KR102023770B1 - 부산물 생산이 감소된 l-라이신 생산 변이 균주 및 이를 이용한 l-라이신의 제조 방법 - Google Patents

부산물 생산이 감소된 l-라이신 생산 변이 균주 및 이를 이용한 l-라이신의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

부산물 생산의 감소 또는 생성된 부산물의 이용을 통하여 L-라이신 생산능이 개선된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 변이 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법에 관한 것이다.

Description

부산물 생산이 감소된 L-라이신 생산 변이 균주 및 이를 이용한 L-라이신의 제조 방법{Mutant Strain With Enhanced L-Lysine Production And Method For Producing L-Lysine Using The Same}
본 발명은 부산물 생산이 감소된 L-라이신 생산 변이 균주 및 이를 이용한 L-라이신의 제조 방법에 관한 것이다.
L-라이신은 필수 아미노산의 일종으로 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며, 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주나 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균주를 이용한 발효에 의해 생산된다. 코리네박테리움 속 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성(Gram positive)의 미생물이다.
L-라이신의 생산을 위해 미생물에서 L-라이신 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 L-라이신의 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적인 접근 방법이 주로 이용되고 있다. 또한, L-라이신 생산에 관여하지 않는 유전자를 제거하는 방법, 구체적으로 기능이 알려지지 않은 유전자를 제거하는 방법 또한 활용되고 있다.
본 발명자들은 라이신 생산능을 증가시킬 수 있는 방법을 연구한 결과, 유전자 변형을 통하여 L-라이신 생합성 중에 생성되는 부산물을 감소시키거나 또는 생성된 부산물을 이용하면 L-라이신 생산능이 증가한다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
1. Journal of Bacteriology, Feb. 2008, 963-971.
본 발명의 일 목적은 모균주 대비 L-라이신의 생산능이 증가된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 변이 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 3-디옥시 아라비노 헵툴로소네이트 7-포스페이트 신타아제(3-deoxy arabino heptulosonate 7-phosphate synthase)의 활성이 약화 또는 불활성화되어 모균주 대비 L-라이신의 생산능이 증가된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 변이 균주를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 변이 균주는 3-디옥시 아라비노 헵툴로소네이트 7-포스페이트 신타아제를 암호화하는 aroF 유전자(Gene ID:1018979)의 전부 또는 일부가 결실되어 3-디옥시 아라비노 헵툴로소네이트 7-포스페이트 신타아제의 활성이 약화 또는 불활성화된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "활성이 약화"는 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 낮은 경우 및 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "불활성화"는 효소 등 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 전혀 이루어지지 않는 경우, 또는 발현이 되더라도 발현된 단백질의 활성이 없는 경우를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "일부"는 폴리뉴클레오티드의 서열의 전부 아닌 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 변이 균주는 추가적으로 락테이트 디하이드로게나아제(lactate dehydrogenase)의 활성이 강화된 것일 수 있으며, 이는 락테이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 lldD 유전자(Gene ID: 1020860)의 발현이 증가되어 활성이 강화된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "발현의 증가"는 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 증가된 것을 의미한다. 미생물에서 발현을 증가시키고자 하는 경우에는 유전자 번역의 개시 코돈을 치환시켜 그 발현을 증가시키거나, 기존에 존재하는 유전자의 복제수(copy number)를 증가시켜 발현을 증가시킬 수 있다. 발현 조절을 위하여 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 발현을 증가시키고자 하는 유전자가 미생물 내에 존재하는 경우, 예를 들어, 상기 유전자의 발현을 작동시키는 고유의 프로모터(native promoter)를 강한 프로모터(strong promoter)로 치환 혹은 변이를 도입함으로써 상기 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 변이 균주는 추가적으로 lldD 유전자의 전사 조절자를 암호화하는 lldR 유전자(Gene ID: 1020857)의 발현이 감소된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "발현의 감소"는 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 감소된 것을 의미한다. 미생물에서 발현을 감소시키고자 하는 경우에는 유전자 번역의 개시 코돈을 치환시켜 그 발현을 감소시키거나, 기존에 존재하는 유전자의 발현량이 감소하도록 유전공학적으로 조작할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 코리네박테리움 속 변이 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes ), 코리네박테리움 아세토액시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola), 코리네 박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 코리네박테리움 속 변이 균주를 제작하기 위하여는 형질전환이 되지 않은 코리네박테리움 속 균주로부터 형질전환된 코리네박테리움 속 균주를 분리 및 수득하는 단계를 포함한다.
상기 형질전환된 균주를 분리 및 수득하는 단계를 실시하는데 있어 선택 표지된 벡터를 이용할 수 있고, 본 발명에서 이용하는 선택표지는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다. 구체적으로는 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함하며, 바람직하게는 암피실린, 카나마이신 내성 유전자, 보다 바람직하게는 카나마이신 내성 유전자이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용하는 벡터는 플라스미드, 파지(phage) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양상은 본 발명에 따른 코리네박테리움 속 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 균주 및 배양 배지에서 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 이용되는 균주는 당업계에 공지된 배양 방법을 통해 배양될 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.
배양물의 온도는 27℃ 내지 40℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 37℃일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 기간은 원하는 생산량의 L-라이신이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10시간 내지 100시간일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 L-라이신을 회수하는 단계는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-라이신을 회수할 수 있으며, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 코리네박테리움 속 변이 균주를 이용하면 L-라이신을 고효율로 생산할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 하나 이상의 구체예를 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: aroF 유전자의 발현이 결손 또는 약화된 코리네박테리움 글루타미쿰 ( Corynebacterium glutamicum ) 균주 제작
미생물 대사 경로에서 포스포에놀피루베이트(phosphoenol pyruvate)는 라이신 합성에 이용되지만, aroF 유전자에 의하여 암호화되는 3-디옥시 아라비노 헵툴로소네이트 7-포스페이트 신타아제(3-deoxy arabino heptulosonate 7-phosphate synthase, DAHP)에 의하여 페닐알라닌, 타이로신 등으로 합성된다. 따라서 L-라이신 이외의 다른 아미노산 부산물을 감소시키고, L-라이신 생합성에 필요한 기질을 증가시키기 위하여 aroF 유전자(Gene ID:1018979 )의 발현이 결손 또는 약화된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum, 이하 C. glutamicum으로 기재함) 균주를 제작하였다.
1-1. aroF 유전자가 결손된 재조합 벡터 제작
Corynebacterium glutamicum의 염색체 DNA를 주형으로 이용하여, aroF 유전자의 개방해독프레임(open reading frame, ORF) 일부분이 소실된 재조합 벡터를 제작하였다. 재조합 벡터 제작에 이용한 프라이머는 표 1에 기재하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
KF1-1F GCGTATACAACGACACCAACGC 1
KF1-1R TATCAGCGATGTCCTGGCGATC 2
KF1-2F CGCCAAGCTTGCGTATACAACGACACCAACGCAATC 3
KF1-2R GTCCTGGCGATCCTGCTCCACC 4
KF1-3F GCGCACAGAACCTTGATCCTGC 5
KF1-3R ACGATTTCCTGGCGTCCGCCATAAC 6
KF1-4F ATCGCTGATAGCGCACAGAACCTTGATCCTGCGA 7
KF1-4R GGCGTCCGCCATAACCGACAGCC 8
KF1-5F AGGAAATCGTGAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC 9
KF1-5R AAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAG 10
구체적으로 DNA 폴리머라제(clontech) 및 상기 표 1의 프라이머를 이용하여 aroF 유전자 단편을 증폭하였다. 증폭 조건은 94℃에서 30초 변성(denaturation), 57℃에서 30초 결합(annealing) 및 72℃에서 2분 동안 확장(extension)하고, 28 내지 30주기로 수행하였다. 이후, 증폭 산물에 제한효소 DpnI을 처리하여 pCGI (Kim et al.,2011.,J. Microbiol. Methods) 벡터와 결합시켰다. 재조합 벡터를 대장균 DH5a (E. coli DH5a; RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618; Hanahan, D., 1983, J. Mol. Biol., 166:557-580)에 형질전환시키고, 카나마이신(50 ㎍/㎖)이 포함된 LB(Luria-Bertani) 한천 플레이트에 도말하여 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. Plasmid miniprep kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 생성된 대장균 콜로니에서 플라스미드(aroF 유전자가 결손된 재조합 벡터)를 추출하고, "pCGaroF"로 명명하였다. 최종 염기서열은 시퀀싱(sequencing) 분석을 통해 확인하였다.
1-2. KF1 균주 제작
CM 액체배지[포도당 10 g, 폴리펩톤 10 g, 효모 추출물 10 g, NaCl 2.5 g, Urea 2 g(증류수 1리터 기준), pH 7.0] 10 ㎖에 C. glutamicum K070 균주를 접종하여 30℃에서 밤새 전배양(preincubation)하였다. 상기 전배양액을 BHIS 배지[BHI 37 g, 2M 소르비톨 250 ㎖(증류수 1리터 기준)] 100 ㎖에 OD600이 0.2 내지 0.3이 되도록 접종하고, 30℃에서 200 rpm으로 OD600이 0.8 내지 0.9가 될 때까지 6시간 동안 배양하였다.
배양이 끝나면 미리 냉각시킨 튜브(prechilled tube)에 배양액을 넣고, 4℃ 및 5,000 rpm에서 3회 내지 4회 정도 10% 글리세롤로 세정하였다. 세정이 끝나면 세포를 회수하여 10% 글리세롤에 현탁시키고, 100 ㎕씩 분주하여 -70℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
BIO-RAD사의 펄서(2.5kv, 25 ㎌, 200)를 이용하여 C. glutamicum K070 세포에 전기천공법(0.2 ㎝ cuvette)으로 pCGaroF를 형질전환시켰다. 그 후, CM 액체 배지 1 ㎖을 첨가하여 바로 46℃에서 6분 동안 예열(pre-warmming)하고, 200 rpm 및 30℃에서 2시간 동안 진탕배양하였다. 2시간 후 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 BHIS(Brain Heart Infusion) 한천 플레이트에 도말하여 30℃에서 40시간 동안 배양하였다.
2차 재조합에 이용하기 위하여, 생성된 콜로니들을 BHIS 배지 200 ㎕에 접종하여 30℃ 및 200 rpm으로 밤새 배양하였다. 이후 배양액을 1:1000으로 희석하여 스트렙토마이신(40 ㎍/㎖)이 포함된 CM 한천 플레이트에 도말하고, 30℃에서 72시간 동안 배양하였다. 삽입물(insert)이 벡터에 정확히 존재하는지 PCR로 확인하고, 최종 선별된 균주를 "KF1"으로 명명하였다.
1-3. KF1 균주의 라이신 생산능 확인
CM 액체배지 10 ㎖에 C. glutamicum K070 균주 및 KF1 균주를 접종하고, 30℃ 및 180 rpm에서 16시간 동안 진탕배양하였다. 100 ㎖ 플라스크에 하기 표 2의 조성을 가지는 L-라이신 생산배지 10 ㎖을 첨가하고, 상기 CM 액체배지에서 진탕배양한 배양액 1 ㎖을 접종하였다. 이후 30℃ 및 180 rpm에서 48시간 동안 진탕배양하였다. 배양 종료 후 오르쏘-프탈알데하이드(ο-phthalaldehyde)를 유도체화시키고(Hill DW et al., 1979. Anal Chem 51:1338), HPLC(Shimazu, Japan), L-라이신 생산량을 측정하였다.
성분 농도 생산배지 첨가량
설탕 10% 100g/L
유안 5.5% 55 g/L
효모액기스 0.5% 20 g/L
MgSO47H2O 1.2 g/L 1.2 g/L
KH2PO4 0.11% 1.1 g/L
ZnSO4 0.9 ppm 0.9 ㎎/L
FeSO4 180 ppm 180 ㎎/L
MnSO4 180 ppm 180 ㎎/L
CuSO4 0.9 ppm 0.9 ㎎/L
beta-alanine (BTA) 9 ppm 9 ㎎/L
NAD (nicotinamide) 60 ppm 60 ㎎/L
Thiamine-HCl 9 ppm 9 ㎎/L
Biotin 1.8 ppm 1.8 ㎎/L
CaCO3 5% 5 g/L
생산된 L-라이신의 농도를 확인한 결과, 하기 표 3에 나타난 것과 같이 모균주인 K070 균주와 비교하여 KF1 균주의 라이신 생산성이 다소 증가한 것을 확인할 수 있었다.
균주 OD600 L-라이신 (g/L)
K070 31.4±0.11 66.2±0.08
KF1 32.0±0.20 67.3±0.10
실시예 2: lldD 유전자의 발현을 강화시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 제작
락테이트 디하이드로게나아제(lactate dehydrogenase)는 lldD 유전자(Gene ID: 1020860)에 의해 암호화되며, 락테이트로부터 피루브산(pyruvate)을 합성하여 라이신 생합성을 위한 기질을 공급한다. 따라서, 실시예 1에서 제작한 KF1 균주를 모주로 하여 lldD 유전자의 발현이 증가된 재조합 균주를 제작하였다.
2-1. lldD 유전자의 발현이 강화된 재조합 벡터 제작
C. glutamicum의 염색체 DNA를 주형으로 이용하여, lldD 유전자 ORF의 DNA 단편 및 염기 서열을 확보하였으며, 하기 표 4의 프라이머를 이용하여 유전자 단편을 증폭하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
KD2-1F ATCGCTGATAAGCTGCCAATTATTCCGGGCTTG 11
KD2-1R GGGTAA AAAATCCTTTCGTAGGTTTC 12
KD2-2F TCCTTTCGTAGGTTTCCGCACCG 13
KD2-2R ATGGTGAAACGTCAACTGCCCAAC 14
KD2-3F AACTGGGTCGACTGCAGAACACAC 15
KD2-3R TTTTTTACCCATGGTGAAACGTCAACTGCCCAAC 16
KD2-4F ACTGCAGAACACACGGTTGTGGG 17
KD2-4R CGACCCAGTTGCGCACAGAACCTTGATCCTGCGAA 18
KD2-5F AACAAGCGCGTCGTGGCTTTC 19
KD2-5R ACCGCCATTGATGCGCAATTTC 20
이후 실시예 1-1과 동일한 방법을 이용하여 증폭된 lldD 유전자 단편을 pCGI 벡터와 결합시켰다. 상기 벡터를 "pCGlld"로 명명하고, 시퀀싱 분석으로 최종 염기서열을 확인하였다.
2-2. KD2 균주 제작 및 라이신 생산능 확인
상기 실시예 1-2에서 제작한 KF1 균주를 모주로 하여 pCGlld 벡터를 형질전환시켰다. 형질전환 방법은 실시예 1-2와 동일한 방법을 이용하였으며, PCR로 lldD 유전자 단편의 삽입 여부를 확인하였다. 최종 선별된 균주(aroF 유전자의 발현은 약화 또는 결손되고, lldD 유전자의 발현은 강화된 균주)는 KD2로 명명하였다.
KF1 균주 및 KD2 균주의 라이신 생산성을 실시예 1-3과 동일한 방법으로 확인한 결과, 하기 표 5에 나타난 바와 같이 KF1 균주와 비교하여 KD2 균주의 라이신 생산성이 상승한 것을 알 수 있었다.
균주 OD600 L-라이신 (g/L)
KF1 30.1±0.13 67.9±0.07
KD2 29.8±0.09 68.8±0.06
실시예 3: lldR 유전자의 발현이 약화 또는 결손된 코리네박테리움 글루타미 쿰 균주 제작
3-1. lldR 유전자가 결손된 재조합 벡터 제작
Corynebacterium glutamicum의 염색체 DNA를 주형으로 lldR 유전자의 ORF 일부분이 소실된 DNA 단편 및 염기 서열을 확보하였으며, 하기 표 6의 프라이머를 이용하여 유전자 단편을 증폭하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
KR3-1F TGATTACGCCCGAACTTGGCTGGAATGCTCT 21
KR3-1R TTTAGGCGACCGCTGCGGA 22
KR3-2F CGAACTTGGCTGGAATGCTCT 23
KR3-2R GTCACCGATTTTTAGGCGACC 24
KR3-3F AATCGGTGACGAAGGCTACTACGAAGAAACC 25
KR3-3R ACGTGGCTTACCCCATCAAC 26
KR3-4F GAAGGCTACTACGAAGAAACC 27
KR3-4R AGAAACCTCCACGTGGCTTAC 28
KR3-5F GGAGGTTTCTCGAATTCACTGGCCGTCGTT 29
KR3-5R TGGTCATAGCTGTTTCCTGT 30
이후 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 증폭된 lldR 유전자 단편을 pCGI 벡터와 결합시켰다. 상기 벡터를 "pCGllr"로 명명하고, 시퀀싱 분석으로 최종 염기서열을 확인하였다.
3-2. KR3 균주 제작 및 라이신 생산능 확인
상기 실시예 2-2에서 제작한 KD2 균주를 모주로 하여 pCGllr 벡터를 형질전환시켰다. 형질전환 방법은 실시예 1-2와 동일한 방법을 이용하였으며, PCR로 lldR 유전자 단편의 삽입 여부를 확인하였다. 최종 선별된 균주(aroF 유전자의 발현은 약화 또는 결손되고, lldD 유전자의 발현은 강화되며, lldR 유전자의 발현은 약화 또는 결손된 균주)는 KR3로 명명하였다.
KD2 균주 및 KR3 균주의 라이신 생산성을 실시예 1-3과 동일한 방법으로 확인한 결과, 표 7에 나타난 바와 같이 KD2 균주와 비교하여 KR3 균주의 라이신 생산성이 상승한 것을 알 수 있었다. 또한, K070 균주와 비교하여 KR3 균주의 라이신 생산성이 8% 향상된 것을 확인할 수 있었다.
균주 OD600 L-라이신 (g/L)
KD2 28.2±0.10 69.0±0.05
KR3 28.0±0.06 70.5±0.03
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Daesang Corporation <120> Mutant Strain With Enhanced L-Lysine Production And Method For Producing L-Lysine Using The Same <130> PN170234 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KF1-1 (forward) <400> 1 gcgtatacaa cgacaccaac gc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KF1-1 (reverse) <400> 2 tatcagcgat gtcctggcga tc 22 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KF1-2 (forward) <400> 3 cgccaagctt gcgtatacaa cgacaccaac gcaatc 36 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KF1-2 (reverse) <400> 4 gtcctggcga tcctgctcca cc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KF1-3 (forward) <400> 5 gcgcacagaa ccttgatcct gc 22 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KF1-3 (reverse) <400> 6 acgatttcct ggcgtccgcc ataac 25 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KF1-4 (forward) <400> 7 atcgctgata gcgcacagaa ccttgatcct gcga 34 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KF1-4 (reverse) <400> 8 ggcgtccgcc ataaccgaca gcc 23 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KF1-5 (forward) <400> 9 aggaaatcgt gaattcactg gccgtcgttt tac 33 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KF1-5 (reverse) <400> 10 aagcttggcg taatcatggt catag 25 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KD2-1 (forward) <400> 11 atcgctgata agctgccaat tattccgggc ttg 33 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KD2-1 (reverse) <400> 12 gggtaaaaaa tcctttcgta ggtttc 26 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KD2-2 (forward) <400> 13 tcctttcgta ggtttccgca ccg 23 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KD2-2 (reverse) <400> 14 atggtgaaac gtcaactgcc caac 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KD2-3 (forward) <400> 15 aactgggtcg actgcagaac acac 24 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KD2-3 (reverse) <400> 16 ttttttaccc atggtgaaac gtcaactgcc caac 34 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KD2-4 (forward) <400> 17 actgcagaac acacggttgt ggg 23 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KD2-4 (reverse) <400> 18 cgacccagtt gcgcacagaa ccttgatcct gcgaa 35 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KD2-5 (forward) <400> 19 aacaagcgcg tcgtggcttt c 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KD2-5 (reverse) <400> 20 accgccattg atgcgcaatt tc 22 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KR3-1 (forward) <400> 21 tgattacgcc cgaacttggc tggaatgctc t 31 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KR3-1 (reverse) <400> 22 tttaggcgac cgctgcgga 19 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KR3-2 (forward) <400> 23 cgaacttggc tggaatgctc t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KR3-2 (reverse) <400> 24 gtcaccgatt tttaggcgac c 21 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KR3-3 (forward) <400> 25 aatcggtgac gaaggctact acgaagaaac c 31 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KR3-3 (reverse) <400> 26 acgtggctta ccccatcaac 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KR3-4 (forward) <400> 27 gaaggctact acgaagaaac c 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KR3-4 (reverse) <400> 28 agaaacctcc acgtggctta c 21 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KR3-5 (forward) <400> 29 ggaggtttct cgaattcact ggccgtcgtt 30 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KR3-5 (reverse) <400> 30 tggtcatagc tgtttcctgt 20

Claims (8)

  1. 3-디옥시 아라비노 헵툴로소네이트 7-포스페이트 신타아제(3-deoxy arabino heptulosonate 7-phosphate synthase)의 활성이 약화 또는 불활성화되고, 락테이트 디하이드로게나아제(lactate dehydrogenase)의 활성이 강화되고, lldD 유전자의 전사 조절자를 암호화하는 lldR 유전자의 발현이 감소되어 모균주 대비 L-라이신의 생산능이 증가된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 변이 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변이 균주는 3-디옥시 아라비노 헵툴로소네이트 7-포스페이트 신타아제를 암호화하는 aroF 유전자의 전부 또는 일부가 결실된 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이 균주는 락테이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 lldD 유전자의 발현이 증가된 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 변이 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
  7. (a) 제1항에 따른 코리네박테리움 속 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 균주 및 배양 배지에서 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인 L-라이신의 제조 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Changhee Cho 등. Biotechnology Advances. Vol. 33, No.7, 페이지 1455-1466 (2014.11.18.) 1부.*

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