CN116064349A - L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法 - Google Patents

L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及L‑赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的L‑赖氨酸的生产方法，上述谷氨酸棒状杆菌突变株通过使编码烯醇化酶的基因的表达增加或增强，或者与此同时使葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的表达减少或弱化，增加前体的供应，使糖利用能力增加，从而可以提高L‑赖氨酸的生产收率。

Description

L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的L-赖氨酸的生产方法
技术领域
本发明涉及L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的L-赖氨酸的生产方法。
背景技术
L-赖氨酸是人体或动物体内不能合成的必要氨基酸，必须从外部供给，一般情况下，是通过利用了细菌或酵母之类的微生物的发酵而生产的。L-赖氨酸的生产可以利用自然状态下获得的野生型菌株或者以提高其L-赖氨酸生产能力的方式转变的突变株。近年来，为了改善L-赖氨酸的生产效率，以多用于L-氨基酸和其它有用物质的生产的大肠杆菌、棒状杆菌等微生物为对象，适用基因重组技术，从而开发了具有优异的L-赖氨酸生产能力的各种重组菌株或突变株及利用其的L-赖氨酸生产方法。
根据韩国授权专利第10-0838038号和第10-2139806号，通过变更对包含与L-赖氨酸生产有关的酶的蛋白质进行编码的基因的碱基序列或氨基酸序列来增加该基因的表达或者剔除不必要的基因，从而可以提高L-赖氨酸生产能力。此外，在韩国公开专利第10-2020-0026881号中公开了为了增加对参与L-赖氨酸生产的酶进行编码的基因的表达而将基因的现有启动子变更为具有强活性的启动子的方法。
如上所述，开发了增加L-赖氨酸生产能力的各种方法，但与L-赖氨酸生产直接或间接相关的酶、转录因子、运输蛋白质等蛋白质的种类达到数十余种，因此关于根据这样的蛋白质的活性变化的L-赖氨酸生产能力是否增加，事实上仍需要大量的研究。
现有技术文献
专利文献
(专利文献1)韩国授权专利第10-0838038号
(专利文献2)韩国授权专利第10-2139806号
(专利文献3)韩国公开专利第10-2020-0026881号
发明内容
本发明的目的在于提供L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变株。
另外，本发明的目的在于提供利用了上述突变株的L-赖氨酸的生产方法。
本发明的发明人为了利用谷氨酸棒状杆菌菌株来开发L-赖氨酸生产能力得到提高的新型突变株而进行了研究，结果确认了在将编码参与L-赖氨酸生物合成途径的烯醇化酶的Eno基因的基因序列特别是起始密码子进行置换时，L-赖氨酸生产量增加，进一步而言，确认了在将编码葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的gntR基因的氨基酸序列中特定位置的氨基酸进行置换时，L-赖氨酸生产量进一步增加，从而完成了本发明。
本发明的一个方式提供烯醇化酶的活性增强而L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株。
本发明中所使用的“烯醇化酶(Enolase)”又称为磷酸丙酮酸水合酶(phosphopyruvate hydratase)，是指为了将丙酮酸(pyruvate)供应到TCA循环而催化该过程中的将2-磷酸甘油酸(2-phosphoglycerate，2-PG)转化为磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)的反应的酶。
根据本发明的一具体例，上述烯醇化酶可以源于棒状杆菌(Corynebacterium)属菌株。具体而言，上述棒状杆菌属菌株可以为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、克氏棒状杆菌(Corynebacterium crudilactis)、荒漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、苏那棒状杆菌(Corynebacterium suranareeae)、润滑脂棒状杆菌(Corynebacterium lubricantis)、道桑棒状杆菌(Corynebacterium doosanense)、高效棒状杆菌(Corynebacteriumefficiens)、乌氏棒状杆菌(Corynebacterium uterequi)、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)、帕氏棒状杆菌(Corynebacterium pacaense)、奇棒状杆菌(Corynebacterium singulare)、腐殖质还原棒状杆菌(Corynebacterium humireducens)、海洋棒状杆菌(Corynebacteriummarinum)、耐盐棒状杆菌(Corynebacteriumhalotolerans)、蝶科棒状杆菌(Corynebacterium spheniscorum)、弗氏棒状杆菌(Corynebacterium freiburgense)、纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum)、犬棒状杆菌(Corynebacterium canis)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、肾棒状杆菌(Corynebacterium renale)、污染棒状杆菌(Corynebacterium pollutisoli)、亚胺棒状杆菌(Corynebacterium imitans)、里海棒状杆菌(Corynebacterium caspium)、睾丸棒状杆菌(Corynebacterium testudinoris)、假性棒状杆菌(Corynebacateriumpseudopelargi)或者微黄棒状杆菌(Corynebacterium flavescens)，但并不限定于此。
本发明中所使用的“活性增强”是指新导入或增大对作为目标的酶、转录因子、运输蛋白质等蛋白质进行编码的基因的表达，从而与野生型菌株或转变前的菌株相比，表达量增加。这样的活性的增强包括以下情况：通过编码基因的核苷酸置换、插入、缺失或者它们的组合，蛋白质本身的活性与原本的微生物具有的蛋白质的活性相比增加的情况，以及通过编码它的基因的表达增加或者翻译增加等，细胞内的整体酶活性程度与野生型菌株或转变前的菌株相比高的情况，也包括它们的组合。
根据本发明的一具体例，上述烯醇化酶的活性增强可以是对编码烯醇化酶的基因诱导位置特异性突变。
根据本发明的一具体例，上述编码烯醇化酶的基因可以由SEQ ID NO:1的碱基序列表示。
另外，根据本发明的一具体例，上述编码烯醇化酶的基因可以由SE Q ID NO:2的氨基酸序列表示。
根据本发明的一具体例，上述烯醇化酶的活性增强可以是编码烯醇化酶的基因的碱基序列中第1至100位碱基中的一个以上的碱基被置换。
更具体而言，本发明中的基因突变可以是编码烯醇化酶的基因的碱基序列中的第1至100位碱基、优选第1至10位碱基被连续或非连续地置换。
根据本发明的一具体例，上述烯醇化酶的活性增强可以是编码烯醇化酶的基因的起始密码子被ATG置换。
根据本发明的一实施例，在对编码谷氨酸棒状杆菌菌株的烯醇化酶的Eno基因进行编码的SEQ ID NO:1的碱基序列中，将起始密码子由GTG置换为ATG，从而获得了具有Eno基因的新型起始密码子的谷氨酸棒状杆菌突变株。这样的谷氨酸棒状杆菌突变株可以包含由SEQ ID NO:3的碱基序列或SEQ ID NO:4的氨基酸序列编码的烯醇化酶氨基酸序列基因。
如上所述具有对于烯醇化酶基因的突变的谷氨酸棒状杆菌突变株的L-赖氨酸生产能力可以得到提高。
本发明中所使用的“生产能力得到提高”是指与亲本菌株相比，L-赖氨酸的生产率增加。上述亲本菌株是指成为突变对象的野生型或突变株，包括直接成为突变的对象或通过重组的载体等转化的对象。在本发明中，亲本菌株可以是野生型谷氨酸棒状杆菌菌株或由野生型突变的菌株。
根据本发明的一具体例，上述亲本菌株是在参与赖氨酸生产的基因(例如，lysC、zwf和hom基因)的序列上诱导了突变的突变株，可以是在韩国微生物保藏中心(KoreanCulture Center of Microorganisms)于2021年4月2日以保藏号KCCM12969P保藏的谷氨酸棒状杆菌菌株(以下称为“谷氨酸棒状杆菌DS1菌株”)。
根据本发明的一实施例，上述L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株通过包含烯醇化酶Eno基因的起始密码子突变，从而L-赖氨酸的重要前体PEP的供应量得到增加，并且与亲本菌株相比，显示出增加的L-赖氨酸生产能力，特别是，与亲本菌株相比，L-赖氨酸生产量增加5％以上，具体而言，增加5至40％(优选10至30％)，从而每1L的菌株培养液可以生产55～85g的L-赖氨酸，优选地，可以生产60～80g的L-赖氨酸。
另外，在本发明中，为了进一步提高L-赖氨酸生产能力，可以对除了编码烯醇化酶的Eno基因以外的参与L-赖氨酸生物合成的其它基因诱导突变。
根据本发明的一具体例，上述突变株可以还包含葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的活性弱化。
微生物利用由调控基因(regulatory gene)、操纵基因(operator)、启动子(promoter)、结构基因(structural gene)等组成的操纵子(operon)进行转录，调控蛋白质表达，将在确定转录的激活时诱导已失活的基因的激活并且促进转录可以顺利发生的一系列蛋白质称为转录激活因子(transcriptional activator)，与之相反，将为了使被激活的基因再次失活而生成的一系列蛋白质称为转录抑制因子(transcriptional repressor)。本发明中所使用的“葡萄糖酸操纵子转录抑制因子(gluconate operon transcriptionalrepressor)”作为参与葡萄糖酸代谢、糖内流等的调控蛋白质，与葡萄糖酸操纵子的操纵基因结合而起到抑制mRNA合成的作用。
根据本发明的一具体例，上述葡萄糖酸操纵子转录抑制因子可以源于棒状杆菌(Corynebacterium)属菌株。具体而言，上述棒状杆菌属菌株可以为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、克氏棒状杆菌(Corynebacterium crudilactis)、荒漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、苏那棒状杆菌(Corynebacterium suranareeae)、润滑脂棒状杆菌(Corynebacteriumlubricantis)、道桑棒状杆菌(Corynebacterium doosanense)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、乌氏棒状杆菌(Corynebacterium uterequi)、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)、帕氏棒状杆菌(Corynebacterium pacaense)、奇棒状杆菌(Corynebacterium singulare)、腐殖质还原棒状杆菌(Corynebacteriumhumireducens)、海洋棒状杆菌(Corynebacteriummarinum)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)、蝶科棒状杆菌(Corynebacterium spheniscorum)、弗氏棒状杆菌(Corynebacterium freiburgense)、纹带棒状杆菌(Corynebacteriumstriatum)、犬棒状杆菌(Corynebacterium canis)、产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、肾棒状杆菌(Corynebacterium renale)、污染棒状杆菌(Corynebacteriumpollutisoli)、亚胺棒状杆菌(Corynebacterium imitans)、里海棒状杆菌(Corynebacterium caspium)、睾丸棒状杆菌(Corynebacterium testudinoris)、假性棒状杆菌(Corynebacaterium pseudopelargi)或者微黄棒状杆菌(Corynebacteriumflavescens)，但并不限定于此。
本发明中所使用的“活性弱化”是指作为客体的对作为目标的酶、转录因子、运输蛋白质等蛋白质进行编码的基因的表达被抑制或剔除，从而与野生型菌株或转变前的菌株相比表达量减少。这样的活性的弱化包括以下情况：通过编码基因的核苷酸置换、插入、缺失或者它们的组合，蛋白质本身的活性与原始微生物具有的蛋白质的活性相比减少的情况，以及通过阻碍编码它的基因的表达或者阻碍翻译等，细胞内的整体酶活性程度与野生型菌株或转变前的菌株相比低的情况，也包括它们组合的情况。
根据发明的一具体例，上述葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的活性弱化可以是对编码葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的基因诱导位置特异性突变。
根据本发明的一具体例，上述编码葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的基因可以由SEQ ID NO:5的碱基序列表示。
另外，根据本发明的一具体例，上述编码葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的基因可以由SEQ ID NO:6的氨基酸序列表示。
根据本发明的一具体例，上述葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的活性增强可以是编码葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的基因的氨基酸序列中第10至100氨基酸区域中的一个以上的氨基酸被置换。
更具体而言，本发明中的基因突变可以是编码葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的基因的氨基酸序列中的1个以上的氨基酸、优选第10至100、第20至90、或者第30至80氨基酸区域中的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸被连续或非连续地置换。
根据本发明的一实施例，在编码谷氨酸棒状杆菌菌株的葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的gntR基因的氨基酸序列中，将第77位由丝氨酸(serine，Ser)置换为苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)，从而获得了具有gntR基因的新型氨基酸序列的谷氨酸棒状杆菌突变株。这样的谷氨酸棒状杆菌突变株可以包含以SEQ ID NO:7的碱基序列或SEQ ID NO:8的氨基酸序列编码的葡萄糖酸操纵子转录抑制因子gntR基因。
在这里，亲本菌株可以是对编码烯醇化酶的Eno基因的序列诱导突变的谷氨酸棒状杆菌突变株。
根据本发明的一实施例，上述L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株通过一同包含烯醇化酶Eno基因的起始密码子突变和葡萄糖酸操纵子转录抑制因子gntR基因的氨基酸突变，从而使菌株的糖利用能力增加，并且与只包含编码烯醇化酶的Eno基因的起始密码子突变的亲本菌株相比，显示出增加的L-赖氨酸生产能力，特别是，与亲本菌株相比，L-赖氨酸生产量增加2％以上，具体而言，增加2至20％，从而每1L的菌株培养液可以生产63～85g的L-赖氨酸，优选地，可以生产65～80g的L-赖氨酸。
根据本发明的一具体例的谷氨酸棒状杆菌突变株可以通过包含亲本菌株中的烯醇化酶Eno基因的起始密码子序列被置换的突变体和/或葡萄糖酸操纵子转录抑制因子gntR基因的氨基酸序列被部分置换的突变体的重组载体来实现。
本发明中所使用的“部分”是指不是氨基酸序列、碱基序列或多核苷酸序列的全部，可以为1至300个，优选可以为1至100个，更优选可以为1至50个，但并不限定于此。
本发明中所使用的“突变体”是指参与L-赖氨酸的生物合成的烯醇化酶Eno基因的起始密码子序列由GTG置换为ATG和/或葡萄糖酸操纵子转录抑制因子gntR基因的氨基酸序列中第10至100氨基酸区域中的一个以上的氨基酸被置换的突变体。
根据本发明的一具体例，可以是上述烯醇化酶基因的起始密码子被ATG置换的突变体具有SEQ ID NO:3的碱基序列或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
另外，根据本发明的一具体例，可以是上述葡萄糖酸操纵子转录抑制因子基因的氨基酸序列中第77位氨基酸被置换的突变体具有SEQ ID NO:7的碱基序列或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明中所使用的“载体”作为可以在合适的宿主细胞中表达目标蛋白质的表达载体，是指为了表达基因插入物而包括可操作地连接的(operably linked)必需的调控元件的基因产物。在这里，“可操作地连接的”是指需要表达的基因与其调节序列彼此功能性地结合并以能够进行基因表达的方式连接，“调控元件”包括用于实施转录的启动子、用于调节转录的任意的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及调节转录和翻译的终止的序列。这样的载体包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体等，但并不限定于此。
本发明中所使用的“重组载体”在转化到合适的宿主细胞内后，可以与宿主细胞的基因组无关地进行复制，或者可以缝合于基因组其自身。这时，上述“合适的宿主细胞”能够进行载体的复制，可以包括作为开始复制的特定碱基序列的复制起点。
在上述转化中，根据宿主细胞而选择合适的载体导入技术，从而可以在宿主细胞内表达作为目标的基因。例如，载体导入可以通过电穿孔法(electroporation)、热冲击(heat-shock)、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射法(microinjection)、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂-DMSO法、或者它们的组合而实施。转化的基因只要可以在宿主细胞内表达，就可以被包括在内，而不限制于将其插入宿主细胞的染色体内或者位于染色体外。
上述宿主细胞包括在生物体内或试管内用本发明的重组载体或多核苷酸转染、转化、或者感染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞为重组宿主细胞、重组细胞或重组微生物。
另外，根据本发明的重组载体可以包括选择标记(selection marker)，上述选择标记用于选择利用载体转化的转化体(宿主细胞)，在经上述选择标记处理的培养基中只有表达选择标记的细胞可以生存，因此能够选择转化的细胞。作为代表性的例子，上述选择标记有卡那霉素、链霉素、氯霉素等，但并不限定于此。
插入到本发明的转化用重组载体内的基因由于同源重组交叉而可以被置换到如棒状杆菌属微生物等的宿主细胞内。
根据本发明的一具体例，上述宿主细胞可以为棒状杆菌属菌株，例如，可以为谷氨酸棒状杆菌DS1菌株。
另外，本发明的另一方式提供L-赖氨酸的生产方法，其包括以下步骤：a)在培养基中培养上述谷氨酸棒状杆菌突变株的步骤；以及b)从上述突变株或者培养突变株的培养基中回收L-赖氨酸的步骤。
上述培养可以根据该领域中已知的合适的培养基和培养条件而进行，只要是本领域技术人员就可以容易地调整培养基和培养条件来使用。具体而言，上述培养基可以是液体培养基，但并不限定于此。培养方法可以包括例如分批式培养(batch culture)、连续式培养(continuous culture)、补料分批式培养(fed-batch culture)或者它们的组合培养，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，上述培养基必须以合适的方式满足特定菌株的要求，可以由本领域技术人员适当地进行变更。关于棒状杆菌属菌株的培养基，可以参考公知的文献(Manual of Methods for General Bacteriology.American Society forBacteriology.Washington D.C.,USA,1981)，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，培养基中可以包含各种碳源、氮源和微量元素成分。作为可以使用的碳源，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素之类的糖及碳水化合物；大豆油、葵花籽油、蓖麻籽油、椰子油等油及脂肪；棕榈酸、硬脂酸、亚油酸之类的脂肪酸；甘油、乙醇之类的醇；乙酸之类的有机酸。这些物质可以单独使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作为可以使用的氮源，可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和尿素或者无机化合物，例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源同样可以单独使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作为可以使用的磷的供应源，可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠的盐，但并不限定于此。此外，培养基可以含有生长所需要的硫酸镁或硫酸铁之类的金属盐，但并不限定于此。除此以外，可以包含氨基酸和维生素之类的必要生长物质。此外，可以使用合适培养基的前体。上述培养基或单个成分可以在培养过程中通过适当的方式，分批或连续添加到培养液中，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，在培养过程中，可以将氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸之类的化合物以适当的方式添加到微生物培养液中来调整培养液的pH。此外，在培养过程中，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯之类的消泡剂来抑制气泡产生。进一步而言，为了维持培养液的有氧状态，可以向培养液内注入氧气或者含氧气的气体(例如空气)。培养液的温度通常可以为20℃至45℃，例如，可以为25℃至40℃。培养时间可以持续到有用物质获得期望的生产量为止，例如，可以为10至160小时。
根据本发明的一具体例，在上述从培养的突变株和培养突变株的培养基中回收L-赖氨酸的步骤中，可以根据培养方法并利用该领域中公知的合适的方法，从培养基中收集或回收所生产的L-赖氨酸。例如，可以使用离心分离、过滤、提取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶化、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)、色谱法(例如，离子交换、亲和性、疏水性和尺寸排阻)等方法，但并不限定于此。
根据本发明的一具体例，在回收赖氨酸的步骤中，可以将培养基低速离心分离而去除生物质，可以将得到的上清液通过离子交换色谱法而分离。
根据本发明的一具体例，在上述回收L-赖氨酸的步骤中，可以包括纯化L-赖氨酸的工序。
根据本发明的谷氨酸棒状杆菌突变株通过使编码烯醇化酶的基因的表达增加或增强，或者与此同时使葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的表达减少或弱化，增加前体的供应，使糖利用能力增加，从而可以提高L-赖氨酸的生产收率。
附图说明
图1表示根据本发明的一实施例的包含起始密码子由GTG置换为ATG的烯醇化酶Eno基因的pCG1+eno(G1A)载体的结构。
图2表示根据本发明的一实施例的包含将葡萄糖酸操纵子转录抑制因子gntR基因的氨基酸序列中第77位氨基酸由丝氨酸置换为苯丙氨酸的gntR基因的pCG1+gntR(S77F)载体的结构。
具体实施方式
下面，对本发明更详细地进行说明。但是，这样的说明只是为了帮助理解本发明而例示性地提出的，本发明的范围并不限定于这样的例示性的说明。
实施例1.谷氨酸棒状杆菌突变株的制造
为了制造烯醇化酶的活性增强的谷氨酸棒状杆菌突变株，使用了谷氨酸棒状杆菌DS1菌株和E.coli DH5a(HIT Competent cellsTM,Cat No.RH618)。
上述谷氨酸棒状杆菌DS1菌株在CM-肉汤(CM-broth)培养基(pH 6.8)中以30℃的温度进行了培养，上述CM-肉汤培养基的组成是在1L的蒸馏水中有5g的葡萄糖、2.5g的NaCl、5.0g的酵母提取物、1.0g的尿素(urea)、10.0g的聚蛋白胨和5.0g的牛肉(beef)提取物。
上述E.coli DH5a在LB培养基上以37℃的温度进行了培养，上述LB培养基的组成是在1L的蒸馏水中有10.0g的胰蛋白胨、10.0g的NaCl和5.0g的酵母提取物。
抗生素卡那霉素(kanamycin)和链霉素(streptomycin)使用了Sigma公司的制品。
DNA测序分析委托马克罗基因株式会社进行了分析。
1-1.重组载体的制作
为了增加对TCA循环的前体供应，在菌株中导入了烯醇化酶的增强。在本实施例中利用的方法中，为了增加编码烯醇化酶的Eno基因的表达，对该基因的翻译起始密码子诱导了特异性突变。导入了将Eno基因的翻译起始密码子由GTG突变为ATG，在谷氨酸棒状杆菌基因组上，以Eno基因正中间为中心，用PCR扩增左臂430bp部分和右臂439bp部分，通过重叠PCR(overlap PCR)方法连接后，克隆到作为重组载体的pCGI(参考文献[Kim et al.,Journal of Microbiological Methods 84(2011)128-130])中。将上述质粒命名为pCG1+eno(G1A)(参考图1)。为了制作上述质粒，使用了下述表1的引物扩增各个基因片段。
【表1】
Figure BDA0003863833900000111
利用以上的引物并在以下的条件下实施PCR。利用热循环仪(Thermocycler)(TP600，TAKARA BIO Inc.，日本)，在添加有各个三磷酸脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)100μM的反应液中，将1pM的寡核苷酸、10ng的谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的染色体DNA用作模板(template)，在1单位的pfu-X DNA聚合酶混合物(Solgent)的存在下，实施了25～30周期(cycle)。PCR实施条件是在(i)变性(denaturation)步骤：在94℃30秒，(ii)退火(annealing)步骤：在58℃30秒，以及(iii)延伸(extension)步骤：在72℃1～2分钟(每1kb赋予2分钟的聚合时间)的条件下实施的。
利用自组装克隆(self-assembly cloning)，将如上所述制造的基因片段克隆到pCGI载体中。将上述载体转化到E.coli DH5a中，涂抹在含有50μg/ml的卡那霉素的LB-琼脂板上，在37℃培养24小时。分离最终形成的菌落，确认插入物(insert)是否正确存在于载体后，分离该载体，用于谷氨酸棒状杆菌菌株的重组。
作为上述方法中共同进行的过程，该基因的扩增是由谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基因组DNA用PCR方法进行扩增的，根据策略，通过自组装克隆(self-assembledcloning)方法插入到pCGI载体中，并在E.coli DH5a中选择。染色体的基因碱基置换(Chromosomal base substitution)是分别扩增各个片段的基因，用层叠PCR制造了目标DNA片段。在基因操作时，作为PCR扩增酶，利用了Ex Taq聚合酶(Takara)、Pfu聚合酶(Solgent)，各种限制酶和DNA修饰酶使用了NEB制品，根据供给的缓冲液和方案进行了使用。
1-2.突变株的制造
利用上述pCG1+eno(G1A)制造了作为突变菌株的DS7-1菌株。以上述载体的最终浓度成为1μg/μl以上的方式准备，对谷氨酸棒状杆菌DS1菌株使用电穿孔法(参考文献[Tauchet al.,FEMS Microbiology letters123(1994)343-347])而诱导了1次重组。这时，将电穿孔的菌株涂抹在含有20μg/μl的卡那霉素的CM-琼脂平板上，分离菌落后，通过PCR和碱基序列分析确认了是否正确插入到了基因组上的诱导位置。为了将这样分离的菌株再次诱导2次重组，接种在含有链霉素的CM-琼脂液体培养基中，培养一夜以上后，涂抹在含有相同浓度的链霉素的琼脂培养基中，分离菌落。在最终分离的菌落中确认了是否存在对卡那霉素的耐性后，通过碱基序列分析确认了在没有抗生素耐性的菌株中是否向Eno基因导入了突变(参考文献[Schafer et al.,Gene 145(1994)69-73])。最终，获得了导入有突变Eno基因的谷氨酸棒状杆菌突变株(DS7-1)。
实验例1.亲本菌株和突变株的L-赖氨酸生产率比较
将亲本菌株谷氨酸棒状杆菌DS1菌株和实施例1中制造的作为生产赖氨酸的突变株的DS7-1菌株的L-赖氨酸生产率进行了比较。
在含有10ml的具有下述表2所示的组成的赖氨酸培养基的100ml的烧瓶中，分别接种亲本菌株(DS1)或突变株(DS7-1)，在30℃以180rpm的条件震荡培养28小时。培养结束后，赖氨酸分析用HPLC(岛津，日本)测定了L-赖氨酸的生产量，将其结果示于表3。
【表2】
组成 含量(1L蒸馏水基准)
葡萄糖(Glucose) 100g
硫酸铵(Ammonium sulfate) 55g
<![CDATA[KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>]]> 1.1g
<![CDATA[MgSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O]]> 1.2g
<![CDATA[MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O]]> 180mg
<![CDATA[FeSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O]]> 180mg
硫胺素(Thiamine)·HCl 9mg
生物素(Biotin) 1.8mg
<![CDATA[CaCO<sub>3</sub>]]> 5％
pH 7.0
【表3】
菌株 L-赖氨酸(g/L) 每单位菌体的L-赖氨酸生产量(g/gDCW)
亲本菌株(DS1) 52.9 6.6
突变株(DS7-1) 64.7 7.0
如上述表3所示的那样，确认了在谷氨酸棒状杆菌突变株DS7-1中，为了增强赖氨酸生物合成途径，Eno基因被置换为最佳的翻译起始序列(ATG)，与亲本菌株谷氨酸棒状杆菌DS1菌株相比，L-赖氨酸的生产率增加约22％。通过这样的结果，可知Eno基因的表达增强使代谢的碳源流量增加，从而提高了菌株的L-赖氨酸生产能力。
实施例2.谷氨酸棒状杆菌突变株的制造
2-1.重组载体的制作
为了进一步提高实施例1中制造的谷氨酸棒状杆菌突变株的赖氨酸生产能力，在谷氨酸棒状杆菌突变株DS7-1中导入了影响糖利用能力的葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的弱化。
在本实施例中利用的方法中，为了弱化编码葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的gntR基因的表达，对gntR基因诱导了特异性突变。将gntR基因的氨基酸序列中第77位氨基酸由丝氨酸置换为苯丙氨酸，在谷氨酸棒状杆菌基因组上，以包含gntR基因第77位氨基酸的部分为中心，用PCR扩增左臂510bp部分和右臂540bp部分，通过重叠PCR(overlap PCR)方法连接后，克隆到作为重组载体的pCGI(参考文献[Kim et al.,Journal of MicrobiologicalMethods 84(2011)128-130])中。将上述质粒命名为pCG1+gntR(S77F)(参考图2)。为了制作上述质粒，使用了下述表4的引物扩增各个基因片段。
【表4】
Figure BDA0003863833900000141
对相应基因进行扩增克隆的过程用与实施例1-1相同的方法实施。
2-2.突变株的制造
利用上述pCG1+gntR(S77F)制造了作为突变菌株的DS7-2菌株。使用pCG1+gntR(S77F)代替pCG1+eno(G1A)作为载体，利用谷氨酸棒状杆菌突变株DS7-1代替谷氨酸棒状杆菌DS1菌株作为宿主细胞，除此以外，实施与实施例1-2相同的方法，从而最终获得了导入有突变gntR基因的谷氨酸棒状杆菌突变株(DS7-2)。
实验例2.亲本菌株和突变株的L-赖氨酸生产率比较
将实施例1中制造的作为生产赖氨酸的突变株的DS7-1菌株和将其作为亲本菌株的实施例2中制造的作为生产赖氨酸的突变株的DS7-2菌株的L-赖氨酸生产率进行了比较。
L-赖氨酸生产量测定用与实验例1相同的方法实施，将其结果示于表5。
【表5】
菌株 L-赖氨酸(g/L) 每单位菌体的L-赖氨酸生产量(g/gDCW)
亲本菌株(DS7-1) 63.8 6.9
突变株(DS7-2) 65.3 7.4
如上述表5所示的那样，确认了在谷氨酸棒状杆菌突变株DS7-2中，为了增强赖氨酸生物合成途径，Eno基因被置换为最佳的翻译起始序列(ATG)，不仅如此，gntR基因的氨基酸序列的特定位置(第77位氨基酸)被置换为最佳的碱基序列，与用作亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌DS7-1菌株相比，L-赖氨酸的生产率增加约2％。通过这样的结果，可知Eno基因的表达增强和gntR基因的表达弱化使代谢的碳源流量增加，从而提高了菌株的L-赖氨酸生产能力。
到目前为止，对本发明围绕其优选实施例进行了研究。本发明所属技术领域的技术人员可以理解本发明在不脱离本发明的本质性的特性的范围内可以以变形的形态实现。因此，公开的实施例应从说明性的角度进行考虑，而不是从限制性的角度进行考虑。本发明的范围显示在权利要求书中而不是上述的说明中，并且应被解释为在与其等同范围内的所有的差异包括在本发明中。

Claims (8)

1.一种谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变株，其烯醇化酶的活性增强而L-赖氨酸生产能力得到提高。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌突变株，其中，所述烯醇化酶的活性增强是对编码烯醇化酶的基因诱导位置特异性突变。
3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌突变株，其中，所述烯醇化酶的活性增强是编码烯醇化酶的基因的起始密码子被ATG置换。
4.根据权利要求3所述的谷氨酸棒状杆菌突变株，其中，所述突变株包含由SEQ ID NO:3表示的碱基序列。
5.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌突变株，其中，所述突变株还包含葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的活性弱化。
6.根据权利要求5所述的谷氨酸棒状杆菌突变株，其中，所述葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的活性弱化是对编码葡萄糖酸操纵子转录抑制因子的基因诱导位置特异性突变。
7.根据权利要求6所述的谷氨酸棒状杆菌突变株，其中，所述突变株包含由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列。
8.一种L-赖氨酸的生产方法，包括以下步骤：
a)在培养基中培养权利要求1至7中任一项所述的突变株的步骤；以及
b)从所述突变株或者培养突变株的培养基中回收L-赖氨酸的步骤。
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