CN117355537A - 改善的通过氨基酸输出蛋白失活来生产胍基乙酸(gaa)的生物技术方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及被转化为能够产生胍基乙酸(GAA)的微生物，该微生物具有失活的氨基酸输出蛋白，并涉及使用这种微生物发酵生产GAA的方法。本发明还涉及用于发酵生产肌酸的方法。
Description
技术领域
本发明涉及被转化为能够生产胍基乙酸(GAA)的微生物，并涉及使用这种微生物发酵生产GAA的方法。本发明还涉及用于发酵生产肌酸的方法。
背景技术
GAA是用作动物饲料添加剂的有机化合物(WO2005120246A1/US2011257075A1)。GAA是肌酸的天然前体。因此，GAA的补充可以在生物体内实现肌酸的最佳供应。
本发明涉及使用工业原料(例如含有氨、铵盐和葡萄糖或糖的底物)作为起始材料通过发酵过程生产GAA的方法。在生物系统中，通过L-精氨酸：甘氨酸-脒基转移酶(AGAT；EC2.1.4.1)的催化作用，由作为起始原料的精氨酸和甘氨酸形成GAA和鸟氨酸，这是在肌酸生物合成中的第一步：
Guthmiller等人(J Biol Chem.1994Jul 1；269(26)：17556-60)通过在大肠杆菌(E.coli)中克隆和异源表达该酶已经表征了大鼠肾脏AGAT。Muenchhoff等人(FEBSJournal 277(2010)3844-3860)报道对来自原核生物的AGAT的首次表征，也是通过在大肠杆菌中克隆和异源表达该酶。为了通过全细胞催化剂由L-精氨酸和甘氨酸生产GAA，Zhang等人通过将来自不同物种(例如智人(Homo sapiens)、拟柱孢藻(Cylindrospermopsisraciborskii)、Moorea producens)的异源AGAT引入至大肠杆菌中，并通过将瓜氨酸合成模块(例如carAB、argF和argI的过表达)和精氨酸合成模块(例如argG、argH的过表达；aspA的引入)引入至大肠杆菌中，已经设计了在大肠杆菌中的重建的鸟氨酸循环(Yiwen Zhang，Hang Zhou，Yong Tao，and Baixue Lin，ACS Synth.Biol.2020，9，2066-2075)。
从文献中还已知的是，用于在微生物，特别是细菌中增加在GAA合成中的起始材料之一，即L-精氨酸的产量的几种方法。Park等人提供对用于L-精氨酸生产的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的代谢工程的综述(NATURE COMMUNICATIONS|DOI：10.1038/ncomms5618)。他们提出对已经生产L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株中的L-精氨酸生产菌(producer)的随机诱变和筛选，例如对ATCC 21831(Nakayama和Yoshida 1974，US3849250A)中的L-精氨酸生产菌的随机诱变和筛选，并且基于代谢全系统分析(system-wide analysis of metabolism)的逐步合理的代谢工程导致在整个菌株工程步骤中的L-精氨酸产量的逐渐提高。Yim等人(J Ind Microbiol Biotechnol(2011)38：1911-1920)能够表明，通过破坏谷氨酸棒杆菌中的染色体argR基因失活编码控制L-精氨酸生物合成途径的中央阻遏蛋白ArgR的基因argR导致改善的生产精氨酸的菌株。Ginesy等人(MicrobialCell Factories(2015)14：29)报道对大肠杆菌的成功改造，以用于增强的精氨酸生产。其中，他们提出了argR阻遏基因的缺失。
Kurahashi等人(EP1057893 A1)报道通过利用重组DNA技术增强L-精氨酸生物合成酶类来提高微生物的L-精氨酸生产能力的方法，例如通过利用属于棒杆菌属(genusCorynebacterium)或短杆菌属(genus Brevibacterium)的微生物，使该微生物携带包含载体DNA和DNA片段的重组DNA，该DNA片段含有衍生自属于埃希氏杆菌属(Escherichia)的微生物的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶的基因、N-乙酰谷氨酸-γ-半醛脱氢酶的基因、N-乙酰谷氨基激酶(glutamokinase)的基因和精氨基琥珀酸酶的基因。为了改善的L-精氨酸产量，作者进一步提出一种微生物，该微生物的细胞内谷氨酸脱氢酶(GDH)活性被增强并且该微生物具有L-精氨酸生产能力。
Suga等人(US7160705 B2)已经报道了使用基因重组菌株的方法，其中抑制精氨酸-生物合成操纵子argR的表达的基因是失活的。特别地，控制精氨酸操纵子的argR的缺失已被认为是精氨酸生产中的一个重要因素。在棒杆菌属的微生物中，涉及精氨酸生物合成的argCJBDFR基因是以操纵子的形式而构成的，并经受由细胞内精氨酸的反馈抑制(Sakanyan et al.，Microbiology，142：9-108，1996)，因此对它的高产率的L-精氨酸生产施加限制。精氨酸操纵子是由编码涉及L-精氨酸生物合成机制的酶的基因组成的操纵子，特别是，精氨酸操纵子由编码构成L-精氨酸生物合成的循环步骤的酶的基因组成。具体而言，精氨酸操纵子由N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)、谷氨酸N-乙酰转移酶(ArgJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)和精氨酸阻遏蛋白(ArgR)组成。这些酶涉及L-精氨酸生物合成的连续酶反应。
根据文献，氨基酸输出蛋白(exporter)LysE不仅催化L-赖氨酸的细胞输出，还催化Lv精氨酸和L-瓜氨酸的细胞输出。LysG激活基因lysE的转录，该基因lysE编码氨基酸输出蛋白LysE。LysG需要共诱导物，例如L-赖氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-组氨酸(Lubitzet al.(2016).“Roles of export genes cgmA and lysE for the production of L-arginine and L-citrulline by Corynebacterium glutamicum.”Appl MicrobiolBiotechnol 100(19)：8465-8474)。Lubitz等人使用谷氨酸棒杆菌菌株ARG2(Peters-Wendisch et al.(2014)Engineering biotin prototrophic Corynebacteriumglutamicum strains for amino acid，diamine and carotenoid production.JBiotechnol.doi：10.1016/j.jbiotec.2014.01.023)，其特征在于通过缺失失活argR基因组合基于质粒表达ArgB的反馈抗性等位基因(ArgBfbr)。对于这种携带全部两种修饰的菌株，作者描述在培养物的上清液中的L-精氨酸的积累。此外，Lubitz等人描述在这种菌株中，编码膜蛋白的基因lysE和基因cmg的失活导致精氨酸形成的减少。
Ginesy等人(M.Ginesy et al.，Microbiol Cell Factories(2015)14：29，DOI10.1186/s12934-015-0211-y)能够表明，通过精氨酸输出蛋白系统的过表达，可以提高用具有特别是缺失的argR阻遏基因的大肠杆菌生产菌株的精氨酸产量。
然而，为了获得相对高的在细胞中的L-精氨酸浓度，必须防止L-精氨酸输出。氨基酸输出蛋白LysE通过从细胞中有效地转运底物精氨酸，来抵消细胞内的精氨酸浓度，并降低底物可用性。此外，来自精氨酸生物合成的瓜氨酸通过活性LysE输出蛋白，也被分泌至培养基中。LysE受转录激活因子LysG调节(Bellmann，A.，et al.(2001).″Expressioncontrol and specificity of the basic amino acid exporter LysE ofCorynebacterium glutamicum.″Microbiology(Reading)147(Pt 7)：1765-1774)。
范文超公开通过非病原微生物，例如谷氨酸棒杆菌的发酵生产肌酸的方法(CN106065411 A)。该微生物具有以下生物转化功能：葡萄糖转化为L-谷氨酸；L-谷氨酸转化为N-乙酰-L-谷氨酸；N-乙酰-L-谷氨酸转化为N-乙酰-L-谷氨酸半醛；N-乙酰-L-谷氨酸半醛转化为N-乙酰-L-鸟氨酸；N-乙酰-L-鸟氨酸转化为L-鸟氨酸；L-鸟氨酸转化为L-瓜氨酸；L-瓜氨酸转化为精氨基琥珀酸；精氨基琥珀酸转化为L-精氨酸；L-精氨酸转化为胍基乙酸；和最后，胍基乙酸转化为肌酸。范文超提出，该微生物过表达选自以下的一种或多种酶：N-乙酰谷氨酸合酶、N-乙酰鸟氨酸-δ-氨基转移酶、N-乙酰鸟氨酸酶、鸟氨酸-氨甲酰基转移酶、精氨基琥珀酸合成酶、甘氨酸脒基转移酶(EC：2.1.4.1)和胍基乙酸N-甲基转移酶(EC：2.1.1.2)。该微生物优选地过表达甘氨酸氨基转移酶(L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶)和胍基乙酸N-甲基转移酶。
本发明所要解决的问题是提供经转化以能够生产胍基乙酸(GAA)的改善的微生物，和使用这种微生物发酵生产GAA的方法。
发明内容
该问题通过这样的微生物来解决，该微生物与野生型微生物的能力相比具有提高的提供L-精氨酸的能力，且包含至少一种编码具有L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白的基因，并且相比于在处于相同细胞周期状态的野生型微生物中的相应蛋白的活性，具有降低的具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白的活性。
这意味着，相比于在细胞周期期间的相同时间和环境下的野生型微生物中的相应蛋白的活性，在本发明的微生物中具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白在细胞周期期间的任何时间和环境下表现出人为设计的降低的活性。
具体实施方式
根据本发明的微生物优选地是非天然存在的基因改造的生物(GMO)。在GMO中，使用基因工程技术已经改变了遗传物质。优选地，使用基因工程技术已经引入了至少一个编码具有L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白的基因。优选地，使用基因工程技术也已经实现了与在野生型微生物中的相应蛋白的活性相比的降低的具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白的活性。
具有L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(AGAT)功能的蛋白属于脒基转移酶家族。脒基转移酶家族包含甘氨酸脒基转移酶(EC：2.1.4.1)和肌醇胺脒基转移酶(EC：2.1.4.2)，所述酶分别涉及肌酸和链霉素的生物合成。该家族还包括精氨酸脱亚胺酶类，EC：3.5.3.6。这些酶催化以下反应：精氨酸+H2O＜＝＞瓜氨酸+NH3。在这个家族中还发现链球菌(Streptococcus)抗肿瘤糖蛋白。具有L-精氨酸：甘氨酸-脒基转移酶(AGAT)活性的酶或蛋白还被描述具有属于PFAM家族：脒基转移酶(PF02274)(PFAM family：Amidinotransf(PF02274))的保守结构域(Marchler-Bauer A et al.(2017)，“CDD/SPARCLE：functionalclassification of proteins via subfamily domain architectures.”，Nucleic AcidsRes.45(D1)：D200-D203)，如也被描述在以下出版物中：Pissowotzki K et al.，Mol GenGenet 1991；231：113-123(PUBMED：1661369EPMC：1661369)；D′Hooghe I et al.，JBacteriol 1997；179：7403-7409(PUBMED：9393705EPMC：9393705)；Kanaoka M et al.，JpnJ Cancer Res 1987；78：1409-1414(PUBMED：3123442EPMC：3123442)。AGAT的具体实例是Mooreaproducens的AGAT、智人的AGAT、褐家鼠(Rattus norvegicus)的AGAT、巽他鼯猴(Galeopterus variegatus)的AGAT和拟柱孢藻的AGAT。
在本发明的上下文中，具有改善的提供L-精氨酸的能力的微生物是指生产或再循环超过其自身需要的L-精氨酸的微生物。这种特性可以通过对作为天然L-精氨酸生产菌的微生物或通过突变可能已获得生产L-精氨酸能力的微生物的选择来实现。这种生产L-精氨酸的微生物的实例是例如谷氨酸棒杆菌ATCC 21831或由Park等人(NATURECOMMUNICATIONS|DOI：10.1038/ncomms5618)或由Ginesy等人(Microbial Cell Factories(2015)14：29)公开的那些。
在本发明的一个实施方案中，在本发明的微生物中的编码精氨酸响应性阻遏蛋白ArgR的argR基因是减弱的或缺失的。
相比于在野生型微生物中的相应酶活性，在本发明的微生物中具有氨甲酰磷酸合酶(EC 6.3.4.16，例如CarAB)功能的酶的活性可被提高。这可以通过编码具有氨甲酰磷酸合酶功能的酶的基因的突变和/或过表达来实现。
此外，在根据本发明的微生物中，可过表达编码L-鸟氨酸和L-精氨酸生物合成途径的酶的基因中的至少一个或多个，所述基因包括编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的argF/argF2、编码精氨基琥珀酸合成酶的argG和编码精氨基琥珀酸裂解酶的argH。
另外地或可选择地，在本发明的微生物中可过表达编码L-鸟氨酸和L-精氨酸生物合成途径的酶的基因中的至少一个或多个，所述基因包括编码谷氨酸脱氢酶的gdh、编码鸟氨酸乙酰转移酶的argJ、编码乙酰谷氨酸激酶的argB、编码乙酰谷氨酰磷酸还原酶的argC和编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶的argD。
基因的过表达通常通过增加基因的拷贝数和/或，通过将基因与强启动子功能性连接，和/或通过增强核糖体结合位点，和/或通过起始密码子使用优化或整个基因的密码子使用优化，或包含上述所有方法中的选择的组合来实现。
在本发明的微生物中，编码具有L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白的基因可以是异源的。
根据本发明的微生物优选地是重组的，并且编码具有L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(AGAT)功能的蛋白的基因优选地是异源的。
异源基因是指该基因已被插入至天然不具有该基因的宿主生物体中。异源基因在宿主中的插入是通过重组DNA技术而进行的。已经经受重组DNA技术的微生物被称为转基因的、遗传修饰的或重组的。
在本发明的微生物中，编码具有L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白的基因可以另外是过表达的。基因的过表达通常通过增加基因的拷贝数，和/或通过将基因与强启动子功能性连接，和/或通过增强核糖体结合位点，和/或通过起始密码子的密码子使用优化或整个基因的密码子使用优化，或包含选择的组合或上述所有方法来实现。
由在本发明的微生物中的至少一个相应基因编码的具有L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(AGAT)功能的蛋白可以例如包含这样的的氨基酸序列，所述氨基酸序列与根据SEQ IDNO：13的氨基酸序列，即Moorea producens的AGAT(“AGAT_Mp”)至少是70％相同的，优选地是至少80％或至少90％相同的。在本发明的另外一个实施方案中，L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶的氨基酸序列与根据SEQ ID NO：13的氨基酸序列相同(参见，Database UniProt，2017年2月15日，“Glycine amidinotransferase”，XP055706853，EBI登录号UNIPROT：A0A1D8TKD3)。编码Moorea producens AGAT的野生型DNA序列是SEQ ID NO：12，对谷氨酸棒杆菌已经密码子优化的相应DNA序列是SEQ ID NO：14。
由在本发明的微生物中的至少一个相应基因编码的具有L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白可以例如还包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与拟柱孢藻ATW205(J.Muenchhoff et al.，FEBS Journal 277(2010)3844-3860)的AGAT的氨基酸序列至少是70％同源的，优选地是至少80％或至少90％相同的。
由在本发明的微生物中的至少一个相应基因编码的具有L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白可包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与巽他鼯猴的AGAT的氨基酸序列至少是70％同源的，优选地是至少80％或至少90％相同的。
在本发明的微生物中的具有L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白可包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类的AGAT(例如人类自身的AGAT(A.Humm，Biochem.J.(1997)322，771-776))或褐家鼠的AGAT的氨基酸序列至少是70％同源的，优选地是至少80％或至少90％同源的。
通常，根据本发明，基因的过表达是通过增加基因的拷贝数和/或通过对调节因子的增强而实现的，例如通过将基因与强启动子功能性连接，和/或通过增强核糖体结合位点，和/或通过起始密码子的密码子使用优化或整个基因的密码子使用优化。这种正向影响基因表达的调节因子的增强可以，例如，通过修饰结构基因上游的启动子序列以便于提高该启动子的有效性，或通过用更有效的启动子或所谓的强启动子完全替代所述启动子来实现。启动子位于基因的上游。启动子是由约40至50个碱基对组成的DNA序列，并且其构成RNA聚合酶全酶的结合位点和转录起点，由此可以影响受控的多核苷酸或基因的表达强度。通常，通过选择强启动子，例如通过用强的天然(最初分配给其它基因)启动子替换原始启动子，或通过将给定的天然启动子的某些区域(例如它的所谓的-10和-35区域)修饰为共有序列，可以实现在细菌中的基因的过表达或表达增加，例如由M.Patek等人(MicrobialBiotechnology 6(2013)，103-117)针对谷氨酸棒杆菌所教导的。“强”启动子的一个实例是超氧化物歧化酶(sod)启动子(“Psod”；Z.Wang et al.，Eng.Life Sci.2015，15，73-82)。“功能性连接”被理解为是指启动子与基因的顺序排列，其导致基因的转录。
遗传密码是简并的，这意味着某种氨基酸可以由许多不同的三联体来编码。术语“密码子使用”是指观察到某一生物体通常不会以相同的频率使用每个可能的针对某一氨基酸的密码子。相反，生物体通常会表现出对特定密码子的某些偏好，这意味着这些密码子更频繁地出现在生物体转录基因的编码序列中。如果在未来宿主生物体中必须表达某一对该未来宿主而言是外源的基因，即来自不同物种的基因，则所述基因的编码序列应根据所述未来宿主生物体的密码子使用来调整(即密码子使用优化)。
表1显示出在不同物种，即大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)中的涉及或有助于精氨酸生物合成的酶的不同名称。
在本发明的微生物中，编码具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白的基因可以是失活的或缺失的。此外，在本发明的微生物中，可以缺失编码所述编码具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白的基因的转录激活因子的基因。
本发明的微生物可属于棒杆菌属，优选地是谷氨酸棒杆菌，或属于肠杆菌属(genus Enterobacteriaceae)，优选地是大肠杆菌，或属于假单胞菌属，优选地是恶臭假单胞菌。
在谷氨酸棒杆菌中，编码具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白的基因是lysE，并且编码转录激活因子的基因是lysG。在大肠杆菌中，编码具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白的基因是argO(ybjE)。在恶臭假单胞菌中，具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白是lysE。
通过发酵生产胍基乙酸(GAA)的方法进一步解决上述问题，该方法包含以下步骤：a)在合适的条件下，在合适的培养基中培养如上限定的本发明的微生物，和b)在所述培养基中积累GAA以形成含有GAA的发酵液。
根据本发明的方法可进一步包括向培养基中添加甘氨酸和/或添加L-精氨酸和/或添加L-鸟氨酸。优选地，培养基以0.1至300g甘氨酸/L培养基的浓度补充甘氨酸，优选地0.82g甘氨酸/L培养基，和/或补充L-精氨酸以获得0.1至200g L-精氨酸/L培养基的浓度，优选地1.9g L-精氨酸/L培养基。
本发明的方法可进一步包括从所述发酵液中分离GAA的步骤。
根据本发明的方法可进一步包括干燥和/或粒化所述含有GAA的发酵液的步骤。
本发明进一步涉及如上限定的微生物，所述微生物进一步包含编码具有胍基乙酸N-甲基转移酶(EC：2.1.1.2)活性的酶的基因。优选地，编码具有胍基乙酸N-甲基转移酶活性的酶的基因是过表达的。
本发明还涉及用于发酵生产肌酸的方法，其包括以下步骤：a)在合适的条件下，在合适的培养基中培养根据本发明的微生物，所述微生物包含编码具有胍基乙酸N-甲基转移酶活性的酶的基因，和b)在所述培养基中积累肌酸以形成含有肌酸的发酵液。
优选地，该方法进一步包括从所述含有肌酸的发酵液中分离肌酸。通过等电点法和/或离子交换法，从发酵液中可以提取肌酸。可替代地，通过在水中的重结晶的方法，可以进一步纯化肌酸。
实施例
A)材料和方法
化学品
卡那链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的卡那霉素溶液购自Sigma Aldrich(圣路易斯，美国，货号K0254)。如果不是另有说明，则所有其它化学品均为从Merck(Darmstadt，德国)、SigmaAldrich(圣路易斯，美国)或Carl-Roth(Karlsruhe，德国)购买的分析纯。
细胞增殖培养
如果不是另有说明，则培养/孵育程序如下执行：
a.使用来自Merck(Darmstadt，德国；货号110285)的LB肉汤(MILLER)以在液体培养基中培养大肠杆菌菌株。在30℃和200rpm下，在来自Infors GmbH(Bottmingen瑞士)的Infors HT Multitron标准培养箱摇床中，孵育了液体培养物(10ml液体培养基/具有3个挡板的100ml锥形瓶)。
b.使用来自Merck(Darmstadt，德国，货号110283)的LB琼脂(MILLER)以用于在琼脂平板上的对大肠杆菌菌株的培养。该琼脂平板在来自VWR(Radnor，美国)的INCU-迷你培养箱中于30℃下孵育。
c.使用来自Merck(Darmstadt，德国，货号110493)的脑心浸液肉汤(BHI)以在液体培养基中培养谷氨酸棒杆菌菌株。在30℃和200rpm下，在来自Infors GmbH(Bottmingen，瑞士)的Infors HT Multitron标准培养箱摇床中孵育了液体培养物(10ml液体培养基/具有3个挡板的100ml锥形瓶)。
d.使用来自Merck(Darmstadt，德国，货号113825)的脑心琼脂(BHI-琼脂)以用于在琼脂平板上的对谷氨酸棒杆菌菌株的培养。该琼脂平板在来自Heraeus Instruments的带有温度控制器的培养箱(Hanau，德国)中在30℃下孵育。
e.对于培养电穿孔后的谷氨酸棒杆菌，BHI-琼脂(Merck，Darmstadt，德国，货号113825)补充有134g/L的山梨糖醇(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，德国)、2.5g/L的酵母提取物(Oxoid/ThermoFisher Scientific，Waltham，美国，货号LP0021)和25mg/L的卡那霉素。该琼脂平板在来自Heraeus Instruments的带有温度控制器的培养箱(Hanau，德国)中在30℃下孵育。
确定细菌悬液的光密度
a.使用来自EppendorfAG(Hamburg，德国)的生物光度计，在600nm(OD600)确定了在摇瓶培养物中的细菌悬液的光密度。
b.用来自Tecan Group AG(瑞士)的GENiosTM读板器，在660nm(OD660)下确定了在Wouter Duetz(WDS)微发酵系统(24孔板)中产生的细菌悬液的光密度。
离心
a.使用Eppendorf 5417R台式离心机，在1.5ml或2ml反应管(例如Eppendorf3810X)中，将具有2ml的最大体积的细菌悬液离心(在13,000rpm下5分钟)。
b.使用Eppendorf 5810R台式离心机，在15ml或50ml离心管(例如FalconTM 50mlConical Centrifuge Tubes)中，将具有50ml的最大体积的细菌悬液在4,000rpm下离心了10分钟。
DNA分离
根据制造商的说明，使用来自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep Kit(Hilden，德国，货号27106)从大肠杆菌细胞中分离了质粒DNA。
聚合酶链式反应(PCR)
使用了具有校对(高保真)聚合酶的PCR，以扩增用于Sanger测序或DNA组装的所需DNA片段。使用了非校对聚合酶试剂盒，以用于确定直接来自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌菌落的所需DNA片段的存在与否。
a.根据制造商的说明，使用了来自New England BioLabs Inc.的High-Fidelity DNA Polymerase Kit(Phusion Kit)(Ipswich，美国，货号M0530)，以用于对选定的DNA区域的模板校正扩增(见表格)。
表2：用来自New England BioLabs Inc.的High-Fidelity DNAPolymerase Kit的PCR的热循环条件
b.使用了来自Qiagen的Taq PCR Core Kit(Taq Kit)(Hilden，德国，货号201203)，以扩增所需的DNA片段，以便于证实它的存在。按照制造商的说明使用了该试剂盒(见下表)。
表3：用来自Qiagen的Taq PCR Core Kit(Taq Kit)的PCR的热循环条件
c.根据制造商的说明，使用了来自Takara Bio Inc的FastPCRMaster Mix(Sapphire Mix)(Takara Bio Europe S.A.S.，Saint-Germain-en-Laye，法国，货号RR350A/B)作为替代品，以确认在从大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌菌落中取得的细胞中的所需的DNA片段的存在(见表格)。
表4：用来自Takara Bio Inc.的Fast PCR Master Mix(SapphireMix)的PCR的热循环条件/>
d.所有寡核苷酸引物均由Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg，法国)使用由McBride and Caruthers(1983)描述的亚磷酰胺方法合成。
e.作为PCR模板，使用了适当稀释的经分离的质粒DNA的溶液，或适当稀释的从液体培养物中分离的总DNA的溶液，或在细菌菌落中含有的总DNA(菌落PCR)。对于所述菌落PCR，通过用牙签从在琼脂平板上的菌落中取出细胞材料并将该细胞材料直接放进至PCR反应管中而制备了模板。在来自SEVERINGmbH(Sundem，德国)的Mikrowave&Grill型微波炉中以800W加热了所述细胞材料10秒，然后向在所述PCR反应管中的所述模板加入了PCR试剂。
f.所有PCR反应均在Eppendorf AG(Hamburg，德国)的Mastercycler或Mastercycler nexus gradient型PCR循环仪中进行。
DNA的限制性内切酶消化
对于限制性内切酶消化，使用了“FastDigest限制性核酸内切酶(FD)”(ThermoFisher Scientific，Waltham，美国)或来自New England BioLabs Inc.(Ipswich，美国)的限制性核酸内切酶。根据制造商手册的说明进行了反应。
确定DNA片段的大小
a.小DNA片段(＜1000bp)的大小通常使用来自Qiagen(Hilden，德国)的QIAxcel通过自动毛细管电泳来确定。
b.如果需要分离DNA片段或如果DNA片段为＞1000bp，则DNA通过TAE琼脂糖凝胶电泳来分开，并用Nucleic Acid Gel Stain(Biotium，Inc.，Fremont，加拿大)来染色。使染色的DNA在302nm处可见。
PCR扩增产物和限制性片段的纯化
根据制造商的说明，使用来自Qiagen的QIAquick PCR Purification Kit(Hilden，德国；货号28106)净化了PCR扩增产物和限制性片段。DNA用30μL的10mM Tris*HCl(pH 8.5)来洗脱。
确定DNA浓度
使用来自PEQLAB Biotechnologie GmbH的NanoDrop SpectrophotometerND-1000(自2015年更名为VWR品牌(Erlangen，德国))，测量了DNA浓度。
组装克隆
使用购自New England BioLabs Inc.的“NEBuilder HiFi DNA AssemblyCloning Kit“(Ipswich，美国，货号E5520)，组装了质粒载体。将含有线性载体和至少一种DNA插入片段的反应混合物在50℃下孵育了60分钟。对每个转化实验使用了0.5μL的组装混合物。
大肠杆菌的化学转化
对于质粒克隆，化学感受态的“Stable Competent E.coli(HighEfficiency)”(New England BioLabs Inc.，Ipswich，美国，货号C3040)根据制造商的方案来转化。在补充有25mg/L的卡那霉素的LB琼脂上选择了成功转化的细胞。
谷氨酸棒杆菌的转化
如由Ruan等人(2015)所述，使用“Gene Pulser Xcell”(Bio-Rad LaboratoriesGmbH，Feldkirchen，德国)通过电穿孔法，进行了用质粒-DNA对谷氨酸棒杆菌的转化。电穿孔是在1.8kV的电压下在1mm电穿孔比色皿(Bio-Rad Laboratories GmbH，Feldkirchen，德国)中执行的，并且固定时间常数设定为5ms。在含有134g/l的山梨糖醇、2.5g/l的酵母提取物和25mg/l的卡那霉素的BHI-琼脂上选择了转化的细胞。
谷氨酸棒杆菌菌株
谷氨酸棒杆菌ATCC13032(DSM 20300，Kinoshita S，Udaka S，Shimono M.，J.Gen.Appl.Microbiol.1957；3(3)：193-205)，谷氨酸棒杆菌野生型菌株，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)或在DSMZ-德国微生物与细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)处是商购可获得的。
谷氨酸棒杆菌ATCC21831，一种生产L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株(US3849250A)，在美国典型培养物保藏中心(ATCC)处是商业可获得的。
确定核苷酸序列
使用Sanger等人(Proceedings of the National Academy of Sciences USA74，5463-5467，1977)的双脱氧链终止法，由Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg，德国)通过循环测序测定了DNA分子的核苷酸序列。使用了来自Scientific&Educational Software(Denver，美国)的Clonemanager Professional 9软件，以可视化和评估序列。
大肠杆菌菌株和谷氨酸棒杆菌菌株的甘油冻存菌
为了对大肠杆菌菌株和谷氨酸棒杆菌菌株的长时间储存，制备了甘油冻存菌(glycerol stock)。在补充有2g/l的葡萄糖的10ml的LB培养基中培养了选定的大肠杆菌克隆。在补充有2g/l的葡萄糖的10ml的双倍浓缩的BHI培养基中培养了选定的谷氨酸棒杆菌克隆。用于培养含有大肠杆菌菌株和谷氨酸棒杆菌菌株的质粒的培养基是补充有25mg/l的卡那霉素。将所述培养基装在具有3个挡板的100ml锥形瓶中。所述培养基接种有一环从菌落中取得的细胞。然后，在30℃和200rpm下将培养物孵育了18小时。在所述孵育时段后，向所述培养物中加入1.2ml的85％(v/v)无菌甘油。然后，将获得的含甘油的细胞悬液等分为2ml部分，并将其储存在-80℃下。
在摇瓶培养中的GAA生产
使用了在250ml带挡板的锥形瓶中的摇瓶培养，评估菌株的GAA产量。
在10ml的种子培养基(SM)中进行了菌株的预培养。将所述培养基装在100ml锥形瓶中。所述培养基接种有100μL的甘油冻存菌培养物，并在30℃和200rpm下孵育所述培养物24小时。所述种子培养基(SM)的组成如在表格中所示。向需要保留质粒的培养物中加入了卡那霉素。
表5：种子培养基(SM)
| 组分 | 浓度(g/l) |
| (NH4)2SO4 | 20 |
| 酵母提取物FM902(安琪酵母股份有限公司，中国湖北) | 20 |
| KH2PO4 | 1 |
| MgSO4*7H2O(Mg-Sulfat*7 H2O) | 0.5 |
| 葡萄糖 | 20 |
| 卡那霉素 | 0.025 |
| pH＝7.0 |
在所述孵育时段后，确定了预培养物的光密度OD600。从预培养物中取样了接种2.5ml的生产培养基(PM)至0.5的OD600所需的体积，对其离心(在8000g下1分钟)，并弃去了上清液。然后，将细胞重悬于200μL的生产培养基中。
通过用来自所述预培养物的各自100μL的重悬细胞接种24孔WDS-平板中的含有2.4mL的生产培养基(PM)的孔，形成了主要培养物。所述生产培养基(PM)的组成如在表格中所示。
表6：生产培养基(PM)
| 组分 | 浓度(g/l) |
| 酵母提取物FM902(安琪酵母股份有限公司，中国湖北) | 8 |
| (NH4)2SO4 | 40 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| MgSO4*7 H2O | 0.5 |
| FeSO4*7 H2O | 0.02 |
| MnSO4*H2O | 0.02 |
| 碳酸钙 | 20 |
| 葡萄糖 | 100 |
| 卡那霉素 | 0.025 |
| L-精氨酸 | 5mM |
| 甘氨酸 | 20 |
| pH＝7.2 |
在30℃和200rpm下，在来自Infors GmbH(Bottmingen，瑞士)的Infors HTMultitron标准孵育摇床中将所述主要培养物孵育了48小时，直到葡萄糖的完全消耗。用来自LifeScan(Johnson&JohnsonMedical GmbH，Neuss，德国)的OneTouch血糖仪，分析了在悬液中的葡萄糖浓度。
在培养后，将培养物悬液转移至50ml离心管(例如FalconTM 50ml ConicalCentrifuge Tubes)。将一部分培养物悬液适当地稀释，以测量OD660。将另一部分的培养物离心，并如下所述分析了在上清液中的GAA的浓度。
GAA的定量
用来自Agilent的分析系统分析了样品，该系统由HPLC“Infinity 1260”外加质量分析仪“Triple Quad 6420”(Agilent Technologies Inc.，Santa Clara，美国)组成。色谱分离在Atlantis HILIC硅胶柱，4，6X250mm，5μm(Waters Corporation，Milford，美国)上于35℃下进行。流动相A为含有10mM的甲酸铵和0.2％的甲酸的水。流动相B是90％乙腈和10％水的混合物，向该混合物中加入了10mM的甲酸铵。HPLC系统以100％B开始，然后以持续22分钟的线性梯度和0.6mL/分钟的恒定流速达到66％B。质量分析仪在ESI正离子化模式下运行。对于GAA的检测，通过使用MRM片段化[M+H]+118-76监测了m/z值。对于GAA的定量限(LOQ)固定为7ppm。
B)实验结果
实施例1：用于在基于谷氨酸棒杆菌的菌株中的基因lysE和基因lysG的染色体缺失的质粒pK19mobsacB-ΔlysEG的克隆
基因lyrE编码在谷氨酸棒杆菌中催化L-赖氨酸、L-精氨酸和L-瓜氨酸流出的输出蛋白。lysG的基因产物正向地调控lysE的表达。这两个基因彼此相邻，但转录方式不同。
为了使转运蛋白LysE和正向调节蛋白LysG失活，构建了质粒pK19mobsacB-ΔlysEG(SEQ ID NO：1)，如在Vrljic等人1996(Vrljic，M.，et al.(1996).“A new type oftransporter with a new type of cellular function：L-lysine export fromCorynebacterium glutamicum.”Mol Microbiol 22(5)：815-826；https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.1996.01527.x)中对pK18mobsacB-ΔlysEG所述。
实施例2：在ATCC13032中的基因argR的染色体缺失
为了改善细胞内的L-精氨酸形成和自L-鸟氨酸的L-精氨酸再循环，将编码控制L-精氨酸生物合成途径的中央阻遏蛋白ArgR的基因argR失活。
因此，如下构建了质粒pK18mobsacB_DargR。使用XbaI切割了质粒pK18mobsacB(Schafer，1994)，并且使用“QIAquick Gel Extraction Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)纯化了线性化的载体DNA(5721bp)。
为了构建插入片段，用下列引物对(ATCC13032的基因组DNA作为模板)通过PCR产生了两个DNA片段：
DargR_lf(SEQ ID NO：2)，+DargR_lr(SEQ ID NO：3)
＝左同源臂(983bp)
DargR_rf(SEQ ID NO：4)，+DargR_rr(SEQ ID NO：5)
＝左同源臂(984bp)
使用“QIAquick PCR Purification Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)纯化了产物DNA。
然后，使用“NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit”(New EnglandBioLabs Inc.，Ipswich，美国，货号E5520)组装了线性化的质粒和PCR产物。将得到的缺失载体命名为pK18mobsacB_DargR。它通过限制性内切酶消化和DNA测序得以证实。
为了使argR基因缺失，通过电穿孔将pK18mobsacB_DargR转化至ATCC13032中。染色体整合(由第一次重组事件产生)通过在补充有134g/l的山梨糖醇、2.5g/l的酵母提取物和25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上铺板来选择。在33℃下将琼脂平板孵育了48小时。
将单个菌落转移至新鲜的琼脂平板(具有25mg/L的卡那霉素)上，并在33℃下孵育24小时。在33℃下，在10mL的BHI培养基中将这些克隆的液体培养物培养24小时，该培养基被容纳在具有3个挡板的100mL锥形瓶中。为了分离已经遇到第二次重组事件的克隆，从每个液体培养物中取出等分试样，将其适当地稀释并在补充有10％的蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常为100至200μL)。将这些琼脂平板在33℃下孵育48小时。然后，检测在含有蔗糖的琼脂平板上生长的菌落的卡那霉素敏感性。为此，使用了牙签以从所述菌落中移除细胞材料，并将它转移至含有25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上和含有10％的蔗糖的BHI琼脂上。将琼脂平板在33℃下孵育60h。通过PCR和DNA测序检测了被证明对卡那霉素敏感的且对蔗糖有抗性的克隆。将得到的菌株命名为ATCC13032_DargR。
实施例3：ATCC13032_DargR中carAB操纵子上游的sod启动子的染色体插入
为了改善L-精氨酸的产量，将强的sod-启动子插入至ATCC13032_DargR的基因组中carAB操纵子的上游。因此，如下构建了质粒pK18mobsacB_Psod-carAB。使用EcoRI+HindIII切割了pK18mobsacB，并且从琼脂糖凝胶切割出了线性化的载体DNA(5670bp)。使用“QIAquick PCR Purification Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)，提取了DNA。
为了构建插入片段，用下列引物对(ATCC13032的基因组DNA作为模板)通过PCR产生了三个DNA片段：
PsodcarAB-LA-F(SEQ ID NO：4)+PsodcarAB-LA-R(SEQ ID NO：5)
＝左同源臂(1025bp)
PsodcarAB-F(SEQ ID NO：6)+PsodcarAB-R(SEQ ID NO：7)
＝sod-启动子(250bp)
PsodcarAB-RA-F(SEQ ID NO：8)+PsodcarAB-RA-R(SEQ ID NO：9)
＝右同源臂(944bp)
使用“QIAquick PCR Purification Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)纯化了产物DNA。然后，使用“NEBuilder HiFi DNAAssembly Cloning Kit”(New England BioLabsInc.，Ipswich，美国，货号E5520)组装了线性化的质粒和PCR产物。通过限制性消化和DNA测序识别了合适的质粒克隆。
然后，通过电穿孔将得到的质粒pK18mobsacB_Psod-carAB转化至ATCC13032_DargR中。染色体整合(由第一次重组事件产生)通过在补充有134g/l的山梨糖醇、2.5g/l的酵母提取物和25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上铺板来选择。将琼脂平板在33℃下孵育了48小时。
将单个菌落转移至新鲜的琼脂平板(具有25mg/L的卡那霉素)上，并在33℃下孵育24小时。将这些克隆的液体培养物在10mL的BHI培养基中于33℃下培养了24小时，该培养基被容纳在具有3个挡板的100mL锥形瓶中。为了分离已经遇到第二次重组事件的克隆，从每个液体培养物中取出了等分试样，将其适当地稀释并在补充有10％的蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常为100至200μL)。将这些琼脂平板在33℃下孵育了48小时。然后，检测了在含有蔗糖的琼脂平板上生长的菌落的卡那霉素敏感性。为此，使用了牙签以从所述菌落中移除细胞材料，并将它转移至含有25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上和含有10％的蔗糖的BHI琼脂上。将琼脂平板在33℃下孵育了60小时。通过PCR和对合适整合的sod启动子的DNA测序，检测了被证明对卡那霉素敏感的且对蔗糖有抗性的克隆。将得到的菌株命名为ATCC13032_DargR_Psod-carAB。
实施例4：ATCC13032_DargR_Psod-carAB中基因lysE和lysG的染色体缺失
基因lysE编码在谷氨酸棒杆菌中催化L-赖氨酸、L-精氨酸和L-瓜氨酸流出的输出蛋白。lysG的基因产物正向地调控lysE的表达。这两个基因彼此相邻，但转录方式不同。
为了使基因lysE和基因lysG基因缺失，通过电穿孔将pK19mobsacB_DlysEG(参见实施例1)转化至ATCC13032_DargR_Psod-carAB中。染色体整合(由第一次重组事件产生)通过在补充有134g/l的山梨糖醇、2.5g/l的酵母提取物和25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上铺板来选择。将琼脂平板在33℃下孵育了48小时。
将单个菌落转移至新鲜的琼脂平板(具有25mg/L的卡那霉素)上，并在33℃下孵育了24小时。将这些克隆的液体培养物在10mL的BHI培养基中于33℃下孵育了24小时，该培养基被容纳在具有3个挡板的100mL锥形瓶中。为了分离已经遇到第二次重组事件的克隆，从每个液体培养物中取出了等分试样，将其适当地稀释并在补充有10％的蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常为100至200μL)。将这些琼脂平板在33℃下孵育了48小时。然后，检测了在含有蔗糖的琼脂平板上生长的菌落的卡那霉素敏感性。为此，使用了牙签以从所述菌落中移除细胞材料，并将它转移至含有25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上和含有10％的蔗糖的BHI琼脂上。将琼脂平板在33℃下孵育了60小时。通过PCR和DNA测序检测了被证明对卡那霉素敏感的且对蔗糖有抗性的克隆。将得到的菌株命名为ATCC13032_DargR_Psod-carAB_DlysEG。
实施例5：对来自Moorea producens的编码L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(AGAT，EC2.1.4.1)的基因AGAT-Mp的克隆
Moorea producens是一种丝状蓝细菌。Moorea producens菌株PAL-8-15-08-1的基因组由Leao等人(Leao T，G，Korobeynikov A，Monroe EA，Podell S，GlukhovE，Allen EE，Gerwick WH，Gerwick L，Proc Natl Acad Sci U S A.2017 Mar 21；114(12)：3198-3203.doi：10.1073/pnas.1618556114；Genbank登录号CP017599.1)发表。它含有一个编码L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶(AGAT，EC 2.1.4.1；locus_tag BJP34_00300，如SEQ IDNO：10所示)的开放阅读框。SEQ ID NO：11显示出衍生的氨基酸序列(GenBank登录号WP_070390602)。
使用软件工具“Optimizer”(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，将该氨基酸序列翻译回至针对谷氨酸棒杆菌的密码子使用所优化的DNA序列(SEQ ID NO：14)。
该优化的基因中的由碱基对13-1142组成的片段在该片段的5’-端处扩增有BsmBI限制性位点。在它的3’-端处添加了第二终止-密码子、来自谷氨酸棒杆菌的lysS-终止子和BsmBI限制性位点。所得DNA序列(SEQ ID NO：12)从Invitrogen/Geneart(Thermo FisherScientific，Waltham，美国)订购以用于基因合成，并且将它作为具有氨苄青霉素抗性基因的克隆质粒的一部分来递送(命名为pMA-RQ_AGAT_Mp_opt)。
设计了第二DNA片段，该第二DNA片段由用于组装克隆的序列、启动子序列、核糖体结合位点、和所述优化的AGAT-Mp基因中的前81个核苷酸组成。该序列从Invitrogen/Geneart(Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国；SEQ ID NO：13)订购作为用于基因合成的线性DNA字符串(string)。
实施例6：对表达质粒pLIB_pBL1_AGAT-Mp的克隆
大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pLIB_pBL1具有来自pBL1的复制起点、pSC101复制起点、卡那霉素抗性基因和NotI限制性位点下游的BioBricks Terminator BBa_B1006(SEQ ID NO：14)。使用限制性核酸内切酶NotI消化它，并且用“QIAquick PCRPurification Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)纯化了DNA。
使用引物AGAT_f(SEQ ID NO：15)和AGAT_r(SEQ ID NO：16)以pMA-RQ_AGAT_Mp_opt作为模板，通过PCR扩增了DNA片段。使用“QIAquick PCR Purification Kit”(QiagenGmbH，Hilden，德国)纯化了PCR产物。
使用“NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit”(New England BioLabsInc.，Ipswich，美国，货号E5520)组装了线性化的质粒、含有DNA-字符串的启动子和PCR产物。将组装产物转化至“NEB Stable Competent E.coli(High Efficiency)”(New EnglandBiolabs，Ipswich，美国)中，并且在含有25mg/L的卡那霉素的LB琼脂上培养细胞。通过限制性消化和DNA测序识别了合适的质粒克隆。将得到的质粒命名为pLIB_pBL1_AGAT-Mp。
实施例7：在强组成型启动子Pg3的控制下的精氨酸生物合成基因argF、argG、argH的染色体表达
为了增强ArgF、ArgG和ArgH的活性，将相应基因的额外拷贝插入至基因组中。设计了合成操纵子，其由Pg3、argF、argG、argH和侧翼区域组成，以用于基因组整合(SEQ ID NO：17)。
该DNA序列从Invitrogen/Geneart(Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国)订购以用于基因合成，并且将它作为具有氨苄青霉素抗性基因的克隆质粒的一部分来递送(命名为pMA-RQ_argFGH)。
使用引物argFGH_f(SEQ ID NO：18)和argFGH_r(SEQ ID NO：19)以pMA-RQ_argFGH为模板，通过PCR扩增了DNA片段。使用“QIAquick PCR Purification Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)纯化了PCR-产物。
使用EcoRI+HindIII切割了质粒pK18mobsacB(A.et al.，Gene.1994Jul22；145(1)：69-73.doi：10.1016/0378-1119(94)90324-7)，并且从琼脂糖凝胶切割出了线性化的载体DNA(5670bp)。使用“QIAquick PCR Purification Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)提取了DNA。
使用“NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit”(New England BioLabsInc.，Ipswich，美国，货号E5520)组装了线性化的质粒和所述PCR-产物。将组装产物转化至“NEB Stable Competent E.coli(High Efficiency)”(New England Biolabs，Ipswich，美国)中，并在含有25mg/L的卡那霉素的LB琼脂上培养细胞。通过限制性消化和DNA测序识别了合适的质粒克隆。将得到的质粒命名为pK18_IBcg0054::Pg3-argFGH(SEQ ID NO：20)。
为了插入合成的操纵子，通过电穿孔将pK18_IBcg0054::Pg3-argFGH转化至ATCC13032_DargR中。染色体整合(由第一次重组事件产生)通过在补充有134g/l的山梨糖醇、2.5g/l的酵母提取物和25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上铺板来选择。将琼脂平板在33℃下孵育了48小时。将单个菌落转移至新鲜的琼脂平板(具有25mg/L的卡那霉素)上，并在33℃下孵育了24小时。在10mL的BHI培养基中，将这些克隆的液体培养物于33℃下培养了24小时，该培养基被容纳在具有3个挡板的100mL锥形瓶中。为了分离已经遇到第二次重组事件的克隆，从每个液体培养物中取出了等分试样，将其适当地稀释并在补充有10％的蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常为100至200μL)。将这些琼脂平板在33℃下孵育了48小时。然后，检测了在含有蔗糖的琼脂平板上生长的菌落的卡那霉素敏感性。为此，使用了牙签以从所述菌落中移除细胞材料，并将它转移至含有25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上和含有10％的蔗糖的BHI琼脂上。在33℃下将琼脂平板孵育了60小时。通过PCR和DNA测序检测了被证明对卡那霉素敏感的且对蔗糖有抗性的克隆。将得到的菌株命名为ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH。
实施例8：在ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH中的基因lysE和基因lysG的染色体缺失
基因lysE编码在谷氨酸棒杆菌中催化L-赖氨酸、L-精氨酸和L-瓜氨酸流出的输出蛋白。lysG的基因产物正向地调控lysE的表达。这两个基因彼此相邻，但转录方式不同。
为了缺失基因lysE和lysG基因，通过电穿孔将pK19mobsacB_DlysEG(参见实施例1)转化至ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH中。染色体整合(由第一次重组事件产生)通过在补充有134g/l的山梨糖醇、2.5g/l的酵母提取物和25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上铺板来选择。在33℃下将琼脂平板孵育了48小时。
将单个菌落转移至新鲜的琼脂平板(具有25mg/L的卡那霉素)上，并在33℃下孵育了24小时。在10mL的BHI培养基中，将这些克隆的液体培养物于33℃下培养了24小时，该培养基被容纳在具有3个挡板的100mL锥形瓶中。为了分离已经遇到第二次重组事件的克隆，从每个液体培养物中取出了等分试样，将其适当地稀释并在补充有10％的蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常为100至200μL)。将这些琼脂平板在33℃下孵育了48小时。然后，检测了在含有蔗糖的琼脂平板上生长的菌落的卡那霉素敏感性。为此，使用了牙签从所述菌落中移除细胞材料，并将它转移至含有25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上和含有10％的蔗糖的BHI琼脂上。在33℃下将琼脂平板孵育了60小时。通过PCR和DNA测序检测了被证明对卡那霉素敏感的且对蔗糖有抗性的克隆。将得到的菌株命名为ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH_DlysEG。
实施例9：在ATCC21831_DlysEG中的基因lysE和基因lysG的染色体缺失
基因lysE编码在谷氨酸棒杆菌中催化L-赖氨酸、L-精氨酸和L-瓜氨酸流出的输出蛋白。lysG的基因产物正向地调控lysE的表达。这两个基因彼此相邻，但转录方式不同。
为了缺失基因lysE和lysG基因，通过电穿孔将pK19mobsacB_DlysEG(参见实施例1)转化至ATCC21831_DlysEG中。染色体整合(由第一次重组事件产生)通过在补充有134g/l的山梨糖醇、2.5g/l的酵母提取物和25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上铺板来选择。在33℃下将琼脂平板孵育了48h。
将单个菌落转移至新鲜的琼脂平板(具有25mg/L的卡那霉素)上，并在33℃下孵育了24小时。在10mL的BHI培养基中将这些克隆的液体培养物于33℃下培养了24小时，该培养基被容纳在具有3个挡板的100mL锥形瓶中。为了分离已经遇到第二次重组事件的克隆，从每个液体培养物中取出了等分试样，将其适当地稀释并在补充有10％的蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常为100至200μL)。在33℃下将这些琼脂平板孵育了48小时。然后，检测了在含有蔗糖的琼脂平板上生长的菌落的卡那霉素敏感性。为此，使用了牙签以从所述菌落中移除细胞材料，并将它转移至含25mg/1的卡那霉素的BHI琼脂上和含有10％的蔗糖的BHI琼脂上。将琼脂平板在33℃下孵育了60小时。通过PCR检测了被证明对卡那霉素敏感的且对蔗糖有抗性的克隆。将得到的菌株命名为ATCC21831_DlysEG。
实施例10：用pLIB_pBL1_AGAT-MP对谷氨酸棒杆菌菌株的转化
用pLIB_pBL1_AGAT-Mp通过电穿孔转化了下列谷氨酸棒杆菌菌株，并含有质粒的细胞用25mg/L的卡那霉素来选择。得到的含有质粒的菌株显示在下表中。
表7：含质粒的谷氨酸棒状杆菌菌株的列表
·谷氨酸棒杆菌ATCC13032：常用的野生型菌株(Kinoshita et al.，J.Gen.Appl.Microbiol.1957；3(3)：193-205)
·ATCC13032_DargR_Psod-carAB：由于在ATCC13032中的降低的ArgR调节蛋白的活性和carAB上游的强sod启动子的整合，因此提高了生产L-精氨酸的能力。
·ATCC13032_DargR_Psod-carAB_DlysEG：由于在ATCC13032中的降低的ArgR调节蛋白的活性和carAB上游的强sod启动子的整合，因此提高了生产L-精氨酸的能力。降低了L-精氨酸的输出活性。
·ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH：由于在ATCC13032中的降低的ArgR调节蛋白的活性和在强启动子Pg3控制下的argFGH表达盒的基因组整合，因此提高了生产L-精氨酸的能力。
·ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH_DlysEG：由于在ATCC13032中的降低的ArgR调节蛋白的活性和在强启动子Pg3控制下的argFGH表达盒的基因组整合，因此提高了生产L-精氨酸的能力。降低了L-精氨酸的输出活性。
·谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21831(Park et al.，Nat Commun.2014 Aug 5；5：4618)由主要底物例如氨和葡萄糖合成L-精氨酸。谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21831_DlysEG(Park etal.，Nat Commun.2014 Aug 5；5：4618)由主要底物例如氨和葡萄糖合成L-精氨酸。降低了L-精氨酸输出活性。
实施例11：提高的生产L-精氨酸的能力和降低的精氨酸输出对GA产量的影响
为了评估提高的生产L-精氨酸的能力和降低的L-精氨酸输出对GAA产量的组合影响，在生产培养基中，在Wouter Duetz系统中培养了菌株ATCC13032、菌株ATCC13032/pLIB_pBL1、菌株ATCC13032/pLIB_pBL1_AGAT-Mp、菌株ATCC13032_DargR_Psod-carAB/pLIB_pBL1_AGAT-Mp、菌株ATCC13032_DargR_Psod-carAB_DlysEG/pLIB_pBL1_AGAT-Mp、菌株ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH/pLIB_pBL1_AGAT-Mp和菌株ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH_DlysEG/pLIB_pBL1_AGAT-Mp，并确定了得到的GAA效价(titer)。
表8：提高的生产L-精氨酸的能力和降低的精氨酸输出对GAA产量的组合影响
| 菌株 | GAA(g/L) |
| ATCC13032 | 0 |
| ATCC13032/pLIB_pBL1 | 0 |
| ATCC13032/pLIB_pBL1_AGAT-Mp | 1.1 |
| ATCC13032_DargR_Psod-carAB/pLIB_pBL1_AGAT-Mp | 2.2 |
| ATCC13032_DargR_Psod-carAB_DlysEG/pLIB_pBL1_AGAT-Mp | 2.3 |
| ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH/pLIB_pBL1_AGAT-Mp | 1.7 |
| ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH_DlysEG/pLIB_pBL1_AGAT-Mp | 1.9 |
如上表所示出，具有编码来自Mooreaproducens的AGAT的多核苷酸、缺失的argR基因和提高的carAB基因或argFGH基因的表达的ATCC13032_DargR_Psod-carAB/pLIB_pBL1_AGAT-Mp和ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH/pLIB_pBL1_AGAT-Mp，分别生产了2.2g/L或1.7g/L的GAA。
菌株ATCC13032_DargR_Psod-carAB_DlysEG/pLIB_pBL1_AGAT-Mp和ATCC13032_DargR_IBcg0054::Pg3-argFGH_DlysEG/pLIB_pBL1_AGAT-Mp还具有编码来自Mooreaproducens的AGAT的多核苷酸、缺失的argR基因和提高的carAB或argFGH基因的表达。此外，基因lysEG是失活的，并且它们已经降低了L-精氨酸的输出活性。这些菌株分别生产了2.3g/l和1.9g/l的GAA，这与没有减少的L-精氨酸输出的菌株相比是改善的。
得出结论，酶促AGAT活性、提高的提供L-精氨酸的能力和减少的L-精氨酸输出的组合改善GAA产量。
实施例12：使用L-精氨酸生产菌株ATCC21831，提高的生产L-精氨酸的能力和减少的精氨酸输出对GAA产量的影响
为了评估提高的生产L-精氨酸的能力和减少的L-精氨酸输出对GAA产量的组合影响，在生产培养基中，在Wouter Duetz系统中培养了菌株ATCC21831、菌株ATCC21831/pLIB_pBL1和菌株ATCC21831/pLIB_pBL1_AGAT-Mp，并且确定了得到的GAA效价。
表9：使用L-精氨酸生产菌株ATCC21831，提高的生产L-精氨酸的能力和减少的精氨酸输出对GAA产量的组合影响
| 菌株 | g/L |
| ATCC21831 | 0.0 |
| ATCC21831/pLIB_pBL1 | 0.0 |
| ATCC21831_DlysEG/pLIB_pBL1 | 0.0 |
| ATCC21831/pLIB_pBL1_AGAT-Mp | 5.0 |
| ATCC21831_DlysEG/pLIB_pBL1_AGAT-Mp | 5.6 |
如在表9中所示出，ATCC21831、ATCC21831/pLIB_pBL1和ATCC21831_DlysEG/pLIB_pBL1不能生产GAA。
菌株ATCC21831/pLIB_pBL1_AGAT-Mp也携带编码来自Moorea producens的AGAT的多核苷酸，并生产5.0g/L的GAA。此外，如在表8中所示出，菌株ATCC13032/pLIB_pBL1_AGAT-Mp携带编码来自Moorea producens的AGAT的多核苷酸，但不能提供额外的L-精氨酸，该菌株仅生产1.1g/L的GAA。菌株ATCC21831_DlysEG/pLIB_pBL1_AGAT-Mp也携带编码来自Moorea producens的AGAT的多核苷酸，但此外基因lysEG在该菌株中是失活的，并且它们具有降低的L-精氨酸输出活性。该菌株生产5.6g/L的GAA，这与没有减少的L-精氨酸输出的菌株相比是改善的。
得出结论，酶促AGAT活性、提高的提供L-精氨酸的能力和减少L-精氨酸输出的组合改善GAA产量。
序列概述：
SEQ ID NO：1：显示出编码质粒pK19mobsacB-DlysEG的DNA序列，该序列如Vrljicet.al 1996(Vrljic，M.，et al.(1996).“Anew type of transporter with a new typeof cellular function：L-lysine export from Corynebacterium glutamicum.”MolMicrobiol 22(5)：815-826)所述得以构建
SEQ ID NO：2：显示出编码引物DargR_lf的DNA序列
SEQ ID NO:3:显示出编码引物DargR_lr的DNA序列
SEQ ID NO:4:显示出编码引物DargR_rf的DNA序列
SEQ ID NO:5:显示出编码引物DargR_rr的DNA序列
SEQ ID NO:6:显示出编码引物PsodcarAB-LA-F的DNA序列
SEQ ID NO:7:显示出编码引物PsodcarAB-LA-R的DNA序列
SEQ ID NO:8:显示出编码引物PsodcarAB-F的DNA序列
SEQ ID NO:9:显示出编码引物PsodcarAB-R的DNA序列
SEQ ID NO:10:显示出编码引物PsodcarAB-RA-F的DNA序列
SEQ ID NO:11:显示出编码引物PsodcarAB-RA-R的DNA序列
SEQ ID NO:12:显示出编码L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT，EC 2.1.4.1，locus_tag BJP34_00300)的开放阅读框
SEQ ID NO:13:显示出衍生自SEQ ID NO:12的氨基酸序列(GenBank登录号WP_070390602)
SEQ ID NO:14:显示出编码来自Moorea producens的L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT，EC 2.1.4.1)的DNA序列，该序列针对谷氨酸棒杆菌的密码子使用得以优化。
SEQ ID NO:15:显示出编码来自Moorea producens的L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT，EC 2.1.4.1)的DNA序列，该序列针对衍生自SEQ ID NO:14的谷氨酸棒杆菌的密码子使用得以优化，该序列具有由碱基对13-1142组成的片段，该片段在它的5’-端处扩增有BsmBI限制性位点。此外，在它的3’-端处添加了第二个终止-密码子、来自谷氨酸棒杆菌的lysS-终止子和BsmBI限制性位点。
SEQ ID NO:16:由用于组装克隆的序列、启动子序列、核糖体结合位点、和优化的AGAT-Mp基因中的前81个核苷酸组成的DNA片段。
SEQ ID NO:17:显示出穿梭质粒pLIB_pBL1的DNA序列，其具有来自pBL1的复制起点、pSC101复制起点、卡那霉素抗性基因和NotI限制性位点下游的BioBricks终止子BBa_B1006
SEQ ID NO:18:显示出引物AGAT_f的DNA序列
SEQ ID NO:19:显示出引物AGAT_r的DNA序列
SEQ ID NO:20显示出引物Pg3-argFGH的DNA序列
SEQ ID NO:21显示出引物argFGH_f的DNA序列
SEQ ID NO:22显示出引物argFGH_r的DNA序列
SEQ ID NO:23显示出引物pK18_IBcg0054::Pg3-argFGH的DNA序列
Claims (21)
1.微生物，其与野生型微生物的能力相比具有提高的提供L-精氨酸的能力，且包含至少一种编码具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白的基因，并且相比于在处于相同细胞周期状态的野生型微生物中的相应蛋白的活性，具有降低的具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白的活性。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中精氨酸响应性阻遏蛋白ArgR的活性是减弱的或缺失的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的微生物，所述微生物与野生型微生物中的相应酶活性相比，具有增加的具有氨甲酰磷酸合酶功能的酶的活性。
4.根据权利要求3所述的微生物，其中所述增加的具有氨甲酰磷酸合酶功能的酶的活性是通过编码具有氨甲酰磷酸合酶功能的酶的基因的突变和/或过表达而实现的。
5.根据权利要求1至4中的任意一项所述的微生物，其中，编码L-鸟氨酸和L-精氨酸生物合成途径的酶的基因中的至少一个或多个是过表达的，所述基因包括：
编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的argF/argF2，
编码精氨基琥珀酸合成酶的argG，和
编码精氨基琥珀酸裂解酶的argH。
6.根据权利要求1至5中的任意一项所述的微生物，其中编码谷氨酸脱氢酶的基因gdh是过表达的。
7.根据前述权利要求中的任意一项所述的微生物，其中所述编码具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白的基因是异源的。
8.根据前述权利要求中的任意一项所述的微生物，其中所述具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白包含与根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少70％相同性的氨基酸序列。
9.根据前述权利要求中的任意一项所述的微生物，其中所述编码具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白的基因是失活的或缺失的。
10.根据前述权利要求中的任意一项所述的微生物，其中所述编码具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白的基因中的编码转录激活因子的基因是缺失的。
11.根据前述权利要求中的任意一项的微生物，其中，所述微生物属于棒杆菌属，属于肠杆菌属或属于假单胞菌属。
12.根据权利要求11所述的微生物，其中，所述微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，并且所述编码具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白的基因是lysE，并且所述编码转录激活因子的基因是lysG。
13.根据权利要求11所述的微生物，其中，所述微生物是大肠杆菌(Escherichiacoli)，并且所述编码具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白的基因是argO(ybjE)。
14.根据权利要求11所述的微生物，其中，所述微生物是恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，并且所述具有精氨酸输出蛋白功能的蛋白是lysE。
15.用于发酵生产胍基乙酸(GAA)的方法，其包括以下步骤：a)在合适的条件下，在合适的培养基中培养如在前述权利要求中的任意一项所限定的微生物，和b)在所述培养基中积累GAA以形成含有GAA的发酵液。
16.根据权利要求15所述的方法，所述方法进一步包括从所述含有GAA的发酵液中分离GAA。
17.根据权利要求15所述的方法，所述方法进一步包括干燥和/或粒化所述含有GAA的发酵液。
18.在根据权利要求1至14中的任意一项中所述的微生物，其进一步包含编码具有胍基乙酸N-甲基转移酶活性的酶的基因。
19.根据权利要求18所述的微生物，其中所述编码具有胍基乙酸N-甲基转移酶活性的酶的基因是过表达的。
20.用于发酵生产肌酸的方法，其包括以下步骤：a)在合适的条件下，在合适的培养基中培养权利要求18至19中的任意一项所限定的微生物，和b)在所述培养基中积累肌酸以形成含有肌酸的发酵液。
21.根据权利要求20所述的方法，所述方法进一步包括从所述含有肌酸的发酵液中分离肌酸。
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