JP2020519240A - ピルビン酸カルボキシラーゼおよびピルビン酸カルボキシラーゼコーディングdna、そのdnaを含有するプラスミド、ならびに産生用微生物、および生成物であってそれらの生合成が前駆体としてオキサロアセテートを含有する生成物の製造方法、および染色体 - Google Patents
ピルビン酸カルボキシラーゼおよびピルビン酸カルボキシラーゼコーディングdna、そのdnaを含有するプラスミド、ならびに産生用微生物、および生成物であってそれらの生合成が前駆体としてオキサロアセテートを含有する生成物の製造方法、および染色体 Download PDFInfo
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Abstract
Description
配列番号1:本発明により改変したピルビン酸カルボキシラーゼpycT343Aをコードする、本発明により改変した、プラスミドベースバリアントのDNA配列
配列番号2:本発明により改変したピルビン酸カルボキシラーゼpycT343A;I1012Sをコードする、本発明により改変した、プラスミドベースバリアントのDNA配列
配列番号3:本発明により改変したピルビン酸カルボキシラーゼPyc−T343Aのアミノ酸配列
配列番号4:本発明により改変したピルビン酸カルボキシラーゼPyc−T343A;I1012Sのアミノ酸配列
配列番号5:ピルビン酸カルボキシラーゼの野生型に関する参考株ATCC 13032lysT311IのDNA配列
配列番号6:ピルビン酸カルボキシラーゼの野生型に関する参考株ATCC 13032lysT311Iのピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列
配列番号7:Pyc−T343Aをコードする、本発明による染色体的バリアントDNA−pyc−A1027G−T1035GのDNA配列
配列番号8:Pyc−T343A;I1012Sをコードする、本発明による染色体的バリアントDNA−pyc−A1027G−T1035G−T3035G−C3039GのDNA配列
染色体上にコードされたPycバリアントPyc−T343Aを有するC.glutamicum ATCC 13032lysCT311IのL−リジン産生の測定:
染色体上のpyc遺伝子中のトレオニンコドン343の、アラニンコドンでの置換は、当業者には公知の方法(Schaefer等、1994、Gene 145:69−73、Hochheim等、2017、Biotechnol Lett 39:283−288)により、pK19mobsacBベクターを使用して、二重相同組換えを用いて行った。その産生を、染色体上の天然pyc遺伝子を有するC.glutamicum ATCC 13032lysCT311I株と比較した。各株を、Biolectorシステム内の4%(wt/vol)グルコースを含むCGXII最小培地800μl中で、24hにわたり、30℃および1200rpmにおいて培養した(図1)。600nmでの開始ODは0.5であった。24h後に、個々の培養の細胞を沈殿させ、上清中のL−リジン濃度を測定した。測定は、オルトフタルジアルデヒドによるアミノ酸のプレカラム誘導体化を伴う逆相HPLCを介して行った。移動相としては、80%溶液A(100mM酢酸ナトリウム(pH7.2))および20%溶液B(100%(vol/vol)メタノール)から20%溶液Aおよび80%溶液Bへの勾配を使用した。この例は、調べたPycバリアントは、そのPycバリアントPyc−T343Aが野生型Pycタンパク質の代わりに染色体上にコードされている場合、リジン産生に対して有利な効果を有し、リジン産生が15%まで高まり得ることを示す。
染色体上にコードされたPycバリアントPyc−T343A;I1012Sを有するC.glutamicum ATCC 13032lysCT311IのL−リジン産生の測定:
染色体上のpyc遺伝子中のトレオニンコドン343の、アラニンコドンでの置換およびイソロイシンコドン1012の、セリンコドンでの置換は、当業者には公知の方法(Schaefer等、1994、Gene 145:69−73、Hochheim等、2017、Biotechnol Lett 39:283−288)により、pK19mobsacBベクターを使用して、二重相同組換えを用いて行った。その産生を、染色体上の天然pyc遺伝子を有するC.glutamicum ATCC 13032lysCT311I株と比較した。各株を、Biolectorシステム内の4%(wt/vol)グルコースを含むCGXII最小培地800μl中で、24hにわたり、30℃および1200rpmにおいて培養した(図1)。600nmでの開始ODは0.5であった。24h後に、個々の培養の細胞を沈殿させ、上清中のL−リジン濃度を測定した。測定は、オルトフタルジアルデヒドによるアミノ酸のプレカラム誘導体化を伴う逆相HPLCを介して行った。移動相としては、80%溶液A(100mM酢酸ナトリウム(pH7.2))および20%溶液B(100%(vol/vol)メタノール)から20%溶液Aおよび80%溶液Bへの勾配を使用した。この例は、調べたPycバリアントは、そのPycバリアントPyc−T343A;I1012Sが野生型Pycタンパク質の代わりに染色体上にコードされている場合、リジン産生に対して有利な効果を有し、リジン産生が19%まで高まり得ることを示す。
C.glutamicum ATCC 13032lysCT311IΔpyc/pAN6−pycT343A;I1012SのL−リジン産生の測定:
その産生を、天然pycをコードするC.glutamicum ATCC 13032lysCT311IΔpyc/pAN6−pyc株および空プラスミド対照C.glutamicum ATCC 13032lysCT311IΔpyc/pAN6と比較した。各株を、Biolectorシステム内の4%(wt/vol)グルコースおよび25mg/lカナマイシンを含むCGXII最小培地800μl中で、24hにわたり、30℃および1200rpmにおいて培養した(図3)。600nmでの開始ODは0.5であった。24h後に、個々の培養の細胞を沈殿させ、上清中のL−リジン濃度を測定した。測定は、オルトフタルジアルデヒドによるアミノ酸のプレカラム誘導体化を伴う逆相HPLCを介して行った。移動相としては、80%溶液A(100mM酢酸ナトリウム(pH7.2))および20%溶液B(100%(vol/vol)メタノール)から20%溶液Aおよび80%溶液Bへの勾配を使用した。この例は、プラスミドpAN6上に野生型Pycの代わりにPycバリアントPycT343A;I1012Sがコードされている場合、リジン産生が9%まで高まり得ることを示す(図4)。
Ohnishi等(Applied Microbiology and Biotechnology(2002)58:217−223)のような以下の従来技術、すなわち、野生株ATCC 13032をベースとし、2つの点突然変異、ホモセリンデヒドロゲナーゼの遺伝子(hom)中のVal59Alaおよびアスパラギン酸キナーゼの遺伝子(lysC)中のThr311Ileを担持するC.glutamicum株AHD2中への、C.glutamicumのPycの458位におけるプロリンからセリンへのアミノ酸置換の染色体への導入から、ならびにC.glutamicum株ATCC 21523由来のPycと比べて複数の突然変異(M1V、E153D、A182S、A206S、H227R、A452G、D1120E)を含むC.glutamicum株NRRL−B11474に由来するピルビン酸カルボキシラーゼが単離された生物に関する刊行物US7,300,777B2(特許文献1)から公知である突然変異は、本発明の主題ではない。
Claims (25)
- 1027〜1029位のトリプレットがアラニンをコードする、配列番号1に対して少なくとも70%の同一性を有するDNA配列。
- DNAが配列番号1に対して少なくとも80%の同一性を有することを特徴とする、請求項1に記載のDNA配列。
- 配列番号1によるDNAであることを特徴とする、請求項1または2に記載のDNA配列。
- 3034〜3036位において、セリンをコードするトリプレットが追加的に存在することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一つに記載のDNA配列。
- DNAが配列番号2に対して少なくとも80%の同一性を有することを特徴とする、請求項4に記載のDNA配列。
- 配列番号2によるDNAであることを特徴とする、請求項4または5に記載のDNA配列。
- 343位にアラニンが存在する、配列番号3によるピルビン酸カルボキシラーゼに対して少なくとも90%の同一性を有するピルビン酸カルボキシラーゼ。
- 配列番号3によるピルビン酸カルボキシラーゼに対して少なくとも95%の同一性を有することを特徴とする、請求項7に記載のピルビン酸カルボキシラーゼ。
- 配列番号3によるピルビン酸カルボキシラーゼであることを特徴とする、請求項7または8に記載のピルビン酸カルボキシラーゼ。
- 1012位においてセリンを追加的に有することを特徴とする、請求項6〜8のいずれか一つに記載のピルビン酸カルボキシラーゼ。
- 配列番号4によるピルビン酸カルボキシラーゼに対して少なくとも95%の同一性を有することを特徴とする、請求項10に記載のピルビン酸カルボキシラーゼ。
- 配列番号4によるピルビン酸カルボキシラーゼであることを特徴とする、請求項10または11に記載のピルビン酸カルボキシラーゼ。
- 請求項1〜6のいずれか一つに記載のDNA配列を含有することを特徴とする、ベクター。
- プラスミドであることを特徴とする、請求項13に記載のベクター。
- 請求項1〜6のいずれか一つに記載のDNAを含有することを特徴とする、微生物。
- 請求項13または14に記載のベクターを含有することを特徴とする、請求項9に記載の微生物。
- コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、バチルス(Bacillus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、カンジダ(Candida)属、ピキア(Pichia)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、エシェリキア(Escherichia)属、ザイモモナス(Zymomonas)属、ヤロウィア(Yarrowia)属、メチロバクテリウム(Methylobacterium)属、ラルストニア(Ralstonia)属、ビブリオ(Vibrio)属およびクロストリジウム(Clostridium)属からなる群からの微生物であることを特徴とする、請求項15または16に記載の微生物。
- 請求項1〜6のいずれか一つに記載のDNAを含有する、請求項7〜12のいずれか一つに記載の配列を有するピルビン酸カルボキシラーゼを生成する微生物を発酵させ、培地中または細胞内で生成物の富化を行うことを特徴とする、生成物であってそれらの生合成が前駆体としてオキサロアセテートを含有する生成物の製造方法。
- 生成物が単離されることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 微生物として、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、カンジダ属、ピキア属、クルイベロミセス属、サッカロミセス属、エシェリキア属、ザイモモナス属、ヤロウィア属、メチロバクテリウム属、ラルストニア属、ビブリオ属およびクロストリジウム属からなる群からの種を使用することを特徴とする、請求項18または19に記載の方法。
- アスパルテートファミリーのアミノ酸を製造することを特徴とする、請求項18〜20のいずれか一つに記載の方法。
- L−リジン、L−アスパルテート、L−アスパラギン、L−トレオニン、L−イソロイシンまたはL−メチオニンを製造することを特徴とする、請求項21に記載の方法。
- アミノ酸のグルタメートファミリー、例えば、L−グルタメート、グルタミン L−アルギニン、L−プロリン、L−シトルリンまたはL−オルニチンからの物質、クエン酸回路の中間体、例えば、マレート、フマレート、スクシネート、マレート、フマレート シトレート、イソシトレートまたは2−オキソグルタメート、ジアミン、例えば、ジアミノペンタンまたはジアミノブタン、およびオキサロアセテートから産生されるさらなる代謝産物、例えば、イタコネート、エクトイン、ガンマ−アミノブチレート、ブタノール、1−プロパノール、L−シトルリン、L−オルニチン、D−アルギニンまたは4−ヒドロキシプロリンを製造することを特徴とする、請求項18〜20のいずれか一つに記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか一つに記載の遺伝子をより強力に発現させることを特徴とする、請求項18〜23のいずれか一つに記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか一つに記載のDNA配列を含有する染色体。
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APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 58, JPN6021051167, 8 December 2001 (2001-12-08), pages 217 - 223, ISSN: 0004668613 * |
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