む群から選択される１つまたは複数の狙いを定めた改変を有するコリネ型細菌細胞も含まれる。
本発明のバリアントでは、ヌクレオチド置換およびそれに従って対応するアミノ酸交換が存在する、コリネ型細菌由来の脂肪酸合成酵素ＦａｓＢのタンパク質および／またはコリネ型細菌由来の脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードする核酸配列も含まれる。そのようなバリアントが実施例において説明されるが、それらは本発明に対して限定的には影響しない。
本発明のバリアントでは、シトレート合成酵素遺伝子ｇｌｔＡと作動可能に連結されたプロモーターの機能性も低下している。そのためには、ポリメラーゼの結合を担う結合部位において本発明によりヌクレオチド置換を行うか、もしくはより微弱なプロモーターのプロモーター全配列を天然に存在するプロモーター配列と交換するか、または両方からなる組み合わせを行うことができ、より微弱なプロモーターは、ヌクレオチド置換によって付加的にさらに弱まる。本発明によると、同一、同種の宿主生物の狙いを定めたヌクレオチド交換であるため、結果として生じる生物は本発明により非組換え的に変化している。
本発明の主旨での「同種」とは、本発明による酵素およびそれらをコードする本発明による核酸配列および本発明による、これらの核酸配列と調節的に連結された非コード核酸配列が、系統的に、コリネ型細菌細胞の共通の親株に由来することと理解される。「同種」とは、本発明により用語「非異種」と同義に利用する。
本発明の主旨での用語「核酸配列」は、遺伝情報を輸送する各相同分子単位を意味する。これはそれに従って、相同遺伝子、好ましくは天然に存在するおよび／もしくは非組換えの相同遺伝子、相同導入遺伝子またはコドン最適化相同遺伝子に関する。用語「核酸配列」は、本発明によると、特異的タンパク質をコードまたは発現する核酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に関する。好ましくは、用語「核酸配列」が、コード配列に先行する（アップストリーム、上流、５’－非コード配列）、および後続する（ダウンストリーム、下流、３’－非コード配列）調節配列を含有する核酸配列に関する。用語「天然に存在する」遺伝子は、自然界に見出される、例えば、コリネ型細菌細胞の野生型株に由来する、その固有の調節配列を有する遺伝子に関する。
用語「作動可能に連結された領域」は、本発明の主旨では、個々の核酸断片上での核酸配列の会合に関するため、一方の核酸配列の機能が他方の核酸配列の機能によって影響されることになる。プロモーターまたは調節タンパク質の結合部位の関連では、本発明の主旨での用語「作動可能な連結」は、コード配列が、コード配列の発現を調節する調節領域（とりわけプロモーターまたは調節因子結合部位）の制御下にあることを意味する。
本発明により、コリネ型細菌のａｃｃＤ１遺伝子前方に５’作動可能に連結された新規ｆａｓＯ結合部位も提供する。本発明のバリアントでは、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域内にある調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の低下または消失した機能性も含まれる。この結合部位は、有利なことには、アミノ酸配列およびコリネ型細菌中での可能な限り最良のコドン使用頻度を考慮しつつ、天然ｆａｓＯ配列：ＭＴＩＳＳＰＸからの最大限の差異を有することが顕著である（図２３）。その際、ａｃｃＢＣ前方にあるｆａｓＯ結合部位中の１１～１３（ｔｇａ－＞ｇｔｃ）および２０～２２位（ｃｃｔ－＞ａａｇ）においてヌクレオチド置換が存在する。ａｃｃＤ１前方のｆａｓＯ結合部位中では、２０～２４位（ｃｃｔｃａ－＞ｇｔａｃｇ）にヌクレオチド置換が存在する。
それゆえ、本発明の主題は、配列番号１５によるヌクレオチド置換を有する、コリネ型細菌由来のａｃｃＤ１遺伝子前方５’側の非コード調節領域内にある作動可能に連結されたｆａｓＯ結合部位の核酸配列でもある。その機能性が変化したｆａｓＯ結合部位に起因し、ＦａｓＲ調節タンパク質の結合がもはや不可能であり、ａｃｃＤ１遺伝子の発現の調節解除が起こり、サブユニットａｃｃＤ１の発現が結果として増強する。本発明による調節解除された、すなわち増強したサブユニットａｃｃＢＣの発現と組み合わせると、本発明によるとこれにより、コリネ型細菌中でのマロニルＣｏＡの供給が増加する。
本発明による改変が、有利なことには染色体上にコードされて存在するコリネ型細菌細胞も本発明の主題である。非組換え（ｎｏｎ－ＧＭＯ）であるコリネ型細菌細胞も本発明により含まれる。
用語「非組換え」とは、本発明の主旨では、本発明によるコリネ型細菌細胞の遺伝物質が、自然な様式で、例えば、自然組換えまたは自然突然変異によって起こり得るであろうようにのみ変化していることと理解される。それゆえ、本発明によるコリネ型細菌細胞は、非遺伝子改変生物（ｎｏｎ－ＧＭＯ）として顕著である。
これにより、組換えまたは異種の遺伝子材料を細胞に導入する必要なく、工業的に興味を引く、コリネ型細菌の産生株をさらに最適化する可能性も開かれる。それゆえ、本発明は、それを用いると明らかにより簡単、より安定、より安価、より経済的にマロニルＣｏＡの微生物産生を行うことができる系を提供する。なぜなら、マロニルＣｏＡ合成能力を有するこれまで公知のすべての細菌株は、それらの増殖に複合培地を必要とするため、培養は明らかにより手間がかかり、より高価、そのためより不経済になるからである。ここではとりわけ、脂肪酸合成の阻害剤、例えば、非常に高価であるため、大規模の産生方法での使用には適切でないセルレニンの添加を挙げておく。また、これまで記載されたすべてのマロニルＣｏＡ産生生物は、ＧＲＡＳ生物ではない。そのため、特定の産業分野（例えば、食品および薬品産業）での使用には、手間のかかる認可手続きゆえに欠点が生じる。
本発明によるコリネ型細菌細胞は、多数の利点を提供し、それらのうち選択したものを以下で記載する。好ましくはコリネバクテリウム属のコリネ型細菌は、あらゆる産業分野で使用可能である「Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ（一般に安全と認められている）」（ＧＲＡＳ）生物である。コリネ型細菌は、合成培地上で高い増殖速度およびバイオマス収量を達成し（Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇｅｒ等、２０１２）、コリネ型細菌の産業上の使用においては広範囲にわたる知見が存在する（Ｂｅｃｋｅｒ等、２０１２）。
本発明によると、コリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム属のコリネ型細菌が含まれる。本発明による、コリネ型細菌のバリアントは、コリネバクテリウムおよびブレビバクテリウム、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム、特に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、またはブレビバクテリウム・ディバリカツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）を含む群から選択される。コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２または狙いを定めて変化させた誘導体もしくは原型、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ） ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＦＥＲＭ ＢＰ－１５３９、ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ディバリカツム ＡＴＣＣ１４０２０を含む群から選択されるコリネ型細菌細胞も本発明により含まれる。
コリネバクテリウム・グルタミクム、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２から出発する、前記の本発明による改変のうちの１つまたは複数を有する、また、好ましくはフェニルプロパノイドおよび安息香酸誘導体を含む群から選択される芳香族成分の異化代謝経路が付加的に消失しているコリネ型細菌細胞も本発明により含まれる。
本発明によるさらなるコリネ型細菌細胞のバリアントは、芳香族成分の異化代謝経路に関与する酵素の機能性および／もしくは活性またはそれらをコードする遺伝子の発現が、遺伝子クラスターｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）、ｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）、ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）ならびにｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）の欠失により消失していることが顕著である。これらの本発明による細胞は、部位特異的に変化させたものであり、ランダム突然変異導入により生じたものではない。それらの細胞は、有利なことには、遺伝的に詳細に特徴づけられている上に前記の改変が欠失によって達成されることが顕著である。該欠失は、本発明により染色体上にコードされて存在する。それゆえ、該細胞は、例外なく相同ＤＮＡを有し、非組換え的に変化している。これが、ＧＲＡＳ生物に数えられるという特性に加えて、有利なことには、生成物、例えば二次植物代謝物の微生物産生用に該細胞を際立たせている。なぜなら、本発明によるコリネ型細菌細胞は、有利なことには、マロニルＣｏＡの供給を増加させるために染色体外ＤＮＡ、例えばプラスミドまたはベクターを必要としないことも特徴とするからである。第一に、２つを超えるプラスミドまたはプラスミドにつき２つを超える遺伝子を有する細菌株は、通例は不安定であり、第二に、本発明により含まれる、細菌中での複雑な二次代謝物の微生物産生は、ポリフェノールおよび／またはポリケチドを産生するために対応する植物遺伝子の異種発現を必要とすることを考慮する必要がある。第三に、所望の該生成物またはそれらの前駆体は、細胞固有の活性、例えば芳香族成分の酵素分解によって再び分解されないのが望ましい。したがって、本発明のさらなる非常に複雑な課題、すなわちプラスミドにコードされた変化を行う必要なく、それと同時に所望の芳香族化合物含有生成物およびそれらの前駆体の、コリネ型細菌中での分解を阻止する、コリネ型細菌中でのマロニルＣｏＡの増加した供給用の系を提供するという課題は、非常に有利な様式で本発明によるコリネ型細菌細胞によって解決される。コリネ型細菌細胞のこの本発明により非常に有利な系は、それにより植物またはその他の異種遺伝子を染色体外で系に導入でき、それにより植物二次代謝物の安定した微生物産生を可能にする高い自由度を与える。
脂肪酸合成酵素阻害剤の添加に依存せずにマロニルＣｏＡの増加した細胞内濃度を供給することが顕著なコリネ型細菌細胞も本発明の主題である。中心的中間体であるマロニルＣｏＡのこの増加した供給は、本発明によると、例えば脂肪酸合成または植物由来の二次代謝物、例えばポリフェノールもしくはポリケチドの合成といった、それらの合成にはマロニルＣｏＡの増加した濃度が必要とされる生成物の産生に利用できる。
ポリフェノール類またはポリケチド類を産生するための、本発明による前記の種類の改変を有する、好ましくはフェニルプロパノイド類および安息香酸誘導体を含む群から選択される芳香族成分の異化代謝経路が付加的に消失しているコリネ型細菌細胞も本発明の主題である。コリネ型細菌は、フェニルプロパノイドまたは安息香酸誘導体を分解するための固有代謝経路を有する（Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ等、２０１６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５３－０１５－７１６５－１）。これは、コリネ型細菌を用いたポリケチドまたはポリフェノールの産生に関しては反産生的であろう。そのためには、本発明によると、マロニルＣｏＡの増加した供給を可能にする上に芳香族成分の異化代謝経路に関与する酵素の機能性および／もしくは活性またはそれらをコードする遺伝子の発現が、遺伝子クラスターｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）、ｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）、ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）ならびにｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）の欠失により消失していることが付加的に顕著なコリネ型細菌細胞が提供される。これらの本発明による細胞は、部位特異的に変化させたものであり、ランダム突然変異導入により生じたものではない。それらの細胞は、有利なことには、遺伝的に詳細に特徴づけられている上に前記の改変が欠失によって達成されることが顕著である。該欠失は、本発明により染色体上にコードされて存在する。それゆえ、該細胞は、例外なく相同ＤＮＡを有し、非組換え的に変化している。これが、ＧＲＡＳ生物に数えられるという特性に加えて、有利なことには、生成物、例えば二次植物代謝物の微生物産生用に該細胞を際立たせている。なぜなら、本発明によるコリネ型細菌細胞は、有利なことには、マロニルＣｏＡの供給を増加させるため、および芳香族成分の分解を回避するために染色体外ＤＮＡ、例えばプラスミドまたはベクターを必要としないことも特徴とするからである。
本発明による前記の種類の改変に加えて、ポリフェノールまたはポリケチド合成用の、植物から誘導された酵素またはそれらをコードする遺伝子を有するコリネ型細菌細胞も本発明の主題である。本発明の一バリアントでは、遺伝子４ｃｌ、ｓｔｓ、ｃｈｓ、ｃｈｉおよびｐｃｓを含む群から選択される、植物から誘導されたポリフェノール産生またはポリケチド産生用の遺伝子を有するコリネ型細菌細胞も含まれる。
前記のように本発明により示される特性を有する本発明によるコリネ型細菌細胞は、有利なことには、５つのマロニルＣｏＡ単位からポリケチドの合成を行えることが顕著である。ポリフェノールの合成も同じく、前記の種類の本発明によるコリネ型細菌細胞を用いて行うことができ、対応する培養培地にポリフェノール前駆体、例えばｐ－クマル酸を補充するとマロニルＣｏＡからスチルベンまたはフラボノイドへの変換が促進される。炭素源としてグルコースから出発すると、本発明によるコリネ型細菌細胞は、遺伝子ａｒｏＨまたはｔａｌによってコードされる酵素３－デオキシ－Ｄ－アラビノヘプツロソネート－７－ホスフェート合成酵素およびチロシンアンモニウムリアーゼを必要とする。
本発明の一バリアントでは、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ由来のフィードバック耐性３－デオキシ－Ｄ－アラビノヘプツロソネート－７－ホスフェート合成酵素（ａｒｏＨ）および好ましくはフラボバクテリウム・ジョンソニエ由来のチロシンアンモニウムリアーゼ（ｔａｌ）をコードする遺伝子を有するコリネ型細菌細胞も含まれる。
酵素５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳ）はＩＩＩ型ポリケチド合成酵素（ＥＣ２．３．１．２１６、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ５８ＶＰ７、（Ａｂｅ等、２００５；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊａ０４３１２０６））である。アロエ・アルボレセンス（Ａｌｏｅ ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＰＣＳは、ｐｃｓ遺伝子によってコードされ、ＥＣ２．３．１．２１６、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ５８ＶＰ７とアノテーションされている。５つのマロニルＣｏＡ分子からノルオイゲニンを合成する触媒活性が、推定上の機能と記載されている。本発明により、アロエ・アルボレセンス由来のｐｃｓ遺伝子をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのコドン使用頻度を利用して合成し、クローニングおよび本発明によるコリネ型細菌細胞の形質転換に使用した。もっとも、結果として生じるコリネ型細菌細胞を用いると、非常に微量のノルオイゲニンしか検出できなかった。すなわち、アロエ・アルボレセンス由来の実証済み酵素ＰＣＳおよびそれをコードするｐｓｃ遺伝子は、そのアノテーションされた機能においてコリネ型細菌細胞中では実証できない。それゆえ、アノテーションされている５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳ）（ＥＣ２．３．１．２１６、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ５８ＶＰ７）は、コリネ型細菌細胞中での本発明による使用には適切でない。
コリネ型細菌中での増強した活性を有する５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）をコードする本発明による核酸配列の単離および供給により、さらなる構造要素が使用可能になり、それを用いると、有利なことには、コリネ型細菌中で植物二次代謝物を産生できる。その際、本発明による５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）は、Ｎ末端アミノ酸１０個だけ短縮されたアミノ酸配列を有する。結果として生じるプラスミドｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａＣｇ－ｓｈｏｒｔは、前記のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株の各々に形質転換可能であり、対応する培養およびサンプリング後に生成物形成を分析する。例示的に、該プラスミドを、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯに形質転換する。結果として生じる、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａＣｇ－ｓｈｏｒｔを、標準条件（ＣＧＸＩＩ＋４％グルコース、１ｍＭ ＩＰＴＧ、３０℃、１３０ＲＰＭ、７２ｈ）下で培養し、ＬＣ－ＭＳを利用して（上記を参照）、採取した試料の生成物形成を分析する。プラスミドｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓｓｈｏｒｔＡａＣｇを用いると、標準条件下、明らかに増強した機能性およびノルオイゲニンの明らかな生成物形成を示すことができる。本発明による５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素バリアント（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）およびそれをコードする核酸配列ｐｃｓｓｈｏｒｔは、これまでのところ公知でない。コリネ型細菌中でポリケチドを合成するための、前記の本発明によるコリネ型細菌細胞のうちの１つの中での増強した５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質も本発明の主題であり、そのアミノ酸配列は、配列番号２０によるアミノ酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する。本発明の一バリアントでは、配列番号２０またはその断片もしくは対立遺伝子によるアミノ酸配列を含有する５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素が含まれる。配列番号１９による核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列またはその断片によってコードされる５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素も本発明により含まれる。本発明の一バリアントでは、配列番号１９による核酸配列またはその断片によってコードされる５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素が含まれる。
本発明のさらなる一バリアントでは、
ａ）配列番号１９による核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列もしくはその断片、
ｂ）ストリンジェントな条件下に配列番号１９による核酸配列の相補的配列またはその断片とハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）配列番号１９もしくはその断片による核酸配列、または
ｄ）ａ）～ｃ）による核酸の各々に対応する５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）をコードし、コリネ型細菌のコドン使用頻度に適合している核酸配列
を含む群から選択されるか、あるいは
ｅ）遺伝暗号の縮重または機能的中立突然変異により、ａ）～ｄ）によるこれらの核酸配列とは異なる
コリネ型細菌中でポリケチドを産生するための、増強した活性を有する５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素をコードする核酸配列（ｐｃｓｓｈｏｒｔ）が含まれる。
本発明のさらなる一バリアントでは、
ａ）配列番号１９による核酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列もしくはその断片、
ｂ）ストリンジェントな条件下に配列番号１９による核酸配列の相補的配列またはその断片とハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）配列番号１９もしくはその断片による核酸配列、または
ｄ）ａ）～ｃ）による核酸の各々に対応する５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）をコードし、コリネ型細菌のコドン使用頻度に適合している核酸配列
を含む群から選択されるか、あるいは
ｅ）遺伝暗号の縮重または機能的中立突然変異により、ａ）～ｄ）によるこれらの核酸配列とは異なる
コリネ型細菌中でポリケチドを産生するための、増強した活性を有する５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素をコードする核酸配列（ｐｃｓｓｈｏｒｔ）が含まれる。
コリネ型細菌中での増強した５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質および／または増強した活性を有する５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）をコードする核酸配列を有する、前記の種類のコリネ型細菌細胞も本発明の主題である。本発明の一バリアントでは、配列番号２０によるアミノ酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する、増強した５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質も含まれる。本発明のさらなる一バリアントは、配列番号２０による、増強した５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質も含む。
植物またはその他の異種系から誘導されたすべての遺伝子、例えば、ａｒｏＨ、ｔａｌ、ならびに／またはポリフェノール合成、好ましくはスチルベンおよび／もしくはフラボノイド合成用の遺伝子、特に挙げたい遺伝子ｓｔｓ、ｃｈｓ、ｃｈｉ、またはポリケチド合成用の遺伝子、好ましくはｐｃｓｓｈｏｒｔを、コリネ型細菌中での発現に向けて、該コリネ型細菌、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクムのそれの細菌コドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ－ｕｓａｇｅ）に適合させて最適化した。それにより、異種核酸配列の割合が本発明により低下し、有利なことにはコリネ型細菌細胞中での発現が促進される。
本発明の一バリアントでは、植物遺伝子が誘導性プロモーターの発現制御下にある前記の種類のコリネ型細菌細胞も含まれる。さらなる一バリアントでは、本発明により、ＩＰＴＧで誘導可能なプロモーター、好ましくはプロモーターＴ７が存在する。
本発明の一バリアントでは、４－クマレートＣｏＡリガーゼ（４－Ｃｕｍａｒａｔ－ＣｏＡ－Ｌｉｇａｓｅ）（４ＣＬ）をコードする遺伝子４ｃｌが誘導性プロモーターの発現制御下にある本発明によるコリネ型細菌細胞が含まれ、誘導性プロモーターおよびそれと調節的に連結された遺伝子が、コリネ型細菌細胞のゲノムに組み込まれている、すなわち染色体上にコードされて存在する。本発明のさらなる一バリアントでは、ＩＰＴＧで誘導可能なプロモーター、好ましくはプロモーターＴ７を使用する。
ポリフェノールまたはポリケチドの合成に必要な遺伝子の発現にとって不可欠の特性を有する、ベクターまたはプラスミドのような染色体外系も本発明の主題である。本発明のバリアントでは、プラスミドまたはベクターにコードされた遺伝子が、誘導性プロモーター、好ましくはＩＰＴＧで誘導可能なプロモーター、好ましくはプロモーターＴ７の影響下にある。本発明によると、誘導性プロモーターの使用は、二次代謝物に必要な遺伝子の発現を、本発明によるコリネ型細菌細胞の増殖または培養条件に依存して狙いを定めて制御できる、すなわちスイッチオンできるという利点を有する。前記の種類の本発明によるコリネ型細菌細胞はそれにより、まず、マロニルＣｏＡの供給を増加させるために培養可能であり、次いで、必要な遺伝子の発現を特異的に誘導して、そのマロニルＣｏＡを、所望の生成物へとさらに変換する。
本発明の主題は、
ａ）ポリフェノール類、好ましくはスチルベン類、特に好ましくはレスベラトロールの合成用の４ｃｌおよびｓｔｓ、または
ｂ）ポリフェノール類、好ましくはフラボノイド類、特に好ましくはナリンゲニンの合成用のｃｈｓおよびｃｈｉ、または
ｃ）ポリケチド類、好ましくはノルオイゲニンの合成用のｐｃｓｓｈｏｒｔ、
を含む群から選択される遺伝子を誘導性プロモーター、好ましくはＩＰＴＧで誘導可能なプロモーター、特に好ましくはＴ７プロモーターの制御下に有するコリネ型細菌細胞でもある。
ａ）ポリフェノール類、好ましくはスチルベン類、特に好ましくはレスベラトロールの合成用の４ｃｌおよびｓｔｓ、または
ｂ）ポリフェノール類、好ましくはフラボノイド類、特に好ましくはナリンゲニンの合成用のｃｈｓおよびｃｈｉ、または
ｃ）ポリケチド類、好ましくはノルオイゲニンの合成用のｐｃｓｓｈｏｒｔ、
を含む群から選択される遺伝子を誘導性プロモーター、好ましくはＩＰＴＧで誘導可能なプロモーター、特に好ましくはＴ７プロモーターの制御下に有するコリネ型細菌細胞でもある。
前記のように、本発明は、有利なことには、マロニルＣｏＡの供給を増加させるための遺伝子またはそれらの遺伝子と調節的に連結された領域が、本発明による細胞のゲノムに組み込まれている、すなわち染色体上にコードされて存在することが顕著である。これが、細胞を酷使することなしに、さらなる異種遺伝子をプラスミドにコードして細胞に導入するための自由度を生み出す。２つを超えるプラスミドを有する細菌細胞は安定には増殖できないという公知の欠点、または２つを超える異種遺伝子を有するプラスミドは、通例は、安定性もしくは発現に関して満足させる結果をもたらさないという大きな欠点は、本発明により非常に有利な、コリネ型細菌細胞の系によって克服される。その系は、その構成により、植物またはその他の異種遺伝子を染色体外で系に導入でき、それによりマロニルＣｏＡから出発する、植物二次代謝物の安定した微生物産生を可能にする高い自由度を提供する。
本発明の一バリアントでは、
ａ）マロニルＣｏＡの供給を増加させるためにその機能性および／もしくは発現が狙いを定めて改変されている、ｆａｓＢおよび／もしくはｇｌｔＡおよび／もしくはａｃｃＢＣＤ１、ならびに
ｂ）好ましくはフェニルプロパノイド類もしくは安息香酸誘導体を含む群からの芳香族成分を分解するためのその機能性が消失しているｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）、ｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）、ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）、ならびに
ｃ）ポリケチド類、好ましくはノルオイゲニンの合成用の、増強した５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質をコードするｐｃｓｓｈｏｒｔ、または
ｄ）任意選択的に、グルコースから出発する、ポリフェノール類の前駆体合成用のａｒｏＨおよびｔａｌ、ならびに
ｅ）ポリフェノール類、好ましくはスチルベン類、特に好ましくはレスベラトロールの合成用の４ｃｌおよびｓｔｓ、または
ｆ）ポリフェノール類、好ましくはフラボノイド類、特に好ましくはナリンゲニンの合成用のｃｈｓおよびｃｈｉ
を含む群から選択される遺伝子を有するコリネ型細菌細胞が存在する。
ａ）マロニルＣｏＡの供給を増加させるためにその機能性および／もしくは発現が狙いを定めて改変されている、ｆａｓＢおよび／もしくはｇｌｔＡおよび／もしくはａｃｃＢＣＤ１、ならびに
ｂ）好ましくはフェニルプロパノイド類もしくは安息香酸誘導体を含む群からの芳香族成分を分解するためのその機能性が消失しているｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）、ｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）、ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）、ならびに
ｃ）ポリケチド類、好ましくはノルオイゲニンの合成用の、増強した５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質をコードするｐｃｓｓｈｏｒｔ、または
ｄ）任意選択的に、グルコースから出発する、ポリフェノール類の前駆体合成用のａｒｏＨおよびｔａｌ、ならびに
ｅ）ポリフェノール類、好ましくはスチルベン類、特に好ましくはレスベラトロールの合成用の４ｃｌおよびｓｔｓ、または
ｆ）ポリフェノール類、好ましくはフラボノイド類、特に好ましくはナリンゲニンの合成用のｃｈｓおよびｃｈｉ
を含む群から選択される遺伝子を有するコリネ型細菌細胞が存在する。
本発明による細菌細胞のバリアントでは、ａ）およびｂ）からの本発明による遺伝子またはそれらの遺伝子と作動可能に連結された調節領域がゲノム中にコードされて存在する。ｃ）～ｆ）からの遺伝子またはそれらの遺伝子と作動可能に連結された調節領域は、プラスミドにコードされて存在する。この際、本発明によると、ポリケチド、好ましくはノルオイゲニンを産生するために、例えば、ｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とｐｃｓｓｈｏｒｔとの；ｇｔｌＡとΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とｐｃｓｓｈｏｒｔとの；ｇｌｔＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とｐｃｓｓｈｏｒｔとの；ｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とｇｌｔＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とｐｃｓｓｈｏｒｔとの組み合わせが可能である。
ポリフェノール、好ましくはスチルベン、さらに好ましくはレスベラトロールを産生するためには、例えば、ｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌと４ｃｌとｓｔｓとの；ｇｔｌＡとΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌと４ｃｌとｓｔｓとの；ｇｔｌＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌと４ｃｌとｓｔｓとの；ｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とｇｔｌＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌと４ｃｌとｓｔｓとの組み合わせが可能である。これら前記のバリアントは、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌの発現に基づき、グルコースから出発するポリフェノールの産生を可能にする。もっとも、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌは、前駆体ｐ－クマル酸を補充した、本発明によるコリネ型細菌細胞の培養には必要とされない。その場合、本発明による前記のコリネ型細菌細胞のバリアントは、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌを有さない。
ポリフェノール、好ましくはフラボノイド、さらに好ましくはナリンゲニンを産生するためには、例えば、ｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌとｃｈｓとｃｈｉとの；ｇｔｌＡとΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌとｃｈｓとｃｈｉとの；ｇｔｌＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌとｃｈｓとｃｈｉとの；ｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とｇｔｌＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌとｃｈｓとｃｈｉとの組み合わせが可能である。これら前記のバリアントは、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌの発現に基づき、グルコースから出発するポリフェノールの産生を可能にする。もっとも、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌは、前駆体ｐ－クマル酸を補充した、本発明によるコリネ型細菌細胞の培養には必要とされない。その場合、本発明による前記のコリネ型細菌細胞のバリアントは、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌを場合により有さない。
本発明のさらなるバリアントでは、
ａ）マロニルＣｏＡの供給を増加させるためにそれらの機能性および／または発現が狙いを定めて改変されている、配列番号２、４、６、８および１０を含む群またはその断片もしくは対立遺伝子から選択される脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードする、配列番号１、３、５、７および９を含む群から選択される核酸配列またはその断片によるｆａｓＢ遺伝子、ならびに／または配列番号１１による作動可能に連結されたプロモーター領域を有するｇｌｔＡ遺伝子、ならびに／または配列番号１３および１５を含む群から選択される作動可能に連結されたｆａｓＯ結合部位を有するａｃｃＢＣＤ１遺伝子クラスター、ならびに
ｂ）好ましくはフェニルプロパノイドまたは安息香酸誘導体を含む群からの芳香族成分を分解するためのその機能性が消失しているｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）、ｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）、ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）、ならびに
ｃ）ポリケチド、好ましくはノルオイゲニンの合成用の、配列番号２０による増強した５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質をコードする配列番号１９によるｐｃｓｓｈｏｒｔまたはその断片もしくは対立遺伝子、あるいは
ｄ）任意選択的に、グルコースから出発する、ポリフェノールの前駆体合成用の、配列番号３０によるａｒｏＨまたはその断片もしくは対立遺伝子、および配列番号３２によるｔａｌまたはその断片もしくは対立遺伝子、ならびに
ｅ）ポリフェノール、好ましくはスチルベン、特に好ましくはレスベラトロールの合成用の、配列番号２２による４ｃｌまたはその断片もしくは対立遺伝子、および配列番号２４によるｓｔｓまたはその断片もしくは対立遺伝子、あるいは
ｆ）ポリフェノール、好ましくはフラボノイド、特に好ましくはナリンゲニンの合成用の、配列番号２６によるｃｈｓまたはその断片もしくは対立遺伝子、および配列番号２８によるｃｈｉまたはその断片もしくは対立遺伝子
を含む群から選択される遺伝子を有する、前記の、遺伝子組み合わせのバリアントを含む前記の種類のコリネ型細菌細胞が存在する。
ａ）マロニルＣｏＡの供給を増加させるためにそれらの機能性および／または発現が狙いを定めて改変されている、配列番号２、４、６、８および１０を含む群またはその断片もしくは対立遺伝子から選択される脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードする、配列番号１、３、５、７および９を含む群から選択される核酸配列またはその断片によるｆａｓＢ遺伝子、ならびに／または配列番号１１による作動可能に連結されたプロモーター領域を有するｇｌｔＡ遺伝子、ならびに／または配列番号１３および１５を含む群から選択される作動可能に連結されたｆａｓＯ結合部位を有するａｃｃＢＣＤ１遺伝子クラスター、ならびに
ｂ）好ましくはフェニルプロパノイドまたは安息香酸誘導体を含む群からの芳香族成分を分解するためのその機能性が消失しているｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）、ｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）、ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）、ならびに
ｃ）ポリケチド、好ましくはノルオイゲニンの合成用の、配列番号２０による増強した５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質をコードする配列番号１９によるｐｃｓｓｈｏｒｔまたはその断片もしくは対立遺伝子、あるいは
ｄ）任意選択的に、グルコースから出発する、ポリフェノールの前駆体合成用の、配列番号３０によるａｒｏＨまたはその断片もしくは対立遺伝子、および配列番号３２によるｔａｌまたはその断片もしくは対立遺伝子、ならびに
ｅ）ポリフェノール、好ましくはスチルベン、特に好ましくはレスベラトロールの合成用の、配列番号２２による４ｃｌまたはその断片もしくは対立遺伝子、および配列番号２４によるｓｔｓまたはその断片もしくは対立遺伝子、あるいは
ｆ）ポリフェノール、好ましくはフラボノイド、特に好ましくはナリンゲニンの合成用の、配列番号２６によるｃｈｓまたはその断片もしくは対立遺伝子、および配列番号２８によるｃｈｉまたはその断片もしくは対立遺伝子
を含む群から選択される遺伝子を有する、前記の、遺伝子組み合わせのバリアントを含む前記の種類のコリネ型細菌細胞が存在する。
これら前記のバリアントは、それにより本発明が限定されることなく本発明の主題である。これらの記載は、本発明をより良く理解するために役立つ。
本発明の主題は、コリネ型細菌中でのマロニルＣｏＡの供給を増加させるための方法であって、
ａ）水およびＣ６炭素源を含有する溶液を用意するステップ、
ｂ）ｆａｓＢ、ｇｔｌＡ、ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１を含む群から選択される遺伝子の調節および／もしくは発現、ならびに／またはそれらによってコードされる酵素の機能性が狙いを定めて改変されている本発明によるコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップａ）による溶液中でＣ６炭素源をマロニルＣｏＡへ微生物変換するステップ
を含む方法でもある。
ａ）水およびＣ６炭素源を含有する溶液を用意するステップ、
ｂ）ｆａｓＢ、ｇｔｌＡ、ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１を含む群から選択される遺伝子の調節および／もしくは発現、ならびに／またはそれらによってコードされる酵素の機能性が狙いを定めて改変されている本発明によるコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップａ）による溶液中でＣ６炭素源をマロニルＣｏＡへ微生物変換するステップ
を含む方法でもある。
「溶液」とは、本発明によると、「培地」、「培養培地」、「培養液」または「培養溶液」と同じ意味と理解され得る。本発明の主旨では、「微生物による」とは、「生物工学的」または「発酵性」と同じ意味と理解され得る。「変換」とは、本発明によると、「代謝（Ｖｅｒｓｔｏｆｆｗｅｃｈｓｌｕｎｇ）」、「代謝（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｉｅｒｕｎｇ）」または「培養」と同じ意味と理解され得る。「処理」とは、本発明によると、「分離」、「濃縮」または「精製」と同じ意味と理解され得る。
使用する培養培地は、適切な様式で各微生物の要件を満たすのが望ましい。様々な微生物の培養培地の記載は、ハンドブック「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）に含まれている。マロニルＣｏＡ供給の出発基質としてのグルコースに加えて、炭素源として糖および炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、乳糖、果糖、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例えば、ダイズ油、ヒマワリ油、落花生油およびヤシ油、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例えば、グリセロールおよびエタノール、ならびに有機酸、例えば酢酸を使用してもよい。これらの物質は、個別にまたは混合物として使用してもよい。窒素源としては、窒素含有有機化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粕および尿素、または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムを使用できる。窒素源は、個別にまたは混合物として使用してもよい。リン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩を使用できる。培養培地は、増殖に必須の金属塩、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄をさらに含有するのが望ましい。最後に、上記の物質に加えて必須生長促進物質、例えば、アミノ酸およびビタミンが使用可能である。前記の使用物質は、１回限りの混合液の形態で培養に添加するか、または適切な様式で培養最中に補給してもよい。培養のｐＨ制御には、塩基性化合物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、または酸性化合物、例えば、塩酸、リン酸もしくは硫酸を適切な様式で使用する。発泡の制御には、消泡剤、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルを使用してもよい。プラスミドの安定性を維持するためには、適切な選択作用物質、例えば、抗生物質を培地に添加することができる。好気性条件を維持するためには、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培養へと導入する。培養の温度は、通常、２０℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃である。
本発明は、培養を断続的または連続的、好ましくはバッチ、流加、反復流加または連続モードで行う方法に関する。
マロニルＣｏＡの供給を増加させるための本発明による方法の一変法では、脂肪酸合成酵素ＦａｓＢが低下もしくは消失している、および／あるいは脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢが、好ましくは１つもしくは複数のヌクレオチド置換により狙いを定めて突然変異しているか、または部分的もしくは完全に欠失している本発明により記載されるｆａｓＢバリアントのうちの１つを含有する本発明によるコリネ型細菌中でＣ６炭素源の微生物変換を行う。
マロニルＣｏＡの供給を増加させるための本発明による方法の一変法では、作動可能に連結されたプロモーターの突然変異、好ましくは複数のヌクレオチド置換によりその発現が低下している、本発明によるシトレート合成酵素をコードする遺伝子ｇｌｔＡを含有する本発明によるコリネ型細菌細胞中でＣ６炭素源の微生物変換を行う。
マロニルＣｏＡの供給を増加させるための本発明による方法の一変法では、本発明による遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１を含有する、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域内にある調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の機能性が、好ましくは１つまたは複数のヌクレオチド置換により低下または消失しており、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の発現が抑制解除されている、好ましくは増強している本発明によるコリネ型細菌細胞中でＣ６炭素源の微生物変換を行う。
マロニルＣｏＡの供給を増加させるための本発明による方法のさらなる一変法では、シトレート合成酵素（ＣＳ）の低下した発現および／または活性、ならびにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）の調節解除され、増強した発現および／または活性からなる組み合わせを有する本発明によるコリネ型細菌細胞中でＣ６炭素源の微生物変換を行う。
マロニルＣｏＡの供給を増加させるための本発明による方法のさらなる一変法では、シトレート合成酵素（ＣＳ）の低下した発現および／または活性、ならびにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）の調節解除され、増強した発現および／または活性、ならびに脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性からなる組み合わせを有する本発明によるコリネ型細菌細胞中でＣ６炭素源の微生物変換を行う。
マロニルＣｏＡの供給を増加させるための本発明による方法のさらなる一変法では、本発明による、コリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム属のコリネ型細菌細胞中でＣ６炭素源の微生物変換を行う。マロニルＣｏＡの供給を増加させるための本発明による方法のさらなる一変法では、コリネバクテリウム・グルタミクム、特に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、ブレビバクテリウム・フラブム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、またはブレビバクテリウム・ディバリカツムを含む群から選択される本発明によるコリネ型細菌細胞中でＣ６炭素源の微生物変換を行う。また、好ましくはフェニルプロパノイドおよび安息香酸誘導体を含む群から選択される芳香族成分の異化代謝経路が付加的に消失している本発明によるコリネ型細菌細胞、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２またはその、狙いを定めて変化させた誘導体もしくは原型、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２中でＣ６炭素源の微生物変換を行う、マロニルＣｏＡの供給を増加させるための本発明による方法の一変法も本発明により含まれる。
本発明の主題は、コリネ型細菌中でポリフェノールまたはポリケチドを微生物産生する方法であって、
ａ）水およびＣ６炭素源を含有する溶液を用意するステップ、
ｂ）本発明によるコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップａ）による溶液中でＣ６炭素源をポリフェノールまたはポリケチドへ微生物変換するステップであって、まず、増加した濃度のマロニルＣｏＡを中間体として供給し、さらに、ポリフェノールまたはポリケチドを微生物合成するために変換させるステップ、
ｃ）ステップｂ）に適切なインデューサーを添加して、誘導性プロモーターの制御下にある異種遺伝子または植物遺伝子の発現を誘導するステップ、
ｄ）任意選択的に、所望の生成物を処理するステップ
を含む、方法でもある。
ａ）水およびＣ６炭素源を含有する溶液を用意するステップ、
ｂ）本発明によるコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップａ）による溶液中でＣ６炭素源をポリフェノールまたはポリケチドへ微生物変換するステップであって、まず、増加した濃度のマロニルＣｏＡを中間体として供給し、さらに、ポリフェノールまたはポリケチドを微生物合成するために変換させるステップ、
ｃ）ステップｂ）に適切なインデューサーを添加して、誘導性プロモーターの制御下にある異種遺伝子または植物遺伝子の発現を誘導するステップ、
ｄ）任意選択的に、所望の生成物を処理するステップ
を含む、方法でもある。
本発明による方法の一変法では、
ａ）マロニルＣｏＡの供給を増加させるためにその機能性および／もしくは発現が狙いを定めて改変されている、ｆａｓＢおよび／もしくはｇｌｔＡおよび／もしくはａｃｃＢＣＤ１、ならびに
ｂ）好ましくはフェニルプロパノイドもしくは安息香酸誘導体を含む群からの芳香族成分を分解するためのその機能性が消失しているｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）、ｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）、ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）、ならびに
ｃ）ポリケチド、好ましくはノルオイゲニンの合成用の、増強した５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質をコードするｐｃｓｓｈｏｒｔ、または
ｄ）グルコースから出発する、ポリフェノールの前駆体合成用のａｒｏＨおよびｔａｌ、ならびに
ｅ）ポリフェノール、好ましくはスチルベン、特に好ましくはレスベラトロールの合成用の４ｃｌおよびｓｔｓ、または
ｆ）ポリフェノール、好ましくはフラボノイド、特に好ましくはナリンゲニンの合成用のｃｈｓおよびｃｈｉ
を含む群から選択される遺伝子を有するコリネ型細菌細胞を使用する。
ａ）マロニルＣｏＡの供給を増加させるためにその機能性および／もしくは発現が狙いを定めて改変されている、ｆａｓＢおよび／もしくはｇｌｔＡおよび／もしくはａｃｃＢＣＤ１、ならびに
ｂ）好ましくはフェニルプロパノイドもしくは安息香酸誘導体を含む群からの芳香族成分を分解するためのその機能性が消失しているｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）、ｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）、ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）、ならびに
ｃ）ポリケチド、好ましくはノルオイゲニンの合成用の、増強した５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質をコードするｐｃｓｓｈｏｒｔ、または
ｄ）グルコースから出発する、ポリフェノールの前駆体合成用のａｒｏＨおよびｔａｌ、ならびに
ｅ）ポリフェノール、好ましくはスチルベン、特に好ましくはレスベラトロールの合成用の４ｃｌおよびｓｔｓ、または
ｆ）ポリフェノール、好ましくはフラボノイド、特に好ましくはナリンゲニンの合成用のｃｈｓおよびｃｈｉ
を含む群から選択される遺伝子を有するコリネ型細菌細胞を使用する。
この際、本発明によると、ポリケチド、好ましくはノルオイゲニンを産生するために、例えば、ｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とｐｃｓｓｈｏｒｔとの；またはｇｔｌＡとΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とｐｃｓｓｈｏｒｔとの；またはｇｔｌＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とｐｃｓｓｈｏｒｔとの；またはｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とｇｔｌＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とｐｃｓｓｈｏｒｔとの組み合わせが可能である。
本発明によると、ポリフェノール、好ましくはスチルベン、さらに好ましくはレスベラトロールを産生するためには、例えば、ｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌと４ｃｌとｓｔｓとの；ｇｔｌＡとΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌと４ｃｌとｓｔｓとの；ｇｔｌＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌと４ｃｌとｓｔｓとの；ｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とｇｔｌＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌと４ｃｌとｓｔｓとの組み合わせが可能である。これら前記のバリアントは、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌの発現に基づき、グルコースから出発するポリフェノールの産生を可能にする。もっとも、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌは、前駆体ｐ－クマル酸を補充した、本発明によるコリネ型細菌細胞の培養には必要とされない。その場合、本発明による前記のコリネ型細菌細胞のバリアントは、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌを有さないか、またはこれらの遺伝子の発現が誘導されない。
本発明によると、ポリフェノール、好ましくはフラボノイド、さらに好ましくはナリンゲニンを産生するためには、例えば、ｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌとｃｈｓとｃｈｉとの；ｇｔｌＡとΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌとｃｈｓとｃｈｉとの；ｇｔｌＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌとｃｈｓとｃｈｉとの；ｆａｓＢのバリアント（置換突然変異体または欠失突然変異体）とｇｔｌＡとａｃｃＢＣＤ１とΔｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）とΔｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）とΔｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）とΔｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）とａｒｏＨとｔａｌとｃｈｓとｃｈｉとの組み合わせが可能である。これら前記のバリアントは、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌの発現に基づき、グルコースから出発するポリフェノールの産生を可能にする。もっとも、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌは、前駆体ｐ－クマル酸を補充した、本発明によるコリネ型細菌細胞の培養には必要とされない。その場合、本発明による前記のコリネ型細菌細胞のバリアントは、遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌを場合により有さない。
ポリフェノール産生のための本発明による方法の一変法では、ステップｂ）における溶液に、ポリフェノール前駆体、好ましくはｐ－クマル酸を補充する。
この際、ｐ－クマル酸の補充は、１～１０ｍＭ、好ましくは２～８ｍＭ、特に好ましくは３～７ｍＭ、とりわけ好ましくは５～６ｍＭ、とりわけ５ｍＭの濃度で、および考えられるすべての中間レベルが適切である。
「処理」とは、本発明によると、「分離」、「抽出」、「濃縮」または「精製」と同じ意味と理解され得る。本発明によるコリネ型細菌の有利な狙いを定めた株構築により、唯一の二次代謝物、例えば、レスベラトロールまたはナリンゲニンまたはノルオイゲニンの産生が達成されるため、生成物処理は、ポリケチドおよびポリフェノールを産生するための本発明による方法においては任意選択である。そのため、有利なことには、培養溶液からの複数の異なる生成物、例えば、レスベラトロールおよびナリンゲニンの分離が不要である。それが、本発明のもさらなる利点である。また、本発明による方法は、有利なことには、脂肪酸合成酵素阻害剤、例えばセルレニンの添加に依存しないことが顕著である。細胞、細胞抽出物、または細胞上清のさらなる抽出、処理は、当業者には公知であり、公知の方法で行うことができる。
本発明による方法の変法では、培養を断続または連続、好ましくはバッチ、流加、反復流加または連続モードで行う。そのような培養法の実施に必要な方法は、当業者には公知である。
コリネ型細菌中でのマロニルＣｏＡの供給を増加させるための、前記の種類の本発明によるコリネ型細菌細胞、および／または１つもしくは複数の本発明によるタンパク質、および／または１つもしくは複数の本発明によるヌクレオチド配列の使用も本発明の主題である。
ポリケチドまたはポリフェノールを産生するため、好ましくはノルオイゲニンを産生するため、またはスチルベン、特に好ましくはレスベラトロールを産生するため、またはフラボノイド、特に好ましくはナリンゲニンを産生するための、本発明によるコリネ型細菌細胞、および／または１つもしくは複数の本発明によるタンパク質、および／または１つもしくは複数の本発明によるヌクレオチド配列の使用も同じく本発明の主題である。
本発明によるコリネ型細菌細胞および／または１つもしくは複数の本発明によるタンパク質および／または１つもしくは複数の本発明によるヌクレオチド配列および／または前記の種類の本発明による方法を用いて産生された、ポリフェノールおよびポリケチド、好ましくはスチルベン、フラボノイドまたはポリケチド、特に好ましくはレスベラトロール、ナリンゲニンおよび／またはノルオイゲニンの群から選択される二次代謝物を含有する組成物も本発明の主題である。
本発明の主題はさらに、医薬、食品、飼料を製造するため、および／もしくは植物生理学において使用するための、本発明によるコリネ型細菌細胞を用いておよび／もしくは本発明の方法により産生されたレスベラトロール、ナリンゲニンおよび／もしくはノルオイゲニンの使用、ならびに／または前記の種類の組成物の使用である。本発明による組成物は、所望の生成物を産生する際に有利であるさらなる物質を有してもよい。選択は、当業者には従来技術から公知である。
表および図面
表１は、本発明の細菌株の一覧を示す。
表１は、本発明の細菌株の一覧を示す。
表２は、本発明のプラスミドの一覧を示す。
表３は、本発明の配列番号の一覧を示す。
本発明を以下の例によってより詳細に説明するが、例は限定的ではない。
コリネ型細菌細胞のゲノムに組み込むための、ヌクレオチド置換によるシトレート合成酵素ＣＳのプロモーター領域内にある調節結合部位の変化
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ＰｇｌｔＡ：：ＰｄａｐＡ－Ｃ７のクローニング
プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ＰｇｌｔＡ：：ＰｄａｐＡ－Ｃ７（図６）を構築するために、まず、プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δ５４０を構築した。ここでは、２つの転写開始およびオペレーター配列を有する天然ｇｌｔＡプロモーター領域を担持する５４０塩基対の大きさの染色体断片を欠失できるようにフランキング領域を選択した。両方の隣接部であるｕｐ（上流）とｄｏｗｎ（下流）との間には、切断部位ＮｓｉＩおよびＸｈｏＩを有する２０塩基対の大きさのリンカーを挿入した。続いて、これらの切断部位を介してｄａｐＡプロモーターのＣ７バリアントをサブクローニングした。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ＰｇｌｔＡ：：ＰｄａｐＡ－Ｃ７のクローニング
プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ＰｇｌｔＡ：：ＰｄａｐＡ－Ｃ７（図６）を構築するために、まず、プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δ５４０を構築した。ここでは、２つの転写開始およびオペレーター配列を有する天然ｇｌｔＡプロモーター領域を担持する５４０塩基対の大きさの染色体断片を欠失できるようにフランキング領域を選択した。両方の隣接部であるｕｐ（上流）とｄｏｗｎ（下流）との間には、切断部位ＮｓｉＩおよびＸｈｏＩを有する２０塩基対の大きさのリンカーを挿入した。続いて、これらの切断部位を介してｄａｐＡプロモーターのＣ７バリアントをサブクローニングした。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δ５４０のクローニングには、プライマー対ＰｇｌｔＡ－ｕｐ－ｓ／ＰｇｌｔＡ－ｕｐ－ａｓを用いて上流側断片ｕｐを増幅し、プライマー対ＰｇｌｔＡ－ｄｏｗｎ－ｓ／ＰｇｌｔＡ－ｄｏｗｎ－ａｓを用いて下流側隣接部を増幅した。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行った。その際、内側プライマー（ＰｇｌｔＡ－ｕｐ－ａｓ／ＰｇｌｔＡ－ｄｏｗｎ－ｓ）のヌクレオチド配列は、両方の増幅断片ｕｐとｄｏｗｎとが、互いに相補的なオーバーハングを含有する（記載のＮｓｉＩ／ＸｈｏＩリンカーを含むように選択した。第２のＰＣＲ（ＤＮＡプライマーは添加せず）では、精製された断片が、相補配列を介して結合し、プライマーとしても鋳型としても互いに機能する（オーバーラップ伸長ＰＣＲ）。そのように生成したΔ５４０断片を、最終ＰＣＲにおいて、第１のＰＣＲからの（遺伝子に面していない）両方の外側プライマーを用いて増幅した（ＰｇｌｔＡ－ｕｐ－ｓ／ＰｇｌｔＡ－ｄｏｗｎ－ａｓ）。１％ＴＡＥアガロースゲル上での電気泳動分離後に、最終的な突然変異断片を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて添付のプロトコルに従いゲルから単離した。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δ５４０の構築には、生成したΔ５４０断片と同様にｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ空ベクターも、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩで切断した。前記断片の制限酵素反応混合液（Ｒｅｓｔｒｉｋｔｉｏｎｓａｎｓａｔｚ）を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、欠失断片を、線状化したベクターバックボーンｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢに対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中でのｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δ５４０の正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｕｎｉｖ／ｒｓｐを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物がｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δ５４０の正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ＰｇｌｔＡ：：ＰｄａｐＡ－Ｃ７の構築には、ｄａｐＡプロモーターのＣ７バリアントを、プライマー対ＰｄａｐＡ－ｓ／ＰｄａｐＡ－ａｓを用いて増幅し、見込まれる塩基対数は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して点検した。生成した断片は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて添付のプロトコルに従い精製した。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ＰｇｌｔＡ：：ＰｄａｐＡ－Ｃ７の構築には、生成したＰｄａｐＡ断片と同様に目的ベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δ５４０も、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｓｉＩで切断した。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、ＰｄａｐＡ断片を、線状化したベクターバックボーンｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δ５４０に対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中でのｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ＰｇｌｔＡ：：ＰｄａｐＡ－Ｃ７の正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｕｎｉｖ／ｒｓｐを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物がｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ＰｇｌｔＡ：：ＰｄａｐＡ－Ｃ７の正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのエレクトロコンピテントセルの一定分量を、記載のプロトコルにより、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ＰｇｌｔＡ：：ＰｄａｐＡ－Ｃ７で形質転換し、ＢＨＩＳ－Ｋａｎ１５プレート上にまいた。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中では複製できないため、続く、仲介されるカナマイシン耐性の選択においては、相同配列を介して突然変異プラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムに効果的に組み込めた場合にのみカナマイシン耐性が形成されると前提できた。得られた組込み体を、第１の選択ラウンドにおいて、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。突然変異プラスミドのゲノム組込みに成功した場合、カナマイシン耐性に加えて、ｓａｃＢによってコードされるレバンスクラーゼが形成される。この酵素は毒性のレバンへのスクロースの重合を触媒するため、スクロース上での増殖時に致死を誘発させる（Ｂｒａｍｕｃｃｉ＆Ｎａｇａｒａｊａｎ、１９９６）。それによると、相同組換えにより突然変異プラスミドをそれらのゲノムに組み込んだコロニーは、カナマイシン耐性であり、スクロース感受性である。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去は、二重に存在することになるＤＮＡ領域を介して、染色体由来の突然変異対象コドンが、最終的に、導入された突然変異断片と交換された第２の組換え現象において起こった。そのためには、記載の表現型（カナマイシン耐性あり、スクロース感受性あり）を示した細胞を、ＢＨＩ培地（カナマイシンは添加せず）３ｍｌを含む試験管中、３０℃において３時間、１７０ＲＰＭでインキュベートした。続いて、１：１０希釈物の各１００μｌを、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。全体として、ＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上で増殖したクローンのうちの５０個を選択し、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去の成功を点検するために、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５およびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。プラスミドが完全に除去された場合、これは、それぞれのクローンのカナマイシン感受性およびスクロース耐性で示される。第２の組換え現象（除去）は、所望の突然変異の他に、野生型の状況の復元ももたらし得る。除去後の得られたクローン中での交換の成功を証明するために、対応するゲノム領域をコロニーＰＣＲで増幅し（プライマー対はｃｈｋ－ＰｇｌｔＡ－ｓ／ｃｈｋ－ＰｇｌｔＡ－ａｓ）、見込まれる断片サイズを、ゲル電気泳動を利用して点検した。プロモーター交換を示すＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製し、交換を検証するためにプライマーｃｈｋ－ＰｇｌｔＡ－ｓおよびｃｈｋ－ＰｇｌｔＡ－ａｓを用いてシーケンスした。本発明によるプロモーター領域ＰｇｌｔＡ：：ＰｄａｐＡ－Ｃ７は、ｇｔｌＡからｄａｐＡへのプロモーター領域の交換に加えて、開始コドンＡＴＧ前方の９５位（ａ－＞ｔ）および９６位（ｇ－＞ａ）でのヌクレオチド置換をさらに有する（図２２）。
使用したプライマー
ＰｇｌｔＡ－ｕｐ－ｓ：ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＴＴＧＡＡＧ
ＰｇｌｔＡ－ｕｐ－ａｓ：ＴＡＴＧＣＡＴＧＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＡＡＧＧ
ＰｇｌｔＡ－ｄｏｗｎ－ｓ：ＣＣＣＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＣＡＡＴＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＣ
ＰｇｌｔＡ－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＣＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＴＡＧＣＣ
ＰｄａｐＡ－ｓ：ＣＣＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＣＡ
ＰｄａｐＡ－ａｓ：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＴＣＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＡＡＣＣＴ
ｃｈｋ－ＰｇｌｔＡ－ｓ：ＡＴＧＡＧＴＣＣＧＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧＣＡＴ
ｃｈｋ－ＰｇｌｔＡ－ａｓ：ＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣ
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ＰｇｌｔＡ－ｕｐ－ｓ：ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＴＴＧＡＡＧ
ＰｇｌｔＡ－ｕｐ－ａｓ：ＴＡＴＧＣＡＴＧＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＣＣＧＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＡＡＧＧ
ＰｇｌｔＡ－ｄｏｗｎ－ｓ：ＣＣＣＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴＴＴＣＡＡＴＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＣ
ＰｇｌｔＡ－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＣＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＴＡＧＣＣ
ＰｄａｐＡ－ｓ：ＣＣＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＣＡ
ＰｄａｐＡ－ａｓ：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＴＣＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＡＡＣＣＴ
ｃｈｋ－ＰｇｌｔＡ－ｓ：ＡＴＧＡＧＴＣＣＧＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧＣＡＴ
ｃｈｋ－ＰｇｌｔＡ－ａｓ：ＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣ
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
コリネ型細菌細胞のゲノムに組み込むための、ヌクレオチド置換による、アセチルカルボキシラーゼＡｃｃＢＣＤ１のプロモーター領域内にあるＦａｓＲ調節タンパク質の調節結合部位（オペレーター：ｆａｓＯ）の変化
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＢＣおよびｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＤ１の構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のそれぞれのｆａｓＯ結合部位の突然変異用のプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＢＣ（図７）およびｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＤ１（図８）を構築するために、相同組換え現象に必要とされるフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＢＣおよびｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＤ１の構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のそれぞれのｆａｓＯ結合部位の突然変異用のプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＢＣ（図７）およびｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＤ１（図８）を構築するために、相同組換え現象に必要とされるフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
上流側断片の生成には、プライマー対ｍｕ－ａｃｃＸＸ－ｕｐ－ｓ／ｍｕ－ａｃｃＸＸ－ｕｐ－ａｓを使用し、下流側隣接部はプライマー対ｍｕ－ａｃｃＸＸ－ｄｏｗｎ－ｓ／ｍｕ－ａｃｃＸＸ－ｄｏｗｎ－ａｓを用いて増幅した。この際、コードＸＸはそれぞれ、両方のａｃｃ遺伝子バリアントのうちの一方を表す（ａｃｃＢＣまたはａｃｃＤ１）。その際、（欠失対象遺伝子に面した）内側プライマー（ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｕｐ－ａｓ／ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｄｏｗｎ－ｓ）のヌクレオチド配列は、両方の増幅断片ｕｐとｄｏｗｎとが、後のギブソン・アセンブリングの前提条件となる互いに相補的なオーバーハングを含有するように選択した。さらに、これらのプライマーにより、それぞれのｆａｓＯ結合部位内に予定の突然変異を導入する。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行い、続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて添付のプロトコルに従い精製した。突然変異プラスミドの構築には、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ空ベクターを、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化した。その制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。ギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ等、２００９ａ）を利用した、ＤＮＡ断片のアセンブリングには、増幅断片を、線状化したベクターバックボーンｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢに対して３倍のモル過剰で使用した。等温反応バッファの他にアセンブリングに必要な酵素（Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ ＤＮＡリガーゼ）を含有する調製済みギブソン・アセンブリ・マスターミックスをＤＮＡ断片に加えた。断片のアセンブリングは、サーモサイクラー中、５０℃において６０分間行う。断片のアセンブリングを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での突然変異プラスミドの正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にアセンブリングした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｕｎｉｖ／ｒｓｐを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物が突然変異プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＢＣまたはｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＤ１の正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのエレクトロコンピテントセルの一定分量を、記載のプロトコルにより、それぞれの突然変異プラスミドで形質転換し、ＢＨＩＳ－Ｋａｎ１５プレート上にまいた。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中では複製できないため、続く、仲介されるカナマイシン耐性の選択においては、相同配列を介して突然変異プラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムに効果的に組み込めた場合にのみカナマイシン耐性が形成されると前提できた。得られた組込み体を、第１の選択ラウンドにおいて、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。突然変異プラスミドのゲノム組込みに成功した場合、カナマイシン耐性に加えて、ｓａｃＢによってコードされるレバンスクラーゼが形成される。この酵素は毒性のレバンへのスクロースの重合を触媒するため、スクロース上での増殖時に誘発性の致死に至る（Ｂｒａｍｕｃｃｉ＆Ｎａｇａｒａｊａｎ、１９９６）。それによると、相同組換えにより突然変異プラスミドをそれらのゲノムに組み込んだコロニーは、カナマイシン耐性であり、スクロース感受性である。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去は、二重に存在することになるＤＮＡ領域を介して、染色体由来の突然変異対象コドンが、最終的に、導入された突然変異断片と交換された第２の組換え現象において起こった。そのためには、記載の表現型（カナマイシン耐性あり、スクロース感受性あり）を示した細胞を、ＢＨＩ培地（カナマイシンは添加せず）３ｍｌを含む試験管中、３０℃において３時間、１７０ＲＰＭでインキュベートした。続いて、１：１０希釈物の各１００μｌを、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。全体として、ＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上で増殖したクローンのうちの５０個を選択し、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去の成功を点検するために、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５およびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。プラスミドが完全に除去された場合、これは、それぞれのクローンのカナマイシン感受性およびスクロース耐性で示される。第２の組換え現象（除去）は、所望の突然変異の他に、野生型の状況の復元ももたらし得る。除去後の得られたクローン中での突然変異の成功を証明するために、対応するゲノム領域をコロニーＰＣＲで増幅した（プライマー対はｃｈｋ＿ａｃｃＸＸ＿ｓ／ｃｈｋ＿ａｃｃＸＸ＿ａｓ）。ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製し、突然変異を検証するためにプライマーｃｈｋ＿ａｃｃＸＸ＿ｓ／ｃｈｋ＿ａｃｃＸＸ＿ａｓを用いてシーケンスした。
それゆえ本発明によると、ａｃｃＢＣ前方にあるｆａｓＯ結合部位中の１１～１３（ｔｇａ－＞ｇｔｃ）および２０～２２位（ｃｃｔ－＞ａａｇ）においてヌクレオチド置換が存在する。ａｃｃＤ１前方のｆａｓＯ結合部位中では、２０～２４位（ｃｃｔｃａ－＞ｇｔａｃｇ）にヌクレオチド置換が存在する。本発明の一バリアントでは、遺伝子ａｃｃＢＤまたはａｃｃＤ１前方にある本発明によるｆａｓＯ結合部位が、配列番号１３または１５による核酸配列を有する。
使用したプライマー
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＢＣ
ｍｕ－ａｃｃＢＣ－ｕｐ－ｓ：ＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＧＣＧＴＴＣＧＴＧ
ｍｕ－ａｃｃＢＣ－ｕｐ－ａｓ：ＴＴＡＣＧＡＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣＴＴＡＴＧ
ｍｕ－ａｃｃＢＣ－ｄｏｗｎ－ｓ：ＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＡＧＡＡＴＡＧＴＣＧＴＡＡＧＴＡＡＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＴＴＧ
ｍｕ－ａｃｃＢＣ－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧ
ｃｈｋ－ａｃｃＢＣ－ｓ：ＧＴＴＣＧＧＣＣＡＣＴＣＣＧＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＧ
ｃｈｋ－ａｃｃＢＣ－ａｓ：ＧＣＣＴＴＧＡＴＧＧＣＧＡＴＴＧＧＧＡＧＡＣＣ
ｍｕｆａｓＯ－ａｃｃＤ１
ｍｕ－ａｃｃＤ１－ｕｐ－ｓ：ＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＴＣＡＡＣＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＧＣ
ｍｕ－ａｃｃＤ１－ｕｐ－ａｓ：ＣＴＡＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＴＣＧＴＡＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＧＧＧ
ｍｕ－ａｃｃＤ１－ｄｏｗｎ－ｓ：ＡＣＣＧＣＴＡＣＧＡＴＴＴＣＡＡＡＡＣＡＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＴＡＧＣＣＣＴＴＴＧＡＴＴＧＡＣＧＴＣＧＣＣＡＡＣＣＴＴＣ
ｍｕ－ａｃｃＤ１－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＴＴＴＴＧ
ｃｈｋ－ａｃｃＤ１－ｓ：ＧＧＣＴＧＡＴＡＴＴＡＧＴＧＣＣＣＣＡＡＣＣＧＡＴＧＡＣ
ｃｈｋ－ａｃｃＤ１－ａｓ：ＧＡＴＣＡＣＧＴＣＴＧＧＧＣＣＧＧＴＡＡＣＧＡＡＣ
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
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ｍｕ－ａｃｃＢＣ－ｕｐ－ｓ：ＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＧＣＧＴＴＣＧＴＧ
ｍｕ－ａｃｃＢＣ－ｕｐ－ａｓ：ＴＴＡＣＧＡＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣＴＴＡＴＧ
ｍｕ－ａｃｃＢＣ－ｄｏｗｎ－ｓ：ＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＡＧＡＡＴＡＧＴＣＧＴＡＡＧＴＡＡＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＴＴＧ
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コリネ型細菌細胞のゲノムに組み込むための、脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの機能性を消失させる、遺伝子ｆａｓＢの欠失
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｆａｓＢの構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子ｆａｓＢの欠失用のプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｆａｓＢ（図５）を構築するために、相同組換え現象に必要とされるフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｆａｓＢの構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子ｆａｓＢの欠失用のプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｆａｓＢ（図５）を構築するために、相同組換え現象に必要とされるフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
上流側断片の生成には、プライマー対ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｕｐ－ｓ／ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｕｐ－ａｓを使用し、下流側隣接部はプライマー対ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｄｏｗｎ－ｓ／ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｄｏｗｎ－ａｓを用いて増幅した。その際、（欠失対象遺伝子に面した）内側プライマー（ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｕｐ－ａｓ／ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｄｏｗｎ－ｓ）のヌクレオチド配列は、両方の増幅断片ｕｐとｄｏｗｎとが、後のギブソン・アセンブリングの前提条件となる互いに相補的なオーバーハングを含有するように選択した。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行い、続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて添付のプロトコルに従い精製した。欠失プラスミドの構築には、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ空ベクターを、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化した。その制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。ギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ等、２００９ａ）を利用した、ＤＮＡ断片のアセンブリングには、増幅断片を、線状化したベクターバックボーンｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢに対して３倍のモル過剰で使用した。等温反応バッファの他にアセンブリングに必要な酵素（Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ ＤＮＡリガーゼ）を含有する調製済みギブソン・アセンブリ・マスターミックスをＤＮＡ断片に加えた。断片のアセンブリングは、サーモサイクラー中、５０℃において６０分間行う。断片のアセンブリングを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中において、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での突然変異プラスミドの正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にアセンブリングした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｕｎｉｖ／ｒｓｐを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物が欠失プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｆａｓＢの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのエレクトロコンピテントセルの一定分量を、記載のプロトコルにより、それぞれの欠失プラスミドで形質転換し、ＢＨＩＳ－Ｋａｎ１５プレート上にまいた。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中では複製できないため、続く、仲介されるカナマイシン耐性の選択においては、相同配列を介して欠失プラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムに効果的に組み込めた場合にのみカナマイシン耐性が形成されると前提できた。得られた組込み体を、第１の選択ラウンドにおいて、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。欠失プラスミドのゲノム組込みに成功した場合、カナマイシン耐性に加えて、ｓａｃＢによってコードされるレバンスクラーゼが形成される。この酵素は毒性のレバンへのスクロースの重合を触媒するため、スクロース上での増殖時に誘発性の致死に至る（Ｂｒａｍｕｃｃｉ＆Ｎａｇａｒａｊａｎ、１９９６）。それによると、相同組換えにより欠失プラスミドをそれらのゲノムに組み込んだコロニーは、カナマイシン耐性であり、スクロース感受性である。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去は、二重に存在することになるＤＮＡ領域を介して、染色体由来の突然変異対象コドンが、最終的に、導入された突然変異断片と交換された第２の組換え現象において起こった。そのためには、記載の表現型（カナマイシン耐性あり、スクロース感受性あり）を示した細胞を、ＢＨＩ培地（カナマイシンは添加せず）３ｍｌを含む試験管中、３０℃において３時間、１７０ＲＰＭでインキュベートした。続いて、１：１０希釈物の各１００μｌを、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。全体として、ＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上で増殖したクローンのうちの５０個を選択し、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去の成功を点検するために、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５およびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。プラスミドが完全に除去された場合、これは、それぞれのクローンのカナマイシン感受性およびスクロース耐性で示される。第２の組換え現象（除去）は、所望の欠失の他に、野生型の状況の復元ももたらし得る。除去後の得られたクローン中での欠失の成功は、得られたクローンのコロニーＰＣＲを利用して、欠失の際に見込まれる断片サイズにより点検した。この際、使用したプライマーｃｈｋ－ｆａｓＢ－ｓ／ｃｈｋ－ｆａｓＢ－ａｓは、染色体中の欠失ＤＮＡ領域外部に、および増幅フランキング遺伝子領域外部にも結合するように選択した。
使用したプライマー
ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｕｐ－ｓ：ＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＣＴＧＧＡＴＧ
ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｕｐ－ａｓ：ＣＧＣＧＧＧＡＡＴＣＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＧＧ
ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｄｏｗｎ－ｓ：ＣＡＧＧＡＡＣＴＴＣＧＡＴＴＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＴＡ
ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＣＴＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣ
ｃｈｋ－ｆａｓＢ－ｓ：ＧＧＡＧＧＡＴＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＣＡＴＴＧ
ｃｈｋ－ｆａｓＢ－ａｓ：ＣＧＣＴＡＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＴＣＧ
ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｕｐ－ｓ：ＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＣＴＧＧＡＴＧ
ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｕｐ－ａｓ：ＣＧＣＧＧＧＡＡＴＣＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＧＧ
ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｄｏｗｎ－ｓ：ＣＡＧＧＡＡＣＴＴＣＧＡＴＴＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＴＡ
ｆａｓＢ－（ｃｇ２７４３）－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＣＴＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣ
ｃｈｋ－ｆａｓＢ－ｓ：ＧＧＡＧＧＡＴＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＣＡＴＴＧ
ｃｈｋ－ｆａｓＢ－ａｓ：ＣＧＣＴＡＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＴＣＧ
コリネ型細菌細胞のゲノムに組み込むための、低下した機能性を有する脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢ中のヌクレオチド置換
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃ細胞を、ＢＨＩ培地５ｍｌ中（試験管、３０℃、１７０ＲＰＭ）、指数増殖期の達成を確保するために、ＯＤ６００ｎｍが５になるまで増殖させた。ＤＭＳＯ中に溶解したメチルニトロニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）（最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）の添加により、３０℃で１５分間、全細胞突然変異導入を行った。被処理細胞を０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）４５ｍｌで２回洗浄し、ＢＨＩ培地１０ｍｌに再懸濁し、続いて３時間、３０℃および１７０ＲＰＭで回復させた。突然変異細胞を、グリセロールストックとして、４０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含むＢＨＩ培地中、－３０℃で保管した。マロニルＣｏＡの供給を定量するために、セルライブラリの希釈物をＢＨＩ寒天プレート上にまいて、単一コロニーをピッキングできるようにした。単一コロニーを無作為にピッキングし、記載のＬＣ－ＭＳ／ＭＳプロトコルに従いマロニルＣｏＡの供給を定量するために培養した。続いて、マロニルＣｏＡの供給の改善を測定できたクローンのゲノムをシーケンスした。検出された突然変異のうちのどれがマロニルＣｏＡの供給の改善に貢献するかを確認するために、選択した突然変異を、菌株バックグラウンドＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃに組み込んだ。続いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用してマロニルＣｏＡの供給を改めて測定し、導入した突然変異がマロニルＣｏＡの供給に対して、推定される有利な影響を有するかどうかを検査した。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃ細胞を、ＢＨＩ培地５ｍｌ中（試験管、３０℃、１７０ＲＰＭ）、指数増殖期の達成を確保するために、ＯＤ６００ｎｍが５になるまで増殖させた。ＤＭＳＯ中に溶解したメチルニトロニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）（最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）の添加により、３０℃で１５分間、全細胞突然変異導入を行った。被処理細胞を０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）４５ｍｌで２回洗浄し、ＢＨＩ培地１０ｍｌに再懸濁し、続いて３時間、３０℃および１７０ＲＰＭで回復させた。突然変異細胞を、グリセロールストックとして、４０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含むＢＨＩ培地中、－３０℃で保管した。マロニルＣｏＡの供給を定量するために、セルライブラリの希釈物をＢＨＩ寒天プレート上にまいて、単一コロニーをピッキングできるようにした。単一コロニーを無作為にピッキングし、記載のＬＣ－ＭＳ／ＭＳプロトコルに従いマロニルＣｏＡの供給を定量するために培養した。続いて、マロニルＣｏＡの供給の改善を測定できたクローンのゲノムをシーケンスした。検出された突然変異のうちのどれがマロニルＣｏＡの供給の改善に貢献するかを確認するために、選択した突然変異を、菌株バックグラウンドＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃに組み込んだ。続いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用してマロニルＣｏＡの供給を改めて測定し、導入した突然変異がマロニルＣｏＡの供給に対して、推定される有利な影響を有するかどうかを検査した。
プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｅ６２２Ｋ、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｇ１３６１Ｄ、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｇ２１５３ＤおよびｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｇ２６６８Ｓの構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子ｆａｓＢによってコードされる脂肪酸合成酵素Ｂ中のそれぞれのアミノ酸置換を組み込むためのプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｅ６２２Ｋ（図１）、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｇ１３６１Ｄ（図２）、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｇ２１５３Ｄ（図３）およびｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｇ２６６８Ｓ（図４）を構築するために、相同組換え現象に必要とされる、それぞれ突然変異対象のコドンのフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子ｆａｓＢによってコードされる脂肪酸合成酵素Ｂ中のそれぞれのアミノ酸置換を組み込むためのプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｅ６２２Ｋ（図１）、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｇ１３６１Ｄ（図２）、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｇ２１５３Ｄ（図３）およびｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｇ２６６８Ｓ（図４）を構築するために、相同組換え現象に必要とされる、それぞれ突然変異対象のコドンのフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
上流側断片の生成には、プライマー対Ｓｂｆｌ＿ＸＸＸ－ｓ／ＯＬ－ＸＸＸ－ａｓを使用し、下流側隣接部はプライマー対ＯＬ－ＸＸＸ－ｓ／ＸｂａＩ－ＸＸＸ－ａｓを用いて増幅した。この際、コードＸＸＸはそれぞれ、脂肪酸合成酵素Ｂ中の特定部位に挿入すべきアミノ酸置換を表す。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行った。その際、（突然変異対象コドンに面した）内側プライマー（ＯＬ＿ＸＸＸ＿ａｓ／ＯＬ＿ＸＸＸ＿ｓ）のヌクレオチド配列は、両方の増幅断片ｕｐとｄｏｗｎとが、互いに相補的なオーバーハングを含有するように選択した。第２のＰＣＲ（ＤＮＡプライマーは添加せず）では、精製された断片が、相補配列を介して結合し、互いにプライマーとしても鋳型としても機能する（オーバーラップ伸長ＰＣＲ）。そのように生成した突然変異断片を、最終ＰＣＲにおいて、第１のＰＣＲからの（遺伝子に面していない）両方の外側プライマーを用いて増幅した（Ｓｂｆｌ＿ＸＸＸ＿ｓ／ＸｂａＩ＿ＸＸＸ＿ａｓ）。１％ＴＡＥアガロースゲル上での電気泳動分離後に、最終的な突然変異断片を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて添付のプロトコルに従いゲルから単離した。突然変異プラスミドの構築には、突然変異断片と同様にｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ空ベクターも、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＳｂｆＩおよびＸｂａＩで線状化した。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、突然変異断片のうちのそれぞれ１つを、線状化したベクターバックボーンｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢに対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での突然変異プラスミドの正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｕｎｉｖ／ｒｓｐを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物がそれぞれの突然変異プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－ＸＸＸの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのエレクトロコンピテントセルの一定分量を、記載のプロトコルにより、それぞれの突然変異プラスミドで形質転換し、ＢＨＩＳ－Ｋａｎ１５プレート上にまいた。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中では複製できないため、続く、仲介されるカナマイシン耐性の選択においては、相同配列を介して突然変異プラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムに効果的に組み込めた場合にのみカナマイシン耐性が形成されると前提できた。得られた組込み体を、第１の選択ラウンドにおいて、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。突然変異プラスミドのゲノム組込みに成功した場合、カナマイシン耐性に加えて、ｓａｃＢによってコードされるレバンスクラーゼが形成される。この酵素は毒性のレバンへのスクロースの重合を触媒するため、スクロース上での増殖時に誘発性の致死に至る（Ｂｒａｍｕｃｃｉ＆Ｎａｇａｒａｊａｎ、１９９６）。それによると、相同組換えにより突然変異プラスミドをそれらのゲノムに組み込んだコロニーは、カナマイシン耐性であり、スクロース感受性である。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去は、二重に存在することになるＤＮＡ領域を介して、染色体由来の突然変異対象コドンが、最終的に、導入された突然変異断片と交換された第２の組換え現象において起こった。そのためには、記載の表現型（カナマイシン耐性あり、スクロース感受性あり）を示した細胞を、ＢＨＩ培地（カナマイシンは添加せず）３ｍｌを含む試験管中、３０℃において３時間、１７０ＲＰＭでインキュベートした。続いて、１：１０希釈物の各１００μｌを、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。全体として、ＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上で増殖したクローンのうちの５０個を選択し、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去の成功を点検するために、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５およびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。プラスミドが完全に除去された場合、これは、それぞれのクローンのカナマイシン感受性およびスクロース耐性で示される。第２の組換え現象（除去）は、所望の突然変異の他に、野生型の状況の復元ももたらし得る。除去後の得られたクローン中での突然変異の成功を証明するために、対応するゲノム領域をコロニーＰＣＲで増幅した（プライマー対はＳｂｆｌ＿ＸＸＸ＿ｓ／ＸｂａＩ＿ＸＸＸ＿ａｓ）。ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製し、突然変異を検証するためにプライマーＳｂｆｌ＿ＸＸＸ＿ｓ、ＯＬ＿ＸＸＸ＿ａｓ、ＯＬ＿ＸＸＸ＿ｓおよびＸｂａＩ＿ＸＸＸ＿ａｓを用いてシーケンスした。
使用したプライマー：
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｅ６２２Ｋ
ＯＬ＿６２２－ｓ：ＧＴＡＣＣＧＣＴＧＣＧＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＧＴＣ
ＯＬ＿６２２－ａｓ：ＧＡＣＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＧＴＴＧＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣ
Ｓｂｆｌ＿６２２－ｓ：ＡＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＣＣＡＧ
Ｘｂａｌ＿６２２－ａｓ：ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＡＣＧＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＧＣＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＣＡＧＧＣ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｇ１３６１Ｄ
ＯＬ＿１３６１－ｓ：ＣＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＣＧＴＴＧＣＴＣ
ＯＬ＿１３６１－ａｓ：ＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＧＡＧＴＴＧＣＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＧＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧ
Ｓｂｆｌ＿１３６１－ｓ：ＡＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＴＧＣＡＣＣＴＧＡＡＴＣＣＡＴＧＣＧＣＣＣＡＴＴＣＧＣＴＧＴＧＡＴＣ
Ｘｂａｌ＿１３６１－ａｓ：ＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＴＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＣＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｆａｓＢ－Ｇ２１５３Ｄ
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本発明のバリアントでは、ヌクレオチド置換およびそれに従って対応するアミノ酸交換が存在する、コリネ型細菌由来の脂肪酸合成酵素ＦａｓＢのタンパク質、および／またはコリネ型細菌由来の脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードする核酸配列も含まれる。そのようなバリアントは、例えば、１８６４位（ｇ－＞ａ）でのヌクレオチド置換を有する配列番号１、４０８２位（ｇ－＞ａ）でのヌクレオチド置換を有する配列番号３、６４５８位（ｇ－＞ａ）でのヌクレオチド置換を有する配列番号５、８００２～８００４位（ｇｇｔ－＞ｔｃｃ）でのヌクレオチド置換を有する配列番号７および２５～８９４３位の欠失を有する配列番号９に記載されている。
遺伝子の欠失もしくは突然変異（ヌクレオチド置換）またはコリネ型細菌細胞へのＤＮＡの組込みに関する全般的な方法
以下のステップは、欠失に関しても組込み／置換に関しても同じである。便宜上、欠失株または欠失プラスミドについてのみ述べる。
以下のステップは、欠失に関しても組込み／置換に関しても同じである。便宜上、欠失株または欠失プラスミドについてのみ述べる。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ欠失株の構築には、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベースの欠失プラスミドをクローニングする（Ｓｃｈａｅｆｅｒ等、１９９４；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０３７８－１１１９（９４）９０３２４－７）。続いて標的遺伝子を、記載のように（ＮｉｅｂｉｓｃｈおよびＢｏｔｔ、２００１年；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２０３０１００２６２）欠失する。その際、このために必要とされる欠失断片は、ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ－ＰＣＲ（Ｌｉｎｋ等、１９９７；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ｊｂ．１７９．２０．６２２８－６２３７．１９９７）を利用して生成する。そのために、第１のステップでは、２つの別々の反応において、染色体中の欠失対象遺伝子の上流および下流に位置する約５００ｂｐのサイズのフランキング断片を生成する。その際、（欠失対象遺伝子に面した）内側プライマーのヌクレオチド配列は、両方の増幅断片が互いに相補的なオーバーハングを含有するように選択する。第２のＰＣＲでは、精製された断片が、相補配列を介して結合し、互いにプライマーとしても鋳型としても機能する。そのように生成した欠失断片を、最終ＰＣＲにおいて、第１のＰＣＲからの（遺伝子に面していない）両方の外側プライマーを用いて増幅する。１％ＴＡＥアガロースゲル上での電気泳動分離（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）後に、最終的な欠失断片を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて添付のプロトコルに従いゲルから単離する。続いて、挿入し加水分解した制限酵素切断部位を介して、該欠失断片をベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢとライゲーションする。続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５化学コンピテントセルを、ライゲーション混合液全体で形質転換する。増殖した形質転換体は、コロニーＰＣＲを利用して正確なライゲーション産物を点検し、ポジティブな欠失プラスミドを単離しシーケンスする。挿入の場合、挿入対象ＤＮＡ配列は、標的座位のフランキング領域間にクローニングされる。以下のステップは、欠失に関しても挿入に関しても同じである。便宜上、欠失プラスミドにつてのみ述べる。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのエレクトロコンピテントセルの一定分量を、記載のプロトコルにより、それぞれの欠失プラスミドで形質転換し、ＢＨＩＳ－Ｋａｎ１５プレート上にまく。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中では複製できないため、続く、仲介されるカナマイシン耐性の選択においては、相同配列を介して欠失プラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムに効果的に組み込めた場合にのみカナマイシン耐性が形成されると前提できた。得られた組込み体を、第１の選択ラウンドにおいて、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０Ｃで一晩インキュベートする。欠失プラスミドのゲノム組込みに成功した場合、カナマイシン耐性に加えて、ｓａｃＢによってコードされるレバンスクラーゼが形成される。この酵素は毒性のレバンへのスクロースの重合を触媒するため、スクロース上での増殖時に誘発性の致死に至る（Ｂｒａｍｕｃｃｉ＆Ｎａｇａｒａｊａｎ、１９９６；ＰＭＩＤ ８８９９９８１）。それによると、相同組換えにより欠失プラスミドをそれらのゲノムに組み込んだコロニーは、カナマイシン耐性であり、スクロース感受性である。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去は、二重に存在することになるＤＮＡ領域を介して、染色体由来の欠失対象遺伝子が、最終的に、導入された欠失断片と交換される第２の組換え現象において起こる。そのためには、記載の表現型（カナマイシン耐性あり、スクロース感受性あり）を示した細胞を、ＢＨＩ培地（カナマイシンは添加せず）３ｍｌを含む試験管中、３０Ｃにおいて３時間、１７０ＲＰＭでインキュベートする。続いて、１：１０希釈物の各１００μｌを、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０Ｃで一晩インキュベートする。全体として、ＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上で増殖したクローンのうちの５０個を選択し、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去の成功を点検するために、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５およびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）上にまいて、３０℃で一晩インキュベートする。プラスミドが完全に除去された場合、これは、それぞれのクローンのカナマイシン感受性およびスクロース耐性で示される。第２の組換え現象（除去）は、所望の遺伝子欠失の他に、野生型の状況の復元ももたらし得る。除去後の得られたクローン中での欠失の成功は、得られたクローンのコロニーＰＣＲを利用して、遺伝子または遺伝子クラスターの欠失の際に見込まれる断片サイズにより点検する。この際、使用したプライマーは、染色体中の欠失ＤＮＡ領域外部に、および増幅フランキング遺伝子領域外部にも結合するように選択する。
この前記の方法を用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２株から出発して、相同脂肪酸合成酵素遺伝子ｆａｓＢのコーディング領域中にヌクレオチド置換（Ｃ．ｇ．１３０２３２－ｆａｓＢ－Ｅ６２２Ｋ、Ｃ．ｇ．１３０２３２－ｆａｓＢ－Ｇ１３６１Ｄ、Ｃ．ｇ．１３０２３２－ｆａｓＢ－Ｇ２１５３Ｅ、Ｃ．ｇ．１３０２３２－ｆａｓＢ－Ｇ２６６８Ｓ）または欠失領域（Ｃ．ｇ．１３０３２－ΔｆａｓＢ）、遺伝子クラスターａｃｃＢＣＤ１前方の相同ｆａｓＯ結合部位中の変化（Ｃ．ｇ．１３０２３２－ｍｕｆａｓＯ）、およびシトレート合成酵素ｇｔｌＡをコードする遺伝子前方の、低下した活性を有する同種プロモーター領域（Ｃ．ｇ．１３０３２－Ｃ７）を有する株を構築する。これらの株は、非組換え的に変化していることが顕著であり、そのためｎｏｎ－ＧＭＯとして際立っている。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ １３０３２ ＤｅｌＡｒｏ３／ＤｅｌＡｒｏ４株構築
以下に記載の方法を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇならびにすべての対応する中間体、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ３、ＤｅｌＡｒｏ４およびＤｅｌＡｒｏ３－４ｃｌＰｃＣｇの構築に使用した。
以下に記載の方法を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇならびにすべての対応する中間体、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ３、ＤｅｌＡｒｏ４およびＤｅｌＡｒｏ３－４ｃｌＰｃＣｇの構築に使用した。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇを構築するための親株として、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＭＢ００１（ＤＥ３）株を選択する。この株は、プロファージを含まないＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２野生株（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＭＢ００１株；Ｂａｕｍｇａｒｔ等、２０１３ｂ、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ＡＥＭ．０１６３４－１３）であり、さらには、強力で誘導性のＴ７プロモーターの利用を可能にする、染色体に組み込まれたＴ７ポリメラーゼを有する（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＭＢ００１（ＤＥ３）株；Ｋｏｒｔｍａｎｎ等、２０１５；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／１７５１－７９１５．１２２３６）。このプロモーターは、それぞれの生成物の合成に関与する植物由来遺伝子の発現に利用されるｐＭＫＥｘ２プラスミド上にも存在する。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＭＢ００１（ＤＥ３）から出発して、遺伝子（クラスター）ｃｇ０３４４－４７、ｃｇ２６２５－４０およびｃｇ１２２６の欠失により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ３株を構築する（Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ等、２０１６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１６．０６．００３）。
ｃｇ０３４４－４７は、フェニルプロパノイド、例えばｐ－クマル酸の異化作用に関与する遺伝子をコードするｐｈｄＢＣＤＥオペロンである。
酵素触媒性の環ヒドロキシル化または環開裂反応による、フェニルプロパノイドの非特異的変換を阻止するためには（４－ヒドロキシベンゾエート－３ーヒドロキシラーゼＰｏｂＡまたはプロトカテクエートジオキシゲナーゼＰｃａＧＨのそれぞれの酵素の天然基質は、フェニルプロパノイドとの高い構造類似性を示す）、対応する遺伝子（クラスター）ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）およびｃｇ２６２５－４０（４－ヒドロキシベンゾエート、カテコール、ベンゾエートおよびプロトカテクエートの分解に必須であるｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ遺伝子）を欠失する。
グルコースからの植物性ポリフェノールの合成を確立する際（プラスミドｐＥＫＥｘ３＿ａｒｏＨＥｃ＿ｔａｌＦｊを付加的に使用）、０．９ｇ／Ｌのプロトカテクエートの蓄積が測定されるが、Ｌ－チロシンもｐ－クマル酸も検出され得ない（Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ等、２０１６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１６．０６．００３）。３－デヒドロシキメートデヒドラターゼ（３－Ｄｅｈｙｄｒｏｓｈｉｋｉｍａｔ Ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）ＱｓｕＢは、シキミ酸経路の中間体３－デヒドロシキメートの、プロトカテクエートへの熱力学的不可逆変換を触媒するため、芳香族アミノ酸の合成経路の中間体の望ましくない損失をもたらす。ｑｓｕＢの欠失は、プロトカテクエートの蓄積を低下させた。それゆえ、構築されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ３株中において、遺伝子ｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）を付加的に欠失させ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４株を得る。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ３またはＤｅｌＡｒｏ４株中での、Ｔ７プロモーターの制御下にあるペトロセリナム・クリスプム由来４ｃｌＰｃＣｇ遺伝子の、欠失座位ｃｇ０３４４－４７への染色体組込みにより（Δｃｇ０３４４－４７：：ＰＴ７－４ｃｌＰｃＣｇ）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ３－４ｃｌＰｃＣｇまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇを構築した。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ３－４ｃｌＰｃＣｇまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇから出発して、類似に（上記の、コリネ型細菌へのＤＮＡの欠失または組込みを参照）、非組換え的に変化させたＤＮＡの組込みにより、それらの株では脂肪酸合成酵素ｆａｓＢの遺伝子が突然変異もしくは欠失する、遺伝子クラスターａｃｃＢＣＤ１前方のｆａｓＯ結合部位が突然変異するか、またはシトレート合成酵素遺伝子ｇｌｔＡ前方のプロモーターが突然変異する対応するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を構築する。それにより上記のすべてのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株（ＤｅｌＡｒｏ３、ＤｅｌＡｒｏ４、ＤｅｌＡｒｏ３－４ｃｌＰｃＣｇ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ）に関して例示的に、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－ｆａｓＢ－Ｅ６２２Ｋ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－ｆａｓＢ－Ｇ１３６１Ｄ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－ｆａｓＢ－Ｇ２１５３Ｅ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－ｆａｓＢ－Ｇ２６６８Ｓ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－ΔｆａｓＢ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ－ｆａｓＢ－Ｅ６２２Ｋ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ－ｆａｓＢ－Ｇ１３６１Ｄ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ－ｆａｓＢ－Ｇ２１５３Ｂ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ－ｆａｓＢ－Ｇ２６６８Ｓ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ－ΔｆａｓＢを含む株を構築する。コリネ型細菌の遺伝子、例えば、ｆａｓＢ、ｆａｓＯおよびｇｔｌＡ中の変化の組み合わせを、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ野生型ＡＴＣＣ１３０３２またはその誘導体Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ３、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ３－４ｃｌＰｃＣｇ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇのゲノム中に有するあらゆる可能な他の細菌株も、記載される同様の様式で製造する。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０３４４－４７－ｄｅｌおよびｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ２６２５－４０－ｄｅｌの構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子クラスターｃｇ０３４４－４７およびｃｇ２６２５－４０の欠失用のプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０３４４－４７－ｄｅｌ（図１２）およびｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ２６２５－４０－ｄｅｌ（図１３）を構築するために、それぞれ欠失対象の遺伝子クラスターの相同組換え現象に必要とされるフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子クラスターｃｇ０３４４－４７およびｃｇ２６２５－４０の欠失用のプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０３４４－４７－ｄｅｌ（図１２）およびｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ２６２５－４０－ｄｅｌ（図１３）を構築するために、それぞれ欠失対象の遺伝子クラスターの相同組換え現象に必要とされるフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
上流側断片の生成には、プライマー対ｃｇＸＸＸＸ－ＸＸ－ｕｐ－ｓ／ｃｇＸＸＸＸ－ＸＸ－ｕｐ－ａｓを使用し、下流側隣接部はプライマー対ｃｇＸＸＸＸ－ＸＸ－ｄｏｗｎ－ｓ／ｃｇＸＸＸＸ－ＸＸ－ｄｏｗｎ－ａｓを用いて増幅した。この際、コードＸＸＸＸ－ＸＸはそれぞれ、欠失対象遺伝子のｃｇ番号を表す。例えば、遺伝子クラスターｃｇ０３４４－４７の欠失にはプライマー対ｃｇ０３４４－４７－ｕｐ－ｓ／ｃｇ０３４４－４７－ｕｐ－ａｓを、相応に遺伝子クラスターｃｇ２６２５－４０の欠失にはプライマー対ｃｇ２６２５－４０－ｕｐ－ｓ／ｃｇ２６２５－４０－ｕｐ－ａｓを利用する。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行った。その際、（欠失対象遺伝子に面した）内側プライマー（ｃｇＸＸＸＸ－ＸＸ－ｕｐ－ａｓ／ｃｇＸＸＸＸ－ＸＸ－ｄｏｗｎ－ｓ）のヌクレオチド配列は、両方の増幅断片ｕｐとｄｏｗｎとが、互いに相補的なオーバーハングを含有するように選択した。これは、遺伝子クラスターｃｇ０３４４－４７に関しては、プライマー対ｃｇ０３４４－４７－ｕｐ－ａｓ／ｃｇ０３４４－４７－ｄｏｗｎ－ｓであり、相応に遺伝子クラスターｃｇ２６２５－４０に関してはプライマー対ｃｇ２６２５－４０－ｕｐ－ａｓ／ｃｇ２６２５－４０－ｄｏｗｎ－ｓである。第２のＰＣＲ（ＤＮＡプライマーは添加せず）では、精製された断片が、相補配列を介して結合し、互いにプライマーとしても鋳型としても機能する（オーバーラップ伸長ＰＣＲ）。そのように生成した欠失断片を、最終ＰＣＲにおいて、第１のＰＣＲからの（遺伝子に面していない）両方の外側プライマーを用いて増幅した（ｃｇＸＸＸＸ－ＸＸ－ｕｐ－ｓ／ｃｇＸＸＸＸ－ＸＸ－ｄｏｗｎ－ａｓ）。これは、遺伝子クラスターｃｇ０３４４－４７に関してはプライマー対ｃｇ０３４４－４７－ｕｐ－ｓ／ｃｇ０３４４－４７－ｄｏｗｎ－ａｓであり、相応に遺伝子クラスターｃｇ２６２５－４０に関してはプライマー対ｃｇ２６２５－４０－ｕｐ－ｓ／ｃｇ２６２５－４０－ｄｏｗｎ－ａｓである。１％ＴＡＥアガロースゲル上での電気泳動分離後に、最終的な欠失断片を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて添付のプロトコルに従いゲルから単離した。欠失プラスミドの構築には、欠失断片と同様にｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ空ベクターも、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで線状化した。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、両方の欠失断片のうちのそれぞれ１つを、線状化したベクターバックボーンｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢに対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での欠失プラスミドの正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｕｎｉｖ／ｒｓｐを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物がそれぞれの欠失プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０３４４－４７－ｄｅｌまたはｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ２６２５－４０－ｄｅｌの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのエレクトロコンピテントセルの一定分量を、記載のプロトコルにより、それぞれの欠失プラスミドで形質転換し、ＢＨＩＳ－Ｋａｎ１５プレート上にまいた。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中では複製できないため、続く、仲介されるカナマイシン耐性の選択においては、相同配列を介して欠失プラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムに効果的に組み込めた場合にのみカナマイシン耐性が形成されると前提できた。得られた組込み体を、第１の選択ラウンドにおいて、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。欠失プラスミドのゲノム組込みに成功した場合、カナマイシン耐性に加えて、ｓａｃＢによってコードされるレバンスクラーゼが形成される。この酵素は毒性のレバンへのスクロースの重合を触媒するため、スクロース上での増殖時に誘発性の致死に至る（Ｂｒａｍｕｃｃｉ＆Ｎａｇａｒａｊａｎ、１９９６）。それによると、相同組換えにより欠失プラスミドをそれらのゲノムに組み込んだコロニーは、カナマイシン耐性であり、スクロース感受性である。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去は、二重に存在することになるＤＮＡ領域を介して、染色体由来の欠失対象遺伝子が、最終的に、導入された欠失断片と交換された第２の組換え現象において起こった。そのためには、記載の表現型（カナマイシン耐性あり、スクロース感受性あり）を示した細胞を、ＢＨＩ培地（カナマイシンは添加せず）３ｍｌを含む試験管中、３０℃において３時間、１７０ＲＰＭでインキュベートした。続いて、１：１０希釈物の各１００μｌを、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。全体として、ＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上で増殖したクローンのうちの５０個を選択し、％スクロース（ｗ／ｖ）上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。プラスミドが完全に除去された場合、これは、それぞれのクローンのカナマイシン感受性およびスクロース耐性で示される。第２の組換え現象（除去）は、所望の遺伝子欠失の他に、野生型の状況の復元ももたらし得る。除去後の得られたクローン中での欠失の成功は、得られたクローンのコロニーＰＣＲを利用して、遺伝子または遺伝子クラスターの欠失の際に見込まれる断片サイズにより点検した。この際、使用したプライマーｄｅｌ－ｃｇＸＸＸＸ－ＸＸ－ｓ／ｄｅｌ－ｃｇＸＸＸＸ－ＸＸ－ａｓは、染色体中の欠失ＤＮＡ領域外部に、および増幅フランキング遺伝子領域外部にも結合するように選択した。これは、遺伝子クラスターｃｇ０３４４－４７に関してはプライマー対ｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ｓ／ｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ａｓであり、相応に遺伝子クラスターｃｇ２６２５－４０に関してはプライマー対ｄｅｌ－ｃｇ２６２５－４０－ｓ／ｄｅｌ－ｃｇ２６２５－４０－ａｓである。
使用したプライマー
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０３４４－４７－ｄｅｌ
ｃｇ０３４４－４７－ｕｐ－ｓ：ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＧＡＧ
ｃｇ０３４４－４７－ｕｐ－ａｓ：ＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＡＣＴＡＴＣＡＡＣＧＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＡＣＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＣ
ｃｇ０３４４－４７－ｄｏｗｎ－ｓ：ＣＴＧＡＣＧＣＧＴＴＧＡＴＡＧＴＡＣＴＴＧＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＴＡＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧ
ｃｇ０３４４－４７－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＧ
ｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ｓ：ＡＧＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＣＧＧＣＧＡＴＧＡＧ
ｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ａｓ：ＧＡＣＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＴＣＧＣＣＡＧ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ２６２５－４０－ｄｅｌ
ｃｇ２６２５－４０－ｕｐ－ｓ：ＡＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＣＧＧＣＧＡＡＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＴＧ
ｃｇ２６２５－４０－ｕｐ－ａｓ：ＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＴＡＴＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＴＡＧ
ｃｇ２６２５－４０－ｄｏｗｎ－ｓ：ＴＴＧＡＧＣＡＣＧＣＧＴＴＧＣＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧＧＡＴＡＡＣ
ｃｇ２６２５－４０－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＧＴＧＣＧＡＡＡＣ
ｄｅｌ－ｃｇ２６２５－４０－ｓ：ＡＡＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＧＡＡＣＡＡＴＣ
ｄｅｌ－ｃｇ２６２５－４０－ａｓ：ＧＴＴＧＧＣＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＧＧＡＴＧ
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０３４４－４７－ｄｅｌ
ｃｇ０３４４－４７－ｕｐ－ｓ：ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＧＡＧ
ｃｇ０３４４－４７－ｕｐ－ａｓ：ＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＡＣＴＡＴＣＡＡＣＧＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＡＣＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＣ
ｃｇ０３４４－４７－ｄｏｗｎ－ｓ：ＣＴＧＡＣＧＣＧＴＴＧＡＴＡＧＴＡＣＴＴＧＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＧＣＴＴＣＴＡＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧ
ｃｇ０３４４－４７－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＧ
ｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ｓ：ＡＧＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＣＧＧＣＧＡＴＧＡＧ
ｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ａｓ：ＧＡＣＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＴＣＧＣＣＡＧ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ２６２５－４０－ｄｅｌ
ｃｇ２６２５－４０－ｕｐ－ｓ：ＡＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＴＣＧＧＣＧＡＡＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＴＧ
ｃｇ２６２５－４０－ｕｐ－ａｓ：ＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＴＡＴＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＴＡＧ
ｃｇ２６２５－４０－ｄｏｗｎ－ｓ：ＴＴＧＡＧＣＡＣＧＣＧＴＴＧＣＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧＧＡＴＡＡＣ
ｃｇ２６２５－４０－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＧＴＧＣＧＡＡＡＣ
ｄｅｌ－ｃｇ２６２５－４０－ｓ：ＡＡＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＧＡＡＣＡＡＴＣ
ｄｅｌ－ｃｇ２６２５－４０－ａｓ：ＧＴＴＧＧＣＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＧＧＡＴＧ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δｃｇ０３４４－４７：：ＰＴ７－４ｃｌＰｃの構築
ペトロセリナム・クリスプム由来の４ｃｌ遺伝子の、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用にコドン最適化されたバリアントをＴ７プロモーターの制御下（ＰＴ７－４ｃｌＰｃ）、欠失座位ｃｇ０３４４－４７へと染色体組込みするためのプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δｃｇ０３４４－４７：：ＰＴ７－４ｃｌＰｃ（図１４）を構築するために、該遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片として化学合成し、プライマー対ＭｌｕＩ－ＰＴ７－４ＣＬＰｃＣｇ－ｓ／ＮｄｅＩ－４ＣＬＰｃＣｇ－ａｓによる増幅用のＤＮＡ鋳型として使用した。組込みプラスミドの構築には、増幅した４ｃｌＰｃ遺伝子と同様にプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０３４４－４７－ｄｅｌもＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＭｌｕＩおよびＮｄｅＩで線状化した。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、４ｃｌＰｃ断片を、線状化したベクターバックボーンｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０３４４－４７－ｄｅｌに対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での挿入プラスミドの正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｕｎｉｖ／ｒｓｐを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物が挿入プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δｃｇ０３４４－４７：：ＰＴ７－４ｃｌＰｃの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
ペトロセリナム・クリスプム由来の４ｃｌ遺伝子の、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用にコドン最適化されたバリアントをＴ７プロモーターの制御下（ＰＴ７－４ｃｌＰｃ）、欠失座位ｃｇ０３４４－４７へと染色体組込みするためのプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δｃｇ０３４４－４７：：ＰＴ７－４ｃｌＰｃ（図１４）を構築するために、該遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片として化学合成し、プライマー対ＭｌｕＩ－ＰＴ７－４ＣＬＰｃＣｇ－ｓ／ＮｄｅＩ－４ＣＬＰｃＣｇ－ａｓによる増幅用のＤＮＡ鋳型として使用した。組込みプラスミドの構築には、増幅した４ｃｌＰｃ遺伝子と同様にプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０３４４－４７－ｄｅｌもＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＭｌｕＩおよびＮｄｅＩで線状化した。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、４ｃｌＰｃ断片を、線状化したベクターバックボーンｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０３４４－４７－ｄｅｌに対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での挿入プラスミドの正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｕｎｉｖ／ｒｓｐを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物が挿入プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－Δｃｇ０３４４－４７：：ＰＴ７－４ｃｌＰｃの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのエレクトロコンピテントセルの一定分量を、記載のプロトコルにより、挿入プラスミドで形質転換し、ＢＨＩＳ－Ｋａｎ１５プレート上にまいた。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中では複製できないため、続く、仲介されるカナマイシン耐性の選択においては、相同配列を介して挿入プラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムに効果的に組み込めた場合にのみカナマイシン耐性が形成されると前提できた。得られた組込み体を、第１の選択ラウンドにおいて、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。挿入プラスミドのゲノム組込みに成功した場合、カナマイシン耐性に加えて、ｓａｃＢによってコードされるレバンスクラーゼが形成される。この酵素は毒性のレバンへのスクロースの重合を触媒するため、スクロース上での増殖時に誘発性の致死に至る（Ｂｒａｍｕｃｃｉ＆Ｎａｇａｒａｊａｎ、１９９６）。それによると、相同組換えにより挿入プラスミドをそれらのゲノムに組み込んだコロニーは、カナマイシン耐性であり、スクロース感受性である。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去は、二重に存在することになるＤＮＡ領域を介して、選択された、染色体由来の組換え座位が、最終的に、導入された挿入断片と交換された第２の組換え現象において起こった。そのためには、記載の表現型（カナマイシン耐性あり、スクロース感受性あり）を示した細胞を、ＢＨＩ培地（カナマイシンは添加せず）３ｍｌを含む試験管中、３０℃において３時間、１７０ＲＰＭでインキュベートした。続いて、１：１０希釈物の各１００μｌを、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。全体として、ＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上で増殖したクローンのうちの５０個を選択し、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去の成功を点検するために、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５およびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。プラスミドが完全に除去された場合、これは、それぞれのクローンのカナマイシン感受性およびスクロース耐性で示される。第２の組換え現象（除去）は、所望のＰＴ７－４ｃｌＰｃ挿入の他に、野生型の状況の復元ももたらし得る。除去後の得られたクローン中での挿入の成功は、得られたクローンのコロニーＰＣＲを利用して、遺伝子または遺伝子クラスターの挿入の際に見込まれる断片サイズにより点検した。この際、使用したプライマーｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ｓ／ｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ａｓは、染色体中の挿入座位外部に、および増幅フランキング遺伝子領域外部にも結合するように選択した。コンストラクトＰＴ７－４ｃｌＰｃの挿入を示すＰＣＲ断片を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製し、挿入の点検にはプライマーｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ｓ、ｃｇ０３４４－４７－ｕｐ－ｓ、ＭｌｕＩ－ＰＴ７－４ＣＬＰｃＣｇ－ｓ、ＮｄｅＩ－４ＣＬＰｃＣｇ－ａｓ、ｃｇ０３４４－４７－ｄｏｗｎ－ａｓおよびｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ａｓを用いてシーケンスした。
使用したプライマー
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
Ｍｌｕｌ－ＰＴ７－４ＣＬＰｃＣｇ－ｓ：ＴＣＣＴＡＣＧＣＧＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＴＴＧＣＧＴＧＧＣＡＣ
Ｎｄｅｌ－４ＣＬＰｃＣｇ－ａｓ：ＧＧＡＣＧＴＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣ
ｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ｓ：ＡＧＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＣＧＧＣＧＡＴＧＡＧ
ｃｇ０３４４－４７－ｕｐ－ｓ：ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＧＡＧ
ｃｇ０３４４－４７－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＧ
ｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ａｓ：ＧＡＣＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＴＣＧＣＣＡＧ
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
Ｍｌｕｌ－ＰＴ７－４ＣＬＰｃＣｇ－ｓ：ＴＣＣＴＡＣＧＣＧＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＴＴＧＣＧＴＧＧＣＡＣ
Ｎｄｅｌ－４ＣＬＰｃＣｇ－ａｓ：ＧＧＡＣＧＴＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣ
ｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ｓ：ＡＧＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＣＧＧＣＧＡＴＧＡＧ
ｃｇ０３４４－４７－ｕｐ－ｓ：ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＧＡＧ
ｃｇ０３４４－４７－ｄｏｗｎ－ａｓ：ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＧ
ｄｅｌ－ｃｇ０３４４－４７－ａｓ：ＧＡＣＣＣＧＣＡＡＴＧＧＴＧＴＣＧＣＣＡＧ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０５０２－ｄｅｌの構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子ｃｇ０５０２の欠失用のプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０５０２－ｄｅｌ（図１５）を構築するために、相同組換え現象に必要とされるフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子ｃｇ０５０２の欠失用のプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０５０２－ｄｅｌ（図１５）を構築するために、相同組換え現象に必要とされるフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
上流側断片の生成には、プライマー対ｃｇ０５０２－ｕｐ－ｓ／ｃｇ０５０２－ｕｐ－ａｓを使用し、下流側隣接部はプライマー対ｃｇ０５０２－ｄｏｗｎ－ｓ／ｃｇ０５０２－ｄｏｗｎ－ａｓを用いて増幅した。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行った。その際、（欠失対象遺伝子に面した）内側プライマー（ｃｇ０５０２－ｕｐ－ａｓ／ｃｇ０５０２－ｄｏｗｎ－ｓ）のヌクレオチド配列は、両方の増幅断片ｕｐとｄｏｗｎとが、互いに相補的なオーバーハングを含有するように選択した。第２のＰＣＲ（ＤＮＡプライマーは添加せず）では、精製された断片が、相補配列を介して結合し、互いにプライマーとしても鋳型としても機能する（オーバーラップ伸長ＰＣＲ）。そのように生成した欠失断片を、最終ＰＣＲにおいて、第１のＰＣＲからの（遺伝子に面していない）両方の外側プライマーを用いて増幅した（ｃｇ０５０２－ｕｐ－ｓ／ｃｇ０５０２－ｄｏｗｎ－ａｓ）。１％ＴＡＥアガロースゲル上での電気泳動分離後に、最終的な欠失断片を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて添付のプロトコルに従いゲルから単離した。欠失プラスミドの構築には、欠失断片と同様にｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ空ベクターも、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで線状化した。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、欠失断片を、線状化したベクターバックボーンｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢに対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での欠失プラスミドの正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｕｎｉｖ／ｒｓｐを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物が欠失プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ０５０２－ｄｅｌの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのエレクトロコンピテントセルの一定分量を、記載のプロトコルにより、それぞれの欠失プラスミドで形質転換し、ＢＨＩＳ－Ｋａｎ１５プレート上にまいた。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中では複製できないため、続く、仲介されるカナマイシン耐性の選択においては、相同配列を介して欠失プラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムに効果的に組み込めた場合にのみカナマイシン耐性が形成されると前提できた。得られた組込み体を、第１の選択ラウンドにおいて、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。欠失プラスミドのゲノム組込みに成功した場合、カナマイシン耐性に加えて、ｓａｃＢによってコードされるレバンスクラーゼが形成される。この酵素は毒性のレバンへのスクロースの重合を触媒するため、スクロース上での増殖時に誘発性の致死に至る（Ｂｒａｍｕｃｃｉ＆Ｎａｇａｒａｊａｎ、１９９６）。それによると、相同組換えにより欠失プラスミドをそれらのゲノムに組み込んだコロニーは、カナマイシン耐性であり、スクロース感受性である。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去は、二重に存在することになるＤＮＡ領域を介して、染色体由来の欠失対象遺伝子が、最終的に、導入された欠失断片と交換された第２の組換え現象において起こった。そのためには、記載の表現型（カナマイシン耐性あり、スクロース感受性あり）を示した細胞を、ＢＨＩ培地（カナマイシンは添加せず）３ｍｌを含む試験管中、３０℃において３時間、１７０ＲＰＭでインキュベートした。続いて、１：１０希釈物の各１００μｌを、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。全体として、ＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上で増殖したクローンのうちの５０個を選択し、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去の成功を点検するために、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５およびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。プラスミドが完全に除去された場合、これは、それぞれのクローンのカナマイシン感受性およびスクロース耐性で示される。第２の組換え現象（除去）は、所望の遺伝子欠失の他に、野生型の状況の復元ももたらし得る。除去後の得られたクローン中での欠失の成功は、得られたクローンのコロニーＰＣＲを利用して、遺伝子または遺伝子クラスターの欠失の際に見込まれる断片サイズにより点検した。この際、使用したプライマーｄｅｌ－ｃｇ０５０２－ｓ／ｄｅｌ－ｃｇ０５０２－ａｓは、染色体中の欠失ＤＮＡ領域外部に、および増幅フランキング遺伝子領域外部にも結合するように選択した。
使用したプライマー
ｕｐ－ｃｇ０５０２－ｓ：ＡＣＧＡＡＧＣＴＴＴＧＴＣＣＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＡＣ
ｕｐ－ｃｇ０５０２－ａｓ：ＴＧＣＧＣＡＴＡＴＧＴＧＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＡＣＧＣＧＴＡＣＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＧＡＴＧＴＡＣＧＣＡＴＧ
ｄｏｗｎ－ｃｇ０５０２－ｓ：ＡＣＧＴＡＣＧＣＧＴＡＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＣＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＡＴＣＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＡＧＣＡＴＣ
ｄｏｗｎ－ｃｇ０５０２－ａｓ：ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＴＣＧＣＡＣＧＴＣ
ｄｅｌ－ｃｇ０５０２－ｓ：ＧＴＧＡＡＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＴＣ
ｄｅｌ－ｃｇ０５０２－ａｓ：ＴＧＡＴＧＴＴＣＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＴＡＧＡＧ
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ｕｐ－ｃｇ０５０２－ｓ：ＡＣＧＡＡＧＣＴＴＴＧＴＣＣＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＡＣ
ｕｐ－ｃｇ０５０２－ａｓ：ＴＧＣＧＣＡＴＡＴＧＴＧＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＡＣＧＣＧＴＡＣＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＧＡＴＧＴＡＣＧＣＡＴＧ
ｄｏｗｎ－ｃｇ０５０２－ｓ：ＡＣＧＴＡＣＧＣＧＴＡＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＣＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＡＴＣＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＡＧＣＡＴＣ
ｄｏｗｎ－ｃｇ０５０２－ａｓ：ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＴＣＧＣＡＣＧＴＣ
ｄｅｌ－ｃｇ０５０２－ｓ：ＧＴＧＡＡＣＡＴＴＧＴＧＴＴＴＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＣＡＣＴＧＴＣ
ｄｅｌ－ｃｇ０５０２－ａｓ：ＴＧＡＴＧＴＴＣＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＴＡＧＡＧ
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ１２２６－ｄｅｌの構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子ｃｇ１２２６の欠失用のプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ１２２６－ｄｅｌ（図１６）を構築するために、相同組換え現象に必要とされるフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の遺伝子ｃｇ１２２６の欠失用のプラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ１２２６－ｄｅｌ（図１６）を構築するために、相同組換え現象に必要とされるフランキング断片を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの単離ゲノムＤＮＡから出発するＰＣＲにより増幅した。
上流側断片の生成には、プライマー対ｃｇ１２２６－ｕｐ－ｓ／ｃｇ１２２６－ｕｐ－ａｓを使用し、下流側隣接部はプライマー対ｃｇ１２２６－ｄｏｗｎ－ｓ／ｃｇ１２２６－ｄｏｗｎ－ａｓを用いて増幅した。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行った。その際、（欠失対象遺伝子に面した）内側プライマー（ｃｇ１２２６－ｕｐ－ａｓ／ｃｇ１２２６－ｄｏｗｎ－ｓ）のヌクレオチド配列は、両方の増幅断片ｕｐとｄｏｗｎとが、互いに相補的なオーバーハングを含有するように選択した。第２のＰＣＲ（ＤＮＡプライマーは添加せず）では、精製された断片が、相補配列を介して結合し、互いにプライマーとしても鋳型としても機能する（オーバーラップ伸長ＰＣＲ）。そのように生成した欠失断片を、最終ＰＣＲにおいて、第１のＰＣＲからの（遺伝子に面していない）両方の外側プライマーを用いて増幅した（ｃｇ１２２６－ｕｐ－ｓ／ｃｇ１２２６－ｄｏｗｎ－ａｓ）。１％ＴＡＥアガロースゲル上での電気泳動分離後に、最終的な欠失断片を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて添付のプロトコルに従いゲルから単離した。欠失プラスミドの構築には、欠失断片と同様にｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ空ベクターも、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで線状化した。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、欠失断片を、線状化したベクターバックボーンｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢに対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での欠失プラスミドの正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｕｎｉｖ／ｒｓｐを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物が欠失プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ１２２６－ｄｅｌの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのエレクトロコンピテントセルの一定分量を、記載のプロトコルにより、それぞれの欠失プラスミドで形質転換し、ＢＨＩＳ－Ｋａｎ１５プレート上にまいた。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中では複製できないため、続く、仲介されるカナマイシン耐性の選択においては、相同配列を介して欠失プラスミドをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムに効果的に組み込めた場合にのみカナマイシン耐性が形成されると前提できた。得られた組込み体を、第１の選択ラウンドにおいて、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。欠失プラスミドのゲノム組込みに成功した場合、カナマイシン耐性に加えて、ｓａｃＢによってコードされるレバンスクラーゼが形成される。この酵素は毒性のレバンへのスクロースの重合を触媒するため、スクロース上での増殖時に誘発性の致死に至る（Ｂｒａｍｕｃｃｉ＆Ｎａｇａｒａｊａｎ、１９９６）。それによると、相同組換えにより欠失プラスミドをそれらのゲノムに組み込んだコロニーは、カナマイシン耐性であり、スクロース感受性である。
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去は、二重に存在することになるＤＮＡ領域を介して、染色体由来の欠失対象遺伝子が、最終的に、導入された欠失断片と交換された第２の組換え現象において起こった。そのためには、記載の表現型（カナマイシン耐性あり、スクロース感受性あり）を示した細胞を、ＢＨＩ培地（カナマイシンは添加せず）３ｍｌを含む試験管中、３０℃において３時間、１７０ＲＰＭでインキュベートした。続いて、１：１０希釈物の各１００μｌを、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５プレートおよびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。全体として、ＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）プレート上で増殖したクローンのうちの５０個を選択し、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢの除去の成功を点検するために、ＢＨＩ－Ｋａｎ２５およびＢＨＩ１０％スクロース（ｗ／ｖ）上にまいて、３０℃で一晩インキュベートした。プラスミドが完全に除去された場合、これは、それぞれのクローンのカナマイシン感受性およびスクロース耐性で示される。第２の組換え現象（除去）は、所望の遺伝子欠失の他に、野生型の状況の復元ももたらし得る。除去後の得られたクローン中での欠失の成功は、得られたクローンのコロニーＰＣＲを利用して、遺伝子または遺伝子クラスターの欠失の際に見込まれる断片サイズにより点検した。この際、使用したプライマーｄｅｌ－ｃｇ１２２６－ｓ／ｄｅｌ－ｃｇ１２２６－ａｓは、染色体中の欠失ＤＮＡ領域外部に、および増幅フランキング遺伝子領域外部にも結合するように選択した。
使用したプライマー
ｕｐ－ｃｇ１２２６－ｓ：ＣＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＴＣＣＧＣＡＧ
ｕｐ－ｃｇ１２２６－ａｓ：ＴＧＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＡＴＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＴＴＣＡＴＧ
ｄｏｗｎ－ｃｇ１２２６－ｓ：ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＣＡＣＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣ
ｄｏｗｎ－ｃｇ１２２６－ａｓ：ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＴＧＣＴＡＣＴＧＣ
ｄｅｌ－ｃｇ０１２２６－ｓ：ＴＡＡＡＴＧＧＴＧＧＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣ
ｄｅｌ－ｃｇ１２２６－ａｓ：ＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＴＧＴＴＣＧＣＧＡＴＣ
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
ｕｐ－ｃｇ１２２６－ｓ：ＣＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＴＣＣＧＣＡＧ
ｕｐ－ｃｇ１２２６－ａｓ：ＴＧＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＡＴＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＴＴＣＡＴＧ
ｄｏｗｎ－ｃｇ１２２６－ｓ：ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＣＡＣＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣ
ｄｏｗｎ－ｃｇ１２２６－ａｓ：ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＴＧＣＴＡＣＴＧＣ
ｄｅｌ－ｃｇ０１２２６－ｓ：ＴＡＡＡＴＧＧＴＧＧＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣ
ｄｅｌ－ｃｇ１２２６－ａｓ：ＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＴＧＴＴＣＧＣＧＡＴＣ
ｕｎｉｖ：ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ｒｓｐ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
コリネ型細菌細胞中での異種遺伝子のコドン最適化
合成生合成経路、例えば、植物由来のポリフェノールまたはポリケチドの合成のコリネ型細菌細胞中での確立は、必要な植物遺伝子の異種発現を要する。様々な種は、普遍的遺伝暗号のバリアントを異なる頻度で使用することが公知であり、それは、最終的には、細胞内の異なるｔＲＮＡ濃度に起因する。この場合、コドン使用頻度（英語でＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ）に関する。めったに使用されないコドンは翻訳を減速させ得るのに対して、より頻繁に利用されるコドンは翻訳を加速させ得る。このため、異種遺伝子は、標的生物に特異的なコドン使用頻度を用いて合成されることになる。このためには、標的異種タンパク質のアミノ酸配列を、特異的コドン使用頻度を有するＤＮＡ配列へと書き換える。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに関しては、コドン使用頻度についてのデータベースが、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝１９６６２７＆ａａ＝１＆ｓｔｙｌｅ＝Ｎから提供される。
合成生合成経路、例えば、植物由来のポリフェノールまたはポリケチドの合成のコリネ型細菌細胞中での確立は、必要な植物遺伝子の異種発現を要する。様々な種は、普遍的遺伝暗号のバリアントを異なる頻度で使用することが公知であり、それは、最終的には、細胞内の異なるｔＲＮＡ濃度に起因する。この場合、コドン使用頻度（英語でＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ）に関する。めったに使用されないコドンは翻訳を減速させ得るのに対して、より頻繁に利用されるコドンは翻訳を加速させ得る。このため、異種遺伝子は、標的生物に特異的なコドン使用頻度を用いて合成されることになる。このためには、標的異種タンパク質のアミノ酸配列を、特異的コドン使用頻度を有するＤＮＡ配列へと書き換える。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに関しては、コドン使用頻度についてのデータベースが、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝１９６６２７＆ａａ＝１＆ｓｔｙｌｅ＝Ｎから提供される。
コリネ型細菌細胞中での遺伝子ａｒｏＨおよびｔａｌの発現
プラスミドｐＥＫＥｘ３－ａｒｏＨＥｃ－ｔａｌＦｊの構築
ポリフェノール前駆体ｐ－クマル酸の補充なしにコリネ型細菌中で植物性ポリフェノール類の合成を行うため、すなわちグルコースからの植物性ポリフェノールの合成には、さらなる２つの遺伝子が必要である（Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ等、２０１６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１６．０６．００３）。これらは、フィードバック耐性３－デオキシ－Ｄ－アラビノヘプツロソネート－７－ホスフェート合成酵素（ａｒｏＨ）、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ由来（ａｒｏＨＥｃ）、およびチロシンアンモニウムリアーゼ（ｔａｌ）、好ましくはフラボバクテリウム・ジョンソニエ由来（ｔａｌＦｊ）をコードする遺伝子である。
プラスミドｐＥＫＥｘ３－ａｒｏＨＥｃ－ｔａｌＦｊの構築
ポリフェノール前駆体ｐ－クマル酸の補充なしにコリネ型細菌中で植物性ポリフェノール類の合成を行うため、すなわちグルコースからの植物性ポリフェノールの合成には、さらなる２つの遺伝子が必要である（Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ等、２０１６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１６．０６．００３）。これらは、フィードバック耐性３－デオキシ－Ｄ－アラビノヘプツロソネート－７－ホスフェート合成酵素（ａｒｏＨ）、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ由来（ａｒｏＨＥｃ）、およびチロシンアンモニウムリアーゼ（ｔａｌ）、好ましくはフラボバクテリウム・ジョンソニエ由来（ｔａｌＦｊ）をコードする遺伝子である。
プラスミドｐＥＫＥｘ３－ａｒｏＨＥｃ－ｔａｌＦｊ（図１７）の構築には次の手順に従う：
Ｅ．ｃｏｌｉ由来の遺伝子ａｒｏＨ（ａｒｏＨＥｃ）およびフラボバクテリウム・ジョンソニエ由来のｔａｌ遺伝子のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用にコドン最適化されたバリアント（ｔａｌＦｊＣｇ）遺伝子の発現用のプラスミドｐＥＫＥｘ３－ａｒｏＨＥｃ－ｔａｌＦｊＣｇの構築には、両方の遺伝子をＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲによるａｒｏＨＥｃ増幅には、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡを単離し、ａｒｏＨＥｃ遺伝子に特異的であるプライマー対ａｒｏＨＥｃ－ｓ／ａｒｏＨＥｃ－ａｓを用いて増幅する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用にコドン最適化されたｔａｌＦｊＣｇ遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片として化学合成し、プライマー対ｔａｌＦｊ－ｓ／ｔａｌＦｊ－ａｓによるｔａｌＦｊＣｇ増幅用のＤＮＡ鋳型として使用する。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行う。プラスミドｐＥＫＥｘ３－ａｒｏＨＥｃ－ｔａｌＦｊＣｇの構築には、プラスミドｐＥＫＥｘ３をＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで線状化する。指定のプライマー対を用いて増幅した遺伝子ａｒｏＨＥｃまたはｔａｌＦｊＣｇを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｐＩまたはＳａｐＩおよびＥｃｏＲＩで加水分解する。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製する。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、両方のインサートａｒｏＨＥｃおよびｔａｌＦｊＣｇを、線状化したベクターバックボーンｐＥＫＥｘ３に対して３倍のモル過剰で使用する。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用する。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させる。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での、使用した断片の正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検する。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用する。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になる。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＥＫＥｘ３ベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｃｈｋ＿ｐＥＫＥｘ３＿ｓ／ｃｈｋ＿ｐＥＫＥｘ３＿ａｓを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検する。それらのＰＣＲ産物がプラスミドｐＥＫＥｘ３－ａｒｏＨＥｃ－ｔａｌＦｊＣｇの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、スぺクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスする。プラスミドは図１に示す。
使用したプライマー：
ａｒｏＨＥｃ－ｓ：ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＴＡＴＣＡＴＧＡＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＡＣＴＣＣＧＴＡＣＴＧＣＧＣＧＴＡＴＴＧ
ａｒｏＨＥｃ－ａｓ：ＴＡＣＧＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＣＧＧＧＴＡＴＣＴＡＣＣＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＧ
ｔａｌＦｊ－ｓ：ＴＴＣＧＣＴＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＧＴＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＡＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧ
ｔａｌＦｊ－ａｓ：ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＴＴＧＡＴＣＡＧＧＴＧＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＡＣ
ｃｈｋ＿ｐＥＫＥｘ３＿ｓ：ＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣ
ｃｈｋ＿ｐＥＫＥｘ３＿ａｓ：ＣＧＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣ
ａｒｏＨＥｃ－ｓ：ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＴＡＴＣＡＴＧＡＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＡＣＴＣＣＧＴＡＣＴＧＣＧＣＧＴＡＴＴＧ
ａｒｏＨＥｃ－ａｓ：ＴＡＣＧＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＣＧＧＧＴＡＴＣＴＡＣＣＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＧ
ｔａｌＦｊ－ｓ：ＴＴＣＧＣＴＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＧＴＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＡＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧ
ｔａｌＦｊ－ａｓ：ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＴＴＧＡＴＣＡＧＧＴＧＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＡＣ
ｃｈｋ＿ｐＥＫＥｘ３＿ｓ：ＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣ
ｃｈｋ＿ｐＥＫＥｘ３＿ａｓ：ＣＧＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣ
コリネ型細菌細胞中での、ポリフェノールまたはポリケチドを合成するための異種遺伝子の発現
ｐＭＫＥｘ２＿ｓｔｓＡｈ＿４ｃｌＰｃの構築
アラキス・ヒポゲア由来の遺伝子ｓｔｓ（ｓｔｓＡｈ）およびペトロセリナム・クリスプム由来の遺伝子４ｃｌ（４ｃｌＰｃ）の発現用のプラスミドｐＭＫＥｘ２＿ｓｔｓＡｈ＿４ｃｌＰｃ（図１８）の構築には、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用にコドン最適化された遺伝子バリアントとしての両方の遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片として化学合成し、ＰＣＲによる増幅用のＤＮＡ鋳型として使用した。遺伝子ｓｔｓＡｈおよび４ｃｌＰｃを、ＰＣＲにより、それぞれの遺伝子に特異的であるプライマー対ｓｔｓＡｈ－ｓ／ｓｔｓＡｈ－ａｓまたは４ｃｌＰｃ－ｓ／４ｃｌＰｃ－ａｓを用いて増幅した。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行った。プラスミドｐＭＫＥｘ２＿ｓｔｓＡｈ＿４ｃｌＰｃの構築には、プラスミドｐＭＫＥｘ２をＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで線状化した。指定のプライマー対を用いて増幅した遺伝子ｓｔｓＡｈおよび４ｃｌＰｃを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩまたはＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで加水分解した。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、両方のインサートｓｔｓＡｈおよび４ｃｌＰｃを、線状化したベクターバックボーンｐＭＫＥｘ２に対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での、使用した断片の正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＭＫＥｘ２ベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２＿ｓ／ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２＿ａｓを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物がプラスミドｐＭＫＥｘ２＿ｓｔｓＡｈ＿４ｃｌＰｃの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
ｐＭＫＥｘ２＿ｓｔｓＡｈ＿４ｃｌＰｃの構築
アラキス・ヒポゲア由来の遺伝子ｓｔｓ（ｓｔｓＡｈ）およびペトロセリナム・クリスプム由来の遺伝子４ｃｌ（４ｃｌＰｃ）の発現用のプラスミドｐＭＫＥｘ２＿ｓｔｓＡｈ＿４ｃｌＰｃ（図１８）の構築には、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用にコドン最適化された遺伝子バリアントとしての両方の遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片として化学合成し、ＰＣＲによる増幅用のＤＮＡ鋳型として使用した。遺伝子ｓｔｓＡｈおよび４ｃｌＰｃを、ＰＣＲにより、それぞれの遺伝子に特異的であるプライマー対ｓｔｓＡｈ－ｓ／ｓｔｓＡｈ－ａｓまたは４ｃｌＰｃ－ｓ／４ｃｌＰｃ－ａｓを用いて増幅した。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行った。プラスミドｐＭＫＥｘ２＿ｓｔｓＡｈ＿４ｃｌＰｃの構築には、プラスミドｐＭＫＥｘ２をＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで線状化した。指定のプライマー対を用いて増幅した遺伝子ｓｔｓＡｈおよび４ｃｌＰｃを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩまたはＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで加水分解した。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、両方のインサートｓｔｓＡｈおよび４ｃｌＰｃを、線状化したベクターバックボーンｐＭＫＥｘ２に対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での、使用した断片の正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＭＫＥｘ２ベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２＿ｓ／ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２＿ａｓを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物がプラスミドｐＭＫＥｘ２＿ｓｔｓＡｈ＿４ｃｌＰｃの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
使用したプライマー
ｓｔｓＡｈ－ｓ：ＡＴＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＡＴＣ
ｓｔｓＡｈ－ａｓ：ＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣ
４ｃｌＰｃ－ｓ：ＡＧＣＧＧＴＡＣＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＴＴＧＣＧＴＧＧＣＡＣ
４ｃｌＰｃ－ａｓ：ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＴＡＣＴＡＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣ
ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２－ｓ：ＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣ
ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２－ａｓ：ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣ
ｓｔｓＡｈ－ｓ：ＡＴＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＡＴＣ
ｓｔｓＡｈ－ａｓ：ＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣ
４ｃｌＰｃ－ｓ：ＡＧＣＧＧＴＡＣＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＡＴＴＧＣＧＴＧＧＣＡＣ
４ｃｌＰｃ－ａｓ：ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＴＡＣＴＡＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣ
ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２－ｓ：ＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣ
ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２－ａｓ：ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣ
ｐＭＫＥＸ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈの構築
ペチュニア・ヒブリダ由来の遺伝子ｃｈｓおよびｃｈｉ（ｃｈｓＰｈおよびｃｈｉＰｈ）の発現用のプラスミドｐＭＫＥＸ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈ（図１９）の構築には、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用にコドン最適化された遺伝子バリアントとしての両方の遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片として化学合成し、ＰＣＲによる増幅用のＤＮＡ鋳型として使用した。ｃｈｓＰｈおよびｃｈｉＰｈを、ＰＣＲにより、それぞれの遺伝子に特異的であるプライマー対ｃｈｓＰｈ－ｓ／ｃｈｓＰｈ－ａｓまたはｃｈｉＰｈ－ｓ／ｃｈｉＰｈ－ａｓを用いて増幅した。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行った。プラスミドｐＭＫＥＸ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈの構築には、プラスミドｐＭＫＥｘ２をＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで線状化した。指定のプライマー対を用いて増幅した遺伝子ｃｈｓＰｈおよびｃｈｉＰｈを、制限酵素ＸｂａＩおよびＮｃｏＩまたはＮｃｏＩおよびＢａｍＩで加水分解した。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、両方のインサートｃｈｓＰｈおよびｃｈｉＰｈを、線状化したベクターバックボーンｐＭＫＥｘ２に対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での、使用した断片の正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＭＫＥｘ２ベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２＿ｓ／ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２＿ａｓを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物がプラスミドｐＭＫＥｘ２－ｃｈｓＰｈおよびｃｈｉＰｈの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
ペチュニア・ヒブリダ由来の遺伝子ｃｈｓおよびｃｈｉ（ｃｈｓＰｈおよびｃｈｉＰｈ）の発現用のプラスミドｐＭＫＥＸ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈ（図１９）の構築には、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用にコドン最適化された遺伝子バリアントとしての両方の遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片として化学合成し、ＰＣＲによる増幅用のＤＮＡ鋳型として使用した。ｃｈｓＰｈおよびｃｈｉＰｈを、ＰＣＲにより、それぞれの遺伝子に特異的であるプライマー対ｃｈｓＰｈ－ｓ／ｃｈｓＰｈ－ａｓまたはｃｈｉＰｈ－ｓ／ｃｈｉＰｈ－ａｓを用いて増幅した。生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行った。プラスミドｐＭＫＥＸ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈの構築には、プラスミドｐＭＫＥｘ２をＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで線状化した。指定のプライマー対を用いて増幅した遺伝子ｃｈｓＰｈおよびｃｈｉＰｈを、制限酵素ＸｂａＩおよびＮｃｏＩまたはＮｃｏＩおよびＢａｍＩで加水分解した。前記断片の制限酵素反応混合液を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて精製した。Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による、加水分解したＤＮＡ断片のライゲーションには、両方のインサートｃｈｓＰｈおよびｃｈｉＰｈを、線状化したベクターバックボーンｐＭＫＥｘ２に対して３倍のモル過剰で使用した。断片のライゲーションを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での、使用した断片の正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＭＫＥｘ２ベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にライゲーションした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２＿ｓ／ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２＿ａｓを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物がプラスミドｐＭＫＥｘ２－ｃｈｓＰｈおよびｃｈｉＰｈの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
使用したプライマー
ｃｈｓＰｈ－ｓ：ＧＴＡＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＧ
ｃｈｓＰｈ－ａｓ：ＣＴＣＣＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＣＡＣＧＧＡＧＴＧＣＡＧＣＡＣ
ｃｈｉＰｈ－ｓ：ＣＴＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＣＣＡＣＣＡＧＴＧＴＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧ
ｃｈｉＰｈ－ａｓ：ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＧＣＣＧＡＴＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧＧＴＧ
ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２－ｓ：ＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣ
ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２－ａｓ：ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣ
ｃｈｓＰｈ－ｓ：ＧＴＡＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＧ
ｃｈｓＰｈ－ａｓ：ＣＴＣＣＣＡＴＧＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＣＡＣＧＧＡＧＴＧＣＡＧＣＡＣ
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ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２－ｓ：ＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣ
ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２－ａｓ：ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣ
コリネ型細菌細胞中での本発明によるポリケチド合成酵素ＰＣＳの発現
ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａおよびｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａ－ｓｈｏｒｔの構築
アロエ・アルボレセンス由来ｐｃｓ（ｐｃｓＡａ）の遺伝子バリアントの発現用のプラスミドｐＭＫＥｘ２＿ｐｃｓＡａ（図２０）およびｐＭＫＥｘ２＿ｐｃｓＡａ－ｓｈｏｒｔ（図２１）の構築には、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用にコドン最適化された遺伝子バリアントとしての該遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片として化学合成し、ＰＣＲによる増幅用のＤＮＡ鋳型として使用した。ｐｃｓＡａ遺伝子を、ＰＣＲにより、プライマー対Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ｓ／Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ａｓまたはＧｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ｓｈｏｒｔ－ｓ／Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ａｓを用いて増幅し、天然と同様に短縮ｐｃｓＡａ配列も生成した。
ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａおよびｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａ－ｓｈｏｒｔの構築
アロエ・アルボレセンス由来ｐｃｓ（ｐｃｓＡａ）の遺伝子バリアントの発現用のプラスミドｐＭＫＥｘ２＿ｐｃｓＡａ（図２０）およびｐＭＫＥｘ２＿ｐｃｓＡａ－ｓｈｏｒｔ（図２１）の構築には、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用にコドン最適化された遺伝子バリアントとしての該遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｓｔｒｉｎｇ ＤＮＡ断片として化学合成し、ＰＣＲによる増幅用のＤＮＡ鋳型として使用した。ｐｃｓＡａ遺伝子を、ＰＣＲにより、プライマー対Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ｓ／Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ａｓまたはＧｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ｓｈｏｒｔ－ｓ／Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ａｓを用いて増幅し、天然と同様に短縮ｐｃｓＡａ配列も生成した。
生成したＤＮＡ断片の見込まれる塩基対数の点検は、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動分析を利用して行い、続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いて添付のプロトコルに従い精製した。発現プラスミドの構築には、プラスミドｐＭＫＥｘ２－ｓｔｓＡｈ－４ｃｌＰｃをＦａｓｔＤｉｇｅｓｔバリアント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の制限酵素ＮｃｏＩおよびＳｃａＩで線状化した。その制限酵素反応混合液を、１％アガロースゲル上で分離した。ベクターバックボーンの見込まれる断片を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてゲルから精製した。ギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ等、２００９ａ）を利用した、ＤＮＡ断片のアセンブリングには、増幅断片のうちの各１つ（ｐｃｓＡａまたはｐｃｓＡａ－ｓｈｏｒｔ）を、線状化したベクターバックボーンｐＭＫＥｘ２に対して３倍のモル過剰で使用した。等温反応バッファの他にアセンブリングに必要な酵素（Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ ＤＮＡリガーゼ）を含有する調製済みギブソン・アセンブリ・マスターミックスをＤＮＡ断片に加えた。断片のアセンブリングは、サーモサイクラー中、５０℃において６０分間行う。断片のアセンブリングを行った後、混合液全量を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α化学コンピテントセルの、４２℃における９０秒間のヒートショックによる形質転換に使用した。ヒートショックに続いて、細胞は氷上で９０秒間回復させてから、ＬＢ培地８００μＬを加えて、３７℃のサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク）中において、９００ＲＰＭで６０分間回復させた。続いて、細胞懸濁液１００μＬを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。増殖した形質転換体中での発現プラスミドの正確なアセンブリングは、コロニーＰＣＲを利用して点検した。このためには、２ｘＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、ウォルサム、ＭＡ、米国）を使用した。この際、ＤＮＡ鋳型は、増殖したコロニーの細胞を添加することでＰＣＲ混合液に混合した。ＰＣＲプロトコルの、９５℃における３分間の最初の熱変性ステップにより、細胞が溶解するため、ＤＮＡ鋳型が放出され、ＤＮＡポリメラーゼが接近可能になった。コロニーＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとしては、ｐＭＫＥｘ２ベクターバックボーンに特異的に結合し、使用した断片が正確にアセンブリングした場合には特定サイズのＰＣＲ産物を形成するプライマー対ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２＿ｓ／ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２＿ａｓを使用し、該ＰＣＲ産物はゲル電気泳動によって点検した。それらのＰＣＲ産物が発現プラスミドコンストラクションｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａおよびｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａ－ｓｈｏｒｔの正確なアセンブリングを示唆するクローンは、プラスミドを単離するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ（ＮｏＬｉｄ）－Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、デューレン）を用いてプラスミドを単離し、前記の増幅およびコロニーＰＣＲプライマーを用いてシーケンスした。
使用したプライマー：
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ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａ
Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ｓ：ＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＣＡＡＣ
Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ａｓ：ＣＣＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧ
ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａ－ｓｈｏｒｔ
Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ｓｈｏｒｔ－ｓ：ＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＧＣＡＧＧＧＣ
Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ａｓ：ＣＣＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧ
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ｃｈｋ＿ｐＭＫＥｘ２－ａｓ：ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣ
ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａ
Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ｓ：ＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＣＡＡＣ
Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ａｓ：ＣＣＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧ
ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａ－ｓｈｏｒｔ
Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ｓｈｏｒｔ－ｓ：ＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＧＣＡＧＧＧＣ
Ｇｉｂｓｏｎ－ＰＣＳ－ａｓ：ＣＣＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧ
培養条件
細胞内マロニルＣｏＡの供給またはナリンゲニン、ノルオイゲニンおよびレスベラトロールの合成を測定するためのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの培養はすべて、４％グルコース（ｗ／ｖ）を含むＣＧＸＩＩ合成培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ等、１９９３）５０ｍｌ中、ＪＲＣ－１－Ｔシェイキングインキュベータ（Ａｄｏｌｆ Ｋｕｅｈｎｅｒ ＡＧ、ビルスフェルデン、スイス）において行う（５００ｍｌバッフル付きフラスコ、３０℃、１３０ＲＰＭ）。適切であれば、前記の濃度の選択用抗生物質を添加する：
細胞内マロニルＣｏＡの供給またはナリンゲニン、ノルオイゲニンおよびレスベラトロールの合成を測定するためのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの培養はすべて、４％グルコース（ｗ／ｖ）を含むＣＧＸＩＩ合成培地（Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ等、１９９３）５０ｍｌ中、ＪＲＣ－１－Ｔシェイキングインキュベータ（Ａｄｏｌｆ Ｋｕｅｈｎｅｒ ＡＧ、ビルスフェルデン、スイス）において行う（５００ｍｌバッフル付きフラスコ、３０℃、１３０ＲＰＭ）。適切であれば、前記の濃度の選択用抗生物質を添加する：
ＣＧＸＩＩ培地中での培養には、株をまず６～８時間、試験管内のＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、米国）５ｍｌ中、１７０ＲＰＭでインキュベートし（第１の前培養）、続いて５００ｍｌバッフル付きフラスコ（向き合う２つのバッフル付き）中のＣＧＸＩＩ培地５０ｍｌに植え付けるために利用する。この第２の前培養を、３０℃および１３０ＲＰＭで一晩インキュベートする。過剰に増殖した（ｂｅｗａｃｈｓｅｎ）第２の前培養を、ＣＧＸＩＩ本培養（５００ｍｌバッフル付きフラスコ中の５０ｍｌ）に、ＯＤ６００ｎｍ１．０（マロニルＣｏＡ測定）または５．０（ナリンゲニン、レスベラトロールまたはノルオイゲニンの産生）で植え付ける。任意選択的に、ナリンゲニンおよびレスベラトロールの合成には、５ｍＭ ｐ－クマル酸（前もってＤＭＳＯ８０μｌ中に溶解）を付加的に補充する。染色体に組み込まれているか、またはプラスミドベースで導入されているかのいずれか一方である異種遺伝子の発現を、植付けから９０分後に、１ｍＭ イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導する。指定の時点に、培養１ｍｌを取り出し、使用まで－２０℃で保管する。生成物定量（マロニルＣｏＡまたはポリフェノールもしくはポリケチド）は、下記のように行う。発酵の終わりごろに、レスベラトロールまたはナリンゲニンもしくはノルオイゲニンを、培養溶液から任意選択的にさらに処理、すなわち分離、精製および／または濃縮してもよい。
マロニルＣｏＡ供給またはポリフェノールもしくはポリケチドの産生を測定するための培養中のバイオマスの定量は、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３３００ ｐｒｏ ＵＶ／Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フライブルク）を用いた６００ｎｍの波長での光学濃度（ＯＤ６００ｎｍ）の測定により行う。このためには、対応する培養の試料体積１００μＬを採取し、測定したＯＤ６００ｎｍが、０．２～０．６の、光度計の線形測定範囲に入るように希釈する。希釈率の分だけ補正することにより、培養の実際のＯＤ６００ｎｍを計算する。＞１：１０（例えば１：１００）のより高い希釈率をピペッティングする場合はこれを順次行う（例：１：１００希釈の場合は２回、１：１０希釈した）。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用したマロニルＣｏＡ定量化
細胞内マロニルＣｏＡレベルを定量するための試料調製は、前記のように行った（Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ等、２０１６）。培養５ｍＬを、三つ組にして、氷冷の６０％ＭｅＯＨ（Ｈ２Ｏ中）１５ｍＬ中でクエンチングしてから遠心分離する。マロニルＣｏＡ濃度の測定は、細胞抽出物中および培養上清中で行う。クエンチング後に得られた上清中で分析を付加的に行う。培養の上清試料の場合、およびクエンチング後は、０．２μｍ酢酸セルロースフィルタを介してろ過する。培養上清の２５０μＬを６０％ＭｅＯＨ７５０μＬで希釈し、クエンチング上清は、無希釈で使用する。
細胞内マロニルＣｏＡレベルを定量するための試料調製は、前記のように行った（Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ等、２０１６）。培養５ｍＬを、三つ組にして、氷冷の６０％ＭｅＯＨ（Ｈ２Ｏ中）１５ｍＬ中でクエンチングしてから遠心分離する。マロニルＣｏＡ濃度の測定は、細胞抽出物中および培養上清中で行う。クエンチング後に得られた上清中で分析を付加的に行う。培養の上清試料の場合、およびクエンチング後は、０．２μｍ酢酸セルロースフィルタを介してろ過する。培養上清の２５０μＬを６０％ＭｅＯＨ７５０μＬで希釈し、クエンチング上清は、無希釈で使用する。
得られた試料（細胞抽出物、培養上清およびクエンチング上清）中でのマロニルＣｏＡ濃度の定量化は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ヴァルトブロン、ドイツ）を使用して、４０℃において、粒径５μｍの１５０ｘ２．１ｍｍ Ｓｅｑｕａｎｔ ＺＩＣ－ｐＨＩＬＩＣカラムおよび２０ｘ２．１ｍｍプレカラム（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）を用いて行う。分離は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ９．２）（バッファＡ）およびアセトニトリル（バッファＢ）を用いて行う。各注入前に、カラムを１５分間、９０％バッファＢで平衡化した。分離には、以下のグラジエントを使用する（注入量は５μＬ）：０分：９０％Ｂ、１分：９０％Ｂ、１０分：７０％Ｂ、２５分：６５％Ｂ、３５分：１０％Ｂ、４５分：１０％Ｂ、５５分：１０％Ｂ。測定は、ＥＳＩ－ＱｑＴＯＦ－ＭＳ（ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ６６００、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ、ダルムシュタット、ドイツ）により、ＩｏｎＤｒｉｖｅイオン源を用いて行う。データ分析には、Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ａｎａｌｙｓｔ ＴＦ１．７（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ、コンコード、ＯＮ、カナダ）を使用する。
参照として、およそ１２．５μＭの濃度を得るために１３Ｃ３標識マロニルＣｏＡを加えた、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来の完全１３Ｃ標識細胞抽出物の定量を行う（遊離酸の分子量をベースとする見積もり）。１３Ｃ３標識マロニルＣｏＡは、チオエステルの自然加水分解によりおそらく生じる［Ｕ－１３Ｃ３］マロネートを不純物として含有した（データは示さず）。この１３Ｃ３標識マロニルＣｏＡをマロネート定量用の内部標準として利用し、試料に、同一体積の内部標準溶液を加えた。外部標準系列としては、５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ中の０．０１～１００μＭの濃度のマロネート標準を使用する。相応に、別個のマロニルＣｏＡ用外部標準系列を調合した。
マロニルＣｏＡ（８５２．１＞７９）およびマロネート（Ｍａｌｏｎａｔ）（１０３＞５９）の最大の遷移用の最適衝突エネルギーとして、－１３０ｅＶまたは－１１ｅＶを使用する。これらの最適衝突エネルギーは、代謝物標準を利用して算出する。溶出の最中、最適衝突エネルギーを用いたＭＳ／ＭＳ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｍｏｄｅでの測定には、前記の遷移および内部標準の遷移（８５５．１＞７９または１０６＞６１）を使用した。
両代謝物の定量には、１２Ｃ、１３Ｃ同位体比を利用した。検量線は、同位体比および標準濃度の直線回帰を利用して算出した。ダイナミックレンジを算出するために、最高濃度の測定信号を除去したため、Ｒ２は０．９９超であった。次いで、低い方の濃度を均等に加重するために、減らした）そのデータセットをｌｏｇ１０変換した。ｌｏｇ１０変換した値では、最低濃度用の測定信号を捨てたため、Ｒ２は０．９９超であった。
本発明によるコリネ型細菌細胞を用いると、例示的に、以下のマロネート（マロニルＣｏＡ）力価が測定される（図２４）。野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２またはその誘導体である原型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇは、標準条件下、０．５０８μＭのマロネート力価を有する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｅ６２２Ｋ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ１３６１Ｄ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ２１５３ＥおよびＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ２６６８Ｓは、１．１４８μＭ、０．６５８μＭ、０．６９４または０．４８４μＭのマロネート力価を有する。ｆａｓＢ欠失株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ΔｆａｓＢは、１．９０９μＭマロネートにすら達する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７を用いると、０．７４１μＭマロネートに達する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７ ｍｕｆａｓＯまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７ ｍｕｆａｓＯ ΔｆａｓＢは、２．２６１μＭマロネートまたは３．６４５μＭマロネートの力価を有する。
酢酸エチル抽出およびＬＣ－ＭＳ測定を利用したポリフェノール／ポリケチド定量化
生成物ナリンゲニン、ノルオイゲニンおよびレスベラトロールの抽出は、前記のように行う（Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ等、２０１６）。培養中に採取した試料を解凍し、酢酸エチル１ｍｌを加え、１，４００ＲＰＭおよび２０℃において１０分間、エッペンドルフサーモミキサー（ハンブルク、ドイツ）中でインキュベートした。続いて懸濁液を１６，０００ｇで５分間遠心分離した。酢酸エチル相から８００μｌを、溶媒耐性の２ｍｌ Ｄｅｅｐ－Ｗｅｌｌプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク、ドイツ）に移した。一晩、溶媒を蒸発させた後、乾燥抽出物を、アセトニトリル８００μｌ中に再懸濁し、ＬＣ－ＭＳ分析に直接使用した。
生成物ナリンゲニン、ノルオイゲニンおよびレスベラトロールの抽出は、前記のように行う（Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ等、２０１６）。培養中に採取した試料を解凍し、酢酸エチル１ｍｌを加え、１，４００ＲＰＭおよび２０℃において１０分間、エッペンドルフサーモミキサー（ハンブルク、ドイツ）中でインキュベートした。続いて懸濁液を１６，０００ｇで５分間遠心分離した。酢酸エチル相から８００μｌを、溶媒耐性の２ｍｌ Ｄｅｅｐ－Ｗｅｌｌプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク、ドイツ）に移した。一晩、溶媒を蒸発させた後、乾燥抽出物を、アセトニトリル８００μｌ中に再懸濁し、ＬＣ－ＭＳ分析に直接使用した。
抽出物中のそれぞれの生成物のＬＣ－ＭＳ分析は、前記のように、６１３０ 四重極ＬＣ－ＭＳシステムと連結した超高速液体クロマトグラフィー１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、ヴァルトブロン、ドイツ）を用いて行った（Ｋａｌｌｓｃｈｅｕｅｒ等、２０１６）。クロマトグラフィー分離には、細孔径１００ÅのＫｉｎｅｔｅｘ １．７μｍ Ｃ１８カラム（５０ｍｍｘ２．１ｍｍ［内径］；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トーランス、ＣＡ、米国）を５０℃で使用した。移動相として、０．１％酢酸（相Ａ）およびアセトニトリル＋０．１％酢酸（相Ｂ）を０．５ｍｌ／分の流速で使用した。グラジエント溶出が続き、その際、相Ｂの割合を段階的に増加させた：０～６分：１０～３０％、６～７分：３０～５０％、７～８分：５０～１００％、８～８．５分：１００～１０％。マススぺクトロメータは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ネガティブモードで行い、データ収集はＳｅｌｅｃｔｅｄ－Ｉｏｎ－Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇモード（ＳＩＭ）で行った。定量には、アセトニトリル中の異なる濃度の純生成物標準を調合した。［Ｍ－Ｈ］用の測定面積－－質量信号（ナリンゲニンの場合ｍ／ｚ ２７１、ノルオイゲニンの場合ｍ／ｚ １９１、レスベラトロールの場合ｍ／ｚ ２２７）は、２５０ｍｇ／ｌまでの濃度に対して線形であった。内部標準としてベンゾエートを使用した（最終濃度１００ｍｇ／ｌ、ベンゾエートの場合ｍ／ｚ １２１）。検量線は、内部標準に対する分析物の測定面積の比率をベースとして計算した。
本発明によるコリネ型細菌細胞を用いると、それぞれ標準条件下、グルコースまたはｐ－クマル酸を補充したグルコース上での増殖時に、以下のポリフェノールまたはポリケチド力価が測定される。野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２またはその誘導体である原型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｐＭＫＥｘ２－ｓｔｓＡｈ－４ｃｌＰｃは、標準条件下、８ｍｇ／Ｌまたは１２ｍｇ／Ｌのレスベラトロール力価を有する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｅ６２２Ｋ ｐＭＫＥｘ２－ｓｔｓＡｈ－４ｃｌＰｃ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ１３６１Ｄ ｐＭＫＥｘ２－ｓｔｓＡｈ－４ｃｌＰｃ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ２１５３Ｅ ｐＭＫＥｘ２－ｓｔｓＡｈ－４ｃｌＰｃおよびＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ２６６８Ｓ ｐＭＫＥｘ２－ｓｔｓＡｈ－４ｃｌＰｃは、レスベラトロール９ｍｇ／Ｌまたは２８．９０ｍｇ／Ｌ、８．３７ｍｇ／Ｌまたは１８．２０ｍｇ／Ｌ、８．４９ｍｇ／Ｌまたは２０．３０ｍｇ／Ｌおよび７．８９ｍｇ／Ｌまたは１１．７０ｍｇ／Ｌのレスベラトロール力価を有する。ｆａｓＢ欠失株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ΔｆａｓＢ ｐＭＫＥｘ２－ｓｔｓＡｈ－４ｃｌＰｃは、レスベラトロール９．４９ｍｇ／Ｌまたは３７ｍｇ／Ｌにすら達する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７ ｐＭＫＥｘ２－ｓｔｓＡｈ－４ｃｌＰｃを用いると、レスベラトロール１４ｍｇ／Ｌまたは１１３ｍｇ／Ｌに達する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ ｐＭＫＥｘ２－ｓｔｓＡｈ－４ｃｌＰｃまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ－ΔｆａｓＢ ｐＭＫＥｘ２－ｓｔｓＡｈ－４ｃｌＰｃは、レスベラトロール２２．８５ｍｇ／Ｌまたは２６２ｍｇ／Ｌならびにレスベラトロール２２．７３ｍｇ／Ｌおよび２６０ｍｇ／Ｌの力価を有する。
ナリンゲニン産生に関しては、本発明によるコリネ型細菌細胞は、それぞれ標準条件下、グルコースまたはｐ－クマル酸を補充したグルコース上での増殖時に以下の力価を有する。野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２またはその誘導体である原型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｐＭＫＥｘ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈは、標準条件下、１ｍｇ／Ｌまたは２．１ｍｇ／Ｌのナリンゲニン力価を有する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｅ６２２Ｋ ｐＭＫＥｘ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ１３６１Ｄ ｐＭＫＥｘ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ２１５３Ｅ ｐＭＫＥｘ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈおよびＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ２６６８Ｓ ｐＭＫＥｘ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈは、ナリンゲニン１．７８ｍｇ／Ｌまたは７．１１ｍｇ／Ｌ、１．３２ｍｇ／Ｌまたは４．５４ｍｇ／Ｌ、１．５５ｍｇ／Ｌまたは５．０８ｍｇ／Ｌおよび１．１６ｍｇ／Ｌまたは２．８４ｍｇ／Ｌのナリンゲニン力価を有する。ｆａｓＢ欠失株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ΔｆａｓＢ ｐＭＫＥｘ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈは、ナリンゲニン２．１５ｍｇ／Ｌまたは９．６１ｍｇ／Ｌにすら達する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７ ｐＭＫＥｘ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈを用いると、ナリンゲニン３．５ｍｇ／Ｌまたは１８．５ｍｇ／Ｌに達する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ ｐＭＫＥｘ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ－ΔｆａｓＢ ｐＭＫＥｘ２－ｃｈｓＰｈ－ｃｈｉＰｈは、ナリンゲニン１０．５９ｍｇ／Ｌまたは６５ｍｇ／Ｌならびにナリンゲニン９．８３ｍｇ／Ｌおよび６０ｍｇ／Ｌの力価を有する。
本発明によるコリネ型細菌細胞は、標準条件下、グルコース上での増殖時に以下のノルオイゲニン力価を有する。野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａＣｇ－ｓｈｏｒｔまたはその誘導体である原型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａＣｇ－ｓｈｏｒｔに関しては、ノルオイゲニン（０．００２ｍｇ／Ｌ）を検出できなかった。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｅ６２２Ｋ ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａＣｇ－ｓｈｏｒｔ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ１３６１Ｄ ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａＣｇ－ｓｈｏｒｔ、ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ２１５３Ｅ ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａＣｇ－ｓｈｏｒｔおよびＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ ｆａｓＢ－Ｇ２６６８Ｓ ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａＣｇ－ｓｈｏｒｔは、ノルオイゲニン０．００４ｍｇ／Ｌ、０．００３ｍｇ／Ｌ、０．００３ｍｇ／Ｌおよび０．００３ｍｇ／Ｌのノルオイゲニン力価を有する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７ ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａＣｇ－ｓｈｏｒｔを用いると、ノルオイゲニン０．８６ｍｇ／Ｌが測定される。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａＣｇ－ｓｈｏｒｔは、ノルオイゲニン４．４ｍｇ／Ｌの力価を有する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＤｅｌＡｒｏ４－４ｃｌＰｃＣｇ－Ｃ７－ｍｕｆａｓＯ－ΔｆａｓＢ ｐＭＫＥｘ２－ｐｃｓＡａＣｇ－ｓｈｏｒｔは、ノルオイゲニン４．５１ｍｇ／Ｌの力価を有する。
Claims (35)
- ｆａｓＢ、ｇｌｔＡ、ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１を含む群から選択される遺伝子の調節および／もしくは発現、ならびに／またはそれらによってコードされる酵素の機能性が、狙いを定めて改変されていることを特徴とする、その原型と比べてマロニルＣｏＡの供給が増加しているコリネ型細菌細胞。
- ａ）脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性、
ｂ）脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢの突然変異または部分的もしくは完全な欠失、
ｃ）シトレート合成酵素遺伝子ｇｔｌＡと作動可能に連結されたプロモーターの低下した機能性、
ｄ）シトレート合成酵素ＣＳをコードする遺伝子ｇｌｔＡの低下した発現、
ｅ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域における調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の低下または消失した機能性、
ｆ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の抑制解除された発現、
ｇ）ａ）～ｆ）からの１つまたは複数の組み合わせ
を含む群から選択される１つまたは複数の狙いを定めた改変を有することを特徴とする、請求項１に記載のコリネ型細菌細胞。 - 脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの機能性が低下または消失している、および／あるいは脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢが、好ましくは１つもしくは複数のヌクレオチド置換により、狙いを定めて突然変異しているか、または部分的もしくは完全に欠失していることを特徴とする、請求項１または２に記載のコリネ型細菌細胞。
- シトレート合成酵素をコードする遺伝子ｇｌｔＡの発現が、作動可能に連結されたプロモーターの突然変異により、好ましくは複数のヌクレオチド置換により、低下していることを特徴とする、請求項１または２に記載のコリネ型細菌細胞。
- アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域における調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の機能性が、好ましくは１つまたは複数のヌクレオチド置換により、低下または消失しており、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の発現が抑制解除されている、好ましくは増強している、ことを特徴とする、請求項１または２に記載のコリネ型細菌細胞。
- シトレート合成酵素（ＣＳ）の低下した発現および／または活性、ならびにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）の調節解除され、増強された発現および／または活性からなる組み合わせを有することを特徴とする、請求項１～５のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- シトレート合成酵素（ＣＳ）の低下した発現および／または活性、ならびにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット（ＡｃｃＢＣおよびＡｃｃＤ１）の調節解除され、増強された発現および／または活性、ならびに脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性からなる組み合わせを有することを特徴とする、請求項１～６のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- コリネ型細菌におけるマロニルＣｏＡの供給を増加させるための、機能性が低下または消失している、コリネ型細菌から単離された脂肪酸合成酵素ＦａｓＢを有するタンパク質において、アミノ酸配列が、配列番号２、４、６、８および１０を含む群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有することを特徴とする、タンパク質。
- コリネ型細菌におけるマロニルＣｏＡの供給を増加させるための、
機能性が低下または消失している、コリネ型細菌由来の脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードする核酸配列であって、
ａ）配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列もしくはその断片に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列、
ｂ）ストリンジェントな条件下に配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列の相補的配列もしくはその断片とハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列もしくはその断片、または
ｄ）ａ）～ｃ）による核酸の各々に相応して、脂肪酸合成酵素ＦａｓＢをコードするが、遺伝暗号の縮重もしくは機能的中立突然変異により、ａ）～ｃ）によるこれらの核酸配列とは異なる核酸配列
を含む群から選択される、核酸配列。 - 請求項８に記載のタンパク質および／または請求項９に記載の核酸配列を有することを特徴とする、請求項１～７のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- ａ）配列番号２、４、６、８および１０を含む群から選択されるアミノ酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有する、脂肪酸合成酵素ＦａｓＢの低下または消失した機能性、
ｂ）配列番号１、３、５、７および９の群から選択される核酸配列またはその断片に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列を有する、脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子ｆａｓＢの突然変異または部分的もしくは完全な欠失、
ｃ）配列番号１１による、シトレート合成酵素遺伝子ｇｌｔＡと作動可能に連結されたプロモーターの低下した機能性、
ｄ）シトレート合成酵素（ＣＳ）をコードする遺伝子ｇｌｔＡの低下した発現、
ｅ）配列番号１３および１５による、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１のプロモーター領域における調節因子ＦａｓＲ用のオペレーター結合部位（ｆａｓＯ）の低下または消失した機能性、
ｆ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニットをコードする遺伝子ａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１の抑制解除された発現、
ｇ）ａ）～ｆ）からの１つまたは複数の組み合わせ
を含む群から選択される１つまたは複数の狙いを定めた改変を有することを特徴とする、請求項１～８および１０のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。 - 前記改変が染色体上にコードされて存在することを特徴とする、請求項１～８、１０および１１のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- 非組換え的（ｎｏｎ－ＧＭＯ）に変化していることを特徴とする、請求項１～８および１０～１２のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、特に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはブレビバクテリウム・ディバリカツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）を含む群から選択される、請求項１～８および１０～１３のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- フェニルプロパノイドおよび安息香酸誘導体を含む群から好ましくは選択される、芳香族成分の異化代謝経路が追加的に消失していることを特徴とする、ポリフェノールまたはポリケチドを産生するための、請求項１～８および１０～１４のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- 芳香族成分の異化代謝経路に関与する酵素の機能性および／もしくは活性またはそれらをコードする遺伝子の発現が、遺伝子クラスターｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）、ｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）、ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）ならびにｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）の欠失により消失していることを特徴とする、請求項１～８および１０～１５のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- 好ましくはＥ．ｃｏｌｉ由来の、フィードバック耐性３－デオキシ－Ｄ－アラビノヘプツロソネート－７－ホスフェート合成酵素（ａｒｏＨ）、および、好ましくはフラボバクテリウム・ジョンソニエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｅｒｔｉｕｍ ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）由来の、チロシンアンモニウムリアーゼ（ｔａｌ）をコードする遺伝子を有することを特徴とする、請求項１～８および１０～１６のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- ポリフェノール合成またはポリケチド合成用の、植物から誘導された酵素またはそれらをコードする遺伝子を追加的に有することを特徴とする、請求項１～８および１０～１７のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- コリネ型細菌においてポリケチドを合成するための、増強された５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質において、アミノ酸配列が、配列番号２２によるアミノ酸配列またはその断片もしくは対立遺伝子に対して少なくとも７０％の同一性を有することを特徴とする、タンパク質。
- コリネ型細菌においてポリケチドを産生するための、増強した活性を有する５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素をコードする核酸配列（ｐｃｓｓｈｏｒｔ）であって、
ａ）配列番号２１による核酸配列もしくはその断片に対して少なくとも７０％の同一性を含む核酸配列、
ｂ）ストリンジェントな条件下に配列番号２１による核酸配列の相補的配列もしくはその断片とハイブリダイズする核酸配列、
ｃ）配列番号２１による核酸配列もしくはその断片、または
ｄ）ａ）～ｃ）による核酸の各々に相応して、５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）をコードし、コリネ型細菌のコドン使用頻度に適合している核酸配列、または
ｅ）遺伝暗号の縮重もしくは機能的中立突然変異により、ａ）～ｄ）によるこれらの核酸配列とは異なる核酸配列
を含む群から選択される、核酸配列。 - 遺伝子４ｃｌ、ｓｔｓ、ｃｈｓ、ｃｈｉおよびｐｃｓを含む群から選択される、植物から誘導されたポリフェノール産生またはポリケチド産生用の遺伝子を有することを特徴とする、請求項１～８および１０～１８のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- 植物遺伝子が、誘導性プロモーターの発現制御下にあることを特徴とする、請求項１～８、１０～１８および２１のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- 誘導性プロモーターの発現制御下にある遺伝子４ｃｌＰｃを、染色体上にコードして有することを特徴とする、請求項１～８、１０～１９、２１および２２のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- 請求項１９に記載のタンパク質および／または請求項２０に記載の核酸配列を有することを特徴とする、請求項１～８、１０～１８および２１～２３のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- ａ）ポリフェノール、好ましくはスチルベン、特に好ましくはレスベラトロールの合成用の４ｃｌおよびｓｔｓ、または
ｂ）ポリフェノール、好ましくはフラボノイド、特に好ましくはナリンゲニンの合成用のｃｈｓおよびｃｈｉ、または
ｃ）ポリケチド、好ましくはノルオイゲニンの合成用のｐｃｓｓｈｏｒｔ
を含む群から選択される遺伝子を、誘導性プロモーターの制御下に有することを特徴とする、請求項１～８、１０～１８および２１～２４のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。 - ａ）マロニルＣｏＡの供給を増加させるために機能性および／もしくは発現が狙いを定めて改変されている、ｆａｓＢおよび／もしくはｇｌｔＡおよび／もしくはａｃｃＢＣおよびａｃｃＤ１またはそれらの組み合わせ、ならびに
ｂ）好ましくはフェニルプロパノイドもしくは安息香酸誘導体を含む群からの、芳香族成分を分解するための機能性が消失している、ｃｇ０３４４－４７（ｐｈｄＢＣＤＥオペロン）、ｃｇ２６２５－４０（ｃａｔ、ｂｅｎおよびｐｃａ）、ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）およびｃｇ０５０２（ｑｓｕＢ）、ならびに
ｃ）ポリケチド、好ましくはノルオイゲニンの合成用の、増強された５，７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン合成酵素活性（ＰＣＳｓｈｏｒｔ）を有するタンパク質をコードするｐｃｓｓｈｏｒｔ、または
ｄ）任意選択的に、グルコースから出発する、ポリフェノールの前駆体合成用のａｒｏＨおよびｔａｌ、ならびに
ｅ）ポリフェノール、好ましくはスチルベン、特に好ましくはレスベラトロールの合成用の４ｃｌおよびｓｔｓ、または
ｆ）ポリフェノール、好ましくはフラボノイド、特に好ましくはナリンゲニンの合成用のｃｈｓおよびｃｈｉ
を含む群から選択される遺伝子を有することを特徴とする、請求項１～８、１０～１８および２１～２５のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。 - コリネバクテリウムおよびブレビバクテリウム、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム、特に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、ブレビバクテリウム・フラブム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムまたはブレビバクテリウム・ディバリカツムを含む群から選択される、請求項１～８、１０～１８および２１～２６のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞。
- 以下のステップ：
ａ）水およびＣ６炭素源を含有する溶液を用意するステップ；
ｂ）請求項１～８および１０～１６のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップａ）による溶液中でＣ６炭素源をマロニルＣｏＡへ微生物変換するステップ
を含む、コリネ型細菌におけるマロニルＣｏＡの供給を増加させるための方法。 - 以下のステップ：
ａ）水およびＣ６炭素源を含有する溶液を用意するステップ；
ｂ）請求項１～８、１０～１８および２１～２７のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞の存在下で、ステップａ）による溶液中でＣ６炭素源をポリフェノールまたはポリケチドへ微生物変換するステップであって、まず、高められた濃度のマロニルＣｏＡを中間体として供給し、さらに変換してポリフェノールまたはポリケチドを微生物合成するステップ、
ｃ）ステップｂ）に適切なインデューサーを添加することによって、誘導性プロモーターの制御下で植物遺伝子の発現を誘導するステップ、
ｄ）任意選択的に、所望の生成物を処理するステップ
を含む、コリネ型細菌においてポリフェノールまたはポリケチドを微生物産生するための方法。 - ステップｂ）における溶液に、ポリフェノール前駆体、好ましくはｐ－クマル酸を補充することを特徴とする、請求項２９に記載のポリフェノール産生のための方法。
- 培養を断続または連続モード、好ましくはバッチ－、流加－、反復流加または連続モードで行うことを特徴とする、請求項２９または３０に記載の方法。
- コリネ型細菌におけるマロニルＣｏＡの供給を増加させるための、請求項１～８、１０～１８および２１～２７のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞および／または請求項８に記載のタンパク質および／または請求項９に記載の核酸配列の使用。
- コリネ型細菌においてポリフェノールまたはポリケチドを産生するための、請求項１～８、１０～１８および２１～２７のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞および／または請求項１９に記載のタンパク質および／または請求項２０に記載の核酸配列の使用。
- 請求項１～８、１０～１８および２１～２７のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞ならびに／または請求項８もしくは１９に記載の１つもしくは複数のタンパク質ならびに／または請求項９もしくは２０に記載の１つもしくは複数のヌクレオチド配列ならびに／または請求項２８～３１のいずれか一つに記載の方法を用いて産生された、ポリフェノールおよびポリケチド、好ましくはスチルベン、フラボノイドまたはポリケチド、特に好ましくはレスベラトロール、ナリンゲニンおよび／またはノルオイゲニンの群から選択される二次代謝物を含有する組成物。
- 医薬、食品、飼料を製造するための、および／もしくは植物生理学において使用するための、請求項１～８、１０～１８および２１～２７のいずれか一つに記載のコリネ型細菌細胞を用いておよび／もしくは請求項２８～３１のいずれか一つに記載の方法に従って産生されたレスベラトロール、ナリンゲニンおよび／もしくはノルオイゲニンの使用、ならびに／または請求項３４に記載の組成物の使用。
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