TW202413629A - 藉由使用nadh-依賴性脫氫酶來製造胍基乙酸(gaa)的改良之生物技術方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於經轉形成能產生胍基乙酸(GAA)且包含為具有NADH-依賴性脫氫酶之功能的蛋白質編碼之至少一種基因的微生物,以及關於使用此微生物發酵性生產GAA之方法。本發明亦關於用於發酵性生產肌酸之方法。
Description
本發明係關於藉由使用NADH-依賴性脫氫酶來製造胍基乙酸(GAA)的改良之生物技術方法。
胍基乙酸(GAA)為用作動物飼料添加劑之無色結晶有機化合物(例如WO 2005120246 A1及
US 2011257075 A1)。GAA為肌酸之天然前驅物(例如Humm等人,Biochem. J. (1997) 322, 771-776)。因此,補充GAA能於生物中最佳地供應肌酸。
本發明係關於經轉形成能產生胍基乙酸(GAA)之微生物以及關於使用此微生物發酵性生產GAA之方法。本發明亦關於用於發酵性生產肌酸之方法。為進行發酵性程序,使用工業原料(例如氨、銨鹽及包含葡萄糖或糖之受質)作為起始材料。
於生物系統中,GAA及鳥胺酸係藉由L-精胺酸:甘胺酸-脒基轉移酶(AGAT;EC 2.1.4.1)之催化作用而由作為起始材料之精胺酸及甘胺酸形成。該反應亦為肌酸生物合成中之第一步驟。
Guthmiller等人(J Biol Chem. 1994 Jul 1; 269(26):17556-60)已藉由在大腸桿菌中選殖及異源地表現大鼠腎臟AGAT而表示該酶之特性分析。Muenchhoff等人(FEBS Journal 277 (2010) 3844-3860)亦藉由在大腸桿菌中選殖及異源地表現AGAT而報告由原核生物之該酶的第一特性分析。Sosio等人(Cell Chemical Biology 25, 540-549, 2018/5/17)闡明鏈黴菌屬中之25假優里黴素(pseudouridimycin)的生物合成路徑。其描述藉由PumN(L精胺酸:甘胺酸-脒基轉移酶(AGAT))催化之L-精胺酸與甘胺酸的反應形成GAA及L-鳥胺酸作為中間反應。
Fan Wenchao揭露藉由非病原微生物諸如麩胺酸棒狀桿菌之發酵來製造肌酸之方法(CN 106065411 A)。該微生物具有下列生物轉形功能:葡萄糖轉化成L-麩胺酸;L-麩胺酸轉化成N-乙醯基-L-麩胺酸;N-乙醯基-L-麩胺酸轉化成N-乙醯基-L-麩胺酸半醛;N-乙醯基-L-麩胺酸半醛轉化成N-乙醯基-L-鳥胺酸;N-乙醯基-L-鳥胺酸轉化成L-鳥胺酸;L-鳥胺酸轉化成L-瓜胺酸;L-瓜胺酸轉化成精胺基丁二酸;精胺基丁二酸轉化成L-精胺酸;L-精胺酸轉化成胍基乙酸;以及最後,胍基乙酸轉化成肌酸。Fan Wenchao提出,該微生物過度表現選自由下列所組成之群組中之一或多種酶:N-乙醯基麩胺酸酯合成酶、N-乙醯基鳥胺酸-δ-胺基轉移酶、N-乙醯基鳥胺酸酶、鳥胺酸-胺甲醯基轉移酶、精胺基丁二酸酯合成酶、甘胺酸脒基轉移酶(EC: 2.1.4.1)、及胍基乙酸酯N-甲基轉移酶(EC: 2.1.1.2)。該微生物較佳過度表現甘胺酸胺基轉移酶(L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶)及胍基乙酸酯N-甲基轉移酶。
CN 113481139 A描述藉由將來自肯塔基無枝菌酸菌(Amycolatopsis kentuckyensis)之外源性精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶引入野生型枯草桿菌之基因組以及藉由剔除該基因組中之gcvP及/或argI基因而建造產生GAA之重組枯草桿菌。
能產生胍基乙酸(GAA)之微生物係由Zhang等人發表(ACS Synth. Biol. 2020, 9, 2066-275)。其藉由將來自不同物種(例如,智人、柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii)、海洋藻青菌(Moorea producens))之異源AGAT引入大腸桿菌以及藉由將瓜胺酸合成模組(例如carAB、argF及argI之過度表現)及精胺酸合成模組(例如argG、argH之過度表現;引入aspA)引入大腸桿菌而設計大腸桿菌中之經重組鳥胺酸循環。
亦由文獻習知用於增加微生物(特別是細菌)中之GAA合成的起始材料中之一者(即,L-精胺酸)的製造之數種途徑。用於L-精胺酸製造之麩胺酸棒狀桿菌(C. glutamicum)之代謝工程的概述係由Park等人提供(NATURE COMMUNICATIONS|DOI: 10.1038/ncomms5618)。其提出隨機誘發突變及篩選已生產L-精胺酸之麩胺酸棒狀桿菌菌株例如ATCC 21831之L-精胺酸生產者(Nakayama and Yoshida 1974, US3849250 A)以及基於代謝之全系統分析的逐步合理代謝工程致使遍及該菌株工程步驟之L-精胺酸製造的逐漸增加。Yim等人(J Ind Microbiol Biotechnol (2011) 38:1911-1920)可顯示藉由在麩胺酸棒狀桿菌中打散染色體
argR基因(為控制L-精胺酸生物合成路徑之中央抑制蛋白質ArgR編碼的基因)而使
argR去活化造成改良之產精胺酸菌株。Ginesy等人(Microbial Cell Factories (2015) 14:29)報告用於增強精胺酸製造之大腸桿菌的成功工程。尤其是,其提出刪除
argR抑制基因。
Kurahashi等人(EP 1057893 A1)報告藉由利用重組DNA技術增強L-精胺酸生物合成酶,例如藉由利用屬於棒狀桿菌屬或短桿菌屬的微生物而提高微生物之L-精胺酸製造能力的方法,該屬於棒狀桿菌屬或短桿菌屬的微生物係製成以錨定重組DNA,包含載體DNA及包含衍生自屬於大腸桿菌屬之微生物的乙醯基鳥胺酸去乙醯酶、N-乙醯基麩胺酸-γ-半醛脫氫酶、N-乙醯基麩胺醯基激酶及精胺基丁二酸酶(argininosuccinase)之基因的DNA片段。為了改良L-精胺酸製造,本案作者進一步提出細胞內麩胺酸酯脫氫酶(GDH)之活性增強且具有L-精胺酸製造能力之微生物。
最後,Schneider及Jankowitsch(
WO 2021122400 A1;EP 3839051 A1)提出藉由使用具有來自不同物種(例如,智人、柱孢藻、海洋藻青菌)之異源AGAT且具有改良之製造L-精胺酸的能力之微生物進行發酵性生產GAA之方法,例如藉由L-精胺酸路徑的酶之提高表現,諸如具有胺甲醯磷酸酯合成酶之功能的酶之提高表現及與精胺酸操縱組相關的酶之提高表現。
至於GAA生物合成之第二起始材料,亦會希望增加甘胺酸之供應以改善天然具備為具有L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶(AGAT)之功能的蛋白質編碼之同源基因或已提供有為具有L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶(AGAT)之功能的蛋白質編碼之異源基因的微生物中之GAA生物合成。
Schneider及Jankowitsch(WO 2022008280 A1)揭露藉由使用包含至少一種為具有L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶(AGAT)之功能的蛋白質及至少一種具有乙醛酸酯胺基轉移酶之蛋白質編碼之基因的微生物來製造GAA之方法。藉由使用乙醛酸酯胺基轉移酶,顯示GAA之產率提高。
數種乙醛酸酯胺基轉移酶為已知以及其對於胺基供體之受質專一性不同(參照例如Kameya等人FEBS Journal 277(2010)1876-1885;Liepman and Olsen, Plant Physiol. Vol. 131, 2003, 215-227;Sakuraba等人,JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 2004, p. 5513-5518;Takada and Noguchi, Biochem. J. (1985) 231, 157-163)。由於大部分此等乙醛酸酯胺基轉移酶能使用不同胺基酸作為胺基供體,其經常以不同EC編號註釋。然而,所有此等胺基轉移酶的共通點係其使用乙醛酸酯作為受體分子,或於逆反應之情況中,使用甘胺酸作為供體分子。亦可顯示具備為具有AGAT之功能的蛋白質編碼的基因之微生物中具有使用乙醛酸酯作為受質之蘋果酸酯合成酶的功能之蛋白質的活性降低導致GAA產率提高(WO 2022008276 A1)。
乙醛酸酯胺基轉移酶之缺點在於胺基供體之胺基通常衍生自L-麩胺酸酯或直接使用L-麩胺酸酯。從2-氧戊二酸酯生物合成L-麩胺酸酯通常需要NADPH。於麩胺酸棒狀桿菌中,NADPH主要透過氧化戊醣磷酸酯路徑(PPP)及部分藉由NADP-依賴性異檸檬酸酯脫氫酶及NADP-依賴性蘋果酸酶而從NADP+再生(Marx, Achim, de Graaf, Albert A., Wiechert, Wolfgang, Lothar Eggeling and Sahm, Hermann (1996), Biotechnology and Bioengineering, Vol 49(2), 111-129, DOI: https://doi.org/10.1002/(SICI) 1097-0290(19960120)49:2 <111::AID-BIT1>3.0.CO;2-T)。此等NADPH-再生之路徑造成碳損失,從而降低最大理論產率。另一方面,已知增強NADPH供應之方法,例如:過度表現無機多磷酸酯/ATP-NAD激酶ppnK(Yin,
Lianghong; Zhao, Jianxun; Chen, Cheng; Hu, Xiaoqing; Wang, Xiaoyuan.(2014)Biotechnology and Bioprocess
Engineering: BBE; Dordrecht Bd. 19, Ed. 1: 132-142. DOI:10.1007/s12257-013-0416-z)或表現異源轉氫酶基因(Yamauchi Y, Hirasawa T, Nishii M, Furusawa C, Shimizu H.(2014) J Gen Appl Microbiol. 2014;60(3):112-8. doi: 10.2323/jgam.60.112. PMID: 25008167)。麩胺酸棒狀桿菌自然地以NADPH-依賴性麩胺酸酯脫氫酶固定NH
3(E. Kimura(2005)"L-Glutamate Production" in Handbook of Corynebacterium glutamicum, ISBN 9780849318214,
Published March 30, 2005 by CRC Press)。已知此亦可能採用異源NADH-依賴性麩胺酸酯脫氫酶(Marx, Achim, Eikmanns, Bernhard J., Sahm, Hermann, de Graaf, Albert A. and Lothar Eggeling (1999) Metabolic Engineering, Volume 1, Issue 1, 1999, Pages 35-48, ISSN 1096-7176, DOI: https://doi.org/10.1006/mben.1998.0106)。此減少NADPH需求。
NADH依賴性胺基酸脫氫酶(AaDH)藉由利用NADH作為輔受質(代替NADPH)催化酮酸成為L-胺基酸之胺化反應。其因此提供細胞中之銨的同化或異化之替代路徑。
由於大部分此等胺基酸脫氫酶能使用不同a-酮酸作為受質,其經常以不同EC編號註釋。然而,所有此等胺基酸脫氫酶的共通點係其使銨同化,或者,於逆反應之情況中,使銨異化。
不同胺基酸脫氫酶之實例如下:
反應EC 1.4.1.1:丙胺酸脫氫酶:
丙酮酸酯+NH3+NADH+H+<->L-丙胺酸+H2O+NAD+
反應EC 1.4.1.10:甘胺酸脫氫酶:
乙醛酸酯+NH3+NADH+H+<->甘胺酸+H2O+NAD+
反應EC 1.4.1.21:天門冬胺酸酯脫氫酶:
草乙酸酯+NH3+NADH+H+<->L-天門冬胺酸酯+H2O+ NAD+
文獻中已知數種NADH依賴性胺基酸脫氫酶(AaDH)蛋白質,其接受廣範圍之受質,因此經常能使數種不同酮酸胺化成對應之胺基酸。(Fernandes等人,Protein Engineering, Design & Selection, 2015, vol. 28 no. 2, pp. 29-35; Giffin等人,Journal of Bacteriology , 2012, vol. 194 no. 5, pp. 1045-1054; Phogosee等人,Archives of Microbiology, 2018 vol. 200 pp. 719-727; Schuffenhauer等人,1999, vol.171, pp 417-423; Vancura等人,Eur J
Biochem 1989, vol. 179, pp. 221-227, Yoshida and Freese, Biochim. Biophys. Acta, 1965, vol. 96, pp 248-262)。
因此,大部分NADH依賴性胺基酸脫氫酶對應於多種反應,因而有多種EC編號。表1顯示一些實例:
表1:NADH依賴性胺基酸脫氫酶(AaDH)蛋白質之實例
反應 | AaDH 結核分枝桿菌 | AaDH 包皮垢 分枝桿菌 | AaDH 枯草桿菌 | AaDH弗雷迪鏈黴菌 (Streptomyces fradiae) | AaDH鹽生隱杆藻(Aphanothece halophytica) |
丙酮酸酯->L-丙胺酸 | 是 (1) | 是 (3) | 是 (4) | 是 (5) | 是 (6) |
L-丙胺酸->丙酮酸酯 | 是 (1) | 是 (3) | 是 (4) | 是 (5) | 是 (6) |
乙醛酸酯->甘胺酸 | 是 (1) | 是 (3) | 是 (4) | no (5) | 是 (6) |
草乙酸酯->天門冬胺酸酯 | 是 (1) | 是 (3) | 無數據 | 是 (5) | 無數據 |
羥基丙酮酸酯->絲胺酸 | 是 (1) | 無數據 | 是 (4) | 無數據 | 無數據 |
丙酮醛->胺基丙酮 | 是 (1) | 無數據 | 無數據 | 無數據 | 無數據 |
4-羥基-2-氧丁酸酯->L-高絲胺酸 | 是 (2) | 無數據 | 無數據 | 無數據 | 無數據 |
2-氧丁酸酯->2-胺基丁酸酯 | 無數據 | 是 (3) | 是 (4) | 是(5) | 無數據 |
文獻 | (1) Giffin, 2012 (2) Fernandes, 2015 | (3) Schuffen-hauer, 1999 | (4) Yoshida, 1965 | (5) Vancura, 1989 | (6) Phogosee, 2019 |
因此,本發明的問題係提供經轉形成能製造胍基乙酸(GAA)的改良之微生物,特別是具有提供甘胺酸作為GAA生物合成之起始材料的改良之能力的微生物;以及使用此微生物發酵性生產GAA之方法。
該問題係藉由包含至少一種為具有L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶(AGAT,例如EC 2.1.4.1)之功能的蛋白質編碼之異源基因且包含至少一種為具有NADH-依賴性胺基酸脫氫酶之功能的蛋白質編碼之異源基因的微生物解決。
異源基因意指該基因已插入並非天然具有此基因之宿主生物。在宿主中插入異源基因係藉由重組DNA技術進行。經歷重組DNA技術之微生物稱之為基因轉殖、基因修飾或重組。異源蛋白質意指非天然存在於微生物中之蛋白質。
同源或內源基因意指包含基因之原本功能或基因之核苷酸序列的基因天然存在於微生物中或「原生」於微生物中。同源或原生蛋白質意指天然存在於微生物中之蛋白質。
具有L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶(AGAT)之功能的蛋白質屬於脒基轉移酶家族。脒基轉移酶家族包含甘胺酸脒基轉移酶(EC:2.1.4.1)及肌醇胺(inosamine)脒基轉移酶(EC:2.1.4.2),分別為涉及肌酸及鏈黴素生物合成之酶。此家族亦包含精胺酸脫亞胺酶(arginine deiminase),EC:3.5.3.6。此等酶催化反應:精胺酸+H2O <=>瓜胺酸+NH3。此家族中亦發現鏈球菌屬抗腫瘤醣蛋白。具有L-精胺酸:甘胺酸-脒基轉移酶(AGAT)活性之酶或蛋白質亦描述為具有屬於PFAM家族之保留結構域:Amidinotransf(PF02274)(Marchler-Bauer A等人(2017), "CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain architectures.", Nucleic Acids Res. 45(D1):D200-D203.),亦如下列出版品所述:Pissowotzki K等人,Mol Gen Genet 1991;231:113-123(PUBMED:
1661369 EPMC:1661369); D'Hooghe I等人,J Bacteriol 1997;179:7403-7409(PUBMED:9393705 EPMC:9393705);
Kanaoka M等人,Jpn J Cancer Res 1987;78:1409-1414 (PUBMED:3123442 EPMC:3123442)。
於根據本發明之微生物中,至少一種具有NADH-依賴性胺基酸脫氫酶之功能的蛋白質可為NADH依賴性胺基酸脫氫酶。其亦可選自由具有丙胺酸脫氫酶(EC 1.4.1.1)之功能、具有甘胺酸脫氫酶(EC 1.4.1.10)之功能、及具有天門冬胺酸酯脫氫酶(EC 1.4.1.21)之功能的蛋白質所組成之群組。
於本發明之微生物的另一實施態樣中,NADH-依賴性胺基酸脫氫酶之活性比野生型微生物中之個別活性提高。較佳地,相較於野生型微生物中之個別基因的表現,至少一種編碼具有NADH-依賴性胺基酸脫氫酶之酶活性的蛋白質之基因於本發明之微生物中係過度表現。
較佳地,本發明之微生物具有由L-鳥胺酸產生L-精胺酸之能力比野生型微生物之能力提高。
於本發明之上下文中,具有提高之產生L-精胺酸之能力的微生物意指微生物產生超過其自身需要的L-精胺酸。此種L-精胺酸產生微生物之實例為例如麩胺酸棒狀桿菌ATCC 21831或Park等人(NATURE
COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618)或Ginesy等人(Microbial Cell Factories (2015) 14:29)所揭露者。
於本發明之一具體實施例中,微生物具有相較於野生型微生物中之個別酶活性,具有胺甲醯磷酸酯合成酶(EC 6.3.4.16)之功能的酶之活性提高。
相較於野生型微生物中之個別酶活性,於根據本發明之微生物中具有精胺基丁二酸酯解離酶(E.C. 4.3.2.1)之功能的酶之活性可提高。
此外,於根據本發明之微生物中,相較於野生型微生物中之個別酶活性,具有鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(EC 2.1.3.3)之功能的酶之活性可提高。
於根據本發明之微生物中,相較於野生型微生物中之個別酶活性,具有精胺基丁二酸酯合成酶(E.C. 6.3.4.5)之功能的酶之活性可提高。
於根據本發明之微生物的另一實施態樣中,編碼具有蘋果酸酯合成酶之功能的蛋白質之基因的表現比野生型微生物中之個別基因的表現衰減,或編碼具有蘋果酸酯合成酶之功能的蛋白質之基因係被去活化或刪除。
於根據本發明之微生物的另一實施態樣中,為精胺酸反應抑制蛋白質ArgR編碼之
argR基因的表現比野生型微生物中之
argR基因的表現衰減。或者,
argR基因係被去活化或刪除。
於本發明之另一實施態樣中,以及視需要除上述修改以外,為L-精胺酸之生物合成路徑的酶編碼之基因中之至少一或多者,包含分別為麩胺酸酯脫氫酶、鳥胺酸乙醯基轉移酶、乙醯基麩胺酸酯激酶、乙醯基麩胺醯磷酸酯還原酶以及乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶編碼之
gdh、
argJ、
argB、
argC及/或
argD於根據本發明之微生物中係過度表現。
於根據本發明之微生物中,具有L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶之功能的蛋白質可為L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶(AGAT,即,EC 2.1.4.1)。
於本發明之微生物中,為具有L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶之功能的蛋白質編碼之基因可進一步過度表現。
本發明之微生物中具有L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶(AGAT)之功能的蛋白質可包含與根據SEQ ID NO: 2之胺基酸序列至少80%相同、較佳為至少90%相同的胺基酸序列。於本發明之另一實施態樣中,L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶之胺基酸序列係與根據SEQ ID NO: 2之胺基酸序列相同。
於本發明之一具體實施例中,具有NADH-依賴性胺基酸脫氫酶之功能的蛋白質包含與根據SEQ ID NO: 6、根據SEQ ID NO: 9、根據SEQ ID NO: 12、根據SEQ ID NO: 15或根據SEQ ID NO: 18之胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列。
本發明之微生物可屬於棒狀桿菌屬,較佳為麩胺酸棒狀桿菌(C. glutamicum),或屬於腸桿菌屬,較佳為大腸桿菌(E. coli),或屬於假單胞菌屬,較佳為戀臭假單胞菌(P. putida)。
通常,相較於野生型微生物中之個別活性,於微生物、特別是於本發明之微生物中之蛋白質的酶活性提高可例如藉由蛋白質之突變,特別是藉由給予蛋白質抗回饋性(例如,抗酶催化反應之產物)的突變,或藉由使編碼具有酶活性之蛋白質的基因相較於野生型微生物中之個別基因的表現過度表現而獲致。
基因之過度表現通常係藉由增加基因之複製數及/或藉由功能性連接基因與強啟動子及/或藉由增強核糖體結合位及/或藉由起始密碼子或整體基因之密碼子使用率最佳化或包含上述所有方法之精選的組合而獲致。
相較於野生型微生物之個別活性,基因於微生物中,特別是於本發明之微生物中的過度表現可藉由增加基因之複製數及/或藉由調節因子之增強,例如藉由功能性連接基因與強啟動子及/或藉由增強核糖體結合位及/或藉由起始密碼子或整體基因之密碼子使用率最佳化而獲致。正向地影響基因表現之此等調節因子之增強可例如藉由修改結構基因上游之啟動子序列以提高啟動子之有效性,或藉由以更有效或所謂強啟動子完全置換該啟動子而獲致。啟動子係位於基因之上游。啟動子為由約40至50對鹼基對組成之DNA序列,且其構成RNA聚合酶全酶及轉錄起始點之結合位,因而可影響受控制多核苷酸或基因之表現的強度。通常,可藉由選擇強啟動子,例如藉由以強且原生(最初分配給其他基因)之啟動子置換原來的啟動子,或藉由將給定之原生啟動子的某些區(例如,所謂-10及-35區)朝共通序列修改,例如,由M. Patek等人(Microbial Biotechnology 6 (2013), 103-117)針對麩胺酸棒狀桿菌所教示,以獲致於細菌中之基因的過度表現或表現提高。「強」啟動子之實例為超氧化物歧化酶(sod)啟動子(「Psod」;Z. Wang等人,Eng. Life Sci. 2015, 15, 73-82)。「官能性連接」應理解為意指具有基因之啟動子的循序排列,其導致基因之轉錄。
基因編碼係簡併,其意指某胺基酸可由一些不同的三聯體編碼。術語密碼子使用率係指某生物通常不會使用具有相同頻率之某胺基酸的每一可能密碼子之觀察。而是,生物將通常顯示對於特定密碼子之某些偏好,意指該等密碼子於生物之轉錄基因的編碼序列中更常被發現。於對其未來宿主而言為外來(即,來自不同物種)之某基因應於未來宿主生物中表現,該基因之編碼序列則應經調整至該未來宿主生物之密碼子使用率(即,密碼子使用率最佳化)。
上述問題係藉由用於發酵性生產胍基乙酸(GAA)之方法而進一步解決,該方法包含以下步驟:a)於適宜的培養基中在適宜的條件下培養前文界定之本發明之微生物,以及b)在該培養基中累積GAA以形成包含GAA之發酵液。
本發明之方法可進一步包含從發酵液單離GAA之步驟。
本發明進一步關於前文界定之微生物,其進一步包含為具有胍基乙酸酯N-甲基轉移酶(EC: 2.1.1.2)之活性的酶編碼之基因。較佳地,為具有胍基乙酸酯N-甲基轉移酶之活性的酶編碼的基因係過度表現。
本發明亦關於用於發酵性生產肌酸之方法,其包含以下步驟:a)於適宜的培養基中在適宜的條件下培養根據本發明之包含為具有胍基乙酸酯N-甲基轉移酶之活性的酶編碼之基因的微生物,以及b)在該培養基中累積肌酸以形成包含肌酸之發酵液。
較佳地,該方法進一步包含從包含肌酸之發酵液單離肌酸。肌酸可藉由等電點法及/或離子交換法從發酵液萃取。或者,肌酸可藉由於水中再結晶之方法進一步純化。
序列:
SEQ ID NO:1:顯示來自海洋藻青菌之為L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶編碼的開放讀序框架(AGAT,EC 2.1.4.1;locus_tag BJP34_00300)。
SEQ ID NO:2:顯示衍生自SEQ ID NO:1之胺基酸序列(基因銀行登錄號(Genbank accession Number) WP_070390602)。
SEQ ID NO:3:顯示針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化的來自海洋藻青菌之為L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶(AGAT,EC 2.1.4.1)編碼之DNA序列。最佳化基因之5'-端係以BsaI限制位、用於組裝選殖之5'-UTR序列及核糖體結合位擴展。於3'-端,已添加第二終止密碼子、用於組裝選殖之序列及BsaI位。
SEQ ID NO:4:顯示由來自pBL1之複製起始序列(麩胺酸棒狀桿菌)、pSC101複製起始序列(大腸桿菌)及康黴素抗藥性基因所組成之大腸桿菌-麩胺酸棒狀桿菌穿梭質體的pLIB_P。在獨特的NotI限制位之後,其具有強啟動子,兩個反向定向之BsaI位及BioBricks Terminator BBa_B1006。
SEQ ID NO:5:顯示為NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之結核分枝桿菌H37Ra的開放讀序框架MRA_2804(基因銀行登錄CP000611 locus_tag="MRA_2804")。
SEQ ID NO:6:顯示衍生自SEQ ID NO: 5之胺基酸序列(來自結核分枝桿菌H37Ra之AaDH-Mt)。
SEQ ID NO:7:顯示針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化的為結核分枝桿菌H37Ra之NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之DNA序列。DNA序列係以由BsaI限制位、用於組裝選殖之同源區、強Pg3N3啟動子及核糖體結合位所組成之5'-UTR擴展。另外,3'-端係以隨機間隔序列、用於組裝選殖之同源區及BsaI限制位擴展。
SEQ ID NO:8:顯示假定為NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之包皮垢分枝桿菌MC2 155的開放讀序框架LJ00_13235 (基因銀行登錄CP009494 locus_tag="LJ00_13235)。
SEQ ID NO:9:顯示衍生自SEQ ID NO:8之胺基酸序列(來自包皮垢分枝桿菌MC2 155之AaDH-Ms)
SEQ ID NO:10:顯示針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化的為包皮垢分枝桿菌MC2 155之NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之DNA序列。DNA序列係以由BsaI限制位、用於組裝選殖之同源區、強Pg3N3啟動子及核糖體結合位所組成之5'-UTR擴展。另外,3'-端係以隨機間隔序列、用於組裝選殖之同源區及BsaI限制位擴展。
SEQ ID NO:11:顯示假定為NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之枯草桿菌亞種枯草桿菌168菌株(Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168)的開放讀序框架IR77_18035
(基因銀行登錄CP053102 locus_tag= "HIR77_18035")。
SEQ ID NO:12:顯示衍生自SEQ ID NO:11之胺基酸序列(來自枯草桿菌亞種枯草桿菌168菌株之AaDH-Bs)。
SEQ ID NO:13:顯示針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化的為枯草桿菌亞種枯草桿菌168菌株之NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之DNA序列。該序列係以由
BsaI限制位、用於組裝選殖之同源區、強Pg3N3啟動子及核糖體結合位所組成之5'-UTR擴展。另外,3'-端係以隨機間隔序列、用於組裝選殖之同源區及
BsaI限制位擴展。
SEQ ID NO:14:顯示假定為NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之弗雷迪鏈黴菌ATCC10745的開放讀序框架CP974_05185(基因銀行登錄CP023696 locus_tag=
"CP974_05185")。
SEQ ID NO:15:顯示衍生自SEQ ID NO: 14之胺基酸序列(來自弗雷迪鏈黴菌ATCC10745之AaDH-Sf)。
SEQ ID NO:16:顯示針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化的為弗雷迪鏈黴菌ATCC10745之NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之DNA序列。該序列係以由
BsaI限制位、用於組裝選殖之同源區、強Pg3N3啟動子及核糖體結合位所組成之5'-UTR擴展。另外,3'-端係以隨機間隔序列、用於組裝選殖之同源區及
BsaI限制位擴展。
SEQ ID NO:17:顯示假定為NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之鹽生隱杆藻CM1的開放讀序框架(基因銀行登錄MG430510)。
SEQ ID NO:18:顯示衍生自SEQ ID NO:17之胺基酸序列(來自鹽生隱杆藻CM1之AaDH-Ah)。
SEQ ID NO:19:顯示針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化的為鹽生隱杆藻CM1之NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之DNA序列。該序列係以由BsaI限制位、用於組裝選殖之同源區、強Pg3N3啟動子及核糖體結合位所組成之5'-UTR擴展。另外,3'-端係以隨機間隔序列、用於組裝選殖之同源區及BsaI限制位擴展。
A)
材料及方法
化學品來自康那鏈黴菌(Streptomyces kanamyceticus)之康黴素溶液係購自Sigma Aldrich(美國,聖路易斯,型錄編號K0254)。若無另外說明,所有其他化學品係自Merck(德國,達姆斯塔特)、Sigma Aldrich(美國,聖路易斯)或Carl-Roth(德國,卡爾斯魯厄)購買分析級純度。
菌株麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032 (Kinoshita S, Udaka S, Shimono M., J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3): 193-205),麩胺酸棒狀桿菌型株/野生型,可於美國菌種中心(American Type Culture Collection (ATCC))或於DSMZ德國微生物及細胞培養收集中心GmbH(DSMZ-German
Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)以寄存號DSM 20300購得。
用於細胞增殖之培養若無另外說明,培養/培育過程係如下進行:
a. 使用得自Merck之LB培養液(MILLER)(德國,達姆斯塔特;型錄編號110285)以於液態培養基中培養大腸桿菌菌株。液態培養物(每一具有3個擋板之100 ml錐形瓶10 ml液態培養基)係於得自Infors GmbH(瑞士,博特明根)之Infors HT Multitron標準培育器搖動器中以30℃及200 rpm培育。
b. 使用得自Merck之LB洋菜(MILLER)(德國,達姆斯塔特,型錄編號110283)以於洋菜培養盤上培養大腸桿菌菌株。此等洋菜培養盤係於得自VWR (美國,瑞諾)之INCU-Line®迷你培育器中以30℃培育。
c. 使用得自Merck之Brain heart infusion broth (BHI) (德國,達姆斯塔特,型錄編號110493)以於液態培養基中培養麩胺酸棒狀桿菌菌株。液態培養物(每一具有3個擋板之100 ml錐形瓶10 ml液態培養基)係於得自Infors GmbH (瑞士,博特明根)之Infors HT Multitron標準培育器搖動器中以30℃及200 rpm培育。
d. 使用得自Merck之Brain heart agar (BHI-agar)(德國,達姆斯塔特,型錄編號113825)以於洋菜培養盤上培養麩胺酸棒狀桿菌菌株。該等洋菜培養盤係於得自Heraeus Instruments且具有Kelvitron®溫度控制器之培育器(德國,哈瑙)中以30℃培育。
e. 為了培養電穿孔後之麩胺酸棒狀桿菌,對BHI-agar(Merck,德國,達姆斯塔特,型錄編號113825)補充有134 g/l之山梨醇(Carl Roth GmbH+Co. KG,德國,卡爾斯魯厄)、2.5 g/l之酵母萃取物(Oxoid/ThermoFisher Scientific,美國,沃爾瑟姆,型錄編號LP0021)及25 mg/l之康黴素。該等洋菜培養盤係於得自Heraeus Instruments且具有Kelvitron®溫度控制器之培育器(德國,哈瑙)中以30℃培育。
測定細菌懸浮液之光學密度a. 於搖瓶培養物中之細菌懸浮液的光學密度係使用得自Eppendorf AG(德國,漢堡)之Bio-Photometer以600 nm (OD600)測定。
b. 於Wouter Duetz(WDS)微發酵系統(24孔盤)中製造之細菌懸浮液的光學密度係採用得自Tecan Group AG(瑞士,門內多夫)之GENios™培養盤判讀機以660 nm(OD660)測定。
離心a. 最大體積為2 ml之細菌懸浮液係使用Eppendorf 5417 R台式離心機於1.5 ml或2 ml反應管(例如Eppendorf Tubes® 3810X)中離心(以13,000 rpm進行5分鐘)。
b. 最大體積為50 ml之細菌懸浮液係使用Eppendorf 5810 R台式離心機於15 ml或50 ml離心管(例如FalconTM 50 ml Conical Centrifuge Tubes)中以4,000 rpm離心10分鐘。
DNA 單離質體DNA係使用得自Qiagen(德國,希爾登,型錄編號27106)之QIAprep Spin Miniprep Kit,根據製造商之指示,從大腸桿菌細胞單離。
聚合酶連鎖反應 (PCR)採用校讀(高保真度)聚合酶之PCR係用以擴增用於定序或DNA組裝之DNA的所欲片段。非校讀聚合酶套組係用以測定是否存在直接來自大腸桿菌或麩胺酸棒狀桿菌菌落的所欲DNA片段。
a. 使用得自New England BioLabs Inc.(美國,伊普斯維奇,型錄編號M0530)之Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase Kit(Phusion Kit),根據製造商之指示,以模板正確擴增所選擇之DNA區(見表2)。
表2:以得自New England BioLabs Inc.之Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase Kit進行PCR之熱循環條件
b. 使用得自Qiagen(德國,希爾登,型錄編號201203)之Taq PCR Core Kit(Taq Kit)以擴增DNA之所欲片段以確認其存在。該套組係根據製造商之指示使用(見表3)。
表3:以得自Qiagen之Taq PCR Core Kit(Taq Kit)進行PCR的熱循環條件
c. 使用得自Takara Bio Inc(Takara Bio Europe S.A.S.,法國,聖日耳曼昂萊,型錄編號RR350A/B)之SapphireAmp® Fast PCR Master Mix(Sapphire Mix)作為替代,根據製造商之指示(見表4),以確認取自大腸桿菌或麩胺酸棒狀桿菌菌落之細胞中的所欲DNA片段之存在。
表4:以得自Takara Bio Inc.之SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Sapphire Mix)進行PCR的熱循環條件
d. 所有寡核苷酸引子係藉由Eurofins Genomics GmbH (德國,埃伯斯堡)合成。
e. 使用單離質體DNA或自液態培養物所單離的全部DNA之適宜的稀釋溶液或細菌菌落中所含的全部DNA(菌落PCR)作為PCR模板。就該菌落PCR而言,模板係藉由以滅菌牙籤從洋菜培養盤上之菌落採集細胞材料,且將該細胞材料直接置於PCR反應管中而製備。細胞材料係於得自SEVERIN Elektrogeräte GmbH(德國,孫登)之型號Mikrowave & Grill的微波爐中以800 W加熱10秒,然後將PCR試劑添加至該PCR反應管中之模板。
f. 所有PCR反應係於得自Eppendorf AG(德國,漢堡)之型號為Mastercycler或Mastercycler nexus gradient的PCR循環裝置中進行。
PCR程序 | |||
步驟 | 時間[分:秒] | T [℃] | 說明 |
1 | 00:30 | 98 | 初始變性步驟 |
2 | 00:05 | 98 | 變性步驟 |
3 | 00:30 | 60 | 退火步驟 |
4 | 30秒/kb DNA | 72 | 延長步驟 |
重複步驟2至4:35 x | |||
5 | 05:00 | 72 | 最終延長步驟 |
6 | 保持 | 4 | 冷卻步驟 |
PCR程序 | |||
步驟 | 時間[分:秒] | T [℃] | 說明 |
1 | 05:00 | 94 | 初始變性步驟 |
2 | 00:30 | 94 | 變性步驟 |
3 | 00:30 | 52 | 退火步驟 |
4 | 1分鐘/kb DNA | 72 | 延長步驟 |
重複步驟2至4:35 x | |||
5 | 04:00 | 72 | 最終延長步驟 |
6 | 保持 | 4 | 冷卻步驟 |
PCR程序 | |||
步驟 | 時間[分:秒] | T [℃] | 說明 |
1 | 01:00 | 94 | 初始變性步驟 |
2 | 00:05 | 98 | 變性步驟 |
3 | 00:05 | 55 | 退火步驟 |
4 | 10秒/kb DNA | 72 | 延長步驟 |
重複步驟2至4:30 x | |||
5 | 04:00 | 72 | 最終延長步驟 |
6 | 保持 | 4 | 冷卻步驟 |
DNA 之限制酶消化為進行限制酶消化,使用「FastDigest 限制性核酸內切酶(FD)」(ThermoFisher Scientific,美國,沃爾瑟姆)或得自England BioLabs Inc.(美國,伊普斯維奇)之限制性核酸內切酶。反應係根據製造商手冊之指示進行。
測定 DNA 片段之大小a. 小DNA片段(<1000 bps)之大小經常使用得自Qiagen(德國,希爾登)之QIAxcel藉由自動毛細管電泳測定。
b. 若DNA片段需要單離或若DNA片段>1000 bps,則DNA係藉由TAE瓊脂糖凝膠電泳且以GelRed® Nucleic Acid Gel Stain(Biotium, Inc., Fremont, Canada)染色而分離。經染色之DNA於302 nm可見。
PCR 擴增及限制性片段之純化PCR擴增及限制性片段係使用得自Qiagen(德國,希爾登;型錄編號28106)之QIAquick PCR Purification Kit,根據製造商之指示清潔。DNA係以30 µl 10 mM Tris*HCl(pH 8.5)洗提。
測定 DNA 濃度DNA濃度係使用得自PEQLAB Biotechnologie GmbH (自2015為VWR品牌)(德國,埃朗根)之NanoDrop Spectrophotometer ND-1000來測量。
組裝選殖質體載體係使用購自New England BioLabs Inc.(美國,伊普斯維奇,型錄編號E5520)之「NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit」組裝。含有線形載體及至少一種DNA插入段之反應混合物係於50℃培育60分鐘。各轉形實驗係使用0.5 µl之組裝混合物。
大腸桿菌之化學轉形為進行質體選殖,根據製造商之規程使具有足夠化學能力之「NEB® Stable Competent E. coli(High Efficiency)
」(New England BioLabs Inc.,美國,伊普斯維奇,型錄編號C3040)轉形。在補充有25 mg/l之康黴素的LB洋菜上選擇成功轉形之細胞。
麩胺酸棒狀桿菌之轉形採用質體-DNA的麩胺酸棒狀桿菌之轉形係通過使用如Ruan等人(2015)所述之「Gene Pulser Xcell」(Bio-Rad Laboratories GmbH,德國,費爾德克興)的電穿孔來進行。電穿孔係於1 mm電穿孔光析管(Bio-Rad Laboratories GmbH,德國,費爾德克興)中以1.8 kV及設為5 ms之固定時間常數進行。於含有134 g/l之山梨醇、2.5 g/l之酵母萃取物及25 mg/l之康黴素的BHI洋菜上選擇轉形之細胞。
測定核苷酸序列DNA分子之核苷酸序列係由Eurofins Genomics GmbH (德國,埃伯斯堡)以循環定序,使用Sanger等人之雙去氧鏈終止法(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463-5467, 1977)測定。使用得自Scientific & Educational Software (美國,丹佛)之Clonemanager Professional 9軟體視覺化及評估序列,以及用於序列之電腦模擬組裝。
大腸桿菌及麩胺酸棒狀桿菌菌株之甘油儲液 (glycerol stock)為了長時間儲存大腸桿菌及麩胺酸棒狀桿菌菌株,製備甘油儲液。所選擇之大腸桿菌殖株係於補充有2 g/l之葡萄糖的10 ml LB培養基中培養。所選擇之麩胺酸棒狀桿菌殖株係於補充有2 g/l之葡萄糖的10 ml兩倍濃縮BHI培養基中培養。用於生長含有大腸桿菌及麩胺酸棒狀桿菌菌株之質體的培養基係補充有25 mg/l之康黴素。將該培養基裝在具有3個檔板之100 ml錐形瓶中。對其接種一圈取自菌落之細胞。然後,該培養物係以30℃及200 rpm培育18 h。在培育期間之後,將1.2 ml 85%(v/v)之滅菌甘油添加至該培養物。然後將所獲得之含有細胞懸浮液之甘油等分為2 ml且儲存於-80℃。
以小規模培養進行之 GAA 生產使用根據Duetz(2007)之毫升規模培養系統來評估菌株之GAA生產。為此目的,使用得自EnzyScreen BV(荷蘭,海姆斯泰德,型錄編號CR1424)之每孔填充有2.5 ml培養基的24深孔微量盤(24孔WDS盤)。
菌株之預培養物係於10 ml種培養基(SM)中完成。將該培養基裝在具有3個檔板之100 ml錐形瓶中。其係接種100 µl之甘油儲液培養物,且該培養物係以30℃及200 rpm培育24 h。種子培養基(SM)之組成係顯示於表5。
表5:種子培養基(SM)
於培育期間之後,測定預培養物之光學密度OD600。從預培養物取樣將2.5 ml之生產培養基(PM)接種至OD600為0.1所需之體積、離心(以8000 g進行1分鐘)以及丟棄上澄液。然後將細胞再懸浮於100 µl之生產培養基中。
主培養物係藉由以各100 µl之來自預培養物之再懸浮細胞接種24孔WDS盤之含有2.4 ml生產培養基(PM)的孔開始。生產培養基(PM)之組成係顯示於表6。
表6:生產培養基(PM)
主培養物係於得自Infors GmbH(瑞士,博特明根)之Infors HT Multitron標準培育器搖動器中以30℃及225 rpm培育72 h,直到葡萄糖完全消耗。懸浮液中之葡萄糖濃度係以得自LifeScan(Johnson & Johnson Medical GmbH,德國,諾斯)之血糖機OneTouch Vita®分析。
於培養之後,將培養物懸浮液轉移至深孔微量盤。一部分培養物懸浮液係經適當地稀釋以測量OD600。另一部分培養物係經離心且如下述分析上澄液中之GAA的濃度。
組分 | 濃度(g/l) |
酵母萃取物FM902 (Angel Yeast Co.,LTD,中國,湖北) | 10 |
脲 | 1.5 |
KH 2PO 4 | 0.5 |
K 2HPO 4 | 0.5 |
MgSO 4* 7 H 2O | 1 |
生物素 | 0.0001 |
鹽酸噻胺 | 0.0001 |
FeSO 4* 7 H 2O | 0.01 |
MnSO 4* H 2O | 0.01 |
葡萄糖 | 20 |
康黴素 | 0.025 |
pH=7.0 |
組分 | 濃度(g/l) |
3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS) | 40 |
酵母萃取物FM902 (Angel Yeast Co.,LTD,中國,湖北) | 1.5 |
(NH 4) 2SO 4 | 10 |
NH 4Cl | 15 |
檸檬酸三鈉 * 2 H 2O | 10 |
脲 | 1 |
KH 2PO 4 | 0.5 |
K 2HPO 4 | 0.5 |
乙酸銨 | 7.7 |
MgSO 4* 7 H 2O | 1 |
生物素 | 0.0001 |
鹽酸噻胺 | 0.0001 |
FeSO 4* 7 H 2O | 0.01 |
MnSO 4* H 2O | 0.01 |
ZnSO 4* 7 H 2O | 0.00002 |
CuSO 4* 5 H 2O | 0.0004 |
Antifoam XFO-1501 (Ivanhoe Industries Inc.,美國,錫安) | 0.5 |
葡萄糖 | 40 |
L-精胺酸 | 1.9 |
康黴素 | 0.025 |
pH=7.2 |
GAA 之定量樣本係以得自Agilent之分析系統分析,該分析系統係由HPLC「Infinity 1260」組成且耦合質量分析儀「Triple Quad 6420」(Agilent Technologies Inc.,美國,聖塔克拉拉)。層析分離係於HILIC矽石管柱,4,6×250mm,5μm (Waters Corporation,美國,米爾福德)上於35℃完成。流動相A為具有10mM甲酸銨及0.2%甲酸之水。流動相B為90%乙腈與10%水之混合物,於該混合物中添加10 mM甲酸銨。HPLC系統係以100% B開始,接著是線性梯度22 min且固定流率為0,6 mL/min至66% B。質量分析儀係以ESI正離子化模式操作。為了偵測GAA,m/z值係藉由使用MRM碎裂[M+H]+118-76來監測。GAA之定量極限(LOQ)固定於7 ppm。
B) 實驗結果
實施例 1 :來自海洋藻青菌之為 L- 精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶 (AGAT , EC 2.1.4.1) 編碼的基因 AGAT-Mp 之選殖海洋藻青菌為絲狀藍綠菌(filamentous cyanobacterium
)。海洋藻青菌菌株PAL-8-15-08-1之基因組係由Leao等人發表(Leao T, Castelão G, Korobeynikov A, Monroe EA, Podell S, Glukhov E, Allen EE, Gerwick WH, Gerwick L, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Mar 21;114(12):3198-3203. doi: 10.1073/pnas.1618556114;基因銀行登錄號CP017599.1)。其含有為L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶編碼的開放讀序框架(AGAT,EC 2.1.4.1;SEQ ID NO: 1中顯示為locus_tag BJP34_00300)。SEQ ID NO: 2顯示衍生之胺基酸序列(基因銀行登錄號WP_070390602)。
使用軟體工具「Optimizer」(http://genomes.urv.es/
OPTIMIZER/)將胺基酸序列轉譯回針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化的DNA序列。最佳化基因之5'-端係以BsaI限制位、用於組裝選殖之5'-UTR序列及核糖體結合位擴展。於3'-端,添加第二終止密碼子、用於組裝選殖之序列及
BsaI位。從Eurofins Genomics GmbH(德國,埃伯斯堡)訂購所得之DNA序列(SEQ ID NO: 3)以進行基因合成,且其係作為具有胺苄青黴素抗藥性基因之選殖質體(指定為pEX-A258_AGAT-Mp)的一部分遞輸。
大腸桿菌-麩胺酸棒狀桿菌穿梭質體的pLIB_P係由來自pBL1之複製起始序列(麩胺酸棒狀桿菌)、pSC101複製起始序列(大腸桿菌)及康黴素抗藥性基因所組成。在獨特的
NotI限制位之後,其具有強啟動子,兩個反向定向之
BsaI位及BioBricks Terminator BBa_B1006(SEQ ID NO: 5)。
pLIB_P係使用限制性核酸內切酶
BsaI消化,以及DNA係以「QIAquick PCR Purification Kit」(Qiagen GmbH,德國,希爾登)純化。
選殖質體pEX-A258_AGAT-Mp係使用限制性核酸內切酶BsaI消化,以及DNA係以「QIAquick PCR Purification Kit」(Qiagen GmbH,德國,希爾登)純化。
結合BsaI消化之pLIB_P及pEX-A258_AGAT-Mp的DNA溶液,以及使用「NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit」(New England BioLabs Inc.,美國,伊普斯維奇,型錄編號E5520)組裝之匹配序列端。使產物轉形成「NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)」(New England Biolabs,美國,伊普斯維奇)以及於含有25 mg/l之康黴素的LB洋菜上生長細胞。適當的質體殖株係藉由限制性消化及DNA定序識別。所得之質體命名為pLIB_P_AGAT-Mp。
實施例 2 :來自結核分枝桿菌 H37Ra 之為 NADH 依賴性 AaDH 編碼的基因之合成結核分枝桿菌H37Ra之開放讀序框架MRA_2804假定為NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼(基因銀行登錄CP000611 locus_tag="MRA_2804", SEQ ID NO:7)。SEQ ID NO: 8顯示衍生之胺基酸序列。
使用軟體工具「Codon Optimization Tool」(Integrated DNA Technologies Inc.,美國,愛荷華州,科拉維爾),使開放讀序框架針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化。所得之序列係以由
BsaI限制位、用於組裝選殖之同源區、強Pg3N3啟動子及核糖體結合位所組成之5'-UTR擴展。另外,3'-端係以隨機間隔序列、用於組裝選殖之同源區及
BsaI限制位擴展。從Invitrogen/Geneart(Thermo Fisher Scientific,美國,沃爾瑟姆)訂購所得之DNA序列(SEQ ID NO: 9)以進行基因合成,且其係作為具有胺苄青黴素抗藥性基因之選殖質體一部分遞輸。
實施例 3 :來自包皮垢分枝桿菌 MC2 155 之為 NADH 依賴性 AaDH 編碼的基因之合成包皮垢分枝桿菌MC2 155之開放讀序框架LJ00_13235假定為NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼(基因銀行登錄CP009494 locus_tag="LJ00_13235", SEQ ID NO:11)。SEQ ID NO: 12顯示衍生之胺基酸序列。
使用軟體工具「Codon Optimization Tool」(Integrated DNA Technologies Inc.,美國,愛荷華州,科拉維爾),使開放讀序框架針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化。所得之序列係以由
BsaI限制位、用於組裝選殖之同源區、強Pg3N3啟動子及核糖體結合位所組成之5'-UTR擴展。另外,3'-端係以隨機間隔序列、用於組裝選殖之同源區及
BsaI限制位擴展。從Invitrogen/Geneart (Thermo Fisher Scientific,美國,沃爾瑟姆)訂購所得之DNA序列(SEQ ID NO: 13)以進行基因合成,且其係作為具有胺苄青黴素抗藥性基因之選殖質體一部分遞輸。
實施例 4 :來自枯草桿菌 168 之為 NADH 依賴性 AaDH 編碼的基因之合成枯草桿菌168之開放讀序框架HIR77_18035假定為NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼(基因銀行登錄CP053102 locus_tag="HIR77_18035", SEQ ID NO:15)。SEQ ID NO: 16顯示衍生之胺基酸序列。
使用軟體工具「Codon Optimization Tool」(Integrated DNA Technologies Inc.,美國,愛荷華州,科拉維爾),使開放讀序框架針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化。所得之序列係以由
Bsa I限制位、用於組裝選殖之同源區、強Pg3N3啟動子及核糖體結合位所組成之5'-UTR擴展。另外,3'-端係以隨機間隔序列、用於組裝選殖之同源區及
BsaI限制位擴展。從Invitrogen/Geneart (Thermo Fisher Scientific,美國,沃爾瑟姆)訂購所得之DNA序列(SEQ ID NO: 17)以進行基因合成,且其係作為具有胺苄青黴素抗藥性基因之選殖質體一部分遞輸。
實施例 5 :來自弗雷迪鏈黴菌 ATCC10745 之為 NADH 依賴性 AaDH 編碼的基因之合成弗雷迪鏈黴菌ATCC10745之開放讀序框架CP974_05185假定為NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼(基因銀行登錄CP023696 locus_tag="CP974_05185", SEQ ID NO:19)。SEQ ID NO: 20顯示衍生之胺基酸序列。
使用軟體工具「Codon Optimization Tool」(Integrated DNA Technologies Inc.,美國,愛荷華州,科拉維爾),使開放讀序框架針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化。所得之序列係以由
BsaI限制位、用於組裝選殖之同源區、強Pg3N3啟動子及核糖體結合位所組成之5'-UTR擴展。另外,3'-端係以隨機間隔序列、用於組裝選殖之同源區及
BsaI限制位擴展。從Invitrogen/Geneart(Thermo Fisher Scientific,美國,沃爾瑟姆)訂購所得之DNA序列(SEQ ID NO: 21)以進行基因合成,且其係作為具有胺苄青黴素抗藥性基因之選殖質體一部分遞輸。
實施例 6 :來自鹽生隱杆藻 CM1 之為 NADH 依賴性 AaDH 編碼的基因之合成鹽生隱杆藻CM1具有假定為NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之開放讀序框架(基因銀行登錄MG430510, SEQ ID NO:23)。SEQ ID NO: 25顯示衍生之胺基酸序列。
使用軟體工具「Codon Optimization Tool」(Integrated DNA Technologies Inc.,美國,愛荷華州,科拉維爾),使開放讀序框架針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子使用率最佳化。所得之序列係以由
BsaI限制位、用於組裝選殖之同源區、強Pg3N3啟動子及核糖體結合位所組成之5'-UTR擴展。另外,3'-端係以隨機間隔序列、用於組裝選殖之同源區及
BsaI限制位擴展。從Invitrogen/Geneart(Thermo Fisher Scientific,美國,沃爾瑟姆)訂購所得之DNA序列(SEQ ID NO: 24)以進行基因合成,且其係作為具有胺苄青黴素抗藥性基因之選殖質體一部分遞輸。
實施例 7 :用於共表現胺基酸脫氫酶及 AGAT-Mp 之質體的選殖為了能組合表現AGAT-Mp及各胺基酸脫氫酶,將脫氫酶基因選至質體pLIB_P_AGAT-Mp。
質體pLIB_P_AGAT-Mp係使用限制性核酸內切酶NotI消化,以及DNA係以「QIAquick PCR Purification Kit」(Qiagen GmbH,德國,希爾登)純化。
五個含有合成胺基酸脫氫酶基因各使用限制性核酸內切酶BsaI消化,以及以「QIAquick PCR Purification Kit」(Qiagen GmbH,德國,希爾登)純化。
將NotI消化之pLIB_P_AGAT-Mp的DNA與BsaI消化之胺基酸脫氫酶基因各者組合,以及使用「NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit」(New England BioLabs Inc.,美國,伊普斯維奇,型錄編號E5520)組裝之匹配序列端。
使產物轉形成「NEB穩定勝任大腸桿菌(高效率)」(New England Biolabs,美國,伊普斯維奇)以及於含有25 mg/l之康黴素的LB洋菜上生長細胞。適當的質體選殖株係藉由限制性消化及DNA定序識別。所得之質體係顯示於表7。
表7:用於共表現胺基酸脫氫酶及AGAT-Mp之質體
質體 | AaDH基因 |
pLIB_AaDH-Mt_AGAT-Mp | 來自結核分枝桿菌H37Ra之AaDH |
pLIB_AaDH-Ms_AGAT-Mp | 來自包皮垢分枝桿菌MC2 155之AaDH |
pLIB_AaDH-Bs_AGAT-Mp | 來自枯草桿菌168之AaDH |
pLIB_AaDH-Sf_AGAT-Mp | 來自弗雷迪鏈黴菌ATCC10745之AaDH |
pLIB_AaDH-Ah_AGAT-Mp | 來自鹽生隱杆藻CM1之AaDH |
實施例 8 :以表現質體使麩胺酸棒狀桿菌 ATCC13032 轉形麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032(Kinoshita等人,J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3): 193-205)係採用表現質體藉由電穿孔而轉形,以及含有細胞之質體係經25 mg/l之康黴素選擇。所得之含有菌株的質體顯示於表8。
實施例 9 : AaDH 活性對於 GAA 生產之影響為了評估AaDH基因之表現對於GAA生產的影響,於Wouter Duetz系統中於生產培養基中培養菌株ATCC13032/pLIB_P_AGAT-Mp、ATCC13032/pLIB_AaDH-Mt_AGAT-Mp、ATCC13032/pLIB_AaDH-Ms_AGAT-Mp、
ATCC13032/pLIB_AaDH-Bs_AGAT-Mp、
ATCC13032/pLIB_AaDH-Sf_AGAT-Mp及
ATCC13032/pLIB_AaDH-Ah_AGAT-Mp,以及所得GAA效價係如上述測定。
相較於ATCC13032/pLIB_P_AGAT-Mp,培養含有AaDH基因之菌株導致較高GAA效價(見表9)。我們的結論是為NADH依賴性胺基酸脫氫酶編碼之基因的表現改善GAA之生產。
TW202413629A_112120265_SEQL.xml
Claims (21)
- 一種微生物,其包含至少一種為具有L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶(amidinotransferase)之功能的蛋白質編碼之異源基因(heterologous gene)以及包含至少一種為具有NADH-依賴性胺基酸脫氫酶(dehydrogenase)之功能的蛋白質編碼之異源基因。
- 如請求項1之微生物,其中,具有NADH-依賴性胺基酸脫氫酶之功能的該蛋白質之活性比野生型微生物之個別活性提高。
- 如請求項1或2之微生物,其中,具有NADH-依賴性胺基酸脫氫酶之功能的該蛋白質係選自由丙胺酸脫氫酶(EC 1.4.1.1)、甘胺酸脫氫酶(EC 1.4.1.10)及天門冬胺酸酯脫氫酶(aspartate dehydrogenase)(EC 1.4.1.21)所組成之群組。
- 如請求項1至3中任一項之微生物,其中,該微生物具有由L-鳥胺酸產生L-精胺酸之能力比該野生型微生物之該能力提高。
- 如請求項4之微生物,其中,該微生物具有相較於該野生型微生物中之該個別酶活性,具有胺甲醯磷酸酯合成酶之功能的酶之活性提高。
- 如請求項4或5之微生物,其中,該微生物進一步包含相較於該野生型微生物中之該個別酶活性,具有提高活性的精胺基丁二酸酯解離酶(argininosuccinate lyase)之功能的酶。
- 如請求項4至6中任一項之微生物,其中,該微生物進一步包含相較於該野生型微生物中之該個別酶活性,具有提高活性的鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ornithine carbamoyltransferase)之功能的酶。
- 如請求項4至7中任一項之微生物,其中,該微生物進一步包含相較於該野生型微生物中之該個別酶活性,具有提高活性的精胺基丁二酸酯合成酶(argininosuccinate synthetase)之功能的酶。
- 如請求項4至8中任一項之微生物,其中,該等酶之提高活性係藉由過度表現編碼該等個別酶之基因而獲致。
- 如前述請求項中任一項之微生物,其中,編碼具有蘋果酸酯合成酶(malate synthase)之功能的蛋白質之基因的表現比該野生型微生物中之該個別基因的表現衰減,或其中,編碼具有蘋果酸酯合成酶之功能的該蛋白質的基因係被去活化或刪除。
- 如請求項4至10中任一項之微生物,其中,為精胺酸反應抑制蛋白質ArgR編碼之 argR基因的表現比該野生型微生物中之該 argR基因的表現衰減,或其中,該argR基因係被去活化或刪除。
- 如請求項4至11中任一項之微生物,其中,為L-精胺酸之生物合成路徑的酶編碼之基因中之至少一或多者,包含分別為麩胺酸酯脫氫酶、鳥胺酸乙醯基轉移酶、乙醯基麩胺酸酯激酶、乙醯基麩胺醯磷酸酯還原酶以及為乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶編碼之 gdh、 argJ、 argB、 argC及/或 argD係過度表現。
- 如前述請求項中任一項之微生物,其中,具有L-精胺酸:甘胺酸脒基轉移酶之功能的該蛋白質包含與根據SEQ ID NO: 2之胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之微生物,其中,具有NADH-依賴性胺基酸脫氫酶之功能的該蛋白質包含與根據SEQ ID NO: 6、根據SEQ ID NO: 9、根據SEQ ID NO: 12、根據SEQ ID NO: 15或根據SEQ ID NO: 18之胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之微生物,其中,該微生物屬於棒狀桿菌屬、腸桿菌屬或假單胞菌屬。
- 一種用於發酵性生產胍基乙酸(GAA)之方法,其包含以下步驟:a)於適宜的培養基中在適宜的條件下培養如前述請求項中任一項所定義之微生物,以及b)在該培養基中累積GAA以形成包含GAA之發酵液(fermentation broth)。
- 如請求項16之方法,其進一步包含由包含GAA之發酵液單離GAA。
- 如請求項1至15中任一項之微生物,其進一步包含為具有胍基乙酸N-甲基轉移酶 (guanidinoacetate N-methyltransferase)之活性的酶編碼之基因。
- 如請求項18之微生物,其中,為具有胍基乙酸N-甲基轉移酶之活性的酶編碼的該基因係過度表現。
- 一種用於發酵性生產肌酸之方法,其包含以下步驟:a)於適宜的培養基中在適宜的條件下培養如請求項18或19中任一項所定義之微生物,以及b)在該培養基中累積肌酸以形成包含肌酸之發酵液。
- 如請求項20之方法,其進一步包含由包含肌酸之發酵液單離肌酸。
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