CN110603321B - 丙酮酸羧化酶和编码丙酮酸羧化酶的dna、包含该dna的质粒、微生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及丙酮酸羧化酶和编码丙酮酸羧化酶的DNA、包含该DNA的质粒以及用于生产的微生物和用于制备其生物合成包含草酰乙酸作为前体的产物的方法以及染色体。根据本发明提供了编码丙酮酸羧化酶并具有与序列编号1至少70％同一性的DNA，其中在位置1027‑1029中的编码苏氨酸‑343的三联体被替换成编码丙氨酸的三联体。在一个优选的实施方案中，在该DNA中另外在位置3034‑3036中将编码异亮氨酸的三联体替换成编码丝氨酸的三联体。通过所述基因的表达，获得丙酮酸羧化酶，通过该丙酮酸羧化酶可以将其生物合成包含草酰乙酸作为前体的产物的产率相对于具有天然Pyc的菌株而言增加9至19％。

Description

丙酮酸羧化酶和编码丙酮酸羧化酶的DNA、包含该DNA的质粒、 微生物及其应用
本发明涉及丙酮酸羧化酶和编码丙酮酸羧化酶的DNA、包含该DNA的质粒以及用于生产的微生物和用于制备其生物合成包含草酰乙酸作为前体的产物的方法以及染色体。
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)在工业上用于制备氨基酸，特别是L-谷氨酸和L-赖氨酸。为了生产L-赖氨酸，从柠檬酸循环中取出中间体草酰乙酸，因为其用作天冬氨酸家族的氨基酸或氨基酸盐的前体。所述天冬氨酸家族的氨基酸或氨基酸盐是L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸。为了能够使柠檬酸循环在虽然取出这些中间体的情况下仍进一步进行，其必须通过所谓的添补反应来重新补充。当在糖上生长时，草酰乙酸池通过丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸羧化成草酰乙酸来补充。通过酶，即丙酮酸羧化酶(Pyc)催化由丙酮酸和二氧化碳或HCO3-以ATP依赖性的形式形成草酰乙酸。因此，对于天冬氨酸家族的氨基酸例如L-赖氨酸和谷氨酸家族的氨基酸例如L-谷氨酸的工业微生物生产而言，Pyc的高活性是重要的。此外，对于衍生自柠檬酸循环中间体的其它代谢物的生产，高Pyc活性是有益的。
谷氨酸棒状杆菌的天然Pyc的酶活性以变构的方式尤其被天冬氨酸抑制，因此在高细胞内天冬氨酸浓度下仅具有有限的活性。因此，L-赖氨酸和衍生自草酰乙酸的其它产物的生产也受到限制，因为仅提供有限量的前体代谢物。迄今所述的Pyc变异体仅导致L-赖氨酸生产的适度增加。
Peters-Wendisch等人在Journal of Molecular Microbiology andBiotechnology(2001)32:295-300中的公开文献“Pyruvate carboxylase is a majorbottleneck for glutamate and lysine production by Corynebacterium glutamicum”公开了菌株谷氨酸棒状杆菌DG52-5中pyc基因的缺失导致赖氨酸效价(Titer)减少60％，而菌株DG 52-5中pyc基因的由质粒介导的过表达导致赖氨酸效价增加50％。此外显示，在野生型菌株ATCC13032中pyc基因的缺失将由吐温60诱发的L-谷氨酸生产减少约50％，而pyc基因的基于质粒的过表达将谷氨酸形成增加700％。高Pyc活性对于生产赖氨酸和谷氨酸的重要性稍后也还在其它出版物中显示(Blombach等人2007 Applied Microbiology andBiotechnology 76:615-623；Shirai等人2007 Microbial Cell Factories 6:19；Neuner和Heinzle 2011 Biotechnology Journal 6:318-329；Neuner等人2013 Journal ofBiotechnology 163:217-224；Guo等人2013 Biotechnology Letters 35:943-950)。
对于生产除氨基酸之外的其它代谢物(其是柠檬酸循环的中间体或衍生自柠檬酸循环的中间体)而言，高Pyc活性也是非常重要的。Shohei Okino等人在Appl.Microbiol.Biotechnol.(2008)81:459-464中的公开文献“An efficient succinicacid production process in a metabolically engineered Corynebacteriumglutamicum strain”和Torben Hoefel等人在Biotechnol.J.2012,7,1277-1287中的公开文献“Comparative reaction engineering studies for succinic acid productionfrom sucrose by metabolically engineered Escherichia coli in fed-batch-operated stirred tank bioreactiors”公开了编码丙酮酸羧化酶的基因的表达或过表达导致琥珀酸的生产或增加生产。这也在其它出版物中显示(Li等人2016 BioresourceTechnology 218:217-223；Tajima等人2015 Applied and Environmental Microbiology81:929-937；Litsanov等人2012 Applied and Environmental Microbiology 78:3325-3337；Meng等人2016 Microbial Cell Factories 15:141)。对于用褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)生产苹果酸，增加的Pyc活性也被证明是有益的(Deng等人2016Biotechnology Progress 31:14-20)。同样，对于衍生自柠檬酸循环的中间体的二胺例如腐胺(1,4-二氨基丁烷)或尸胺(1,5-二氨基戊烷)的生产而言，使用增强的Pyc活性(Nguyen等人2015 Metabolites 5:211-231；Kind等人2010 Metabolic Engineering 12:341-351)。
Ohnishi等人(Applied Microbiology and Biotechnology(2002)58:217-223)描述了通过染色体方式将谷氨酸棒状杆菌的Pyc的位置458中脯氨酸替换成丝氨酸的氨基酸替换引入谷氨酸棒状杆菌菌株AHD2中，该谷氨酸棒状杆菌菌株AHD2基于野生型ATCC 13032并且带有两个点突变，即高丝氨酸脱氢酶(hom)基因中的Val59Ala和天冬氨酸激酶(lysC)基因中的Thr311Ile。具有pyc-P458S突变的菌株AHP-3比亲本菌株AHD-2形成多6％的L-赖氨酸。该作者描述了对于pyc突变的识别而言没有已知的可选表型，并且其据推测仅可通过比较基因组分析来找到。此外，Pyc变异体Pyc-P458S尚未进一步表征。
文献US 7,300,777 B2描述了生物体，其中相比于从谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC21523中分离出Pyc，从具有多个突变(M1V、E153D、A182S、A206S、H227R、A452G、D1120E)的谷氨酸棒状杆菌菌株NRRL-B11474中分离出丙酮酸羧化酶。所述突变中的至少一个导致Pyc变异体，其通过低浓度(1-10mM)的天冬氨酸刺激其活性直至2.5倍并且在较高天冬氨酸浓度下再次被抑制至在不存在天冬氨酸时活性的最多30％。在30mM的天冬氨酸下，菌株NRRL-B11474的Pyc仍表现出与在不存在天冬氨酸时相等的活性，而菌株ATCC 21523的Pyc在30mM天冬氨酸下仅还具有其在不存在天冬氨酸时展现出的活性的30％。但是，谷氨酸棒状杆菌NRRL-B11474的抗反馈Pyc变异体对于发酵生产氨基酸，尤其是L-赖氨酸和L-谷氨酸的作用未在文献US 7,300,777 B2中公开。
德国专利申请102012016716.4公开了一种筛选方法，通过该方法可以找到改进的酶。
因此，本发明的目的是提供微生物、丙酮酸羧化酶、编码丙酮酸羧化酶的基因、包含该基因的质粒或染色体以及用于制备其生物合成包含草酰乙酸作为前体的产物的方法，由此可以增加生产衍生自草酰乙酸的产物时的产率、效价、体积生产率(克产物/升/小时)或比生产率(克产物/小时/克细胞干质量)。特别地，应增加天冬氨酸家族的氨基酸，即L-赖氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-蛋氨酸的生产。此外，应增加谷氨酸家族的氨基酸，如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸或L-脯氨酸，柠檬酸循环的中间体如盐和酸，例如琥珀酸、苹果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、柠檬酸或异柠檬酸，二胺如1,5-二氨基戊烷或1,4-二氨基丁烷或其它产物，如衣康酸、依克多因(Ectoin)、γ-氨基丁酸、丁醇、1-丙醇、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸、D-精氨酸或4-羟基脯氨酸的生产。
从权利要求1和并列权利要求的上位概念出发，所述目的根据本发明通过权利要求1和并列权利要求的特征部分中给出的特征来实现。
通过所述微生物、丙酮酸羧化酶、编码丙酮酸羧化酶的基因、包含该基因的质粒或染色体以及通过所述制备方法，可以增加其生物合成包含草酰乙酸作为前体的产物的产率。特别地，可以增加草酰乙酸/天冬氨酸家族的氨基酸，即L-赖氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸的生产。此外，可以增加谷氨酸族的氨基酸如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸或L-脯氨酸，中间体如柠檬酸循环的盐和酸，例如琥珀酸、苹果酸、延胡索酸或2-酮戊二酸、柠檬酸或异柠檬酸，二胺例如1,5-二氨基戊烷或1,4-二氨基丁烷或其它产物，如衣康酸、依克多因、γ-氨基丁酸、丁醇、1-丙醇、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸、D-精氨酸或4-羟基脯氨酸的生产。在从属权利要求中给出了本发明的有利扩展方案。
在下文中，以其一般形式描述本发明，而不限制性地解释本发明。
令人惊讶地发现，通过将位置343中的苏氨酸替换成丙氨酸的相对于菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I修饰的丙酮酸羧化酶和编码该丙酮酸羧化酶的基因修饰基因、包含该基因的质粒，以及包含该基因或质粒的微生物，以及制备方法实现了所述目的。例如，相比于菌株ATCC 13032 lysCT311I而言，对于L-赖氨酸的生产发现了L-赖氨酸的最终浓度增加15％。
在一个优选的变异体中，相比于菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I修饰的丙酮酸羧化酶除了将位置343中的苏氨酸替换成丙氨酸之外还将位置1012中的异亮氨酸替换成丝氨酸。相应地，本发明还涉及编码具有T343A和I1012S修饰的丙酮酸羧化酶的基因修饰基因、包含该基因的质粒，以及包含该基因或质粒的微生物以及制备方法。在该实施方案中，相比于菌株ATCC 13032lysCT311I而言，对于L-赖氨酸的生产发现了L-赖氨酸的最终浓度增加9至19％。
根据本发明，提供了具有与根据序列编号1的基因至少70％的同一性并编码丙酮酸羧化酶的基因，其从序列编号1的至少70％同一性的基因出发在位置1027-1029中将编码苏氨酸-343的三联体替换成编码丙氨酸的三联体。位置1027-1029因此编码丙氨酸。根据本发明的DNA包含70％至100％同一性的序列。优选地，同一性为80％、85％至90％。特别优选为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。非常特别优选为根据序列编号1的基因。
在一个优选的实施方案中，提供了具有与根据序列编号1的基因至少70％同一性并编码丙酮酸羧化酶的基因，其从序列编号1的至少70％同一性的基因出发另外在位置3034-3036中具有编码丝氨酸的三联体。在该实施方案中，也包含70％至100％同一性的序列。优选地，同一性为80％、85％至90％。特别优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。非常特别优选为根据序列编号2的基因。
如本文使用的同一性可以通过公式I(％)＝[1-V/X]×100定义，其中I表示同一性，X表示对比序列的碱基总数，V表示要观察的序列相对于对比序列而言不同碱基的数目。在每种情况下，编码多肽的术语核酸序列包括根据遗传密码简并(Degeneration)而看起来有可能的所有序列。
此外，根据本发明提供了包含编码具有修饰T343A或T343A和I1012S的丙酮酸羧化酶的基因的载体，优选质粒。在此，原则上每个空载体或每个空质粒都可被考虑作为起始载体或起始质粒。例如，如Frunzke等人的公开文献Molecular Microbiology 2008,67:305-322中所述的质粒pAN6可以用作空载体，其中插入本发明的基因。
根据本发明，还提供了染色体，其包含具有修饰T343A或T343A和I1012S的本发明DNA。在此，应将本发明DNA插入染色体中，以使得不损害或破坏对于微生物存活力而言相关的基因的功能。
通过根据序列编号1的基因的表达，获得本发明丙酮酸羧化酶，其具有与根据序列编号3的丙酮酸羧化酶至少90％的序列同一性，其中从菌株ATCC 13032lysCT311I的丙酮酸羧化酶出发将位置343中的苏氨酸替换成丙氨酸(pycT343A)。因此，根据本发明在该丙酮酸羧化酶的位置343中存在丙氨酸，如例如在序列编号3中那样。本发明的丙酮酸羧化酶包括具有与序列编号3 90％至100％同一性的丙酮酸羧化酶。优选地，根据本发明修饰的丙酮酸羧化酶与序列编号3的所述同一性为95％、96％或97％，特别优选98％或99％。非常特别优选为根据序列编号3的丙酮酸羧化酶。
通过根据序列编号2的基因的表达，获得本发明丙酮酸羧化酶，其具有与根据序列编号4的丙酮酸羧化酶至少90％的序列同一性，其中从菌株ATCC 13032 lysCT311I的丙酮酸羧化酶出发，将位置343中的苏氨酸替换成丙氨酸并另外将位置1012中的异亮氨酸替换成丝氨酸(pycT343A；I1012S)。因此，根据本发明在该丙酮酸羧化酶的位置343中存在丙氨酸并且在位置1012中存在丝氨酸。本发明的丙酮酸羧化酶包括具有与序列编号4 90％至100％同一性的丙酮酸羧化酶。优选地，根据本发明修饰的丙酮酸羧化酶与序列编号4的所述同一性为95％、96％或97％，特别优选98％或99％。非常特别优选为根据序列编号4的丙酮酸羧化酶。
如本文使用的表述同一性可以通过公式I(％)＝[1-V/X]×100定义，其中I表示同一性，X表示对比序列的碱基总数，V表示要观察的序列相对于对比序列而言不同碱基的数目。在序列表中列出了以下序列：
序列编号1:基于质粒的变异体的根据本发明修饰的DNA序列，其编码根据本发明修饰的丙酮酸羧化酶pycT343A；
序列编号2:基于质粒的变异体的根据本发明修饰的DNA序列，其编码根据本发明修饰的丙酮酸羧化酶pycT343A；I1012S；
序列编号3:根据本发明修饰的丙酮酸羧化酶Pyc-T343A的氨基酸序列；
序列编号4:根据本发明修饰的丙酮酸羧化酶Pyc-T343A；I1012S的氨基酸序列；
序列编号5:用于丙酮酸羧化酶野生型的参比菌株ATCC 13032 lysCT311I的DNA序列；
序列编号6:用于丙酮酸羧化酶野生型的参比菌株ATCC 13032 lysCT311I的丙酮酸羧化酶的氨基酸序列；
序列编号7:编码Pyc-T343A的本发明染色体变异体DNA-pyc-A1027G-T1035G的DNA序列；
序列编号8:编码Pyc-T343A；I1012S的本发明染色体变异体DNA-pyc-A1027G-T1035G-T3035G-C3039G的DNA序列。
在本发明的一个有利扩展方案中，可以增强本发明基因的表达。为此，例如但非限制地可以使用更强的启动子，可以增加基因拷贝数量，或可以改变核糖体结合位点，以增加信使RNA的翻译。用于进行所述方法的方法是本领域技术人员已知的。
此外，本发明的主题是包含本发明基因或本发明载体的微生物。该微生物优选是棒状细菌。作为棒状细菌，例如可以提及谷氨酸棒状杆菌、醋麸酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)、热产氨棒状杆菌(Corynbacterium thermoaminogenes)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、黄色短杆菌或乳糖发酵短杆菌。
根据本发明特别优选的细胞是如下属的那些：棒状杆菌、短杆菌、埃希氏菌、芽孢杆菌、乳杆菌、乳球菌、发酵单胞菌、甲基杆菌、雷尔氏菌、梭菌、假丝酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母、酵母和耶氏酵母，其中谷氨酸棒状杆菌、高效棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、布朗克假丝酵母、皱落假丝酵母、运动发酵单胞菌、解脂耶氏酵母、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)特别优选。根据本发明最优选的细胞是棒状杆菌属和埃希氏菌属的细胞，其中谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌是非常特别优选的细菌菌株。
特别是在产物是L-赖氨酸的情况下，基因技术修饰的细胞可以特别地衍生自选自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、醋麸酸棒状杆菌ATCC15806、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965、热产氨棒状杆菌FERM BP-1539、黄色短杆菌ATCC14067、乳糖发酵短杆菌ATCC13869和散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020和由此制备的生产L-氨基酸的突变体或菌株，例如生产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌FERM-P 1709、黄色短杆菌FERM-P 1708、乳糖发酵短杆菌FERM-P 1712、谷氨酸棒状杆菌FERM-P 6463、谷氨酸棒状杆菌FERM-P 6464和谷氨酸棒状杆菌DSM 5715或例如生产L-蛋氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC21608的细胞。作为合适大肠杆菌菌株的实例，可提及大肠杆菌AJ11442(参见JP56-18596和US 4,346,170)、大肠杆菌菌株VL611和大肠杆菌菌株WC196(参见WO-A-96/17930)。
根据本发明，提供了制备其生物合成包含草酰乙酸作为前体的产物的方法。
为此，将包含编码丙酮酸羧化酶且具有基因修饰的基因(编码蛋白中的一个替换T343A或两个替换T343A和I1012S)的微生物用于生产衍生自草酰乙酸的代谢产物。
为此，将具有与序列编号1至少70％同一性且在位置1027-1029中将编码苏氨酸的三联体替换成编码丙氨酸的三联体的基因、或具有与序列编号2至少70％同一性且在1027-1029中将编码苏氨酸的三联体替换成编码丙氨酸的三联体且另外在位置3034-3036中将编码异亮氨酸的三联体替换成编码丝氨酸的三联体的基因引入微生物中。
本发明的方法包括使用具有与根据序列编号1或2的基因至少70％至100％同一性的基因。
优选地，使用具有与序列编号1或序列编号2至少80％至90％同一性的基因的微生物。特别优选地，具有与序列编号1或序列编号2 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的基因用于所述制备方法。非常特别优选为根据序列编号1或序列编号2的基因。
根据本发明使用的编码丙酮酸羧化酶的基因可以在此通过染色体的方式，或在载体中，优选在质粒中使用。
该基因被表达，并且具有与根据序列编号3的丙酮酸羧化酶至少90％同一性的本发明丙酮酸羧化酶(其中在位置343中苏氨酸替换成丙氨酸)导致衍生自草酰乙酸的代谢产物的生产增加。
具有与根据序列编号4的丙酮酸羧化酶至少90％同一性的本发明丙酮酸羧化酶(其中在位置343中苏氨酸替换成丙氨酸且在位置1012中异亮氨酸替换成丝氨酸)导致衍生自草酰乙酸的代谢产物的生产增加。
本发明的方法包括使用具有与根据序列编号3和序列编号4的丙酮酸羧化酶90％至100％同一性的丙酮酸羧化酶。
优选地，根据本发明使用的丙酮酸羧化酶与序列编号3或4的同一性为95％、96％或97％，特别优选98％或99％。特别优选的是使用根据序列编号3的丙酮酸羧化酶。非常特别优选的是使用根据序列编号4的丙酮酸羧化酶。
在一个优选的实施方案中，本发明的基因被增强表达。
将如此获得的微生物进行发酵。
作为生产生物体，可以优选地使用选自棒状杆菌属、短杆菌属、埃希氏菌属、芽孢杆菌、乳杆菌属、乳球菌属、发酵单胞菌属、甲基杆菌属、雷尔氏菌属、梭菌属、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母属和耶氏酵母属的生物体，其中特别优选是谷氨酸棒状杆菌、高效棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、布朗克假丝酵母、皱落假丝酵母、运动发酵单胞菌、解脂耶氏酵母、扭脱甲基杆菌、真氧产碱杆菌和巴氏毕赤酵母。根据本发明，最优选的细胞是棒状杆菌属和埃希氏菌属的那些，其中谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌是非常特别优选的细菌菌株。
特别地在代谢物是L-赖氨酸的情况下，基因技术修饰的细胞或微生物特别是可以衍生自选自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、醋麸酸棒状杆菌ATCC15806、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965、热产氨棒状杆菌FERM BP-1539、黄色短杆菌ATCC14067、乳糖发酵短杆菌ATCC13869和散枝短杆菌ATCC14020和由此制备的生产L-氨基酸的突变体或菌株，例如生产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌FERM-P 1709、黄色短杆菌FERM-P 1708、乳糖发酵短杆菌FERM-P 1712、谷氨酸棒状杆菌FERM-P 6463、谷氨酸棒状杆菌FERM-P 6464和谷氨酸棒状杆菌DSM 5715或例如生产L-蛋氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC21608的细胞。作为合适的大肠杆菌菌株的实例，可使用大肠杆菌AJ11442(参见JP 56-18596和US 4,346,170)、大肠杆菌菌株VL611和大肠杆菌菌株WC196(参见WO-A-96/17930)。
通过本发明的方法，特别是可以增加天冬氨酸家族的氨基酸，即制备L-赖氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-蛋氨酸。此外，谷氨酸家族的氨基酸如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸或L-脯氨酸，柠檬酸循环的中间体如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸或2-酮戊二酸，二胺如二氨基戊烷或二氨基丁烷或其它产物如衣康酸、依克多因、γ-氨基丁酸、丁醇、1-丙醇、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸、D-精氨酸或4-羟基脯氨酸的生产可以增加。
通过发酵制备并分泌到培养上清液中的产物然后富集和分离出来。
在下文中参考附图显示了实验结果，这些附图示例性描述本发明。
图1：具有天然Pyc、染色体编码的PycT343A和染色体编码的PycT343A；I1012S的谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I的生长；
图2：菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I、具有染色体编码的PycT343A的谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I以及具有染色体编码的PycT343A；I1012S的谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I的L-赖氨酸生产；
图3：具有质粒pAN6-pycT343A；I1012S的谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311IΔpyc的生长；
图4：具有质粒pAN6-pycT343A；I1012S的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311IΔpyc的L-赖氨酸生产。
图1显示了具有染色体编码的Pyc变异体PycT343A和PycT343A；I1012S的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I的生长。在图1中，横坐标表示以小时(h)为单位的时间，且纵坐标表示在620nm(A.U.)下的背向散射值，其作为细胞密度的量度。具有天然Pyc，即在位置343处具有苏氨酸和在位置1012处具有异亮氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I充当对照。在系统中，将所有菌株在含有4％(重量/体积)葡萄糖的CGXII基本培养基中在30℃和1200rpm下培养24小时。
图2显示了具有染色体编码的Pyc变异体PycT343A和具有染色体编码的Pyc变异体PycT343A；I1012S的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I的L-赖氨酸生产。其中，横坐标表示三个独立重复测定(Replikate)以及来自三个实验的平均值，且纵坐标表示赖氨酸浓度百分比，其中三个独立重复测定中对照菌株ATCC 13032 lysCT311I的赖氨酸浓度(黑色条)各自被设定为100％。菌株ATCC 13032 lysCT311IpycT343A的L-赖氨酸浓度显示为斜阴影条。菌株ATCC 13032 lysCT311IpycT343A；I1012S的L-赖氨酸浓度显示为水平阴影条。在细胞在系统中培养24小时后(参见图1)收获细胞，并通过具有邻苯二甲醛衍生化的反相HPLC测定各个培养物的上清液中的L-赖氨酸浓度。在三个重复测定的每一个中，具有突变的Pyc变异体PycT343A的菌株以及具有突变的Pyc变异体PycT343A；I1012S的菌株都显示出比具有天然Pyc的对照菌株更高的赖氨酸效价。观察到L-赖氨酸最终浓度相比于谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I而言增加平均15-19％。通过t检验比较各个突变体的所测量的赖氨酸浓度。在此，该图中显示的星号表示p≤0.01。
图3中显示了具有质粒pAN6-pycT343A；I1012S的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032lysCT311IΔpyc的生长。在该图中，横坐标又表示以小时(h)为单位的时间，且纵坐标表示在620nm(A.U.)下的背向散射值。作为对照，带有空质粒pAN6或具有天然pyc的质粒pAN6-pyc的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311IΔpyc一起进行。将所有菌株在系统中在含有4％(重量/体积)葡萄糖和25mg L-1卡那霉素的CGXII基本培养基中在30℃和1200rpm下培养24小时。在培养开始时，用1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱发pyc的表达。
图4以比较形式显示了具有质粒pAN6-pycT343A；I1012S的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 lysCT311IΔpyc的L-赖氨酸生产。其中，横坐标表示菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032lysCT311IΔpyc，其包含空载体pAN6(阴影条)、具有天然丙酮酸羧化酶的载体pAN6-pyc(白条)或载体pAN6-pycT343A；I1012S(黑条)。在将细胞在系统中培养24小时后(参见图3)收获细胞，并通过具有邻苯二甲醛衍生化的反相HPLC测定各个培养物的上清液中的L-赖氨酸浓度。作为比较，在菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311IΔpyc/pAN6(无Pyc)和ATCC 13032 lysCT311I/pAN6-pyc(具有天然Pyc)中测量了赖氨酸生产。本数据是来自至少六个生物学重复测定的平均值和标准偏差。通过t检验比较各个突变体的所测量的赖氨酸浓度。在此，图中显示的星号表示p≤0.05。相比于具有天然Pyc的菌株，可看出具有PycT343A ；I1012S变异体的菌株中L-赖氨酸最终浓度明显增加9％。
在本发明的上下文中，可以识别pyc基因中的突变，其导致L-赖氨酸生产增加。首先，通过易错PCR建立基于质粒的Pyc突变体库，然后将其在菌株ATCC1303lysCT311IΔpyc中借助基因编码的赖氨酸传感器(pSenLys)和荧光激活细胞分选(FACS)首先筛选增加的荧光。然后将分离出的细胞进行繁殖并测试增加的赖氨酸形成。这些方法是本领域技术人员已知的(参见Binder等人，Genome Biol.2012,13:R40)。对在此分离出的基因变异体和酶变异体进行基因表征，这最终导致识别本发明的Pyc变异体，其增加L-赖氨酸以及衍生自草酰乙酸的其它代谢物的生产。发现的突变是T343A和T343A；I1012S。
1.染色体编码的Pyc-变异体Pyc-T343A：
测量具有染色体编码的Pyc变体Pyc-T343A的谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032lysCT311I的L-赖氨酸生产：
在染色体pyc基因中苏氨酸密码子343替换成丙氨酸密码子是借助两次同源重组在使用载体pK19mobsacB的情况下根据本领域技术人员已知的方法来进行的(等人1994 Gene 145:69–73；Hochheim等人2017 Biotechnol Lett 39:283–288)。将使用具有天然染色体pyc基因的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I的生产进行比较。将所述菌株在Biolector系统中在800μl含有4％(重量/体积)葡萄糖的CGXII基本培养基中在30℃和1200rpm下培养24小时(图1)。600nm处的起始OD为0.5。24小时后，各个培养物的细胞沉降，并测量上清液中的L-赖氨酸浓度。通过具有经邻苯二甲醛的氨基酸柱前衍生化的反相HPLC进行测量。使用80％溶液A(100mM乙酸钠(pH 7.2))和20％溶液B(100％(体积/体积)甲醇)至20％溶液A和80％溶液B的梯度作为流动相。该实施例表明，所研究的Pyc变异体对赖氨酸生产具有积极作用，并且如果不是野生型Pyc蛋白、而是Pyc变异体Pyc-T343A进行染色体编码，则赖氨酸生产可以增加高达15％。
2.染色体编码的Pyc变异体Pyc-T343A；I1012S：
测量具有染色体编码的Pyc变异体Pyc-T343A；I1012S的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 lysCT311I的L-赖氨酸生产：
在染色体pyc基因中苏氨酸密码子343替换成丙氨酸密码子和异亮氨酸密码子1012替换成丝氨酸密码子是借助两次同源重组在使用载体pK19mobsacB的情况下根据本领域技术人员已知的方法来进行的(等人1994 Gene 145:69–73；Hochheim等人2017Biotechnol Lett 39:283–288)。将使用具有天然染色体pyc基因的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 lysCT311I的生产进行比较。将所述菌株在Biolector系统中在800μl含有4％(重量/体积)葡萄糖的CGXII基本培养基中在30℃和1200rpm下培养24小时(图1)。600nm处的起始OD为0.5。24小时后，各个培养物的细胞沉降，并测量上清液中的L-赖氨酸浓度。通过具有经邻苯二甲醛的氨基酸柱前衍生化的反相HPLC进行测量。使用80％溶液A(100mM乙酸钠(pH7.2))和20％溶液B(100％(体积/体积)甲醇)至20％溶液A和80％溶液B的梯度作为流动相。该实施例表明，所研究的Pyc变异体对赖氨酸生产具有积极作用，并且如果不是野生型Pyc蛋白、而是Pyc变异体Pyc-T343A；I1012S进行染色体编码，则赖氨酸生产可以增加高达19％。
3.质粒编码的Pyc变异体Pyc-T343A；I1012S：
测量谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032lysCT311IΔpyc/pAN6-pycT343A；I1012S的L-赖氨酸生产：
将使用编码天然Pyc的菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032lysCT311IΔpyc/pAN6-pyc和空质粒对照谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032lysCT311IΔpyc/pAN6的生产进行比较。将所述菌株在Biolector系统中在800μl含有4％(重量/体积)葡萄糖和25mg/l卡那霉素的CGXII基本培养基中在30℃和1200rpm下培养24小时(图3)。600nm处的起始OD为0.5。24小时后，各个培养物的细胞沉降，并测量上清液中的L-赖氨酸浓度。通过具有经邻苯二甲醛的氨基酸柱前衍生化的反相HPLC进行测量。使用80％溶液A(100mM乙酸钠(pH 7.2))和20％溶液B(100％(体积/体积)甲醇)至20％溶液A和80％溶液B的梯度作为流动相。该实施例表明，如果不是野生型Pyc蛋白、而是Pyc变异体Pyc-T343A；I1012S在质粒pAN6上编码，则赖氨酸生产可以增加高达9％(图4)。
放弃：
本发明的主题不是由下列现有技术已知的突变，例如Ohnishi等人(AppliedMicrobiology and Biotechnology(2002)58:217-223)，即通过染色体方式将在谷氨酸棒状杆菌的Pyc的位置458处脯氨酸替换成丝氨酸的氨基酸替换引入谷氨酸棒状杆菌菌株AHD2中，所述谷氨酸棒状杆菌菌株AHD2基于野生型ATCC 13032并且带有两个点突变，即高丝氨酸脱氢酶(hom)基因中的Val59Ala和天冬氨酸激酶(lysC)基因中的Thr311Ile，以及来自文件US 7,300,777 B2，其具有生物体，其中相比于从谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 21523分离出Pyc，从具有多个突变(M1V、E153D、A182S、A206S、H227R、A452G、D1120E)的谷氨酸棒状杆菌菌株NRRL-B11474中分离出丙酮酸羧化酶。

Claims (17)

1.一种DNA，其是根据序列编号1的DNA。
2.一种DNA，其是根据序列编号2的DNA。
3.一种丙酮酸羧化酶，其是根据序列编号3的丙酮酸羧化酶。
4.一种丙酮酸羧化酶，其是根据序列编号4的丙酮酸羧化酶。
5.一种载体，
其特征在于，
其含有根据权利要求1至2任一项的DNA。
6.根据权利要求5的载体，
其特征在于，
其是质粒。
7.一种微生物，
其特征在于，
其含有根据权利要求1至2任一项的DNA。
8.根据权利要求7的微生物，
其特征在于，
其含有根据权利要求5或6任一项的载体。
9.根据权利要求7或8的微生物，
其特征在于，
其是选自棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、耶氏酵母属(Yarrowia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、弧菌属(Vibrio)和梭菌属(Clostridium)的微生物。
10.一种制备产物的方法，所述产物的生物合成包含草酰乙酸作为前体，
其特征在于，
将含有根据权利要求1至2任一项的DNA且形成具有根据权利要求3至4任一项的序列的丙酮酸羧化酶的微生物进行发酵，其中根据权利要求1至2的DNA被增强表达，和将产物富集在培养基或细胞中。
11.根据权利要求10的方法，
其特征在于，
分离出所述产物。
12.根据权利要求10或11的方法，
其特征在于，
使用选自棒状杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌、乳杆菌属、乳球菌属、假丝酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、埃希氏菌属、发酵单胞菌属、耶氏酵母属、甲基杆菌属、雷尔氏菌属、弧菌属和梭菌属的种类作为微生物。
13.根据权利要求10至12任一项的方法，
其特征在于，
制备天冬氨酸家族的氨基酸。
14.根据权利要求13的方法，
其特征在于，
制备L-赖氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-异亮氨酸或L-蛋氨酸。
15.根据权利要求10至12任一项的方法，
其特征在于，
制备来自氨基酸的谷氨酸家族的物质，柠檬酸循环的中间体，二胺，以及其它由草酰乙酸制备的代谢产物。
16.根据权利要求10至12任一项的方法，
其特征在于，
制备L-谷氨酸、谷氨酰胺、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-瓜氨酸或L-鸟氨酸，琥珀酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸、异柠檬酸或2-酮戊二酸，二氨基戊烷或二氨基丁烷，衣康酸、依克多因、γ-氨基丁酸、丁醇、1-丙醇、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸、D-精氨酸或4-羟基脯氨酸。
17.一种染色体，其含有根据权利要求1至2任一项的DNA。
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