KR20230035565A - 구아니디노아세트산의 발효적 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구아니디노아세트산 (GAA) 을 생산할 수 있도록 형질전환된 미생물 및 이러한 미생물을 사용하는 GAA 의 발효적 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 크레아틴의 발효적 생산 방법에 관한 것이다.

Description

구아니디노아세트산의 발효적 생산 방법
본 발명은 구아니디노아세트산 (GAA) 을 생산할 수 있도록 형질전환된 미생물 및 이러한 미생물을 사용하는 GAA 의 발효적 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 크레아틴의 발효적 생산 방법에 관한 것이다.
GAA 은 동물 사료 첨가제로서 사용되는 유기 화합물이다 (US2011257075 A1). GAA 은 크레아틴의 선천 전구체이다 (예를 들어 Humm et al., Biochem. J. (1997) 322, 771-776). 그러므로, GAA 의 보충은 유기체에서 크레아틴의 최적의 공급을 허용한다.
본 발명은 출발 물질로서 산업용 공급 원료 (예를 들어 암모니아, 암모늄 염 및 글루코스 또는 당 함유 기질) 를 사용하는 발효 공정에 의해 GAA 을 생산하는 방법에 관한 것이다. 생물계에서 GAA 및 L-오르니틴은 출발 물질로서의 아르기닌 및 글라이신으로부터 L-아르기닌:글라이신-아미디노트랜스페라아제 (AGAT; EC 2.1.4.1) 의 촉매 작용에 의해 형성되며, 이는 크레아틴 생합성에서 제 1 단계이다:
Figure pct00001
Guthmiller et al. (J Biol Chem. 1994 Jul 1;269(26):17556-60) 은 래트 신장 AGAT 를 그 효소를 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 에서 클로닝하고 이종적으로 발현시킴으로써 특성분석했다. Muenchhoff et al. (FEBS Journal 277 (2010) 3844-3860) 은 또한 원핵생물로부터의 AGAT 를 그 효소를 에스케리키아 콜라이에서 클로닝하고 이종적으로 발현시킴으로써 제 1 특성분석을 보고한다. Sosio et al. (Cell Chemical Biology 25, 540-549, May 17, 2018) 은 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종에서 슈도우리디마이신에 대한 생합성 경로를 설명했다. 그들은 PumN, L-아르기닌:글라이신-아미디노트랜스페라아제 (AGAT) 에 의해 촉매작용되는 L-아르기닌과 글라이신의 반응에 의한 GAA 및 L-오르니틴의 형성을 중간 반응으로서 기술한다.
미생물, 특히 박테리아에서 GAA 합성의 출발 물질 중 하나, 즉 L-아르기닌의 생산을 증가시키기 위한 여러 접근법이 또한 문헌으로부터 알려져 있다. L-아르기닌 생산을 위한 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 의 대사 조작에 관한 개요가 Park et al. (NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618) 에 의해 제공되어 있다. 그들은 이미 L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주, 예를 들어 ATCC 21831 의 L-아르기닌 생산자에 대한 무작위 돌연변이유발 및 스크리닝을 제안하며 (Nakayama and Yoshida 1974, US3849250 A), 대사의 시스템-와이드 분석에 기반하는 단계적 합리적 대사 조작은 균주 조작 단계 전체를 통하여 L-아르기닌 생산의 점진적 증가를 초래한다. Yim et al. (J Ind Microbiol Biotechnol (2011) 38:1911-1920) 은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 염색체 argR 유전자를 파괴함으로써 L-아르기닌 생합성 경로를 제어하는 중심 리프레서 단백질 ArgR 에 대해 코딩하는 유전자인 argR 을 불활성화시키는 것이 개선된 아르기닌-생산 균주를 초래한다는 것을 보여줄 수 있었다. Ginesy et al. (Microbial Cell Factories (2015) 14:29) 은 증가된 아르기닌 생산을 위한 에스케리키아 콜라이의 성공적인 조작을 보고한다. 그 중에서도, 그들은 argR 리프레서 유전자의 결실을 제안했다.
아르기닌-생합성 오페론 argR 의 발현을 저해하는 유전자가 불활성화된 유전자 재조합 균주의 사용 방법이 Suga et al. (US20070031946 A1) 에 의해 보고된 바 있다. 특히, 아르기닌 오페론을 제어하는 argR 의 결실은 아르기닌 생산의 중요한 인자로서 여겨져 왔다.
Fan Wenchao 은 비병원성 미생물, 예컨대 코리네박테리움 글루타미쿰의 발효에 의한 크레아틴의 생산 방법을 개시한다 (CN106065411 A). 미생물은 하기 생체내 변화 기능을 갖는다: 글루코스의 L-글루탐산으로의 전환; L-글루탐산의 N-아세틸-L-글루탐산으로의 전환; N-아세틸-L-글루탐산의 N-아세틸-L-글루탐산 세미알데히드로의 전환; N-아세틸-L-글루탐산 세미알데히드의 N-아세틸-L-오르니틴으로의 전환; N-아세틸-L-오르니틴의 L-오르니틴으로의 전환; L-오르니틴의 L-시트룰린으로의 전환; L-시트룰린의 아르기니노-숙신산으로의 전환; 아르기니노-숙신산의 L-아르기닌으로의 전환; L-아르기닌의 구아니디노아세트산으로의 전환; 및, 마지막으로, 구아니디노아세트산의 크레아틴으로의 전환. Fan Wenchao 은 미생물이 N-아세틸글루타메이트-신타아제, N-아세틸오르니틴-δ-아미노트랜스페라아제, N-아세틸오르니티나아제, 오르니틴-카르바모일 트랜스페라아제, 아르기니노숙시네이트 신테타아제, 글라이신 아미디노-트랜스페라아제 (EC: 2.1. 4.1), 및 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스페라아제 (EC: 2.1.1.2) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 과발현한다고 제안한다. 미생물은 바람직하게는 글라이신 아미디노트랜스페라아제 (L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제) 및 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스페라아제를 과발현한다.
GAA 생합성의 제 2 출발 물질에 관하여, L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제 (AGAT) 의 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 동종 유전자가 자연적으로 제공되어 있거나 또는 L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제 (AGAT) 의 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 이종 유전자가 제공된 미생물에서 GAA 생합성을 개선하기 위해서 글라이신의 공급을 증가시키는 것이 바람직할 것이다.
에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 미생물에 자연적으로 존재하는, 소위 글리옥실레이트 션트 (shunt) 경로는 트리카르본산 (TCA) 사이클 (Krebs 사이클) 의 부반응이고, 이소시트레이트 리아제에 의한 이소시트레이트로부터의 글리옥실레이트 및 숙시네이트의 형성 및 말레이트 신타아제에 의한 글리옥실레이트 및 아세틸-CoA 로부터의 말레이트의 형성을 포함한다 (Salusjaervi et al., Applied Microbiology and Biotechnology (2019) 103:2525-2535).
글리옥실레이트는 아미노 공여체, 예컨대 아미노산, 및 글리옥실레이트 트랜스아미나아제의 존재 하에서의 글라이신의 형성을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 글리옥실레이트 트랜스아미나아제는 아미노산으로부터 글리옥실레이트로의 아미노 기의 전달을 촉매작용한다. 이러한 전달의 산물은 글라이신 및 상응하는 α-케토산이다.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 글리콜레이트의 생산을 개선하려는 시도에서 Zahoor et al. (Journal of Biotechnology 192 (2014) 366-375) 은 말레이트 신타아제 유전자 aceB 의 결실에 의해 그 중에서도 글리옥실레이트 전구체의 공급의 증가를 달성했다.
여러 글리옥실레이트 아미노 트랜스페라아제가 알려져 있고, 아미노 공여체에 대한 그들의 기질 특이성에서 다양하다 (예를 들어 Kameya et al. FEBS Journal 277 (2010) 1876-1885; Liepman and Olsen, Plant Physiol. Vol. 131, 2003, 215-227; Sakuraba et al., JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 2004, p. 5513-5518; Takada and Noguchi, Biochem. J. (1985) 231, 157-163 참조). 대부분의 이들 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제는 상이한 아미노산을 아미노 공여체로서 사용할 수 있으므로, 그들은 상이한 EC 번호로 주석이 달린다. 그러나, 모든 이들 아미노트랜스페라아제는 그들이 글리옥실레이트를 수용체 분자로서 사용하거나, 또는, 역반응의 경우에, 글라이신을 공여체 분자로서 사용한다는 점을 공통으로 한다.
글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제의 기능을 갖는 단백질의 예는 다음과 같다:
글라이신 트랜스아미나아제 (EC 2.6.1.4) 는 다음 반응을 촉매작용한다:
L-글루타메이트 + 글리옥실레이트 <=> 알파-케토글루타레이트 + 글라이신.
글라이신:옥살로아세테이트 트랜스아미나아제 (EC 2.6.1.35) 는 다음 반응을 촉매작용한다:
L-아스파르테이트 + 글리옥실레이트 <=> 옥살로아세테이트 + 글라이신.
알라닌:글리옥실레이트 트랜스아미나아제 (EC 2.6.1.44) 는 다음 반응을 촉매작용한다:
L-알라닌 + 글리옥실레이트 <=> 피루베이트 + 글라이신.
세린:글리옥실레이트 트랜스아미나아제 (EC 2.6.1.45) 는 다음 반응을 촉매작용한다:
L-세린 + 글리옥실레이트 <=> 3-히드록시-피루베이트 + 글라이신.
메티오닌:글리옥실레이트 트랜스아미나아제 (EC 2.6.1.73) 는 다음 반응을 촉매작용한다:
L-메티오닌 + 글리옥실레이트 <=> 4-(메틸술파닐)-2-케토-부타노에이트 + 글라이신.
방향족 아미노산:글리옥실레이트 트랜스아미나아제 (EC 2.6.1.60) 는 다음 반응을 촉매작용한다:
방향족 아미노산 + 글리옥실레이트 <=> 방향족 케토산 + 글라이신.
키뉴레닌:글리옥실레이트 트랜스아미나아제 (EC 2.6.1.63) 는 다음 반응을 촉매작용한다:
키뉴레닌 + 글리옥실레이트 <=> 4-(2-아미노페닐)-2,4-디케토-부타노에이트 + 글라이신.
(S)-우레이도-글라이신:글리옥실레이트 트랜스아미나아제 (EC 2.6.1.112) 는 다음 반응을 촉매작용한다:
(S)-우레이도-글라이신 + 글리옥실레이트 <=> N-카르바모일-2-케토-글라이신 + 글라이신.
그러나, 현재까지 에스케리키아 콜라이 및 코리네박테리움 글루타미쿰에 대해 내생 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제가 기재된 적이 없다. 게다가, 야생형에 비해 증가된 GAA 의 생산에 적합한 미생물 및 이러한 미생물을 사용하는 당해 GAA 의 생산 방법은 보고된 적이 없다.
그러므로, 본 발명의 기초가 되는 과제는 구아니디노아세트산 (GAA) 을 생산할 수 있도록 형질전환된 미생물, 특히 GAA 생합성의 출발 물질로서 글라이신을 제공하는 능력이 개선된 미생물, 및 이러한 미생물을 사용하는 GAA 의 발효적 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제는 L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제 (AGAT, 예를 들어 EC 2.1.4.1) 의 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제의 기능을 갖는 적어도 하나의 단백질을 포함하는 미생물에 의해 해결된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물에서 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제의 기능을 갖는 적어도 하나의 단백질의 효소 활성은 야생형 미생물에서의 당해 효소 활성에 비해 활성이 증가된다.
본 발명에 따른 미생물은 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제의 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함할 수 있다. 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제의 효소 활성을 갖는 적어도 하나의 단백질은 동종성 또는 이종성일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물에서 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제의 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자가 과발현된다.
바람직하게는, 본 발명의 미생물은 야생형 미생물의 능력에 비해 증가된 L-아르기닌 생산 능력을 갖는다.
본 발명의 맥락에서, L-아르기닌 생산 능력이 증가된 미생물은 L-아르기닌을 그 자신의 필요를 초과하여 생산하는 미생물을 의미한다. 이러한 L-아르기닌 생산 미생물의 예는 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21831 또는 Park et al. (NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618) 또는 Ginesy et al. (Microbial Cell Factories (2015) 14:29) 에 의해 개시된 것들이다.
본 발명의 특별한 구현예에서, 미생물은 카르바모일포스페이트 신타아제 (EC 6.3.4.16) 의 기능을 갖는 효소의 활성이 야생형 미생물에서의 당해 효소 활성에 비해 증가된다.
본 발명에 따른 미생물에서 아르기니노숙시네이트 리아제 (E.C. 4.3.2.1) 의 기능을 갖는 효소의 활성은 야생형 미생물에서의 당해 효소 활성에 비해 증가될 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 미생물에서, 오르니틴 카르바모일트랜스페라아제 (EC 2.1.3.3) 의 기능을 갖는 효소의 활성은 야생형 미생물에서의 당해 효소 활성에 비해 증가될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물에서, 아르기니노숙시네이트 신테타아제 (E.C. 6.3.4.5) 의 기능을 갖는 효소의 활성이 또한 야생형 미생물에서의 당해 효소 활성에 비해 증가될 수 있다.
미생물에서 효소 활성의 증가는, 예를 들어, 상응하는 내생 유전자의 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. 효소 활성을 증가시키기 위한 추가의 조치는 당해 효소에 대해 코딩하는 mRNA 를 안정화시키는 것일 수 있다. 위에서 언급된 효소의 활성의 증가는 또한 당해 효소에 대해 코딩하는 유전자를 과발현시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물의 추가의 구현예에서 말레이트 신타아제의 기능을 갖는 단백질의 활성이 야생형 미생물에서의 당해 활성에 비해 감소된다.
말레이트 신타아제의 기능을 갖는 단백질의 활성은, 그 단백질을 야생형 단백질보다 효소 활성이 더 낮은 단백질로 돌연변이시킴으로써, 말레이트 신타아제의 기능을 갖는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 야생형 미생물에서의 당해 유전자의 발현에 비해 약화시킴으로써, 예를 들어 ATG 시작 코돈을 GTG 로 변화시키는 것에 의해, mRNA 의 5' 미번역 영역 내로 이차 구조를 도입하는 것에 의해 또는 코돈 사용법을 약화시키는 것에 의해 번역 효율을 감소시킴으로써 또는 말레이트 신타아제의 기능을 갖는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시킴으로써 감소될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물은 바람직하게는 또한 오르니틴 카르바모일트랜스페라아제 (EC 2.1.3.3) 의 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 유전자 (예를 들어 argF/argF2/argI), 아르기니노숙시네이트 신테타아제 (E.C. 6.3.4.5) 의 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 유전자 (예를 들어 argG), 및 아르기니노숙시네이트 리아제 (E.C. 4.3.2.1) 의 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 유전자 (예를 들어 argH) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 과발현된 유전자를 포함한다.
게다가, 본 발명에 따른 미생물에서 아르기닌 오페론 (argCJBDFR) 은 과발현될 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 미생물에서 아르기닌 반응성 리프레서 단백질 ArgR 에 대해 코딩하는 argR 유전자는 약화 또는 결실될 수 있다.
본 발명의 추가의 구현예에서 및, 선택적으로 위에서 언급된 변경에 더하여, 각각 글루타메이트 데히드로게나아제, 오르니틴 아세틸트랜스페라아제, 아세틸글루타메이트 키나아제, 아세틸글루타밀포스페이트 리덕타아제 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스페라아제에 대해 코딩하는 gdh, argJ, argB, argC 및/또는 argD 을 포함하는, L-아르기닌의 생합성 경로의 효소에 대해 코딩하는 유전자 중 적어도 하나 이상이 본 발명에 따른 미생물에서 과발현된다.
표 1 은 상이한 종, 즉 에스케리키아 콜라이, 코리네박테리움 글루타미쿰 및 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 에서 아르기닌 생합성에 관여하는 또는 기여하는 상이한 효소의 명칭을 보여준다.
표 1: 효소의 명칭
Figure pct00002
Figure pct00003
유전자의 과발현은 일반적으로 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 및/또는 유전자를 강 프로모터와 기능적으로 연결시킴으로써 및/또는 리보솜 결합 자리를 증대시킴으로써 및/또는 시작 코돈 또는 전체 유전자의 코돈 사용법 최적화에 의해 또는 위에서 언급된 모든 방법 중 선별을 포함하는 조합에 의해 달성된다.
본 발명의 미생물의 본 발명의 추가의 구현예에서 L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제의 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 유전자는 이종성이다.
이종 유전자는 자연적으로 이 유전자를 갖지 않는 숙주 유기체 내로 유전자가 삽입된 것을 의미한다. 숙주 내의 이종 유전자의 삽입은 재조합 DNA 기술에 의해 수행된다. 재조합 DNA 기술을 적용한 미생물은 트랜스제닉, 유전자 변형 또는 재조합으로 호칭된다.
이종 단백질은 미생물에 자연적으로 존재하지 않는 단백질을 의미한다.
동종 또는 내생 유전자는 그러한 그것의 기능을 포함하는 유전자 또는 그 유전자의 뉴클레오티드 서열이 미생물에 자연적으로 존재하거나 또는 그 미생물에서 "선천적" 인 것을 의미한다.
동종 또는 선천 단백질은 미생물에 자연적으로 존재하는 단백질을 의미한다.
L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제 (AGAT) 의 기능을 갖는 단백질은 아미디노트랜스페라아제 패밀리에 속한다. 아미디노트랜스페라아제 패밀리는 크레아틴 및 스트렙토마이신 생합성 각각에 관여하는 효소인 글라이신 (EC:2.1.4.1) 및 이노사민 (EC:2.1.4.2) 아미디노트랜스페라아제를 포함한다. 이 패밀리는 또한 아르기닌 데이미나아제, EC:3.5.3.6 를 포함한다. 이들 효소는 다음 반응을 촉매작용한다: 아르기닌 + H2O <=> 시트룰린 + NH3. 이 패밀리에서 또한 발견되는 것은 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 항종양 당단백질이다. L-아르기닌:글라이신-아미디노트랜스페라아제 (AGAT) 활성을 갖는 효소 또는 단백질은 또한 PFAM 패밀리: Amidinotransf (PF02274) 에 속하는 보존된 도메인을 보유하는 것으로 기술되어 있으며 (Marchler-Bauer A et al. (2017), "CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain architectures.", Nucleic Acids Res. 45(D1):D200-D203.), 이는 또한 하기 문헌에 기재되어 있다: Pissowotzki K et al., Mol Gen Genet 1991;231:113-123 (PUBMED:1661369 EPMC:1661369); D'Hooghe I et al., J Bacteriol 1997;179:7403-7409 (PUBMED:9393705 EPMC:9393705); Kanaoka M et al. , Jpn J Cancer Res 1987;78:1409-1414 (PUBMED:3123442 EPMC:3123442).
본 발명의 미생물에서 L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제의 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 유전자는 추가로 과발현될 수 있다. 유전자의 과발현은 일반적으로 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 및/또는 유전자를 강 프로모터와 기능적으로 연결시킴으로써 및/또는 리보솜 결합 자리를 증대시킴으로써 및/또는 시작 코돈 또는 전체 유전자의 코돈 사용법 최적화에 의해 또는 위에서 언급된 모든 방법 중 선별을 포함하는 조합에 의해 달성된다.
본 발명의 미생물에서 L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제의 기능을 갖는 단백질은 SEQ ID NO: 11 에 따른 아미노산 서열과 적어도 80 % 상동성, 바람직하게는 적어도 90 % 상동성인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가의 구현예에서 L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11 에 따른 아미노산 서열과 동일하다.
본 발명의 특별한 구현예에서, 본 발명에 따른 미생물에서 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제의 효소 활성을 갖는 단백질은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 8 에 따른 아미노산 서열과 적어도 80 % 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 미생물은 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 또는 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae) 속, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 또는 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 바람직하게는 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 에 속할 수 있다.
미생물에서, 특히 본 발명의 미생물에서 야생형 미생물에서의 당해 활성에 비해 증가된 단백질의 효소 활성은 예를 들어 단백질의 돌연변이에 의해, 특히 예를 들어 효소-촉매작용되는 반응의 산물에 대한 피드백 저항성을 단백질에 제공하는 돌연변이에 의해, 또는 야생형 미생물에서의 당해 유전자의 발현에 비해 증가된 그 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 의해 달성될 수 있다.
미생물에서, 특히 본 발명의 미생물에서 야생형 미생물에서의 당해 활성에 비해 증가된 유전자의 발현 또는 과발현은 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 및/또는 조절 인자의 증대에 의해, 예를 들어 유전자를 강 프로모터와 기능적으로 연결시킴으로써 및/또는 리보솜 결합 자리를 증대시킴으로써 및/또는 시작 코돈 또는 전체 유전자의 코돈 사용법 최적화에 의해 달성될 수 있다. 유전자 발현에 긍정적 영향을 미치는 조절 인자의 증대는, 예를 들어, 프로모터의 효과를 증가시키기 위해 구조 유전자의 상류에 있는 프로모터 서열을 변형시킴으로써 또는 상기 프로모터를 더욱 효과적인 또는 소위 강 프로모터로 완전히 대체함으로써 달성될 수 있다. 프로모터는 유전자의 상류에 위치한다. 프로모터는 약 40 내지 50 개의 염기쌍으로 이루어진 DNA 서열이고, RNA 폴리머라아제 홀로엔자임에 대한 결합 자리 및 전사 시작점을 구성하여, 이에 의해 제어되는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 발현 강도가 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, 강 프로모터를 선택함으로써, 예를 들어 원래의 프로모터를 강, 선천 (원래 다른 유전자에 할당됨) 프로모터로 대체함으로써 또는 주어진, 선천 프로모터의 특정 영역 (예를 들어 그것의 소위 -10 및 -35 영역) 을 공통 서열에 대해 변형시킴으로써 박테리아에서 유전자의 과발현 또는 발현의 증가를 달성할 수 있으며, 이는 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰에 관해 M. Patek et al. (Microbial Biotechnology 6 (2013), 103-117) 에 의해 교시된 바와 같다. "강" 프로모터의 예는 슈퍼옥사이드 디스무타아제 (superoxide dismutase) (sod) 프로모터이다 ("Psod"; Z. Wang et al., Eng. Life Sci. 2015, 15, 73-82). "기능적 연결" 은 유전자의 전사를 초래하는 프로모터와 유전자의 순차적 배열을 의미하는 것으로 이해된다.
유전 부호는 축퇴되어 있으며, 이는 특정 아미노산이 다수의 상이한 트리플렛에 의해 코딩될 수 있음을 의미한다. 용어 코돈 사용법은 특정 유기체가 전형적으로 특정 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈을 동일한 빈도로 사용하지 않을 것이라는 관찰을 나타낸다. 그 대신 유기체는 전형적으로 특정 코돈에 대한 특정 선호도를 보일 것이며, 이는 이들 코돈이 유기체의 전사된 유전자의 코딩 서열에서 더 빈번하게 발견됨을 의미한다. 그것의 미래의 숙주에 외래인, 즉 상이한 종으로부터 유래된 특정 유전자가 미래의 숙주 유기체에서 발현되어야 하는 경우에, 상기 유전자의 코딩 서열은 상기 미래의 숙주 유기체의 코돈 사용법에 맞춰 조정되어야 한다 (즉, 코돈 사용법 최적화).
위에서 언급된 과제는 추가로 구아니디노 아세트산 (GAA) 의 발효적 생산 방법으로서, a) 위에서 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 미생물을 적합한 배지에서 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 b) 배지에 GAA 을 축적시켜 GAA 함유 발효 브로쓰를 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 해결된다.
본 발명의 방법은 발효 브로쓰로부터 GAA 을 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 GAA 함유 발효 브로쓰를 건조 및/또는 과립화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스페라아제 (EC: 2.1.1.2) 의 활성을 갖는 효소에 대해 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 위에서 정의된 바와 같은 미생물에 관한 것이다. 바람직하게는, 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스페라아제의 활성을 갖는 효소에 대해 코딩하는 유전자는 과발현된다.
본 발명은 또한 크레아틴의 발효적 생산 방법으로서, 단계 a) 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스페라아제의 활성을 갖는 효소에 대해 코딩하는 유전자를 포함하는 본 발명에 따른 미생물을 적합한 배지에서 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 b) 배지에 크레아틴을 축적시켜 크레아틴 함유 발효 브로쓰를 형성하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 크레아틴 함유 발효 브로쓰로부터 크레아틴을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 크레아틴은 발효 브로쓰로부터 등전점 방법 및 / 또는 이온 교환 방법에 의해 추출될 수 있다. 대안적으로, 크레아틴은 물에서의 재결정화 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다.
실험 부분
A) 물질 및 방법
화학물질
스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 (Streptomyces kanamyceticus) 로부터의 카나마이신 용액을 Sigma Aldrich (St. Louis, USA, Cat. No. K0254) 로부터 구입했다. IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드) 를 Carl-Roth (Karlsruhe, Germany, Cat. No. 2316.4.) 로부터 구입했다. 다르게 언급되지 않으면, 모든 다른 화학물질은 Merck (Darmstadt, Germany), Sigma Aldrich (St. Louis, USA) 또는 Carl-Roth (Karlsruhe, Germany) 로부터 분석적으로 순수하게 구입했다.
세포 증식을 위한 배양
다르게 언급되지 않으면, 배양 / 인큐베이션 절차는 다음과 같이 수행했다:
a. Merck (Darmstadt, Germany; Cat. No. 110285) 로부터의 LB 브로쓰 (MILLER) 를 사용하여 액체 배지에서 에스케리키아 콜라이 균주를 배양했다. 액체 배양물 (배플이 3 개인 100 ㎖ 에를렌마이어 플라스크 당 10 ㎖ 액체 배지) 을 Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland) 로부터의 Infors HT Multitron 표준 인큐베이터 셰이커에서 30℃ 및 200 rpm 에서 인큐베이션했다.
b. Merck (Darmstadt, Germany, Cat. No. 110283) 로부터의 LB 아가 (MILLER) 를 사용하여 아가 플레이트 상에서 에스케리키아 콜라이 균주를 배양했다. 아가 플레이트를 VWR (Radnor, USA) 로부터의 INCU-Line® 미니 인큐베이터에서 30℃ 에서 인큐베이션했다.
c. Merck (Darmstadt, Germany, Cat. No. 110493) 로부터의 뇌 심장 인퓨전 브로쓰 (BHI) 를 사용하여 액체 배지에서 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양했다. 액체 배양물 (배플이 3 개인 100 ㎖ 에를렌마이어 플라스크 당 10 ㎖ 액체 배지) 을 Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland) 로부터의 Infors HT Multitron 표준 인큐베이터 셰이커에서 30℃ 및 200 rpm 에서 인큐베이션했다.
d. Merck (Darmstadt, Germany, Cat. No. 113825) 로부터의 뇌 심장 아가 (BHI-agar) 를 사용하여 아가 플레이트 상에서 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양했다. 아가 플레이트를 Kelvitron® 온도 조절기 (Hanau, Germany) 가 있는 Heraeus Instruments 로부터의 인큐베이터에서 30℃ 에서 인큐베이션했다.
e. 전기천공 후에 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하기 위해서, BHI-아가 (Merck, Darmstadt, Germany, Cat. No. 113825) 에 134 g/ℓ 소르비톨 (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany), 2.5 g/ℓ 효모 추출물 (Oxoid/ThermoFisher Scientific, Waltham, USA, Cat. No. LP0021) 및 25 ㎎/ℓ 카나마이신을 보충했다. 아가 플레이트를 Kelvitron® 온도 조절기 (Hanau, Germany) 가 있는 Heraeus Instruments 로부터의 인큐베이터에서 30℃ 에서 인큐베이션했다.
박테리아 현탁액의 광학 밀도의 확인
a. 세이크 플라스크 배양물 중 박테리아 현탁액의 광학 밀도를 Eppendorf AG (Hamburg, Germany) 로부터의 BioPhotometer 를 사용하여 600 nm (OD600) 에서 확인했다.
b. Wouter Duetz (WDS) 마이크로 발효 시스템 (24-웰 플레이트) 에서 생산된 박테리아 현탁액의 광학 밀도를 Tecan Group AG (Maennedorf, Switzerland) 로부터의 GENios™ 플레이트 리더로 660 nm (OD660) 에서 확인했다.
원심분리
a. 최대 부피 2 ㎖ 의 박테리아 현탁액을 1.5 ㎖ 또는 2 ㎖ 반응 튜브 (예를 들어 Eppendorf Tubes® 3810X) 에서 Eppendorf 5417 R 벤치탑 원심분리기 (13.000 rpm 에서 5 분) 를 사용하여 원심분리했다.
b. 최대 부피 50 ㎖ 의 박테리아 현탁액을 15 ㎖ 또는 50 ㎖ 원심분리기 튜브 (예를 들어 Falcon™ 50 ㎖ 원뿔형 원심분리기 튜브) 에서 Eppendorf 5810 R 벤치탑 원심분리기를 사용하여 10 분 동안 4.000 rpm 에서 원심분리했다.
DNA 단리
플라스미드 DNA 를 에스케리키아 콜라이 세포로부터 Qiagen (Hilden, Germany, Cat. No. 27106) 로부터의 QIAprep Spin Miniprep Kit 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 단리했다.
폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR)
프루프 리딩 (하이 피델리티) 폴리머라아제에 의한 PCR 을 사용하여 Sanger 시퀀싱 또는 DNA 어셈블리를 위한 DNA 의 원하는 분절을 증폭시켰다. 비-프루프 리딩 폴리머라아제 키트를 사용하여 에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 콜로니로부터 직접 원하는 DNA 단편의 존재 또는 부재를 확인했다.
a. New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA, Cat. No. M0530) 로부터의 Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase Kit (Phusion Kit) 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 선별된 DNA 영역을 템플레이트-코렉트 증폭시켰다 (표 2 참조).
표 2: New England BioLabs Inc. 로부터의 Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase Kit 를 사용하는 PCR 에 관한 열순환 조건
Figure pct00004
b. Qiagen (Hilden, Germany, Cat. No. 201203) 로부터의 Taq PCR Core Kit (Taq Kit) 를 사용하여 DNA 의 원하는 분절을 그것의 존재를 확인하기 위해 증폭시켰다. 키트를 제조사의 지침에 따라 사용했다 (표 3 참조).
표 3: Qiagen. 로부터의 Taq PCR Core Kit (Taq Kit) 를 사용하는 PCR 에 관한 열순환 조건
Figure pct00005
c. Takara Bio Inc (Takara Bio Europe S.A.S., Saint-Germain-en-Laye, France, Cat. No. RR350A/B) 로부터의 SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Sapphire Mix) 를 대안적으로서 제조사의 지침에 따라 사용하여 에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 콜로니로부터 취한 세포에서 DNA 의 원하는 분절의 존재를 확인했다 (표 4 참조).
표 4: Takara Bio Inc. 로부터의 SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Sapphire Mix) 를 사용하는 PCR 에 관한 열순환 조건
Figure pct00006
d. 모든 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany) 에 의해 McBride and Caruthers (1983) 에 의해 기재된 포스포라미다이트 방법을 사용하여 합성되었다.
e. PCR 주형으로서 단리된 플라스미드 DNA 또는 액체 배양물로부터 단리된 전체 DNA 또는 박테리아 콜로니 (콜로니 PCR) 에 함유된 전체 DNA 의 적합하게 희석된 용액을 사용했다. 상기 콜로니 PCR 을 위해 아가 플레이트 상의 콜로니로부터 이쑤시개로 세포 물질을 취하고, 세포 물질을 직접 PCR 반응 튜브 내로 배치함으로써 주형을 제조했다. 세포 물질을 SEVERIN Elektrogeraete GmbH (Sundern, Germany) 로부터의 마이크로웨이브 오븐 타입 Mikrowave & Grill 에서 800 W 로 10 초 동안 가열하고, 그 후 PCR 시약을 PCR 반응 튜브 내의 주형에 첨가했다.
f. 모든 PCR 반응을 Eppendorf AG (Hamburg, Germany) 로부터의 PCR 사이클러 타입 Mastercycler 또는 Mastercycler Nexus Gradient 에서 수행했다.
DNA 의 제한 효소 소화
제한 효소 소화를 위해 "FastDigest 제한 엔도뉴클레아제 (FD)" (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA) 또는 New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA) 로부터의 제한 엔도뉴클레아제를 사용했다. 반응을 제조사의 매뉴얼의 지침에 따라 수행했다.
DNA 단편의 크기의 확인
a. 작은 DNA 단편 (<1000 bps) 의 크기는 통상적으로 Qiagen (Hilden, Germany) 로부터의 QIAxcel 을 사용하여 자동 모세관 전기영동에 의해 확인되었다.
b. DNA 단편이 단리될 필요가 있는 경우에 또는 DNA 단편이 >1000 bps 인 경우에 DNA 를 TAE 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고 GelRed® Nucleic Acid Gel Stain (Biotium, Inc., Fremont, Canada) 으로 염색했다. 염색된 DNA 를 302 nm 에서 시각화했다.
PCR 증폭물 및 제한 단편의 정제
PCR 증폭물 및 제한 단편을 Qiagen (Hilden, Germany; Cat. No. 28106) 로부터의 QIAquick PCR Purification Kit 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 세정했다. DNA 를 30 ㎕ 10 mM Tris*HCl (pH 8.5) 로 용리시켰다.
DNA 농도의 확인
PEQLAB Biotechnologie GmbH, since 2015 VWR brand (Erlangen, Germany) 로부터의 NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 을 사용하여 DNA 농도를 측정했다.
어셈블리 클로닝
New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA, Cat. No. E5520) 로부터 구입한 "NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit" 를 사용하여 플라스미드 벡터를 어셈블했다. 선형 벡터 및 적어도 하나의 DNA 인서트를 함유하는 반응 믹스를 50℃ 에서 60 분 동안 인큐베이션했다. 0.5 ㎕ 의 어셈블리 혼합물을 각각의 형질전환 실험에 사용했다.
에스케리키아 콜라이의 화학적 형질전환
플라스미드 클로닝을 위해, 화학적으로 컴피턴트 (competent) 한 "NEB® Stable Competent E. coli (High Efficiency)" (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. C3040) 를 제조사의 프로토콜에 따라 형질전환시켰다. 성공적으로 형질전환된 세포를 25 ㎎/ℓ 카나마이신이 보충된 LB 아가 상에서 선별했다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환
Ruan et al. (2015) 에 의해 기재된 바와 같이 "Gene Pulser Xcell" (Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany) 을 사용하는 전기천공을 통해 플라스미드-DNA 에 의한 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환을 수행했다. 전기천공을 1 mm 전기천공 큐베트 (Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany) 에서 1.8 kV 및 5 ms 로 설정된 고정된 시간 상수에서 수행했다. 134 g/ℓ 소르비톨, 2.5 g/ℓ 효모 추출물 및 25 ㎎/ℓ 카나마이신을 함유하는 BHI-아가 상에서 형질전환된 세포를 선별했다.
뉴클레오티드 서열의 확인
DNA 분자의 뉴클레오티드 서열은 Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463 - 5467, 1977) 의 디데옥시 사슬 종결 방법을 사용하여 사이클 시퀀싱에 의해 Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany) 에 의해 확인되었다. Scientific & Educational Software (Denver, USA) 로부터의 Clonemanager Professional 9 소프트웨어를 사용하여 서열을 시각화하고 평가했다.
에스케리키아 콜라이 및 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 글리세롤 스톡
에스케리키아 콜라이- 및 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 장시간 저장을 위해 글리세롤 스톡을 제조했다. 선별된 에스케리키아 콜라이 클론을 2 g/ℓ 글루코스가 보충된 10 ㎖ LB 배지에서 배양했다. 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 클론을 2 g/ℓ 글루코스가 보충된 10 ㎖ 2배 농축된 BHI 배지에서 배양했다. 플라스미드 함유 에스케리키아 콜라이- 및 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 성장시키기 위한 배지에 25 ㎎/ℓ 카나마이신을 보충했다. 배지는 배플이 3 개인 100 ㎖ 에를렌마이어 플라스크에 함유되었다. 그것에 콜로니로부터 취한 세포의 루프를 접종했다. 배양물을 그 후 18 h 동안 30℃ 및 200 rpm 에서 인큐베이션했다. 상기 인큐베이션 기간 후에 1.2 ㎖ 85 % (v/v) 멸균 글리세롤을 배양물에 첨가했다. 얻어진 글리세롤 함유 세포 현탁액을 그 후 2 ㎖ 분량씩 앨리쿼트로 만들고, -80℃ 에서 저장했다.
밀리리터-규모 배양에서 GAA 생산
Duetz (2007) 에 따른 밀리리터-규모 배양 시스템을 사용하여 균주의 GAA-생산을 평가했다. 이 목적을 위해, 웰 마다 2.5 ㎖ 배지를 채운 EnzyScreen BV (Heemstede, Netherlands, Cat. No. CR1424) 로부터의 24-딥웰 마이크로플레이트 (24 웰 WDS 플레이트) 를 사용했다.
균주의 예비배양을 10 ㎖ 시드 배지 (SM) 에서 수행했다. 배지는 배플이 3 개인 100 ㎖ 에를렌마이어 플라스크에 함유되었다. 그것에 100 ㎕ 의 글리세롤 스톡 배양물을 접종하고, 배양물을 24 h 동안 30℃ 및 200 rpm 에서 인큐베이션했다. 시드 배지 (SM) 의 조성이 표 5 에 제시되어 있다.
표 5: 시드 배지 (SM)
Figure pct00007
상기 인큐베이션 기간 후에 예비배양물의 광학 밀도 OD600 를 확인했다. 0.1 의 OD600 까지 2.5 ㎖ 의 생산 배지 (PM) 를 접종하는데 필요한 부피를 예비배양물로부터 샘플채취하고, 원심분리하고 (8000 g 에서 1 분), 상청액을 폐기했다. 세포를 그 후 100 ㎕ 의 생산 배지에 재현탁시켰다.
24 웰 WDS-플레이트의 2.4 ㎖ 생산 배지 (PM) 함유 웰에 각각 예비배양물로부터의 재현탁된 세포 100 ㎕ 를 접종함으로써 주된 배양을 시작했다. 생산 배지 (PM) 의 조성이 표 6 에 제시되어 있다.
표 6: 생산 배지 (PM)
Figure pct00008
주된 배양물을 Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland) 로부터의 Infors HT Multitron 표준 인큐베이터 셰이커에서 글루코스가 완전히 소모될 때까지 72 h 동안 30 ℃ 및 300 rpm 에서 인큐베이션했다. 현탁액 중의 글루코스 농도를 LifeScan (Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, Germany) 로부터의 혈액 글루코스-미터 OneTouch Vita® 로 분석했다.
배양 후에 배양물 현탁액을 딥 웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 배양물 현탁액의 일부를 OD660 을 측정하기 위해 적합하게 희석했다. 배양물의 또다른 일부를 원심분리하고, 상청액 중 GAA 의 농도를 하기와 같이 분석했다.
효모 펩톤 FM902 중 L-아르기닌 및 글라이신 함량의 확인
효모 추출물 FM902 (Angel Yeast Co.,LTD, Hubei, P.R.China) 는 다양한 펩티드 및 아미노산을 함유하므로, 그것의 L-아르기닌 및 글라이신 함량을 다음과 같이 측정했다.
유리 아미노산을 측정하기 위해서, 1 g 의 효모 추출물을 20 ㎖ 의 물에 용해시킴으로써 샘플을 제조했다. 용액에 전체 부피가 25 ㎖ 가 될 때까지 물을 채우고, 용액을 철저히 혼합하고, 0.2 μM 나일론 시린지 필터를 사용하여 여과했다.
전체 아미노산 (유리 아미노산 + 펩티드에 결합된 아미노산) 을 측정하기 위해, 10 ㎖ 6M HCl 에 1 g 효모 추출물을 용해시키고 24h 동안 110℃ 에서 인큐베이션하여 샘플을 제조했다. 그 후, 전체 부피가 25 ㎖ 가 될 때까지 물을 첨가했다. 용액을 철저히 혼합하고, 0.2 μM 나일론 시린지 필터를 사용하여 여과했다.
SYKAM Vertriebs GmbH (Fuerstenfeldbruck, Germany) 로부터의 SYKAM S433 아미노산 분석기를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 샘플 중의 L-아르기닌 및 글라이신의 농도를 확인했다. 고체 상으로서 SYKAM 로부터의 구형, 폴리스티렌계 양이온 교환기 (Peek LCA N04/Na, 치수 150 x 4.6 mm) 가 있는 칼럼을 사용했다. L-아미노산에 따라 용리를 위해 버퍼 A 및 B 의 혼합물을 사용하는 등용매 런 (run) 으로 또는 상기 버퍼를 사용하는 그래디언트 용리에 의해 분리를 수행한다. 버퍼 A 로서 20 ℓ 263 g 시트르산 삼나트륨, 120 g 시트르산, 1100 ㎖ 메탄올, 100 ㎖ 37 % HCl 및 2 ㎖ 옥탄산 (최종 pH 3.5) 을 함유하는 수용액을 사용했다. 버퍼 B 로서 20 ℓ 392 g 시트르산 삼나트륨, 100 g 붕산 및 2 ㎖ 옥탄산 (최종 pH 10.2) 을 함유하는 수용액을 사용했다. 유리 아미노산을 컬럼후 유도체화를 통해 닌히드린으로 염색하고 570 nm 에서 광도측정으로 검출했다.
표 7 은 효모 추출물 FM902 (Angel Yeast Co.,LTD, Hubei, P.R.China) 에서 확인된 유리 및 전체 L-아르기닌 및 글라이신의 함량, 뿐만 아니라 생산 배지 (PM) 에서의 결과적인 양을 보여준다.
표 7: 효모 추출물 (YE) FM902 에서의 L-아르기닌 및 글라이신의 함량 및 1.5 g/ℓ YE 을 함유하는 생산 배지 (PM) 에서의 결과적인 농도.
Figure pct00009
GAA 의 정량화
질량 분석기 "Triple Quad 6420" 와 커플링된 HPLC "Infinity 1260" 로 이루어지는 Agilent 로부터의 분석 시스템 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA) 으로 샘플을 분석했다. Atlantis HILIC Silica 칼럼, 4,6X250mm, 5μm (Waters Corporation, Milford, USA) 에서 35℃ 에서 크로마토그래피 분리를 수행했다. 이동상 A 는 10mM 암모늄 포르메이트 및 0,2% 포름산을 함유하는 물이었다. 이동상 B 는 90% 아세토니트릴 및 10 % 물의 혼합물이었고, 이 혼합물에 10 mM 암모늄 포르메이트를 첨가했다. HPLC 시스템을 100% B 로 시작했으며, 그 후 22 분 동안 0,6 mL/분의 일정한 유속으로 66% B 로의 선형 구배가 뒤따랐다. 질량 분석기를 ESI 양성 이온화 모드로 작동시켰다. GAA 의 검출을 위해 MRM 단편화 [M+H] + 118 - 76 를 사용하여 m/z 값을 모니터링했다. GAA 에 대한 정량화의 한계 (LOQ) 를 7 ppm 으로 고정했다.
B) 실험 결과
실시예 1: 아라비돕시스 탈리아나 ( Arabidopsis thaliana ) 로부터의 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제에 대해 코딩하는 유전자 GGT1 의 클로닝
아라비돕시스 탈리아나의 유전자 GGT1 (Genbank 접근 번호 NM_102180, SEQ ID NO:1) 는 글루타메이트:글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 (Genbank 접근 번호 NP_564192, SEQ ID NO:2) 에 대해 코딩한다. 이 단백질은 하기 반응을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다: 글리옥실레이트 + L-알라닌 = 글라이신 + 피루베이트 (EC 2.6.1.44), 2-옥소글루타레이트 + L-알라닌 = L-글루타메이트 + 피루베이트 (EC 2.6.1.2), 및 2-옥소글루타레이트 + 글라이신 = 글리옥실레이트 + L-글루타메이트 (EC 2.6.1.4; Liepman AH, Olsen LJ., Plant Physiol. 2003 Jan;131(1):215-27. doi: 10.1104/pp.011460).
소프트웨어 툴 "Codon Optimization Tool" (Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA) 을 사용하여 GGT1 단백질의 아미노산 서열을 코리네박테리움 글루타미쿰의 코돈 사용법에 최적화된 DNA 서열로 역번역했다. Shine-Dalgarno-Sequenz 를 열린 해독틀 (AGGAAAGGAGAGGATTG; Shi F, Luan M, Li Y, AMB Express. 2018 Apr 18;8(1):61. doi: 10.1186/s13568-018-0595-2) 의 바로 상류에 첨가하고, 결과적인 서열의 말단을 후속적 서브클로닝을 위한 모티프로 확장시켰다. 결과적인 DNA 서열 AtGGT1_opt_RBS (SEQ ID NO:3) 을 유전자 합성을 위해 Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany) 로부터 주문하고, 그것을 암피실린 내성을 부여하는 클로닝 플라스미드 (pEX-A258-AtGGT1_opt_RBS 로 명명됨) 의 일부로서 전달했다.
실시예 2: 아라비돕시스 탈리아나로부터의 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제에 대해 코딩하는 유전자 GGT2 의 클로닝
아라비돕시스 탈리아나의 유전자 AOAT2 (동의어: GGT2) (Genbank 접근 번호 NM_001036185, SEQ ID NO:4) 는 알라닌-2-옥소글루타레이트 아미노트랜스페라아제 2 (Genbank 접근 번호 NP_001031262, SEQ ID NO:5) 에 대해 코딩한다. 이 단백질은 하기 반응을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다: 글리옥실레이트 + L-알라닌 = 글라이신 + 피루베이트 (EC 2.6.1.44), 2-옥소글루타레이트 + L-알라닌 = L-글루타메이트 + 피루베이트 (EC 2.6.1.2), 및 2-옥소글루타레이트 + 글라이신 = 글리옥실레이트 + L-글루타메이트 (EC 2.6.1.4; Liepman AH, Olsen LJ. (2003), Plant Physiol. 2003 Jan;131(1):215-27. doi: 10.1104/pp.011460).
소프트웨어 툴 "Codon Optimization Tool" (Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA) 을 사용하여 GGT2 단백질의 아미노산 서열을 코리네박테리움 글루타미쿰의 코돈 사용법에 최적화된 DNA 서열로 역번역했다. Shine-Dalgarno-Sequenz 를 열린 해독틀 (AGGAAAGGAGAGGATTG; Shi, 2018) 의 바로 상류에 첨가하고, 결과적인 서열의 말단을 후속적 서브클로닝을 위한 모티프로 확장시켰다. 결과적인 DNA 서열 AtGGT2_opt_RBS (SEQ ID NO:6) 을 유전자 합성을 위해 Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany) 로부터 주문하고, 그것을 암피실린 내성을 부여하는 클로닝 플라스미드 (pEX-A258-AtGGT2_opt_RBS 로 명명됨) 의 일부로서 전달했다.
실시예 3: 테르모코쿠스 리토랄리스 ( Thermococcus litoralis ) 로부터의 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제에 대해 코딩하는 유전자 agt 의 클로닝
테르모코쿠스 리토랄리스의 유전자 agt (Genbank 접근 번호 AB033996, SEQ ID NO:7) 는 알라닌:글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 (Genbank 접근 번호 BAB40321, SEQ ID NO:8) 에 대해 코딩한다. 이 단백질은 하기 반응을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다: 글리옥실레이트 + L-알라닌 = 글라이신 + 피루베이트 (EC 2.6.1.44) 및 글리옥실레이트 + L-세린 = 글라이신 + 3-히드록시피루베이트 (EC 2.6.1.45; Sakuraba, H. et al., J Bacteriol. 2004 Aug; 186(16): 5513-5518. doi: 10.1128/JB.186.16.5513-5518.2004).
소프트웨어 툴 "Codon Optimization Tool" (Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA) 을 사용하여 Agt 단백질의 아미노산 서열을 코리네박테리움 글루타미쿰의 코돈 사용법에 최적화된 DNA 서열로 역번역했다. Shine-Dalgarno-Sequenz 를 열린 해독틀 (AGGAAAGGAGAGGATTG; Shi F, Luan M, Li Y, AMB Express. 2018 Apr 18;8(1):61. doi: 10.1186/s13568-018-0595-2) 의 바로 상류에 첨가하고, 결과적인 서열의 말단을 후속적 서브클로닝을 위한 모티프로 확장시켰다. 결과적인 DNA 서열 (SEQ ID NO:9) 을 유전자 합성을 위해 Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany) 로부터 주문하고, 그것을 암피실린 내성을 부여하는 클로닝 플라스미드 (pEX-A258-AGT_Tl_opt_RBS 로 명명됨) 의 일부로서 전달했다.
실시예 4: 무레아 프로두센스 (Moorea producens) 로부터의 L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제 (AGAT, EC 2.1.4.1) 에 대해 코딩하는 유전자 AGAT_Mp 의 클로닝
무레아 프로두센스는 사상 시아노박테리아이다. 무레아 프로두센스 균주 PAL-8-15-08-1 의 게놈은 Leao et al. (Leao T, Castelao G, Korobeynikov A, Monroe EA, Podell S, Glukhov E, Allen EE, Gerwick WH, Gerwick L, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Mar 21;114(12):3198-3203. doi: 10.1073/pnas.1618556114; Genbank 접근 번호 CP017599.1) 에 의해 공개되었다. 그것은 추정상 L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제 (AGAT, EC 2.1.4.1; locus_tag BJP34_00300, SEQ ID NO:10 에 제시됨) 에 대해 코딩하는 열린 해독틀을 함유한다. SEQ ID NO:11 은 거기에서 유래하는 아미노산 서열 (Genbank 접근 번호 WP_070390602) 을 보여준다.
소프트웨어 툴 "GeneOptimizer" (Geneart/ThermoFisher Scientific, Waltham, USA) 을 사용하여 이 아미노산 서열을 코리네박테리움 글루타미쿰의 코돈 사용법에 최적화된 DNA 서열로 역번역했다. 그것의 말단을 어셈블리 클로닝을 위한 서열로 확장시키고, 열린 해독틀의 5 염기쌍 상류에 Shine-Dalgarno-Sequenz (AGGA) 를 부가했다. 결과적인 DNA 서열 (SEQ ID NO:12) 을 유전자 합성을 위해 Invitrogen/Geneart (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 로부터 구입하고, 그것을 클로닝 플라스미드 (pMA-T_AGAT_Mp 로 명명됨) 의 일부로서 전달했다.
실시예 5: 발현 플라스미드 pEC-XK99E 내로의 AGAT_Mp 의 클로닝
에스케리키아 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 플라스미드 pEC-XK99E (Genbank 접근 번호 AY219682) 를 제한 엔도뉴클레아제 SmaI 를 사용하여 소화시켰다. 말단 포스페이트를 "FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 를 사용하여 제거했다. DNA 를 그 후 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 로 정제했다.
클로닝 플라스미드 pMA-T_AGAT_Mp 를 MluI + AatII 로 소화시키고, 결과적인 단편을 "Fast DNA End Repair Kit" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 을 사용하여 블런트 (blunt) 절단했다. 그들을 아가로스 겔 전기영동 (TAE 버퍼 중 0,8% 아가로스) 에 의해 분리하고, "AGAT_Mp" (1174 bp) 에 해당하는 밴드를 잘라냈다. 그것의 DNA 를 "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 정제했다.
AGAT_Mp 단편 및 선형화된 pEC-XK99E 를 "Ready-To-Go T4 DNA ligase" (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany) 를 사용하여 결찰시켰다. 결찰 산물을 "NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)" (New England Biolabs, Ipswich, USA) 내로 형질전환시키고, 25 ㎎/ℓ 카나마이신을 함유하는 LB 아가 상에서 세포를 성장시켰다. 적당한 클론을 제한 효소 소화 및 DNA 시퀀싱에 의해 식별했다. 결과적인 플라스미드를 pEC-XK99E_AGAT_Mp 로 명명했다.
실시예 6: 발현 플라스미드 pEC-XK99E_AGAT_Mp 내로의 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 유전자의 클로닝
플라스미드 pEC-XK99E_AGAT_Mp 를 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 를 사용하여 소화시키고, 말단 포스페이트를 "FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 를 사용하여 제거했다. 소화된 DNA 를 그 후 "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 정제했다.
클로닝 플라스미드 pEX-A258-AtGGT1_opt_RBS, pEX-A258-AtGGT2_opt_RBS 및 pEX-A258-AGT_Tl_opt_RBS 를 각각 BamHI 및 BsaI 로 소화시켰다. 절단된 플라스미드를 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 정제했다.
소화된 pEC-XK99E_AGAT_Mp 를 "Ready-To-Go T4 DNA ligase" (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany) 를 사용하여 각각의 소화된 클로닝 플라스미드와 결찰시켰다. 결찰 산물을 "NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)" (New England Biolabs, Ipswich, USA) 내로 형질전환시키고, 25 ㎎/ℓ 카나마이신을 함유하는 LB 아가 상에서 세포를 성장시켰다. 적당한 클론을 제한 효소 소화 및 DNA 시퀀싱에 의해 식별했다. 결과적인 플라스미드가 표 8 에 제시되어 있다. 그들은 강 IPTG 유도성 trc-프로모터의 제어 하에 오페론 유사 구조에서 AGAT_Mp 유전자 및 당해 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제를 제공한다.
표 8: 유전자 발현에 사용된 에스케리키아 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 플라스미드.
Figure pct00010
실시예 7: ATCC13032 에서 carAB 오페론의 상류에 sod 프로모터의 염색체 삽입
L-아르기닌의 생산을 개선하기 위해서, 강 sod-프로모터를 ATCC13032 의 게놈 내로 carAB 오페론의 상류에 삽입했다. 그러므로, 플라스미드 pK18mobsacB_Psod-carAB 를 다음과 같이 구축했다. pK18mobsacB (Schaefer, A. et al., Gene. 1994 Jul 22;145(1):69-73. doi: 10.1016/0378-1119(94)90324-7) 를 EcoRI + HindIII 를 사용하여 절단하고, 선형화된 벡터 DNA (5670 bps) 를 아가로스 겔로부터 잘라냈다. "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 DNA 를 추출했다.
인서트를 구축하기 위해서, 세 개의 DNA 단편을 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 에 의해 생성했다 (주형으로서 ATCC13032 의 게놈 DNA):
PsodcarAB-LA-F (SEQ ID NO:13) + PsodcarAB-LA-R (SEQ ID NO:14)
= 좌측 상동성 아암 (1025 bps)
PsodcarAB-F (SEQ ID NO:15) + PsodcarAB-R (SEQ ID NO:16)
= sod-프로모터 (250 bps)
PsodcarAB-RA-F SEQ ID NO:17) + PsodcarAB-RA-R (SEQ ID NO:18)
= 우측 상동성 아암 (944 bps)
DNA 산물을 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 정제했다. 선형화된 플라스미드 및 PCR 산물을 그 후 "NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit" (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520) 를 사용하여 조립했다. 적절한 플라스미드 클론을 제한 소화 및 DNA 시퀀싱에 의해 식별했다.
결과적인 플라스미드 pK18mobsacB_Psod-carAB 를 그 후 ATCC13032 내로 전기천공에 의해 형질전환시켰다. 염색체 통합 (제 1 재조합 이벤트로부터의 결과) 을 134 g/ℓ 소르비톨, 2.5 g/ℓ 효모 추출물 및 25 ㎎/ℓ 카나마이신이 보충된 BHI 아가 상에 플레이팅하여 선별했다. 아가 플레이트를 48 h 동안 33℃ 에서 인큐베이션했다.
개별 콜로니를 새로운 아가 플레이트 (25 ㎎/ℓ 카나마이신 함유) 상에 옮기고, 24 h 동안 33℃ 에서 인큐베이션했다. 이들 클론의 액체 배양물을 배플이 3 개인 100 ㎖ 에를렌마이어 플라스크에 함유된 10 ㎖ BHI 배지에서 24 h 동안 33℃ 에서 배양했다. 제 2 재조합 이벤트를 겪은 클론을 단리하기 위해서, 각각의 액체 배양물로부터 앨리쿼트를 취하고, 적합하게 희석하고, 10 % 사카로스가 보충된 BHI 아가 상에 플레이팅했다 (전형적으로 100 내지 200 ㎕). 이들 아가 플레이트를 48 h 동안 33℃ 에서 인큐베이션했다. 사카로스 함유 아가 플레이트 상에서 성장하는 콜로니를 그 후 카나마이신 민감도에 대해 조사했다. 이를 위해 이쑤시개를 사용하여 콜로니로부터 세포 물질을 제거하고, 그것을 25 ㎎/ℓ 카나마이신을 함유하는 BHI 아가 및 10 % 사카로스를 함유하는 BHI 아가 상에 옮겼다. 아가 플레이트를 60 h 동안 33℃ 에서 인큐베이션했다. 카나마이신에 민감하고 사카로스에 내성이 있는 것으로 입증된 클론을 PCR 및 DNA 시퀀싱에 의해 sod 프로모터의 적당한 통합에 대해 조사했다. 결과적인 균주를 ATCC13032_Psod-carAB 로 명명했다.
실시예 8: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_Psod-carAB 에서 유전자 aceB (NCgl2247) 의 염색체 결실.
글리옥실레이트에서 L-말레이트로의 대사 플럭스를 감소시키기 위해서, 말레이트 신타아제 (EC 2.3.3.9) 에 대해 코딩하는, 유전자 aceB (NCgl2247) 를 균주 ATCC13032_Psod-carAB 에서 결실시켰다.
그러므로, 플라스미드 pK18mobsacB_DaceB 를 다음과 같이 구축했다. 플라스미드 pK18mobsacB (Schaefer, 1994) 를 XbaI 를 사용하여 절단하고, 선형화된 벡터 DNA (5721 bps) 를 "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 정제했다.
인서트를 구축하기 위해서, 두 개의 DNA 단편을 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 에 의해 생성했다 (주형으로서 ATCC13032 의 게놈 DNA):
1f-aceB-D2_vec (SEQ ID NO:19) + 1r-aceB-D2_aceB (SEQ ID NO:20)
= 좌측 상동성 아암 (1065 bps)
2f-aceB-D2_aceB (SEQ ID NO:21) + 2r-aceB_D2_Vec (SEQ ID NO:22)
= 좌측 상동성 아암 (1080 bps)
DNA 산물을 "QIAquick PCR Purification Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 를 사용하여 정제했다. 선형화된 플라스미드 및 PCR 산물을 그 후 "NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit" (New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520) 를 사용하여 조립했다. 결과적인 결실 벡터를 pK18mobsacB_DaceB 로 명명했다. 그것을 제한 효소 소화 및 DNA 시퀀싱에 의해 확인했다.
aceB 유전자를 결실시키기 위해서, pK18mobsacB_DaceB 를 ATCC13032_Psod-carAB 내로 전기천공에 의해 형질전환시켰다. 염색체 통합 (제 1 재조합 이벤트로부터의 결과) 을 134 g/ℓ 소르비톨, 2.5 g/ℓ 효모 추출물 및 25 ㎎/ℓ 카나마이신이 보충된 BHI 아가 상에 플레이팅하여 선별했다. 아가 플레이트를 48 h 동안 33℃ 에서 인큐베이션했다.
개별 콜로니를 새로운 아가 플레이트 (25 ㎎/ℓ 카나마이신 함유) 상에 옮기고, 24 h 동안 33℃ 에서 인큐베이션했다. 이들 클론의 액체 배양물을 배플이 3 개인 100 ㎖ 에를렌마이어 플라스크에 함유된 10 ㎖ BHI 배지에서 24 h 동안 33℃ 에서 배양했다. 제 2 재조합 이벤트를 겪은 클론을 단리하기 위해서, 각각의 액체 배양물로부터 앨리쿼트를 취하고, 적합하게 희석하고, 10 % 사카로스가 보충된 BHI 아가 상에 플레이팅했다 (전형적으로 100 내지 200 ㎕). 이들 아가 플레이트를 48 h 동안 33℃ 에서 인큐베이션했다. 사카로스 함유 아가 플레이트 상에서 성장하는 콜로니를 그 후 카나마이신 민감도에 대해 조사했다. 이를 위해 이쑤시개를 사용하여 콜로니로부터 세포 물질을 제거하고, 그것을 25 ㎎/ℓ 카나마이신을 함유하는 BHI 아가 및 10 % 사카로스를 함유하는 BHI 아가 상에 옮겼다. 아가 플레이트를 60 h 동안 33℃ 에서 인큐베이션했다. 카나마이신에 민감하고 사카로스에 내성이 있는 것으로 입증된 클론을 PCR 및 DNA 시퀀싱에 의해 sod 프로모터의 적당한 통합에 대해 조사했다. 결과적인 균주를 ATCC13032_Psod-carAB_DaceB 로 명명했다.
표 9: 균주의 목록
Figure pct00011
실시예 9: 다양한 발현 플라스미드에 의한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 형질전환
하기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 전기천공에 의해 플라스미드로 형질전환시켰다 (표 10). 플라스미드 함유 세포를 25 ㎎/ℓ 카나마이신으로 선별했다.
· 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032: 통상적으로 사용되는 야생형 균주 (Kinoshita et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3): 193-205)
· 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_Psod-carAB: ATCC13032 에서 CarAB 의 상류에서 강 sod 프로모터의 염색체 통합으로 인해 L-아르기닌 생산 능력이 증가됨
· 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_Psod-carAB_DaceB: ATCC13032 에서 aceB 유전자의 염색체 결실로 인해 말레이트 신타아제의 활성이 감소되고, CarAB 의 상류에서 강 sod 프로모터의 염색체 통합으로 인해 L-아르기닌 생산 능력이 증가됨
표 10: 플라스미드-함유 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 목록
Figure pct00012
실시예 10: GAA 생산에 대한 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 활성의 영향.
GAA 생산에 대한 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 효소 활성의 영향을 평가하기 위해서, 균주 ATCC13032/pEC-XK99E, ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp, ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1, ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2, 및 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl 를 Wouter Duetz 시스템에서 배양하고, 결과적인 GAA 역가를 확인했다. 생산 배지 (PM) 는 40 g/ℓ D-글루코스 및 1.90 g/ℓ L-아르기닌을 함유했으나, 부가적 글라이신은 함유하지 않았다.
표 11: 1.90 g/ℓ L-아르기닌의 존재 하에서의 GAA 생산에 대한 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 효소 활성의 영향.
Figure pct00013
표 11 에 제시된 바와 같이, 균주 ATCC13032/pEC-XK99E 는 검출가능한 양의 GAA 을 생산하지 않았다.
균주 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp 는 효소 AGAT 활성을 제공하는 무레아 프로두센스로부터의 AGAT 에 대해 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 갖는다. 그것은 122 ㎎/ℓ 의 GAA 를 생산했다.
균주 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1, ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2, 및 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl 는 효소 AGAT 활성 및 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 효소 활성을 갖는다. 그들은 246 ㎎/ℓ, 255 ㎎/ℓ, 및 199 ㎎/ℓ 의 GAA 를 각각 생산했다.
본 발명자들은, 효소 AGAT 활성의 존재 하에서, 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 효소 활성이 GAA 생산을 개선한다는 결론을 내렸다.
실시예 11: GAA 생산에 대한 증가된 L-아르기닌 생산 능력과 조합된 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 활성의 영향.
GAA 생산에 대한 증가된 L-아르기닌 생산 능력과 조합된 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 활성의 영향을 평가하기 위해서, 균주 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1, ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2, ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl, ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1, ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2, 및 ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl 를 Wouter Duetz 시스템에서 배양하고, 결과적인 GAA 역가를 확인했다. 염색체 유전자 carA 및 carB 의 상류에 강 sod-프로모터의 삽입으로 인해, 마지막 세 개의 균주는 개선된 L-아르기닌 생산 능력을 갖는다. 생산 배지 (PM) 는 40 g/ℓ D-글루코스 및 1.90 g/ℓ L-아르기닌을 함유했으나, 부가적 글라이신은 함유하지 않았다.
표 12: 1.90 g/ℓ L-아르기닌의 존재 하에서의 GAA 생산에 대한 증가된 L-아르기닌 생산 능력과 조합된 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 활성의 영향.
Figure pct00014
균주 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1, ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2, 및 ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl 는 효소 AGAT 활성 및 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 효소 활성을 갖는다. 표 12 에 제시된 바와 같이, 그들은 246 ㎎/ℓ, 255 ㎎/ℓ, 및 199 ㎎/ℓ 의 GAA 를 각각 생산했다.
균주 ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1, ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2, 및 ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl 는 또한 효소 AGAT 활성 및 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 효소 활성을 갖는다. 게다가, 그들은 증가된 L-아르기닌 생산 능력을 갖는다. 이들 균주는 325 ㎎/ℓ, 322 ㎎/ℓ, 및 316 ㎎/ℓ 의 GAA 를 각각 생산했다.
본 발명자들은, 효소 AGAT 활성의 존재 하에서, 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 활성 및 증가된 L-아르기닌 생산 능력의 조합이 GAA 생산을 개선한다는 결론을 내렸다.
실시예 12: GAA 생산에 대한 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 활성, 감소된 말레이트 신타아제 활성, 및 증가된 L-아르기닌 생산 능력의 조합된 영향.
GAA 생산에 대한 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 활성, 감소된 말레이트 신타아제 활성, 및 증가된 L-아르기닌 생산 능력의 조합된 영향을 평가하기 위해서, 균주 ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1, ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2, ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl, ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1, ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2, 및 ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl 를 Wouter Duetz 시스템에서 배양하고, 결과적인 GAA 역가를 확인했다. aceB 유전자의 결실로 인해, 마지막 세 개의 균주는 감소된 말레이트 신타아제 활성을 갖는다. 생산 배지 (PM) 는 40 g/ℓ D-글루코스 및 1.90 g/ℓ L-아르기닌을 함유했으나, 부가적 글라이신은 함유하지 않았다.
표 13: 1.9 g/ℓ L-아르기닌의 존재 하에서의 GAA 생산에 대한 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 활성, 감소된 말레이트 신타아제 활성, 및 증가된 L-아르기닌 생산 능력의 조합된 영향.
Figure pct00015
균주 ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1, ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2, 및 ATCC13032_Psod-carAB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl 는 효소 AGAT 활성, 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 효소 활성, 및 증가된 L-아르기닌 생산 능력을 갖는다. 표 13 에 제시된 바와 같이, 이들 균주는 325 ㎎/ℓ, 322 ㎎/ℓ, 및 316 ㎎/ℓ 의 GAA 를 각각 생산했다.
균주 ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1, ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2, 및 ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl 는 또한 효소 AGAT 활성, 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 효소 활성, 및 증가된 L-아르기닌 생산 능력을 갖는다. 게다가, 그들은 감소된 말레이트 신타아제 효소 활성을 갖는다. 이들 균주는 362 ㎎/ℓ, 354 ㎎/ℓ, 및 331 ㎎/ℓ 의 GAA 를 각각 생산했다.
본 발명자들은 효소 AGAT 활성, 증가된 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제 활성, 감소된 말레이트 신타아제 활성, 및 증가된 L-아르기닌 생산 능력의 조합이 GAA 의 생산을 개선한다는 결론을 내렸다.
SEQUENCE LISTING <110> Evonik Operations GmbH <120> Method for the fermentative production of guanidinoacetic acid <130> 201900349 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2205 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (425)..(1870) <223> GGT1 <400> 1 ctcttcgtct ggaatctcca ccacattttt attctcttca aaaattatct gcttctattt 60 ttataattaa gcaagaacgg tcttcgtagc ataaaaacga gacacggata tagagatatc 120 gtgaattgac ttttgtctga caaatcctct tcgtcaattt cagtggctct gctgcttcct 180 ttgttgtgaa gccacataga ttagattgag gaatgatcca aactcatgtc atacacacat 240 ttgtaatctg ctacacaaaa tacttttaaa atcacacaca ctaatatttt aactctcccc 300 actctttgcc ttgcccttgg ctctagaacc gaacgtgact ctccagatag acttttggag 360 tcacaacatt gagtttgaag aggagggaag aagtgagcta gggattggtt cagagtgaac 420 ataa atg gct ctc aag gca tta gac tac gat act ctg aat gaa aac gtc 469 Met Ala Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Asp Thr Leu Asn Glu Asn Val 1 5 10 15 aag aag tgt cag tat gcc gta aga ggt gaa ctt tat ctc cga gct tct 517 Lys Lys Cys Gln Tyr Ala 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Arg Gly Gly Tyr Phe 290 295 300 Glu Met Thr Asn Leu Pro Pro Arg Val Val Glu Glu Ile Tyr Lys Val 305 310 315 320 Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Ser Ala Gln Ile Phe Met Gly 325 330 335 Leu Met Val Asn Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile Ser Tyr Asp Gln Phe 340 345 350 Ala Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu Ser Leu Arg Arg Arg Ala Arg 355 360 365 Leu Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Lys Asn Val Val Cys Asn Phe 370 375 380 Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Arg Leu Pro Thr Gly 385 390 395 400 Ala Leu Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly Lys Val Pro Asp Val Phe Tyr 405 410 415 Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val Pro Gly Ser 420 425 430 Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe His Leu Arg Thr Thr Ile Leu 435 440 445 Pro Ala Glu Asp Glu Met Pro Glu Ile Met Asp Ser Phe Lys Lys Phe 450 455 460 Asn Asp Glu Phe Met Thr Gln Tyr Asp Asn Asn Phe Gly Tyr Ser Lys 465 470 475 480 Met <210> 3 <211> 1560 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 3 ggtctcccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccgacgtc 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caaagaagta cagctggtca gcttccatac tgtctctaag ggttattggg gtgaatgtgg 960 ccagcgcggc ggctacttcg aaatgactaa cctcccccct cgcgtcgtgg aagagatcta 1020 taaggttgca tctattgctt tgtcgcccaa cgtatcggcc cagatcttta tgggactgat 1080 ggtaaacccc cctaaacctg gagacattag ctacgaccag ttcgcgcgtg aatctaaggg 1140 tatccttgaa tcccttcgtc gccgcgcgcg tctgatgact gacggattca attcatgtaa 1200 gaacgtagta tgcaacttca cggaaggcgc gatgtactct ttcccccaga tccgtcttcc 1260 aaccggtgca ctccaggctg ctaagcaggc gggaaaggtg cccgatgtgt tttattgtct 1320 caaattgttg gaggcgaccg gcatctccac tgttccaggc agcggctttg gacagaagga 1380 gggagttttt catctgcgta cgactatcct tcctgccgag gatgagatgc ctgaaattat 1440 ggattctttc aagaagttta acgacgagtt catgactcaa tatgacaata atttcggata 1500 ctccaaaatg taataaggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcactggcc gtcggagacc 1560 <210> 4 <211> 1817 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (148)..(1593) <223> GGT2 <400> 4 ataaaaaacc aatctttatg atcgactcaa taagtcaaat cttgttgtgt taagtgaaat 60 ctatagtagt gaaagggtct ccacttagct gtttgagggg aagtgaggaa tcattttgct 120 tttagctttg aaaagtaaat cctggaa atg tct ctc aag gcg tta gac tac gag 174 Met Ser Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Glu 1 5 tcc ttg aat gaa aac gtg aag aat tgt cag tat gca gtc aga ggt gaa 222 Ser Leu Asn Glu Asn Val Lys Asn Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu 10 15 20 25 ctt tat ctt cgt gct tct gag ctt cag aaa gaa ggc aaa aag att att 270 Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile 30 35 40 ttc aca aat gtt gga aac cct cat gct tta gga cag aaa cct ctg act 318 Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr 45 50 55 ttt cct cgt cag gtg gtt tct tta tgc caa gca cca ttt ctg tta gat 366 Phe Pro Arg Gln Val Val Ser Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp 60 65 70 gat cca aat gtt ggt atg ata ttc cca gca gat gct att gca aga gct 414 Asp Pro Asn Val Gly Met Ile Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala 75 80 85 aag cat tat ctt tcc ttg act tct ggt ggt ctt ggt gct tac agt gac 462 Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp 90 95 100 105 tca aga ggt ctt ccg gga gtt cgg aaa gaa gtc gct gag ttc att gaa 510 Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Glu 110 115 120 cgg cgt gat gga tat cca agc gat cca gaa ctc ata ttt cta act gat 558 Arg Arg Asp Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp 125 130 135 gga gcg agc aaa ggt gtg atg caa atc ttg aat tgt gtc ata cgc ggt 606 Gly Ala Ser Lys Gly Val Met Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly 140 145 150 cag aaa gac gga att ctg gtt cca gtt cca cag tat cca ctc tac tcg 654 Gln Lys Asp Gly Ile Leu Val Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser 155 160 165 gct act ata tct ctg tta ggt ggt act ctt gtt cct tac tat ctt gaa 702 Ala Thr Ile Ser Leu Leu Gly Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Glu 170 175 180 185 gag tct gaa aac tgg gga ctt gat gtt aac aac ctt cgc caa tct gtt 750 Glu Ser Glu Asn Trp Gly Leu Asp Val Asn Asn Leu Arg Gln Ser Val 190 195 200 gct caa gct cgc tct caa gga ata aca gta agg gca atg gtg att att 798 Ala Gln Ala Arg Ser Gln Gly Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile 205 210 215 aac ccc gga aac cca act ggc cag tgt ctt agc gaa gct aac ata aga 846 Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg 220 225 230 gag ata cta cgg ttc tgt tgt gat gag aga tta gtt ctt ctc gga gac 894 Glu Ile Leu Arg Phe Cys Cys Asp Glu Arg Leu Val Leu Leu Gly Asp 235 240 245 gaa gtg tat cag caa aat ata tac caa gat gaa cgt ccc ttt atc agt 942 Glu Val Tyr Gln Gln Asn Ile Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser 250 255 260 265 tcc aag aag gtt ttg atg gat atg gga gca ccg atc agc aag gaa gtt 990 Ser Lys Lys Val Leu Met Asp Met Gly Ala Pro Ile Ser Lys Glu Val 270 275 280 cag ctc ata tct ttc cac acc gtt tcc aaa gga tac tgg ggc gaa tgt 1038 Gln Leu Ile Ser Phe His Thr Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys 285 290 295 ggg caa cgg gga ggt tac ttt gag atg aca aat atc cct ccc agg acc 1086 Gly Gln Arg Gly Gly Tyr Phe Glu Met Thr Asn Ile Pro Pro Arg Thr 300 305 310 gtt gag gag ata tac aag gtg gcc tct ata gct ctc agc ccc aac gtc 1134 Val Glu Glu Ile Tyr Lys Val Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val 315 320 325 tct gcg cag ata ttt atg ggt tta atg gtt agc cca cca aag cct gga 1182 Ser Ala Gln Ile Phe Met Gly Leu Met Val Ser Pro Pro Lys Pro Gly 330 335 340 345 gac att tca tat gac caa ttc gtt cgt gag agc aag gga ata cta gaa 1230 Asp Ile Ser Tyr Asp Gln Phe Val Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu 350 355 360 tca ctg aga aga aga gca agg atg atg act gat gga ttc aac agc tgc 1278 Ser Leu Arg Arg Arg Ala Arg Met Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys 365 370 375 aaa aac gtc gtc tgt aat ttc aca gaa ggt gct atg tat tca ttc cct 1326 Lys Asn Val Val Cys Asn Phe Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro 380 385 390 caa ata aag ttg ccg tcg aaa gca atc caa gca gca aaa caa gcc gga 1374 Gln Ile Lys Leu Pro Ser Lys Ala Ile Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly 395 400 405 aaa gtc cct gac gtt ttc tac tgc ctt aag ctc tta gaa gcc aca gga 1422 Lys Val Pro Asp Val Phe Tyr Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly 410 415 420 425 atc tcc aca gtt cca ggc tct gga ttt gga caa aaa gaa ggg gtg ttt 1470 Ile Ser Thr Val Pro Gly Ser Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe 430 435 440 cat tta agg aca aca att ctg cca gca gaa gaa gaa atg cca gag att 1518 His Leu Arg Thr Thr Ile Leu Pro Ala Glu Glu Glu Met Pro Glu Ile 445 450 455 atg gac agt ttc aaa aag ttc aat gat gag ttt atg tct cag tac gct 1566 Met Asp Ser Phe Lys Lys Phe Asn Asp Glu Phe Met Ser Gln Tyr Ala 460 465 470 gat aac ttt ggt tac tcc aga atg tga aaaagaaagg acttagagtc 1613 Asp Asn Phe Gly Tyr Ser Arg Met 475 480 agagtcagag atcacttctt cttctttcac gacattatta ttgtctattc acactcttaa 1673 aaagcaataa gtactggtcc tactctgtgt caaactcttc ttggtgctct taaaaccttt 1733 gtatctattg ttaccaattt gtgtgactca cacacacaca cacacaaatc tctaatgttc 1793 aattatatgg taaatggttt attt 1817 <210> 5 <211> 481 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 5 Met Ser Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Glu Ser Leu Asn Glu Asn Val Lys 1 5 10 15 Asn Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu 20 25 30 Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro 35 40 45 His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe Pro Arg Gln Val Val Ser 50 55 60 Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp Asp Pro Asn Val Gly Met Ile 65 70 75 80 Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr 85 90 95 Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val 100 105 110 Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Glu Arg Arg Asp Gly Tyr Pro Ser 115 120 125 Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Lys Gly Val Met 130 135 140 Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly Gln Lys Asp Gly Ile Leu Val 145 150 155 160 Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Thr Ile Ser Leu Leu Gly 165 170 175 Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Glu Glu Ser Glu Asn Trp Gly Leu 180 185 190 Asp Val Asn Asn Leu Arg Gln Ser Val Ala Gln Ala Arg Ser Gln Gly 195 200 205 Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly 210 215 220 Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg Glu Ile Leu Arg Phe Cys Cys 225 230 235 240 Asp Glu Arg Leu Val Leu Leu Gly Asp Glu Val Tyr Gln Gln Asn Ile 245 250 255 Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Lys Val Leu Met Asp 260 265 270 Met Gly Ala Pro Ile Ser Lys Glu Val Gln Leu Ile Ser Phe His Thr 275 280 285 Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly Gln Arg Gly Gly Tyr Phe 290 295 300 Glu Met Thr Asn Ile Pro Pro Arg Thr Val Glu Glu Ile Tyr Lys Val 305 310 315 320 Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Ser Ala Gln Ile Phe Met Gly 325 330 335 Leu Met Val Ser Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile Ser Tyr Asp Gln Phe 340 345 350 Val Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu Ser Leu Arg Arg Arg Ala Arg 355 360 365 Met Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Lys Asn Val Val Cys Asn Phe 370 375 380 Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Lys Leu Pro Ser Lys 385 390 395 400 Ala Ile Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly Lys Val Pro Asp Val Phe Tyr 405 410 415 Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val Pro Gly Ser 420 425 430 Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe His Leu Arg Thr Thr Ile Leu 435 440 445 Pro Ala Glu Glu Glu Met Pro Glu Ile Met Asp Ser Phe Lys Lys Phe 450 455 460 Asn Asp Glu Phe Met Ser Gln Tyr Ala Asp Asn Phe Gly Tyr Ser Arg 465 470 475 480 Met <210> 6 <211> 1560 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 6 ggtctcccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccgacgtc aggaaaggag 60 aggattgatg tccctcaagg ctttggacta cgaatctttg aacgaaaacg ttaaaaattg 120 tcagtatgcg gtccggggtg aactctatct gcgtgcttcc gagttgcaaa aagagggtaa 180 aaaaatcatt tttactaacg tcggaaaccc acacgcattg ggacagaagc cacttacctt 240 tccacggcaa gttgtgtcgc tctgtcaggc tccttttttg ttggacgacc ccaacgtagg 300 tatgatcttt ccggcagatg ccatcgcccg ggcgaagcat tatttgtcac ttacctcggg 360 tggactcgga gcatattctg attcgcgggg actcccaggt gtacgtaaag aagtcgccga 420 gttcattgaa cgccgtgatg gctacccctc cgatccggaa ctcatttttc ttacggacgg 480 agcgtcgaaa ggagttatgc aaattctcaa ctgtgtgatt cgcggccaga aggatggtat 540 tctggtgcca gttccgcaat accctctgta ttccgcaact atttcgctcc tcggtggaac 600 gcttgtcccc tattatttgg aggagtccga gaattggggc ctcgacgtaa ataatctgcg 660 gcaatccgtt gctcaggccc ggtcgcaggg aattactgtt cgtgcgatgg tcatcatcaa 720 tcccggcaac ccgactggac aatgcctgtc cgaggctaac attcgcgaga ttctccgttt 780 ttgctgtgac gaacggttgg ttttgcttgg agatgaagtt tatcaacaaa atatttatca 840 ggacgagcgg ccattcatca gctcaaagaa ggtattgatg gatatgggcg ctccaattag 900 caaggaggtc cagcttatct catttcacac tgtttcgaag ggctactggg gcgaatgcgg 960 tcagcggggt ggttacttcg aaatgacgaa tatcccccca cgtaccgtgg aagagattta 1020 taaggttgcc tcgattgcac tttcgccaaa cgtatccgcg cagattttta tgggcctgat 1080 ggtatctccc ccaaagcccg gtgacatttc ctacgatcaa ttcgtgcggg aatcaaaagg 1140 aattcttgaa tcattgcgcc ggcgcgcccg tatgatgact gatggcttca atagctgcaa 1200 aaacgttgta tgcaacttta ccgagggtgc aatgtattct ttccctcaga ttaagctccc 1260 ttcgaaggct atccaggcgg cgaagcaagc gggaaaagtg ccagatgtct tttactgcct 1320 caaactgctg gaagcgaccg gaatctccac ggtcccgggc tctggattcg gccaaaagga 1380 aggagtattt catctccgga ctaccattct gccggccgag gaagaaatgc cagagatcat 1440 ggacagcttc aaaaaattca atgacgaatt tatgtcgcag tatgccgata acttcggcta 1500 ttcgcggatg taataaggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcactggcc gtcggagacc 1560 <210> 7 <211> 2406 <212> DNA <213> Thermococcus litoralis <220> <221> CDS <222> (196)..(1419) <223> AGT <400> 7 tctagaagca ctccccgtgg aggtgccttc ggatctttcc agagttctat ttcatagaat 60 ttctcaatca tcttaattcc attttccgga atttgtcgtg ttataaacac cttgggcttc 120 atggtatttc cccttctaag ataatggtca aaacgtataa atatctttat gaagattagt 180 taatggtgat gttga atg gat tac aca aaa tac cta gcc gga agg gcg aat 231 Met Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Ala Gly Arg Ala Asn 1 5 10 tgg att aag ggc tca gct ttg gct gat gtg atg aaa aag gct tca gaa 279 Trp Ile Lys Gly Ser Ala Leu Ala Asp Val Met Lys Lys Ala Ser Glu 15 20 25 ctc caa aag aaa ggg gta aag cta att tct ctc gca gct gga gat cca 327 Leu Gln Lys Lys Gly Val Lys Leu Ile Ser Leu Ala Ala Gly Asp Pro 30 35 40 gat ccg gag tta att cca aga gct gtt ctt ggg gaa ata gca aaa gaa 375 Asp Pro Glu Leu Ile Pro Arg Ala Val Leu Gly Glu Ile Ala Lys Glu 45 50 55 60 gtt ctt gaa aag gaa cca aaa tcc gtt atg tat act ccg gca aat gga 423 Val Leu Glu Lys Glu Pro Lys Ser Val Met Tyr Thr Pro Ala Asn Gly 65 70 75 atc ccg gag ctt agg gaa gag ctg gca gca ttc ttg aaa aaa tac gac 471 Ile Pro Glu Leu Arg Glu Glu Leu Ala Ala Phe Leu Lys Lys Tyr Asp 80 85 90 cat tta gaa gtt tct cca gaa aac att gtt att aca ata gga gga acg 519 His Leu Glu Val Ser Pro Glu Asn Ile Val Ile Thr Ile Gly Gly Thr 95 100 105 gga gca ttg gat ctt ctt gga agg gtt ttg ata gac cct gga gat gtc 567 Gly Ala Leu Asp Leu Leu Gly Arg Val Leu Ile Asp Pro Gly Asp Val 110 115 120 gtg ata aca gag aac cca tcg tac ata aac aca tta ttg gca ttt gaa 615 Val Ile Thr Glu Asn Pro Ser Tyr Ile Asn Thr Leu Leu Ala Phe Glu 125 130 135 140 cag ttg gga gcc aaa att gag ggg gtt cca gtt gat aac gat ggg atg 663 Gln Leu Gly Ala Lys Ile Glu Gly Val Pro Val Asp Asn Asp Gly Met 145 150 155 agg gtt gat ctg ttg gag gag aaa ata aag gag ctt aaa gct aaa gga 711 Arg Val Asp Leu Leu Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 160 165 170 cag aaa gtt aag ctg atc tac acc atc ccg act ggt cag aat cca atg 759 Gln Lys Val Lys Leu Ile Tyr Thr Ile Pro Thr Gly Gln Asn Pro Met 175 180 185 ggc gtc act atg agc atg gaa cgg aga aag gca cta ctt gag att gcc 807 Gly Val Thr Met Ser Met Glu Arg Arg Lys Ala Leu Leu Glu Ile Ala 190 195 200 tct aaa tac gac ctc cta ata att gag gac act gct tat aat ttc atg 855 Ser Lys Tyr Asp Leu Leu Ile Ile Glu Asp Thr Ala Tyr Asn Phe Met 205 210 215 220 aga tat gaa gga ggg gat ata gtc ccc tta aag gct ttg gac aat gaa 903 Arg Tyr Glu Gly Gly Asp Ile Val Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asn Glu 225 230 235 gga aga gtt atc gtg gcg gga acg ctc agc aaa gtc ctt gga aca gga 951 Gly Arg Val Ile Val Ala Gly Thr Leu Ser Lys Val Leu Gly Thr Gly 240 245 250 ttc aga att gga tgg ata ata gca gag gga gaa atc ctc aaa aaa gtt 999 Phe Arg Ile Gly Trp Ile Ile Ala Glu Gly Glu Ile Leu Lys Lys Val 255 260 265 ctc atg cag aaa cag cca att gac ttc tgt gct cca gct att tcc caa 1047 Leu Met Gln Lys Gln Pro Ile Asp Phe Cys Ala Pro Ala Ile Ser Gln 270 275 280 tac att gcc cta gaa tac tta aag agg ggc tat ttt gag aag tat cac 1095 Tyr Ile Ala Leu Glu Tyr Leu Lys Arg Gly Tyr Phe Glu Lys Tyr His 285 290 295 300 ttg gaa gga gca ctg ctc ggt tat aaa gag aag agg gac atc atg ctg 1143 Leu Glu Gly Ala Leu Leu Gly Tyr Lys Glu Lys Arg Asp Ile Met Leu 305 310 315 aag gct ctt gaa aat cac ttg cca aat gca gaa ttt aca aag cca ata 1191 Lys Ala Leu Glu Asn His Leu Pro Asn Ala Glu Phe Thr Lys Pro Ile 320 325 330 gcg gga atg ttt gtt atg ttt ttc ctt cca gag gga gca gat ggc atc 1239 Ala Gly Met Phe Val Met Phe Phe Leu Pro Glu Gly Ala Asp Gly Ile 335 340 345 tca ttt gcc aac gag ctc atg gaa agg gag gga gtt gtg gta gtt cca 1287 Ser Phe Ala Asn Glu Leu Met Glu Arg Glu Gly Val Val Val Val Pro 350 355 360 gga aag cct ttc tac aca gac gag tct gga aag aat gct ata agg ctt 1335 Gly Lys Pro Phe Tyr Thr Asp Glu Ser Gly Lys Asn Ala Ile Arg Leu 365 370 375 380 aac ttc tca agg cca agc aag gaa gaa att cca ata gga atc aag aaa 1383 Asn Phe Ser Arg Pro Ser Lys Glu Glu Ile Pro Ile Gly Ile Lys Lys 385 390 395 ctt gct aag ctt tat aag gaa aag ttt ggc gag tga attctttgtt 1429 Leu Ala Lys Leu Tyr Lys Glu Lys Phe Gly Glu 400 405 tttacatttt cttctgggcc atcacattct cgatggagag aaggttagtt tgtttttaat 1489 gcactcagaa aagttctttt tggtgcgggg gcggggattt gaaccccgga acccctacgg 1549 gacgggaccc tcaatcccgc gcctttgacc aggctcggca acccccgcaa gagcgccgtt 1609 tatttgtctt cttagtttgt ttataaattt ttctgtcccc tttaaccggg gcgtgtttat 1669 agtaaccttt attagggttt ttgctgaatt ctttcaggtg gttgtcgtga tccccagatg 1729 ggatcacaaa ctcaaagacc ctgaaagcgt ggcattcata atcctcgacg ttttagcaga 1789 cttcgaatca gaaggaaagc tgaagaacct gccaaaaatc caaaaaattt ccagtaaaaa 1849 caatactggc aatactcctc tttaaacaat actacaacct acccctcaga gacgcccagc 1909 actacggcag aaaattcttc ggagcaaaca ttcactactc aaccctccac aactgggaga 1969 aaaagctgaa cctcgaagaa ctgacaaacc acctcctgaa aaaactccag aaattaccct 2029 acgccagcac tcaagcagac tcaaccatta tcacaaataa aaaaaggaca gaatagaagt 2089 tcaggcaata acgagaatcc tgccgggttt actgtatccg gttgctgtga agatcacaac 2149 ttctgagaac gagctgattg aactcctgcc ggagggttct gggaattttt atgctgatgg 2209 ggcttatgat tcaaagaaag ttctgaacac tgtggtggaa aagggttatc ggccgattgt 2269 taagaaaact aagaaccctc caggtggttt tggtagtaag aagagagata gagtgttttc 2329 tgaagaagag tacaggcata ggaatcctca tgaggggttc tggggtgcgt ttacaacgtg 2389 gtttggcagt aggatcc 2406 <210> 8 <211> 407 <212> PRT <213> Thermococcus litoralis <400> 8 Met Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Ala Gly Arg Ala Asn Trp Ile Lys Gly 1 5 10 15 Ser Ala Leu Ala Asp Val Met Lys Lys Ala Ser Glu Leu Gln Lys Lys 20 25 30 Gly Val Lys Leu Ile Ser Leu Ala Ala Gly Asp Pro Asp Pro Glu Leu 35 40 45 Ile Pro Arg Ala Val Leu Gly Glu Ile Ala Lys Glu Val Leu Glu Lys 50 55 60 Glu Pro Lys Ser Val Met Tyr Thr Pro Ala Asn Gly Ile Pro Glu Leu 65 70 75 80 Arg Glu Glu Leu Ala Ala Phe Leu Lys Lys Tyr Asp His Leu Glu Val 85 90 95 Ser Pro Glu Asn Ile Val Ile Thr Ile Gly Gly Thr Gly Ala Leu Asp 100 105 110 Leu Leu Gly Arg Val Leu Ile Asp Pro Gly Asp Val Val Ile Thr Glu 115 120 125 Asn Pro Ser Tyr Ile Asn Thr Leu Leu Ala Phe Glu Gln Leu Gly Ala 130 135 140 Lys Ile Glu Gly Val Pro Val Asp Asn Asp Gly Met Arg Val Asp Leu 145 150 155 160 Leu Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Gln Lys Val Lys 165 170 175 Leu Ile Tyr Thr Ile Pro Thr Gly Gln Asn Pro Met Gly Val Thr Met 180 185 190 Ser Met Glu Arg Arg Lys Ala Leu Leu Glu Ile Ala Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Leu Leu Ile Ile Glu Asp Thr Ala Tyr Asn Phe Met Arg Tyr Glu Gly 210 215 220 Gly Asp Ile Val Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asn Glu Gly Arg Val Ile 225 230 235 240 Val Ala Gly Thr Leu Ser Lys Val Leu Gly Thr Gly Phe Arg Ile Gly 245 250 255 Trp Ile Ile Ala Glu Gly Glu Ile Leu Lys Lys Val Leu Met Gln Lys 260 265 270 Gln Pro Ile Asp Phe Cys Ala Pro Ala Ile Ser Gln Tyr Ile Ala Leu 275 280 285 Glu Tyr Leu Lys Arg Gly Tyr Phe Glu Lys Tyr His Leu Glu Gly Ala 290 295 300 Leu Leu Gly Tyr Lys Glu Lys Arg Asp Ile Met Leu Lys Ala Leu Glu 305 310 315 320 Asn His Leu Pro Asn Ala Glu Phe Thr Lys Pro Ile Ala Gly Met Phe 325 330 335 Val Met Phe Phe Leu Pro Glu Gly Ala Asp Gly Ile Ser Phe Ala Asn 340 345 350 Glu Leu Met Glu Arg Glu Gly Val Val Val Val Pro Gly Lys Pro Phe 355 360 365 Tyr Thr Asp Glu Ser Gly Lys Asn Ala Ile Arg Leu Asn Phe Ser Arg 370 375 380 Pro Ser Lys Glu Glu Ile Pro Ile Gly Ile Lys Lys Leu Ala Lys Leu 385 390 395 400 Tyr Lys Glu Lys Phe Gly Glu 405 <210> 9 <211> 1338 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 9 ggtctcccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccgacgtc aggaaaggag 60 aggattgatg gactatacca aatatcttgc gggccgggct aattggatta agggctctgc 120 actcgcggac gtaatgaaaa aagcatccga attgcagaaa aagggcgtca aacttatttc 180 gctcgccgcc ggtgatcctg accccgaact gattccccgt gcagtgttgg gcgagattgc 240 aaaggaggtc ctcgaaaaag aacctaagtc ggtaatgtac actcccgcca acggcattcc 300 ggagcttcgg gaggagttgg ccgcttttct caagaagtat gaccaccttg aagtgtctcc 360 tgagaacatc gtcatcacca ttggcggtac tggtgcactc gatctgcttg gacgtgtact 420 gatcgatcct ggcgacgtag tcatcacgga aaatccatcg tacattaaca ccctcctcgc 480 tttcgaacaa ctcggagcaa aaattgaggg agtaccggtg gataacgacg gcatgcgggt 540 tgaccttctg gaagagaaga tcaaagagtt gaaggctaag ggtcaaaaag tgaaactgat 600 ttatacgatt ccaaccggac aaaatccaat gggtgtaacg atgtcaatgg aacggcgtaa 660 ggcgttgctg gagatcgcct caaaatacga tttgctgatc attgaggaca ctgcgtacaa 720 cttcatgcgg tacgaaggtg gtgatattgt cccgctcaag gcgttggata atgagggacg 780 tgtgatcgtg gccggaaccc tttcaaaggt actcggcact ggttttcgta ttggctggat 840 tatcgccgaa ggcgagattt tgaagaaggt tctcatgcag aaacaaccta tcgatttctg 900 cgcgcccgcg atttcgcagt atattgcgct cgaatatctg aagcgtggat acttcgagaa 960 gtaccacctt gagggtgcat tgttgggata taaggagaaa cgcgacatca tgctgaaggc 1020 ccttgagaat catctcccga acgcagaatt caccaagccc atcgcgggta tgttcgtcat 1080 gttcttcctg ccagaaggtg cggacggcat ctcctttgcg aacgagctca tggagcgcga 1140 gggcgtagtc gttgtccccg gaaaaccttt ctacactgac gaatccggta aaaacgccat 1200 tcggctgaat ttctcccgcc cttcaaaaga agagattccc attggaatta aaaaacttgc 1260 taaactgtat aaagaaaaat tcggtgagta ataaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt 1320 cactggccgt cggagacc 1338 <210> 10 <211> 1146 <212> DNA <213> Moorea producens <220> <221> CDS <222> (1)..(1143) <400> 10 atg tcg gaa aaa att gtt aat tcc tgg aat gaa tgg gat gaa ttg gaa 48 Met Ser Glu Lys Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Glu 1 5 10 15 gaa atg gtg gta gga att gca gac tat gct agc ttt gaa cca aaa gaa 96 Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Phe Glu Pro Lys Glu 20 25 30 cca ggg aat cat ccg aaa tta aga aat caa aat tta gcg gaa atc att 144 Pro Gly Asn His Pro Lys Leu Arg Asn Gln Asn Leu Ala Glu Ile Ile 35 40 45 cct ttc ccc agt gga cct aaa gac cct aaa gtc ctt gaa aaa gct aat 192 Pro Phe Pro Ser Gly Pro Lys Asp Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Asn 50 55 60 gaa gaa tta aat gga ctg gct tat tta tta aaa gac cac gat gtg ata 240 Glu Glu Leu Asn Gly Leu Ala Tyr Leu Leu Lys Asp His Asp Val Ile 65 70 75 80 gta aga aga ccc gaa aaa att gat ttt act aaa tct cta aaa aca cct 288 Val Arg Arg Pro Glu Lys Ile Asp Phe Thr Lys Ser Leu Lys Thr Pro 85 90 95 tac ttt gaa gtt gca aat caa tac tgt gga gtc tgt cct cgg gat gtc 336 Tyr Phe Glu Val Ala Asn Gln Tyr Cys Gly Val Cys Pro Arg Asp Val 100 105 110 atg att acc ttt ggg aat gaa atc atg gaa gcg act atg tcg aag aga 384 Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Met Glu Ala Thr Met Ser Lys Arg 115 120 125 gct aga ttt ttt gaa tac tta cct tac cgg aaa ttg gtc tat gaa tat 432 Ala Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr 130 135 140 tgg aat aaa gac gag cat atg att tgg aat gct gcg cct aaa ccg act 480 Trp Asn Lys Asp Glu His Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr 145 150 155 160 atg cag gat agt atg tat cta gag aat ttc tgg gag ctg tct tta gaa 528 Met Gln Asp Ser Met Tyr Leu Glu Asn Phe Trp Glu Leu Ser Leu Glu 165 170 175 gaa cga ttt aag cgt atg cat gat ttt gaa ttt tgt att aca caa gat 576 Glu Arg Phe Lys Arg Met His Asp Phe Glu Phe Cys Ile Thr Gln Asp 180 185 190 gaa gta att ttt gat gcg gct gac tgt agc aga tta gga aag gat ata 624 Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Leu Gly Lys Asp Ile 195 200 205 tta gtt cag gaa tcg atg aca aca aat aga aca gga att cgg tgg tta 672 Leu Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Thr Gly Ile Arg Trp Leu 210 215 220 aaa aag cac cta gaa cca aga gga ttt cgg gtt cac cct gtt cat ttt 720 Lys Lys His Leu Glu Pro Arg Gly Phe Arg Val His Pro Val His Phe 225 230 235 240 ccc ctt gat ttt ttc ccc tca cac att gac tgt acg ttt gtt cct ttg 768 Pro Leu Asp Phe Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu 245 250 255 cga cca ggt ctt att ttg aca aac cct gaa aga cct ata cgg gaa gag 816 Arg Pro Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Glu Arg Pro Ile Arg Glu Glu 260 265 270 gag gag aag att ttt aaa gag aat ggc tgg gag ttg atc aca gtt cct 864 Glu Glu Lys Ile Phe Lys Glu Asn Gly Trp Glu Leu Ile Thr Val Pro 275 280 285 caa ccg act tgc tcg aat gat gaa atg cca atg ttt tgc cag tcc agt 912 Gln Pro Thr Cys Ser Asn Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser 290 295 300 aag tgg ttg tca atg aat gtt ctg agt ata tca ccg aca aag gtt atc 960 Lys Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Thr Lys Val Ile 305 310 315 320 tgt gag gaa aga gaa aaa cct ctc caa gaa ttg ttg gat aag cat gga 1008 Cys Glu Glu Arg Glu Lys Pro Leu Gln Glu Leu Leu Asp Lys His Gly 325 330 335 ttt gag gtt ttt cct tta ccc ttt aga cat gtc ttt gaa ttt ggg ggg 1056 Phe Glu Val Phe Pro Leu Pro Phe Arg His Val Phe Glu Phe Gly Gly 340 345 350 tct ttt cat tgt gca act tgg gat att cgc cga aaa ggt gag tgt gaa 1104 Ser Phe His Cys Ala Thr Trp Asp Ile Arg Arg Lys Gly Glu Cys Glu 355 360 365 gat tat tta cca aat tta aac tat caa ccg att tgt ggt taa 1146 Asp Tyr Leu Pro Asn Leu Asn Tyr Gln Pro Ile Cys Gly 370 375 380 <210> 11 <211> 381 <212> PRT <213> Moorea producens <400> 11 Met Ser Glu Lys Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Glu 1 5 10 15 Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Phe Glu Pro Lys Glu 20 25 30 Pro Gly Asn His Pro Lys Leu Arg Asn Gln Asn Leu Ala Glu Ile Ile 35 40 45 Pro Phe Pro Ser Gly Pro Lys Asp Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Asn 50 55 60 Glu Glu Leu Asn Gly Leu Ala Tyr Leu Leu Lys Asp His Asp Val Ile 65 70 75 80 Val Arg Arg Pro Glu Lys Ile Asp Phe Thr Lys Ser Leu Lys Thr Pro 85 90 95 Tyr Phe Glu Val Ala Asn Gln Tyr Cys Gly Val Cys Pro Arg Asp Val 100 105 110 Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Met Glu Ala Thr Met Ser Lys Arg 115 120 125 Ala Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr 130 135 140 Trp Asn Lys Asp Glu His Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr 145 150 155 160 Met Gln Asp Ser Met Tyr Leu Glu Asn Phe Trp Glu Leu Ser Leu Glu 165 170 175 Glu Arg Phe Lys Arg Met His Asp Phe Glu Phe Cys Ile Thr Gln Asp 180 185 190 Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Leu Gly Lys Asp Ile 195 200 205 Leu Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Thr Gly Ile Arg Trp Leu 210 215 220 Lys Lys His Leu Glu Pro Arg Gly Phe Arg Val His Pro Val His Phe 225 230 235 240 Pro Leu Asp Phe Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu 245 250 255 Arg Pro Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Glu Arg Pro Ile Arg Glu Glu 260 265 270 Glu Glu Lys Ile Phe Lys Glu Asn Gly Trp Glu Leu Ile Thr Val Pro 275 280 285 Gln Pro Thr Cys Ser Asn Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser 290 295 300 Lys Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Thr Lys Val Ile 305 310 315 320 Cys Glu Glu Arg Glu Lys Pro Leu Gln Glu Leu Leu Asp Lys His Gly 325 330 335 Phe Glu Val Phe Pro Leu Pro Phe Arg His Val Phe Glu Phe Gly Gly 340 345 350 Ser Phe His Cys Ala Thr Trp Asp Ile Arg Arg Lys Gly Glu Cys Glu 355 360 365 Asp Tyr Leu Pro Asn Leu Asn Tyr Gln Pro Ile Cys Gly 370 375 380 <210> 12 <211> 1248 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 12 cgtctctgtg gataactgag cggataagtt cctagtacgc gtgcgagcag gaagaacatg 60 agcgagaaaa ttgtgaacag ctggaatgaa tgggatgaac tggaagaaat ggttgttggt 120 attgcagatt atgcaagctt tgaaccgaaa gaaccgggta atcatccgaa actgcgtaat 180 cagaatctgg cagaaattat tccgtttccg agcggtccga aagatccgaa agttctggaa 240 aaagcaaatg aagaactgaa tggtctggcc tatctgctga aagatcatga tgttattgtt 300 cgccgtccgg aaaaaatcga ctttaccaaa agcctgaaaa ccccgtattt cgaagttgcc 360 aatcagtatt gtggtgtttg tccgcgtgat gttatgatta cctttggcaa cgaaattatg 420 gaagccacca tgagcaaacg tgcccgtttt tttgaatatc tgccgtatcg taaactggtg 480 tatgagtatt ggaacaaaga tgagcatatg atctggaatg cagcaccgaa accgaccatg 540 caggatagca tgtatctgga aaacttttgg gaactgagcc tggaagaacg ttttaaacgt 600 atgcacgatt ttgagttttg catcacccag gatgaagtga tttttgatgc agcagattgt 660 agccgtctgg gtaaagatat tctggttcaa gaaagcatga ccaccaatcg taccggtatt 720 cgttggctga aaaaacatct ggaaccgcgt ggttttcgtg ttcatccggt tcattttccg 780 ctggattttt ttccgagcca tattgattgt acctttgttc cgctgcgtcc gggtctgatt 840 ctgaccaatc cggaacgtcc gattcgtgaa gaagaagaga aaatcttcaa agagaatggc 900 tgggagctga ttaccgttcc gcagccgacc tgtagcaatg atgaaatgcc gatgttttgt 960 cagagcagca aatggctgag catgaatgtt ctgagcatta gcccgaccaa agttatttgt 1020 gaagaacgtg aaaaaccgct gcaagaactg ctggataaac atggttttga agtgtttccg 1080 ctgccgtttc gtcatgtttt tgaatttggt ggtagctttc attgtgccac ctgggatatt 1140 cgtcgtaaag gtgaatgtga agattatctg ccgaatctga attatcagcc gatttgtggt 1200 taataagacg tccgcgaggg ccgtgttgcc ggtttcttca gagagacg 1248 <210> 13 <211> 46 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 13 ggaaacagct atgacatgat tacgcggtta tcgcggaatc cgtatg 46 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 14 ttaagcgttt tgtgcaactc cgtct 25 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide <400> 15 agacggagtt 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Express. 2018 Apr 18;8(1):61. doi: 10.1186/s13568-018-0595-2 <400> 23 aggaaaggag aggattg 17 201900349A 3

Claims (28)

  1. L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제의 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제의 기능을 갖는 적어도 하나의 단백질을 포함하는 미생물.
  2. 제 1 항에 있어서, 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제의 기능을 갖는 적어도 하나의 단백질의 효소 활성이 야생형 미생물에서의 당해 효소 활성에 비해 증가된 미생물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 미생물이 야생형 미생물의 능력에 비해 증가된 L-아르기닌 생산 능력을 갖는 미생물.
  4. 제 3 항에 있어서, 미생물이 야생형 미생물에서의 당해 효소 활성에 비해 증가된 카르바모일포스페이트 신타아제의 기능을 갖는 효소의 활성을 갖는 미생물.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 미생물이 야생형 미생물에서의 당해 효소 활성에 비해 활성이 증가된 아르기니노숙시네이트 리아제의 기능을 갖는 효소를 추가로 포함하는 미생물.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 야생형 미생물에서의 당해 효소 활성에 비해 활성이 증가된 오르니틴 카르바모일트랜스페라아제의 기능을 갖는 효소를 추가로 포함하는 미생물.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 야생형 미생물에서의 당해 효소 활성에 비해 활성이 증가된 아르기니노숙시네이트 신테타아제의 기능을 갖는 효소를 추가로 포함하는 미생물.
  8. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소의 증가된 활성이 당해 효소를 코딩하는 유전자를 과발현시킴으로써 달성되는 미생물.
  9. 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 말레이트 신타아제의 기능을 갖는 단백질의 활성이 야생형 미생물에서의 당해 활성에 비해 감소된 미생물.
  10. 제 9 항에 있어서, 말레이트 신타아제의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 야생형 미생물에서의 당해 유전자의 발현에 비해 약화되거나 또는 말레이트 신타아제의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자가 결실된 미생물.
  11. 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌 오페론 (argCJBDFR) 이 과발현되는 미생물.
  12. 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 아르기닌 반응성 리프레서 단백질 ArgR 에 대해 코딩하는 argR 유전자의 발현이 야생형 미생물에서의 argR 유전자의 발현에 비해 약화되거나 또는 argR 유전자가 결실된 미생물.
  13. 제 3 항 내지 제 10 항 또는 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 글루타메이트 데히드로게나아제, 오르니틴 아세틸트랜스페라아제, 아세틸글루타메이트 키나아제, 아세틸글루타밀포스페이트 리덕타아제 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스페라아제에 대해 코딩하는 gdh, argJ, argB, argC 및/또는 argD 를 포함하는, L-아르기닌의 생합성 경로의 효소에 대해 코딩하는 유전자 중 적어도 하나 이상이 과발현되는 미생물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제의 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 유전자가 이종성인 미생물.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제의 기능을 갖는 단백질에 대해 코딩하는 유전자가 과발현되는 미생물.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, L-아르기닌:글라이신 아미디노트랜스페라아제의 기능을 갖는 단백질이 SEQ ID NO: 11 에 따른 아미노산 서열과 적어도 80 % 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 미생물.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 글리옥실레이트 아미노트랜스페라아제의 효소 활성을 갖는 단백질이 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 8 에 따른 아미노산 서열과 적어도 80 % 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 미생물.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae) 속 또는 슈도모나스 (Pseudomonas) 속에 속하는 미생물.
  19. 제 18 항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 인 미생물.
  20. 제 18 항에 있어서, 미생물이 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 인 미생물.
  21. 제 18 항에 있어서, 미생물이 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 인 미생물.
  22. 구아니디노 아세트산 (GAA) 의 발효적 생산 방법으로서, a) 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 미생물을 적합한 배지에서 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 b) 배지에 GAA 을 축적시켜 GAA 함유 발효 브로쓰를 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제 24 항에 있어서, GAA 함유 발효 브로쓰로부터 GAA 을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, GAA 함유 발효 브로쓰를 건조 및/또는 과립화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스페라아제의 활성을 갖는 효소에 대해 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 미생물.
  26. 제 25 항에 있어서, 구아니디노아세테이트 N-메틸트랜스페라아제의 활성을 갖는 효소에 대해 코딩하는 유전자가 과발현되는 미생물.
  27. 크레아틴의 발효적 생산 방법으로서, a) 제 25 항 또는 제 26 항에 정의된 바와 같은 미생물을 적합한 배지에서 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 b) 배지에 크레아틴을 축적시켜 크레아틴 함유 발효 브로쓰를 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 크레아틴 함유 발효 브로쓰로부터 크레아틴을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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