KR20200008997A - 피루브산 카르복실라제 및 피루브산 카르복실라제 암호화 dna, 상기 dna를 함유한 플라스미드 및 그 생산을 위한 미생물, 그리고 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물의 제조 방법, 그리고 염색체 - Google Patents

피루브산 카르복실라제 및 피루브산 카르복실라제 암호화 dna, 상기 dna를 함유한 플라스미드 및 그 생산을 위한 미생물, 그리고 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물의 제조 방법, 그리고 염색체 Download PDF

Info

Publication number
KR20200008997A
KR20200008997A KR1020197030800A KR20197030800A KR20200008997A KR 20200008997 A KR20200008997 A KR 20200008997A KR 1020197030800 A KR1020197030800 A KR 1020197030800A KR 20197030800 A KR20197030800 A KR 20197030800A KR 20200008997 A KR20200008997 A KR 20200008997A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ala
leu
val
gly
glu
Prior art date
Application number
KR1020197030800A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102593871B1 (ko
Inventor
마이케 코트만
마이케 바움가르트
미하엘 보트
Original Assignee
포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하 filed Critical 포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하
Publication of KR20200008997A publication Critical patent/KR20200008997A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102593871B1 publication Critical patent/KR102593871B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 피루브산 카르복실라제 및 피루브산 카르복실라제 암호화 DNA, 상기 DNA를 함유한 플라스미드 및 그 생산을 위한 미생물, 그리고 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물들의 제조를 위한 방법, 그리고 염색체에 관한 것이다. 본 발명에 따라서, 서열 번호 1에 대해 최소한 70%의 동일성을 갖는 피루브산 카르복실라제 암호화 DNA가 가용하게 되며, 이 경우 트레오닌 343을 암호화하는 트리플렛은 1027 ~ 1029번째 위치들에서 알라닌 암호화 트리플렛으로 치환된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 DNA 내에서는, 추가로 3034 ~ 3036번째 위치에서 이소류신 암호화 트리플렛은 세린 암호화 트리플렛으로 치환된다. 상기 유전자들의 발현을 통해, 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물들의 수율은 자연형 Pyc를 함유한 스트레인에 비해 9 내지 19%만큼 증가될 수 있게 하는 피루브산 카르복실라제가 수득된다.

Description

피루브산 카르복실라제 및 피루브산 카르복실라제 암호화 DNA, 상기 DNA를 함유한 플라스미드 및 그 생산을 위한 미생물, 그리고 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물의 제조 방법, 그리고 염색체
본 발명은 피루브산 카르복실라제(pyruvate carboxylase) 및 피루브산 카르복실라제 암호화 DNA, 상기 DNA를 함유한 플라스미드(plasmid) 및 그 생산을 위한 미생물, 그리고 자체의 생합성(biosyntesis)에서 전구체(precursor)로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물들(product)의 제조를 위한 방법, 그리고 염색체(chromosome)에 관한 것이다.
코리네박테리움 글루타미쿰은 산업상 아미노산류, 특히 L-글루타메이트 및 L-리신(Lysine)의 제조를 위해 사용된다. L-리신의 생산을 위해, 구연산회로(citrate cycle)에서 옥살로아세테이트 중간체(intermediate)가 추출되는데, 그 이유는 상기 중간체가 아스파르테이트 패밀리(Aspartate family)의 아미노산류, 또는 이 아미노산류의 염을 위한 전구체로서 이용되기 때문이다. 상기 중간체의 추출에도 불구하고 구연산회로가 계속하여 처리될 수 있도록 하기 위해, 구연산회로는 이른바 보급 대사 반응(anaplerotic reaction)을 통해 다시 보충되어야 한다. 당류(sugar)에서의 성장 시, 옥살로아세테이트 풀(pool)의 보충은 피루브산(pyruvate) 또는 포스포에놀피루브산(phosphoenol pyruvate)의 카르복실화를 통해 수행된다. 피루브산 및 이산화탄소 내지 HCO3 -로 옥살로아세테이트의 ATP 의존형 형성은 피루브산 카르복실라제(Pyc) 효소를 통해 촉진된다. 따라서, 예컨대 L-리신과 같은 아스파르테이트 패밀리 및 예컨대 L-글루타메이트와 같은 글루타메이트 패밀리의 아미노산류의 산업용 미생물 생산을 위해, Pyc의 높은 활동도(activity)가 중요하다. 또한, 구연산회로의 중간체들에서 유도되는 다른 대사물(metabolite)의 생산을 위해서도, 높은 Pyc 활동도가 유리하다.
C. 글루타미쿰의 자연형 Pyc(native Pyc)의 효소 활동도는 특히 아스파르테이트를 통해 알로오스테리 억제(allosteric inhibition)되며, 그리고 그로 인해 자연형 Pyc는 세포 내 아스파르테이트 농도가 높은 경우 단지 제한된 활동도만을 갖는다. 그에 따라, L-리신, 그리고 옥살로아세테이트에서 유도되는 다른 생성물들의 생산 역시도 제한되는데, 그 이유는 단지 전구체 대사물의 제한된 양만이 제공되기 때문이다. 종래 기술한 Pyc 변형체들은 단지 L 리신 생산을 중간 정도(moderate)로만 증가시킨다.
Molecular Microbiology and biotechnology(분자 미생물학 및 생물공학)의 학술지(2001) 32:295-300에 실린 Peters-Wendisch(페터스 벤디시) 등의 발표 논문 "Pyruvate carboxylase is a major bottleneck for glutamate and lysine production by Cornebacterium glutamicum(피루브산 카르복실라제는 코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 글루타메이트 및 리신 생산에서 주요 장애물이다)."에는, C. 글루타미쿰 DG52-5 스트레인 내에서 pyc 유전자의 결실(deletion)이 리신 역가(Lysine titer)의 60% 감소를 야기하는 반면, DG52-5 스트레인 내에서 pyc 유전자의 플라스미드 중재식 과발현은 50%만큼 증가된 리신 역가를 야기한다고 개시되어 있다. 그 밖에도, ATCC13032 야생형 스트레인(wild type strain) 내에서 pyc 유전자의 결실은 트윈(Tween) 60을 통해 유도되는 L-글루타메이트 생산을 약 50%만큼 감소시키는 반면, pyc 유전자의 플라스미드 기반 과발현은 글루타메이트 형성을 700%만큼 증가시킨다고 제시되어 있다. 리신 및 글루타메이트의 생산을 위한 높은 Pyc 활동도의 중요도는 추후에 다른 간행물들에도 제시되었다(Blombach et al. 2007 Applied Microbiology and Biotechnology(응용 미생물학 및 생명공학) 76: 615-623; Shirai et al. 2007 Microbial Cell Factories(미생물 세포 공장) 6: 19; Neuner und Heinzle 2011 Biotechnology Journal(생명공학 학술지) 6: 318-329; Neuner et al. 2013 Journal of biotechnology(생명공학 학술지) 163: 217-224; Guo et al. 2013 Biotechnology Letters(생명공학 통신) 35: 943-950).
구연산회로의 중간체를 나타내거나, 또는 구연산회로의 중간체들에서 유도되는, 아미노산을 제외한 다른 대사물들의 생산을 위해서도, 높은 Pyc 활동도는 매우 중요하다. Appl. Microbiol. Biotechnol.(응용 미생물학 및 생명공학)(2008) 81: 459-464에 실린 Shohei Okino 등의 발표 논문 "An efficient succinic acid production process in a metabolically engineered Corynebacterium glutamicum strain(대사공학적 코리네박테리움 글루타미쿰 스트레인에서 효율적인 숙신산 생산 공정)" 및 Biotechnol. J.(생명공학 학술지) 2012, 7, 1277-1287에 실린 Torben Hoefel 등의 발표 논문 "Comparative reaction engineering studies for succinic acid production from sucrose by metabolically engineered Escherichia coli in fed-batch-operated stirred tank bioreactiors(유가식 교반형 반응기에서 대사공학적 에셔리키아 콜리에 의해 자당에서 숙신산 생산을 위한 비교 반응 공학 연구)"에는, 피루브산 카르복실라제 암호화 유전자들의 발현 내지 과발현이 숙신산의 생산 또는 증가된 생산을 달성한다고 개시되어 있다. 이는 또 다른 간행물들에서도 제시된다(Li et al. 2016 Bioresource Technology(생물자원 공학) 218: 217-223; Tajima et al. 2015 Applied and Environmental Microbiology(응용 및 환경 미생물학) 81: 929-937; Litsanov et al. 2012 Applied and Environmental Microbiology 78: 3325-3337; Meng et al. 2016 Microbial Cell Factories 15: 141). 테르모비피다 푸스카(Thermobifida fusca)를 함유한 말산염(Malate)의 생산의 경우에도 증가된 Pyc 활동도가 마찬가지로 유리한 것으로서 증명되었다(Deng et al. 2016 Biotechnology Progress 31: 14-20). 마찬가지로, 예컨대 푸트레신(Putrescine)(1,4-디아미노부탄) 또는 카다베린(Cadaverine)(1,5-디아미노펜탄)처럼, 구연산회로의 중간체들에서 유도되는 디아민의 생산을 위해, Pyc 활동도의 강화가 적용되었다(Nguyen et al. 2015 Metabolites(대사물) 5: 211-231; Kind et al. 2010 Metabolic Engineering(대사공학) 12: 341-351).
Ohnishi 등(Applied Microbiology and Biotechnology (2002) 58: 217-223)은, 야생형 ATCC 13032를 기반으로 하면서 2개의 점돌연변이(point mutation), 요컨대 호모세린 디하이드로게나제(hom)를 위한 유전자 내 Val59Ala 및 아스파르테이트 키나제(lysC)를 위한 유전자 내 Thr311IIe를 운반하는 C. 글루타미쿰 스트레인 AHD2 내로, C. 글루타미쿰의 Pyc의 458번째 위치에서의 프롤린(proline) 대 세린(serine)의 아미노산 치환의 염색체 도입을 기술하였다. pyc-P458S 돌연변이를 갖는 스트레인 AHP-3은 모체 스트레인(parental strain) AHD-2보다 6% 더 많은 L-리신을 형성하였다. 논문 저자는, pyc 돌연변이의 식별을 위해 선택 가능한 표현형(phenotype)은 없으며, 그리고 그 식별은 단지 대응하는 유전인자 분석으로 통해서만 확인될 것으로 추측한다고 기술하였다. 더 아나가, Pyc 변형체 Pyc-P458S의 특징도 여전히 설명하지 않았다.
미국 공보 US 7,300,777 B2호는, 다수의 돌연변이(M1V, E153D, A182S, A206S, H227R, A452G, D1120E)를 갖는 C. 글루타미쿰 스트레인 NRRL-B11474에서 기인하는 피루브산 카르복실라제가 C. 글루타미쿰 스트레인 ATCC 21523에서 기인하는 Pyc에 비해 고립(isolation)된 유기체를 기술하고 있다. 전술한 돌연변이들 중 적어도 하나는, 최대 2.5배까지의 낮은 농도(1 ~ 10mM)의 아스파르테이트를 통해 자신의 활동도와 관련하여 자극(stimulation)을 받고 아스파르테이트 농도가 상대적으로 더 높은 경우에는 아스파르테이트가 존재하지 않는 상태에서 활동도의 최대 30%까지 다시 억제되는 Pyc 변형체를 야기한다. 아스파르테이트가 30mM인 경우, 스트레인 NRRL-B11474에서 기인하는 Pyc는 여전히 아스파르테이트가 존재하지 않은 상태와 동일한 활동도를 나타냈으며, 그에 반해 스트레인 ATCC 21523의 Pyc는 아스파르테이트가 30mM인 경우 단지 활동도의 30%만을 보유했으며, 이런 활동도는 상기 Pyc가 아스파르테이트의 부재 상태에서 나타냈다. 그러나 아미노산류, 특히 L-리신 및 L-글루타메이트의 발효성 생산(fermentative production)에 대해, C. 글루타미쿰 NRRL-B11474에서 기인하는 피드백 내성 Pyc 변형체(feed-back-resistant Pyc variant)의 작용은 미국 공보 US 7,300,777 B2호에 개시되지 않았다.
독일 특허 출원 102012016716.4호는 향상된 효소들을 찾아내는데 이용할 수 있는 스크리닝 방법(Screening method)을 개시하고 있다.
그러므로 본 발명의 과제는, 옥살로아세테이트에서 유도되는 생성물들을 생산할 때 수율, 역가, 부피 생산성(g 생성물/리터/시간) 또는 비생산성(specific productivity)(g 생성물/시간/g 세포건조질량)을 증가시키는데 이용할 수 있는 미생물, 피루브산 카르복실라제, 피루브산 카르복실라제 암호화 유전자, 상기 유전자를 함유한 플라스미드 또는 염색체, 그리고 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물들의 제조를 위한 방법을 제공하는 것에 있다. 특히 본 발명의 과제는, 아스파르테이트 패밀리의 아미노산류, 다시 말해 L-리신, L-아스파르테이트, L-아스파라긴, L-트레오닌, L-이소류신 및 L-메티오닌의 생산이 증가되게 하는 것에 있다. 또한, 본 발명의 과제는, L-글루타메이트, L-글루타민, L-아르기닌 또는 L-플로린과 같은 글루타메이트 패밀리의 아미노산류, 구연산회로의 염류 및 산류, 예컨대 숙신산, 말산염, 푸마르산염, 2-옥소글루타르산, 구연산 또는 이소시트르산과 같은 중간체들, 예컨대 1,5-디아미노펜탄 또는 1,4-디아미노부탄과 같은 디아민류, 또는 이타코네이트(Itaconate), 엑토인(Ectoine), 감마-아미노낙산염(aminobutyrate), 부탄올, 1-프로판올, L-시트룰린, L-오르니틴(Ornithine), D-아르기닌 또는 4-히드록시프롤린과 같은 또 다른 생성물들의 생산이 증가되게 하는 것에 있다.
상기 과제는, 청구항 제1항 및 대등의 청구항들의 전제부에서 출발하여 본 발명에 따라서 청구항 제1항 및 대등의 청구항들의 특징부에 명시되어 있는 특징들에 의해 해결된다.
미생물, 피루브산 카르복실라제, 피루브산 카르복실라제 암호화 유전자, 상기 유전자를 함유한 플라스미드 또는 염색체, 그리고 제조 방법에 의해, 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물들의 수율은 증가될 수 있다. 특히 옥살로아세테이트/아스파르테이트 패밀리의 아미노산류, 다시 말해 L-리신, L-아스파르테이트, L-아스파라긴, L-트레오닌, L-이소류신 및 L-메티오닌의 생산은 증가될 수 있다. 또한, L-글루타메이트, L-글루타민, L-아르기닌 또는 L-플로린과 같은 글루타메이트 패밀리의 아미노산류, 구연산회로의 염류 및 산류, 예컨대 숙신산, 말산염, 푸마르산염, 2-옥소글루타르산, 구연산 또는 이소시트르산과 같은 중간체들, 예컨대 1,5-디아미노펜탄 또는 1,4-디아미노부탄과 같은 디아민류, 또는 이타코네이트, 엑토인, 감마-아미노낙산염, 부탄올, 1-프로판올, L-시트룰린, L-오르니틴, D-아르기닌 또는 4-히드록시프롤린과 같은 또 다른 생성물들의 생산도 증가될 수 있다. 본 발명의 바람직한 개선예들은 종속 청구항들에 명시되어 있다.
하기에서, 본 발명은 자신의 일반적인 형태와 관련하여 기술되지만, 이는 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
놀라운 방식으로 확인된 점에 따르면, 알라닌을 통한 343번째 위치에서의 트레오닌의 치환에 의해 스트레인 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I에 비해 변형된 피루브산 카르복실라제, 및 상기 피루브산 카르복실라제를 암호화하고 유전학적으로 변형된 유전자, 상기 유전자를 함유하는 플라스미드, 및 상기 유전자 또는 플라스미디를 함유한 미생물, 그리고 제조 방법은 본원의 과제들을 해결한다. 예컨대 L-리신의 생산을 위해, 스트레인 ATCC 13032 lysC T311I에 비해 15%만큼 증가된 L-리신의 최종 농도가 결정된다.
바람직한 변형예에서, 스트레인 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I에 비해 변형된 피루브산 카르복실라제는, 알라닌을 통한 343번째 위치에서의 트레오닌의 치환 외에, 추가로, 세린을 통한 1012번째 위치에서의 이소류신의 치환도 포함한다. 그에 상응하게, 본 발명은 변형체들 T343A 및 I1012S를 함유하는 피루브산 카르복실라제를 암호화하고 유전학적으로 변형된 유전자, 상기 유전자를 함유한 플라스미드, 및 상기 유전자 또는 플라스미드를 함유하는 미생물, 그리고 제조 방법에도 관한 것이다. 본 실시형태에서, L-리신의 생산을 위해, 스트레인 ATCC 13032 lysC T311I에 비해, 9 내지 10%만큼 증가된 L-리신의 최종 농도가 결정된다.
본 발명에 따라서, 피루브산 카르복실라제를 암호화하면서 서열 번호 1에 따른 유전자의 최소한 70%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 유전자가 가용하게 되며, 상기 유전자는, 서열 번호 1의 최소한 70% 동일성을 갖는 유전자에서 출발하여, 1027 ~ 1029번째 위치에서 알라닌 암호화 트리플렛(triplet)으로 트레오닌 343 암호화 트리플렛의 치환을 보유한다. 그러므로 1027 ~ 1029번째 위치는 알라닌을 암호화한다. 본 발명에 따른 DNA에는 70% 내지 100%의 동일성의 서열들이 포함된다. 바람직하게 동일성은 80%, 85% 내지 90%이며, 특히 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 매우 특히 바람직한 경우는 서열 번호 1에 따른 유전자이다.
바람직한 구현예에서, 피루브산 카르복실라제를 암호화하면서 서열 번호 1에 따른 유전자의 최소한 70%의 동일성을 갖는 유전자가 가용하게 되며, 상기 유전자는 서열 번호 1의 최소한 70%의 동일성을 갖는 유전자에서 출발하여, 추가로 3034 ~ 3036번째 위치에서 세린을 암호화하는 트리플렛을 보유한다. 이런 실시형태에서도, 70% 내지 100%의 동일성의 서열들이 포함된다. 바람직하게 동일성은 80%, 85% 내지 90%이며, 특히 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 매우 특히 바람직한 경우는 서열 번호 2에 따른 유전자이다.
본원에서 이용되는 것과 같은 동일성은 방정식 I(%) = [1-V/X] x 100을 통해 정의될 수 있으며, 상기 방정식에서 I는 동일성을 의미하고, X는 비교 서열의 핵염기(nucleobase)의 총수이며, V는 비교 서열과 관련하여 고려될 서열의 상이한 핵염기들의 개수이다. 어느 경우에서든, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열(nucleic acid sequence)이란 용어에 의해서는, 유전학적 코드의 변성(degeneration)에 따라서 가능한 것으로 보이는 모든 서열이 포함된다.
또한, 본 발명에 따라서, 변형체 T343A 또는 T343A 및 I1012S를 함유하는 피루브산 카르복실라제를 암호화하는 상기 유전자를 함유하는 벡터(vector), 바람직하게는 플라스미드가 가용하게 된다. 이 경우, 원칙상, 각자의 공벡터(empty vector) 또는 각자의 공플라스미드(empty plasmid)는 출발 벡터(starting vector) 또는 출발 플라스미드(starting plasmid)로서 고려된다. 예컨대 공벡터로서는, Molecular Microbiology 2008, 67: 305~322에 실린 Frunzke 등의 발표 논문에 기술되는 것과 같은 플라스미드 pAN6이 사용될 수 있으며, 여기에 본 발명에 따른 유전자가 삽입되어 있다.
본 발명에 따라서, 변형체 T343A 또는 T343A 및 I1012S를 함유한 본 발명에 따른 DNA를 함유하는 염색체 역시도 가용하게 된다. 이 경우, 본 발명에 따른 DNA는, 미생물의 생존능력에 관련된 유전자들의 기능이 저하되거나 파괴되지 않도록 염색체 내로 삽입되어야 한다.
서열 번호 1에 따른 유전자의 발현을 통해, 서열 번호 3에 따른 피루브산 카르복실라제에 대해 최소한 90%의 서열 동일성을 갖는 본 발명에 따른 피루브산 카르복실라제가 수득되되, 이 본 발명에 따른 피루브산 카르복실라제의 경우, 스트레인 ATCC 13032 lysC T311I의 피루브산 카르복실라제에서 출발하여, 343번째 위치의 트레오닌은 알라닌으로 치환되어 있다(pyc T343A). 그러므로 피루브산 카르복실라제의 343번째 위치에는, 본 발명에 따라서, 예컨대 서열 번호 3에서처럼 알라닌이 위치된다. 본 발명에 따른 피루브산 카르복실라제에는, 서열 번호 3에 대해 90% 내지 100%의 동일성을 갖는 피루브산 카르복실라제들이 포함된다. 바람직하게 동일성은 서열 번호 3의 본 발명에 따라 변형된 피루브산 카르복실라제의 95%, 96%, 또는 97%이며, 특히 바람직하게는 98% 또는 99%이다. 매우 특히 바람직한 경우는 서열 번호 3에 따른 피루브산 카르복실라제이다.
서열 번호 2에 따른 유전자의 발현을 통해, 서열 번호 4에 따른 피루브산 카르복실라제에 대해 최소한 90%의 서열 동일성을 갖는 본 발명에 따른 피루브산 카르복실라제가 수득되되, 이 본 발명에 따른 피루브산 카르복실라제의 경우, 스트레인 ATCC 13032 lysC T311I의 피루브산 카르복실라제에서 출발하여, 343번째 위치에서의 트레오닌은 알라닌을 통해 치환되며, 그리고 그에 추가로 1012번째 위치에서의 이소류신은 세린을 통해 치환된다(pyc T343A;I1012S). 그러므로 피루브산 카르복실라제의 343번째 위치에는, 본 발명에 따라서, 알라닌이 위치되고, 1012번째 위치에는 세린이 위치된다. 본 발명에 따른 피루브산 카르복실라제에는, 서열 번호 4에 대해 90% 내지 100%의 동일성을 갖는 피루브산 카르복실라제들이 포함된다. 바람직하게 동일성은 서열 번호 4의 본 발명에 따라 변형된 피루브산 카르복실라제의 95%, 96%, 또는 97%이며, 특히 바람직하게는 98% 또는 99%이다. 매우 특히 바람직한 경우는 서열 번호 4에 따른 피루브산 카르복실라제이다.
본원에서 이용되는 것과 같은 동일성이란 표현은 방정식 I(%) = [1-V/X] x 100을 통해 정의될 수 있으며, 상기 방정식에서 I는 동일성을 의미하고, X는 비교 서열의 아미노산류의 총수이며, V는 비교 서열과 관련하여 고려될 서열의 상이한 아미노산류의 개수이다. 하기 서열들은 서열 프로토콜에 목록화되어 있다.
서열 번호 1: 본 발명에 따라 변형된 피루브산 카르복실라제(pyc T343A)를 암호화하는, 플라스미드 기반 변형체의 본 발명에 따라 변형된 DNA 서열.
서열 번호 2: 본 발명에 따라 변형된 피루브산 카르복실라제(pyc T343A;I1012S)를 암호화하는, 플라스미드 기반 변형체의 본 발명에 따라 변형된 DNA 서열.
서열 번호 3: 본 발명에 따라 변형된 피루브산 카르복실라제(Pyc-T343A)의 아미노산 서열.
서열 번호 4: 본 발명에 따라 변형된 피루브산 카르복실라제(Pyc-T343A;I1012S)의 아미노산 서열.
서열 번호 5: 피루브산 카르복실라제의 야생형에 대한 기준 스트레인 ATCC 13032 lysC T311I의 DNA 서열.
서열 번호 6: 피루브산 카르복실라제의 야생형에 대한 기준 스트레인 ATCC 13032 lysC T311I의 피루브산 카르복실라제의 아미노산 서열.
서열 번호 7: Pyc-T343A를 암호화하는 본 발명에 따른 염색체 변형체 DNA-pyc-A1027G-T1035G의 DNA 서열.
서열 번호 8: Pyc-T343A;I1012S를 암호화하는 본 발명에 따른 염색체 변형체 DNA-pyc-A1027G-T1035G-T3035G-C3039G의 DNA 서열.
본 발명의 바람직한 개선예에서, 본 발명에 따른 유전자들의 발현은 강화될 수 있다. 이를 위해, 예시로서, 그러나 그에 제한되지 않으면서 상대적으로 더 강한 프로모터들(promoter)이 사용될 수 있고, 유전자 복제수(gene copy number)는 증가될 수 있거나, 또는 전령 RNA(messenger RNA)의 번역(translation)을 증대시키기 위해 리보솜 결합 부위(ribosome-binding site)가 변형될 수 있다. 상기 방식들의 실행을 위해 이용될 방법들은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
또한, 미생물은 본 발명에 따른 유전자 또는 본 발명에 따른 벡터를 함유하는 본 발명의 대상이다. 상기 미생물은 바람직하게는 코리네형 세균(coryneform bacteria)이다. 코리네형 세균으로서는, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토아시도필룸, 코리네박테리움 멜라세콜라, 코리네박테리움 써모아미노게네스, 코리네박테리움 에피시엔스, 브레비박테리움 플라붐, 또는 브레비박테리움 락토퍼멘튬을 예로 들 수 있다.
본 발명에 따라 특히 바람직한 세포들은 코리네박테리움, 브레비박테리움, 에셔리키아(Escherichia), 바실루스(Bacillus), 락토바실루스, 락토코쿠스(Lactococcus), 자이모모나스(Zymomonas), 메틸로박테리움, 랄스토니아, 클로스트리듐, 칸디다(Candida), 피키아(Pichia), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 사카로미세스(Saccharomyces) 및 야로이야(Yarrowia) 종들(species)의 세포들이며, 여기서 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 에피시엔스, 브레비박테리움 플라붐, 브레비박테리움 락토퍼멘튬, 에셔리키아 콜리, 사카로미세스 세레비시아, 클루이베로미세스 락티스, 칸디다 블랑키(candida blankii), 칸디다 루고사(candida rugosa), 자이모모나스 모빌리스, 야로이야 리폴리티카, 메틸로박테리움 엑스토르겐스(Methylobacterium extorquens), 랄스토니아 유트로파 및 피키아 파스토리스가 특히 바람직하다. 본 발명에 따라서 가장 바람직한 세포들은 코리네박테리움 및 에셔리키아 종들의 세포들이며, 코리네박테리움 글루타미쿰 및 에셔리키아 콜리가 매우 특히 바람직한 세균 스트레인들(bacteria strain)이다.
특히 생성물이 L-리신인 경우, 유전학적으로 변형된 세포들은, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC13870, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘튬 ATCC13869 및 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020, 그리고 이들로부터 제조되는 L-아미노산류를 생산하는 돌연변이체들 내지 스트레인들이며, 예컨대 L-리신을 생산하는 스트레인들인 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708, 브레비박테리움 락토퍼멘튬 FERM-P 1712, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715와 같은, 또는 예컨대 L-메티오닌을 생산하는 스트레인인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608과 같은 상기 돌연변이체들 내지 스트레인들로 구성되는 군에서 선택되는 세포들에서 유도될 수 있다. 적합한 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) 스트레인들로서는 에셔리키아 콜리 AJ11442(JP 56-18596 및 US 4,346,170 참조), 에셔리키아 콜리 스트레인 VL611 및 에셔리키아 콜리 스트레인 WC196(WO-A-96/17930 참조)을 예로 들 수 있다.
본 발명에 따라서, 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물들의 제조를 위한 방법이 가용하게 된다.
이를 위해, 유전학적으로 변형되는 피루브산 카르복실라제 암호화 유전자를 함유하면서 단백질 내 치환 T343A 또는 2개의 치환 T343A 및 I1012S를 암호화하는 미생물이 옥살로아세테이트에서 유도되는 신진대사 생성물들(metabolic product)의 생산을 위해 이용된다.
이를 위해, 1027 ~ 1029번째 위치들에서 트레오닌 암호화 트리플렛이 알라닌 암호화 트리플렛으로 치환되는 것이면서 서열 번호 1에 대해 최소한 70%의 동일성을 갖는 유전자, 또는 1027 ~ 1029번째 위치들에서 트레오닌 암호화 트리플렛이 알라닌 암호화 트리플렛으로 치환되며, 그리고 그에 추가로 3034 ~ 3036번째 위치에서 이소류신 암호화 트리플렛이 세린 암호화 트리플렛으로 치환되는 것이면서 서열 번호 2에 대해 최소한 70%의 동일성을 갖는 유전자가 미생물 내로 유입된다.
본 발명에 따른 방법에서는, 서열 번호 1 또는 2에 따른 유전자에 대해 최소한 70% 내지 100%의 동일성을 갖는 유전자의 이용이 포함된다.
바람직하게는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 대해 최소한 80% 내지 90%의 동일성을 갖는 유전자를 함유한 미생물이 이용된다. 특히 바람직하게는, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 대해 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 유전자가 본원의 제조 방법을 위해 이용된다. 매우 특히 바람직한 경우는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 따른 유전자이다.
이 경우, 본 발명에 따라 사용되는 피루브산 카르복실라제 암호화 유전자는 염색체로 이용되거나, 또는 벡터, 바람직하게는 플라스미드 내에서 이용될 수 있다.
유전자는 발현되며, 그리고 343번째 위치에서 트레오닌이 알라닌으로 치환되는 것이면서 서열 번호 3에 따른 피루브산 카르복실라제에 대해 최소한 90%의 동일성을 갖는 본 발명에 따른 피루브산 카르복실라제는 옥살로아세테이트에서 유도되는 신진대사 생성물들의 증가된 생산을 실현한다.
343번째 위치에서 트레오닌이 알라닌으로 치환되고 1012번째 위치에서는 이소류신이 세린으로 치환되는 것이면서 서열 번호 4에 따른 피루브산 카르복실라제에 대해 최소한 90%의 동일성을 갖는 본 발명에 따른 피루브산 카르복실라제의 발현 역시도 오살로아세테이트에서 유도되는 신진대사 생성물들의 증가된 생산을 실현한다.
본 발명에 따른 방법에서는, 서열 번호 3 및 서열 번호 4에 따른 피루브산 카르복실라제에 대해 최소한 90% 내지 100%의 동일성을 갖는 피루브산 카르복실라제의 이용이 포함된다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 이용되는 피루브산 카르복실라제의 동일성은 서열 번호 3 또는 4에 대해 95%, 96% 또는 97%이며, 특히 바람직하게는 98% 또는 99%이다. 특히 바람직한 경우는 서열 번호 3에 따른 피루브산 카르복실라제의 이용이다. 매우 특히 바람직한 경우는 서열 번호 4에 따른 피루브산 카르복실라제의 이용이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 유전자는 강화되어 발현된다.
이렇게 수득되는 미생물들은 발효된다.
생산 유기체로서는 바람직하게는 코리네박테리움, 브레비박테리움, 에셔리키아, 바실루스, 락토바실루스, 락토코쿠스, 자이모모나스, 메틸로박테리움, 랄스토니아, 클로스트리듐, 칸디다, 피키아, 클루이베로미세스, 사카로미세스 및 야로이야 종들로 구성되는 군에서 선택되는 유기체가 사용될 수 있되, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 에피시엔스, 브레비박테리움 플라붐, 브레비박테리움 락토퍼멘튬, 에셔리키아 콜리, 사카로미세스 세레비시아, 클루이베로미세스 락티스, 칸디다 블랑키, 칸디다 루고사, 자이모모나스 모빌리스, 야로이야 리폴리티카, 메틸로박테리움 엑스토르겐스, 랄스토니아 유트로파 및 피키아 파스토리스가 특히 바람직하다. 본 발명에 따라 가장 바람직한 세포들은 코리네박테리움 및 에셔리키아 종의 세포들이며, 코리네박테리움 글루타미쿰 및 에셔리키아 콜리가 매우 특히 바람직한 세균 스트레인들이다.
특히 대사물이 L-리신인 경우, 유전학적으로 변형된 세포들 내지 미생물들은, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC13870, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘튬 ATCC13869 및 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020, 그리고 이들로부터 제조되는 L-아미노산류를 생산하는 돌연변이체들 내지 스트레인들이며, 예컨대 L-리신을 생산하는 스트레인들인 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708, 브레비박테리움 락토퍼멘튬 FERM-P 1712, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715와 같은, 또는 예컨대 L-메티오닌을 생산하는 스트레인인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608과 같은 상기 돌연변이체들 내지 스트레인들로 구성되는 군에서 선택되는 세포들에서 유도될 수 있다. 적합한 에셔리키아 콜리 스트레인들로서는 에셔리키아 콜리 AJ11442(JP 56-18596 및 US 4,346,170 참조), 에셔리키아 콜리 스트레인 VL611 및 에셔리키아 콜리 스트레인 WC196(WO-A-96/17930 참조)을 예로 들 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해, 특히 아스파르테이트 패밀리의 아미노산류, 다시 말해 L-리신, L-아스파르테이트, L-아스파라긴, L-트레오닌, L-이소류신 및 L-메티오닌이 제조될 수 있다. 또한, L-글루타메이트, L-글루타민, L-아르기닌 또는 L-플로린과 같은 글루타메이트 패밀리의 아미노산류, 예컨대 숙신산, 푸마르산염, 말산염, 구연산, 이소시트르산 또는 2-옥소글루타르산과 같은 구연산회로의 중간체들, 디아민류, 예컨대 디아미노펜탄 또는 디아미노부탄, 또는 이타코네이트, 엑토인, 감마-아미노낙산염, 부탄올, 1-프로판올, L-시트룰린, L-오르니틴, D-아르기닌 또는 4-히드록시프롤린과 같은 또 다른 생성물들의 생산도 증가될 수 있다.
그런 다음, 발효를 통해 제조되어 배양 상층액(culture supermatant) 내로 분비(secretion)되는 생성물은 농축되어 고립된다.
하기에서는 실험에 따른 결과들이, 본 발명이 예시적으로 재현되어 있는 도면들에 따라서 설명된다.
도 1은 자연형 Pyc, 염색체로 암호화된 PycT343A 및 염색체로 암호화된 PycT343A;I1012S를 각각 함유하는 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I의 성장을 나타낸 그래프이다.
도 2는 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I, 염색체로 암호화된 PycT343A를 함유한 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I 및 염색체로 암호화된 PycT343A;I1012S를 함유한 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I 스트레인들의 L-리신 생산을 나타낸 그래프이다.
도 3은 플라스미드 pAN6-pyc T343A;I1012S를 함유한 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I Δpyc의 성장을 나타낸 그래프이다.
도 4는 플라스미드 pAN6-pyc T343A;I1012S를 함유한 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I Δpyc 스트레인의 L-리신 생산을 나타낸 그래프이다.
도 1에는, 염색체로 암호화된 Pyc 변형체들 PycT343A 및 PycT343A;I1012S를 각각 함유한 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I 스트레인들의 성장이 도시되어 있다. 도 1에서, 가로좌표에는 시(h) 단위의 시간이 도시되어 있고, 세로좌표에는 620㎚에서 후방산란(Backscatter)에 대한 값(A.U.)이 세포 밀도의 척도로서 도시되어 있다. 대조군으로서는 자연형 Pyc를 함유하는, 다시 말하면 343번째 위치의 트레오닌 및 1012번째 위치의 이소류신을 함유하는 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I 스트레인이 이용된다. 모든 스트레인은 BioLector® 시스템을 이용하여 4%(wt/vol)의 포도당을 함유한 CGXII 최소 배지에서 30℃ 및 1200rpm의 조건으로 24h 동안 배양하였다.
도 2에는, 염색체로 암호화된 Pyc 변형체 PycT343A 및 염색체로 암호화된 Pyc 변형체 PycT343A;I1012S를 각각 함유하는 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I 스트레인들의 L-리신 생산이 도시되어 있다. 여기서는 가로좌표에 3개의 독립된 복제물 및 3개의 실험을 토대로 한 평균값이 표시되어 있고, 세로좌표에는 백분율의 리신 농도가 표시되어 있되, 3개의 독립된 복제물에서 대조군 스트레인 ATCC 13032 lysC T311I의 리신 농도(검은색 막대)는 각각 100%로서 설정하였다. ATCC 13032 lysC T311I pyc T343A 스트레인에 대한 L-리신 농도는 비스듬한 빗금으로 표시된 막대로서 도시되어 있다. ATCC 13032 lysC T311I pyc T343A;I1012S 스트레인에 대한 L-리신 농도는 수평 빗금으로 표시된 막대로서 도시되어 있다. BioLector® 시스템에서 24h 동안 세포들의 배양(도 1 참조) 후에, 세포들을 수득하였고, 각각의 배양의 상층액에서 L-리신 농도는 오르토프탈디알데히드 유도체화(ortho-Phthaldialdehyde derivatization)를 이용한 반전 위상 HPLC를 통해 측정하였다. 3개의 복제물 각자에서는, 변성된 Pyc 변형체 PycT343A를 함유한 스트레인뿐만 아니라 변성된 Pyc 변형체 PycT343A;I1012S를 함유한 스트레인 역시도 자연형 Pyc를 함유한 비교 스트레인보다 더 높은 리신 역가를 나타냈다. 그리고 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I에 비해 평균 15 ~ 19%만큼 최종 L-리신 농도의 증가가 관찰된다. 개별 돌연변이체들의 측정된 리신 농도들은 t 시험을 이용하여 비교하였다. 이 경우, 도면에 도시된 별표(*)는 p ≤ 0.01을 나타낸다.
도 3에는, 플라스미드 pAN6-pyc T343A;I1012S를 함유한 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I Δpyc 스트레인의 성장이 도시되어 있다. 도면에서, 다시금, 세로좌표에는 시(h) 단위의 시간이 표시되어 있고, 세로좌표에는 620㎚에서 후방산란에 대한 값(A.U.)이 표시되어 있다. 대조를 위해, 공플라스미드 pAN6, 또는 자연형 pyc를 함유한 플라스미드 pAN6-pyc를 운반하는 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I Δpyc 스트레인들을 함께 처리하였다. 모든 스트레인은 BioLector® 시스템을 이용하여 4%(wt/vol)의 포도당 및 25mg L-1의 카나마이신을 함유한 CGXII 최소 배지에서 30℃ 및 1200rpm의 조건으로 24h 동안 배양하였다. 배양의 시작 시에, 1mM의 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)로 pyc의 발현을 유도하였다.
도 4에는, 플라스미드 pAN6-pyc T343A;I1012S를 함유한 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I 스트레인의 L-리신 생산이 도시되어 있다. 여기서, 세로좌표에는 공벡터 pAN6(빗금 표시된 막대), 자연형 피루브산 카르복실라제를 포함한 벡터 pAN6-pyc(백색 막대) 또는 벡터 pAN6-pyc T343A;I1012S(검은색 막대)를 각각 함유하는 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I Δpyc 스트레인들이 서로 비교되어 표시되어 있다. BioLector® 시스템에서 24h 동안 세포들의 배양(도 3 참조) 후에, 세포들을 수득하였고, 각각의 배양의 상층액에서 L-리신 농도는 오르토프탈디알데히드 유도체화를 이용한 반전 위상 HPLC를 통해 측정하였다. 비교예로서, C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I Δpyc/pAN6(Pyc 미함유) 및 ATCC 13032 lysC T311I/pAN6-pyc(자연형 Pyc 함유) 스트레인에서 리신 생산을 측정하였다. 표시된 데이터는 적어도 6개의 생물체 복제물을 토대로 한 평균값들 및 표준 편차들이다. 개별 돌연변이체들의 측정된 리신 농도들은 t 시험을 이용하여 비교하였다. 이 경우, 도면에 도시된 별표(*)는 p ≤ 0.05을 나타낸다. 따라서 자연형 Pyc를 함유한 스트레인과 비교하여, PycT343A;I1012S 변형체를 함유한 스트레인에서 9%만큼 최종 L-리신 농도의 분명한 증가가 확인된다.
본 발명의 범주에서, L-리신 생산을 증가시키는 pyc 유전자에서의 돌연변이를 식별할 수 있었다. 맨 먼저, 에러 유발 PCR(error prone PCR)을 이용하여 플라스미드 기반 Pyc 돌연변이체 라이브러리(mutant library)를 작성하였으며, 그에 이어서 이 Pyc 돌연변이체 라이브러리는 ATCC1303 lysC T311I Δpyc 스트레인에서 유전학적으로 암호화된 리신 센서(pSenLys) 및 형광발광 활성화 세포 분류 분석법(FACS)을 이용하여 우선 증가된 형광 발광으로 스크리닝하였다. 그에 이어서, 고립된 세포들을 증가시키고 증가된 리신 형성에 대해 시험하였다. 이런 방식들은 통상의 기술자에게 공지되어 있다(Binder et al., Genome Biol. 2012, 13:R40 참조). 이 경우 고립된 유전자 및 효소 변형체들은 유전학적인 특징을 표시하였으며, 이로써 최종적으로 L-리신의 생산뿐만 아니라 옥살로아세테이트에서 유도되는 다른 대사물들의 생산 역시도 증가시키는 본 발명에 따른 Pyc 변형체들을 식별할 수 있었다. 확인된 돌연변이는 T343A 및 T343A;I1012S이다.
1. 염색체로 암호화된 Pyc 변형체 Pyc-T343A:
염색체로 암호화된 Pyc 변형체 Pyc-T343A를 함유한 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I의 L-리신 생산의 측정:
알라닌 코돈(Alanine Codon)으로 염색체 pyc 유전자 내의 트레오닌 코돈 343의 치환은 통상의 기술자에게 공지된 방법(Schaefer et al. 1994 Gene 145:69~73; Hochheim et al. 2017 Biotechnol Lett 39:238~288)에 따라서 벡터 pK19mobsacB를 이용하면서 2배의 상동 재조합(homologous recombination)을 이용하여 수행하였다. 자연형 염색체 pyc 유전자를 이용한 생산과 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I 스트레인을 이용한 생산을 비교하였다. 스트레인들은 Biolector 시스템을 이용하여 4%(wt/vol)의 포도당을 함유한 800㎕의 CGXII 최소 배지에서 30℃ 및 1200rpm의 조건으로 24h 동안 배양하였다(도 1). 600nm에서 시작 OD는 0.5이었다. 24h 후에, 개별 배양들의 세포들은 침전시키고 상층액 내에서 L-리신 농도를 측정하였다. 측정은 오르토프탈디알데히드를 통한 아미노산류의 칼럼 전 유도체화(pre-column derivatization)를 이용한 반전 위상 HPLC를 통해 수행하였다. 이동상(mobile phase)으로서는 20% 용액 A(100mN의 나트륨 아세테이트(pH 7.2)) 및 80% 용액 B(100%(vol/vol)의 메탄올) 대비 80% 용액 A 및 20% 용액 B의 기울기를 이용하였다. 본 예에서 확인된 점에 따르면, Pyc 변형체 Pyc-T343A가 야생형 Pyc 단백질 대신 염색체로 암호화된다면, 분석한 Pyc 변형체는 리신 생산에 긍정적인 효과가 있고 리신 생산은 최대 15%까지 증가될 수 있다.
2. 염색체로 암호화된 Pyc 변형체 Pyc-T343A;I1012S:
염색체로 암호화된 Pyc 변형체 Pyc-T343A;I1012S를 함유한 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I의 L-리신 생산의 측정:
염색체 pyc 유전자 내에서 알라닌 코돈으로 트레오닌 코돈 343의 치환 및 세린 코돈으로 이소류신 코돈 1012의 치환은 통상의 기술자에게 공지된 방법(Schaefer et al. 1994 Gene 145:69~73; Hochheim et al. 2017 Biotechnol Lett 39:238~288)에 따라서 벡터 pK19mobsacB를 이용하면서 2배의 상동 재조합을 이용하여 수행하였다. 자연형 염색체 pyc 유전자를 이용한 생산과 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I 스트레인을 이용한 생산을 비교하였다. 스트레인들은 Biolector 시스템을 이용하여 4%(wt/vol)의 포도당을 함유한 800㎕의 CGXII 최소 배지에서 30℃ 및 1200rpm의 조건으로 24h 동안 배양하였다(도 1). 600nm에서 시작 OD는 0.5이었다. 24h 후에, 개별 배양들의 세포들은 침전시키고 상층액 내에서 L-리신 농도를 측정하였다. 측정은 오르토프탈디알데히드를 통한 아미노산류의 칼럼 전 유도체화를 이용한 반전 위상 HPLC를 통해 수행하였다. 이동상으로서는 20% 용액 A(100mN의 나트륨 아세테이트(pH 7.2)) 및 80% 용액 B(100%(vol/vol)의 메탄올) 대비 80% 용액 A 및 20% 용액 B의 기울기를 이용하였다. 본 예에서 확인된 점에 따르면, Pyc 변형체 Pyc-T343A;I1012S가 야생형 Pyc 단백질 대신 염색체로 암호화된다면, 분석한 Pyc 변형체는 리신 생산에 긍정적인 효과가 있고 리신 생산은 최대 19%까지 증가될 수 있다.
3. 플라스미드 암호화 Pyc 변형체 Pyc-T343A;I1012S:
C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I Δpyc/pAN6-pycT343A;I1012S의 L-리신 생산의 측정:
자연형 Pyc를 암호화하는 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I Δpyc/pAN6-pyc 스트레인을 이용한 생산과 공플라스미드 대조군 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC T311I Δpyc/pAN6을 이용한 생산을 비교하였다. 스트레인들은 Biolector 시스템을 이용하여 4%(wt/vol)의 포도당 및 25mg/l의 카나마이신을 함유한 800㎕의 CGXII 최소 배지에서 30℃ 및 1200rpm의 조건으로 24h 동안 배양하였다(도 3). 600nm에서 시작 OD는 0.5이었다. 24h 후에, 개별 배양들의 세포들은 침전시키고 상층액 내에서 L-리신 농도를 측정하였다. 측정은 오르토프탈디알데히드를 통한 아미노산류의 칼럼 전 유도체화를 이용한 반전 위상 HPLC를 통해 수행하였다. 이동상으로서는 20% 용액 A(100mN의 나트륨 아세테이트(pH 7.2)) 및 80% 용액 B(100%(vol/vol)의 메탄올) 대비 80% 용액 A 및 20% 용액 B의 기울기를 이용하였다. 본 예에서 확인된 점에 따르면, Pyc 변형체 PycT343A;I1012S가 야생형 Pyc 대신 플라스미드 pAN6에서 암호화된다면, 리신 생산은 최대 9%만큼 증가될 수 있다.
권리포기(disclaimer):
본 발명의 대상은, Ohnishi 등(Applied Microbiology and Biotechnology(응용 미생물학 및 생명공학)(2002) 58: 217-223)의 논문, 요컨대 야생형 ATCC 13032를 기반으로 하면서 2개의 점돌연변이, 요컨대 호모세린 디하이드로게나제(hom)를 위한 유전자 내 Val59Ala 및 아스파르테이트 키나제(lysC)를 위한 유전자 내 Thr311IIe를 운반하는 C. 글루타미쿰 스트레인 AHD2 내로, C. 글루타미쿰의 Pyc의 458번째 위치에서의 프롤린 대 세린의 아미노산 치환의 염색체 도입, 및 다수의 돌연변이(M1V, E153D, A182S, A206S, H227R, A452G, D1120E)를 갖는 C. 글루타미쿰 스트레인 NRRL-B11474에서 기인하는 피루브산 카르복실라제가 C. 글루타미쿰 스트레인 ATCC 21523에서 기인하는 Pyc에 비해 고립된 유기체를 기술한 미국 공보 US 7,300777 B2호에서와 같은 종래 기술에서 공지되어 있는 돌연변이는 아니다.
SEQUENCE LISTING <110> Forschungszentrum J?ich GmbH <120> Pyruvatcarboxylase und f? die Pyruvatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismus zur Produktion und Verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Biosynthese Oxalacetat als Vorstufe beinhaltet und Chromosom <130> PT1.2785 PCT <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3423 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 atgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60 ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120 atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180 attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240 gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300 cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360 cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420 gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480 cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540 gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600 gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660 gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720 ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780 ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840 gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900 ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960 gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020 atcaaggccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080 ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140 cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200 aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260 gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320 gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380 cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440 accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500 cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560 ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620 ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680 gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740 gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800 ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860 ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920 ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980 atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040 gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100 gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160 ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220 gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280 ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340 ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400 gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460 tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520 tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580 gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640 aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700 gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760 cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820 tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880 gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940 gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000 ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060 ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120 gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180 accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240 ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300 atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360 cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420 taa 3423 <210> 2 <211> 3423 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 atgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60 ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120 atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180 attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240 gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300 cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360 cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420 gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480 cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540 gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600 gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660 gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720 ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780 ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840 gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900 ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960 gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020 atcaaggccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080 ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140 cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200 aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260 gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320 gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380 cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440 accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500 cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560 ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620 ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680 gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740 gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800 ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860 ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920 ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980 atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040 gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100 gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160 ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220 gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280 ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340 ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400 gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460 tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520 tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580 gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640 aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700 gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760 cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820 tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880 gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940 gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000 ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgagccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060 ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120 gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180 accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240 ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300 atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360 cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420 taa 3423 <210> 3 <211> 1140 <212> PRT <213> Corybebacterium glutamicum <400> 3 Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu 1 5 10 15 Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu 20 25 30 Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly 35 40 45 Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu 50 55 60 Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu 85 90 95 Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr 100 105 110 Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser 115 120 125 Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu 130 135 140 Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly 145 150 155 160 Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg 165 170 175 Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr 180 185 190 Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr 195 200 205 Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu 210 215 220 Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser 225 230 235 240 Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His 245 250 255 Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe 260 265 270 Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val 275 280 285 Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln 290 295 300 Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys 305 310 315 320 Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu 325 330 335 Thr Gln Asp Lys Ile Lys Ala His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile 340 345 350 Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile 355 360 365 Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala 370 375 380 Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val 385 390 395 400 Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala 405 410 415 Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile 420 425 430 Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg 435 440 445 Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro 450 455 460 Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val 465 470 475 480 Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro 485 490 495 Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser 500 505 510 Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu 515 520 525 Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala 530 535 540 His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro 545 550 555 560 Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu 565 570 575 Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu 580 585 590 Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val 595 600 605 Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro 610 615 620 Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser 625 630 635 640 Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln 645 650 655 Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala 660 665 670 Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys 675 680 685 Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys 690 695 700 Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg 705 710 715 720 Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp 725 730 735 Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala 740 745 750 Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala 755 760 765 Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile 770 775 780 Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu 785 790 795 800 Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr 805 810 815 Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg 820 825 830 His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr 835 840 845 Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala 850 855 860 Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser 865 870 875 880 Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp 885 890 895 Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser 900 905 910 Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp 915 920 925 Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys 930 935 940 Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala 945 950 955 960 Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro 965 970 975 Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr 980 985 990 Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg 995 1000 1005 Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val 1010 1015 1020 Arg Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn 1025 1030 1035 Val Val Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg 1040 1045 1050 Asp Arg Ser Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp 1055 1060 1065 Ser Ser Asn Lys Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val 1070 1075 1080 Thr Val Thr Val Ala Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala 1085 1090 1095 Val Ala Ile Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala 1100 1105 1110 Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr 1115 1120 1125 Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile Val Val Val Ser 1130 1135 1140 <210> 4 <211> 1140 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu 1 5 10 15 Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu 20 25 30 Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly 35 40 45 Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu 50 55 60 Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu 85 90 95 Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr 100 105 110 Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser 115 120 125 Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu 130 135 140 Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly 145 150 155 160 Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg 165 170 175 Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr 180 185 190 Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr 195 200 205 Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu 210 215 220 Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser 225 230 235 240 Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His 245 250 255 Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe 260 265 270 Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val 275 280 285 Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln 290 295 300 Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys 305 310 315 320 Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu 325 330 335 Thr Gln Asp Lys Ile Lys Ala His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile 340 345 350 Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile 355 360 365 Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala 370 375 380 Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val 385 390 395 400 Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala 405 410 415 Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile 420 425 430 Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg 435 440 445 Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro 450 455 460 Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val 465 470 475 480 Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro 485 490 495 Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser 500 505 510 Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu 515 520 525 Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala 530 535 540 His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro 545 550 555 560 Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu 565 570 575 Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu 580 585 590 Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val 595 600 605 Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro 610 615 620 Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser 625 630 635 640 Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln 645 650 655 Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala 660 665 670 Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys 675 680 685 Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys 690 695 700 Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg 705 710 715 720 Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp 725 730 735 Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala 740 745 750 Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala 755 760 765 Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile 770 775 780 Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu 785 790 795 800 Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr 805 810 815 Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg 820 825 830 His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr 835 840 845 Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala 850 855 860 Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser 865 870 875 880 Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp 885 890 895 Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser 900 905 910 Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp 915 920 925 Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys 930 935 940 Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala 945 950 955 960 Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro 965 970 975 Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr 980 985 990 Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg 995 1000 1005 Glu Thr Leu Ser Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val 1010 1015 1020 Arg Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn 1025 1030 1035 Val Val Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg 1040 1045 1050 Asp Arg Ser Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp 1055 1060 1065 Ser Ser Asn Lys Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val 1070 1075 1080 Thr Val Thr Val Ala Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala 1085 1090 1095 Val Ala Ile Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala 1100 1105 1110 Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr 1115 1120 1125 Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile Val Val Val Ser 1130 1135 1140 <210> 5 <211> 3423 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 atgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60 ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120 atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180 attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240 gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300 cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360 cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420 gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480 cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540 gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600 gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660 gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720 ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780 ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840 gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900 ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960 gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020 atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080 ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140 cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200 aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260 gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320 gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380 cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440 accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500 cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560 ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620 ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680 gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740 gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800 ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860 ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920 ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980 atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040 gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100 gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160 ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220 gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280 ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340 ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400 gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460 tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520 tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580 gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640 aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700 gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760 cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820 tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880 gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940 gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000 ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060 ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120 gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180 accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240 ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300 atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360 cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420 taa 3423 <210> 6 <211> 1140 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu 1 5 10 15 Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu 20 25 30 Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly 35 40 45 Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu 50 55 60 Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu 85 90 95 Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr 100 105 110 Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser 115 120 125 Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu 130 135 140 Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly 145 150 155 160 Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg 165 170 175 Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr 180 185 190 Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr 195 200 205 Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu 210 215 220 Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser 225 230 235 240 Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His 245 250 255 Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe 260 265 270 Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val 275 280 285 Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln 290 295 300 Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys 305 310 315 320 Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu 325 330 335 Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile 340 345 350 Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile 355 360 365 Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala 370 375 380 Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val 385 390 395 400 Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala 405 410 415 Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile 420 425 430 Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg 435 440 445 Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro 450 455 460 Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val 465 470 475 480 Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro 485 490 495 Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser 500 505 510 Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu 515 520 525 Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala 530 535 540 His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro 545 550 555 560 Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu 565 570 575 Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu 580 585 590 Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val 595 600 605 Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro 610 615 620 Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser 625 630 635 640 Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln 645 650 655 Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala 660 665 670 Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys 675 680 685 Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys 690 695 700 Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg 705 710 715 720 Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp 725 730 735 Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala 740 745 750 Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala 755 760 765 Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile 770 775 780 Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu 785 790 795 800 Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr 805 810 815 Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg 820 825 830 His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr 835 840 845 Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala 850 855 860 Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser 865 870 875 880 Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp 885 890 895 Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser 900 905 910 Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp 915 920 925 Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys 930 935 940 Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala 945 950 955 960 Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro 965 970 975 Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr 980 985 990 Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg 995 1000 1005 Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val 1010 1015 1020 Arg Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn 1025 1030 1035 Val Val Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg 1040 1045 1050 Asp Arg Ser Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp 1055 1060 1065 Ser Ser Asn Lys Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val 1070 1075 1080 Thr Val Thr Val Ala Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala 1085 1090 1095 Val Ala Ile Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala 1100 1105 1110 Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr 1115 1120 1125 Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile Val Val Val Ser 1130 1135 1140 <210> 7 <211> 3423 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 7 atgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60 ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120 atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180 attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240 gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300 cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360 cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420 gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480 cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540 gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600 gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660 gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720 ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780 ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840 gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900 ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960 gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020 atcaaggccc acggggcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080 ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140 cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200 aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260 gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320 gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380 cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440 accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500 cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560 ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620 ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680 gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740 gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800 ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860 ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920 ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980 atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040 gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100 gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160 ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220 gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280 ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340 ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400 gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460 tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520 tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580 gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640 aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700 gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760 cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820 tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880 gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940 gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000 ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060 ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120 gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180 accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240 ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300 atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360 cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420 taa 3423 <210> 8 <211> 3423 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 8 atgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60 ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120 atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180 attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240 gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300 cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360 cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420 gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480 cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540 gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600 gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660 gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720 ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780 ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840 gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900 ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960 gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020 atcaaggccc acggggcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080 ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140 cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200 aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260 gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320 gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380 cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440 accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500 cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560 ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620 ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680 gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740 gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800 ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860 ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920 ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980 atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040 gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100 gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160 ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220 gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280 ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340 ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400 gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460 tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520 tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580 gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640 aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700 gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760 cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820 tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880 gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940 gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000 ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgagccggc tgccagatgt gcgcacccca 3060 ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120 gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180 accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240 ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300 atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360 cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420 taa 3423

Claims (25)

  1. 서열 번호 1에 대해 최소한 70%의 동일성을 갖는 DNA 서열에 있어서, 1027 ~ 1029번째 위치에서의 트리플렛은 알라닌을 암호화하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA는 서열 번호 1에 대해 최소한 80%의 동일성을 보유하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DNA는 서열 번호 1에 따른 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 3034 ~ 3036번째 위치에, 세린을 암호화하는 트리플렛이 위치되는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
  5. 제4항에 있어서, 상기 DNA는 서열 번호 2에 대해 최소한 80%의 동일성을 보유하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 DNA는 서열 번호 2에 따른 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
  7. 서열 번호 3에 따른 피루브산 카르복실라제에 대해 최소한 90%의 동일성을 갖는 피루브산 카르복실라제에 있어서, 343번째 위치에 알라닌이 위치되는 것을 특징으로 하는 피루브산 카르복실라제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 피루브산 카르복실라제는 서열 번호 3에 따른 피루브산 카르복실라제에 대해 최소한 95%의 동일성을 보유하는 것을 특징으로 하는 피루브산 카르복실라제.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 피루브산 카르복실라제는 서열 번호 3에 따른 피루브산 카르복실라제인 것을 특징으로 하는 피루브산 카르복실라제.
  10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피루브산 카르복실라제는 추가로 1012번째 위치에 세린을 포함하는 것을 특징으로 하는 피루브산 카르복실라제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 피루브산 카르복실라제는 서열 번호 4에 따른 피루브산 카르복실라제에 대해 최소한 95%의 동일성을 보유하는 것을 특징으로 하는 피루브산 카르복실라제.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 피루브산 카르복실라제는 서열 번호 4에 따른 피루브산 카르복실라제인 것을 특징으로 하는 피루브산 카르복실라제.
  13. 벡터에 있어서, 상기 벡터는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 DNA 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 벡터.
  15. 미생물에 있어서, 상기 미생물은 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 DNA을 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  16. 제9항에 있어서, 상기 미생물은 제13항 또는 제14항에 다른 벡터를 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움, 브레비박테리움, 바실루스, 락토바실루스, 락토코쿠스, 칸디다, 피키아, 클루이베로미세스, 사카로미세스, 에셔리키아, 자이모모나스, 야로이야, 메틸로박테리움, 랄스토니아, 비브리오 및 클로스트리듐 종들로 구성되는 군에서 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는 미생물.
  18. 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물들의 제조를 위한 방법에 있어서, 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 서열을 함유한 피루브산 카르복실라제를 형성하는 제1항 내지 제6항에 따른 DNA를 함유하는 미생물은 발효되며, 배지 내에서, 또는 세포들 내에서 생성물의 농축이 실행되는 것을 특징으로 하는 생성물의 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 생성물은 고립되는 것을 특징으로 하는 생성물의 제조 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 미생물로서는 코리네박테리움, 브레비박테리움, 바실루스, 락토바실루스, 락토코쿠스, 칸디다, 피키아, 클루이베로미세스, 사카로미세스, 에셔리키아, 자이모모나스, 야로이야, 메틸로박테리움, 랄스토니아, 비브리오 및 클로스트리듐 종들로 구성되는 군에서 선택되는 종이 사용되는 것을 특징으로 하는 생성물의 제조 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파르테이트 패밀리의 아미노산이 제조되는 것을 특징으로 하는 생성물의 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, L-리신, L-아스파르테이트, L-아스파라긴, L-트레오닌, L-이소류신 또는 L-메티오닌이 제조되는 것을 특징으로 하는 생성물의 제조 방법.
  23. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, L-글루타메이트, 글루타민, L-아르기닌, L-플로린, L-시트룰린 또는 L-오르니틴과 같은 아미노산류의 글루타메이트 패밀리로 이루어진 물질들, 말산염, 푸마르산염, 숙신산, 말산염, 푸마르산염, 구연산, 이소시트르산, 또는 2-옥소글루타르산과 같은 구연산회로의 중간체들, 디아미노펜탄 또는 디아미노부탄과 같은 디아민류, 그리고 이타코네이트, 엑토인, 감마-아미노낙산염, 부탄올, 1-프로판올, L-시트룰린, L-오르니틴, D-아르기닌 또는 4-히드록시프롤린과 같은 옥살로아세테이트로 제조되는 또 다른 신진대사 생성물들이 제조되는 것을 특징으로 하는 생성물의 제조 방법.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제6항에 따른 유전자들은 강화되어 발현되는 것을 특징으로 하는 생성물의 제조 방법.
  25. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 DNA 서열을 함유하는 염색체.
KR1020197030800A 2017-05-18 2018-04-13 피루브산 카르복실라제 및 피루브산 카르복실라제 암호화 dna, 상기 dna를 함유한 플라스미드 및 그 생산을 위한 미생물, 그리고 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물의 제조 방법, 그리고 염색체 KR102593871B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102017004751.0 2017-05-18
DE102017004751.0A DE102017004751A1 (de) 2017-05-18 2017-05-18 Pyruvatcarboxylase und für die Pyruvatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismus zur Produktion und verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Bioynthese Oxalacetat als Vorstufe beeinhaltet und Chromosom
PCT/DE2018/000104 WO2018210358A1 (de) 2017-05-18 2018-04-13 Pyruvatcarboxylase und für die pyruvatcarboxylase kodierende dna, plasmid enthaltend die dna, sowie mikroorganismus zur produktion und verfahren zur herstellung von produkten, deren biosynthese oxalacetat als vorstufe beinhaltet und chromosom

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200008997A true KR20200008997A (ko) 2020-01-29
KR102593871B1 KR102593871B1 (ko) 2023-10-26

Family

ID=62110811

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197030800A KR102593871B1 (ko) 2017-05-18 2018-04-13 피루브산 카르복실라제 및 피루브산 카르복실라제 암호화 dna, 상기 dna를 함유한 플라스미드 및 그 생산을 위한 미생물, 그리고 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물의 제조 방법, 그리고 염색체

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11028384B2 (ko)
EP (1) EP3625336B1 (ko)
JP (1) JP7201614B2 (ko)
KR (1) KR102593871B1 (ko)
CN (1) CN110603321B (ko)
DE (1) DE102017004751A1 (ko)
DK (1) DK3625336T3 (ko)
WO (1) WO2018210358A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755492B (zh) * 2020-07-20 2023-05-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19831609A1 (de) * 1997-10-04 1999-04-15 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel
EP1607193A2 (de) * 2004-06-15 2005-12-21 ABB PATENT GmbH Verfahren und System zur Zustandsbewertung von wenigstens einem Achsgelenk
WO2008006680A2 (de) * 2006-07-13 2008-01-17 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren mittels mutanten des glta-gens kodierend für citratsynthase

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5618596A (en) 1979-07-23 1981-02-21 Ajinomoto Co Inc Production of l-lysine through fermentation process
DE69534801T3 (de) 1994-12-09 2013-05-08 Ajinomoto Co., Inc. Neues lysin decarboxylase gen und verfahren zur herstellung von l-lysin
SK284235B6 (en) 1997-10-04 2004-11-03 Forschungszentrum Juelich Gmbh Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method
DK2194122T3 (en) * 1998-04-13 2016-02-15 Univ Georgia Overexpression of pyruvate carboxylase increased the production of biochemicals derived from oxaloacetate, in microbial cells
US6171833B1 (en) * 1998-12-23 2001-01-09 Massachusetts Institute Of Technology Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum
DE19931314A1 (de) 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von Lysin
AU2002213146B2 (en) 2000-10-13 2006-02-16 Archer-Daniels-Midland Company Feedback-resistant pyruvate carboxylase gene from corynebacterium
US7927859B2 (en) * 2003-08-22 2011-04-19 Rice University High molar succinate yield bacteria by increasing the intracellular NADH availability
WO2007113127A1 (en) 2006-03-30 2007-10-11 Basf Se Process for the production of cadaverine
CL2008002085A1 (es) * 2007-07-16 2008-11-21 Genentech Inc Anticuerpo humanizado anti-cd79b/igbeta/b29; polinucleotido codificacnte, vector, celula huesped; metodo de fabricacion; inmunoconjugado; composicion farmaceutica; uso para tratar cancer; metodo in vitro para determinar presencia de cd79b, oinhibir crecimiento de celulas quqe expresa cd79b; ensayo in vitro para detectar celulas b
WO2009102473A2 (en) * 2008-02-14 2009-08-20 Human Genome Sciences, Inc. Human g-protein chemokine receptor (ccr5) hdgnr10
JP2011193788A (ja) 2010-03-19 2011-10-06 Toyota Central R&D Labs Inc 発酵能力が向上された酵母及びその利用
EP2633042A1 (en) * 2010-10-29 2013-09-04 Allylix, Inc. Modified valencene synthase polypeptides, encoding nucleic acid molecules and uses thereof
EP2796555B1 (en) * 2011-12-21 2018-08-29 Cj Cheiljedang Corporation Method for producing l-lysine using microorganisms having ability to produce l-lysine
DE102012016716A1 (de) 2012-08-22 2014-02-27 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Herstellung von Vektoren enthaltend ein für in seiner feedback-Inhibierung gemindertes oder ausgeschaltetes Enzym kodierendes Gen und deren Verwendung für die Herstellung von Aminosäuren und Nukleotiden

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19831609A1 (de) * 1997-10-04 1999-04-15 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel
EP1607193A2 (de) * 2004-06-15 2005-12-21 ABB PATENT GmbH Verfahren und System zur Zustandsbewertung von wenigstens einem Achsgelenk
WO2008006680A2 (de) * 2006-07-13 2008-01-17 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren mittels mutanten des glta-gens kodierend für citratsynthase

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Appl Microbiol Biotechnol.,58(2):217-223(2002.2.) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3625336A1 (de) 2020-03-25
US20200056166A1 (en) 2020-02-20
JP7201614B2 (ja) 2023-01-10
US11028384B2 (en) 2021-06-08
CN110603321A (zh) 2019-12-20
DK3625336T3 (da) 2021-09-20
KR102593871B1 (ko) 2023-10-26
EP3625336B1 (de) 2021-07-07
DE102017004751A1 (de) 2018-11-22
WO2018210358A1 (de) 2018-11-22
CN110603321B (zh) 2024-03-05
JP2020519240A (ja) 2020-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2733425C1 (ru) Новый промотор и его применение
JP4595506B2 (ja) Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
AU2016284767B2 (en) Microorganisms for producing putrescine or ornithine and process for producing putrescine or ornithine using them
US10415068B2 (en) Microorganism for production of putrescine and methods for production of putrescine using the same
CN112888776B (zh) 生产目标物质的方法
RU2687206C1 (ru) Микроорганизмы corynebacterium sp., обладающие способностью продуцировать l-лизин, и способ продуцирования l-лизина с использованием этих микроорганизмов
AU2016297226A1 (en) Microorganism for producing putrescine or ornithine and method for producing putrescine or ornithine by using same
JP6860565B2 (ja) Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ−リジン生産方法
JP2017023147A (ja) 発酵法による目的物質の製造法
CN101952418B (zh) 生产(2s，3r，4s)-4-羟基-l-异亮氨酸的方法
JP2009507505A (ja) 微生物を使用するアミノ酸産生法
Xu et al. Genetically modifying aspartate aminotransferase and aspartate ammonia-lyase affects metabolite accumulation in l-lysine producing strain derived from Corynebacterium glutamicum ATCC13032
KR102593871B1 (ko) 피루브산 카르복실라제 및 피루브산 카르복실라제 암호화 dna, 상기 dna를 함유한 플라스미드 및 그 생산을 위한 미생물, 그리고 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물의 제조 방법, 그리고 염색체
WO2007114465A1 (ja) メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法
US20150118720A1 (en) Process for producing amino acid
WO2023095896A1 (ja) 遺伝子組換え微生物、及びアスパラギン酸を生産する方法
KR102023770B1 (ko) 부산물 생산이 감소된 l-라이신 생산 변이 균주 및 이를 이용한 l-라이신의 제조 방법
JPWO2008026698A1 (ja) Ｌ‐グルタミンの製造法
KR20230092008A (ko) L-아미노산의 제조법
CN114350585A (zh) 一种高产d-泛酸的基因工程菌、构建方法其应用
WO2018210359A1 (de) Pyruvatcarboxylase mit einer feedback-resistenz verursachende mutation, kodierende dna, plasmide, sowie migroorganismus zur produktion und verfahren zur herstellung von produkten, deren biosynthese oxalacetat als vorstufe beinhaltet

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right